JP2002209589A - 変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼｂ型サブユニットタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型
サブユニットタンパク質の提供。 【解決手段】 ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブ
ユニットタンパク質は、ニワトリ由来特定のアミノ酸配
列の２個所の特定位置のアミノ酸残基がアラニンである
ことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、変異型ニワトリ乳
酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、Ｎ
ＡＤ⁺を水素受容体として乳酸を脱水素してピルビン酸
を生じる酵素であって、解糖系でピルビン酸から乳酸を
生成することに働く酵素として、動物諸組織、微生物に
広く存在する。

【０００３】特に動物のＬＤＨにはＡ型（Ｍ型または骨
格筋型）、Ｂ型（Ｈ型または心筋型）といった２種類の
サブユニットが存在することが知られ、その酵素学的な
性質もＬＤＨアイソザイム間で異なっている。サブユニ
ットは同種同士または異種間で四量体を形成し、陽極側
への電気移動度の高いものからＬＤＨ₁（Ｂ₄）、ＬＤＨ
₂（Ａ₁Ｂ₃）、ＬＤＨ₃（Ａ₂Ｂ₂）、ＬＤＨ₄（Ａ
₃Ｂ₁）、ＬＤＨ₅（Ａ₄）と呼ばれるアイソザイムが存在
する。体内における各アイソザイムの分布は偏ってお
り、心筋、赤血球および腎にはＬＤＨ−Ｂ₄が、骨格筋
および肝にはＬＤＨ−Ａ₄が多く含まれている。また、
前立腺、結腸、甲状腺、肺の各組織にはＬＤＨ−Ａ ₂Ｂ₂
が多い。さらに近年、新たにＣ型およびＤ型サブユニッ
トの存在も確認されており、精巣および精子中からＬＤ
Ｈ−Ｘ（Ｃ₄）が、絨毛癌（ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎ
ｏｍａ）とその転移巣からＬＤＨ−Ｚ（Ｄ₄）が見い出
されている。

【０００４】ＬＤＨは特に臨床検査薬の分野において、
１）生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素とし
て、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）等の
種々のアミノトランスフェラーゼの酵素活性を測定する
場合や、２）尿素等の種々の基質をピルビン酸に変換
し、生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素とし
て、また、３）検体中の内因性ピルビン酸の消去にも利
用されている。特に、１）のアミノトランスフェラーゼ
は肝臓、心臓、腎臓などに強い活性を示す酵素であり、
各種疾患時に血清中に著しく増大するため、ＬＤＨを使
用した生体試料（血清、血漿などの体液）中のアミノト
ランスフェラーゼ活性の測定は、臨床検査の一項目とし
て広く行われている。

【０００５】臨床検査用試薬として使用するには、簡便
性の観点から粉末状態のものよりも液体状態で安定なも
のが好ましい。アミノトランスフェラーゼ活性測定のた
めの臨床検査用試薬としては大量に入手できるという観
点から一般にブタ由来のＬＤＨ−Ｂ₄が使用されてきた
が、これは液体状態では長期間に渡って安定した状態で
保存することが困難であるという欠点があった。

【０００６】近年、鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ₄が補酵素
（ＮＡＤＨ）の溶液安定性を考慮したｐＨ領域、例えば
ｐＨ約９−１０の範囲においても、著しい耐熱溶液安定
性を示すことがわかった。鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ₄の酵
素的性質は、従来のブタＬＤＨ−Ｂ₄とほとんどかわら
ず、トランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）
活性測定試薬として本酵素を使用した場合も、測定感度
において特に問題はない。従って、鳥類由来のＬＤＨ−
Ｂ₄は、溶液安定性および酵素的性質からして、臨床検
査用酵素として充分有用性があると期待される（「トラ
ンスアミナーゼ測定試薬」特開平８−２８９）および
「液状ＡＬＴ測定試薬に好適な耐熱型乳酸脱水素酵素」
臨床化学 第２３巻補冊２号 １９９４年 １４１
ｂ）。

【０００７】しかしながら、天然のＬＤＨ−Ｂ₄タンパ
ク質を鳥類から調製する場合極少量しか得られないた
め、臨床検査用酵素として例えば、ニワトリ臓器より取
得し実用化を図ることは数量面で困難である。また、天
然源から調製されたＬＤＨ−Ｂ ₄タンパク質の場合、精
製を充分に行っても混在するＮＡＤＨ分解酵素を完全に
除けないことが知られている。これは、ＬＤＨの酵素反
応はＮＡＤＨを補酵素として利用するため問題となる。
従って、鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ遺伝子をクローニング
し、遺伝子工学的手法によりＬＤＨ−Ｂ₄タンパク質を
大量かつ簡便に発現させることが重要である。

【０００８】この点、内田らの特開平９−２６２０８９
号は、ニワトリ心臓由来乳酸デヒドロゲナーゼＢサブユ
ニットの遺伝子をクローニングし、ニワトリＬＤＨ−Ｂ
₄組換えタンパク質の発現に成功したことを開示してい
る。得られた組換えニワトリＬＤＨ−Ｂ₄タンパク質の
熱安定性について、特開平９−２６２０８９号は天然の
ニワトリＬＤＨ−Ｂ₄と同等であると記載している。

【０００９】しかしながら、本発明者らがより詳細に熱
安定性を検討した結果、特開平９−２６２０８９号の組
換えＬＤＨ−Ｂ₄タンパク質はタンパク質濃度に依存し
て熱安定性が大きく変化することが見出された。具体的
には、トランスアミナーゼ活性を測定するための構成成
分として使用されるＬＤＨ量は通常１−１０Ｕ／ｍＬ程
度の範囲である。よって、組換えＬＤＨ−Ｂ₄比活性
（１３６Ｕ／ｍｇタンパク質）より、熱安定性および溶
液安定性はＬＤＨタンパク質濃度として０．００７−
０．０７ｍｇ／ｍＬの範囲で測定すべきであると換算さ
れる。ところが、後述の参考例１に記載したように、特
開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ ₄タンパク
質は、このような低濃度では熱に不安定であることがわ
かった。よって、当該組換えＬＤＨ−Ｂ₄タンパク質
は、熱安定性および溶液安定性を有するトランスアミナ
ーゼ活性測定試薬を提供するには未だ充分でない可能性
がある。

【００１０】よって、簡便で大量に遺伝子工学的手法に
よって得ることができ、かつ充分な熱安定性および溶液
安定性を保持する乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質の提
供が希求される。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、耐熱性およ
び溶液安定性を示し、ＮＡＤＨ分解酵素を含まない、変
異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニット
タンパク質を提供することを目的とする。本発明のニワ
トリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質
は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相
当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、そして、
アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基がア
ラニンであることを特徴とする。本発明のニワトリ乳酸
デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質は、好ま
しくは配列番号１のアミノ酸配列を有する。

【００１２】本発明はまた、前記変異型のニワトリ乳酸
デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質をコード
する核酸を提供することを目的とする。本発明の核酸
は、好ましくは配列番号２に記載の塩基配列を有する。

【００１３】本発明はさらに、前記変異型のニワトリ乳
酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を発現
するためのベクター、前記ベクターを含む宿主細胞を提
供することを目的とする。

【００１４】本発明はさらにまた、前記宿主細胞を培養
して、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニット
タンパク質を製造する方法を提供することを目的とす
る。本発明はさらに、前記変異型のニワトリ乳酸デヒド
ロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を構成成分とす
るニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型タンパク質を含
む、トランスアミナーゼ測定用試薬を提供することを目
的とする。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
解決のため鋭意研究を重ねた結果、特開平９−２６２０
８９号の組換えＬＤ−Ｂ₄タンパク質に変異を導入し、
その生化学的活性の熱安定性および溶液安定性（ｐＨ安
定性）、ならびにＮＡＤＨ分解活性を検討することによ
り、低濃度でも熱安定性および溶液安定性（ｐＨ安定
性）を保持する変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼ
Ｂ型サブユニットを見出し、本発明を想到した。

【００１６】以下、本発明を詳述する。変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニット
タンパク質 本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブ
ユニットタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列のア
ミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニ
ンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置
のアミノ酸残基がアラニンであることを特徴とする。そ
して、生学的的な特徴としては、補酵素ＮＡＤＨの存在
下でピルビン酸を乳酸に変換する活性を有し、そしてゲ
ル濾過クロマトグラフィーで４量体の状態で分子量が約
１５０，０００であり、特に以下の性質： １）０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱
処理で失活せず；そして ２）ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない を有することを特徴とする。上記１）および２）の性質
は公知のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニッ
トタンパク質にはない特有の性質である。

