CN101724611B - 酸性植酸酶appa,其突变体及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种来源于细菌Yersiniafrederiksenii的植酸酶APPA及其基因、该植酸酶的单氨基酸位点突变体APPA-S22T及其编码基因，以及包含该基因的重组载体和应用。本发明提供了一种新植酸酶APPA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述植酸酶的基因appa。本发明获得一种植酸酶，其最适pH值为2.5，其适应饲喂动物胃肠道环境的能力优于目前应用的植酸酶。本发明还获得该植酸酶的单氨基酸位点突变体APPA-S22T，其最适pH值变为4.5，且其比活、pH稳定性和热稳定性都有所提高，这些性质使其在饲料中具有更广泛的应用和更高的应用价值。

Description

酸性植酸酶APPA,其突变体及其制备

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植酸酶APPA，其单氨基酸位点突变体，编码该酶和突变体的基因、及包含这些基因的重组载体和应用。

背景技术

磷是一种所有动物生长都需要的重要矿物质。在动物日粮中提供充足的磷是非常重要的。长期磷缺乏会导致生长动物的佝偻病和成年动物的骨质疏松症，从而影响动物的生长性能。目前在动物饲料中添加无机磷如磷酸氢钙来满足动物对磷的需求。但是在主要以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷，只不过是因为它们主要以动物不能利用的植酸磷的形式存在而已。

植酸磷是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1—5％，它占植物中总磷的60—80％。但是，以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用，其利用率仅在0—40％。植酸磷不能被动物有效利用，从而在饲喂过程中造成了许多问题，第一、造成磷源浪费，一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中额外添加无机磷，提高了饲料成本。在实际生产中，添加无机磷时还常因无机磷中残留有氟、重金属等元素而造成动物中毒。第二、形成高磷粪便而污染环境，饲料中85％左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的磷使水和土壤受到严重污染。因此，防止磷对环境的污染更具有特殊的意义。第三、植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物肠胃道的消化吸收过程中会与多种金属离子Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，从而降低了动物对这些营养元素的有效利用。

植酸酶(EC.3.1.3.8)是一种能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷酸。植酸酶广泛存在于微生物中，如枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、酵母及曲霉等。

植酸酶的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷排泄量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此对提高畜牧业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。

尽管植酸酶的种类和性质多种多样，但是却没有一个真正理想的可用于生产实践的野生型植酸酶。理论上所谓“理想的”的植酸酶必须具备几个条件：催化效率高、抗蛋白酶水解、很好的热稳定性并且必须价格便宜等。事实上，这种十全十美的植酸酶是根本不存在的。这种植酸酶虽然不可能从自然界中找到，但是随着基因工程和蛋白质工程的发展，现在人们把目光转向人为的制造出这种“理想的”植酸酶。并且通过基因操作，已经成功地实现了植酸酶的一个或多个性质得到改善和提高。基于对不同植酸酶晶体结构的研究，利用点突变的方法对植酸酶进行改造，来提高A.fumigatus植酸酶的比活(Tomschy et al.2000)，提高E.coli植酸酶的热稳定性(Rodriguez et al.2000)，提高A.niger植酸酶的pH作用范围(Mullaney et al.2002)。

随着饲料工业的发展，新型植酸酶已经成为饲料添加剂和酶制剂研究的热点。重点的研究方向之一就是通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达植酸酶基因，可望达到大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用于动物饲喂的新型植酸酶。

本发明的目的之一是提供一种植酸酶APPA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的还在于提供一种核酸分子，其编码权利要求1所述的植酸酶APPA。实施方式之一中，所述酸分子的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的还在于提供一种植酸酶的单氨基酸位点突变体，其是由植酸酶APPA氨基酸序列第22位单位点突变形成的。实施方式之一中，所述氨基酸序列第22位处的氨基酸突变为苏氨酸(图6)。另一实施方式中，所述氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

本发明的目的还在于提供一种核酸分子，其编码本发明的植酸酶突变体。实施方式之一中，所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种核酸分子构建物，其在本发明植酸酶APPA或植酸酶突变体的编码序列之外还包含其它利于其表达和/或分泌的功能元件，此类元件是本领域技术人员所熟知的，例如信号肽、终止密码子等。例如，信号肽序列可如图6a和6b中划线部分所示，终止密码子可以是例如taa、tga、tag等常用终止密码子。例如，本发明核酸分子构建物的序列可以如SEQ ID NO.5(图6a)或SEQ IDNO：6(图6b)所示，其中，前87个核苷酸为信号肽的编码序列，最后的taa为终止密码子。

