CN116334049B - 人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法。该人工设计的赖氨酰内切酶是将野生型赖氨酰内切酶中的第167位、第193位和第207位中的至少一个氨基酸进行如下突变得到：第167位的缬氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；第193位的丝氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸；第207位的甘氨酸突变为缬氨酸或亮氨酸。本发明提供的赖氨酰内切酶酶活高，可达到8000U/L以上，且具有稳定性高的优点。

Description

人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法。
背景技术
赖氨酰特异性内切酶是一条由268个氨基酸残基构成的多肽，其中肽链内部含有三个二硫键(Cys6-Cys216，Cys12-Cys80，Cys36-Cys58)，由His57、Asp113和Ser194构成的三联体决定了该酶的催化活性，而Asp225决定了其对赖氨酸的特异选择性。
赖氨酰特异性内切酶与牛胰蛋白酶的氨基酸序列虽然只有20％的同源性，但是决定酶催化活性以及赖氨酸特异性相关的氨基酸序列和空间结构完全一致，因此赖氨酰特异性内切酶被归为胰蛋白酶家族。与牛胰蛋白酶相比，赖氨酰特异性内切酶对赖氨酸碳端的选择性更高，并且有10倍于胰蛋白酶的活性、较广的最适pH范围(pH8.5～10.5)及在4M的尿素或0.1％的SDS中依然正常的稳定性。这些特性使赖氨酰特异性内切酶成为生物医药生产中一种非常有用的工具酶。
1978年，日本茨城大学Masaki等人从无色杆菌Achromobacter lyticus M497-1发酵液上清中分离到一种分子量为30KDa的碱性蛋白酶-无色杆菌赖氨酰内切酶，该酶可特异性水解赖氨酰基，包括赖氨酰-脯氨酸基团[Masaki,T.,et al.,A new proteolyticenzyme from Achromobacter lyticus M497-1.Agricultural and BiologicalChemistry,1978.42.]；Tsunasawa等人通过测序获得无色杆菌赖氨酰内切酶的基因序列和蛋白序列，通过分析发现，赖氨酰内切酶属于丝氨酸蛋白酶，赖氨酰内切酶前体除了含有268个氨基酸残基的成熟肽肽段，还包括N端205个氨基酸残基的前肽和C端180个氨基酸残基的大肽段，其底物结合位点由His210-Trp211-Gly212组成，通过序列比对发现，赖氨酰内切酶蛋白序列与牛胰蛋白酶仅有20％同源性[Tsunasawa,S.,et al.,The primarystructure and structural characteristics of Achromobacter lyticus protease I,alysine-specific serine protease.J Biol Chem,1989.264(7):p.3832-9.]。
由于无色杆菌赖氨酰内切酶具有特异性高，耐受pH范围广且稳定的特点，不仅用于生物药如胰岛素等蛋白的前导肽及C肽的切割，还可用于单克隆抗体等大分子蛋白的肽图质谱研究，由于无色杆菌赖氨酰内切酶应用广泛，商业价值高，而利用天然无色杆菌Achromobacter lyticus M497-1生产的赖氨酰内切酶表达量低，周期长，成本明显较高，导致赖氨酰内切酶价格居高不下。
Ohara等人利用基因工程手段，将无色杆菌赖氨酰内切酶酶原基因克隆至重组质粒，于重组大肠杆菌中表达，最终在大肠杆菌周质空间收获有活性的赖氨酰内切酶，但发酵液上清中并未检测到蛋白酶的表达[Ohara,T.,et al.,Cloning,nucleotide sequence,and expression of Achromobacter protease I gene.J Biol Chem,1989.264(34):p.20625-31.]；诺和诺德公司采用基因扩增技术将不含有C端前导肽的无色杆菌赖氨酰内切酶酶原基因克隆后，转化至大肠杆菌中，最终在重组大肠杆菌发酵液上清中检测到赖氨酰内切酶酶活，但酶活高低不明[process for producing extracellular proteins inbacteria.US6171823 B1]。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人工设计的赖氨酰内切酶。
本发明的另一目的在于提供编码上述人工设计的赖氨酰内切酶的核苷酸序列。
本发明的再一目的在于提供所述的人工设计的赖氨酰内切酶的发酵方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人工设计的赖氨酰内切酶，是将野生型赖氨酰内切酶中的第167位、第193位和第207位中的至少一个氨基酸进行如下突变得到：第167位的缬氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；第193位的丝氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸；第207位的甘氨酸突变为缬氨酸或亮氨酸。从而，人工设计的赖氨酰内切酶相对于野生型赖氨酰内切酶具有更高的酶活。
所述的人工设计的赖氨酰内切酶还包括如下情形：是将野生型赖氨酰内切酶中的第30位、第49位、第106位和第155位赖氨酸中一个或多个突变为精氨酸。从而，人工设计的赖氨酰内切酶相对于野生型赖氨酰内切酶具有更强的稳定性。
所述的人工设计的赖氨酰内切酶优选为将野生型赖氨酰内切酶中的第30位、第49位、第106位和第155位赖氨酸突变为精氨酸。
所述的人工设计的赖氨酰内切酶中的第167位、第193位和第207位的突变组合优选如下：V167I、S193A、G207V；V167I、S193A、G207L；V167I、S193G、G207V；V167L、S193A、G207V；V167I、S193G、G207L；V167L、S193A、G207L；V167L、S193G、G207V；V167L、S193G；V167L；或V167L、S193G、G207L。
所述的人工设计的赖氨酰内切酶优选为氨基酸序列如下所示的赖氨酰内切酶(SEQ ID NO:1)：
