CN100354421C - 在甲醇酵母中高表达的耐高温植酸酶基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在甲醇酵母中高表达的耐高温植酸酶基因以及它的制备方法，本发明采用PCR扩增技术合成耐高温植酸酶基因，并对其进行DNA改组，在原核表达质粒上构建突变植酸酶基因文库，通过突变植酸酶筛选获得耐高温植酸酶基因，通过改变基因的偏爱密码，使基因适合在酵母中表达，通过电击转化将耐高温的植酸酶基因整合到毕赤酵母中实现高表达。

Description

在甲醇酵母中高表达的耐高温植酸酶基因

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，更具体地说是通过基因工程方法改变植酸酶基因，使表达的蛋白质能够在高温下保持长时间活性。

技术背景

禾谷类、豆科类及油料作物是人的食品和动物饲料中的主要原料。这些原料中虽含有大量的磷，但其中50％-70％是以植酸磷(六磷酸肌醇)的形式存在(Salunkhe 1982，食品研究进展)。单胃动物缺乏分解植酸磷所必需的酶，磷的利用率很低，造成大量磷源浪费，无法利用的磷被排除体外，造成环境磷污染(Cromwell 1991，生物技术在食品工业中的应用进展)，另外由于磷是动物生长过程中的基本元素，为了弥补新陈代谢中磷的消耗，常常需要在食品和饲料中添加无机磷(Common 1989，自然杂志)。

植酸酶能将植酸水解成肌醇和磷酸，在饲料中添加植酸酶不仅可以提高植物性饲料中磷的利用率，减少粪便中排出的磷对环境污染(Nelson 1968，畜牧科学)，而且能够通过降低植酸盐的抗营养作用，增加动物对蛋白质和一些金属离子的吸收能力(Wyss 1999，应用环境微生物科学)。

开发植酸酶的直接原因来源于植酸带来的磷污染。一方面，植酸中螫合的磷无法吸收利用，另一方面则是必须在饲料和食品中添加大量无机磷，造成磷源浪费和环境污染。自80年代中期，欧洲就致力于寻找全面解决无机磷污染的方案。其直接的动因来源于原欧共体成员国议会对环境保护的关注，在他们实施的环保指南(CouncilDirective91/676/EEC)中，着重强调限制养殖业的磷排泄量。植酸酶是目前所有使用的添加剂中，具有最直接、最显著环保社会效益的酶制剂。植酸酶也是目前所有饲料酶制剂产品中功能研究最清楚的产品。使用植酸酶最大的好处在于减少饲料中磷酸氢钙等无机磷的使用量，幅度至少50％-70％。在中国，很多养殖区可以将磷酸氢钙的用量减少70％以上，尤其在杂粕用量较大的蛋鸡养殖区，可以全部替代磷酸氢钙。使用植酸酶的饲料，向环境排泄的磷相应减少30％以上。据最保守的估计，从开始引入植酸酶以来，我国的养殖业已经少向环境排放了7200吨磷。折合磷酸氢钙42000吨。加上磷矿开采的污染和费用，以及节约的储运成本。植酸酶创造的综合效益远远不止在养殖和饲料方面估计的9200多万元。

事实上，植酸酶的最大受益者是人类自身。在赖以生存的环境中，植酸酶能从污染的源头轻而易举地消灭磷污染，比常规使用的后期治理的方法更为经济有效。可以预期，植酸酶将以显著的经济效益和社会效益对整个行业的可持续发展产生巨大促进作用。

最新的研究结果还发现了植酸酶的潜在营养价值。能够提高饲料中蛋白质的消化利用率。应用植酸酶，加大了非常规原料资源的使用比例，为节约蛋白质饲料提供了方便。使用植酸酶能直接降低了饲料的原料成本，从而提高产品的价格竞争力。在中国，每生产1吨全价饲料，至少可以因此增加5-10元的净收益。每生产1吨5％的预混料，则可以增加收益百元以上。使用植酸酶在减少饲料中无机磷添加量的同时，大幅度地减轻甚至完全杜绝了磷酸氢钙导致的氟和其它重金属中毒问题。

植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中。许多微生物都能产生植酸酶，尤其在曲霉属中。1968年Shien等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所用的22株黑霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于Aspergillus terreusNO.9A-1，它的最适pH为4.5，最适反应温度为70℃，此酶在pH1.2～9.0均能稳定维持活性。此后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶，其中来源于A.ficcum NR-RL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶phyA在酸性条件下有较高酶活性，被认为是目前最具应用前景的饲用植酸梅，其酶学性质的研究也较为深入。植酸酶phyA，是一种糖基化蛋白，分子量为85KD。它的最适pH为2.5和5.5，最适反应温度为55℃。在37℃、pH2.5的条件下，以植酸为底物的Km值为50mmol，Ca²⁺、Fe²⁺对酶活性无影响，Mn²⁺、Co²⁺有激活作用，能使酶活性分别提高30％和13％。Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Cu⁺对酶活性有抑制作用，其中前两种为非竞争性抑制，后两种为竞争性抑制。对酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如L(+)-酒石酸对它却没有抑制作用。

目前生产上采用的植酸酶均来自黑曲霉(Aspergillus niger)。黑曲霉中的植酸酶(PhyA)具有比活高、结构稳定等优点。在植酸酶发展初期，均采用原始菌株发酵生产，然而，原始菌株表达量低，使生产成本较高，通过化学诱变可以获得产酶量提高的菌株，然而所需时间很长，诱变菌株容易退化，利用生物反应器高效表达植酸酶基因，大幅度提高了植酸酶产量，克服了野生型菌株含量低的缺点^[6，7]。中国农业科学院饲料所和生物技术研究所从1996年开始合作，从黑曲酶中克隆了适合在饲料中使用的植酸酶基因，并共同开发了利用生物反应器大规模、低成本生产饲料添加剂植酸酶的工艺。但是，该植酸酶存在一个很大的缺陷：不能耐受较高的温度，在加工过程中酶活力单位大量丧失(Kim 1998，酶和微生物技术)。因此，从自然界寻找或者通过随机突变筛选热稳定植酸酶成为目前饲料行业研究的热点。

