CN105969750B - 一种植酸酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种新型植酸酶突变体，属于生物技术领域。该突变体在耐温性及酶活等方面均表现出良好的特性，具有较好的应用前景。该突变体经甲醇诱导96h发酵液酶活可达28000U/mL，较原始植酸酶提高180％；植酸酶经75℃处理后存留酶活保留在90％以上；突变体耐受85℃制粒温度，存留酶活达到85％以上，适应颗粒饲料生产要求。

Description

一种植酸酶突变体及其应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植酸酶突变体及其在饲料技术领域的应用。

背景技术：

植酸酶，也称肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸或磷酸盐的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶，它实际上包括植酸酶和酸性磷酸酶两种酶。植酸酶主要应用于猪、鸡、鸭等单胃动物以及一些鱼类水产动物的饲料添加剂，使植酸或植酸盐分子释放无机磷，从而被动物利用，以缓解或消除植食性饲料中植酸的抗营养作用，以提高生物机体对矿物质元素、蛋白质及微量元素的利用率，促进其生长发育，提高动植物的生产能力，能够减少磷向环境中排量达50％之多，进而降低由于磷的富集造成的环境污染问题。

植酸酶在自然界中分布广泛，在植物、动物及微生物中都有发现，其中以来源于微生物，包括细菌、酵母菌及霉菌的植酸酶居多。产植酸酶的细菌以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌以及克雷伯菌为主。植酸酶的来源不同，它的最适温度和最适pH差异也较大，植物来源的植酸酶最适pH为4.0-7.5，因此不适合单胃畜牧类的酸性胃环境，而微生物来源的植酸酶最适pH有2个，即5.5和2.5，范围较宽，比较适合单胃动物，也因此微生物来源的植酸酶被广泛应用。通常微生物来源的植酸酶活性温度一般在45-57℃，超过65℃活性就降低超过一半。

然而，植酸酶在生产上的主要用途就是作为饲料添加剂以提高磷的利用率。饲用酶在造粒的过程中需要经过一个75-93℃的短暂高温过程，而很多植酸酶在这个过程中将会降低酶活，甚至丧失酶活。于是，选择具有高热稳定性、且能够在动物胃肠道环境中保持高活性的植酸酶作为饲料添加剂就显得尤为重要。如何选择具有种这样要求的植酸酶就成为目前植酸酶应用研究的热点。

随着基因工程和蛋白质工程的发展，人们把目光转向人为制造催化效率高、抗蛋白酶水解且热稳定性好的植酸酶。比如中国专利200810201709.2，公布了一种植酸酶突变体，该植酸酶突变体为单氨基酸位点突变体APPA-S22T，其最适pH值为4.5，比活性最高为1321U/mg蛋白质，在最适pH，突变体最高比活是野生型的3倍；中国专利201010602210.X，公开了一种在酸性范围的催化能力和比活性提高的植酸酶APPA-M及其基因和应用，突变位点为M216C和N306D，经过优化改良的植酸酶APPA-M其在酸性范围pH 2到5的催化活性得到了很大的提高，可在应用中显示出巨大的应用潜力；中国发明专利201310125275.3，利用定点突变技术对基因的关键位点进行定点突变，获得突变基因Appa-M2,该突变体耐热性能好，85℃保温10分钟，残余酶活可达到60％，在饲料和食品工业中有广泛的应用前景。

上述植酸酶的不同突变体在最适pH、温度、酶活及耐温性等方面均表现出不同的特性，本申请人在研究实验的过程中也通过突变的方法获得了一种新型植酸酶突变体，该突变体在耐温性及酶活等方面均表现出良好的特性，具有较好的应用前景。

发明内容：

在本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、植酸酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示植酸酶突变体中突变的氨基酸。如Val19Gly，表示位置19的氨基酸由原始植酸酶的Val替换成Gly，位置的编号对应于SEQ IDNo：4中植酸酶的氨基酸序列编号。同样采用“原始核苷酸位置替换的核苷酸”来表示突变的核苷酸，位置的编号对应于SEQ ID No：2中植酸酶的核苷酸序列编号。

本发明将提供一种大肠杆菌植酸酶APPA的突变体APPAm1,其编码基因APPAm1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述突变体APPAm1的表达基因appAm1基因是在原始appA基因(如序列表SEQ ID No.2所示)的基础上突变获得。