【００１７】本発明者らは先ずニワトリ心臓ｃＤＮＡラ
イブラリーの作製し、特開平９−２６２０８９号に記載
のＬＤ−Ｂ遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列を取得し
た。ｃＤＮＡライブラリーの作製は慣用技術、例えばＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ １９８９）に詳述されている方法に従った。特
開平９−２６２０８９号に記載の方法に従がい、作製し
たｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによ
りＬＤ−Ｂ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンを取得
した。得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、
本明細書で後述する配列表の配列番号５に記載した。さ
らに、配列番号５の塩基配列より推定されるアミノ酸配
列は配列番号４に記載した。これらは、特開平９−２６
２０８９号に開示された塩基配列及びアミノ酸配列（各
々、特開平９−２６２０８９号の配列番号３及び１）と
同一であることが確認された。

【００１８】一方、ニワトリ心臓より精製された天然の
ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミ
ノ酸配列が Ｔｓｏｉ，Ｓ．Ｃ．Ｍ．， Ｌｉ，Ｊ．
Ｙ．，Ｍａｎｎｅｎ，Ｈ． ａｎｄ Ｌｉ，Ｓ．Ｓ．
Ｌ． Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ （０３−ＪＵＮ−１９９
８）： ＧＩ “３３４２４０３” ［ＧｅｎＢａｎ
ｋ］に開示されている（配列番号３）。

【００１９】特開平９−２６２０８９号の組換えニワト
リ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配
列（配列番号４）とＴｓｏｉらの天然ニワトリ乳酸デヒ
ドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配列（配列番
号３）を比較したところ、２カ所のアミノ酸残基が相違
した。具体的には、配列番号３および４において１０番
目のアミノ酸残基が前者（配列番号３）はスレオニン、
後者（配列番号４）はアラニンであり、そして２０７番
目のアミノ酸残基が前者ではアラニン、後者はバリンで
あった。

【００２０】上記特開平９−２６２０８９号の組換えニ
ワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットとＴｓｏ
ｉらの天然ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニ
ットのアミノ酸配列に基づき、これら公知のニワトリ乳
酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットに変異を施すこと
によって、本発明者らは熱安定性および溶液安定性（ｐ
Ｈ安定性）に優れ、かつＮＡＤＨ分解活性を有しない優
れた生化学的性質を有する変異型ニワトリ乳酸デヒドロ
ゲナーゼＢ型サブユニットを得ることに成功し、本発明
を想到した。具体的には、本発明の変異型ニワトリ乳酸
デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、配列番号１（ま
たは配列番号３または４）のアミノ酸配列のアミノ酸番
号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであ
り、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミ
ノ酸残基がアラニンであることを特徴とする。

【００２１】本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナ
ーゼＢ型サブユニットは、公知の上記特開平９−２６２
０８９号の組換えニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サ
ブユニットとＴｓｏｉらの天然ニワトリ乳酸デヒドロゲ
ナーゼＢ型サブユニットのいずれとも相違し、新規なタ
ンパク質である。以下、本明細書中、簡便のため必要に
応じ、本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブ
ユニットを（１０Ａ、２０７Ａ）ＬＤＨ−Ｂ、上記特開
平９−２６２０８９号の組換え型のものを（１０Ａ、２
０７Ｖ）ＬＤＨ−Ｂ、そして天然由来のものを（１０
Ｔ、２０７Ａ）ＬＤＨ−Ｂと略称する。

【００２２】本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂは好ましくは配
列番号１に記載のアミノ酸配列１−３３３を有するが、
これらに限定されない。天然のタンパク質の中にはそれ
を生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いによる
遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在な
どに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異
タンパク質が存在することは周知である。さらに、一般
に生理活性を有するペプチドのアミノ酸配列が多少変更
された場合、即ち、該アミノ酸配列の中の１又は複数の
アミノ酸が置換され若しくは欠失し、または１又は複数
のアミノ酸が付加された場合でも該ペプチドの生理活性
が維持される場合があることは周知の事実である。

【００２３】よって、本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂタンパ
ク質は、配列番号１のアミノ酸残基１−３３３におい
て、１０番目のアラニン残基および２０７番目のアラニ
ン残基以外の部分において１またはそれ以上のアミノ酸
残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ
酸配列を有し、かつ、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有す
る（生物学的に活性な、酵素的に活性な）タンパク質も
含む。本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂタンパク質が「乳酸デ
ヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、Ｂ型同士またはＡ
型等の異なる型のサブユニットと四量体を形成して、Ｎ
ＡＤ⁺を水素受容体として乳酸を脱水素してピルビン酸
を生じる活性を有することを意味する。

【００２４】本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」
とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は
付加などを意味する。本発明の変異ニワトリＬＤＨ−Ｂ
酵素は、好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列を
有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定され
るわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限
り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。

【００２５】配列番号１に示された本発明のＬＤＨ−Ｂ
タンパク質のアミノ酸配列は、ニワトリＬＤＨのＡ型サ
ブユニットタンパク質のアミノ酸配列と７３．３％の相
同性を有する。また、ニワトリＬＤＨ−Ｂタンパク質の
アミノ酸配列と、対応するヒト、ブタおよびマウスＢ型
サブユニットタンパク質のアミノ酸配列との相同性は、
それぞれ８９．５％、８８．９％および８８．３％であ
る。よって、限定されるわけではないが、本発明の変異
ニワトリＬＤＨ−Ｂ酵素は、配列番号１のアミノ酸配列
と、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以
上、もっとも好ましくは９８％以上の相同性を有するア
ミノ酸配列を有する。

【００２６】本明細書において、相同性のパーセント
は、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９
７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配
列情報と比較し決定することが可能である。当該プログ
ラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎ
ｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａ
ｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェ
ブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプ
ログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）
は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜
変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値
を用いて行う。

【００２７】一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同
士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性
アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性
アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミ
ノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩
基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異
タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有すること
が多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望
の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業
者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の
範囲に含まれる。

【００２８】その他の例として、Ｃｙｓ残基が欠失する
または他のアミノ酸で置き換えられる原因となる様に、
Ｃｙｓ残基をコードする配列を変化させ、再生時の不適
当な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができ
る。置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、
アスパラギン酸およびリジンからなる基より選択され、
最も好ましくは、アミノ酸はトリプトファンである。

【００２９】同様に、生物活性への欠失または挿入によ
る潜在的効果を考慮することにより、アミノ酸配列を欠
失または付加することが可能である。例えば、酵母の発
現系を用いると均一の炭水化物が減少した類似体が発現
されるが、Ｎ−グリコシル化部位を修飾してグルコシル
化を排除することができる。真核生物のポリペプチド内
のグリコシル化部位は、アミノ酸のトリプレット、Ａｓ
ｎ−Ｘ−Ｙ（式中，ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸で
あり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。
このトリプレットをコードするヌクレオチド配列の適当
な修飾は、Ａｓｎ側鎖の炭水化物残基の結合を防ぐ置
換、付加または欠失を結果として生ずるであろう。ある
いは、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系での
発現を強化するために、二塩基性のアミノ酸残基をコー
ドする配列を修飾することも可能である。

【００３０】変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型
サブユニットの生化学的性質 ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットが、
「乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、Ｂ型同士
またはＡ型等の異なる型のサブユニットと四量体を形成
して、ＮＡＤ⁺を水素受容体として乳酸を脱水素してピ
ルビン酸を生じる活性を有することを意味する。即ち、
ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼ四量体タンパク質は、以
下の酵素反応を可逆的に促進する。

【００３１】

【化１】酵素反応： ピルビン酸＋ＮＡＤＨ⇔Ｌ−乳酸
＋ＮＡＤ⁺ また、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニット
は、ゲル濾過クロマトグラフィーで４量体の状態で分子
量が約１５０，０００である。本発明の変異型ニワトリ
乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、特に以下の
生化学性質： １）０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱
処理で失活せず；そして ２）ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない を有することを特徴とする。上記１）および２）の性質
は公知のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニッ
トタンパク質にはない特有の性質である。

【００３２】本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ
型サブユニットが耐熱性であり、熱処理で失活しない、
とは、本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブ
ユニットからなるＬＤＨ−Ｂ₄（以下、単に「本発明の
ＬＤＨ−Ｂ₄」という）が、好ましくは８０％以上、よ
り好ましくは９０％以上、最も好ましくは９３％以上の
ＬＤＨ活性の残存活性率を有することを意味する。本発
明のＬＤＨ−Ｂ₄はより低濃度、即ち、好ましくは０．
０１ｍｇ／ｍｌより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌの
濃度でも、例えば、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理
で好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、
最も好ましくは９３％以上残存活性率を有する。