从烟熏曲霉(Aspergillus fumigatus)中分离的植酸酶能够耐受90-100℃高温，而且能在较宽的pH范围内降解植酸，因此具有很大的市场潜力(van Loon 1998，应用环境微生物学)。然而，在野生型菌株中，植酸酶的表达量很低，难以在生产上推广。

发明内容

本发明的目的是寻找一种偏爱密码改变、编码蛋白质耐热性能提高的植酸酶基因，并利用酵母中高表达制备该植酸酶的方法。

本发明试图通过改变基因的偏爱密码，使基因适合在酵母中表达，通过电击转化将耐热的植酸酶基因整合到毕赤酵母中，实现高效表达。

为了提高植酸酶基因的耐热性和比活，对合成的植酸酶基因进行DNA改组(DNAShuffling)、在原核表达质粒上构建突变植酸酶基因的文库，通过突变植酸酶活性筛选，最终获得了高比活的耐高温植酸酶基因。新的植酸酶Fphy的比活为原先Fphy1的5倍左右。Fphy和Fphy1的氨基酸数相同，但有9个氨基酸发生了改变。其中包括：72V＞I，86F＞Y，87A＞T，194Q＞E，200A＞E，236S＞P，292T＞A，338V＞I，396A＞V等。

耐热性植酸酶基因合成采用重叠延伸PCR方法，结合高保真的PWO DNA聚合酶，将引物片段按顺序连接。合成基因长度为1320 bp。

突变耐热植酸酶基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如下，从蛋白质一级结构分析，该植酸酶含有6个糖激化位点。

本发明耐热性植酸酶基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列如下：

TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTACCTCCCACCTTTGGGGACAATAC

  S  K  S  C  D  T  V  D  L  G  Y  Q  C  S  P  A  T  S  H  L  W  G  Q  Y

TCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAACTTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTG

  S  P  F  F  S  L  E  D  E  L  S  V  S  S  K  L  P  K  D  C  R  I  T  L

GTTCAAGTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACAAAAAACTGATC

  V  Q  V  L  S  R  H  G  A  R  Y  P  T  S  S  K  S  K  K  Y  K  K  L   I

ACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTCAAAGGAAAATACACTTTCTTGAAAACCTACAACTACACCTTG

  T  A  I  Q  A

A  T  D  F  K  G  K   Y  T  F  L  K  T  Y

Y  T  L

GGAGCTGACGACTTGACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCTGGAATCAAATTCTACCAAAGATAC

  G  A  D  D  L  T  P  F  G  E  Q  Q  L  V  N  S  G  I  K  F  Y  Q  R  Y

AAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTTCTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAA

  K  A  L  A  R  S  V  V  P  F  I  R  A  S  G  S  D  R  V  I  A  S  G  E

AAATTCATCGAAGGATTCCAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGCTATC

  K  F  I  E  G  F  Q  Q  A  K  L  A  D  P  G  A  T  N  R  A  A  P  A  I

TCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCT

  S  V  I  I  P  E  S  E  T  F

N  T  L  D  H  G  V  C  T  K  F  E  A

TCTGAACTTGGAGACGAGGTCGAGGCTAACTTCACCGCTTTGTTCGCTCCTGACATCAGAGCTAGAGCTGAA

S   E  L  G  D  E  V   E  A  N  F  T  A  L  F  A  P  D  I  R  A  R  A  E

AAACACTTGCCTGGTGTCACCTTGACCGACGAAGACGTTGTTTCCTTGATGGATATGTGCCCCTTCGACACC

  K  H  L  P  G  V  T  L  T  D  E  D  V  V  S  L  M  D  M  C   P  F  D  T

GTTGCTAGAACCTCCGACGCTTCCCAACTTTCCCCATTCTGCCAACTTTTCACCCACAACGAATGGAAAAAA

  V  A  R  T  S  D  A  S  Q  L  S  P  F  C  Q  L  F  T  H  N  E  W  K  K

TACAACTACCTGCAGTCCTTGGGAAAATACTACGGATACGGAGCTGGAAACCCATTGGGACCAGCTCAAGGA

  Y  N  Y  L  Q  S  L  G  K  Y  Y  G  Y  G  A  G  N  P  L  G  P  A  Q  G

ATCGGATTCGCCAACGAATTGATCGCTAGATTGACCAGATCCCCAGTTCAAGACCACACCTCCACTAACTCC

I  G  F   A  N  E  L  I  A  R  L  T  R  S  P  V  Q  D  H  T  S  T     S

ACCTTGGTTTCCAACCCAGCTACCTTCCCATTGAACGCTACCATGTACGTTGACTTCTCCCACGACAACTCT

  T  L  V  S  N  P  A  T  F  P  L     A  T  M  Y  V  D  F  S  H  D  N  S

ATGATCTCCATCTTCTTCGCTTTGGGACTTTACAACGGAACTGAACCATTGTCCAGAACTTCCGTTGAATCC

M   I  S  I  F  F  A  L  G  L  Y     G  T  E  P  L  S  R  T  S  V  E  S

GCTAAAGAACTTGACGGATACTCCGCTTCCTGGGTTGTTCCATTCGGTGCTAGAGCTTACTTTGAAACTATG

  A  K  E  L  D  G  Y  S  A  S  W  V  V  P  F  G  A  R  A  Y  F  E  T  M

CAATGCAAATCCGAAAAAGAACCATTGGTTAGAGTCTTGATTAACGACAGAGTTGTTCCATTGCACGGATGC

  Q  C  K  S  E  K  E  P  L  V  R   V  L  I  N  D  R  V  V  P  L  H  G  C

GACGTTGACAAATTGGGAAGATGCAAATTGAACGACTTCGTTAAAGGATTGTCTTGGGCTAGATCCGGTGGT

  D  V  D  K  L  G  R  C  K  L  N  D  F  V  K  G  L  S  W  A  R  S  G  G

AACTGGGGTGAATGCTTCTCCTAA

  N  W  G  E  C  F  S  -

突变耐热植酸酶基因与原始基因相比，352个核苷酸发生变化，核苷酸的同源性为73％，核苷酸密码在合成过程中全部采用酵母偏爱密码，其中精氨酸采用AGA，赖氨酸采用AAA，半胱氨酸采用TGC，天冬氨酸采用AAC。另外，为了提高表达量，合成基因切除了5’端26个氨基酸的信号肽编码序列和信号肽内的内含子序列，以便植酸酶基因编码框能正确插入带有高表达的启动子和分泌信号肽之后，稳定高效表达。

新的植酸酶基因Fphy与原植酸酶基因Fphy1相比较：

FPHY1    -TCCAAGTCCTGCGATACGGTAGACCTCGGGTACCAGTGCTCCCCTGCGAC-50

          ||||| |||||||| || || ||| | || ||||| ||||||||||| ||

FPHY     -TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTAC-50

FPHY1    -TTCTCATCTATGGGGCCAGTACTCGCCATTCTTTTCGCTCGAGGACGAGC-100

           || || || ||||| || ||||| |||||||| ||  | |||||||| |

FPHY     -CTCCCACCTTTGGGGACAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAAC-100

FPHY1    -TGTCCGTGTCGAGTAAGCTTCCCAAGGATTGCCGGATCACCTTGGTACAG-150

          | ||||| ||    ||  | || || |||||| | ||||||||||| ||

FPHY     -TTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGGTTCAA-150

FPHY1    -GTGCTATCGCGCCATGGAGCGCGGTACCCAACCAGCTCCAAGAGCAAAAA-200

          ||  | ||  | || || ||  | |||||||||  ||||||   ||||||

FPHY     -GTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAA-200

FPHY1    -GTATAAGAAGCTTGTGACGGCGATCCAGGCCAATGCCACCGACTTCAAGG-250

           || || || || || || || ||||| || || || ||||||||||| |

FPHY     -ATACAAAAAACTGATCACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTCAAAG-250

FPHY1    -GCAAGTTTGCCTTTTTGAAGACGTACAACTATACTCTGGGTGCGGATGAC-300

          | || || || || ||||| || |||||||| |   |||| || || |||

FPHY     -GAAAATACACTTTCTTGAAAACCTACAACTACAACTTGGGAGCTGACGAC-300

FPHY1    -CTCACTCCCTTTGGGGAGCAGCAGCTGGTGAACTCGGGCATCAAGTTCTA-350

           | |  || || || || || || || || ||||| || ||||| |||||

FPHY    -TTGAACCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCTGGAATCAAATTCTA-350

FPHY1  -CCAGAGGTACAAGGCTCTGGCGCGCAGTGTGGTGCCGTTTATTCGCGCCT -400

        ||| || ||||| || || ||  |    || || || || ||  | || |

FPHY   -CCAAAGATACAAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTT -400

FPHY1  -CAGGCTCGGACCGGGTTATTGCTTCGGGAGAGAAGTTCATCGAGGGGTTC -450

        | ||||| ||| | ||||| ||||| ||||| || |||||||| || |||

FPHY   -CTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAAAAATTCATCGAAGGATTC -450

FPHY1  -CAGCAGGCGAAGCTGGCTGATCCTGGCGCGACGAACCGCGCCGCTCCGGC -500

        || || || ||  ||||||| ||||| || || ||| | || ||||| ||

FPHY   -CAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGC -500

FPHY1  -GATTAGTGTGATTATTCCGGAGAGCGAGACGTTCAACAATACGCTGGACC -550

         ||    || || || || ||   ||| || |||||||| ||  ||||||

FPHY   -TATCTCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACC -550

FPHY1  -ACGGTGTGTGCACGAAGTTTGAGGCGAGTCAGCTGGGAGATGAGGTTGCG -600

        ||||||| ||||| || || |||||   ||| || ||||| ||||| | |

FPHY   -ACCGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCTTCTGAACTTGGAGACGAGGTCGAG -600