GVSGSCNIDVVCPEGDGRRDIIRAVGAYSRSGTLACTGSLVNNTANDRRMYFLTAHHCGMGTASTAASIVVYWNYQNSTCRAPNTPASGANGDGSMSQTQSGSTVRATYATSDFTLLELNNAANPAFNLFWAGWDRRDQNYPGAIAIHHPNVAERRISNSTSPTSFIAWGGGAGTTHLNVQWQPSGGVTEPGASGSPIYSPEKRVLVQLHGGPSSCSATGTNRSDQYGRVFTSWTGGGAAASRLSDWLDPASTGAQFIDGLDSGGGTP。
编码上述人工设计的赖氨酰内切酶的核苷酸序列，是依据密码子原则得到；优选为依据宿主细胞密码子偏好性得到的核苷酸序列；更优选如下所示(SEQ ID NO:2)：
ggtgtttctggttcttgcaacatcgacgttgtttgcccggaaggtgacggtcgtcgtgacatcatccgtgctgttggtgcttactctcgtt
ctggtaccctggcttgcaccggttctctggttaacaacaccgctaacgaccgtcgtatgtacttcctgaccgctcaccactgcggtatggg
taccgcttctaccgctgcttctatcgttgtttactggaactaccagaactctacctgccgtgctccgaacaccccggcttctggtgctaac
ggtgacggttctatgtctcagacccagtctggttctaccgttcgtgctacctacgctacctctgacttcaccctgctggaactgaacaacg
ctgctaacccggctttcaacctgttctgggctggttgggaccgtcgtgaccagaactacccgggtgctatcgctatccaccacccgaacgt
tgctgaacgtcgtatctctaactctacctctccgacctctttcatcgcttggggtggtggtgctggtaccacccacctgaacgttcagtgg
cagccgtctggtggtgttaccgaaccgggtgcttctggttctccgatctactctccggaaaaacgtgttctggttcagctgcacggtggtc
cgtcttcttgctctgctaccggtaccaaccgttctgaccagtacggtcgtgttttcacctcttggaccggtggtggtgctgctgcttctcgtctgtctgactggctggacccggcttctaccggtgctcagttcatcgacggtctggactctggtggtggtaccccgtaatga。
一种人工设计的赖氨酰内切酶原，由信号肽、N端前导肽和上述人工设计的赖氨酰内切酶依次连接得到。
所述的信号肽的氨基酸序列如下所示：MKKTAIAIAVALAGFATVAQA。
所述的N端前导肽的氨基酸序列如下所示：
APASRPAAFDYANLSSVDKVALRTMPAVDVAKAKAEDLQRDKRGDIPRFALAIDVDMTPQNSGAWEYTADGQFAVWRQRVRSEKALSLNFGFTDYYMPAGGRLLVYPATQAPAGDRGLISQYDASNNNSARQLWTAVVPGAEAVIEAVIPRDKVGEFKLRLTKVNHDYVGFGPLARRLAAASGEK。
所述的人工设计的赖氨酰内切酶原的氨基酸序列优选如下所示：
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPASRPAAFDYANLSSVDKVALRTMPAVDVAKAKAEDLQRDKRGDIPRFALAIDVDMTPQNSGAWEYTADGQFAVWRQRVRSEKALSLNFGFTDYYMPAGGRLLVYPATQAPAGDRGLISQYDASNNNSARQLWTAVVPGAEAVIEAVIPRDKVGEFKLRLTKVNHDYVGFGPLARRLAAASGEKGVSGSCNIDVVCPEGDGRRDIIRAVGAYSRSGTLACTGSLVNNTANDRRMYFLTAHHCGMGTASTAASIVVYWNYQNSTCRAPNTPASGANGDGSMSQTQSGSTVRATYATSDFTLLELNNAANPAFNLFWAGWDRRDQNYPGAIAIHHPNVAERRISNSTSPTSFIAWGGGAGTTHLNVQWQPSGGVTEPGASGSPIYSPEKRVLVQLHGGPSSCSATGTNRSDQYGRVFTSWTGGGAAASRLSDWLDPASTGAQFIDGLDSGGGTP。
编码上述人工设计的赖氨酰内切酶原的核苷酸序列，是依据密码子原则得到；优选为依据宿主细胞密码子偏好性得到的核苷酸序列；更优选如下所示(SEQ ID NO:3)：
atgaaaaaaaccgctatcgctatcgctgttgctctggctggtttcgctaccgttgctcaggctgctccggcttctcgtccggctgctttcgactacgctaacctgtcttctgttgacaaagttgctctgcgtaccatgccggctgttgacgttgctaaagctaaagctgaagacctgcagcgtgacaaacgtggtgacatcccgcgtttcgctctggctatcgacgttgacatgaccccgcagaactctggtgcttgggaatacaccgctgacggtcagttcgctgtttggcgtcagcgtgttcgttctgaaaaagctctgtctctgaacttcggtttcaccgactactacatgccggctggtggtcgtctgctggtttacccggctacccaggctccggctggtgaccgtggtctgatctctcagtacgacgcttctaacaacaactctgctcgtcagctgtggaccgctgttgttccgggtgctgaagctgttatcgaagctgttatcccgcgtgacaaagttggtgaattcaaactgcgtctgaccaaagttaaccacgactacgttggtttcggtccgctggctcgtcgtctggctgctgcttctggtgaaaaaggtgtttctggttcttgcaacatcgacgttgtttgcccggaaggtgacggtcgtcgtgacatcatccgtgctgttggtgcttactctcgttctggtaccctggcttgcaccggttctctggttaacaacaccgctaacgaccgtcgtatgtacttcctgaccgctcaccactgcggtatgggtaccgcttctaccgctgcttctatcgttgtttactggaactaccagaactctacctgccgtgctccgaacaccccggcttctggtgctaacggtgacggttctatgtctcagacccagtctggttctaccgttcgtgctacctacgctacctctgacttcaccctgctggaactgaacaacgctgctaacccggctttcaacctgttctgggctggttgggaccgtcgtgaccagaactacccgggtgctatcgctatccaccacccgaacgttgctgaacgtcgtatctctaactctacctctccgacctctttcatcgcttggggtggtggtgctggtaccacccacctgaacgttcagtggcagccgtctggtggtgttaccgaaccgggtgcttctggttctccgatctactctccggaaaaacgtgttctggttcagctgcacggtggtccgtcttcttgctctgctaccggtaccaaccgttctgaccagtacggtcgtgttttcacctcttggaccggtggtggtgctgctgcttctcgtctgtctgactggctggacccggcttctaccggtgctcagttcatcgacggtctggactctggtggtggtaccccgtaatga。
一种表达上述人工设计的赖氨酰内切酶原的重组载体，为将上述编码人工设计的赖氨酰内切酶原的核苷酸序列重组于表达载体上得到。
所述的表达载体为pET9a、pET28a-c(+)、pET32a-c(+)、pET30a-c(+)或pET33b(+)；优选为pET9a或pET28a。
所述的表达上述人工设计的赖氨酰内切酶原的重组载体，通过以下步骤得到：
(1)在上述编码人工设计的赖氨酰内切酶原的核苷酸序列的5'端加上NdeI酶切位点，在3'端加上BamHI酶切位点，得到含有NdeI和BamHI双酶切位点的序列；
(2)利用NdeI和BamHI限制性内切酶分别双酶切步骤(1)最终得到的序列以及表达载体；双酶切后的序列与双酶切后的表达载体连接，得到表达人工设计的赖氨酰内切酶原的重组载体。
一种表达人工设计的赖氨酰内切酶原的菌株，为将上述人工设计的赖氨酰内切酶原的重组载体转化到宿主菌株得到。
所述的宿主菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21star(DE3)或BL21star(DE3)pLysS；优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述的表达人工设计的赖氨酰内切酶原的菌株的发酵方法，包括如下步骤：将上述表达人工设计的赖氨酰内切酶原的菌株接种到发酵培养基中，进行发酵。
所述的发酵条件优选如下：温度控制在35℃～37℃之间，pH值控制在6.5～7.0之间，搅拌转速控制在150rpm～700rpm之间，空气流速控制在200L/h～1600L/h之间，溶解氧(DO)控制在10～50％的最大氧饱和度，诱导剂IPTG的添加量在0.1mmol/L～0.6mmol/L(在发酵体系中的终浓度)；当碳源耗尽时开始补料，采用指数补料，比生长速率μ控制在0.03-0.15h-1之间。
所述的发酵培养基的组成如下：每升含有酵母提取物2～5g、蛋白胨3～8g、氯化钠1～2g、磷酸二氢钾2～5g、磷酸氢二钠2～5g、二水合氯化钙0.01～0.02g、硫酸镁1～2g、甘油4～7g、硫酸铵5～7g、微量元素0.875mL；用水定容至1L，pH6.5～7.0；优选如下：每升含有酵母提取物3g、蛋白胨5g、氯化钠1g、磷酸二氢钾3g、磷酸氢二钠3.25g、二水合氯化钙0.014g、硫酸镁1g、甘油4.125g、硫酸铵6g、微量元素0.875mL；用水定容至1L，pH6.5～7.0。
所述的微量元素的组成如下：每升含有四水合氯化亚铁20～30g、氯化锌1～3g、六水合氯化钴2～4g、二水合钼酸钠2～4g、二水合氯化钙1～2g、二水合氯化铜1～2g、硼酸0.4～0.6g、一水合硫酸锰2～3g、浓度为质量百分比37％的浓盐酸100mL，用水定容至1L；优选如下：每升含有四水合氯化亚铁22.87g、氯化锌1.31g、六水合氯化钴2g、二水合钼酸钠2g、二水合氯化钙1g、二水合氯化铜1.25g、硼酸0.5g、一水合硫酸锰2.17g、浓度为质量百分比37％的浓盐酸100mL，用水定容至1L。
所述的补料的组成如下：每升含有250～500g甘油，余量为水；优选如下：每升含有500g甘油，余量为水。
所述的IPTG的添加量优选为按终浓度计算，为0.3mmol/L。
所述的人工设计的赖氨酰内切酶的酶活达到8000U/L以上(酶活：在30℃下每分钟催化底物生成1μmol对硝基苯胺的酶量定义为1U)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发明人结合赖氨酰内切酶的保守序列和底物活性中心氨基酸序列，在考虑催化活性、蛋白质结构稳定性等方面，提供一种人工设计的赖氨酰内切酶。该酶具有高酶活、且高稳定性的优点。
(2)本发明提供了一种编码人工设计的无色杆菌赖氨酰内切酶原的核苷酸序列。该核苷酸序列为经过优化得到，适于大肠杆菌中进行表达。
(3)本发明提供了表达人工设计的无色杆菌赖氨酰内切酶原的菌株的发酵方法，其中的发酵培养基，由有机氮源、碳源和无机盐组成，该培养基适合产赖氨酰内切酶基因工程菌的表达。通过该发酵方法得到的赖氨酰内切酶的酶活达到了8000U/L以上。
附图说明
图1是人工设计的赖氨酰内切酶氨基酸与野生型无色杆菌赖氨酰内切酶氨基酸序列比对图。
图2是本发明中工程菌BL21(DE3)/pET28a-LyC发酵液上清分别在诱导前和诱导后的SDS-PAGE图；其中，泳道M为蛋白Marker，各条带大小：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.0KDa、14.4Kda；泳道1为诱导前5h的样品，泳道2为诱导前2h的样品，泳道3为诱导0h的样品，泳道4为诱导6h的样品，泳道5为诱导12h的样品，箭头指的是成熟肽。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实验过程概述：
一、赖氨酰内切酶的人工设计和筛选
