CN105567656A - 一种植酸酶突变体及其应用 - Google Patents

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CN105567656A CN201610003132.9A CN201610003132A CN105567656A CN 105567656 A CN105567656 A CN 105567656A CN 201610003132 A CN201610003132 A CN 201610003132A CN 105567656 A CN105567656 A CN 105567656A
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苗华彪
韩楠玉
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Abstract

本发明公开了一种植酸酶突变体及其应用，植酸酶突变体的序列SEQ？ID？NO：1，该突变体是由编码无花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQ？ID？NO：3中的氨基酸发生如下改变A39E,N40D,S42L,V43S,I44V,P46S,R167G,Q169T,P170N,G171R,Q172A,T252R,S253T,T254S,V255D,D256A,T257S,K258Q而获得的；所述植酸酶突变体在饲料添加剂中的应用。本发明获得了新的植酸酶基因的突变体SEQ？ID？NO：2；突变体能有较宽的pH作用范围，具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，较好地满足饲料工业的要求。

Description

一种植酸酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种植酸酶突变体及其应用。
背景技术
植酸广泛存在于玉米、米糠、各种饼粕等饲料原料中，一方面它具有很强的抗营养作用，与饲料中金属离子和蛋白质结合，影响这些营养物质的消化与吸收；另一方面植酸分子含有大量有机磷，动物胃肠道由于缺少相应的酶，因而不能利用，这些有机磷随粪便排放到环境中，造成环境污染。植酸酶可使植酸发生水解反应，生成肌醇衍生物和正磷酸，作为单胃动物的饲料添加剂，可以促进动物对磷元素的利用，有助于畜禽生长，提高畜牧业效益，同时它还能降低植酸磷对环境的污染，并且可以提高饲料中能量与蛋白质的消化率。现在已成为饲料行业公认的有效饲料添加剂。植酸酶作为饲料添加剂在实际应用过程中需要耐受饲料高温制粒过程，因此饲用植酸酶必须耐热，而目前大多数植酸酶耐热性能较差。
无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)虽然酶比活相对高，也具有一定的耐热作用，但在实际应用上还不理想，如果能够将其耐热性增高，无花果植酸酶将具有更大的应用价值。相比之下，烟曲霉植酸酶有着更好的耐热性，但比活相对较低。因此，本发明根据烟曲霉植酸酶的序列中与其耐热性相关的氨基酸序列来改造无花果曲霉植酸酶，使其成为耐热性高的植酸酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植酸酶突变体及其应用，旨在解决无花果植酸酶的耐热性较差，在实际应用上不理想的问题。
本发明是这样实现的，通过定点突变的方法将编码无花果曲霉(黑曲霉)植酸酶氨基酸序列SEQIDNO：3中的氨基酸发生如下改变A39E,N40D,S42L,V43S,I44V,P46S,R167G,Q169T,P170N,G171R,Q172A,T252R,S253T,T254S,V255D,D256A,T257S,K258Q获得一种新的植酸酶突变体，所述植酸酶突变体的氨基酸序列SEQIDNO：1；所述植酸酶突变体的核苷酸序列SEQIDNO：2。
本发明的另一目的在于提供一种所述植酸酶突变体在饲料添加剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种如所述植酸酶突变体的获得方法，所述植酸酶突变体的获得方法包括：
原来无花果植酸酶基因连接到ppic9k载体上的重组质粒为模板，进行突变PCR扩增；PCR体系按照试剂盒说明书配制50μL；
取10μlPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。条带正确后加1μlDMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；
然后转化，加入2-5μlDMT酶消化产物于50μlDMT感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟；42℃准确热激45秒，立即置于冰上10min；加500μlLB培养基，200转，37℃培养1小时；7000rpm离心3min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜；
验证阳性克隆子，每个位点的阳性克隆送出测序，测序结果与原序列比对，找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至止突变位点全部突变掉，突变后的质粒转入毕赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)中进行表达，发酵测酶活，研究酶学及应用特性。
进一步，所述PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30S，66℃退火30S，72℃延伸3min30S，共28个循环；94℃变性30S，52℃退火30S，72℃延伸3min30S，共7个循环；72℃扩增后延伸10min；其中从66℃到52℃每个循环温度下降0.5℃。
进一步，所述植酸酶突变体的酶促反应最适pH值为6.0；最适温度为50℃；在pH2、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在60％左右，在pH5、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在90％以上。植酸酶在70℃耐受5min、80℃时耐受3min、高温90℃时耐受1min,残活都在80％以上。