FPHY1  -GCCAATTTCACTGCGCTCTTTGCACCCGACATCCGAGCTCGCGCCGAGAA -650

        || || ||||| ||  | || || || |||||| ||||| | || || ||

FPHY   -GCTAACTTCACCGCTTTGTTCGCTCCTGACATCAGAGCTAGAGCTGAAAA -650

FPHY1  -GCATCTTCCTGGCGTGACGCTGACAGACGAGGACGTTGTCAGTCTAATGG -700

         ||  | ||||| || ||  |||| ||||| ||||||||     | ||||

FPHY   -ACACTTGCCTGGTGTCACCTTGACCGACGAAGACGTTGTTTCCTTGATGG -700

FPHY1  -ACATGTGTTCGTTTGATACGGTAGCGCGCACCAGCGACGCAAGTCAGCTG -750

        | |||||  | || || || || ||  | |||  ||||||    || ||

FPHY   -ATATGTGCCCCTTCGACACCGTTGCTAGAACCTCCGACGCTTCCCAACTT -750

FPHY1  -TCACCGTTCTGTCAACTCTTCACTCACAATGAGTGGAAGAAGTACAACTA -800

        || || ||||| ||||| ||||| ||||| || ||||| || ||||||||

FPHY   -TCCCCATTCTGCCAACTTTTCACCCACAACGAATGGAAAAAATACAACTA -800

FPHY1  -CCTTCAGTCCTTGGGCAAGTACTACGGCTACGGCGCAGGCAACCCTCTGG -850

        ||| ||||||||||| || |||||||| ||||| || || |||||  |||

FPHY   -CCTGCAGTCCTTGGGAAAATACTACGGATACGGAGCTGGAAACCCATTGG -850

FPHY1  -GACCGGCTCAGGGGATAGGGTTCACCAACGAGCTGATTGCCCGGTTGACT -900

        |||| ||||| || || || ||| |||||||  |||| ||  | |||||

FPHY   -GACCAGCTCAAGGAATCGGATTCGCCAACGAATTGATCGCTAGATTGACC -900

FPHY1  -CGTTCGCCAGTGCAGGACCACACCAGCACTAACTCGACTCTAGTCTCCAA -950

         | || ||||| || |||||||||  ||||||||| ||  | || |||||

FPHY   -AGATCCCCAGTTCAAGACCACACCTCCACTAACTCCACCTTGGTTTCCAA -950

FPHY1  -CCCGGCCACCTTCCCGTTGAACGCTACCATGTACGTCGACTTTTCACACG-1000

         ||| || |||||||| |||||||||||||||||||| ||||| || ||||

FPHY   -CCCAGCTACCTTCCCATTGAACGCTACCATGTACGTTGACTTCTCCCACG-1000

FPHY1  -ACAACAGCATGGTTTCCATCTTCTTTGCATTGGGCCTGTACAACGGCACT-1050

         |||||   ||| | ||||||||||| || ||||| || |||||||| |||

FPHY   -ACAACTCTATGATCTCCATCTTCTTCGCTTTGGGACTTTACAACGGAACT-1050

FPHY1  -GAACCCTTGTCCCGGACCTCGGTGGAAAGCGCCAAGGAATTGGATGGGTA-1100

         ||||| |||||| | || || || |||  ||| || ||| | || || ||

FPHY   -GAACCATTGTCCAGAACTTCCGTTGAATCCGCTAAAGAACTTGACGGATA-1100

FPHY1  -TTCTGCATCCTGGGTGGTGCCTTTCGGCGCGCGAGCCTACTTCGAGACGA-1150

          || ||||||||||| || || ||||| ||  |||| ||||| || || |

FPHY   -CTCCGCTTCCTGGGTTGTTCCATTCGGTGCTAGAGCTTACTTTGAAACTA-1150

FPHY1  -TGCAATGCAAGTCGGAAAAGGAGCCTCTTGTTCGCGCTTTGATTAATGAC-1200

         |||||||||| || ||||| || || |  ||| | |  |||||||| |||

FPHY   -TGCAATGCAAATCCGAAAAAGAACCATTGGTTAGAGTCTTGATTAACGAC-1200

FPHY1  -CGGGTTGTGCCACTGCATGGCTGCGATGTGGACAAGCTGGGGCGATGCAA-1250

          | ||||| ||| ||   || ||||| || |||||  ||||  |||||||

FPHY   -AGAGTTGTTCCATTGTTGGGATGCGACGTTGACAAATTGGGAAGATGCAA-1250

FPHY1  -GCTGAATGACTTTGTCAAGGGATTGAGTTGGGCCAGATCTGGGGGCAACT-1300

           |||| ||||| || || ||||||  |||||| ||||| || || ||||

FPHY   -ATTGAACGACTTCGTTAAAGGATTGTCTTGGGCTAGATCCGGTGGTAACT-1300

FPHY1  -GGGGAGAGTGCTTTAGTTGA-1320

         |||| || |||||    | |

FPHY   -GGGGTGAATGCTTCTCCTAA-1320

植酸酶作为动物饲料添加剂，对动物生长的促进作用已经得到确证，但是目前在饲料工业中还未全面利用，主要原因是植酸酶的生产菌株表达量低，难以获得大量产品。利用毕赤酵母(P.pastoris)表达植酸酶可以大大提高植酸酶的表达水平，表达量由原始菌株的每毫升几微克提高到1-10毫克，在毕赤酵母中表达了来源于A.nigerNRRL3135的phyA2基因，可以使植酸酶的表达量提高近3000倍。此外在酵母中能进行糖基化修饰等蛋白翻译后加工，提高酶的生物活性。

本发明的有益效果：

1、本发明的植酸酶具有明显高的耐热性，90℃处理80分钟。酶的活性仍有40％。而一般产品在90℃下处理30分钟，酶活性破坏80％。

2、本发明的植酸酶基因更适合在甲醇酵母中转录表达，将两个基因同时转化到酵母中，表达量是野生型基因的13倍。经高密度发酵，蛋白表达量为每升5.6g。

3、突变的植酸酶基因在酵母中表达后，酶活性pH值范围大，pH 2.5-6.5。pH值为5.5-6.5时，植酸酶活性达到最高。

附图说明：

图1是构建成的酵母表达植酸酶载体。

图2是植酸酶菌株发酵后，受甲醇诱导不同时间，植酸酶的分泌表达。

图3表示不同PH条件下，植酸酶的相对活力。

图4表示在90℃高温不同时间处理下，植酸酶的相对活力。

具体实施方式

实施例1：耐高温植酸酶基因的化学合成

1.利用连续延伸PCR合成耐高温植酸酶基因。引物长度为70-90bp，合成21个寡核苷酸引物，引物与引物之间连接通过20-30bp重叠序列，Tm值为60-66。将所有引物加入反应体系，中间引物量为10-20ng，两侧的引物量为100-200ng。PCR反应体系为100μL。PCR扩增条件为94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共进行35个循环。