本发明还提供上述植酸酶突变体APPAm1的氨基酸序列，如SEQ ID No.3所示。与原始植酸酶(氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示)相比，突变体APPAm1在第19,43,177,187,289位发生突变，具体见下表:

氨基酸突变位点	核苷酸突变位点
		Val19 Gly	T56G
Lys43 Asn	G129T
		Leu177 Trp	T530G
Ser187 Tyr	C560A
		Tyr289 Cys	A866G

本发明提供的技术方案之二为：将上述突变体基因重新构建重组载体，并在毕赤酵母GS115中的高效表达，得到重组菌株，通过发酵、提取等技术获得新型植酸酶。

本发明提供的技术方案之三为：突变体APPAm1在饲料领域的应用。

本发明的实验步骤具体如下：

1、将突变体APPAm1的编码基因appAm1进行酶切，连接至表达载体pPIC 9K，得到重组载体；

2、将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到新型植酸酶的生产菌株GS115/pPIC9K-APPAm1；

3、以GS115/pPIC 9K-APPAm1为生产菌株发酵生产植酸酶，具体步骤如下：

1)菌株培养：菌株经过二级种子培养后，将二级种子液按5％接种量接入发酵罐中，调节温度至30℃，用氨水维持pH在5.0，加入PTMl微量盐溶液，通气搅拌培养约18-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽；

2)甘油促生长：补加初始发酵液50％甘油，持续5h；

3)甲醇诱导：用氨水调节pH至5.0，流加100％甲醇，持续96h。

有益效果：

1、本发明公布了一种全新的植酸酶突变体，该突变体具有酶活高，热稳定性好的特点。该突变体经甲醇诱导96h发酵液酶活可达28000U/mL，较原始植酸酶提高180％；

2、本发明获得的植酸酶经75℃处理后存留酶活保留在90％以上。而原始植酸酶经75℃热处理5分钟酶活存留在30％左右；85℃处理后突变体APPAm1的残余率为80％以上，而原始酶仅为12％，本发明获得的植酸酶耐温性较原始植酸酶有明显提高；

3、本发明所提供的突变体耐受85℃制粒温度，存留酶活达到85％以上，适应颗粒饲料生产要求。

说明书附图：

图1突变体APPAm1和原始植酸酶的耐温曲线。

具体实施方式：

实施例1：构建appAm1基因重组菌

1.表达载体pPIC9K-appAm1的构建

通过全基因合成技术获得SEQ ID No.1所示的appAm1基因，并将其与毕赤酵母表达载体pPIC 9K经过EcoRI和NotI双酶切，随后进行连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，选择Amp^r的阳性转化子，菌落培养后提质粒，酶切验证成功，即得到重组表达载体pPIC9K-appAm1。

2.构建重组菌株

(1)质粒DNA的线性化

在转化毕赤酵母之前，分别用SacI和SalI限制性内切酶对重组表达质粒pPIC 9K-appAm1进行线性化酶切。

(2)线性化质粒pPIC 9K-appAm1电转至毕赤酵母

①将感受态细胞与线性化质粒pPIC 9K-appAm1加入到1.5mL预冷的离心管中，吹打混匀，随后加入预冷的电转杯中；

②对转化杯冰浴10min，随后电转化；

③电击后，立即加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液于电转杯中，并将电转液转移到新的1.5mL离心管中；

④30℃静置培养1-2h，吸取毕赤酵母GS115电转液200μL涂布在MD培养基上。

(3)阳性转化子的鉴定及植酸酶高产菌株的筛选

①涂有电转液的MD平板在30℃培养2-3d；

②挑取转化子，提取酵母基因组，稀释100倍后作为模板进行PCR。另以转入空质粒pPIC 9K的毕赤酵母GS115/pPIC 9K作为对照，确定阳性转化子。

③确定阳性转化子后，先挑取在含不同浓度遗传霉素抗性平板上单菌落比较大的高遗传霉素抗性转化子，随后分别测定挑选出的转化子的植酸酶酶活，从而得到植酸酶的高产菌株GS115/pPIC 9K-appAm1。以上述同样方法制备原始基因对照菌株GS115/pPIC 9K-appA。