本发明的目的还在于包含本发明各种核酸分子或核酸分子构建物的载体和菌株。实施方式之一中，所述菌株为大肠杆菌。

本发明的目的还在于提供一种制备植酸酶APPA或其突变体的方法，所述方法包括以下步骤：

1)用一种或多种含有本发明所述核酸分子的载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的植酸酶或其突变体。

实施方式之一中，本发明获得一种植酸酶，其最适pH值为2.5，其适应饲喂动物胃肠道环境的能力优于目前应用的植酸酶。且其单氨基酸位点突变体APPA-S22T，其最适pH值变为4.5，其比活、pH稳定性和热稳定性都有所提高，这些性质使其在饲料中具有更广泛的应用和更高的应用价值。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达并纯化的重组植酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质标记物(Marker)；WT：纯化的重组植酸酶APPA；S22T：纯化的重组植酸酶突变体APPA-S22T。

图2：重组植酸酶和突变体的最适pH及比活性。

图3：重组植酸酶和突变体的pH稳定性。

图4：重组植酸酶和突变体的最适温度。

图5：重组植酸酶和突变体的热稳定性。

图6a：一种本发明植酸酶APPA的氨基酸序列及其编码序列；

图6b：一种本发明植酸酶的单氨基酸位点突变体的氨基酸序列及其编码序列。

具体实施方式

实验条件：

1、菌株及载体：

细菌Yersinia frederiksenii基因组DNA购自军事医学科学院(中国，北京)。大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)、表达载体pET-22b(+)(购自Novagen公司)。引物合成由捷瑞公司(中国，上海)完成。

2、酶类及其他生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Invitrogen公司。PNPGal、植酸钠等底物购自Sigma公司，其它都为市售。

3.培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特别说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)。

实施例1 耶尔氏菌植酸酶编码基因appa的克隆和获得

将来自军事医学科学院的耶尔氏菌(Yersinia frederiksenii)基因组DNA用30μL无菌水溶解，备用。根据中性植酸酶的保守序列设计合成了简并引物：

F I：5′-GTKSTKAWWKTGAGYCGCCA-3′(SEQ ID NO：17)

R I：5′-TWKGCMAKRTTRGTATCATG-3′(SEQ ID NO：18)。

其中，K是G或T或U，S是C或G，W是A或T，Y是C或T或U，M是A或C，N是A、C、G或T或U，R是A或G。

以耶尔氏菌基因组DNA为模板进行兼并性PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性3min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环后72℃保温10min。得到植酸酶保守性片段，将该片段回收后测序。

根据以上测得的耶尔氏菌植酸酶保守性片段序列，采用TAIL-PCR方法分别设计上下游特异性引物：

usp1：5′-TGGACGTTTTAAAACTTCAGACTTTGCAATGAT-3′(SEQ IDNO：7)

usp2：5′-CAGACTTTGCAATGATTTTTCCCTTTAAATCAAAAGC-3′(SEQID NO：8)

usp3：5′-TACTTTTTGTGGCGTCTGTTGGATGAATCCA-3′(SEQ ID NO：9)

dsp1：5′-TGGATTCATCCAACAGACGCCACAAAAAG-3′(SEQ ID NO：10)

dsp2：5′-CGCCACAAAAAGTATTATTGTGGGAACTG-3′(SEQ ID NO：11)

dsp3：5′-GGGAAAAATCATTGCAAAGTCTGAAGTTTTAAAACG-3′(SEQID NO：12)。

根据耶尔氏菌植酸酶保守区序列RHGXRXP和HDTN，采用TAIL-PCR方法设计随机简并引物：

AD1：5′-WGTGNCNAGWNCAGA-3′(SEQ ID NO：19)

AD2：5′-AGWGCAWAWANCNAWG-3′(SEQ ID NO：20)

其中，W和N如前所述。

以所述耶尔氏菌基因组DNA为模板扩增得到基因的全部序列，使用GemomeWalking Kit(TaKaRa，中国大连)，按照说明书进行反应。最后经过正确的拼接，最终得到一个含新植酸酶编码序列的基因，appa。经测序，该基因以ATG为起始密码子，由1326个碱基对组成，编码441个氨基酸和一个终止密码子taa(SEQID NO：5)。其中，前第1-87碱基编码一段长度29个氨基酸的信号肽(见图6a)，本发明新植酸酶成熟体蛋白的氨基酸序列及其编码基因序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