赖氨酰内切酶属于丝氨酸蛋白酶家族，该类酶在碱性条件下的酶活是中性条件下的5～6倍。在产赖氨酰内切酶的野生菌中，先以一种无活性的前体蛋白质被合成的。这种前体蛋白质称为赖氨酰内切酶酶原，包括了信号肽序列、N端前导肽、成熟肽及C端延伸肽，酶原经由信号肽牵引着整个肽链进入细胞膜后，信号肽被切割下来。赖氨酰内切酶通过自切割，将N端肽链和C端肽链切割下来，形成成熟的有活性的赖氨酰内切酶。
在赖氨酰内切酶的自切割过程中，N端前导肽起着很重要的作用，其可促进赖氨酰内切酶成熟肽的正确折叠修饰。相对于N端前导肽，C端延伸肽的作用并不明确。本发明发明人通过筛选，得到优选的信号肽(MKKTAIAIAVALAGFATVAQA，如SEQ ID NO:4所示)，替换赖氨酰内切酶自身信号肽。
本发明的研究人员分析赖氨酰内切酶-底物结合催化机制，在考虑底物催化活性及底物进入赖氨酰内切酶活性口袋特性，通过将野生型赖氨酰内切酶(如SEQ ID NO:5所示)活性口袋附近的多个亲水性或疏水性较弱的氨基酸残基突变为具有较大疏水侧链的氨基酸残基，使得其能够协助赖氨酰内切酶更高效地结合底物并促进底物的旋转。通过实验分析，将野生型赖氨酰内切酶第167位Val、第193位Ser及第207位Gly中一个或多个突变为Val、Leu、IIe或Ala；优选突变为Val167 IIe、Ser193 Ala、Gly207 Val，得到的人工设计的赖氨酰内切酶的活性得以提高。本发明的研究人员综合考虑赖氨酰内切酶结构特性和酶催化机制，将第30位、第49位、第106位和第155位赖氨酸中一个或多个突变为精氨酸，得到的人工设计的赖氨酰内切酶的酶活稳定性得以进一步增强。筛选得到的酶活最高的人工设计的赖氨酰内切酶命名为LyC，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述的野生型赖氨酰内切酶的序列如下所示：
1GVSGSCNIDV VCPEGDGRRD IIRAVGAYSK SGTLACTGSL VNNTANDRKM YFLTAHHCGM
61GTASTAASIV VYWNYQNSTC RAPNTPASGA NGDGSMSQTQ SGSTVKATYA TSDFTLLELN
121NAANPAFNLF WAGWDRRDQN YPGAIAIHHP NVAEKRISNS TSPTSFVAWG GGAGTTHLNV
181QWQPSGGVTE PGSSGSPIYS PEKRVLGQLH GGPSSCSATG TNRSDQYGRV FTSWTGGGAA
241ASRLSDWLDP ASTGAQFIDG LDSGGGTP。
本发明的人工设计的赖氨酰内切酶与无色杆菌赖氨酰内切酶的氨基酸序列具有97％的同源性(在线NCBI Blast分析)，其氨基酸序列对比见图1。
二、重组表达载体的构建
Novagen公司开发的pET系列载体，使用具有强启动能力的T7启动子，可以高效驱动目的基因的表达，现已成为最常用的原核表达载体之一。
本发明选用的载体pET 28a(+)使用T7lac复合启动子，可以自由关闭和开启基因的表达，在诱导之前基因基本不表达，大大降低了宿主菌的负荷，诱导后可以迅速表达出大量目的蛋白，获得的重组表达载体命名为pET28a-LyC。
本发明还选用pET9a作为表达载体，它具有单独的T7启动子，可以在没有诱导剂存在的情况下，启动目的基因的表达。赖氨酰内切酶酶原基因在宿主菌内首先表达为赖氨酰内切酶酶原，然后通过一系列的转运、切割和修饰成为具有生物活性的成熟酶。由此可见，外源蛋白质的过快表达可能会形成包涵体，而不能加工出较多的成熟酶，同时，对于赖氨酰内切酶这类蛋白酶，其在大肠杆菌内过量积累，可能会严重影响大肠杆菌正常的代谢，抑制菌体的生长。因此，采用组成型表达模式可以调节蛋白质的合成，提高宿主菌的产酶能力。同样，使用限制性酶切位点NdeI和BamHI将LyC克隆至载体pET9a，可以实现上述目的，获得的重组表达载体命名为pET9a-LyC。
三、赖氨酰内切酶重组菌的建立
用氯化钙法将重组表达载体导入到大肠杆菌表达宿主中，构建赖氨酰内切酶重组菌。
四、工程菌的发酵培养
本发明公开了一种发酵培养基，由有机氮源、碳源和无机盐组成，该培养基适合产赖氨酰内切酶基因工程菌的表达。本发明经过实验证明，补料方式采用指数补料为宜，比生长速率μ控制在0.03-0.15h-1之间。
本发明中：
所用到的用于点突变的引物如表1所示：
表1用于点突变的引物序列
发酵小试实验步骤：
(1)取20μL重组菌株，接种至50ml抗性液体培养基，在28℃、250rpm的摇床中培养16小时，从而活化菌种。再将50ml活化过的菌种接种到400ml抗性液体培养基中，在28℃，250rpm的条件下继续培养3h，获得种子培养物，控制它的菌体浓度OD600在0.8～1.2之间。
(2)使用20L搅拌式发酵罐，按照表2和表3所示的发酵培养基配方进行投料，投料体积为8L。严格控制发酵条件：温度控制在35℃～37℃之间，pH控制在6.5～7.0之间，发酵转速控制在150rpm～700rpm(根据DO的变化调控)之间，空气流速控制在200L/h～1600L/h之间(根据DO的变化调控)，溶解氧(DO)控制在10～50％的最大氧饱和度之间。培养至碳源耗尽时开始补料(补料培养基每L含500g甘油，用水定容至1L)，当碳源耗尽时开始补料，采用指数补料，比生长速率μ控制在0.12h-1；当培养至菌体浓度OD600≈30时，开始添加IPTG至终浓度0.3mmol/L，开始诱导。
表2发酵培养基配方表
表3微量元素配方表
发酵诱导12h后，取1ml发酵液，12000rmp离心1min后取上清，检测发酵液上清中赖氨酰内切酶酶活。
赖氨酰内切酶酶活检测方法如下：
取1450μL底物溶液(180mmol/L Tris-HCl(pH9.2)，0.25mmol/L Bz-Lys-pNA(Na-苯甲酰-DL-赖氨酸-对硝基苯酰，如式I所示))。
于30℃水浴锅中加热5min，然后再加入50μL经稀释合适倍数的发酵液上清，于30℃反应5min，立即加入500μL的45％(V/V)乙酸终止反应，用纯化水稀释3倍后，在405nm波长下测定反应液的吸光度。酶活定义为：在30℃下每分钟催化底物生成1μmol对硝基苯胺的酶量，定义为1U。
LB液体培养基的组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0～7.5；
LB固体培养基的组成为LB液体培养基+琼脂粉15g/L。
抗性液体培养基：含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基。
