CN102399768A - 一种低温木聚糖酶ba-xyl11a及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温木聚糖酶BA-XYL11A及其基因和应用。本发明提供了一种低温木聚糖酶BA-XYL11A，其具有如SEQ IDNO.1或2所示的氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述低温木聚糖酶BA-XYL11A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的低温木聚糖酶BA-XYL11A所以在工业和农业上的应用可以节省大量的能源。本发明的低温木聚糖酶是一种性质优良的、适合于在食品、饲料工业中应用新的低温木聚糖酶。其最适pH为5.0，在pH 3-6都有较高的酶活性；在低温下有很高的催化活性，催化效率要比其它的低温木聚糖酶高，即使在0℃时仍然具有约27％的相对活性。

Description

一种低温木聚糖酶BA-XYL11A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种低温木聚糖酶BA-XYL11A及其基因和应用。

背景技术

半纤维素作为植物细胞壁的主要组分，是陆生植物中继纤维素之后含量最丰富的碳水化合物，约占植物干重的35％。其中木聚糖是半纤维素中的代表性组分，是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews.2005，29：3-23.)。但是木聚糖是一种杂聚多糖，它的主链是由吡喃木糖通过β-1，4糖苷键连接而形成的，在主链的吡喃木糖环的2号，3号和5号位有不同的取代基。这些取代基包括4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸残基、α-L-阿拉伯糖残基、O-乙酰基等，其中α-L-阿拉伯糖残基上又可与阿魏酸和香豆酸等酚酸酯化。

木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶，它能够随机地切割木聚糖主链骨架β-1，4糖苷键，最后生成木糖、寡聚木糖或带有侧链的寡聚木糖。虽然木聚糖的完全降解需要多种酶的协同作用，包括：β-D-木糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶等酶；但是在木聚糖的降解过程中，内切-1，4-β-D-木聚糖酶，也就是我们通常所说的木聚糖酶，从木聚糖的主链内部随机切割吡喃木糖残基之间的β-1，4-连接键，发挥的作用是最主要和最重要的。它们是木聚糖降解相关酶中研究最多和最有应用价值的一类酶。

木聚糖酶在多个领域有着重要的应用：作为饲料添加剂可以消除饲料里的木聚糖的抗营养作用，提高饲料的营养价值和利用率；在造纸工业上，可以用于纸浆的漂白，减少环境的污染；在食品行业上，可以用来生产功能性低聚木糖、面包发酵等；在能源上，可以用来水解木聚糖得到的木单糖发酵生产的燃料乙醇等等。此外，木聚糖酶在纺织、医药等其它行业也有广泛的应用。据报道各种微生物如细菌和真菌等都能产生木聚糖酶。但获得新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。低温木聚糖酶由于其在低温环境中具有较高的酶活，相对于中温或高温木聚糖酶有其特有的应用优势(Gerday et al.Trends Biotechnology.2000，18：103-107)。比如水产动物由于水体环境影响其肠道温度偏低，因此低温木聚糖酶更适合作为水产饲料添加剂使用以提高养殖鱼类对饲料中营养成分的吸收。同时，在食品工业中，低温木聚糖酶与果胶酶及纤维素酶同时在低温作用可有效降低果汁黏度，有效提高果汁口味。因此开发新型的低温木聚糖酶将对推动木聚糖酶在各种工业中应用。目前报道的低温木聚糖酶为第十和第八家族的木聚糖酶，而对糖苷水解酶第十一家族的木聚糖酶还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温木聚糖酶BA-XYL11A。

本发明的另一目的是提供编码上述低温木聚糖酶的基因BA-xyl11A。

本发明的另一目的是提供包含上述低温木聚糖酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述低温木聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供制备上述低温木聚糖酶的方法。

本发明的另一目的是提供上述低温木聚糖酶的应用。

本发明从Bispora antennata CBS 126.38菌株中获得了一种低温木聚糖酶BA-XYL11A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MVSFSSLIFV VAAAVGVAAA PSEVLVERGG TPSSTGTNNG FYYSFWTDGA

GDITYTNGAA                                      60

GQYNVKWSGN NGNFVGGKGW NPGSGRVINY SGTYCPNGNS

YLSIYGWTRN PLIEYYIVEN                           120

YGTYNPSSAA TKKGSITVDG SNYDILQTTR TNQPSIDGTK TFQQYWSVRT

SKRSSGSVNT                                      180

QAHFDAWAKV GMKLGTEFNY LIVATEGYFS SGSATITVS      219

其中，该酶全长219个氨基酸，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列“MVSFSSLIFV VAAAVGVAA”。

因此，成熟的低温木聚糖酶BA-XYL11A的理论分子量为21.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

