JP2000197487A - 耐熱性ホタルルシフェラ―ゼ、耐熱性ホタルルシフェラ―ゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラ―ゼの製造法 - Google Patents
耐熱性ホタルルシフェラ―ゼ、耐熱性ホタルルシフェラ―ゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラ―ゼの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列において、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルの
ルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水
性アミノ酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ、野生型ホタルルシフェラーゼのア
ミノ酸配列において、２１７及び３１５位のアミノ酸、
又はゲンジボタル若しくはヘイケボタルの２１７及び３
１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異さ
れていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラー
ゼ、当該耐熱性ルシフェラーゼをコードする遺伝子、当
該耐熱性ルシフェラーゼをコードする遺伝子を組み込ん
だベクター、及び当該ベクターを用いた耐熱性ホタルル
シフェラーゼの製造方法。 【効果】 本発明耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子の
発現により得られる耐熱性ホタルルシフェラーゼは、Ａ
ＴＰ等の微量検定等において極めて有用である。また本
発明の耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造方法により、
効率よく上記ルシフェラーゼを得ることが可能であり、
産業上極めて有用である。
配列において、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルの
ルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水
性アミノ酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ、野生型ホタルルシフェラーゼのア
ミノ酸配列において、２１７及び３１５位のアミノ酸、
又はゲンジボタル若しくはヘイケボタルの２１７及び３
１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異さ
れていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラー
ゼ、当該耐熱性ルシフェラーゼをコードする遺伝子、当
該耐熱性ルシフェラーゼをコードする遺伝子を組み込ん
だベクター、及び当該ベクターを用いた耐熱性ホタルル
シフェラーゼの製造方法。 【効果】 本発明耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子の
発現により得られる耐熱性ホタルルシフェラーゼは、Ａ
ＴＰ等の微量検定等において極めて有用である。また本
発明の耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造方法により、
効率よく上記ルシフェラーゼを得ることが可能であり、
産業上極めて有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性ホタルルシ
フェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規
な組み換え体ＤＮＡ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの
製造法に関する。
フェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規
な組み換え体ＤＮＡ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの
製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ルシフェラーゼは、発光素であるルシフ
ェリンの酸化を触媒して、これを発光させる発光酵素で
ある。そして、ルシフェリンの発光の際にＡＴＰ等の物
質を必要とする、ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米ボ
タル等由来のホタルのルシフェラーゼは、当該性質に基
づいて、上記ＡＴＰ等の微量定量に利用されている。
ェリンの酸化を触媒して、これを発光させる発光酵素で
ある。そして、ルシフェリンの発光の際にＡＴＰ等の物
質を必要とする、ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米ボ
タル等由来のホタルのルシフェラーゼは、当該性質に基
づいて、上記ＡＴＰ等の微量定量に利用されている。
【０００３】しかしながら、一般的にルシフェラーゼ
は、熱に対して不安定なため、試薬として保存する際に
失活しやすいという欠点を有する。かかる欠点を克服す
るための手段の一つとして、試薬に塩等を添加して、あ
る程度ルシフェラーゼを安定に保存することは可能であ
る。しかし、この場合にも、ルシフェラーゼの塩による
反応障害が惹起されがちであるという欠点が存在する。
は、熱に対して不安定なため、試薬として保存する際に
失活しやすいという欠点を有する。かかる欠点を克服す
るための手段の一つとして、試薬に塩等を添加して、あ
る程度ルシフェラーゼを安定に保存することは可能であ
る。しかし、この場合にも、ルシフェラーゼの塩による
反応障害が惹起されがちであるという欠点が存在する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者等
は、耐熱性ホタルルシフェラーゼを開発することを主た
る課題とする。
は、耐熱性ホタルルシフェラーゼを開発することを主た
る課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
ついて鋭意検討した結果、野性型ホタルルシフェラーゼ
における特定のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に変
換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し
た。すなわち、本願は、以下の発明を提供するものであ
る。 （１）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルのルシフェ
ラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ
酸に変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ遺伝子。 （２）野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタルのルシ
フェラーゼである（１）記載の耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子。 （３）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリ
ン若しくはフェニルアラニンである（１）又は（２）記
載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 （４）（１）又は（２）記載の耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とす
る新規な組み換え体ＤＮＡ。 （５）（４）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタル
ルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼの製造法。 （６）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルのルシフェ
ラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ
酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシ
フェラーゼ。 （７）野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタルのルシ
フェラーゼである（６）記載の耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ。 （８）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、２１７及び３１５位のアミノ酸、又はゲンジボタ
ル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び
３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異
されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシ
フェラーゼ遺伝子。 （９）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若し
くはゲンジボタルのルシフェラーゼである（８）記載の
耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 （１０）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バ
リン若しくはフェニルアラニンである（８）又は（９）
記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 （１１）（８）又は（９）記載の耐熱性ホタルルシフェ
ラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴と
する新規な組み換え体ＤＮＡ。 （１２）（１１）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱
性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア
属に属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホ
タルルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性
ホタルルシフェラーゼの製造法。 （１３）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列に
おいて、２１７及び３１５位のアミノ酸、又はゲンジボ
タル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及
び３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変
異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ。 （１４）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若
しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである（１３）記
載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
ついて鋭意検討した結果、野性型ホタルルシフェラーゼ
における特定のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に変
換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し
た。すなわち、本願は、以下の発明を提供するものであ