抗性固体培养基：含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基。
实施例1赖氨酰内切酶比活性研究
1、突变载体的构建
1.1利用定点突变技术，设计定点突变引物，如表1所示。
1.2野生型赖氨酰内切酶酶原由优选的信号肽、赖氨酰内切酶N端前导肽及野生型成熟肽依次连接得到，通过对野生型赖氨酰内切酶酶原的核苷酸序列密码子进行优化，根据大肠杆菌的密码子使用数据库，获得了相应的核苷酸序列，优化后的野生型赖氨酰内切酶酶原的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。为了方便基因与载体的连接，在该核苷酸序列的5’添加限制性酶切位点NdeI(CATATG)，3’末端添加限制性酶切位点BamHI(GGATCC)，命名为LyC0，将该序列提交到南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，合成的LyC0序列已经由南京金斯瑞生物科技有限公司连接到载体pMD18T，获得的重组载体命名为pMD18T-LyC0。
优化后的野生型赖氨酰内切酶酶原的核酸序列：
atgaaaaaaaccgctatcgctatcgctgttgctctggctggtttcgctaccgttgctcaggctgctccggcttctcgtccggctgctttcgactacgctaacctgtcttctgttgacaaagttgctctgcgtaccatgccggctgttgacgttgctaaagctaaagctgaagacctgcagcgtgacaaacgtggtgacatcccgcgtttcgctctggctatcgacgttgacatgaccccgcagaactctggtgcttgggaatacaccgctgacggtcagttcgctgtttggcgtcagcgtgttcgttctgaaaaagctctgtctctgaacttcggtttcaccgactactacatgccggctggtggtcgtctgctggtttacccggctacccaggctccggctggtgaccgtggtctgatctctcagtacgacgcttctaacaacaactctgctcgtcagctgtggaccgctgttgttccgggtgctgaagctgttatcgaagctgttatcccgcgtgacaaagttggtgaattcaaactgcgtctgaccaaagttaaccacgactacgttggtttcggtccgctggctcgtcgtctggctgctgcttctggtgaaaaaggtgtttctggttcttgcaacatcgacgttgtttgcccggaaggtgacggtcgtcgtgacatcatccgtgctgttggtgcttactctaaatctggtaccctggcttgcaccggttctctggttaacaacaccgctaacgaccgtaaaatgtacttcctgaccgctcaccactgcggtatgggtaccgcttctaccgctgcttctatcgttgtttactggaactaccagaactctacctgccgtgctccgaacaccccggcttctggtgctaacggtgacggttctatgtctcagacccagtctggttctaccgttaaagctacctacgctacctctgacttcaccctgctggaactgaacaacgctgctaacccggctttcaacctgttctgggctggttgggaccgtcgtgaccagaactacccgggtgctatcgctatccaccacccgaacgttgctgaaaaacgtatctctaactctacctctccgacctctttcgttgcttggggtggtggtgctggtaccacccacctgaacgttcagtggcagccgtctggtggtgttaccgaaccgggttcttctggttctccgatctactctccggaaaaacgtgttctgggtcagctgcacggtggtccgtcttcttgctctgctaccggtaccaaccgttctgaccagtacggtcgtgttttcacctcttggaccggtggtggtgctgctgcttctcgtctgtctgactggctggacccggcttctaccggtgctcagttcatcgacggtctggactctggtggtggtaccccgtaatga。
使用TaKaRa公司的限制性内切酶NdeI和BamHI对重组载体pMD18T-LyC0进行双酶切，取5μL酶切产物用质量体积比1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，确认酶切完全后，将全部酶切产物进行质量体积比0.8％琼脂糖电泳，割下含1.4kb的DNA片段的凝胶，使用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒将凝胶中的DNA片段纯化到30μL去离子水中，就得到带粘性末端的基因片段。同样，用NdeI和BamHI对质粒pET28a(+)进行双酶切，将酶切后的质粒片段纯化到20μL去离子水中。使用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit 2.0将基因片段和质粒片段于16℃连接过夜。取10μL过夜连接的产物，加入到80μL用CaCl2法(美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》第三版)制备的大肠杆菌Top10F’(购自invitrogen公司)感受态细胞中，42℃处理90s，迅速加入300μL经过37℃预热的LB液体培养基，在37℃摇床中低速振荡(150～200rpm)培养45min，然后取100μL培养物涂布抗性固体培养基。在37℃培养箱中倒置培养该平板约18h，直到长出单菌落，随机挑取部分单菌落进行菌液PCR鉴定，PCR反应的条件为：94℃5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃5min；引物为：T7上游引物5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′、T7下游引物5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。将初步筛选得到的阳性克隆抽提质粒，通过NdeI和BamHI进行酶切鉴定，得到1.4kb的基因片段和5.3kb的载体片段的克隆，即为含有LyC0片段的克隆。将鉴定含有LyC0片段的克隆送至Invitrogen公司进行测序。将测序证明没有碱基突变和读码框移位的单克隆，接种至50ml抗性液体培养基，37℃、250rpm培养18h，获得的培养物用TIANGEN公司的质粒小提中量试剂盒抽提质粒(按说明书进行操作)，获得的重组表达质粒命名为pET28a-LyC0。