APSEVLVERG GTPSSTGTNN GFYYSFWTDG AGDITYTNGA AGQYNVKWSG

NNGNFVGGKG              60

WNPGSGRVIN YSGTYCPNGN SYLSIYGWTR NPLIEYYIVE NYGTYNPSSA

ATKKGSITVD             120

GSNYDILQTT RTNQPSIDGT KTFQQYWSVR TSKRSSGSVN TQAHFDAWAK

VGMKLGTEFN              180

YLIVATEGYF SSGSATITVS    200

该木聚糖酶BA-XYL11A的最适pH为5.0，在pH 3.5-6.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的50％以上。木聚糖酶在pH 4.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在90％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。最适温度为40℃，在0-50℃间具有较高的木聚糖降解活性；在50℃处理30min，保持40％的酶活性，即使在0℃时仍然具有约27％的相对活性，这为在低温条件应用提供了可能；具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶处理能力，经过糜蛋白酶、枯草蛋白酶、胶原蛋白酶、胃蛋白酶、或胰蛋白酶处理1h后，仍能维持40％-70％的活性；同时高密度发酵酶活性高，易于工业化生产。该酶的性质非常适合在饲料食品等行业中应用。

本发明还提供了编码上述低温木聚糖酶BA-XYL11A的基因BA-xyl11A。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

atggtatcct tctcctccct catcttcgtt gtcgctgctg ccgttggggt tgctgctgcc     60

ccttctgagg tccttgtaga gcgtggtgga acacctagct caacaggaac caacaacggt    120

ttctactatt ctttctggac tgatggagct ggagatatca catataccaa tggagcagct    180

ggacaataca atgtgaaatg gtctggcaac aatggaaact ttgttggagg aaagggatgg    240

aacccaggaa gcggcaggta agaaaatccg attcactttg tcacaaattc ctataaaagc    300

aactcactaa tcttctccgc gcttcagagt catcaactac tccggcacct actgccctaa    360

tggcaatagc tacctttcca tctacggttg gaccagaaac cctcttatcg agtactacat    420

tgtcgaaaac tacggcacct acaacccttc tagtgctgct acgaagaagg gctccatcac    480

cgttgacggc tcaaactacg atattctcca gactacccgt accaaccagc cttccatcga    540

tggtaccaag acctttcagc agtactggtc tgtccgaacg agcaagcgct ccagtggatc    600

tgtcaacact caagctcatt tcgacgcatg ggccaaggtt ggaatgaagt tgggcacgga    660

attcaactac ttgatcgttg caaccgaggg atacttcagc agcggatcag caactatcac    720

cgtttcatag                                                           730

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一木聚糖酶基因BA-xyl11A，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶BA-xyl11A结构基因全长730bp，含有1个内含子，+258～328bp，为其内含子序列，cDNA长660bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示：