る。 （１）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルのルシフェ
ラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ
酸に変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ遺伝子。 （２）野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタルのルシ
フェラーゼである（１）記載の耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子。 （３）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリ
ン若しくはフェニルアラニンである（１）又は（２）記
載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 （４）（１）又は（２）記載の耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とす
る新規な組み換え体ＤＮＡ。 （５）（４）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタル
ルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼの製造法。 （６）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルのルシフェ
ラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ
酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシ
フェラーゼ。 （７）野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタルのルシ
フェラーゼである（６）記載の耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ。 （８）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、２１７及び３１５位のアミノ酸、又はゲンジボタ
ル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び
３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異
されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシ
フェラーゼ遺伝子。 （９）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若し
くはゲンジボタルのルシフェラーゼである（８）記載の
耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 （１０）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バ
リン若しくはフェニルアラニンである（８）又は（９）
記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 （１１）（８）又は（９）記載の耐熱性ホタルルシフェ
ラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴と
する新規な組み換え体ＤＮＡ。 （１２）（１１）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱
性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア
属に属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホ
タルルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性
ホタルルシフェラーゼの製造法。 （１３）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列に
おいて、２１７及び３１５位のアミノ酸、又はゲンジボ
タル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及
び３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変
異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ。 （１４）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若
しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである（１３）記
載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明における遺伝子の改変による耐熱性ルシフ
ェラーゼが提供される前提として、野性型のホタルのル
シフェラーゼ遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡを調製す
ることが必要である。野性型ホタルの遺伝子等の種類
は、提供が企図される耐熱性ルシフェラーゼ遺伝子の種
類に応じて用いられる。そして、ホタル由来のものであ
れば、如何なるものでも用いることが可能であり、例え
ば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米ボタル等由来の
ものを用いることが可能である。
する。本発明における遺伝子の改変による耐熱性ルシフ
ェラーゼが提供される前提として、野性型のホタルのル
シフェラーゼ遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡを調製す
ることが必要である。野性型ホタルの遺伝子等の種類
は、提供が企図される耐熱性ルシフェラーゼ遺伝子の種
類に応じて用いられる。そして、ホタル由来のものであ
れば、如何なるものでも用いることが可能であり、例え
ば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米ボタル等由来の
ものを用いることが可能である。
【０００７】これらの遺伝子等は、既に公知の方法に従
って調製される。例えば、野性型ゲンジボタル遺伝子及
びその組み換え体ＤＮＡは、特開平１−５１０８６号公
報に記載の方法により調製することが可能であり、ま
た、ヘイケボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは、
特公平７−１１２４３４号公報に記載の方法により調製
することが可能であり、また更に、北米ボタル遺伝子及
びその組み換え体ＤＮＡは、東洋紡績（株）より購入す
ることが可能である。本発明において、「北米ボタルの
ルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸」と
は、確定したルシフェラーゼのアミノ酸配列を、北米ボ
タルのルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較した場合
に、北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位のアミノ酸
に対応するアミノ酸を意味するものである。また本発明
において、「ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシ
フェラーゼの２１７及び３１５位と同等位置のアミノ
酸」とは、確定したルシフェラーゼのアミノ酸配列を、
ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの
アミノ酸配列と比較した場合に、ゲンジボタル若しくは
ヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位の
アミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。
って調製される。例えば、野性型ゲンジボタル遺伝子及
びその組み換え体ＤＮＡは、特開平１−５１０８６号公
報に記載の方法により調製することが可能であり、ま
た、ヘイケボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは、
特公平７−１１２４３４号公報に記載の方法により調製
することが可能であり、また更に、北米ボタル遺伝子及
びその組み換え体ＤＮＡは、東洋紡績（株）より購入す
ることが可能である。本発明において、「北米ボタルの
ルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸」と
は、確定したルシフェラーゼのアミノ酸配列を、北米ボ
タルのルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較した場合
に、北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位のアミノ酸
に対応するアミノ酸を意味するものである。また本発明
において、「ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシ
フェラーゼの２１７及び３１５位と同等位置のアミノ
酸」とは、確定したルシフェラーゼのアミノ酸配列を、
ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの
アミノ酸配列と比較した場合に、ゲンジボタル若しくは
ヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位の
アミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。
【０００８】具体的には、既製のアミノ酸の相同性の解
析用ソフト、例えばＭｉｃｒｏ ＧｅｎｉｅTM（ベック
マン社製）により、各々のルシフェラーゼのアミノ酸配
列とゲンジボタル若しくはヘイケボタルのアミノ酸配列
の相同性を比較することにより決定される。当該アミノ
酸としては、例えばアラニンが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。
析用ソフト、例えばＭｉｃｒｏ ＧｅｎｉｅTM（ベック
マン社製）により、各々のルシフェラーゼのアミノ酸配
列とゲンジボタル若しくはヘイケボタルのアミノ酸配列
の相同性を比較することにより決定される。当該アミノ
酸としては、例えばアラニンが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。
【０００９】さらに、本発明において、「疎水性アミノ
酸」としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチ
オニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン
又はシステイン等を挙げることができる。そして、これ
らの中でも、イソロイシン、ロイシン、バリン又はフェ
ニルアラニンは、疎水性値が高いという点で特に好まし
いものとして挙げることができる。
酸」としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチ
オニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン
又はシステイン等を挙げることができる。そして、これ
らの中でも、イソロイシン、ロイシン、バリン又はフェ
ニルアラニンは、疎水性値が高いという点で特に好まし
いものとして挙げることができる。
【００１０】野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の変異
処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行
ない得る。すなわち、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝
