JP2003310274A - グルコース脱水素酵素およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents
グルコース脱水素酵素およびそれをコードする遺伝子Info
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- JP2003310274A JP2003310274A JP2002128309A JP2002128309A JP2003310274A JP 2003310274 A JP2003310274 A JP 2003310274A JP 2002128309 A JP2002128309 A JP 2002128309A JP 2002128309 A JP2002128309 A JP 2002128309A JP 2003310274 A JP2003310274 A JP 2003310274A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】従来知られていない耐熱性、耐アルカリ性およ
び／または改善された比活性を有するグルコース脱水素
酵素を遺伝子工学的手法により提供するとともに、その
組換えベクター、形質転換体，当該形質転換体によるグ
ルコース脱水素酵素の製造方法およびグルコースアッセ
イキットを提供する。 【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むグルコース脱水
素酵素、その１乃至複数個が欠失、置換もしくは付加さ
れたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素であっ
て、無機塩の非存在下での耐熱性、耐アルカリ性および
／または改善された比活性を有するグルコース脱水素酵
素、これらのグルコース脱水素酵素をコードする遺伝
子、特定の塩基配列を含む遺伝子、これらの遺伝子を含
む組換えベクター、形質転換体および当該形質転換体の
培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴
とするグルコース脱水素酵素の製造方法ならびにグルコ
ースアッセイキット。
び／または改善された比活性を有するグルコース脱水素
酵素を遺伝子工学的手法により提供するとともに、その
組換えベクター、形質転換体，当該形質転換体によるグ
ルコース脱水素酵素の製造方法およびグルコースアッセ
イキットを提供する。 【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むグルコース脱水
素酵素、その１乃至複数個が欠失、置換もしくは付加さ
れたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素であっ
て、無機塩の非存在下での耐熱性、耐アルカリ性および
／または改善された比活性を有するグルコース脱水素酵
素、これらのグルコース脱水素酵素をコードする遺伝
子、特定の塩基配列を含む遺伝子、これらの遺伝子を含
む組換えベクター、形質転換体および当該形質転換体の
培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴
とするグルコース脱水素酵素の製造方法ならびにグルコ
ースアッセイキット。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、グルコース脱水素
酵素、その遺伝子、当該遺伝子を含む組換えベクター、
当該ベクターにより得られる形質転換体、当該形質転換
体を用いるグルコース脱水素酵素の製造方法およびグル
コース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキットに関
する。より詳細には、本発明は、無機塩の非存在下での
耐熱性を有するグルコース脱水素酵素、好ましくは当該
耐熱性に加えて更に耐アルカリ性および／または改善さ
れた比活性を有するNAD(P)+依存性β-Dグルコース脱水
素酵素、当該酵素をコードする遺伝子、当該遺伝子を含
む組換えベクター、当該ベクターにより得られる形質転
換体、当該形質転換体を用いるグルコース脱水素酵素の
製造方法およびグルコース脱水素酵素を含むグルコース
アッセイキットに関する。
酵素、その遺伝子、当該遺伝子を含む組換えベクター、
当該ベクターにより得られる形質転換体、当該形質転換
体を用いるグルコース脱水素酵素の製造方法およびグル
コース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキットに関
する。より詳細には、本発明は、無機塩の非存在下での
耐熱性を有するグルコース脱水素酵素、好ましくは当該
耐熱性に加えて更に耐アルカリ性および／または改善さ
れた比活性を有するNAD(P)+依存性β-Dグルコース脱水
素酵素、当該酵素をコードする遺伝子、当該遺伝子を含
む組換えベクター、当該ベクターにより得られる形質転
換体、当該形質転換体を用いるグルコース脱水素酵素の
製造方法およびグルコース脱水素酵素を含むグルコース
アッセイキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】NAD(P)+依存性β-Dグルコース脱水素酵