实施例2 突变体植酸酶编码基因appa-S22T的获得

应用Quick-Change基因突变试剂盒(Stratagene公司)，设计引物

S22T(+)：5’-GTGTTCGTTCACCGACCAAACAAACACAGCT-3’(SEQ IDNO：13)和S22T(-)：5’-AGCTGTGTTTGTTTGGTCGGTGAACGAACAC-3’(SEQ IDNO：14)，以图6a所示序列为模板，利用PCR对该氨基酸序列第51位进行单点突变，得到一个含植酸酶appa-S22T突变体编码序列的基因，该基因以ATG为起始密码子，由1326个碱基对组成，编码441个氨基酸和一个终止密码子taa(SEQ ID NO：6)。其中，前第1-87碱基编码一段长度29个氨基酸的信号肽(见图6b)，其中，植酸酶appa-S22T突变体编码序列如SEQ ID NO：4所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，其中，第22位氨基酸为苏氨酸(Thu22)。

实施例3　重组植酸酶的制备

根据实施例1所得序列(SEQ ID NO：5)设计表达引物：

appaF，5’-GTTGGATCCGCAACCTGGTGGTTTACACTTTG-3′，(SEQ IDNO：15)

appaR，5′-GACGCGGCCGCTTAAATATGGCAGGCTGGTTCTATC-3′(SEQ IDNO：16)，其中，引物的末端分别引入了酶切位点BamHI和NotI。以所述Yersiniafrederiksenii基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

扩增产物用EcoR I和Not I酶切，所得酶切片段连接到载体pET-22b的BamHI-Not I位点，获得含有本发明植酸酶编码基因的重组质粒pET-appa。用所得重组质粒pET-appa转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组菌株。

根据实施例2所得的编码序列(SEQ ID NO：6)设计表达引物：

appaF，5’-GTTGGATCCGCAACCTGGTGGTTTACACTTTG-3′，(SEQ IDNO：15)

appaR，5′-GACGCGGCCGCTTAAATATGGCAGGCTGGTTCTATC-3′(SEQ IDNO：16)，其中，引物的末端分别引入了酶切位点BamHI和NotI。以突变体DNA为模板，进行PCR扩增。

扩增产物用BamHI和Not I酶切，所得酶切片段连接到载体pET-22b的BamHI-Not I位点，获得含有本发明植酸酶突变体编码序列的重组质粒pET-appa-S22T。用所得重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组菌株。

取两种重组菌株和含有pET-22b(+)空质粒的BL21(DE3)菌株(作对照)，分别接种于3mL LB(加有100μg/mL的氨苄青霉素)培养基中，37℃快速振荡培养过夜；再按照1/100体积接种过夜培养物于含有100μg/mL氨苄青霉素的20mL LB培养基中(100mL三角瓶)，快速振荡培养约2h(OD₆₀₀达到0.6)，加入1/1000体积1mol/L的诱导剂IPTG，30℃振荡培养24h，使其表达目的蛋白。取培养液，10,000rpm离心5min，收集菌体，沉淀的菌体经超声波破碎细胞，离心分离，收集上清液即为大肠杆菌发酵所产植酸酶的粗酶液。同样处置的含有空质粒pET-22b(+)的菌体BL21作为阴性对照。采用以下实施例4中所述方法进行植酸酶活性分析。

结果，菌体破碎后得到的粗酶液中检测到植酸酶活性，APPA和APPA-S22T表达活性分别为0.56和1.14U/ml，表明基因appa和appa-S22T均在大肠杆菌中得到了表达。

实施例4 植酸酶的活性分析方法

酶活测定方法为:将实施例3所得植酸酶粗酶液用含有0.05％BSA和0.05％Triton X-100的0.25mol/L的乙酸钠缓冲液做10倍梯度稀释，根据显色效果确定合适的试验浓度。取50μL稀释酶液加底物1.5mmol/L植酸钠950μL(用0.25mol/L的乙酸钠缓冲液配制，pH5.0)，37℃反应15min，加1mL10％三氯乙酸(TCA)终止反应，加2mL显色液(10g四水合钼酸铵+32mL硫酸+73.2g硫酸亚铁，加水定容至1L)。对照则为上述植酸钠溶液中加酶液后先加TCA混匀，再加底物。反应30min，显色后于700nm下测其OD值，计算酶活。

如下绘制植酸酶活力测定标准曲线：将4.0mmol/L磷酸二氢钾标准溶液用乙酸缓冲液稀释成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/L的溶液，按上述操作步骤一起反应。以无机磷含量为纵坐标(0.2ml以上稀释液无机磷含量分别为：0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80μmol)，以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程(Y＝KX+B)。