子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡ
と変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線
照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆
使する方法等を広く用いることができる。
処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行
ない得る。すなわち、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝
子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡ
と変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線
照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆
使する方法等を広く用いることができる。
【００１１】上記変異処理に用いられる変異原となる薬
剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル
−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、
亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシ
ル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件
は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能
であり、現実に所望の変異を野生型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定さ
れない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃
度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分以上、
好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、
所望の変異を惹起可能である。
剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル
−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、
亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシ
ル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件
は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能
であり、現実に所望の変異を野生型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定さ
れない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃
度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分以上、
好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、
所望の変異を惹起可能である。
【００１２】紫外線照射を行なう場合においても、上記
の通り常法に従うことができる（現代化学、ｐｐ２４〜
３０、１９８９年６月号）。蛋白質工学的手法を駆使す
る方法としては、一般的に、サイト−スペシフィック
ミュータジュネシス（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）として知られる手法を用いるこ
とができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｋｒａｍｅｒ，
Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ９４４１−９４５６（１９８
４）：Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ３５０−３
６７（１９８７）：Ｂａｕｅｒ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ７３−８１（１９
８５）），Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．
Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ８７４９−８７６４（１９８
５）：Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ８７
６５−８７８５（１９８５）：Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｋ．
Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ９６７９−９６９８（１９８
６））），Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄｓ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．，ｖｏｌ．８２，ｐｐ４８８−４９２（１９８
５）：Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ３６７
−３８２（１９８７））等が挙げられる。
の通り常法に従うことができる（現代化学、ｐｐ２４〜
３０、１９８９年６月号）。蛋白質工学的手法を駆使す
る方法としては、一般的に、サイト−スペシフィック
ミュータジュネシス（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）として知られる手法を用いるこ
とができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｋｒａｍｅｒ，
Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ９４４１−９４５６（１９８
４）：Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ３５０−３
６７（１９８７）：Ｂａｕｅｒ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ７３−８１（１９
８５）），Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．
Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ８７４９−８７６４（１９８
５）：Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ８７
６５−８７８５（１９８５）：Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｋ．
Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ９６７９−９６９８（１９８
６））），Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄｓ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．，ｖｏｌ．８２，ｐｐ４８８−４９２（１９８
５）：Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ３６７
−３８２（１９８７））等が挙げられる。
【００１３】なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成
法又は酵素合成法により、直接所望の改変ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子を合成し得ることはもちろんである。上
記方法により得られる所望のホタルルシフェラーゼ遺伝
子の塩基配列の決定・確認は、例えばマキサム−ギルバ
ートの化学修飾法〔Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，ｖｏｌ．６５，ｐｐ４９９−５６
０（１９８０）〕やＭ１３ファージを用いるジデオキシ
ヌクレオチド鎖終結法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ２６９−２７６
（１９８２）〕等により行ない得る。
法又は酵素合成法により、直接所望の改変ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子を合成し得ることはもちろんである。上
記方法により得られる所望のホタルルシフェラーゼ遺伝
子の塩基配列の決定・確認は、例えばマキサム−ギルバ
ートの化学修飾法〔Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，ｖｏｌ．６５，ｐｐ４９９−５６
０（１９８０）〕やＭ１３ファージを用いるジデオキシ
ヌクレオチド鎖終結法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ２６９−２７６
（１９８２）〕等により行ない得る。
【００１４】上述の如くして得られた耐熱性ホタルルシ
フェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファー
ジ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転
換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各
々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換・
形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エ
ッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ ３３８７６）、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１（ＡＴＣＣ ３３８４９）、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ １０１（ＡＴＣＣ３３６９
４）等を選択する場合には、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈａ
ｎ）の方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９
８５）〕等により形質転換するか、あるいは「モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、第２５６〜２６８頁、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）」記
載の方法等により形質導入することにより形質転換株あ
るいは形質導入株を得ることが可能である。
フェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファー
ジ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転
換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各
々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換・
形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エ
ッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ ３３８７６）、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１（ＡＴＣＣ ３３８４９）、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ １０１（ＡＴＣＣ３３６９
４）等を選択する場合には、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈａ
ｎ）の方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９
８５）〕等により形質転換するか、あるいは「モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、第２５６〜２６８頁、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）」記
載の方法等により形質導入することにより形質転換株あ
るいは形質導入株を得ることが可能である。
【００１５】そして、上記菌株より耐熱性ホタルルシフ
ェラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすること
により、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクター
ＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼ生産能を有するエシェリシア属に属す
る菌株を得ることができる。このようにして得られた菌
株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、
例えばピー・グーリー（Ｐ．Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法
〔ジェイ．バクテイオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）第１１６巻、第１０６４〜１０６６頁（１９７
３年）〕、デー・ビー・クレウェル（Ｄ．Ｂ．Ｃｌｅｗ
ｅｌｌ）の方法〔ジェイ．バクテイオロジー（Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１０巻、第６６７〜６７６
頁（１９７２年）〕等により得ることができる。
ェラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすること
により、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクター
ＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼ生産能を有するエシェリシア属に属す
る菌株を得ることができる。このようにして得られた菌
株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、
例えばピー・グーリー（Ｐ．Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法
〔ジェイ．バクテイオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）第１１６巻、第１０６４〜１０６６頁（１９７
３年）〕、デー・ビー・クレウェル（Ｄ．Ｂ．Ｃｌｅｗ
ｅｌｌ）の方法〔ジェイ．バクテイオロジー（Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１０巻、第６６７〜６７６
頁（１９７２年）〕等により得ることができる。
【００１６】そして、このようにして得られた組み換え
体ＤＮＡより耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有
するＤＮＡを得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに
制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを温度３０〜
４０℃、好ましくは３７℃程度で１〜２４時間、好まし
くは２時間程度作用させて、反応終了液をアガロースゲ
ル電気泳動法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０頁、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
（１９８２）〕記載で処理することにより得ることがで
きる。
体ＤＮＡより耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有
するＤＮＡを得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに
制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを温度３０〜
４０℃、好ましくは３７℃程度で１〜２４時間、好まし
くは２時間程度作用させて、反応終了液をアガロースゲ
ル電気泳動法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０頁、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
（１９８２）〕記載で処理することにより得ることがで
きる。
【００１７】上記のようにして得られた耐熱性ホタルル
シフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能
を有するエシェリシア属に属する菌株を用いて耐熱性ホ
タルルシフェラーゼを生産するには、この菌株を通常の
固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法
を採用して培養するのが好ましい。
シフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能
を有するエシェリシア属に属する菌株を用いて耐熱性ホ
タルルシフェラーゼを生産するには、この菌株を通常の
固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法
を採用して培養するのが好ましい。
【００１８】また、上記菌株を培養する培地としては、
例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、
コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふす
まの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、
リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あ
るいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したも
のが用いられる。
例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、
コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふす
まの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、
リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あ
るいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したも
のが用いられる。
【００１９】なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調
整するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ま
しくは３７℃前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時
間で、通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等により実施
するのが好ましい。培養終了後、培養物より耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段
を用いて得ることができる。
整するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ま
しくは３７℃前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時
間で、通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等により実施
するのが好ましい。培養終了後、培養物より耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段
を用いて得ることができる。
【００２０】例えば、常法により菌体を、超音波破砕処
理、磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶菌
酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の
存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵
素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶
液を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要に
よりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫
酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、
アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採
取し、粗酵素を得る。
理、磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶菌
酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の
存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵
素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶
液を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要に
よりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫
酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、
アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採
取し、粗酵素を得る。
【００２１】上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得る
には、例えばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバ
イオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる
吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳
動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖
密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマト法；
分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適
宜選択し、またこれらを組合わせて実施することによ
り、精製された酵素標品を得ることが出来る。
には、例えばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバ
イオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる
吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳
動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖
密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマト法；
分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適
宜選択し、またこれらを組合わせて実施することによ
り、精製された酵素標品を得ることが出来る。
【００２２】このようにして、所望の耐熱性ホタルルシ
フェラーゼを得ることができる。そして、当該耐熱性ホ
タルルシフェラーゼのうち耐熱性ゲンジ及びヘイケボタ
ルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、特開平１
−１４１５９２号公報記載の野性型ゲンジボタルのルシ
フェラーゼ、又は特開平１−２６２７９１号公報記載の
野性型ヘイケボタルのルシフェラーゼと同様である。 作用適温の範囲：０〜６５℃である。 ｐＨ、温度等による失活の条件： ｉ）ｐＨ４．０以下はｐＨ１２．０以上で４時間後完全
に失活する。
フェラーゼを得ることができる。そして、当該耐熱性ホ
タルルシフェラーゼのうち耐熱性ゲンジ及びヘイケボタ
ルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、特開平１
−１４１５９２号公報記載の野性型ゲンジボタルのルシ
フェラーゼ、又は特開平１−２６２７９１号公報記載の
野性型ヘイケボタルのルシフェラーゼと同様である。 作用適温の範囲：０〜６５℃である。 ｐＨ、温度等による失活の条件： ｉ）ｐＨ４．０以下はｐＨ１２．０以上で４時間後完全
に失活する。
【００２３】ｉｉ）ｐＨ７．８において温度６５℃、６
０分間の熱処理により完全に失活する。 熱安定性：温度５２℃、２０分間の処理で８０％以上
の残存酵素活性を有し、温度５２℃、６０分間の処理で
も６５％以上の残存酵素活性を有する。 発光波長：６２０±５ｎｍ また、当該耐熱性ホタルルシフェラーゼのうち耐熱性北
米ボタルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、Ｄ
ｅｌｕｃａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．７２，３−１５（１９７８）記載の野生型
北米ボタルのルシフェラーゼと同様である。 温度等による失活の条件：ｐＨ７．８において温度５
５℃、６０分間の熱処理により完全に失活する。 熱安定性：温度４０℃、２０分間及び６０分間の処理
で夫々８０％以上及び６５％以上の残存酵素活性を有す
る。 発光波長：６２０±５ｎｍ
０分間の熱処理により完全に失活する。 熱安定性：温度５２℃、２０分間の処理で８０％以上
の残存酵素活性を有し、温度５２℃、６０分間の処理で
も６５％以上の残存酵素活性を有する。 発光波長：６２０±５ｎｍ また、当該耐熱性ホタルルシフェラーゼのうち耐熱性北
米ボタルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、Ｄ
ｅｌｕｃａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．７２，３−１５（１９７８）記載の野生型
北米ボタルのルシフェラーゼと同様である。 温度等による失活の条件：ｐＨ７．８において温度５
５℃、６０分間の熱処理により完全に失活する。 熱安定性：温度４０℃、２０分間及び６０分間の処理
で夫々８０％以上及び６５％以上の残存酵素活性を有す
る。 発光波長：６２０±５ｎｍ
【００２４】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。 （実施例）なお、項目１及び２には、既に取得された耐
熱性ヘイケボタルルシフェラーゼの３１５番目のＡｌａ
を疎水性アミノ酸残基に置換することにより、更なるル
シフェラーゼの耐熱化を示した。また、項目３には、野
性型北米ボタルルシフェラーゼのヘイケボタルルシフェ
ラーゼの３１５番目と同等位置である３１３番目のＡｌ
ａを疎水性アミノ酸残基に置換して耐熱化を行なった例
を示した。
説明する。 （実施例）なお、項目１及び２には、既に取得された耐
熱性ヘイケボタルルシフェラーゼの３１５番目のＡｌａ
を疎水性アミノ酸残基に置換することにより、更なるル
シフェラーゼの耐熱化を示した。また、項目３には、野
性型北米ボタルルシフェラーゼのヘイケボタルルシフェ
ラーゼの３１５番目と同等位置である３１３番目のＡｌ
ａを疎水性アミノ酸残基に置換して耐熱化を行なった例
を示した。
【００２５】１．組み換え体プラスミドｐＨＬｆ７ＤＮ
Ａの変異 先ず、組み換え体ｐＨＬｆ７−２１７ＬｅｕＤＮＡ〔プ
ラスミドｐＵＣ１１９ＤＮＡに２１７番目のＡｌａがＬ
ｅｕに置換された耐熱変異のヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏ
ｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子（特
開平５−２４４９４２号公報記載）が挿入されたも
の。〕の１本鎖ＤＮＡをヘルパーファージＭ１３ Ｋ０
７（宝酒造社・製）を用いて調製し、ＤＮＡＭｏｄｅｌ
３９２シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製）を用いて合成したオリゴヌクレオチドＳ
ＬＦ１５（ＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣ
ＡＧＴＴ）とオリゴヌクレオチド−ダイレクティッド
インビトロ ミュータジェネシス システム バージョ
ン２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社・製）を用いて、ルシフェラ
ーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は変えずにルシフ
ェラーゼ遺伝子の内部に存在するＥｃｏＲＩ部位を除去
した組み換え体プラスミドｐＨＬｆ１０７ＤＮＡを得
た。
Ａの変異 先ず、組み換え体ｐＨＬｆ７−２１７ＬｅｕＤＮＡ〔プ
ラスミドｐＵＣ１１９ＤＮＡに２１７番目のＡｌａがＬ
ｅｕに置換された耐熱変異のヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏ
ｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子（特
開平５−２４４９４２号公報記載）が挿入されたも
の。〕の１本鎖ＤＮＡをヘルパーファージＭ１３ Ｋ０
７（宝酒造社・製）を用いて調製し、ＤＮＡＭｏｄｅｌ
３９２シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製）を用いて合成したオリゴヌクレオチドＳ
ＬＦ１５（ＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣ
ＡＧＴＴ）とオリゴヌクレオチド−ダイレクティッド
インビトロ ミュータジェネシス システム バージョ
ン２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社・製）を用いて、ルシフェラ
ーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は変えずにルシフ
ェラーゼ遺伝子の内部に存在するＥｃｏＲＩ部位を除去
した組み換え体プラスミドｐＨＬｆ１０７ＤＮＡを得
た。
【００２６】組み換え体プラスミドｐＨＬｆ１０７ＤＮ
Ａ３０μｇを、ヒドロキシルアミン溶液〔０．８Ｍ塩酸
ヒドロキシルアミン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）／１ｍＭＤＴＡ〕１００μＬに溶解し、６５℃で２
時間変異処理したのち、常法によりエタノール沈澱を行
ない沈澱物を回収した。この沈澱物をＴＥ緩衝液〔１０
ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭＤＴ
Ａ〕に溶解し、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈａｎ）の方法
〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）〕に
より、大腸菌ＪＭ１０１株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形
質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地〔バクトトリプトン１
％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣ
ｌ０．５％（Ｗ／Ｖ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍ
ｌ）及び１．４％（Ｗ／Ｖ）寒天〕に接種し、３７℃で
培養した。１２時間後、出現してきたコロニーをＬＢ−
ａｍｐ培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エ
キス０．５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（Ｗ／
Ｖ）、及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）〕３ｍｌ
中、３７℃で１８時間振盪培養を行なった。この培養液
０．５ｍｌを１０ｍｌの上記ＬＢ−ａｍｐ培地に接種
し、３７℃で４時間振盪培養したのち、８０００ｒ．
ｐ．ｍ．で１０分間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫
々２０ｍｇずつ得た。回収した菌体を、０．１０ＭＫＨ
2ＰＯ4（pH7.8）、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジテオスレ
イトール、及び０．２ｍｇ／ｍｌプロタミン硫酸からな
る緩衝液０．９ｍｌに懸濁し、更に、これに、１０ｍｇ
／ｍｌのリゾチーム溶液１００μＬを添加し、氷中に１
５分間放置した。次に、この懸濁液をメタノール、ドラ
イアイス浴中で凍結し、次いで温度２５℃に放置し、完
全に解凍した。更に、１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間
遠心分離操作を行なうことにより、上清として粗酵素１
ｍｌを得た。
Ａ３０μｇを、ヒドロキシルアミン溶液〔０．８Ｍ塩酸
ヒドロキシルアミン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）／１ｍＭＤＴＡ〕１００μＬに溶解し、６５℃で２
時間変異処理したのち、常法によりエタノール沈澱を行
ない沈澱物を回収した。この沈澱物をＴＥ緩衝液〔１０
ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭＤＴ
Ａ〕に溶解し、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈａｎ）の方法
〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）〕に
より、大腸菌ＪＭ１０１株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形
質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地〔バクトトリプトン１
％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣ
ｌ０．５％（Ｗ／Ｖ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍ
ｌ）及び１．４％（Ｗ／Ｖ）寒天〕に接種し、３７℃で
培養した。１２時間後、出現してきたコロニーをＬＢ−
ａｍｐ培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エ