素（EC1.1.147: 以下、「グルコース脱水素酵素」ともい
う。）は、補酵素NAD+またはNADP+に水素を添加する反
応と共役してβ-Dグルコース(ブドウ糖)の脱水素反応を
触媒する酵素であり、この性質を利用して分析試料中の
ブドウ糖量の測定や関連酵素の酵素活性測定等に用いら
れている。
素（EC1.1.147: 以下、「グルコース脱水素酵素」ともい
う。）は、補酵素NAD+またはNADP+に水素を添加する反
応と共役してβ-Dグルコース(ブドウ糖)の脱水素反応を
触媒する酵素であり、この性質を利用して分析試料中の
ブドウ糖量の測定や関連酵素の酵素活性測定等に用いら
れている。
【０００３】既に、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株が生産するグ
ルコース脱水素酵素及びその変異グルコース脱水素酵素
が報告されている（Toshihiro N. et al. FEBS Letters
253、 1、2、 113-116(1989)、特開平２−８６７７９
号及び特開平４−２５８２９３号参照）。これらのう
ち、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株が生産するグルコース脱水素
酵素は耐熱性および耐アルカリ性が低く、この耐熱性も
塩化ナトリウム等の無機塩が存在しない場合には低下す
るという欠点を有していた。
ｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株が生産するグ
ルコース脱水素酵素及びその変異グルコース脱水素酵素
が報告されている（Toshihiro N. et al. FEBS Letters
253、 1、2、 113-116(1989)、特開平２−８６７７９
号及び特開平４−２５８２９３号参照）。これらのう
ち、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株が生産するグルコース脱水素
酵素は耐熱性および耐アルカリ性が低く、この耐熱性も
塩化ナトリウム等の無機塩が存在しない場合には低下す
るという欠点を有していた。
【０００４】また、このバチルス・メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株が生産す
るグルコース脱水素酵素の変異で得られた変異グルコー
ス脱水素酵素は、耐アルカリ性および耐熱性が従来のグ
ルコース脱水素酵素に比して改善されているものの、こ
の耐熱性には依然として塩化ナトリウム等の無機塩が高
濃度で存在することが要求され、またこの耐アルカリ性
の改善も十分なものとはいえなかった。更に、この変異
グルコース脱水素酵素の中には比活性が１／２以下に低
下するものも存在していた。
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株が生産す
るグルコース脱水素酵素の変異で得られた変異グルコー
ス脱水素酵素は、耐アルカリ性および耐熱性が従来のグ
ルコース脱水素酵素に比して改善されているものの、こ
の耐熱性には依然として塩化ナトリウム等の無機塩が高
濃度で存在することが要求され、またこの耐アルカリ性
の改善も十分なものとはいえなかった。更に、この変異
グルコース脱水素酵素の中には比活性が１／２以下に低
下するものも存在していた。
【０００５】一方、糖尿病の診断に用いられるグルコー
ス脱水素酵素には、生体試料（血液、尿等の体液）のよ
うな塩濃度が低く、且つ比較的ｐＨ変動が大きい溶液中
で反応を行う場合に迅速且つ安定した測定ができるよう
に、従来のグルコース脱水素酵素よりも更に優れた特
性、即ち、塩化ナトリウム等の無機塩の非存在下での耐
熱性、好ましくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性
および／または改善された比活性が要望されているが、
かかる要望を満たすグルコース脱水素酵素は未だ見出さ
れていない。
ス脱水素酵素には、生体試料（血液、尿等の体液）のよ
うな塩濃度が低く、且つ比較的ｐＨ変動が大きい溶液中
で反応を行う場合に迅速且つ安定した測定ができるよう
に、従来のグルコース脱水素酵素よりも更に優れた特
性、即ち、塩化ナトリウム等の無機塩の非存在下での耐
熱性、好ましくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性
および／または改善された比活性が要望されているが、
かかる要望を満たすグルコース脱水素酵素は未だ見出さ
れていない。
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記事情に
鑑みなされたものであり、従来知られている耐熱性グル
コース脱水素酵素に見られない塩化ナトリウム等の無機
塩の非存在下での耐熱性、好ましくは当該耐熱性に加え
て更に耐アルカリ性および／または改善された比活性を
有するグルコース脱水素酵素を遺伝子工学的手法により
提供するとともに、その大量生産に必要な遺伝子、当該
遺伝子を含む組換えベクター、当該ベクターにより得ら
れる形質転換体、当該形質転換体によるグルコース脱水