【００３３】ＬＤＨ活性は例えば、１００ｍＭ リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−０．８ｍＭ ピリビン
酸ナトリウム−０．３ｍＭ ＮＡＤＨを基質混合液とし
て用い、測定温度２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＮ
ＡＤ⁺生成量を１単位とすることができる。ＮＡＤ⁺生成
量は、例えば、ＮＡＤＨの分子吸光係数（例えば、波長
３４０ｎｍで１ｃｍ光路幅のキュベットセルを用いた場
合に、ＮＡＤ⁺の１ミリモル濃度あたり６．３０とな
る）を用いる。基質反応混合液に試料を添加し、その後
１分間あたりの３４０ｎｍにおける吸光度減少量を測定
し、次式に従い試料中のＬＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）を換算
することができる。

【００３４】

【化２】ＬＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）＝Ｖ×（１分間あたり
の３４０ｎｍにおける吸光度減少量）（ｖ×６．３０） Ｖ： キュベット中の最終反応液量（ｍｌ） ｖ： 試料液量（ｍｌ） ６．３０： ＮＡＤＨ分子吸光係数（ＮＡＤ⁺の１ミリ
モル濃度あたり） 上記分光光度計によるＬＤＨ活性測定方法については例
えば、オリエンタル酵母工業株式会社製品カタログ（２
０００年版）の第６６頁−第６７頁に、ＮＡＤＨ分子吸
光係数の説明とともに詳述されている。例えば、限定さ
れるわけではないが、配列番号１のアミノ酸配列を有す
る本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニ
ットからなるＬＤＨ−Ｂ₄は、後述する実施例３で０．
００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理
で約９３％の残存活性率を示した（図１）。

【００３５】本発明のＬＤＨ−Ｂ₄はまた、溶液ｐＨ安
定性にも優れており、好ましくはｐＨ５−９の範囲で安
定である。限定されるわけではないが、好ましくは０．
００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９、５５℃、３０分間の熱処理
でも失活しない。例えば、限定されるわけではないが、
配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のニワトリ乳
酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−
Ｂ₄は、後述する実施例３でｐＨ９．０の条件下、０．
００３ｍｇ／ｍｌ、５５℃、３０分間の熱処理で９８
％、６５℃の熱処理で９５％の残存活性率を示した（図
１）。

【００３６】本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ
型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ ₄はさらに、ＮＡＤ
Ｈ分解酵素を実質的に含まない。ＮＡＤＨ分解酵素を実
質的に含まないとは、例えば、ＬＤＨ−Ｂ₄を４５℃で
２日間保存した後に、ＮＡＤＨ残存率が好ましくは８９
％以上、より好ましくは９２％以上保持することを意味
する。

【００３７】本発明においてＬＤＨタンパク質とともに
添加混合したＮＡＤＨの残存率は、例えばＮＡＤＨの有
する吸収スペクトルに基づき、３４０ｎｍの吸光度を分
光学的に測定して求めることができる。例えば、本明細
書において後述する実施例３では、ＮＡＤＨをＬＤＨタ
ンパク質と混合して試薬Ｒ−１を調製した直後の初期吸
光度に対する保存経過後の吸光後の割合として試算し
た。

【００３８】

【化３】ＮＡＤＨ残存率＝（保存経過後の吸光後）／
（試薬調製直後） さらに、限定されるわけではないが、本発明のＬＤＨ−
Ｂ₄は好ましくは、補酵素ＮＡＤＨに対する高い特異
性、を有する。さらには、補酵素アナログに対する反応
性については、補酵素アナログとの組合せにより測定方
法ならびに測定試薬の特徴付けをし得ることが望まし
い。例えば、ＮＡＤＨの補酵素アナログＡＰＡＤＨはＮ
ＡＤＨに比べて溶液安定性が高い。本発明のＬＤＨを補
酵素ＡＰＡＤＨともに利用して、例えば生体試料中のピ
ルビン酸を基質あるいは生成物質とする酵素活性を測定
するための液状試薬を構築することが可能である。その
場合、ＬＤＨの有するＡＰＡＤＨに対する交差反応性が
問題となる。例えば、本明細書中の実施例１において、
配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のニワトリ乳
酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−
Ｂ₄は、ＮＡＤＨへの反応性１００％とした時、ＡＰＡ
ＤＨに対して１０％程度の交差反応性を有した（実施例
１）。

【００３９】なお、上述したように、本発明のニワトリ
乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、アミノ酸配
列が好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸
番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであ
り、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミ
ノ酸残基がアラニンである。しかしながら、上記生化学
的性質を有するニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブ
ユニットは本発明によって初めて得られたものである。
よって、本発明の新規なニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼ
Ｂ型サブユニットタンパク質は、上記生化学的性質を有
するものであればそのアミノ酸配列は特に限定されな
い。

【００４０】変異型ニワトリＬＤＨ−Ｂ型サブユニット
（ＬＤＨ−Ｂ）遺伝子 本発明のＬＤＨ−Ｂタンパク質は、例えば後述の実施例
に記載するように、ＬＤＨ−Ｂタンパク質遺伝子を用い
て遺伝子工学的に発現させることができる。当業者は本
明細書の記載および慣用された遺伝子工学技術を用い
て、本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子を容易に得ることが可能
である。

【００４１】よって、本発明は変異型ＬＤＨ−Ｂタンパ
ク質をコードする核酸を提供する。本明細書において、
「核酸」または「遺伝子」とは、一本鎖又は二本鎖のＤ
ＮＡまたはＲＮＡを意味する。本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝
子は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ又はＲＮＡ、組
換えＤＮＡまたはＲＮＡ、化学合成ＤＮＡまたはＲＮＡ
の何れでもよく、またゲノムＤＮＡクローン、ｃＤＮＡ
クローン、ｍＲＮＡ等、いずれの核酸でもよい。

【００４２】１つのアミノ酸をコードするコドンは複数
存在するので、コードされるアミノ酸配列が同じであれ
ば、どのような塩基配列の核酸も本発明の範囲に含まれ
る。従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコー
ドするいずれの核酸も本発明の範囲に含まれる。

【００４３】天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物
種の品種の違いや、生態系の違いに起因する少数の変異
やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が
存在することは当業者に周知である。従って、本発明の
変異型ＬＤＨ−Ｂの遺伝子は、配列番号５に記載の塩基
配列を有する野生型ＬＤＨ−Ｂ遺伝子に由来するものに
限定されるわけではなく、上述した本発明の変異型ＬＤ
Ｈ−Ｂの生化学的性質を有するポリペプチドをコードす
る全ての遺伝子を包含する。

【００４４】本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子の好ましい態様
は、配列番号２に記載の塩基配列を有するものである。
配列番号２の塩基配列を有する本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝
子を有する発現プラスミドで形質転換された大腸菌形質
転換細胞は、平成１３年１月１６日に寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７４３１で、経済産業省産業技術総合研究所生
命工学工業技術研究所（〒３０５−８５６６ 茨城県つ
くば市東１丁目１番３号）に微生物の国際寄託に関する
ブタペスト条約に基づき国際寄託されている。

【００４５】本発明の変異型はまた、まず野生型のＬＤ
Ｈ−Ｂ遺伝子を得て、それに変異を施すことにより得る
ことも可能である。例えば配列番号５に記載の塩基配列
を有する野生型のＬＤＨ−Ｂ遺伝子は、特開平９−２６
２０８９に記載されているように、平成７年１１月１３
日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（当
時）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９２で国際寄託さ
れている酵母宿主細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＹＲｐ１Ｇ−ｃＬＤ−Ｂ）から得
ることができる。また、必要に応じ特開平９−２６２０
８９に記載されているように、ニワトリ心臓ｍＲＮＡ由
来のｃＤＮＡライブラリーから、例えばプラークハイブ
リダイゼーション法を利用して得ることもできるし、あ
るいはまた本発明により決定されたＤＮＡの塩基配列に
基づいて、ニワトリ心臓ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブ
ラリーを鋳型とするＰＣＲ法により、又はニワトリ心臓
ｍＲＮＡを出発物質とするＲＴ−ＰＣＲ法により容易に
調製することもできる。このように調製したＬＤＨ−Ｂ
ｃＤＮＡを利用して後述する方法により変異体を調製
することもできる。

【００４６】あるいはまた、本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂ
遺伝子であって、配列番号２に記載された塩基配列を有
するもの、さらに配列番号２以外の塩基配列を有するも
のも、本明細書中の配列番号１に記載された変異型ＬＤ
Ｈ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードす
るＤＮＡ配列、またはそれらの一部に基づいて、例え
ば、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子
工学の基本的手法を用いて得ることが可能である。これ
らの遺伝子工学的手法を用いてさらに同様の生理活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子を単離することも
可能である。