1.3突变质粒的构建
(1)通过引物V167I-F、V167I-R、S193A-F、S193A-R、G207V-F、G207V-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为IIe，第193位Ser替换为Ala，第207位Gly替换为Val，所得到的基因命名为LyC1，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC1。
(2)通过引物G207L-F和G207L-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第207位Gly替换为Leu，所得到的基因命名为LyC2，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC2。
(3)通过引物S193G-F、S193G-R、G207L-F和G207L-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第193位Ser替换为Gly，第207位Gly替换为Leu，所得到的基因命名为LyC3，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC3。
(4)通过引物V167L-F、V167L-R、G207L-F和G207L-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为Leu，第207位Gly替换为Leu所得到的基因命名为LyC4，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC4。
(5)通过引物V167L-F、V167L-R、S193G-F、S193G-R、G207L-F和G207L-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为Leu，第193位Ser替换为Gly，第207位Gly替换为Leu，所得到的基因命名为LyC5，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC5。
(6)通过引物S193G-F、S193G-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第193位Ser替换为Gly，所得到的基因命名为LyC6，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC6。
(7)通过引物V167L-F、V167L-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为Leu，所得到的基因命名为LyC7，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC7。
(8)通过引物V167L-F、V167L-R、S193G-F、S193G-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为Leu，第193位Ser替换为Gly，所得到的基因命名为LyC8，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC8。
(9)通过引物G193V-F、G193V-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第193位Gly替换为Val，所得到的基因命名为LyC9，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC9。
(10)通过引物V167L-F、V167L-R、S193G-F、S193G-R、G207V-F和G207V-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为Leu，第193位Ser替换为Gly，第207位Gly替换为Val，所得到的基因命名为LyC10，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC10。
(11)通过引物S193A-F、S193A-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第193位Ser替换为Ala，所得到的基因命名为LyC11，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC11。
(12)通过引物V167L-F、V167L-R、S193A-F、S193A-R、G207L-F和G207L-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为Leu，第193位Ser替换为Ala，第207位Gly替换为Leu，所得到的基因命名为LyC12，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC12。
(13)通过引物V167I-F、V167I-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为IIe，所得到的基因命名为LyC13，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC13。
(14)通过引物V167I-F、V167I-R、S193G-F、S193G-R、G207L-F和G207L-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为IIe，第193位Ser替换为Gly，第207位Gly替换为Leu，所得到的基因命名为LyC14，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC14。