素酵素の製造方法ならびにグルコース脱水素酵素を含む
グルコースアッセイキットを提供することを目的とす
る。
鑑みなされたものであり、従来知られている耐熱性グル
コース脱水素酵素に見られない塩化ナトリウム等の無機
塩の非存在下での耐熱性、好ましくは当該耐熱性に加え
て更に耐アルカリ性および／または改善された比活性を
有するグルコース脱水素酵素を遺伝子工学的手法により
提供するとともに、その大量生産に必要な遺伝子、当該
遺伝子を含む組換えベクター、当該ベクターにより得ら
れる形質転換体、当該形質転換体によるグルコース脱水
素酵素の製造方法ならびにグルコース脱水素酵素を含む
グルコースアッセイキットを提供することを目的とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく研究を重ねた結果、４種類のグルコース脱水
素酵素生産菌株由来のグルコース脱水素酵素遺伝子の間
でランダムな組換えを行うことにより、親株が有しない
塩化ナトリウム等の無機塩の非存在下での耐熱性を有す
るグルコース脱水素酵素をコードするグルコース脱水素
酵素遺伝子を得ることができること、またこのグルコー
ス脱水素酵素は当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性お
よび／または改善された比活性をも保有し得ることを見
出した。
解決すべく研究を重ねた結果、４種類のグルコース脱水
素酵素生産菌株由来のグルコース脱水素酵素遺伝子の間
でランダムな組換えを行うことにより、親株が有しない
塩化ナトリウム等の無機塩の非存在下での耐熱性を有す
るグルコース脱水素酵素をコードするグルコース脱水素
酵素遺伝子を得ることができること、またこのグルコー
ス脱水素酵素は当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性お
よび／または改善された比活性をも保有し得ることを見
出した。
【０００７】本発明は上記知見に基づき完成されたもの
であり、以下の構成を有する。 ［１］ 配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列を
含むグルコース脱水素酵素。 ［２］配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の１
４５番目のセリン、１５８番目のチロシンおよび１６２
番目のリジンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当該
３個のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃至複数個が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース
脱水素酵素であって、無機塩の非存在下での耐熱性を有
するグルコース脱水素酵素。 ［３］無機塩が塩化ナトリウムである［２］に記載のグ
ルコース脱水素酵素。 ［４］グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を更に有す
る［２］または［３］に記載のグルコース脱水素酵素。 ［５］グルコース脱水素酵素が改善された比活性を更に
有する［２］乃至［４］のいずれかに記載のグルコース
脱水素酵素。 ［６］配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の１
４５番目のセリン、１５８番目のチロシン、１６２番目
および１７０番目のリジンならびに２５２番目のロイシ
ンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当該５個のアミ
ノ酸以外のアミノ酸の１乃至複数個が欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素
であって、無機塩の非存在下での耐熱性を有するグルコ
ース脱水素酵素。 ［７］無機塩が塩化ナトリウムである［６］に記載のグ
ルコース脱水素酵素。 ［８］グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を更に有す
る［６］または［７］に記載のグルコース脱水素酵素。 ［９］グルコース脱水素酵素が改善された比活性を更に
有する［６］乃至［８］のいずれかに記載のグルコース
脱水素酵素。 ［１０］［１］乃至［９］のいずれかに記載のグルコー
ス脱水素酵素をコードする遺伝子。 ［１１］配列表の配列番号３で表される塩基配列を含む
遺伝子。 ［１２］［１０］または［１１］に記載の遺伝子を含む
組換えベクター。 ［１３］［１２］に記載の組換えベクターを含む形質転
換体。 ［１４］［１３］に記載の形質転換体を培養し、得られ
る培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特
徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。 ［１５］［１］乃至［９］のいずれかに記載のグルコー
ス脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
