CN106011102B - 植酸酶突变体YkAPPA-L396V、YeAPPA-L396V及其编码基因和应用 - Google Patents

植酸酶突变体YkAPPA-L396V、YeAPPA-L396V及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及植酸酶突变体YkAPPA‑L396V、YeAPPA‑L396V及其编码基因和应用。通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1或3所示的植酸酶的第396位亮氨酸突变为缬氨酸而获得。相比于野生型，本发明的两个植酸酶突变体YkAPPA‑L396V和YeAPPA‑L396V的胃蛋白酶抗性和明显提高，有利于饲料酶开发和应用。

Description

植酸酶突变体YkAPPA-L396V、YeAPPA-L396V及其编码基因和 应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及植酸酶突变体YkAPPA-L396V、 YeAPPA-L396V及其编码基因和应用。
背景技术
植酸磷是植物性饲料中磷的最普遍的储存形式，因单胃动物体内缺乏水解植酸及其盐的植酸酶而难以吸收，因此造成了严重的环境污染。此外，矿物铁和蛋白质通常与植酸形成不溶性复合物而无法被吸收。因此，通过植酸酶将植酸矿物化是单胃动物生产中提高营养元素的生物利用率，降低生产成本和保护环境的有效策略。
从1907年发现第一个植酸酶后，目前在细菌，真菌，植物，和一些动物已鉴定了众多的植酸酶。根据催化机理，植酸酶是分为四大类：组氨酸酸性磷酸酶(HAP)、半胱胺酸磷酸酶(CP)，紫色酸性磷酸酶(PAP)，和β-螺旋桨植酸酶(BP)。大多数微生物植酸酶属于HAP家庭，是目前研究和商业应用最广泛的植酸酶。目前发现的 HAP植酸酶一般在pH 1.3-5.5和45-70℃具有最高活性，消化系统中强酸和高浓度蛋白酶却常常会降低其生物功能活性。
抗蛋白酶消化是植酸酶作为饲料添加剂的一个先决条件。植酸酶的敏感性与暴露的蛋白酶切割位点及其侧链结构有关，因此改变植酸酶蛋白上胃蛋白酶切割位点的结构可能有助于提高胃蛋白酶的稳定性。本发明应用定点突变技术改造植酸酶，分别获得植酸酶突变体YkAPPA-L396V和YeAPPA-L396V，其胃蛋白酶抗性明显提高，扩大了其在工业上的应用。
发明内容
本发明的目的是通过定点突变的方法对植酸酶进行改造，使改造后的植酸酶突变体YkAPPA-L396V或YeAPPA-L396V在胃蛋白酶抗性上性质更加优良。
本发明另一目的是提供编码上述植酸酶突变体YkAPPA-L396V或 YeAPPA-L396V的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述植酸酶突变体YkAPPA-L396V或 YeAPPA-L396V编码基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述植酸酶突变体YkAPPA-L396V或 YeAPPA-L396V编码基因的重组菌株。
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如前所述的植酸酶突变体 YkAPPA-L396V或YeAPPA-L396V的基因或如前所述的重组载体。
本发明对克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)来源植酸酶YkAPPA或小肠结膜炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)来源植酸酶YeAPPA基因进行点突变，该植酸酶的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.4，所示的核苷酸序列编码的。
SEQ ID NO.1
MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLM NDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIY VQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPE KTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATF AANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLL SLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLG GHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFY QTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
SEQ ID NO.2
Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcac aatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatg atgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatggg cgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgtt gaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgattt gaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcac cttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaaggga caaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgt cgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaacccct tatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactg ccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattg gcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacg ctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaa ttgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaag tgatcgagccagcctgccatatttaa
SEQ ID NO.3
MSVAKRNLHLSALTLIMGCFTAGAAPIATPPASYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQL MNDVTPDKWPLWPVKAGYLTPRRAELVTLMGGFYGDYFRSQGLLSAGCPVDGS VYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKVDPLFHTVEAGVCKLD SAKTHQAVEERLGGPLSDLSQRYAKPFAQMGEVLNFAASPYCKSLQKNGKTCDFATFTANEIKVNEEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQDSQAMPDVAWHRLSGEENWVS LLSLRNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFL GGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMF YQTMDQLRNAEKLDMKNNPAKIVPITIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPA CHI.
SEQ ID NO.4
Atgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacac cgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaat gatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggg gggattttatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgtt gaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgattt gaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaactggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatc gccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattaaggtaaacgaagaaggt actaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgt ggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccc cgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaac actgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaa ttggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagc gctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaattagatatgaaaaacaacccagctaaa attgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaag tgatcgagccagcctgccatatttaa
采用定点突变的方法，获得了2个提高胃蛋白酶抗性的突变体，分别命名为YkAPPA-L396V和YeAPPA-L396V，即YkAPPA或YeAPPA的第396位的亮氨酸突变为缬氨酸。
因此根据本发明的胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体YkAPPA-L396V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示
SEQ ID NO.5
MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLM NDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIY VQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPE KTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATF AANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLL SLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLG GHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFY QTMEQLRNADKVDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
突变体YeAPPA-L396V的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示
MSVAKRNLHLSALTLIMGCFTAGAAPIATPPASYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQL MNDVTPDKWPLWPVKAGYLTPRRAELVTLMGGFYGDYFRSQGLLSAGCPVDGS VYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKVDPLFHTVEAGVCKLD SAKTHQAVEERLGGPLSDLSQRYAKPFAQMGEVLNFAASPYCKSLQKNGKTCDFATFTANEIKVNEEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQDSQAMPDVAWHRLSGEENWVS LLSLRNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFL GGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMF YQTMDQLRNAEKVDMKNNPAKIVPITIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPA CHI.
本发明还提供了编码上述胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体YkAPPA-L396V和YeAPPA-L396V的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7和8所示。
SEQ ID NO.7
Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcac aatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatg atgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatggg cgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgtt gaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgattt gaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgGtgaatttttcggcctca ccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaaggg acaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatg tcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaacccc ttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacact gccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaatt ggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaac gctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaaga attgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaa gtgatcgagccagcctgccatatttaa
SEQ ID NO.8
Atgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacac cgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaat gatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggg gggattttatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgtt gaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgattt gaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaactggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatc gccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattaaggtaaacgaagaaggt actaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgt ggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccc cgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaac actgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaa ttggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagc gctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaaGtagatatgaaaaacaacccagctaa aattgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaa gtgatcgagccagcctgccatatttaa
将上述编码胃蛋白酶抗性提高的突变酶YkAPPA-L396V或YeAPPA-L396V的阅读框插入到所述载体的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明优选的载体为pET-22b(+)，得到突变体的重组原核表达质粒。本发明优选的宿主菌为BL21(DE3)。所述植酸酶突变体的核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控。相比于野生型，本发明的两个植酸酶突变体 YkAPPA-L396V和YeAPPA-L396V的胃蛋白酶抗性和明显提高，有利于饲料酶开发和应用。