(15)通过引物S193A-F、S193A-R、G207V-F和G207V-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第193位Ser替换为Ala，第207位Gly替换为Val，所得到的基因命名为LyC15，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC15。
(16)通过引物V167L-F、V167L-R、S193A-F、S193A-R、G207V-F和G207V-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为Leu，第193位Ser替换为Ala，第207位Gly替换为Val，所得到的基因命名为LyC16，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC16。
(17)通过引物V167I-F、V167I-R、G207V-F和G207V-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为IIe，第207位Gly替换为Val，所得到的基因命名为LyC17，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC17。
(18)通过引物V167I-F、V167I-R、S193G-F、S193G-R、G207V-F和G207V-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为IIe，第193位Ser替换为Gly，第207位Gly替换为Val，所得到的基因命名为LyC18，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC18。
(19)通过引物V167I-F、V167I-R、S193A-F、S193A-R，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为IIe，第193位Ser替换为Ala，所得到的基因命名为LyC19，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC19。
(20)通过引物V167I-F、V167I-R、S193A-F、S193A-R、G207L-F和G20LV-R，，将重组质粒pET28a-LyC0上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第167位Val替换为IIe，第193位Ser替换为Ala，第207位Gly替换为Leu，所得到的基因命名为LyC20，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC20。
2、将所得的突变质粒通过测序确定，然后按照美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》第三版提供的氯化钙法，将上述突变载体转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组菌株。接着进行发酵小试实验，诱导12h后，检测发酵液上清中赖氨酰内切酶酶活，研究结果如表4所示。
表4不同突变位点赖氨酰内切酶相对酶活
基因 V167突变 S193突变 G207突变 相对酶活％
LyC0 - - - 100
LyC1 V167I S193A G207V 332.2
LyC2 - - G207L 113.6
LyC3 - S193G G207L 131.5
LyC4 V167L - G207L 133.5
LyC5 V167L S193G G207L 200.3
LyC6 - S193G - 180.1
LyC7 V167L - - 210.9
LyC8 V167L S193G - 226.9
LyC9 - - G207V 170.8
LyC10 V167L S193G G207V 223.6
LyC11 - S193A - 187.0
LyC12 V167L S193A G207L 219.9
LyC13 V167I - - 169.1
LyC14 V167I S193G G207L 214.3
LyC15 - S193A G207V 137.9
LyC16 V167L S193A G207V 274.4
LyC17 V167I - G207V 164.1
LyC18 V167I S193G G207V 300.7
LyC19 V167I S193A - 173.1
LyC20 V167I S193A G207L 306.9
由表4可知，将野生型赖氨酰内切酶第167位氨基酸Val，第193位Ser及第207位Gly分别替换为Val、Leu、IIe、Gly或Ala，均可提高酶活，其中，最优组合为Val167 IIe、Ser193Ala、Gly207 Val。
实施例2不同突变位点的赖氨酰内切酶的稳定性研究
1、突变载体的构建
1.1利用定点突变技术，设计定点突变引物，如表1所示。
1.2突变体的构建，按照TaKaRa公司的点突变试剂盒说明书操作，以pET28a-LyC1为模板：
(1)通过引物Arg49-F、Arg49-R、Arg106-F、Arg106-R、Arg155-F、Arg155-R，将重组质粒pET28a-LyC1上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第49位Lys替换为Arg，第106位Lys替换为Arg，第155位Lys替换为Arg，所得到的基因命名为LyC21，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC21。
(2)通过引物Arg30-F、Arg30-R、Arg155-F和Arg155-R，将重组质粒pET28a-LyC1上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第30位Lys替换为Arg，第155位Lys替换为Arg，所得到的基因命名为LyC22，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC22。