【００４７】遺伝子のスクリーニングのために使用する
ハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一
般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、
２×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤ
Ｓ、４５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション
条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリ
ダイゼーションの温度としては、より好ましくは５５℃
ないし６８℃（ホルムアミド無し）または４５℃ないし
５５℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。
ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイ
ゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相
同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクロ
ーニングできることは当業者に周知であり、このように
してクローニングされた相同遺伝子も本発明の変異ＬＤ
Ｈ−Ｂを製造するために用いられ得る。

【００４８】核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応
（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３０，ｐ．１３５０−１３５４）、ライゲース連鎖反応
（ＬＣＲ）（ウーら、１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
４，ｐ．５６０−５６９；バリンガーら、１９９０，Ｇ
ｅｎｅ ８９，ｐ．１１７−１２２；バラニーら、１９
９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８，ｐ．１８０９−１９３）および転写に基づく増
幅（コーら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，ｐ．１１７３−１１７７）
等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（Ｓ
ＤＡ）（ウォーカーら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，ｐ．３９２−３
９６；ウォーカーら、１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．
Ｒｅｓ．２０，ｐ．１６９１−１６９６）、自己保持配
列複製（３ＳＲ）（グアテリら、１９９０，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，ｐ．１８
７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リ
ザイルディら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６，ｐ．１１９７−１２０２）等の恒温反応を含む。
また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標
的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増
幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂ
ａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢ
Ａ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法であ
る。

【００４９】上記のようなハイブリダイゼーション、核
酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子
は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列に対して少な
くとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好まし
くは９５％以上の相同性を有する。

【００５０】ニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子の塩基配列に基
づいて、ニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子を得るための核酸増
幅反応に用いる増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを
作製できる。より詳細には、オリゴヌクレオチドは、例
えば、配列番号２の塩基配列から以下の条件を満たすよ
うに２つの領域を選択し： １）各領域の長さが１５−３０塩基であること； ２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であるこ
と；および ３）各領域間の距離が約１００−約１０００塩基である
こと 上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩
基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一
本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化さ
せないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡ
の混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質
をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失
わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造すること
を含む方法により製造することが可能である。当該オリ
ゴヌクレオチド用いて、例えば本発明の変異型ＬＤＨ−
Ｂ遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼ
ーション、適当な２種をプライマー対として用いたＰＣ
Ｒ等の増幅反応、あるいは変異を導入する部分を含む適
当な相補的なプライマー対を用いた部位特異的突然変異
導入するための温度循環反応に用いることが可能であ
る。

【００５１】本発明の変異ＬＤＨ−Ｂ遺伝子は、上述の
ように得られた野生型のＬＤＨ−ＢをコードするＤＮＡ
配列、またはそれらの一部を利用して、例えば、周知技
術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．
２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２）を施すこと
によって得ることもできる。また、市販の部位突然変異
誘発用キット（例えば、Ｓｔａｒａｇａｇｅｎ社のＱｕ
ｉｋＣｈａｎｇｅ^TM Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍ
ｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ Ｋｉｔ）を利用することもでき
る。なお、本明細書において「１または複数個のアミノ
酸残基」とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失
または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。

【００５２】部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の
変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき、例
えばファージ等の一本鎖ＤＮＡに相補的な合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて次のように行うことがで
きる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオ
チドを用いて上記一本鎖ＤＮＡに相補的な鎖を合成さ
せ、得られた二本鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。
形質転換された宿主細胞の培養物を寒天にプレートし、
上記ＤＮＡを含有する単一細胞からプラークを形成せし
める。すると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖
として変異を有するＤＮＡを含有し、残りの５０％が元
の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全
に一致するものとはハイブリダイズするが、不一致のも
の、即ち元の配列を有するものとはハイブリダイズしな
い温度において、得られたプラークをラジオアイソトー
プ等で標識された合成プローブとハイブリダイズさせ
る。次に該プローブとハイブリダイズするプローブを拾
い、培養しＤＮＡを回収する。

【００５３】尚、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ
酸配列にその活性を喪失せしめない１又は複数のアミノ
酸の置換、欠失または挿入を施す方法としては、上記の
部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理す
る方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌ
クレオチドを除去、付加または置換し、次いで連結する
方法もある。尚、上記した本発明の核酸の両端、即ち翻
訳開始暗号および翻訳停止暗号は、それぞれ任意の核酸
断片と結合することができる。この核酸断片の塩基配列
のサイズは重要ではなく、バクテリア等の有する核外遺
伝子と連結するための適当な核酸断片であればよい。

【００５４】さらに、組換えタンパク質の発現量を高め
る、回収を容易にする等の目的ための変異を行うこと
は、当該技術分野において通常行われている改変であ
り、このようなこのも当然本発明の範囲に含まれる。

【００５５】組換え変異型ニワトリＬＤＨのＢ型サブユ
ニットポリペプチドの製造 さらに、本発明は変異型ＬＤＨ−Ｂ をコードする核酸
を含む発現ベクター、及びこれら発現ベクターを含有す
る宿主細胞を変異型ＬＤＨ−Ｂポリペプチドの発現に適
する条件下で培養して、その発現された変異型ＬＤＨ−
Ｂを回収することにより組換え変異型ＬＤＨ−Ｂポリペ
プチドを製造する方法も提供する。

【００５６】本発明の組換え変異型ＬＤＨ−Ｂ（以下、
場合により「ＬＤＨ−Ｂ」と略称する）ポリペプチドを
製造するためには、使用する宿主細胞に応じて選ばれた
発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆
虫遺伝子等から誘導された、適当な転写又は翻訳調節ヌ
クレオチド配列に連結した変異型ＬＤＨ−Ｂ ＤＮＡ配
列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモータ
ー、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソ
ーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御
する適切な配列が挙げられる。加えて、ＬＤＨ−Ｂ遺伝
子に本来存在しない適切なシグナルペプチドをコードす
る配列を発現ベクター内に組み込んでもよい。

【００５７】変異型ＬＤＨ−Ｂポリペプチドの発現に適
する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が
含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で
用いる適切なクローニング及び発現ベクターは、例え
ば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ら， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８
５） に記載されている。

【００５８】宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞
が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０
９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイ
セス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）な
ど）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例
示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリ
カツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル
由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹
立した培養細胞株などが例示される。特に好ましい宿主
細胞は大腸菌、より好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（ＪＭ
１０９のコンピテントセルは宝酒造等より市販されてい
る）である。

【００５９】好ましい宿主細胞は原核細胞である。原核
生物には、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸
菌又は枯草菌が含まれる。大腸菌のような原核細胞内で
は、ｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドは、原核細胞内でも組換
えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオ
ニン残基を含んでもよい。このＮ末端Ｍｅｔは、公知の
方法により発現後に組換えｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドか
ら切り離すことができる。宿主細胞として細菌、特に大
腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、
プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、ＬＤＨ
−Ｂ酵素タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、
ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。

【００６０】原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、
一般に１又は２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を
含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生
物質耐性を付与するか又は独立栄養要求性を付与する遺
伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例に
は、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の如き市販の
プラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれ
る。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリ
ン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を
同定するのが簡単である。適切なプロモーターおよびｃ
ＬＤＨ−Ｂ ＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター
内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐ
ＴＲＰ（Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．ら，１９９５ Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ． Ｖｏｌ．２３７（１−２），ｐ
ｐ．４３−５８）、ｐＫＫ２２３−３（スェーデン、ウ
プサラの Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）及びｐＧＥＭ１（米国、ウィスコンシン州、
マジソンの ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ）が含まれ
る。

【００６１】原核宿主細胞用の発現ベクターに普通に用
いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター（Ｃｈａｎｇ
ら，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５， １９７８；及
び Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４
４， １９７９）等が含まれる。特に有用な原核宿主細
胞発現系は、ファージλＰ_Lプロモーター及びｃＩ８５
７ｔｓ不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λＰ_Lプロ
モーターの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションから入手できるプラスミド
ベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ
９（ＡＴＣＣ３７０９２）内に存する）及びｐＰＬｃ２
８（大腸菌ＲＰ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存する）
が含まれる。

【００６２】好ましい宿主細胞の他の例は酵母細胞であ
る。好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビ
シエ）を用いるが、ピキア （Ｐｉｃｈｉａ） 又はク
ルイベロミセス （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ） の
如き他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２
μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自律複製配列
（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のため
の配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカ
ー遺伝子を含有することが多い。酵母ベクターに適する
プロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、
３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ
ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：２０７
３， １９８０）又は他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，
Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４
９， １９６８；及び Ｈｏｌｌａｎｄら， Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ． １７：４９００， １９７８）、例えば、エ
ノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキ
シラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−
ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートム
ターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェート
イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグ
ルコキナーゼが含まれる。酵母発現に用いるのに適する
他のベクター及びプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎ，
ＥＰＡ−７３，６５７に更に記載されている。もう１
つの代用物は、Ｒｕｓｓｅｌｌ ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４， １９８２）及び Ｂ
ｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４， １９８
２）により記載されたグルコース被抑制性ＡＤＨ２プロ
モーターである。大腸菌内での選択及び複製のためのｐ
ＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子及び複製
の起点）を上記の酵母ベクター内に挿入することによ
り、酵母及び大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクタ
ーを構築することができる。