キス０．５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（Ｗ／
Ｖ）、及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）〕３ｍｌ
中、３７℃で１８時間振盪培養を行なった。この培養液
０．５ｍｌを１０ｍｌの上記ＬＢ−ａｍｐ培地に接種
し、３７℃で４時間振盪培養したのち、８０００ｒ．
ｐ．ｍ．で１０分間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫
々２０ｍｇずつ得た。回収した菌体を、０．１０ＭＫＨ
2ＰＯ4（pH7.8）、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジテオスレ
イトール、及び０．２ｍｇ／ｍｌプロタミン硫酸からな
る緩衝液０．９ｍｌに懸濁し、更に、これに、１０ｍｇ
／ｍｌのリゾチーム溶液１００μＬを添加し、氷中に１
５分間放置した。次に、この懸濁液をメタノール、ドラ
イアイス浴中で凍結し、次いで温度２５℃に放置し、完
全に解凍した。更に、１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間
遠心分離操作を行なうことにより、上清として粗酵素１
ｍｌを得た。
【００２７】このようにして得られたルシフェラーゼを
含む粗酵素液を５５℃で３０分間熱処理し、その中の１
０μｌについて、特開平１−１４１５９２号公報記載の
方法で力価の測定を行なった。その結果２１７番目のＡ
ｌａがＬｅｕに置換されている耐熱性ヘイケボタルルシ
フェラーゼ（以下、ＬｌＬ−２１７Ｌと略称する）より
熱安定性に優れているものを得た。更に、この粗酵素液
を特開平１−１４１５９２号公報記載の方法で精製し、
上記の方法で熱処理し、力価を測定した結果、ＬｌＬ−
２１７Ｌより熱安定性に優れていことが判明した。以上
の如くして新たに得られた耐熱性ルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮ
ＡをｐＨＬｆ１０７Ｖと命名し、該組み換え体プラスミ
ドＤＮＡで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｖ）は工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５
３４５として寄託されている。
含む粗酵素液を５５℃で３０分間熱処理し、その中の１
０μｌについて、特開平１−１４１５９２号公報記載の
方法で力価の測定を行なった。その結果２１７番目のＡ
ｌａがＬｅｕに置換されている耐熱性ヘイケボタルルシ
フェラーゼ（以下、ＬｌＬ−２１７Ｌと略称する）より
熱安定性に優れているものを得た。更に、この粗酵素液
を特開平１−１４１５９２号公報記載の方法で精製し、
上記の方法で熱処理し、力価を測定した結果、ＬｌＬ−
２１７Ｌより熱安定性に優れていことが判明した。以上
の如くして新たに得られた耐熱性ルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮ
ＡをｐＨＬｆ１０７Ｖと命名し、該組み換え体プラスミ
ドＤＮＡで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｖ）は工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５
３４５として寄託されている。
【００２８】なお、特開平５−２４４９４２号公報記載
の方法によりｐＨＬｆ１０７ＶＤＮＡに含まれる変異Ｌ
ｌＬ−２１７Ｌ遺伝子の塩基配列の決定を行なったとこ
ろ、このようにして得られた変異型ホタルルシフェラー
ゼはＬｌＬ−２１７Ｌのアミノ酸配列において３１５位
のＡｌａがＶａｌに置換されていることが判明した。精
製した本酵素１００キロカウント（Ｋｃｏｕｎｔ）含有
する酵素液１００μｌ〔１００ｍＭリン酸カリウム、１
ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、２ｍＭ２−
メルカプトエタノール、１０％グリセリン、ｐＨ７．
５〕を温度５５℃で３０分間保持して残存する酵素活性
を測定した。その結果本酵素は上記条件で５．９％の残
存酵素活性を保持していた。なお、対照としてＬｌＬ−
２１７Ｌについても上記と同様にして残存酵素活性を測
定したところ残存酵素活性は１．１％であった。
の方法によりｐＨＬｆ１０７ＶＤＮＡに含まれる変異Ｌ
ｌＬ−２１７Ｌ遺伝子の塩基配列の決定を行なったとこ
ろ、このようにして得られた変異型ホタルルシフェラー
ゼはＬｌＬ−２１７Ｌのアミノ酸配列において３１５位
のＡｌａがＶａｌに置換されていることが判明した。精
製した本酵素１００キロカウント（Ｋｃｏｕｎｔ）含有
する酵素液１００μｌ〔１００ｍＭリン酸カリウム、１
ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、２ｍＭ２−
メルカプトエタノール、１０％グリセリン、ｐＨ７．
５〕を温度５５℃で３０分間保持して残存する酵素活性
を測定した。その結果本酵素は上記条件で５．９％の残
存酵素活性を保持していた。なお、対照としてＬｌＬ−
２１７Ｌについても上記と同様にして残存酵素活性を測
定したところ残存酵素活性は１．１％であった。
【００２９】２．部位特異的変換 次にＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のアラニンを疎水性
アミノ酸であるロイシン、イソロイシン及びフェニルア
ラニンに変換させる方法を記載する。大腸菌ＪＭ１０１
（ｐＨＬｆ１０７）にヘルパーファージＭ１３Ｋ０７
（宝酒造社製）を感染させることにより、メッシング
（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法〔メソズ イン エンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、第１０１巻、第２０〜７８項（１９８３）〕に従
って１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖ＤＮＡに
よる部位特異的変換はインビトロ ミュータジェネシス
システム バージョン２．０（アマシャム社製）を用
いて行なった。なお、部位特異的変換のプライマーとし
て用いる為に、合成ＤＮＡＳＬＦ１２９（配列番号１記
載）を合成した。なお、ＳＬＦ１２９内のｎがｇの場合
ＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のＡｌａがＬｅｕに置換
される。同様にｔの場合にはＩｌｅ、ａの場合にはＰｈ
ｅに置換される。
アミノ酸であるロイシン、イソロイシン及びフェニルア
ラニンに変換させる方法を記載する。大腸菌ＪＭ１０１
（ｐＨＬｆ１０７）にヘルパーファージＭ１３Ｋ０７
（宝酒造社製）を感染させることにより、メッシング
（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法〔メソズ イン エンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、第１０１巻、第２０〜７８項（１９８３）〕に従
って１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖ＤＮＡに
よる部位特異的変換はインビトロ ミュータジェネシス
システム バージョン２．０（アマシャム社製）を用
いて行なった。なお、部位特異的変換のプライマーとし
て用いる為に、合成ＤＮＡＳＬＦ１２９（配列番号１記
載）を合成した。なお、ＳＬＦ１２９内のｎがｇの場合
ＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のＡｌａがＬｅｕに置換
される。同様にｔの場合にはＩｌｅ、ａの場合にはＰｈ
ｅに置換される。
【００３０】また、部位特異的変換遺伝子のシークエン
シングは、ダイプライマー タックシークェンシング
キット（アプライド バイオシステムズ社製）を用いて
反応を行ない、ＡＢＩ３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー
（アプライド バイオシステムズ社製）で泳動、解析を
行なった。このようにして得られた部位特異的変換遺伝
子は、ＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のアミノ酸がロイ
シン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換さてい
るアミノ酸配列をコードしており、夫々のプラスミドを
ｐＨＬｆ１０７Ｌ、ｐＨＬｆ１０７Ｉ及びｐＨＬｆ１０
７Ｆと命名した。
シングは、ダイプライマー タックシークェンシング
キット（アプライド バイオシステムズ社製）を用いて
反応を行ない、ＡＢＩ３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー
（アプライド バイオシステムズ社製）で泳動、解析を
行なった。このようにして得られた部位特異的変換遺伝
子は、ＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のアミノ酸がロイ
シン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換さてい
るアミノ酸配列をコードしており、夫々のプラスミドを
ｐＨＬｆ１０７Ｌ、ｐＨＬｆ１０７Ｉ及びｐＨＬｆ１０
７Ｆと命名した。
【００３１】これらのプラスミドを夫々保有する大腸菌
ＪＭ１０１より項目１記載の方法により粗酵素液を得、
更にこの粗酵素液を精製した。このようにして得られた
精製ルシフェラーゼを、項目１記載の方法にて５５℃で
３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて残存する
酵素活性を測定したところ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｊ
Ｍ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｌ）由来ルシフェラーゼは、
２．１％残存酵素活性を保持し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｉ）由来ルシフェラー
ゼは、５．１％残存酵素活性を保持し、また大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｆ）由来
ルシフェラーゼは、２．１％残存酵素活性を保持した。
いずれも対照のＬｌＬ−２１７Ｌの残存酵素活性１．１
％を上回った。
ＪＭ１０１より項目１記載の方法により粗酵素液を得、
更にこの粗酵素液を精製した。このようにして得られた
精製ルシフェラーゼを、項目１記載の方法にて５５℃で
３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて残存する
酵素活性を測定したところ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｊ
Ｍ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｌ）由来ルシフェラーゼは、
２．１％残存酵素活性を保持し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｉ）由来ルシフェラー
ゼは、５．１％残存酵素活性を保持し、また大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｆ）由来
ルシフェラーゼは、２．１％残存酵素活性を保持した。
いずれも対照のＬｌＬ−２１７Ｌの残存酵素活性１．１
％を上回った。
【００３２】３．組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３０１
ＤＮＡの変異 次に北米ボタルのルシフェラーゼのヘイケボタルの３１
５位と同等の位置の残基を疎水性アミノ酸であるバリ
ン、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変
換させる方法を記載する。北米ホタルルシフェラーゼ
（ＰｐＬ）のアミノ酸配列において、ヘイケボタルルシ