であり、以下の構成を有する。 ［１］ 配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列を
含むグルコース脱水素酵素。 ［２］配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の１
４５番目のセリン、１５８番目のチロシンおよび１６２
番目のリジンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当該
３個のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃至複数個が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース
脱水素酵素であって、無機塩の非存在下での耐熱性を有
するグルコース脱水素酵素。 ［３］無機塩が塩化ナトリウムである［２］に記載のグ
ルコース脱水素酵素。 ［４］グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を更に有す
る［２］または［３］に記載のグルコース脱水素酵素。 ［５］グルコース脱水素酵素が改善された比活性を更に
有する［２］乃至［４］のいずれかに記載のグルコース
脱水素酵素。 ［６］配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の１
４５番目のセリン、１５８番目のチロシン、１６２番目
および１７０番目のリジンならびに２５２番目のロイシ
ンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当該５個のアミ
ノ酸以外のアミノ酸の１乃至複数個が欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素
であって、無機塩の非存在下での耐熱性を有するグルコ
ース脱水素酵素。 ［７］無機塩が塩化ナトリウムである［６］に記載のグ
ルコース脱水素酵素。 ［８］グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を更に有す
る［６］または［７］に記載のグルコース脱水素酵素。 ［９］グルコース脱水素酵素が改善された比活性を更に
有する［６］乃至［８］のいずれかに記載のグルコース
脱水素酵素。 ［１０］［１］乃至［９］のいずれかに記載のグルコー
ス脱水素酵素をコードする遺伝子。 ［１１］配列表の配列番号３で表される塩基配列を含む
遺伝子。 ［１２］［１０］または［１１］に記載の遺伝子を含む
組換えベクター。 ［１３］［１２］に記載の組換えベクターを含む形質転
換体。 ［１４］［１３］に記載の形質転換体を培養し、得られ
る培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特
徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。 ［１５］［１］乃至［９］のいずれかに記載のグルコー
ス脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
【発明の実施の形態】以下、本発明の構成を詳細に説明
する。本発明は、配列表の配列番号（以下、「配列番
号」ともいう。）３で表される塩基配列を含む遺伝子に
関する。但し、当該遺伝子に限定されず、配列番号４で
表されるアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素をコ
ードする全ての遺伝子を含む。また、本発明では、配列
番号４で表されるアミノ酸配列の１４５番目のセリン、
１５８番目のチロシン、１６２番目および１７０番目の
リジンならびに２５２番目のロイシンが保持され、当該
アミノ酸配列のうち当該５個のアミノ酸以外のアミノ酸
の１乃至複数個、好ましくは１乃至数個が欠失、置換も
しくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素
酵素をコードする遺伝子であって、無機塩、好ましくは
塩化ナトリウムの非存在下での耐熱性を有するグルコー
ス脱水素酵素をコードする遺伝子、好ましくは当該耐熱
性に加えて更に耐アルカリ性および／または改善された
比活性を有するグルコース脱水素酵素をコードする遺伝
子も含まれる。更に本発明では、配列番号４で表される
アミノ酸配列の１４５番目のセリン、１５８番目のチロ
シンおよび１６２番目のリジンが保持され、当該アミノ
酸配列のうち当該３個のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃
至複数個、好ましくは１乃至数個が欠失、置換もしくは
付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素を
コードする遺伝子であって、無機塩、好ましくは塩化ナ
トリウムの非存在下での耐熱性を有するグルコース脱水
素酵素をコードする遺伝子、好ましくは当該耐熱性に加
えて更に耐アルカリ性および／または改善された比活性
を有するグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子も含