【００６３】酵母α因子リーダー配列を用いて、ｃＬＤ
Ｈ−Ｂポリペプチドの分泌を行わせることができる。こ
のα因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝
子配列の間に挿入されることが多い。例えば、Ｋｕｒｊ
ａｎら， Ｃｅｌｌ ３０：９３３， １９８２；Ｂｉ
ｔｔｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ． ＵＳＡ ８１：５３３０， １９８４；米国特
許第４，５４６，０８２号；及びＥＰ３２４，２７４を
参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌
を促進するのに適する他のリーダー配列も知られてい
る。リーダー配列は、１又は２以上の制限部位を含有す
るようにその３’末端の近くで修飾されていてもよい。
これは、そのリーダー配列の構造遺伝子への連結を容易
にするであろう。

【００６４】酵母の形質転換手順は公知である。かかる
手順の１つは、Ｈｉｎｎｅｎら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１９２
９，１９７８ に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらの手
順は、選択培地中でＴｒｐ⁺形質転換体を選択するもの
であって、その選択培地は、０．６７％酵母窒素原基、
０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌ
アデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。

【００６５】発現を誘発するために、ＡＤＨ２プロモー
ター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母
宿主細胞を“リッチ”培地中で生育させてもよい。リッ
チ培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／
ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプト
ン、及び１％グルコースからなる培地である。ＡＤＨ２
プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から消費
され尽くした時に起こる。

【００６６】哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用い
て、組換えｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドを発現することも
できる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができ
る。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻
訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができる。
普通に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配
列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２等から誘
導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０
起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプ
ライス部位、及びポリアデニル化部位から誘導されるＤ
ＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子
配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。哺
乳動物宿主細胞内で用いるための発現ベクターは、例え
ば Ｏｋａｙａｍａ 及び Ｂｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅ
ｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０，１９８３）の方法で
構築することができる。

【００６７】ｃＬＤＨ−Ｂタンパク質をコードするＤＮ
Ａを含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ｃＬ
ＤＨ−Ｂタンパク質が発現する条件下で培養することに
よって組換えｃＬＤＨ−Ｂタンパク質を産生できる。産
生された組換えｃＬＤＨ−Ｂサブユニットは、四量体を
形成してｃＬＤＨ−Ｂ₄アイソザイムとなる。次いで、
用いた発現系に依存して、組換えｃＬＤＨ−Ｂタンパク
質を培養培地又は細胞抽出液から回収する。ｃＬＤＨ−
Ｂタンパク質を精製する操作は、用いた宿主細胞の型及
びｃＬＤＨ−Ｂタンパク質が培養培地中に分泌されるか
どうかといった要因に応じて適宜決定してもよい。

【００６８】細菌宿主で産生した組換えｃＬＤＨ−Ｂタ
ンパク質は、通常宿主細胞内に存在するので、まず細胞
を崩壊し、細胞沈殿物または上澄み液を遠心分離や濾過
等で分離した後、濃縮、塩析、イオン交換、アフィニテ
ィ精製又はゲル濾過精製の適当な組み合わせにより単離
される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ−ＨＰＬＣ
を用いてもよい。微生物細胞宿主の破壊は、凍結−解凍
の繰り返し、音波処理、機械的崩壊、又は細胞溶解剤の
使用を含む適当な慣用的方法により行うことができる。

【００６９】形質転換酵母宿主を用いるときは、好まし
くはｃＬＤＨ−Ｂ₄を分泌ポリペプチドとして発現させ
ることができる。これにより精製が簡単になる。酵母宿
主細胞発酵上清に分泌された組換えポリペプチドは、Ｕ
ｒｄａｌ ら（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ２９６：
１７１， １９８４）により開示された方法と類似の方
法により精製することができる。 Ｕｒｄａｌらは、組
換えｃＬＤＨ−Ｂ₄の精製のための分取ＨＰＬＣカラム
での２連続逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。

【００７０】得られた組換え変異型ＬＤＨ−Ｂ₄タンパ
ク質は、例えば臨床検査薬の分野において、１）生成ピ
ルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、アラニ
ンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）等の種々のアミ
ノトランスフェラーゼの酵素活性を測定する場合や、
２）尿素等の種々の基質をピルビン酸に変換し、生成ピ
ルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、また、
３）検体中の内因性ピルビン酸の消去等に使用すること
ができる。特に、１）のＬＤＨを使用したアミノトラン
スフェラーゼ活性の測定は、臨床検査の一つとして広く
行われており、本発明により大量に得られた組換えｃＬ
ＤＨ−Ｂ₄タンパク質を使用することが可能となった。

【００７１】本発明の組換えｃＬＤＨ−Ｂ₄を使用した
トランスアミナーゼの酵素活性の測定およびＡＬＴ活性
の算出は、前述の特開平８−２８９、臨床検査提要 第
３１版」 １９９８年 金原出版株式会社 ｐｐ．６４
３−６４９等に記載の原理に従った公知の方法によって
行うことができる（例えば、実施例３に記載の方法）。参考文献 １． 特開平８−２８９ ２．「液状ＡＬＴ測定試薬に好適な耐熱型乳酸脱水素酵
素」 臨床化学 第２３巻補冊２号 １９９４年 １４
１ｂ） ３． 特開平９−２６２０８９ ４． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，
１９８２ ５． 臨床検査提要 第３１版」 １９９８年 金原出
版株式会社 ｐｐ．６４３−６４９等

【００７２】

【実施例】参考例１ ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼ
（ＬＤＨ）の熱安定性 特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ₄タンパ
ク質および天然のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サ
ブユニットタンパク質の熱安定性、特に溶液中、低濃度
の状態での耐熱性について検討した。具体的には、トラ
ンスアミナーゼ活性を測定するための構成成分として使
用されるＬＤＨ量は通常１−１０Ｕ／ｍＬ程度の範囲で
ある。よって、組換えＬＤＨ−Ｂ₄比活性（１３６Ｕ／
ｍｇタンパク質）より、熱安定性（および溶液安定性）
はＬＤＨタンパク質濃度として０．００７−０．０７ｍ
ｇ／ｍＬの範囲で測定すべきであると換算される。

【００７３】よって、下記表に示した各濃度になるよう
に、特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ₄タ
ンパク質（１０Ａ、２０７Ｖ）Ｈ−Ｂ、および天然のニ
ワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク
質（１０Ｔ、２０７Ａ）を５０ｍＭ リン酸ナトリウム
バッファー（ｐＨ７．０）に溶解した試料を調製した。
試料調製直後と、３０分間の熱処理後におけるＬＤＨ活
性を測定し、残存活性率を調べた。ＬＤＨ活性は、５０
ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−０．８ｍ
Ｍ ピリビン酸ナトリウム−０．３ｍＭ ＮＡＤＨを基
質混合液として用い、測定温度２５℃で１分間あたり１
μｍｏｌのＮＡＤ⁺生成量を１単位とした。

【００７４】

【表１】 表１ ６５℃熱安定性（残存活性率）とＬＤ−Ｂ₄タンパク質濃度との関係 試料中のＬＤ―Ｂ₄ 組換えＬＤＨ−Ｂ₄ 天然ＬＤＨ−Ｂ₄ タンパク質濃度 （１０Ａ、２０７Ｖ） （１０Ｔ、２０７Ａ） １ｍｇ／ｍＬ ９８％ ９０％ ０．１ ２０％ ９０％ ０．０１ １％ ９０％０．００１ ＜１％ ８５％ 表１に示したように、組換えＬＤＨ−Ｂ₄（１０Ａ、２
０７Ｖ）は１ｍｇ／ｍｌでは耐熱性を示すが、０．１ｍ
ｇ／ｍｌ以下では残存活性率が２０％と低下し、０．０
０１ｍｇ／ｍｌでは１％以下と実質的にほぼ失活してし
まった。

【００７５】実施例１ アミノ酸置換による変異酵素
（１０Ａ、２０７Ａ）の作製 ａ．Ｖ２０７Ａ発現プラスミドの構築 本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）は、前述した特
開平９−２６２０８９号記載のニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝
子（１０Ａ、２０７Ｖ）を基に作製した。具体的には、
特開平９−２６２０８９号記載のニワトリＬＤＨ−Ｂ
（１０Ａ、２０７Ｖ）は、２０７番目アミノ酸残基がバ
リンであるので、これをアラニンに変換するように、遺
伝子に突然変異を施した。