(3)通过引物Arg30-F和Arg30-R，将重组质粒pET28a-LyC1上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第30位Lys替换为Arg，所得到的基因命名为LyC23，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC23。
(4)通过引物Arg30-F、Arg30-R、Arg49-F、Arg49-R、Arg106-F、Arg106-R、Arg155-F、Arg155-R，将重组质粒pET28a-LyC1上的赖氨酰内切酶酶原成熟肽基因第30位Lys替换为Arg，第49位Lys替换为Arg，第106位Lys替换为Arg，第155位Lys替换为Arg，所得到的基因命名为LyC，所得到的突变质粒命名为pET28a-LyC。
2、将所得的突变质粒通过测序确定，然后按照美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》第三版提供的氯化钙法，将上述构建的重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组菌株。将获得的重组菌进行发酵小试实验。发酵(诱导12h，发酵周期30h)结束后，收集5ml发酵液上清，进行酶活稳定性研究实验，发酵液上清置于室温中，每隔24h取样检测酶活，研究结果如表5所示：
表5不同突变位点赖氨酰内切酶稳定性研究
由表5可知，研究表明K30R、K49R、K106R及K155R一个或多肽突变后，酶活无显著变化，但是酶稳定性有显著差异。将野生型赖氨酰内切酶中的赖氨酸替换为精氨酸，可明显提高赖氨酰内切酶稳定性，由于赖氨酰内切酶有特异性的赖氨酰残基切割活性，不仅可水解其他蛋白，还能水解自身，随着赖氨酰内切酶成熟肽赖氨酸残基的增加，其稳定性逐步下降。
实施例3
参照《分子克隆实验指南》第三版的重组载体构建及感受态大肠杆菌制备及转化方法，获得重组菌株BL21(DE3)/pET28a-LyC，将赖氨酰内切酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-LyC进行发酵小试。诱导时间为12h，发酵周期为30h。发酵结束后，发酵液上清中酶活达到8000U/L。
赖氨酰内切酶的电泳分析：分别取5ml诱导前5h、诱导前2h、诱导前0h、诱导6h和诱导12h的发酵液12000rmp离心1min，取发酵液上清，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％)，结果见图2。由此可见，本发明的赖氨酰内切酶分子量与理论大小相符，约为30KDa；赖氨酰内切酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-LyC在诱导前无目的蛋白的表达，表明基因工程菌无本底表达，诱导6h和诱导12h，均在发酵液上清中检测目的蛋白，且目的蛋白的表达随着诱导时间的延长有明显提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种人工设计的赖氨酰内切酶，其特征在于：所述的人工设计的赖氨酰内切酶任选如下一种：
是将野生型赖氨酰内切酶中的第167位的缬氨酸突变为亮氨酸；
或是，将野生型赖氨酰内切酶中的第193位的丝氨酸突变为甘氨酸和第207位的甘氨酸突变为亮氨酸中的至少一个氨基酸突变与将第167位的缬氨酸突变为亮氨酸组合得到；
或是，将野生型赖氨酰内切酶中的第167位的缬氨酸突变为亮氨酸、第193位的丝氨酸突变为丙氨酸、第207位的甘氨酸突变为亮氨酸组合得到；
或是，将野生型赖氨酰内切酶中的第167位的缬氨酸突变为亮氨酸、第193位的丝氨酸突变为甘氨酸、第207位的甘氨酸突变为缬氨酸组合得到；
或是，将野生型赖氨酰内切酶中的第167位的缬氨酸突变为亮氨酸、第193位的丝氨酸突变为丙氨酸、第207位的甘氨酸突变为缬氨酸组合得到；
所述的野生型赖氨酰内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.编码权利要求1所述的人工设计的赖氨酰内切酶的核苷酸序列。
3.一种人工设计的赖氨酰内切酶原，其特征在于：由信号肽、N端前导肽及权利要求1所述的人工设计的赖氨酰内切酶组成；
所述的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的N端前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.编码权利要求3的人工设计的赖氨酰内切酶原的核苷酸序列。
5.一种表达人工设计的赖氨酰内切酶原的重组载体，其特征在于：将权利要求4所述的核苷酸序列重组于表达载体上得到。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述的表达载体为pET9a、pET28a-c(+)、pET32a-c(+)、pET30a-c(+)或pET33b(+)。
7.一种表达人工设计的赖氨酰内切酶原的菌株，其特征在于：将权利要求5或6所述的重组载体转化到宿主菌株得到；所述的宿主菌株为大肠杆菌。
8.权利要求7所述的表达人工设计的赖氨酰内切酶原的菌株的发酵方法，其特征在于包括如下步骤：将权利要求7所述的表达人工设计的赖氨酰内切酶原的菌株接种到发酵培养基中，进行发酵；
发酵条件如下：温度控制在35℃～37℃之间，pH值控制在6.5～7.0之间，搅拌转速控制在150rpm～700rpm之间，空气流速控制在200L/h～1600L/h之间，溶解氧控制在10～50％的最大氧饱和度，诱导剂IPTG的添加量按终浓度计算为0.1mM～0.6mM之间；当碳源耗尽时开始补料，采用指数补料，比生长速率μ控制在0.03-0.15h-1之间；
所述的发酵培养基的组成如下：每升含有酵母提取物2～5g、蛋白胨3～8g、氯化钠1～2g、磷酸二氢钾2～5g、磷酸氢二钠2～5g、二水合氯化钙0.01～0.02g、硫酸镁1～2g、甘油4～7g、硫酸铵5～7g、微量元素0.875mL；用水定容至1L，pH6.5～7.0；
所述的微量元素的组成如下：每升含有四水合氯化亚铁20～30g、氯化锌1～3g、六水合氯化钴2～4g、二水合钼酸钠2～4g、二水合氯化钙1～2g、二水合氯化铜1～2g、硼酸0.4～0.6g、一水合硫酸锰2～3g、浓度为质量百分比37％的浓盐酸100mL，用水定容至1L；
所述的补料的组成如下：每升含有250～500g甘油，余量为水。
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