atggtatcct tctcctccct catcttcgtt gtcgctgctg ccgttggggt tgctgctgcc     60

ccttctgagg tccttgtaga gcgtggtgga acacctagct caacaggaac caacaacggt    120

ttctactatt ctttctggac tgatggagct ggagatatca catataccaa tggagcagct    180

ggacaataca atgtgaaatg gtctggcaac aatggaaact ttgttggagg aaagggatgg    240

aacccaggaa gcggcagagt catcaactac tccggcacct actgccctaa tggcaatagc    300

tacctttcca tctacggttg gaccagaaac cctcttatcg agtactacat tgtcgaaaac    360

tacggcacct acaacccttc tagtgctgct acgaagaagg gctccatcac cgttgacggc    420

tcaaactacg atattctcca gactacccgt accaaccagc cttccatcga tggtaccaag    480

acctttcagc agtactggtc tgtccgaacg agcaagcgct ccagtggatc tgtcaacact    540

caagctcatt tcgacgcatg ggccaaggtt ggaatgaagt tgggcacgga attcaactac    600

ttgatcgttg caaccgaggg atacttcagc agcggatcag caactatcac cgtttcatag    660

其中，信号肽的碱基序列为：

“atggtatcct tctcctccct catcttcgtt gtcgctgctg ccgttggggt tgctgct”，

因此，编码成熟木聚糖酶的基因序列如SEQ ID NO.5所示：

gccccttctg aggtccttgt agagcgtggt ggaacaccta gctcaacagg aaccaacaac     60

ggtttctact attctttctg gactgatgga gctggagata tcacatatac caatggagca    120

gctggacaat acaatgtgaa atggtctggc aacaatggaa actttgttgg aggaaaggga    180

tggaacccag gaagcggcag agtcatcaac tactccggca cctactgccc taatggcaat    240

agctaccttt ccatctacgg ttggaccaga aaccctctta tcgagtacta cattgtcgaa    300

aactacggca cctacaaccc ttctagtgct gctacgaaga agggctccat caccgttgac    360

ggctcaaact acgatattct ccagactacc cgtaccaacc agccttccat cgatggtacc    420

aagacctttc agcagtactg gtctgtccga acgagcaagc gctccagtgg atctgtcaac    480

actcaagctc atttcgacgc atgggccaag gttggaatga agttgggcac ggaattcaac    540

tacttgatcg ttgcaaccga gggatacttc agcagcggat cagcaactat caccgtttca    600

tag                                                                  603

该酶属于糖基水解酶第11家族。将木聚糖酶基因BA-xyl11A的cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，与Glomerella graminicolaM1.001(EFQ27362)来源的一个预测的内切-1，4-β-木糖苷酶具有最高的氨基酸序列一致性为71％。说明BA-xyl11A是一种新的木聚糖酶基因。

本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A的重组载体，优选为pPIC-BA-xyl11A。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-BA-xyl11A。

本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A的重组菌株，所述菌株为酵母菌、大肠杆菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/BA-xyl11A。

本发明还提供了一种制备上述低温木聚糖酶BA-XYL11A的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶BA-XYL11A表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶BA-XYL11A。

其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/BA-xyl11A。

本发明还提供了上述低温木聚糖酶BA-XYL11A的应用，优选该酶在水解木聚糖及其在食品、饲料工业中的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在食品、饲料工业中应用新的低温木聚糖酶。低温木聚糖酶在室温有非常高的活性，因其不需要外加能量供酶促反应，所以在工业和农业上的应用可以节省大量的能源。本发明的木聚糖酶最适pH为5.0，在pH 3-6都有较高的酶活性；在低温下有很高的催化活性，催化效率要比其它的低温木聚糖酶高，即使在0℃时仍然具有约27％的相对活性。在食品工业中，低温木聚糖酶与果胶酶及纤维素酶同时在低温作用可有效降低果汁黏度，有效提高果汁口味，同时在面包的发酵过程中添加低温木聚糖酶(面包发酵一般在20℃度左右)可以改善面包的品质，增加面包的口感。在饲料工业中，低温木聚糖酶可以作为水产饲料添加剂使用，降低饲料的黏度，增加营养物质的吸收。

附图说明

图1在毕赤酵母菌中表达的本发明重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1：蛋白质Marker；2：含有木聚糖酶基因的毕赤酵母菌培养上清液浓缩液；3：纯化的重组木聚糖酶；4：脱糖基后的木聚糖酶。

图2本发明重组木聚糖酶的最适pH。

图3本发明重组木聚糖酶的pH稳定性。

图4本发明重组木聚糖酶的最适温度。

图5本发明重组木聚糖酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：真菌Bispora antennata CBS 126.38，保存于荷兰真菌保藏所(CBS)其保藏号为：CBS 126.38。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)真菌Bispora antennata CBS 126.38培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH 5.0。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4))BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1真菌Bispora antennata CBS 126.38产酶特性

将Bispora antennata CBS 126.38经麦芽提取物培养基培养后，接种于诱导培养基中(0.2％MgSO₄·7H₂O，0.1％KH₂PO₄，0.1％CuSO₄·5H₂O，0.1％CaCl₂，0.5％蛋白胨，1％玉米芯粉，1％麸皮，pH 5.0)，30℃培养3～4d，测定其产纤维素酶和半纤维素酶的活性。经测定该菌为高产木聚糖酶菌株。

实施例2真菌Bispora antennata CBS 126.38木聚糖酶编码基因BA-xyl11A的克隆

提取真菌Bispora antennata CBS 126.38基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第十一家族木聚糖酶基因的保守(P-L-[I/V/A/M]-E-Y-Y和T-F-[QN]-Q-Y-W-S)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-TA[C/T][A/C]TG[A/G/T]S[A/T/G/C][C/G]T[C/G/T]TA[C/T]GG[C/G/T]TGG-3′；

P2：5′-ACCAGTA[C/T]TG[A/C/G/T]T[A/C/G/T][A/G]AA[A/C/G/T]GT-3′。

以Bispora antennata CBS 126.38总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，48℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约200bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22-30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶BA-xyl11A TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

实施例3木聚糖酶基因的RT-PCR分析

提取Bispora antennata CBS 126.38的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物(Xyl11A F：5′-ATGGTATCCTTCTCCTCCCTCATC-3′，Xyl11A R：5′-CTATGAAACGGTGATAGTTGCT-3′)扩增该单链cDNA，获得木聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