【００７６】具体的には、特開平９−２６２０８９号の
ニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子（１０Ａ、２０７Ｖ）をコー
ドするｃＤＮＡクローン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ−ＣＬＤＢ８−Ｅ／Ｂ）を含む環状２本鎖プラスミド
を鋳型とし、先ず、当該鋳型の変異を導入したい箇所
（２０７Ｖ）に対応する前後１０塩基程度からなる２重
鎖のオリゴヌクレオチド対をＤＮＡ合成機により合成し
た。プライマーの具体的な配列は下記の通りである。

【００７７】

【化４】 プライマー１（配列番号６） (611) tt aat gtg gca ggt gtt tct ctc c (634) aa tta cac cgt cca caa aga gag g プライマー２（配列番号７） 対応アミノ酸配列 (205) Asn Val Ala Gly Val Ser Leu (211) （アミノ酸置換部位に該当する改変塩基配列を下線で表記した） 前記二本鎖プラスミドを鋳型、前記オリゴヌクレオチド
対をプライマーとし、市販の部位突然変異誘発用キット
（例えば、Ｓｔａｒａｇａｇｅｎ社のＱｕｉｋＣｈａｎ
ｇｅ^TM Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎ
ｉｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いて、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ
ｆｕ Ｔｕｒｂｏ（登録商標） ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ）を用い、アニーリング反応後、温度循環反応
（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｉｎｇ）を行っ
た。温度循環反応により鋳型プラスミドが複製され、オ
リゴヌクレオチドプライマーに含まれる変異を有するニ
ックプラスミドが得られた。これを、メチル化されたＤ
ＮＡのみを切断する制限酵素酵素ＤｐｎＩで処理するこ
とにより、変異の入っていない鋳型プラスミドのみが切
断された。なお、制限酵素処理後、変異が入ったプラス
ミドを大腸菌に形質転換すると、大腸菌内でニックが修
復され、完全な環状プラスミドとして得られる。変異プ
ラスミドの具体的な調製手順はＳｔａｒａｔａｇｅｎｅ
社のキット使用説明書に従って行った。

【００７８】次いで、得られた上記変異を含む遺伝子を
含むプラスミドを用いて、市販のＪＭ１０９コンピテン
トセル（宝酒造製）を形質転換し、変異プラスミド
（「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−Ｖ２０７Ａ−Ｅ／
Ｂ」と呼ぶ）を回収した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ− Ｖ２０７Ａ −Ｅ／Ｂを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢ
ａｍＨＩで消化し、Ｖ２０７ＡをコードするＤＮＡを断
片化した。ＤＮＡ断片を抽出し、ｐＴＲＰ発現プラスミ
ド（Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．ら，１９９５ Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．Ａｃｔａ． Ｖｏｌ．２３７（１−２），ｐｐ．
４３−５８）のＥｃｏＲＩ―ＢａｍＨＩ部位に連結挿入
し、発現プラスミド（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ）を作製し
た。市販ＪＭ１０９コンピテントセルをｐＴＲＰ−Ｖ２
０７Ａにて形質転換し、組換えＶ２０７Ａタンパク質を
発現する形質転換体（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０
９）を得た。ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０９は、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＲ
Ｐ−ｃＬＤＨとして、平成１３年１月１６日に寄託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−７４３１で、経済産業省産業技術総合
研究所生命工学工業技術研究所（〒３０５−８５６６
茨城県つくば市東１丁目１番３号）に微生物の国際寄託
に関するブタペスト条約に基づき国際寄託された。

【００７９】ｂ．形質転換体の培養 大腸菌形質転換体（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０
９）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培
地プレート上でコロニー化し、白金耳にて単一コロニー
を１００ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地が入ったフ
ラスコにて３７℃、終夜振盪培養した。得られた菌体懸
濁液より、遠心分離にて菌体を集め、さらに超音波破砕
処理を行い発現した組換えタンパク質を抽出した。

【００８０】本発明の（１０Ａ、２０７Ａ）変異型タン
パク質（本明細書中、以下、簡便のため「Ｖ２０７Ａ）
と呼称する）は、超音波破砕処理にて可溶性分画に回収
された。培養液あたり５Ｕ／ｍＬの活性発現量であっ
た。ＬＤＨ活性は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）−０．８ｍＭ ピリビン酸ナトリウム−
０．３ｍＭ ＮＡＤＨを基質混合液として用い、測定温
度２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤ⁺生成量を
１単位とした。

【００８１】ｃ．Ｖ２０７Ａタンパク質の精製 上記の超音波破砕処理した遠心分離上清を出発材料と
し、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅゲルを用いたイ
オン交換クロマトグラフィー、フェニル−セファロース
ＣＬ４Ｂを用いた疎水クロマトグラフィー、さらにＵｌ
ｔｒｏｇｅｌ ＡＣＡ４４を用いたゲルろ過クロマトグ
ラフィーを行うことにより、Ｖ２０７Ａタンパク質を精
製した。

【００８２】具体的には、先ずイオン交換クロマトグラ
フィーで素通り分画に回収されたＶ２０７Ａを疎水クロ
マトグラフィーにて吸着溶出分画に分離精製した。硫安
濃度のグラジエント溶出にて０．５−０Ｍの硫安分画に
Ｖ２０７Ａが回収できた。次いで、ゲルろ過クロマトグ
ラフィーにより分子量１５０，０００のところに位置す
るＶ２０７Ａを回収した。

【００８３】大腸菌形質転換体（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ
／ＪＭ１０９）より最終的に得られたＶ２０７Ａタンパ
ク質精製標品の理化学的性質を下記の表２にまとめた。

【００８４】

【表２】酵素反応： ピルビン酸＋ＮＡＤＨ⇔Ｌ−乳酸
＋ＮＡＤ⁺ 分子量： １５０，０００（ゲルろ過、４量体） 作用ｐＨ： ｐＨ５−８（２５℃測定） ｐＨ安定性： ｐＨ５−９（６０℃、３０分間の熱処
理） 熱安定性： ６５℃まで失活しない（ｐＨ７、３０分間
の熱処理） 補酵素特異性： ＮＡＤＨを１００％とした時、ＮＡＤ
ＨアナログであるＡＰＡＤＨとの反応性は１０％程度 また、Ｖ２０７Ａは比活性３５０Ｕ／ｍｇを示し、特開
平９−２６２０８９号記載のものに比べ２．５倍の高比
活性型となった。実施例２ Ｖ２０７Ａタンパク質の熱安定性 実施例１で得られたＶ２０７Ａ精製タンパク質を１Ｕ／
ｍＬ（０．００３ｍｇタンパク質／ｍＬ）になるように
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
し、４５℃、５５℃、６５℃、７５℃の各温度にて３０
分間熱処理をおこなった。また、同様に５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて溶解したＶ２０７Ａにつ
いても同様に熱処理を行った。

【００８５】熱処理後のＶ２０７Ａタンパク質（１０
Ａ、２０７Ａ）の残存活性率（％）をニワトリ心臓から
精製した天然酵素タンパク質（オリエンタル酵母製）
（１０Ｔ、２０７Ａ）および特開平９−２６２０８９号
の組換えＬＤ−Ｂ４タンパク質（１０Ａ、２０７Ｖ）を
対照品として比較した。結果を図１に示す。

【００８６】図１より、Ｖ２０７Ａは対照品２者と比べ
て優れた耐熱性を示した。例えば、０．００３ｍｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で９３％の残存
活性率を示した。また、ｐＨ９．０の条件下でも０．０
０３ｍｇ／ｍｌ、５５℃、３０分間の熱処理で９８％、
６５℃の熱処理で９３％の残存活性率を示した。実施例３ Ｖ２０７Ａタンパク質を構成成分とする活性
測定試薬を用いたヒトプール血清中のアラニンアミノト
ランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性測定 ａ．アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性
測定試薬の調製 以下の液状試薬Ｒ−１及びＲ−２を調製し、以下のアラ
ニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性の測定に
使用した。