本发明提供的植酸酶突变体及其应用，通过分析具有更好的耐热性烟曲霉植酸酶分子结构特征，使用烟曲霉植酸酶的部分序列来替代无花果曲霉植酸酶氨基酸序列,无花果曲霉(黑曲霉)植酸酶氨基酸序列SEQIDNO：3中的氨基酸发生如下改变A39E,N40D,S42L,V43S,I44V,P46S,R167G,Q169T,P170N,G171R,Q172A,T252R,S253T,T254S,V255D,D256A,T257S,K258Q。具体方案为以无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)作为模版，使无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因发生突变，获得了新的植酸酶基因的突变体SEQIDNO：2，该突变后的基因除与PPIC9K构建重组质粒外，还可以与PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C等表达载体构建重组质粒，转化相应宿主菌(毕赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)，通过在平板上加入植酸钙或在平板中加入G418、Zeocin等抗生素，筛选获得植酸酶突变体基因工程菌，然后通过发酵获得新的植酸酶突变体。使其成为耐热性高的植酸酶，该植酸酶突变体在高温下，植酸酶的温度耐受情况如图5-图7所示，无论在任何温度和时间下，突变后的相对酶活都高于突变前的，在70℃耐受1小时突变植酸酶相对酶活大约还有50％，而突变之前无花果植酸酶仅仅剩余30％。在80℃时突变后相对酶活剩余一半时的时间大约为30min，而突变前耐受15min就达到半衰期了。高温90℃时耐受20min突变后相对酶活还剩余接近40％，而突变前植酸酶仅仅剩余25％，总之突变后与突变前相比耐受相对酶活提高了15％左右；同时植酸酶突变体较原无花果曲霉植酸酶具有更宽的作用pH，相对突变前无花果植酸酶，突变后的酶的最适pH提高了0.5个单位，并且在中性环境下pH7.0相对酶活剩余接近50％左右，与突变之前有改进。该突变体能在中性环境中很好发生作用，并且具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，因此特别适合于作为水产饲料添加剂。
附图说明
图1是本发明实施例提供的植酸酶突变体的获得方法流程图。
图2是本发明实施例提供的最适pH的测定曲线图。
图3是本发明实施例提供的最适温度曲线图。
图4是本发明实施例提供的pH耐受曲线图。
图5是本发明实施例提供的70℃耐受曲线图。
图6是本发明实施例提供的80℃耐受曲线图。
图7是本发明实施例提供的90℃耐受曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明通过计算机辅助手段比对耐热性高的烟曲霉植酸酶与无花果曲霉植酸酶的序列以及结构，根据影响烟曲霉植酸酶耐热性的氨基酸序列来替代无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)相应位置的氨基酸序列。无花果曲霉(黑曲霉)植酸酶氨基酸序列SEQIDNO：3中的氨基酸发生如下改变A39E,N40D,S42L,V43S,I44V,P46S,R167G,Q169T,P170N,G171R,Q172A,T252R,S253T,T254S,V255D,D256A,T257S,K258Q。具体实施方案为以无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因为模板，通过基因的定点突变方法，使无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因发生突变，获得了新的植酸酶基因的突变体SEQIDNO：2，将该突变基因与PPIC9K或PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C、PPINKHc\Lc相连构建重组质粒，转入毕赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)中进行表达，发酵可以获得该植酸酶突变体。该突变体能在中性环境中很好发生作用，并且具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，因此特别适合于水产饲料添加剂。
本发明实施例的植酸酶突变后的突变体的氨基酸序列SEQIDNO：1；突变后无花果曲霉植酸酶核苷酸序列SEQIDNO：2。
如图1所示，本发明实施例的植酸酶突变体的获得方法包括以下步骤：
S101：无花果植酸酶基因连接到ppic9k载体上的重组质粒为模板，进行突变PCR扩增；PCR体系按照试剂盒说明书配制50μL；
S102：取10μlPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。条带正确后加1μlDMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；
S103：然后转化，加入2-5μlDMT酶消化产物于50μlDMT感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟；42℃准确热激45秒，立即置于冰上10min；加500μlLB培养基，200转，37℃培养1小时；7000rpm离心3min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜；
S104：验证阳性克隆子，每个位点的阳性克隆送出测序(华大基因公司)，测序结果与原序列比对，找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至止突变位点全部突变掉，突变后的质粒转入酵母表达，发酵测酶活。
PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30S，66℃退火30S，72℃延伸3min30S，共28个循环；94℃变性30S，52℃退火30S，72℃延伸3min30S，共7个循环；72℃扩增后延伸10min；其中从66℃到52℃每个循环温度下降0.5℃。