实施例2突变体APPAm1及原始植酸酶的制备

分别以GS115/pPIC 9K-appAm1和对照菌株GS115/pPIC 9K-appA为生产菌株进行实验：

1、培养基

(1)斜面培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母提取物1％，琼脂2％，pH5.0；121℃灭菌20min；

(2)种子培养基：葡萄糖3％，蛋白胨2％，KCl 0.05％,MgSO₄ 0.05％,MnSO₄0.03％,FeSO₄ 0.05％，pH5.0；121℃灭菌20min；

(3)发酵培养基：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母提取物1％，KCl 0.05％,MgSO₄0.05％,MnSO₄ 0.03％,FeSO₄ 0.03％，pH5.0；121℃灭菌20min；

2、植酸酶制备

1)菌株培养：新鲜斜面上挑取1环生产菌接种到50mL种子培养基中，30℃，200rpm培养18h作为一级种子液；按10％接种量接入200mL种子培养基中，30℃，200rpm培养20h得二级种子液；将二级种子液按5％接种量接入到装有5L发酵培养基的发酵罐中，调节温度至30℃，用氨水维持pH在5.0，加入PTMl(5mL/L)，通气搅拌培养约18-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；

2)甘油促生长，补加初始发酵液50％甘油(含有PTMl，10mL/L)，补料速度为20mL/L·h，持续5h；

3)甲醇诱导，用氨水调节pH至5.0，流加100％甲醇(含有PTMl，10mL/L)，流速从1mL/L·h经12hr升至4mL/L·h，持续96h。

发酵结束后，8000rpm离心20min即得粗酶液。经检测知突变体APPAm1发酵结束最终平均发酵酶活达到28000U/mL，而原始植酸酶仅为10000U/mL。

实施例3酶活及耐热性测定

酶活定义：在温度37℃、pH5.5条件下,每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1umol/L无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

酶活测定方法：GB/T 18634-2009。

1、最适pH及温度测定

将实施例2所得植酸酶粗酶液在不同pH(1-7)及不同温度(30-90℃)条件下进行酶促反应以测定其最适pH和最适温度，可知突变体APPAm1最适作用pH为4.0，最适温度为55℃。

2、热稳定性测定

热处理：将实施例2所得植酸酶粗酶液在恒温60-90℃水浴处理5min后，冰水混合物速冷待测。并以残余率，即各自热处理后的酶活与热处理前的酶活比值，表示耐热性。突变体APPAm1和原始植酸酶的耐温曲线如图1所示。

如图1所示，本发明获得的植酸酶经75℃处理后存留酶活保留在90％以上。而原始植酸酶经75℃热处理5分钟酶活存留在30％左右；85℃处理后突变体APPAm1的残余率为80％，而原始酶仅为12％，本发明获得的植酸酶耐温性较原始植酸酶有明显提高。

3、制粒后酶活

将实施例2所得粗酶液8000rpm离心40min,将上清用80％硫酸铵沉淀，离心去除上清，再用40mM pH4.5乙酸钠缓冲液溶解，使用相同缓冲液透析三天，使用阳离子树脂纯化，得到纯度98％的植酸酶，再经Hiprep26/10desalting脱去洗脱缓冲液中的氯化钠得到纯酶。

突变体APPAm1纯酶添加到饲料中，在饲料加工过程中分别取混合制粒前和制粒后样品各10个，测定酶活并计算收率。调质温度：85℃；调质时间：35s，调质蒸汽压力：0.43-0.46Mpa，水分含量：15-17％。

结果表明突变体APPAm1耐受85℃制粒温度，平均酶活存留率达到85％，适应颗粒饲料生产要求。

Claims (6)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体为APPAm1，其氨基酸序列如序列表SEQID No.3所示。

2.权利要求1所述植酸酶突变体的编码基因。

3.权利要求2所述的植酸酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因如序列表SEQ ID No.1所示。

4.权利要求1所述植酸酶突变体的用途，其特征在于，用于饲料制备领域。

5.一种包含权利要求3所述的编码基因的表达载体或宿主细胞。

6.如权利要求5所述的表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述表达载体为pPIC 9K，宿主细胞为毕赤酵母GS115。