フェラーゼ（ＬｌＬ）の３１５位のアミノ酸残基と同等
の位置を見い出すために、ベックマン社製のアミノ酸相
同性解析用ソフトＭｉｃｒｏ ＧｅｎｉｅTMを用いて両
者のアミノ酸配列を解析したところ、ＰｐＬの３１３位
のＡｌａがＬｌＬの３１５位に相当することが明らかに
なった。組み換え体ＤＮＡプラスミドｐＴ３／Ｔ７−Ｌ
ＵＣ（東洋紡・社・製）〔野性型北米ホタルルシフェラ
ーゼ（ＰｐＬ）の遺伝子を含有する〕よりＰｐＬ遺伝子
を含有する１．９ＫｂのＢａｍＨＩを切り出し、プラス
ミドｐＵＣ１１９（宝酒造社・製）のＢａｍＨＩ部位に
ＰｐＬ遺伝子の転写方向をラクトースプロモーターの転
写方向と同じ向きに挿入した組み換え体プラスミドｐＡ
Ｌｆ３０１を得た。
ＤＮＡの変異 次に北米ボタルのルシフェラーゼのヘイケボタルの３１
５位と同等の位置の残基を疎水性アミノ酸であるバリ
ン、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変
換させる方法を記載する。北米ホタルルシフェラーゼ
（ＰｐＬ）のアミノ酸配列において、ヘイケボタルルシ
フェラーゼ（ＬｌＬ）の３１５位のアミノ酸残基と同等
の位置を見い出すために、ベックマン社製のアミノ酸相
同性解析用ソフトＭｉｃｒｏ ＧｅｎｉｅTMを用いて両
者のアミノ酸配列を解析したところ、ＰｐＬの３１３位
のＡｌａがＬｌＬの３１５位に相当することが明らかに
なった。組み換え体ＤＮＡプラスミドｐＴ３／Ｔ７−Ｌ
ＵＣ（東洋紡・社・製）〔野性型北米ホタルルシフェラ
ーゼ（ＰｐＬ）の遺伝子を含有する〕よりＰｐＬ遺伝子
を含有する１．９ＫｂのＢａｍＨＩを切り出し、プラス
ミドｐＵＣ１１９（宝酒造社・製）のＢａｍＨＩ部位に
ＰｐＬ遺伝子の転写方向をラクトースプロモーターの転
写方向と同じ向きに挿入した組み換え体プラスミドｐＡ
Ｌｆ３０１を得た。
【００３３】このようにして得られた大腸菌より項目２
記載の方法で１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖
ＤＮＡによる部位特異的変換は、インビトロ ミュータ
ジェネシス システム バージョン−２．０（アマシャ
ム社製）を用いて行なった。なお、部位特異的変換のプ
ライマーとして用いる為に、以下の合成ＤＮＡＳＬＦ１
２７（配列番号２記載）を合成した。なお、ＳＬＦ１２
７内のｎがｃの場合，ＰｐＬの３１３番目のＡｌａがＶ
ａｌに置換される。同様にｇの場合はＬｅｕ、ｔの場合
はＩｌｅ，ａの場合はＰｈｅに置換される。
記載の方法で１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖
ＤＮＡによる部位特異的変換は、インビトロ ミュータ
ジェネシス システム バージョン−２．０（アマシャ
ム社製）を用いて行なった。なお、部位特異的変換のプ
ライマーとして用いる為に、以下の合成ＤＮＡＳＬＦ１
２７（配列番号２記載）を合成した。なお、ＳＬＦ１２
７内のｎがｃの場合，ＰｐＬの３１３番目のＡｌａがＶ
ａｌに置換される。同様にｇの場合はＬｅｕ、ｔの場合
はＩｌｅ，ａの場合はＰｈｅに置換される。
【００３４】また、部位特異的変換遺伝子のシークエン
シングは、ダイプライマータックシークエンシングキッ
ト（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を
行ない、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（ア
プライドバイオシステムズ社製）で泳動解析を行なっ
た。このようにして得られた組み換え体プラスミドにお
けるルシフェラーゼの部位特異的変換遺伝子は、ＰｐＬ
の３１３番目のアミノ酸に相当する遺伝子部分がバリ
ン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンに変換
さているアミノ酸配列をコードしており、夫々ｐＡＬｆ
３０３、ｐＡＬｆ３０４、ｐＡＬｆ３０６、ｐＡＬｆ３
０５と命名した。
シングは、ダイプライマータックシークエンシングキッ
ト（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を
行ない、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（ア
プライドバイオシステムズ社製）で泳動解析を行なっ
た。このようにして得られた組み換え体プラスミドにお
けるルシフェラーゼの部位特異的変換遺伝子は、ＰｐＬ
の３１３番目のアミノ酸に相当する遺伝子部分がバリ
ン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンに変換
さているアミノ酸配列をコードしており、夫々ｐＡＬｆ
３０３、ｐＡＬｆ３０４、ｐＡＬｆ３０６、ｐＡＬｆ３
０５と命名した。
【００３５】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＡ
Ｌｆ３０３）は、ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４４として工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。この
形質転換体及び野性型ＰｐＬを生産する組み換え体ＪＭ
１０１（ｐＡＬｆ３０１）より項目１記載の方法により
粗酵素液を得、更に、この粗酵素液を精製した。このよ
うにして得られた精製ルシフェラーゼを、項目１記載の
緩衝液中、４５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μ
ｌについて残存する酵素活性を測定したところ、野性型
ＰｐＬが３．２％の残存活性しか示さなかったのに対
し、３１３番目のＡｌａを夫々Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、Ｐｈｅに置換された変異型ＰｐＬは夫々５１．６
％、９．１％、２４．４％、２９．１％の残存活性を示
した。上記より明らかな如く本発明は、対照に比し著し
く耐熱性を有するルシフェラーゼであることが判った。
Ｌｆ３０３）は、ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４４として工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。この
形質転換体及び野性型ＰｐＬを生産する組み換え体ＪＭ
１０１（ｐＡＬｆ３０１）より項目１記載の方法により
粗酵素液を得、更に、この粗酵素液を精製した。このよ
うにして得られた精製ルシフェラーゼを、項目１記載の
緩衝液中、４５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μ
ｌについて残存する酵素活性を測定したところ、野性型
ＰｐＬが３．２％の残存活性しか示さなかったのに対
し、３１３番目のＡｌａを夫々Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、Ｐｈｅに置換された変異型ＰｐＬは夫々５１．６
％、９．１％、２４．４％、２９．１％の残存活性を示
した。上記より明らかな如く本発明は、対照に比し著し
く耐熱性を有するルシフェラーゼであることが判った。
【００３６】
【発明の効果】本発明により耐熱性ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子、この遺伝子を組み換え体ＤＮＡ及び該組み換
え体ＤＮＡを含む微生物により耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼを製造する方法並びにそのようにして得られた新規
な耐熱性ホタルルシフェラーゼが提供された。そして、
本発明の方法により、耐熱性ホタルルシフェラーゼを効
率よく生産することができるので、本発明は産業上極め
て有用である。
ゼ遺伝子、この遺伝子を組み換え体ＤＮＡ及び該組み換
え体ＤＮＡを含む微生物により耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼを製造する方法並びにそのようにして得られた新規
な耐熱性ホタルルシフェラーゼが提供された。そして、
本発明の方法により、耐熱性ホタルルシフェラーゼを効
率よく生産することができるので、本発明は産業上極め
て有用である。
【００３７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KIKKOMAN CORPORATION <120> THERMOSTABLE LUCIFERASE OF FIREFLY, THERMOSTABLE LUCIFERASE GENE OF FIREFLY,NOVEL RECOMBINANT DNA, AND PROCESS FOR THE PREPARATI ON OF THERMOSTABLE LUCIFERASE OF FIREFLY <130> P2036 <160> 2 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gataaaggag ctccgccaga aanaatttca actaaatttg 40
【００３８】 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 gaggtgcacc cccagaaana atttcgtgta aattaga 37
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年９月７日（１９９９．９．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】このようにして得られたルシフェラーゼを
含む粗酵素液を５５℃で３０分間熱処理し、その中の１
０μｌについて、特開平１−１４１５９２号公報記載の
方法で力価の測定を行なった。その結果２１７番目のＡ
ｌａがＬｅｕに置換されている耐熱性ヘイケボタルルシ
フェラーゼ（以下、ＬｌＬ−２１７Ｌと略称する）より
熱安定性に優れているものを得た。更に、この粗酵素液
を特開平１−１４１５９２号公報記載の方法で精製し、
上記の方法で熱処理し、力価を測定した結果、ＬｌＬ−
２１７Ｌより熱安定性に優れていことが判明した。以上
の如くして新たに得られた耐熱性ルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮ
ＡをｐＨＬｆ１０７Ｖと命名し、該組み換え体プラスミ
ドＤＮＡで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｖ）は工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６
８６６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４５号より移管）として
寄託されている。
含む粗酵素液を５５℃で３０分間熱処理し、その中の１
０μｌについて、特開平１−１４１５９２号公報記載の
方法で力価の測定を行なった。その結果２１７番目のＡ
ｌａがＬｅｕに置換されている耐熱性ヘイケボタルルシ
フェラーゼ（以下、ＬｌＬ−２１７Ｌと略称する）より
熱安定性に優れているものを得た。更に、この粗酵素液
を特開平１−１４１５９２号公報記載の方法で精製し、
上記の方法で熱処理し、力価を測定した結果、ＬｌＬ−
２１７Ｌより熱安定性に優れていことが判明した。以上
の如くして新たに得られた耐熱性ルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮ
ＡをｐＨＬｆ１０７Ｖと命名し、該組み換え体プラスミ
ドＤＮＡで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｖ）は工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６
８６６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４５号より移管）として
寄託されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＡ
Ｌｆ３０３）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６５（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５３４４号より移管）として工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている。この形質転換体及
び野性型ＰｐＬを生産する組み換え体ＪＭ１０１（ｐＡ
Ｌｆ３０１）より項目１記載の方法により粗酵素液を
得、更に、この粗酵素液を精製した。このようにして得
られた精製ルシフェラーゼを、項目１記載の緩衝液中、
４５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて
残存する酵素活性を測定したところ、野性型ＰｐＬが
３．２％の残存活性しか示さなかったのに対し、３１３
番目のＡｌａを夫々Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅに
置換された変異型ＰｐＬは夫々５１．６％、９．１％、
２４．４％、２９．１％の残存活性を示した。上記より
明らかな如く本発明は、対照に比し著しく耐熱性を有す
Ｌｆ３０３）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６５（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５３４４号より移管）として工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている。この形質転換体及
び野性型ＰｐＬを生産する組み換え体ＪＭ１０１（ｐＡ
Ｌｆ３０１）より項目１記載の方法により粗酵素液を
得、更に、この粗酵素液を精製した。このようにして得
られた精製ルシフェラーゼを、項目１記載の緩衝液中、
４５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて
残存する酵素活性を測定したところ、野性型ＰｐＬが
３．２％の残存活性しか示さなかったのに対し、３１３
番目のＡｌａを夫々Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅに
置換された変異型ＰｐＬは夫々５１．６％、９．１％、
２４．４％、２９．１％の残存活性を示した。上記より
明らかな如く本発明は、対照に比し著しく耐熱性を有す
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成１１年９月１０日（１９
９９．９．１０）
９９．９．１０）
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所
工学工業技術研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４５
【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所
工学工業技術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６６
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成１１年９月１０日（１９９
９．９．１０）
９．９．１０）
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所
工学工業技術研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４４
【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所
工学工業技術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA11 BA08 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL03 4B065 AA26X AA90Y AB01 AC14 AC15 BA02 CA28 CA46
Claims (14)
- 【請求項１】 野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列において、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルの
ルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水
性アミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコードする
耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタ
ルのルシフェラーゼである請求項１記載の耐熱性ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項３】 疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシ
ン、バリン若しくはフェニルアラニンである請求項１又
は請求項２記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項４】 請求項１又は請求項２記載の耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したこ
とを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項４記載の組み換え体ＤＮＡを含
み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシ
ェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より
耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とす
る耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。 - 【請求項６】 野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列において、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルの
ルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水
性アミノ酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ。 - 【請求項７】 野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタ
ルのルシフェラーゼである請求項６記載の耐熱性ホタル
ルシフェラーゼ。 - 【請求項８】 野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列において、２１７及び３１５位のアミノ酸、又はゲ
ンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２
１７及び３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ
酸に変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項９】 野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボ
タル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである請求
項８記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項１０】 疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイ
シン、バリン若しくはフェニルアラニンである請求項８
又は請求項９記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝
子。 - 【請求項１１】 請求項８又は請求項９記載の耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した
ことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。 - 【請求項１２】 請求項１１記載の組み換え体ＤＮＡを
含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッ
シェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物よ
り耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴と
する耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。 - 【請求項１３】 野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ
酸配列において、２１７及び３１５位のアミノ酸、又は
ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの
２１７及び３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミ
ノ酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルル
シフェラーゼ。 - 【請求項１４】 野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケ
ボタル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである請
求項１３記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00027199A JP3681911B2 (ja) | 1999-01-05 | 1999-01-05 | 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 |
| PCT/JP1999/006303 WO2000040731A1 (fr) | 1999-01-05 | 1999-11-11 | Luciferases de lucioles thermostables, genes de luciferases de lucioles thermostables, nouvel adn recombine et procede de production de luciferase de luciole thermostable |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00027199A JP3681911B2 (ja) | 1999-01-05 | 1999-01-05 | 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005111777A Division JP3844082B2 (ja) | 2005-04-08 | 2005-04-08 | 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000197487A true JP2000197487A (ja) | 2000-07-18 |
| JP3681911B2 JP3681911B2 (ja) | 2005-08-10 |
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ID=11469252
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00027199A Expired - Fee Related JP3681911B2 (ja) | 1999-01-05 | 1999-01-05 | 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 |
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