一个酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放出1μmol无机磷所需酶量为一个酶活性单位。

植酸酶活性U按下面的公式计算：

          U＝((K×(A-A₀))/(s×v×30))×F

其中：U——样品植酸酶活性，U/ml；

K——标准曲线斜率；

A——样品的测得吸光度

A₀——对照的测得吸光度

F——样品溶液反应前的总稀释倍数；

S——样品测试量(体积)；

v——试样体积，ml；

30——反应时间，min。

两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。

植酸酶的比活力按下面的公式计算：

U_c＝U/c

其中：U_c——样品植酸酶比活性，U/mg；

U——样品植酸酶活力，U/ml；

c——样品溶液中的蛋白质含量，mg/ml。

结果如图2-5所示。

实施例5 重组植酸酶的纯化

将实施例3中经IPTG诱导，30℃培养24h后的菌液500ml，经离心收集菌体，超声波破碎细胞，于4℃、12,000rpm离心10min，获得上清(粗酶液)；将400mL粗酶液浓缩到50mL左右进一步进行离子交换层析。将浓缩后的酶液过HiTrap Q XL(5mL)阴离子柱。平衡缓冲液为pH7.5，20mmol/L的Tris-HCl，洗脱液为含1mol/LNaCl的pH7.5，20mmol/LTris-HCl，上样量2.0mL，0-100％洗脱12CV，流速2mL/min，分部收集，每管1mL。然后对收集管中的溶液测定酶活力及蛋白电泳分析。根据估算分子量和和电泳图谱确定目标纯化产物，并根据酶活测定结果确认产物具有酶活力。图1显示纯化后的植酸酶蛋白仅有一条单一的条带，表明得到了电泳纯植酸酶和突变体。

实施例6 重组植酸酶的最适pH

最适pH的测定为底物植酸钠用一系列不同pH值的缓冲液(pH1.0-3.5，HCl-Gly缓冲液；pH3.5-6.0，HAc-NaAc缓冲液；pH6.0-8.5，Tris-HCl缓冲液；pH8.5-10.0，Gly-NaOH缓冲液)配制，缓冲液中含有0.05％牛血清白蛋白和0.05％Triton X-100，37℃下在这些不同的缓冲体系中如实施例4所述测定酶活性。结果(图2)表明，实施例5纯化所得植酸酶APPA的最适pH为2.5，其比活性最高为428U/mg蛋白质，实施例5纯化所得突变体APPA-S22T的最适反应pH为4.5，其比活性最高为1321U/mg蛋白质。在最适pH，突变体最高比活是野生型APPA的3倍。

实施例7 重组植酸酶的pH稳定性

实施例3所得植酸酶APPA及其突变体APPA-S22T的粗酶液，用上述不同pH值的缓冲液稀释10倍后，37℃保温1h后，然后分别在pH2.5的HCl-Gly缓冲液和pH4.5的HAc-NaAc缓冲液中，如实施例4所述测定酶活性，以评价其稳定性。结果表明(图3)，APPA和APPA-S22T在pH3.0～10.0之间酶活性损失较小，说明它们具有较好的pH稳定性。剩余酶活性均在70％以上，这说明此酶在碱性条件下具有较好的pH稳定性。APPA在pH1.0～2.0之间丧失酶活性，而APPA-S22T在pH1.0～2.0之间能够保持最低68.4％的酶活性，说明该突变体具有更好的酸性环境适应性。

实施例8 重组植酸酶的最适反应温度和热稳定性

在最适pH及不同温度下如实施例4所述进行酶促反应，测定植酸酶APPA和APPA-S22T的最适反应温度。结果表明(图4)，它们的最适温度分别为45和55℃。

酶的热稳定性实验是将实施例3所得植酸酶的粗酶液在60℃水浴中保温不同的时间(0～20min)，然后如实施例4所述测得酶活。结果表明，处理2min后APPA不再具有活性，而APPA-S22T处理2和10分钟后，剩余酶活分别为最高酶活的85.2％和42.6％，其较野生型植酸酶具有更好的热稳定性(图5)。

序列表

<110>福建福大百特科技发展有限公司

<120>酸性植酸酶APPA，其突变体及其制备

<130>086712

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>412

<212>PRT

<213>耶尔氏菌(Yersinia frederiksenii)

<400>1

<210>2

<211>1236

<212>DNA

<213>耶尔氏菌(Yersinia frederiksenii)

<400>2

<210>3

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<213>耶尔氏菌(Yersinia frederiksenii)

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Claims (10)

1.一种植酸酶APPA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的植酸酶APPA。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种植酸酶的单氨基酸位点突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求4所述的植酸酶突变体。

6.如权利要求5所述的核酸分子，其碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

7.包含权利要求2或3所述核酸分子的载体或菌株。

8.包含权利要求5或6所述核酸分子的载体或菌株。

9.如权利要求7或8所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。

10.一种制备植酸酶APPA或其突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求7或8所述的载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的植酸酶或其突变体。

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