通过比较木聚糖酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有1个内含子，cDNA长660bp，编码219个氨基酸和一个终止密码子，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列。所测出的基因BA-xyl11A的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的木聚糖酶氨基酸序列最高一致性为71％，证明从Bispora antennata CBS 126.38中分离克隆得到的编码木聚糖酶的基因为新基因。

实施例4重组木聚糖酶的制备。

将毕赤酵母表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码木聚糖酶的基因BA-xyl11A双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段(不含信号肽片段，SEQ ID NO.5)与表达载体pPIC9连接，获得含有Bispora antennata CBS126.38木聚糖酶基因BA-xyl11A的重组质粒pPIC9-BA-xyl11A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/BA-xyl11A。同样，将包含有信号肽序列的木聚糖酶BA-XYL11A的cDNA(SEQ ID NO.4)通过酶切、连接方法插入已去除α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9中，获得含自身信号肽序列的编码木聚糖酶的基因BA-xyl11A的重组质粒pPIC9-BA-xyl11A-1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/BA-xyl11A-1。

挑取GS115/BA-xyl11A和GS115/BA-xyl11A-1重组菌株，分别接种于300mLBMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于100mLBMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。GS115/BA-xyl11A菌株所产重组木聚糖酶的表达量为516U/mL，相比之下，GS115/BA-xyl11A-1菌株所产重组木聚糖酶的表达量低于前者。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其目标蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上，达到电泳纯。

实施例5重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH 4.5，40℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例6重组木聚糖酶BA-XYL11A的性质测定

1、重组木聚糖酶BA-XYL11A的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中40℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图2)表明，BA-XYL11A的最适pH为5.0，在pH 3.5-6.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的40％以上。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH 5.0缓冲液体系中40℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明木聚糖酶在pH 4.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在90％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在40℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为40℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，重组酶在40℃时稳定性非常好，50℃下保温30min，剩余酶活性为39.6％，即使在0℃，仍具有约27％的相对活性。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖(4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，Sigma From birchwood)为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)缓冲液体系中，40℃下测定酶活性，计算出其在40℃下的k_m值。经测定，此木聚糖酶在40℃下以木聚糖为底物的k_m值为11.3mg/mL，最大反应速度V_max为10570.8μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对BA-XYL11A酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在40℃、pH 5.0条件下测定酶活性。结果(表2)表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组木聚糖酶的活力有一定的激活作用，但是Cu²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺有一定的抑制其活力。当Co²⁺，Cu²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺浓度为5mmol时可以部分抑制BA-XYL11A活力。β-巯基乙醇在1mmol和5mmol时能分别使重组酶活力增加到原来的1.2和1.15倍。

表2.各种化学试剂对木聚糖酶BA-XYL11A活力的影响

注：“-”代表无法检测。

5、木聚糖酶抗蛋白酶能力测定如下：

用重组的纯化蛋白BA-XYL11A(100μg/mL)分别与约150U的胰蛋白酶(pH 7.0，25℃)、10U的α-糜蛋白酶(pH 7.8，25℃)、10U的胶原蛋白酶(pH 74，37℃)、5U的枯草杆菌蛋白酶A(pH 7.5，37℃)、或胃蛋白酶(pH 2.0，37℃)中处理60min后，按标准方法在最适温度和最适pH下检测已处理酶的剩余酶活。对照酶液用配制蛋白酶液的相应缓冲液处理相同的时间，以其酶活作为对照计算相对酶活。经过各种蛋白酶处理一小时后的BA-XYL11A酶活力变化结果表明：70.7％(胰蛋白酶)，711％(α-糜蛋白酶)，66.2％(枯草杆菌溶素A)和42.6％(胃蛋白酶)；从以上结果可以看出：BA-XYL11A对这四种蛋白酶都有较好的抵抗能力。

6、重组木聚糖酶BA-XYL11A的底物特异性。

该酶可以有效地降解不同来源的木聚糖，例如桦木和榉木木聚糖，同时该酶对不可溶性木聚糖(Insoluble xylan)和羧甲基纤维素钠也具有弱的活性，但对于大麦β-葡聚糖、微晶纤维素等底物没有活性(表3)。

表3.木聚糖酶BA-XYL11A底物特异性分析

Claims (9)

1.一种低温木聚糖酶BA-XYL11A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。

2.一种低温木聚糖酶基因BA-xyl11A，其特征在于，编码权利要求1所述的木聚糖酶。

3.根据权利要求2所述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3、4或5所示。

4.包含权利要求2或3所述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pPIC9-BA-xyl11A。

6.包含权利要求2或3所述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。

8.一种制备低温木聚糖酶BA-XYL11A的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶BA-XYL11A的表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶BA-XYL11A。

9.权利要求1所述低温木聚糖酶BA-XYL11A的应用。

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