下面结合试验对本发明的应用原理作详细的描述。
酶活定义：样品在温度为37℃、pH5.50条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个酶活性单位，以U表示(GB/T18634-2009)。
1、试验材料和试剂
菌株及载体：大肠杆菌EscherichiacoliDMT感受态购于北京全式金生物技术有限公司，表达载体PPIC9K或PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C、PPINKHc\Lc等及毕赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)(来源于INVITROGEN公司)。
2、酶类及其他生化试剂
DNA聚合酶,核酸酶内切酶和dNTP购自TaKaRa公司；植酸钠购自Sigma公司；FastMutagenesisSystem试剂盒购自TRANSGENBIOTECH公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
培养基：
LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
YEPD培养基：Peptone20g，Yeastextract10g，glucose20g(单灭)，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
酵母发酵培养基FA和FB购自INVITROGEN公司
3、植酸酶突变体的构建
以表1的序列为引物，无花果植酸酶基因连接到ppic9k载体上的重组质粒为模板，进行突变PCR扩增。PCR体系按照试剂盒说明书配制50μL，PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30S，66℃退火30S，72℃延伸3min30S，共28个循环；94℃变性30S，52℃退火30S，72℃延伸3min30S，共7个循环；72℃扩增后延伸10min；其中从66℃到52℃每个循环温度下降0.5℃。取10μlPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。条带正确后加1μlDMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h。然后转化。转化步骤为：a.加入2-5μlDMT酶消化产物于50μlDMT感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟；b.42℃准确热激45秒，立即置于冰上10min；c.加500μlLB培养基，200转，37℃培养1小时；d.7000rpm离心3min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜。验证阳性克隆子，每个位点的阳性克隆送出测序，测序结果与原序列比对，找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至止突变位点全部突变掉。突变后的质粒转入毕赤酵母GS115表达，发酵测酶活。
其它毕赤酵母表达载体构建及毕赤酵母转化、筛选与发酵按相应的毕赤酵母载体与宿主菌株说明书(来源于INVITROGEN公司)进行。
表1、无花果曲霉植酸酶基因突变所用引物
4、植酸酶酶学性质的测定法
4.1、仪器与设备
恒温水浴锅、紫外分光光度计、恒温培养振荡器、pH仪比色皿等。
4.2、实验材料
4.2.1、酶液
突变植酸酶菌株发酵酶液(突变)、原模板植酸酶菌株发酵酶液(无花果)
4.2.2、溶液配制
4.2.2.1、缓冲液：具体参见2002年黄培德译分子克隆实验指南第三版
0.25mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH1.5-3.0)
0.25mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.5-6.5)
0.25mol/LTris-Hcl缓冲液(pH7.0-9.0)
4.2.2.2、底物溶液：5mmol/L植酸钠溶液
称取0.495g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100ml容量瓶中，用缓冲液定容至100ml，现用现配。配好后不要使底物溶液受热，否则将影响测试结果。
4.2.2.3、100g/L钼酸铵溶液
取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7024·4H2O]于100ml容量瓶中，加入1ml氨水(25％)，用双蒸水定容至100ml。
4.2.2.4、硝酸溶液
将浓硝酸与双蒸水以1:2的比率配制
4.2.2.5、2.35g/L偏钒酸铵溶液
取0.235g偏钒酸铵(NH4VO3)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(4.1.2.1.5)，用双蒸水定容至100ml。避光下可以保存一周。
4.2.2.6、颜色终止液配制
将钼酸铵溶液(4.1.2.1.4)、偏钒酸铵溶液(4.1.2.1.6)与硝酸溶液(4.1.2.1.5)以1:1:2的比率配制到相应的用量，要缓慢加入硝酸溶液，终止液中不要有白色沉淀。注意终止液现用现配。
4.3、酶活测定方法
取10ml试管，加入1.8ml缓冲液(4.1.2.1.1)，加入0.2ml待测酶液，混合后预热5分钟，依次加入底物(4.1.2.1.3)，加入底物时间间隔一致，混合后反应30分钟，之后依次加入终止液(4.1.2.1.7)，加入时间间隔和加入底物的时间间隔一致，混合后，冷却10min在415nm波长下测定吸光值。如果有沉淀应先离心再测吸光值。对照组为先加入终止液后冷却至室温再加入底物溶液。实验为一个对照组，三个平行试验。
4.4、植酸酶pH适性和温度适性的测定
4.4.1、植酸酶pH最适性测定
将缓冲液(4.2.2.1)调成不同pH：2、3、4、5、6、7、8，9甘氨酸-盐酸(1.5-3.0)乙酸-乙酸钠(3.5-6.5)Tris-Hcl(7.0-9.0)不同pH的缓冲液溶解底物成不同pH，将酶液稀释到合适的倍数，依照4.3的试验方法在37℃测出最适pH，之后在最大值两侧补半点继续检测最适pH值(例如最适pH为5，则再取pH4、pH4.5、pH5、pH5.5和pH6按照4.3的方法检测)。