附图说明
图1为改造前后的植酸酶的蛋白酶抗性比较；
图2为改造前后的植酸酶的耐酸性比较。
具体实施方式
实验材料
原核表达载体pET-22b(+)购自Novagen公司。大肠杆菌BL21(DE3)细胞、 Pfu DNA聚合酶、限制性内切酶和连接酶购自天根公司。植酸钠和蛋白酶购自Sigma 公司，其它都为国产试剂，均可从普通生化试剂公司购买得到。大肠杆菌培养基LB 的组份为1％蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％NaCI(pH7.O)。
实施例1：突变基因的获得
采用Overlap PCR方法产生YkAPPA和YeAPPA的突变体YkAPPA-L396V和 YeAPPA-L396V。该方法以含有野生植酸酶基因的重组质粒pEASY-T3-YkAPPA和 pEASY-T3-YeAPPA为模板，通过两轮PCR反应引入突变。扩增突变基因完整编码序列的上下游引物带有EcoR I和Not I识别序列，分别为YkAPPA Forward： 5’-cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3’和YkAPPA Reverse： 5’-gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcG-3’；YeAPPA Forward：5’ -cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3’和YeAPPA Reverse：5’ -gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcg-3’。在特定位置引入突变的上下游引物为 YkAPPA-L396V Forward:5’-AGGTGGTGAATTTTTCGGCCTCACCTTA-3’, YkAPPA-L396V Reverse:5’-TAAGGTGAGGCCGAAAAATTCACCACCT-3’, YkAPPA-L396A Forward:5’-CAATGCAGATAAGGCAGATTTGAAAAAc-3’, YkAPPA-L396A Reverese:5’-GTTTTTCAAATCTGCCTTATCTGCATTG-3’, YeAPPA-L396V Forward:5’-TGCCGAGAAAGTAGATATGAAAAACAAC-3’, YeAPPA-L396V Reverese:5’-GTTGTTTTTCATATCTACTTTCTCGGCA-3’。所需的突变基因连接到pEASY-T3载体上并经测序证实。酶切位点用斜体标出。突变核苷酸用下划线标出。
实施例2：突变植酸酶与野生酶在细菌中表达与纯化
除去信号肽序列的野生酶和突变酶，插入到表达载体pET-22b(+)上并转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，经终浓度为2mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-半乳糖苷)诱导表达植酸酶。粗酶液经Ni-NTA(镍-次氮基三乙酸)柱和DEAE(二乙基氨基乙基)柱进行纯化。经纯化后的野生酶和突变酶在SDS-PAGE电泳时均表现为一条约46kDa的特异性蛋白条带(数据未显示)。
实施例3：突变植酸酶与野生酶的蛋白酶抗性比较
野生酶YkAPPA和YeAPPA与突变酶YkAPPA-L396V和YeAPPA-L396V分别用不同浓度的胃蛋白酶(pH2)和胰蛋白酶(pH7)在37℃下处理2h后，分析处理样品中的剩余酶活，研究蛋白酶对植酸酶活性的影响。蛋白酶和植酸酶比例在1/1000到1 /20之间。植酸酶活性使用硫酸亚铁钼蓝法测定。以1.5mmol/L植酸钠为底物，在 37℃下反应30min，用TCA终止反应，再用显色液(1％四水合钼酸铵，3.2％浓硫酸，7.32％硫酸亚铁)进行显色。对照是在加酶液之前先加入TCA混匀使酶变性，其它相同。根据显色后的700nm光吸收计算酶活。
突变酶YkAPPA-L396V和YeAPPA-L396V的胰蛋白酶抗性分别与野生酶 YkAPPA和YeAPPA类似，当胰蛋白酶处理浓度从1/1000上升至1/20时，突变体 YKAPPA-L396V的酶活基本不变，野生酶YkAPPA可保持一半以上酶活(图1)。
突变酶YkAPPA-L396V和YeAPPA-L396V的胃蛋白酶抗性明显高于野生酶(图 1)。在1/1000至1/20的胃蛋白浓度下，突变酶YkAPPA-L396V可保持16.8％和10.8％以上酶活，而野生酶YkAPPA几乎完全失去活性。当胃蛋白浓度为1/1000和1/500 时，突变酶YeAPPA-L396V分别保持16.5％和12.9％以上酶活，而野生酶YeAPPA 则完全失活。因此植酸酶YkAPPA和YeAPPA的第396位亮氨酸在蛋白酶切割中起重要作用。
实施例4：突变植酸酶与野生酶的耐酸性比较
野生酶和突变酶在pH 1-4下37℃处理2h，研究酶的酸稳定性。突变酶 YkAPPA-L396V与YeAPPA-L396V在pH1.5-3下的稳定性明显高于野生酶(图2)。在pH1.5-3下，突变酶YkAPPA-L396V保持81.9％以上的酶活，而野生酶YkAPPA 只保持68.5％的酶活性。在pH1.5-3下，突变酶YeAPPA-L162V可保持7.4％的酶活，而野生酶YeAPPA则完全失去活性。
实施例5：突变植酸酶与野生酶的酶学性质比较
野生酶和突变酶在不同pH(1-12)和不同温度(30-80℃)下反应30min，确定最适pH和最适温度。酶在pH 1-9下37℃处理1h，研究其pH稳定性。在60℃下将酶液分别处理0，2，5，10，20，30，60min后进行测定热稳定性。所用的缓冲液为：0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，pH1-3；0.1mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液，pH 3-6； 0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液，pH 6-8；0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 8-12。
突变酶YkAPPA-L396V与野生酶的酶学性质比较如表1。突变酶YkAPPA-L396V 的最适pH和最适温度相似，分别是pH4.5和55℃。突变酶YkAPPA-L396V在60℃下30min的热稳定性与野生酶相似,可保持16.4％的酶活。突变酶YkAPPA-L396V在 pH 2-10下处理1h后，保持与野生酶相似的酶活。突变酶YkAPPA-L396V在pH 1 下处理1h具有较好的耐酸性，可保持80.3％的酶活，而野生酶YkAPPA只保持63.7％的酶活。
突变酶YeAPPA-L396V与野生酶的酶学性质比较如表1。突变酶YeAPPA-L396V 的最适pH和最适温度与野生酶相似，分别是pH 5和45℃。突变酶YeAPPA-L396V 在60℃下处理30min的热稳定性与野生酶相似。突变酶YeAPPA-L396V在pH3-9下处理2h与野生酶保持相似的稳定性；在pH 2下处理2h较野生酶具有更好的耐酸性，可保持40.2％的酶活，而野生酶YeAPPA只保持18.4％的酶活。
表1改造前后的植酸酶的酶学性质比较
。

Claims (9)

1.植酸酶YkAPPA突变体YkAPPA-L396V，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第396位亮氨酸突变为缬氨酸而获得。
2.植酸酶YeAPPA突变体YeAPPA-L396V，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的植酸酶的第396位亮氨酸突变为缬氨酸而获得。
3.植酸酶突变体基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的植酸酶YkAPPA突变体YkAPPA-L396V或权利要求2所述的植酸酶YeAPPA突变体YeAPPA-L396V。
4.根据权利要求3所述的植酸酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
5.包含权利要求3所述的植酸酶突变体基因的重组载体。
6.包含权利要求3所述的植酸酶突变体基因的重组菌株。
7.一种制备稳定性改良的植酸酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)用权利要求5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组的植酸酶基因表达；以及
3)回收并纯化所表达的植酸酶突变体YkAPPA-L396V或植酸酶突变体YeAPPA-L396V。
8.权利要求1所述的植酸酶突变体YkAPPA-L396V的应用。
9.权利要求2所述的植酸酶突变体YeAPPA-L396V的应用。
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