耐高温植酸酶基因引物为：

phy1：

TCCAAATCCFGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTACCTCCCACCTTTGG

GGACAATAC

phy2：

ACCTCCCACCTTTGGGGACAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAACTTTCCGTFTCCTC

CAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATC

Phy3：

CAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTGGTTCAAGTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATA

CCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATAC

Phy4：

CAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACAAAAAACTGGTCACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCG

ACTTCAAAGGAAAATTCGCTTTCTTG

Phy5：GACTTCAAAGGAAAATTCGCTTTCTTGAAAACCTACAACTACACCTTGGGAGCTGACGA

CTTGACCCCATTCGGAGAACAACAACTTG

Phy6：

GACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCTGGAATCAAATTCTACCAAAGATACAAAGC

ACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTC

Phy7：

CACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTTCTGGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGG

AGAAAAATTCATCGAAGGATTCCAAC

Phy8：

CTGGAGAAAAATTCATCGAAGGATTCCAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACA

GAGCTGCTCCTGCTATCTCCG

Phy9：

CCAACAGAGCTGCTCCTGCTATCTCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTT

GGACCACGGTGTTTGCACCAAATTC

Phy10：

GGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCTTCTCAACTTGGAGACGAGGTCGCTGCTAACTT

CACCGCTTTGTTCGCTCCTGACATC

Phy11：

CAAGGAAACAACGTCTTCGTCGGTCAAGGTGACACCAGGCAAGTGTTTTTCAGCTCTAGCTCT

GATGTCAGGAGCGAACAAAGCGGTG

Phy12：

GCAGAATGGGGAAAGTTGGGAAGCGTCGGAGGTTCTAGCAACGGTGTCGAAGGAGCACATAT

CCATCAAGGAAACAACGTCTTCGTC

Phy13：

CCGTAGTATTTTCCCAAGGACTGCAGGTAGTTGTATTTTTTCCATTCGTTGTGGGTGAAAAGTTG

GCAGAATGGGGAAAGTTGGGAAG

Phy14：

CAATCTAGCGATCAATTCGTTGGTGAATCCGATTCCTTGAGCTGGTCCCAATGGGTTTCCAGCT

CCGTATCCGTAGTATTTTCCCAAGGACTG

Phy15：

GTAGCTGGGGTTGGAAACCAAGGTGGAGTTAGTGGAGGTGTGGTCTTGAACTGGGGATCTGGTC

AATCTAGCGATCAATTCGTTGGTG

Phy16：

GAAGAAGATGGAGACCATAGAGTTGTCGTGGGAGAAGTCAACGTACTAGGTAGCGTTCAATGG

GAAGGTAGCTGGGTTGGAAACCAAGGTGG

Phy17：

GTTCTTTAGCGGATTCAACGGAAGTTCTGGACAATGGTTCAGTTCCGTTGTAAAGTCCCAAAG

CGAAGAAGATGGAGACCATAGAGTTG

Phy18：

CATTGCATAGTTTTCAAAGTAAGCTGTAGCACCGAATGGAACAACCCAGGAAGCGGAGTATCCG

TCAAGTTCTTTAGCGGATTCAACGGAAGTTC

Phy19：

GCATCCGTGCAATGGAACAACTCTGTCGTTAATCAAGGCTCTAACCAATGGTTCTTTTCTTATTT

GCATTGCATAGTTTCAAAGTAAGC

Phy20：

ACCACCGGATCTAGCCCAAGACAATCCTTTAACGAAGTCGTTCAATTTGCATCTTCCCAATTTG

TCAACGTCGCATCCGTGCAATGGAACAACTC

Phy21：

TTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTACCACCGGATCTAGCCCAAGACAATC

实施例2：耐高温植酸酶基因的DNA分子重排(DNA Shuffling)

2.1 PCR扩增酸性植酸酶基因及回收

以合成植酸酶基因为模板，FphyZ1，FphyF1为引物扩增植酸酶基因，FphyZ1：(5’-TTGGATCCTCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTG-3’)；FphyF1：(5’-CGAGCTCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTACCAC-3’)反应条件为：94℃ 10min预变性，94℃变性30s，72℃退火和延伸1.5min，共30个循环，1％Agrose电泳，透吸袋法回收1.4kp的基因片段。

2.2 DNase I降解DNA及回收小片段

回收Fphy基因片段以DNase I缓冲液(50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1mmol/LMgCl₂)100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10％丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μl 10×无引物PCR缓冲液(PrimerlessPCRBuffer)(50mmol/L KCl+10mmol/LTris-Cl pH9.0+1％Triton)溶解沉淀。

2.3无引物PCR(Primerless PCR)

进行Primerless PCR扩增。反应体系：5μl小片段DNA+4μl 2.5mmol/L dNTPs+4.5μl25mmol/LMgCl₂+Taq2U+ddH₂O to 50μl；反应程序为：94℃ 30s，40℃30s，72℃ 30s，共45个循环)，2％Agrose电泳检测PCR扩增结果。

2.4有引物PCR(Primer PCR)

进行PrimerPCR扩增反应。反应体系：5μlPrimerless PCR产物+FphyZ1

0.2ng+FphyF1 0.2ng+10×PCR Buffer 5μl+2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ddH₂O to 50μl。

反应程序为：94℃ 30s，70℃ 30s，72℃2.0min，共35个循环，1％Agrose电泳检测，回收1.4kp基因片段。

2.5高活性植酸酶筛选

回收1.4kb的重排植酸酶基因片段，经BamH I和SacI双酶切后，构建入原核表达载体pG251(CN1338515)启动子和t1t2终止子之间，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，库容达到10⁷，进行高比活植酸酶的筛选。