【００８７】

【表３】Ｒ−１試薬（ｐＨ９．２） １０ｍＭ トリス ０．４５ｍＭ ＮＡＤＨ ３２００Ｕ／Ｌ 組換えＬＤＨ（Ｖ２０７Ａ） １８１ｍＭ Ｌ−アラニン １ｍＭ ＥＤＴＡ−２ナトリウム ０．１％アジ化ナトリウムＲ−２試薬（ｐＨ７．２） １６０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ４７ｍＭ ２−オキソグルタル酸 １．２Ｍ Ｌ−アラニン ３ｍＭ ＥＤＴＡ−２ナトリウム ０．１％ アジ化ナトリウム ｂ．ＡＬＴの活性測定 ＡＬＴ活性測定方法およびＡＬＴ活性の算出方法につい
ては、「臨床検査提要第３１版」 １９９８年 金原出
版株式会社 ｐｐ．６４３−６４９に記載の原理に従っ
た。具体的には先ず、測定試料（ヒトプール血清）を１
５μＬ、Ｒ−１試薬を２４０μＬ、Ｒ−２試薬を１２０
μＬを混合し、以下の式で示される反応を開始した。

【００８８】

【化５】 反応開始から１分後から５分後までの３４０ｎｍにおけ
る吸光後減少量を日立７１５０型自動分析機にてモニタ
リングし、１分間あたりの吸光度減少量を求めた。当該
吸光度減少量を利用し、以下の式に従って、試料中のＡ
ＬＴ活性（Ｕ／Ｌ、３７℃）を算出した。

【００８９】

【化６】 Ａ１／分： 試料を用いた場合の反応開始後の１分間あ
たりの３４０ｎｍにおける吸光度減少量 Ａ２／分： 対照（生理食塩水）を用いた盲験の場合の
反応開始後の１分間あたりの３４０ｎｍにおける吸光度
減少量 ６．３ × １０³： ＮＡＤＨの分光吸光係数（ＮＡ
Ｄ⁺の１モル濃度あたり） 試料液量、Ｒ１液量およびＲ２液量の単位はμＬであ
る。結果を図２に示す。ＡＬＴ測定における直線性を、
原点を通る直線回帰より理論値の±５％範囲と設定する
と、本実施例のａで調製した液状試薬の場合は、０−
２，０００Ｕ／Ｌ（３７℃）と良好な結果となった。調
製試薬を４５℃で２日間虐待保存し、保存後の劣化度を
ＡＬＴ直線性より求めた。その結果、４５℃２日間虐待
保存後でもＡＬＴ直線性は初期性能を維持していた。

【００９０】また、液状試薬の構成成分として共存する
補酵素ＮＡＤＨの保存安定性についてもその残存率を調
べた。具体的にはＮＡＤＨをＬＤＨタンパク質と混合し
て試薬Ｒ−１を調製した直後の初期吸光度に対する保存
経過後の吸光後の割合として試算した。

【００９１】

【化７】ＮＡＤＨ残存率＝（保存経過後の吸光後）／
（試薬調製直後） その結果、本発明のＶ２０７Ａタンパク質は、天然酵素
タンパク質（１０Ｔ、２０７Ａ）および特開平９−２６
２０８９号の組換えＬＤ−Ｂ４タンパク質（１０Ａ、２
０７Ｖ）と比較して、高い成分安定性を示した。４５℃
で２日間虐待保存後の、ＬＤ活性およびＮＡＤＨ残存率
の結果を図３にまとめた。

【００９２】

【発明の効果】本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲ
ナーゼＢ型サブユニットは、耐熱性および溶液安定性に
優れている。よって、本発明のＬＤＨの産業的な量産化
の達成により、より安定な組換え型乳酸デヒドロゲナー
ゼが供給が可能となった。特に臨床面において生体液中
のトランスアミナーゼ活性を汎用的な測定を可能とし
た。

【００９３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Oriental Yeast Co., Ltd. NAITOU Toshiaki <120> <130> 010031 <160> <210> 1 <211> 333 <212> PRT <213> chicken <214> 1 Met Ala Thr Leu Lys Glu Lys Leu Ile Ala Pro Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Thr Val Pro Ser Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Gln 20 25 30 Val Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Gly Lys Gly Leu Cys 35 40 45 Asp Glu Leu Ala Leu Val Asp Val Leu Glu Asp Lys Leu Lys Gly 50 55 60 Glu Met Met Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Gln Thr His 65 70 75 Lys Ile Val Ala Asp Lys Asp Tyr Ala Val Thr Ala Asn Ser Lys 80 85 90 Ile Val Val Val Thr Ala Gly Val Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser 95 100 105 Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg Asn Val Asn Val Phe Lys Phe Ile 110 115 120 Ile Pro Gln Ile Val Lys Tyr Ser Pro Asn Cys Thr Ile Leu Val 125 130 135 Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr Tyr Val Thr Trp Lys Leu 140 145 150 Ser Gly Leu Pro Lys His Arg Val Ile Gly Ser Gly Cys Asn Leu 155 160 165 Asp Thr Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Ala Glu Arg Leu Gly Ile 170 175 180 His Pro Thr Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu His Gly Asp 185 190 195 Ser Ser Val Ala Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly Val Ser 200 205 210 Leu Gln Glu Leu Asn Pro Ala Met Gly Thr Asp Lys Asp Ser Glu 215 220 225 Asn Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Glu Ser Ala Tyr Glu 230 235 240 Val Ile Arg Leu Lys Gly Tyr Thr Asn Trp Ala Ile Gly Leu Ser 245 250 255 Val Ala Glu Leu Cys Glu Thr Met Leu Lys Asn Leu Tyr Arg Val 260 265 270 His Ser Val Ser Thr Leu Val Lys Gly Thr Tyr Gly Ile Glu Asn 275 280 285 Asp Val Phe Leu Ser Leu Pro Cys Val Leu Ser Ala Ser Gly Leu 290 295 300 Thr Ser Val Ile Asn Gln Lys Leu Lys Asp Asp Glu Val Ala Gln 305 310 315 Leu Lys Lys Ser Ala Asp Thr Leu Trp Ser Ile Gln Lys Asp Leu 320 325 330 Lys Asp Leu 333 <210> 2 <211> 999 <212> DNA <213> chicken <400> 2 atggcgaccc tgaaggagaa gctgatcgcc cccgtggccg cgggcagcac ggttcccagc 60 aacaagatca ccgtggtggg ggtcgggcag gtggggatgg cgtgtgccat cagcatcctc 120 ggcaagggtc tttgtgatga gcttgctctg gttgatgttt tggaagacaa gctaaaagga 180 gaaatgatgg atctacagca tggcagcttg ttccttcaga ctcataagat tgtggcagac 240 aaagattatg ctgtcacagc caactccaag attgtggtag taactgcagg tgttcgtcag 300 caagaggggg agagtcgtct caacctggtt cagaggaatg tgaacgtctt caaattcatc 360 attcctcaga ttgtgaaata cagccccaat tgcactatcc ttgtggtttc caacccagtg 420 gatatattaa cctatgtcac atggaagctg agtggcctgc caaagcaccg tgtgattgga 480 agtggctgca atctagacac agctagattc cgctacctga tggctgagag acttggtatc 540 cacccaacca gctgccatgg ctggatttta ggagaacatg gtgattctag tgtggctgtt 600 tggagcggag ttaatgtggc aggtgtttct ctccaggagc tgaatcctgc catgggaact 660 gacaaagaca gcgagaactg gaaggaagtt cacaagcagg ttgttgaaag tgcctatgag 720 gtaatcagac tcaaggggta tacgaactgg gccattggtc ttagcgttgc tgagctctgt 780 gagacaatgc tgaagaactt gtaccgagtt cattctgtgt caacactggt aaagggcaca 840 tatggcattg agaacgatgt cttcctgagc ctgccttgtg tcctgagtgc ctctggattg 900 acaagtgtca tcaaccaaaa gctgaaggat gatgaagtgg ctcagctgaa gaagagtgca 960 gacacattgt ggagcatcca gaaagatctt aaagatctg 999 <210> 3 <211> 333 <212> PRT <213> chicken <214> 3 Met Ala Thr Leu Lys Glu Lys Leu Ile Thr Pro Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Thr Val Pro Ser Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Gln 20 25 30 Val Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Gly Lys Gly Leu Cys 35 40 45 Asp Glu Leu Ala Leu Val Asp Val Leu Glu Asp Lys Leu Lys Gly 50 55 60 Glu Met Met Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Gln Thr His 65 70 75 Lys Ile Val Ala Asp Lys Asp Tyr Ala Val Thr Ala Asn Ser Lys 80 85 90 Ile Val Val Val Thr Ala Gly Val Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser 95 100 105 Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg Asn Val Asn Val Phe Lys Phe Ile 110 115 120 Ile Pro Gln Ile Val Lys Tyr Ser Pro Asn Cys Thr Ile Leu Val 125 130 135 Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr Tyr Val Thr Trp Lys Leu 140 145 150 Ser Gly Leu Pro Lys His Arg Val Ile Gly Ser Gly Cys Asn Leu 155 160 165 Asp Thr Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Ala Glu Arg Leu Gly Ile 170 175 180 His Pro Thr Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu His Gly Asp 185 190 195 Ser Ser Val Ala Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly Val Ser 200 205 210 Leu Gln Glu Leu Asn Pro Ala Met Gly Thr Asp Lys Asp Ser Glu 215 220 225 Asn Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Glu Ser Ala Tyr Glu 230 235 240 Val Ile Arg Leu Lys Gly Tyr Thr Asn Trp Ala Ile Gly Leu Ser 245 250 255 Val Ala Glu Leu Cys Glu Thr Met Leu Lys Asn Leu Tyr Arg Val 260 265 270 His Ser Val Ser Thr Leu Val Lys Gly Thr Tyr Gly Ile Glu Asn 275 280 285 Asp Val Phe Leu Ser Leu Pro Cys Val Leu Ser Ala Ser Gly Leu 290 295 300 Thr Ser Val Ile Asn Gln Lys Leu Lys Asp Asp Glu Val Ala Gln 305 310 315 Leu Lys Lys Ser Ala Asp Thr Leu Trp Ser Ile Gln Lys Asp Leu 320 325 330 Lys Asp Leu 333 <210> 4 <211> 333 <212> PRT <213> chicken <214> 4 Met Ala Thr Leu Lys Glu Lys Leu Ile Ala Pro Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Thr Val Pro Ser Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Gln 20 25 30 Val Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Gly Lys Gly Leu Cys 35 40 45 Asp Glu Leu Ala Leu Val Asp Val Leu Glu Asp Lys Leu Lys Gly 50 55 60 Glu Met Met Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Gln Thr His 65 70 75 Lys Ile Val Ala Asp Lys Asp Tyr Ala Val Thr Ala Asn Ser Lys 80 85 90 Ile Val Val Val Thr Ala Gly Val Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser 95 100 105 Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg Asn Val Asn Val Phe Lys Phe Ile 110 115 120 Ile Pro Gln Ile Val Lys Tyr Ser Pro Asn Cys Thr Ile Leu Val 125 130 135 Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr Tyr Val Thr Trp Lys Leu 140 145 150 Ser Gly Leu Pro Lys His Arg Val Ile Gly Ser Gly Cys Asn Leu 155 160 165 Asp Thr Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Ala Glu Arg Leu Gly Ile 170 175 180 His Pro Thr Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu His Gly Asp 185 190 195 Ser Ser Val Ala Val Trp Ser Gly Val Asn Val Val Gly Val Ser 200 205 210 Leu Gln Glu Leu Asn Pro Ala Met Gly Thr Asp Lys Asp Ser Glu 215 220 225 Asn Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Glu Ser Ala Tyr Glu 230 235 240 Val Ile Arg Leu Lys Gly Tyr Thr Asn Trp Ala Ile Gly Leu Ser 245 250 255 Val Ala Glu Leu Cys Glu Thr Met Leu Lys Asn Leu Tyr Arg Val 260 265 270 His Ser Val Ser Thr Leu Val Lys Gly Thr Tyr Gly Ile Glu Asn 275 280 285 Asp Val Phe Leu Ser Leu Pro Cys Val Leu Ser Ala Ser Gly Leu 290 295 300 Thr Ser Val Ile Asn Gln Lys Leu Lys Asp Asp Glu Val Ala Gln 305 310 315 Leu Lys Lys Ser Ala Asp Thr Leu Trp Ser Ile Gln Lys Asp Leu 320 325 330 Lys Asp Leu 333 <210> 5 <211> 999 <212> DNA <213> chicken <400> 5 atggcgaccc tgaaggagaa gctgatcgcc cccgtggccg cgggcagcac ggttcccagc 60 aacaagatca ccgtggtggg ggtcgggcag gtggggatgg cgtgtgccat cagcatcctc 120 ggcaagggtc tttgtgatga gcttgctctg gttgatgttt tggaagacaa gctaaaagga 180 gaaatgatgg atctacagca tggcagcttg ttccttcaga ctcataagat tgtggcagac 240 aaagattatg ctgtcacagc caactccaag attgtggtag taactgcagg tgttcgtcag 300 caagaggggg agagtcgtct caacctggtt cagaggaatg tgaacgtctt caaattcatc 360 attcctcaga ttgtgaaata cagccccaat tgcactatcc ttgtggtttc caacccagtg 420 gatatattaa cctatgtcac atggaagctg agtggcctgc caaagcaccg tgtgattgga 480 agtggctgca atctagacac agctagattc cgctacctga tggctgagag acttggtatc 540 cacccaacca gctgccatgg ctggatttta ggagaacatg gtgattctag tgtggctgtt 600 tggagcggag ttaatgtggt aggtgtttct ctccaggagc tgaatcctgc catgggaact 660 gacaaagaca gcgagaactg gaaggaagtt cacaagcagg ttgttgaaag tgcctatgag 720 gtaatcagac tcaaggggta tacgaactgg gccattggtc ttagcgttgc tgagctctgt 780 gagacaatgc tgaagaactt gtaccgagtt cattctgtgt caacactggt aaagggcaca 840 tatggcattg agaacgatgt cttcctgagc ctgccttgtg tcctgagtgc ctctggattg 900 acaagtgtca tcaaccaaaa gctgaaggat gatgaagtgg ctcagctgaa gaagagtgca 960 gacacattgt ggagcatcca gaaagatctt aaagatctg 999 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> oligonucleotide designed for PCR primer <400> 6 ttaatgtggc aggtgtttct ctcc <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> oligonucleotide designed for PCR primer <400> 7 aattacaccg tccacaaaga gagg