まれる。
する。本発明は、配列表の配列番号（以下、「配列番
号」ともいう。）３で表される塩基配列を含む遺伝子に
関する。但し、当該遺伝子に限定されず、配列番号４で
表されるアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素をコ
ードする全ての遺伝子を含む。また、本発明では、配列
番号４で表されるアミノ酸配列の１４５番目のセリン、
１５８番目のチロシン、１６２番目および１７０番目の
リジンならびに２５２番目のロイシンが保持され、当該
アミノ酸配列のうち当該５個のアミノ酸以外のアミノ酸
の１乃至複数個、好ましくは１乃至数個が欠失、置換も
しくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素
酵素をコードする遺伝子であって、無機塩、好ましくは
塩化ナトリウムの非存在下での耐熱性を有するグルコー
ス脱水素酵素をコードする遺伝子、好ましくは当該耐熱
性に加えて更に耐アルカリ性および／または改善された
比活性を有するグルコース脱水素酵素をコードする遺伝
子も含まれる。更に本発明では、配列番号４で表される
アミノ酸配列の１４５番目のセリン、１５８番目のチロ
シンおよび１６２番目のリジンが保持され、当該アミノ
酸配列のうち当該３個のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃
至複数個、好ましくは１乃至数個が欠失、置換もしくは
付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素を
コードする遺伝子であって、無機塩、好ましくは塩化ナ
トリウムの非存在下での耐熱性を有するグルコース脱水
素酵素をコードする遺伝子、好ましくは当該耐熱性に加
えて更に耐アルカリ性および／または改善された比活性
を有するグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子も含
まれる。
【０００８】なお、既に報告されているグルコース脱水
素酵素のアミノ酸配列によれば、本願の配列表の配列番
号を用いて示すと、当該配列表の配列番号４で表される
アミノ酸配列の１４５番目のセリン、１５８番目のチロ
シン、１６２番目のリジンの３個のアミノ酸残基がグル
コース脱水素酵素活性を示すのに必要であることが知ら
れている〔Ｋｅｉｚｏ Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２９（２）３０３−３１２（２
００２）〕。
素酵素のアミノ酸配列によれば、本願の配列表の配列番
号を用いて示すと、当該配列表の配列番号４で表される
アミノ酸配列の１４５番目のセリン、１５８番目のチロ
シン、１６２番目のリジンの３個のアミノ酸残基がグル
コース脱水素酵素活性を示すのに必要であることが知ら
れている〔Ｋｅｉｚｏ Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２９（２）３０３−３１２（２
００２）〕。
【０００９】ここで、無機塩、好ましくは塩化ナトリウ
ムの非存在下での耐熱性とは、実施例１２に記載の条件
中熱処理時間が１時間の場合に、相対活性（％）が１０
％以上であることいい、好ましくは５０％以上であるこ
とをいう。耐アルカリ性とは、実施例１３に記載の条件
中ｐＨが９．５の場合において、相対活性（％）が５０
％以上であることをいい、好ましくは８０％以上である
ことをいう。改善された比活性とは、比活性が１５０ｕ
／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであることをいう。
ムの非存在下での耐熱性とは、実施例１２に記載の条件
中熱処理時間が１時間の場合に、相対活性（％）が１０
％以上であることいい、好ましくは５０％以上であるこ
とをいう。耐アルカリ性とは、実施例１３に記載の条件
中ｐＨが９．５の場合において、相対活性（％）が５０
％以上であることをいい、好ましくは８０％以上である
ことをいう。改善された比活性とは、比活性が１５０ｕ
／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであることをいう。
【００１０】無機塩、好ましくは塩化ナトリウムの非存
在下での耐熱性、耐アルカリ性および改善された比活性
を有するグルコース脱水素酵素とは、当該耐熱性、耐ア
ルカリ性および改善された比活性の全てを有するグルコ
ース脱水素酵素をいい、具体的には当該耐熱性が実施例
１２に記載の条件中熱処理時間が１時間の場合に相対活
性（％）が１０％以上であり且つ当該耐アルカリ性が実
施例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の場合において相
対活性（％）が５０％以上であり且つ当該比活性が１５
０ｕ／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであるグルコース脱水素酵
素をいい、好ましくは、当該耐熱性が実施例１２に記載
の条件中熱処理時間が１時間の場合に相対活性（％）が
１０％以上であり且つ当該耐アルカリ性が実施例１３に