取1μl细菌稀释96倍，等量加入96孔细菌培养板(12×8)，在每一个孔中加入150μl的LB培养液至OD₆₀₀＝0.4-0.6，从培养板的孔中取出10μl菌液转移到试管中培养，同一行的12个孔和同一列的8个孔中的细菌放置同一根试管中培养，共20根试管，每管加入带氨苄青霉素的LB培养液3mL，培养8-12小时后，离心回收菌体，超声破碎细胞，离心取上清100μl，加入植酸钾钠底物，37℃反应30分钟，加入钼蓝显色剂(钼酸胺，硫酸亚铁，浓硫酸)显色。

取每行中活性最高和每列中活性最高的交接点，将10μl培养板交接点孔中的细菌稀释96倍后，加入另一块培养板培养，每孔150μl LB培养液，10μl菌液，进行新一轮筛选。3-5轮筛选后，取交接点中细菌稀释10-100倍涂布在含氨苄抗生素的LB固体培养板上，挑取单菌落进行活性比较，获得高比活的植酸酶基因Fphy。

实施例3：酵母表达植酸酶载体构建

按合成基因的两端序列设计引物，在基因5’端加入Xho I切点和信号态切割序列，引物为：FP1Z(5’-AACTC GAGAAAAGAGAGGCTGAGGCTTCCAAATCCTGCGAC ACCGTTGACTTG-3’)，在基因3’端加入Not I切点：引物为FP1F(5’-AACGCGGCCGCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTAC-3’)。扩增片段克隆后，Xho I和Not I双酶切，定向插入pPIC9载体(Invetrogen company)，构建成fphy的酵母表达载体pPfphy(图1)。

实施例4：植酸酶高表达重组酵母筛选

将活化的酵母菌株Pichia Pastoris于500ml YPD中30℃培养18hr，至OD₆₀₀＝1.7，5000r/min离心收集菌体，先后用500，250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清液，用20ml预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5ml预冷的山梨醇悬浮，用于电击感受态。

大量抽提酵母表达载体pPfphy，BgIII酶切回收小片段，取2μg线性化片段加入50μL感受态细胞，冰浴5min，用Bio-Red GenePulser电击仪电击，参数为2.5Kv，25μF。电击结束后立即加入1.0ml预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于固体选择培养基平板(18.6％山梨醇，2％葡萄糖，1.34％YNB，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，2％琼脂糖)，30℃培养直至转化子出现。用牙签将转化子对应点种到MM(1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，1.5％琼脂糖)和MD(1.34％YNB，0.00004％Biotin，2％葡萄糖，1.5％琼脂糖)平板上，30℃培养2d，在MD上生长正常而在MM上生长不正常或不生长的转化子为阳性克隆。

将重组酵母接种于20ml BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB 0.000004％Biotin，1％甘油)，30℃培养，离心收集菌体，加入20ml诱导培养基BMMY(用0.5％甲醇代替BMGY中的甘油)，30℃下继续诱导培养36hr。

以甲醇为唯一碳源的MM培养基和以葡萄糖为碳源的MD培养基进行对应培养，进一步筛选定点整合的重组转化子68个，命名为P.pastoris FPHY1、2、3.....68。

将所有的阳性克隆单独接种三角瓶中，30℃培养至OD₆₀₀＝4-5，利用甲醇诱导培养36hr，每个诱导菌株取5μl上清液进行SDS-PAGE检测，另取10μl上清液稀释100倍，以植酸钾钠为底物进行酶活性测定。植酸酶酶活性测定方法采取钼黄法(BASF Company)。植酸酶酶活性单位(U)定义为：在37℃下，每分钟分解植酸盐释放出1nmol/L无机磷酸所需要的酶量为1U。结合电泳条带和酶活力单位，筛选到3株高效表达植酸酶基因的重组子P.pastoris FPHY34，P.pastoris FPHY41、P.pastoris FPHY57。

实施例5：重组菌株的高密度发酵

挑取植酸酶高表达重组酵母P.pastoris FPHY34菌株接种200ml YPED培养基，30℃培养至OD₆₀₀＝3.0，转入B.Braun 5L发酵罐中进行高密度发酵，以YPED培养重组酵母，利用氨水控制pH值为5.5，发酵过程中氧含量控制在20％，培养90hr，甘油耗尽，加入0.5％甲醇，30℃诱导培养。

30℃培养6hr后，重组酵母进入对数生长期，氧消耗加快，须充入纯氧，氧含量控制在20％，在发酵过程中，持续加入氨水调节pH值恒定在5.5，发酵90hr后，OD₆₀₀＝110，加入0.5％甲醇诱导培养，诱导不同时间后取3ul无菌体的诱导培养液进行SDS-PAGE检测。结果(图2)，随着诱导时间的增加，植酸酶的表达量不断提高，60h后，上清液中的表达量保持稳定。重组子P.pastoris FPHY34诱导60hr后，植酸酶表达量高达5.6mg/ml。表达的植酸酶分子量大小约为85kD。

在37℃ pH5.5的条件下对含表达产物的培养液进行植酸酶活性测定，重组酵母P.pastoris FPHY34培养60hr后，酶活力为130,000u/ml，增加诱导表达时间，植酸酶的表达量仅缓慢增加。

实施例6：植酸酶性质测定

将底物分别配制成pH＝1.5；2.5；3.5；4.5；5.5；6.5，以pH＝5.5时的酶活单位为100％，以高密度发酵上清液测定不同pH条件下植酸酶的相对活力。结果表明该植酸酶在pH2.5-6.5之间均有酶活力，pH值为5.5-6.5时，植酸酶活性达到最高，往中性范围偏移酶活性没有明显变化(图3)。

将上清液用90℃处理不同时间，放置冰上冷却，加入酶反应底物，37℃反应30min，以未经高温处理的发酵液为参比，测定上清液中的残存酶活性。经过80min处理，植酸酶的活性仍保持40％。90℃高温处理120min，仍有部分活性。(图4)