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７
Ａ）の熱安定性およびｐＨ安定性を示す。

【図２】図２は、本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７
Ａ）のＡＬＴ測定における直線性能を示す。

【図３】図３は、本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７
Ａ）の長時間高温保存後の残存活性およびＮＡＤＨ安定
性に及ぼす影響を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/04 (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｑ 1/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (72)発明者 内田 浩二 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号 オリ エンタル酵母工業株式会社内 (72)発明者 松川 寛和 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号 オリ エンタル酵母工業株式会社内 (72)発明者 松尾 雄志 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号 オリ エンタル酵母工業株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA03 4B050 CC01 CC04 DD11 EE10 FF09E FF11E FF12E HH04 LL03 4B063 QA01 QQ03 QQ26 QQ82 QR04 QR42 QR57 QR65 QS28 QX01 4B065 AA26X AA77X AA80X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA28 CA46

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号
   １０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、
   そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸
   残基がアラニンであることを特徴とする、ニワトリ乳酸
   デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質。
2. 【請求項２】配列番号１のアミノ酸配列を有するか、ま
   たは、配列番号１のアミノ酸配列において１または複数
   個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミ
   ノ酸配列を有し（ただし、配列番号１のアミノ酸配列の
   アミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基はアラ
   ニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位
   置のアミノ酸残基はアラニンである）、かつ乳酸デヒド
   ロゲナーゼ活性を有する、請求項１に記載のニワトリ乳
   酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質。
3. 【請求項３】配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求
   項１または２に記載のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ
   型サブユニットタンパク質。
4. 【請求項４】補酵素ＮＡＤＨの存在下でピルビン酸を乳
   酸に変換する活性を有し、そしてゲル濾過クロマトグラ
   フィーで４量体の状態で分子量が約１５０，０００であ
   るニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタン
   パク質であって、以下の性質： １）０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱
   処理で失活せず；そして ２）ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない を有することを特徴とする、前記ニワトリ乳酸デヒドロ
   ゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質。
5. 【請求項５】さらに０．００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９、５
   ５℃、３０分間の熱処理でも失活しないという性質を有
   する、請求項４に記載のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼ
   Ｂ型サブユニットタンパク質。
6. 【請求項６】請求項１ないし５に記載のニワトリ乳酸デ
   ヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質をコードす
   る核酸。
7. 【請求項７】請求項１に記載のアミノ酸配列を有するニ
   ワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク
   質をコードする、請求項６に記載の核酸。
8. 【請求項８】請求項２に記載の塩基配列を有する、請求
   項６または７に記載の核酸。
9. 【請求項９】請求項６ないし８のいずれか１項に記載の
   核酸を含む、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユ
   ニットタンパク質を発現するためのベクター。
10. 【請求項１０】ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａである、請求項９
    に記載のベクター。
11. 【請求項１１】請求項９または１０のベクターによって
    形質転換された宿主細胞。
12. 【請求項１２】請求項９または１０のベクターによって
    形質転換された宿主細胞を、前記ベクターによるニワト
    リ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質の
    発現に適した条件下で培養することを含む、ニワトリ乳
    酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質の製造
    方法。
13. 【請求項１３】請求項１ないし５に記載のニワトリ乳酸
    デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を構成成
    分とするニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型タンパク質
    を含む、トランスアミナーゼ測定用試薬。