4.4.2、植酸酶温度最适性的测定
依照4.3的方法测定，在上述最适pH的条件下，将反应物放在不同温度下反应：10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，测出最适温度后，在最大值两侧补半点(例如最适温度是40℃，则补充30℃、35℃、40℃、45℃、50℃按照4.3的方法检测)。
4.4.3、植酸酶pH耐受测定
将缓冲液(4.2.2.1)调节到不同pH：2、3、4、5、6、7、8，用这些不同pH的缓冲液稀释酶液，从放入酶液之时开始计时，稀释好的酶液放入37℃水浴锅中耐受1小时放在冰上，之后立马按照4.3的方法在最适pH和最适温度下进行反应。对照组的酶液是未耐受过的酶液。
4.4.4、植酸酶温度耐受测定
将酶液稀释到相应倍数，然后放入不同温度：70℃、80℃、90℃耐受1min、3min、5min、10min、15min、20min、30min、60min。之后按照4.3的方法在最适pH和最适温度下反应。对照实验组酶液是未温度耐受过的酶液。
5、结果与分析
5.1、无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因突变，按上实验方法进行突变后送华大基因公司测序，结果如SEQIDNO：2，对应植酸酶氨基酸序列如SEQIDNO：1，转化的酵母菌株具有植酸酶活性，选取一株发酵酶活性单位高的菌株进行发酵获得酶液进行酶学性质测定。
5.2、植酸酶最适pH测定
植酸酶酶促反应最适pH值结果如图2所示。突变体与无花果植酸酶最适pH分别为6.0、5.5；并且在2.5都有一个峰值，相对突变前无花果植酸酶，突变后的酶的最适pH提高了0.5个单位，并且在中性环境下pH7.0剩余接近50％左右相对酶活，与突变之前有改进。
5.3、植酸酶最适温度测定
植酸酶酶促反应最适温度值如图3所示，突变和无花果植酸酶最适温度为50℃；突变前后二者差异不明显。
5.4、植酸酶酶促反应中pH耐受
由图4可知，两种植酸酶的pH耐受曲线趋势是相同的，在pH2～pH9之间37℃耐受1小时相对酶活并没有太大变化，基本维持在60％以上。
5.5、植酸酶温度耐受
高温下植酸酶的温度耐受情况如图5-图7所示，随着温度的升高，相对酶活不断降低，随着时间的增加，相对酶活也逐渐降低。无论在任何温度和时间下，突变后的相对酶活都高于突变前的，在70℃耐受1小时突变植酸酶相对酶活大约还有50％，而突变之前无花果植酸酶仅仅剩余30％。在80℃时突变后相对酶活剩余一半时的时间大约为耐受30min而突变前耐受15min就达到半衰期了。高温90℃时耐受20min突变后相对酶活还剩余接近40％，突变前仅仅剩余25％，总之突变后与突变前相比对热耐受相对提高了15％左右。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述植酸酶突变体的氨基酸序列SEQIDNO：1,是由编码无花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQIDNO：3中的氨基酸发生如下改变A39E,N40D,S42L,V43S,I44V,P46S,R167G,Q169T,P170N,G171R,Q172A,T252R,S253T,T254S,V255D,D256A,T257S,K258Q而获得的；所述植酸酶突变体的核苷酸序列SEQIDNO：2。
2.一种如权利要求1所述植酸酶突变体在饲料添加剂中的应用。
3.一种如权利要求1所述植酸酶突变体的获得方法，其特征在于，所述植酸酶突变体的获得方法包括：
无花果植酸酶基因连接到ppic9k载体上的重组质粒为模板，分别设计下列引物进行突变PCR扩增；PCR体系按照试剂盒说明书配制50μL；
取10μlPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测，条带正确后加1μlDMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；
然后转化，加入2-5μlDMT酶消化产物于50μlDMT感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟；42℃准确热激45秒，立即置于冰上10min；加500μlLB培养基，200转，37℃培养1小时；7000rpm离心3min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜；
验证阳性克隆子，每个位点的阳性克隆送出测序，测序结果与原序列比对，找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至止突变位点全部突变掉，突变后的质粒转入毕赤酵母GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK中进行表达，发酵测酶活，研究酶学及应用特性。
4.如权利要求3所述的植酸酶突变体基因工程菌的获得方法，其特征在于，所述植酸酶基因突变体与PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C、PICHIAPINK-Hc、PICHIAPINK-Lc的表达载体构建重组质粒，转化相应宿主菌GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK中，通过在平板上加入植酸钙或在平板中加入G418、Zeocin抗生素，筛选获得植酸酶突变体基因工程菌，然后通过发酵获得新的植酸酶突变体。
5.如权利要求3所述的植酸酶突变体酶学特性是，其特征在于，所述植酸酶突变体的酶促反应pH值为6.0；温度为50℃；在pH2、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在60％，在pH5、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在90％以上；植酸酶在70℃耐受5min、80℃时耐受3min、高温90℃时耐受1min，残活都在80％以上。
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