序列表

(1)一般信息：

发明名称：在甲醇酵母中高表达的耐高温植酸酶基因

(i)序列数目：2

(2)序列SEQ ID NO1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1320bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：DNA

(ii)序列描述：SEQ NO1

tccaaatcct gcgacaccgt tgacttggga taccaatgct cccctgctac ctcccacctt     60

tggggacaat actctccatt cttctctttg gaggacgaac tttccgtttc ctccaaattg    120

ccaaaagatt gcagaatcac cttggttcaa gtcttgtcca gacacggtgc tagataccca    180

acctcctcca aatccaaaaa atacaaaaaa ctgatcactg ctatccaagc taacgctacc    240

gacttcaaag gaaaatacac tttcttgaaa acctacaact acaccttggg agctgacgac    300

ttgaccccat tcggagaaca acaacttgtc aactctggaa tcaaattcta ccaaagatac    360

aaagcacttg ctagatccgt tgttcctttc atcagagctt ctggctccga cagagttatc    420

gcttctggag aaaaattcat cgaaggattc caacaagcta aattggctga ccctggagct    480

accaacagag ctgctcctgc tatctccgtt atcatcccag aatccgaaac cttcaacaac    540

accttggacc acggtgtttg caccaaattc gaggcttctg aacttggaga cgaggtcgag    600

gctaacttca ccgctttgtt cgctcctgac atcagagcta gagctgaaaa acacttgcct    660

ggtgtcacct tgaccgacga agacgttgtt tccttgatgg atatgtgccc cttcgacacc    720

gttgctagaa cctccgacgc ttcccaactt tccccattct gccaactttt cacccacaac    780

gaatggaaaa aatacaacta cctgcagtcc ttgggaaaat actacggata cggagctgga    840

aacccattgg gaccagctca aggaatcgga ttcgccaacg aattgatcgc tagattgacc    900

agatccccag ttcaagacca cacctccact aactccacct tggtttccaa cccagctacc    960

ttcccattga acgctaccat gtacgttgac ttctcccacg acaactctat gatctccatc   1020

ttcttcgctt tgggacttta caacggaact gaaccattgt ccagaacttc cgttgaatcc   1080

gctaaagaac ttgacggata ctccgcttcc tgggttgttc cattcggtgc tagagcttac   1140

tttgaaacta tgcaatgcaa atccgaaaaa gaaccattgg ttagagtctt gattaacgac   1200

agagttgttc cattgcacgg atgcgacgtt gacaaattgg gaagatgcaa attgaacgac   1260

ttcgttaaag gattgtcttg ggctagatcc ggtggtaact ggggtgaatg cttctcctaa   1320

植酸酶结构基因组成部分，全部采用酵母偏爱密码。如精氨酸用AGA，赖氨酸采用AAA，半胱氨酸采用TGC，天冬氨酸采用AAC等等。同原始基因phyA2比较，同源序列为948，同源性为73％。

(3)序列SEQ ID NO2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：440 AA

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ NO2

SKSCDTVDLG YQCSPATSHL WGQYSPFFSL EDELSVSSKL PKDCRITLVQ VLSRHGARYP    60

TSSKSKKYKK LITAIQANAT DFKGKYTFLK TYNYTLGADD LTPFGEQQLV NSGIKFYQRY   120

KALARSVVPF IRASGSDRVI ASGEKFIEGF QQAKLADPGA TNRAAPAISV IIPESETFNN   180

TLDHGVCTKF EASELGDEVE ANFTALFAPD IRARAEKHLP GVTLTDEDVV SLMDMCPFDT   240

VARTSDASQL SPFCQLFTHN EWKKYNYLQS LGKYYGYGAG NPLGPAQGIG FANELIARLT   300

RSPVQDHTST NSTLVSNPAT FPLNATMYVD FSHDNSMISI FFALGLYNGT EPLSRTSVES   360

AKELDGYSAS WVVPFGARAY FETMQCKSEK EPLVRVLIND RVVPLHGCDV DKLGRCKLND   420

FVKGLSWARS GGNWGECFS                                                439

植酸酶氨基酸序列，构成高比活植酸酶的一级结构，多肽分子大小为50kD。该氨基酸序列与原始基因编码的氨基酸序列存在9个氨基酸差异。分子之间含有6个糖基化位点，一般在酵母中表达出84 kD糖基化分子。经糖基化的植酸酶分子形成特定的高级结构，含有植酸的结合和催化位点。

Claims (5)

1、一种如下编码的耐高温植酸酶基因：

TCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTGGGATACCAATGCTCCCCTGCTACCTCCCACCTTTGGGGACAATAC

  S  K  S  C  D  T  V  D  L  G  Y  Q  C  S  P  A  T  S  H  L  W  G  Q  Y

TCTCCATTCTTCTCTTTGGAGGACGAACTTTCCGTTTCCTCCAAATTGCCAAAAGATTGCAGAATCACCTTG

  S  P  F  F  S  L  E  D  E  L  S  V  S  S  K  L  P  K  D  C  R  I  T  L

GTTCAAGTCTTGTCCAGACACGGTGCTAGATACCCAACCTCCTCCAAATCCAAAAAATACAAAAAACTGATC

  V  Q  V  L  S  R  H  G  A  R  Y  P  T  S  S  K  S  K  K  Y  K  K  L   I

ACTGCTATCCAAGCTAACGCTACCGACTTAAAGGAAAATACACTTTCTTGAAAACCTACAACTACACCTTG

  T  A  I  Q  A  N  A  T  D  F  K  G  K   Y  T  F  L  K  T  Y  N  Y  T  L

GGAGCTGACGACTTGACCCCATTCGGAGAACAACAACTTGTCAACTCTGGAATCAAATTCTACCAAAGATAC

  G  A  D  D  L  T  P  F  G  E  Q  Q  L  V  N  S  G  I  K  F  Y  Q  R  Y

AAAGCACTTGCTAGATCCGTTGTTCCTTTCATCAGAGCTTCTGGCTCCGACAGAGTTATCGCTTCTGGAGAA

  K  A  L  A  R  S  V  V  P  F  I  R  A  S  G  S  D  R  V  I  A  S  G  E

AAATTCATCGAAGGATTCCAACAAGCTAAATTGGCTGACCCTGGAGCTACCAACAGAGCTGCTCCTGCTATC

  K  F  I  E  G  F  Q  Q  A  K  L  A  D  P  G  A  T  N  R  A  A  P  A  I

TCCGTTATCATCCCAGAATCCGAAACCTTCAACAACACCTTGGACCACGGTGTTTGCACCAAATTCGAGGCT

  S  V  I  I  P  E  S  E  T  F  N  N  T  L  D  H  G  V  C  T  K  F  E  A

TCTGAACTTGGAGACGAGGTCGAGGCTAACTTCACCGCTFTGTTCGCTCCTGACATCAGAGCTAGAGCTGAA

  S   E  L  G  D  E  V   E  A  N  F  T  A  L  F  A  P  D  I  R  A  R  A  E

AAACACTTGCCTGGTGTCACCTTGACCGACGAAGACGTTGTTTCCTTGATGGATATGTGCCCCTTCGACACC

  K  H  L  P  G  V  T  L  T  D  E  D  V  V  S  L  M  D  M  C   P  F  D  T

GTTGCTAGAACCTCCGACGCTTCCCAACTTTCCCCATTCTGCCAACTTTTCACCCACAACGAATCGAAAAAA

  V  A  R  T  S  D  A  S  Q  L  S  P  F  C  Q  L  F  T  H  N  E  W  K  K

TACAACTACCTGCAGTCCTTGGCAAAATACTACGGATACGGAGCTGGAAACCCATTGGGACCAGCTCAAGGA

  Y  N  Y  L  Q  S  L  G  K  Y  Y  G  Y  G  A  G  N  P  L  G  P  A  Q  G

ATCGGATTCGCCAACGAATTGATCGCTAGATTGACCAGATCCCCAGTTCAAGACCACACCTCCACTAACTCC

  I  G  F   A  N  E  L  I  A  R  L  T  R  S  P  V  Q  D  H  T  S  T  N  S

ACCTTGGTTTCCAACCCAGCTACCTTCCCATTGAACGCTACCATGTACGTTGACTTCTCCCACGACAACTCT

  T  L  V  S  N  P  A  T  F  P  L  N  A  T  M  Y  V  D  F  S  H  D  N  S

ATGATCTCCATCTTCTTCGCTTTGGGACTTTACAACGGAACTGAACCATTGTCCAGAACTTCCGTTGAATCC

  M   I  S  I  F  F  A  L  G  L  Y  N  G  T  E  P  L  S  R  T  S  V  E  S

GCTAAAGAACTTCACGGATACTCCGCTTCCTGGGTTGTTCCATTCGGTGCTAGAGCTTACTTTGAAACTATG

  A  K  E  L  D  G  Y  S  A  S  W  V  V  P  F  G  A  R  A  Y  F  E  T  M

CAATGCAAATCCGAAAAAGAACCATTGGTTAGAGTCTTGATTAACGACAGAGTTGTTCCATTGCACGGATGC

  Q  C  K  S  E  K  E  P  L  V  R   V  L  I  N  D  R  V  V  P  L  H  G  C

GACGTTGACAAATTGGGAAGATGCAAATTGAACGACTTCGTTAAAGGATTGTCTTGGGCTAGATCCGGTGGT

  D  V  D  K  L  G  R  C  K  L  N  D  F  V  K  G  L  S  W  A  R  S  G  G

AACTGGGGTGAATGCTTCTCCTAA

  N  W  G  E  C  F  S  -

2、根据权利要求1所述耐高温植酸酶基因，其特征在于该植酸酶含有6个糖激化位点，基因长度为1320bp，权利要求1所述植酸酶基因与已知植酸酶基因的核苷酸同源性为73％，核苷酸密码全部为酵母偏爱密码。

3、如权利要求1所述耐高温植酸酶基因制备方法为如下步骤：

a、采用连续延伸PCR合成耐高温植酸酶基因；

b、以上合成的耐高温植酸酶基因为模板，利用DNA分子重排技术对合成基因进行体外重组FphyZ1、FphyF1为引物扩增重排的植酸酶基因，回收1.4Kb重排的植酸酶基因片段，构建到原核表达载体中，电击法转入大肠杆菌菌株DH5α，获得突变体表达文库进行高比活植酸酶筛选；

c、按合成基因的两端序列设计引物，在基因5’端加入XhoI切点和信号态切割序列，引物为：FP1Z(5’-AACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAGGCTTCCAAATCCTGCGACACCGTTGAC TTG-3’)，在基因3’端加入NotI切点：引物为：FP1F(5’-AACGCGGCCGCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTAC-3’)，扩增片段克隆后，XhoI和NotI双酶切，定向插入pPIC9载体，构建成耐高温植酸酶基因的酵母表达载体pPfphy；

d、植酸酶高表达重组酵母筛选；

e、将重组酵母菌菌株高密度发酵。

4、根据权利要求3所述具有酵母表达耐高温植酸酶基因的制备方法，其特征在于构建的酵母表达载体pPfphy含有权利要求1所述耐高温植酸酶基因序列。

5、根据权利要求3所述的具有表达耐高温植酸酶基因的制备方法，其特征在于合成植酸酶基因通过体外分子重排后，采用引物为FphyZ1和FphyF1，扩增片段，BamH I和Sac I双酶切定向插入启动子和t1+2终止子之间，构建成植酸酶基因原核表达载体库。

Images