記載の条件中ｐＨが９．５の場合において相対活性
（％）が８０％以上であり且つ当該比活性が１５０ｕ／
ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであるグルコース脱水素酵素、も
しくは当該耐熱性が実施例１２に記載の条件中熱処理時
間が１時間の場合に相対活性（％）が５０％以上であり
且つ当該耐アルカリ性が実施例１３に記載の条件中ｐＨ
が９．５の場合において相対活性（％）が５０％以上で
あり且つ比活性が１５０ｕ／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであ
るグルコース脱水素酵素をいい、より好ましくは、当該
耐熱性が実施例１２に記載の条件中熱処理時間が１時間
の場合に相対活性（％）が５０％以上であり且つ当該耐
アルカリ性が実施例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の
場合において相対活性（％）が８０％以上であり且つ当
該比活性が１５０ｕ／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであるグル
コース脱水素酵素をいう。
在下での耐熱性、耐アルカリ性および改善された比活性
を有するグルコース脱水素酵素とは、当該耐熱性、耐ア
ルカリ性および改善された比活性の全てを有するグルコ
ース脱水素酵素をいい、具体的には当該耐熱性が実施例
１２に記載の条件中熱処理時間が１時間の場合に相対活
性（％）が１０％以上であり且つ当該耐アルカリ性が実
施例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の場合において相
対活性（％）が５０％以上であり且つ当該比活性が１５
０ｕ／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであるグルコース脱水素酵
素をいい、好ましくは、当該耐熱性が実施例１２に記載
の条件中熱処理時間が１時間の場合に相対活性（％）が
１０％以上であり且つ当該耐アルカリ性が実施例１３に
記載の条件中ｐＨが９．５の場合において相対活性
（％）が８０％以上であり且つ当該比活性が１５０ｕ／
ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであるグルコース脱水素酵素、も
しくは当該耐熱性が実施例１２に記載の条件中熱処理時
間が１時間の場合に相対活性（％）が５０％以上であり
且つ当該耐アルカリ性が実施例１３に記載の条件中ｐＨ
が９．５の場合において相対活性（％）が５０％以上で
あり且つ比活性が１５０ｕ／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであ
るグルコース脱水素酵素をいい、より好ましくは、当該
耐熱性が実施例１２に記載の条件中熱処理時間が１時間
の場合に相対活性（％）が５０％以上であり且つ当該耐
アルカリ性が実施例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の
場合において相対活性（％）が８０％以上であり且つ当
該比活性が１５０ｕ／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであるグル
コース脱水素酵素をいう。
【００１１】無機塩、好ましくは塩化ナトリウムの非存
在下での耐熱性および耐アルカリ性を有するグルコース
脱水素酵素とは、具体的には当該耐熱性が実施例１２に
記載の条件中熱処理時間が１時間の場合に相対活性
（％）が１０％以上であり且つ当該耐アルカリ性が実施
例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の場合において相対
活性（％）が５０％以上であるグルコース脱水素酵素を
いい、好ましくは、当該耐熱性が実施例１２に記載の条
件中熱処理時間が１時間の場合に相対活性（％）が１０
％以上であり且つ当該耐アルカリ性が実施例１３に記載
の条件中ｐＨが９．５の場合において相対活性（％）が
８０％以上であるグルコース脱水素酵素、もしくは当該
耐熱性が実施例１２に記載の条件中熱処理時間が１時間
の場合に相対活性（％）が５０％以上であり且つ当該耐
アルカリ性が実施例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の
場合において相対活性（％）が５０％以上であるグルコ
ース脱水素酵素をいい、より好ましくは、当該耐熱性が
実施例１２に記載の条件中熱処理時間が１時間の場合に
相対活性（％）が５０％以上であり且つ当該耐アルカリ
性が実施例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の場合にお
いて相対活性(％)が８０％以上であるグルコース脱水素
酵素をいう。
在下での耐熱性および耐アルカリ性を有するグルコース
脱水素酵素とは、具体的には当該耐熱性が実施例１２に
記載の条件中熱処理時間が１時間の場合に相対活性
（％）が１０％以上であり且つ当該耐アルカリ性が実施
例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の場合において相対
活性（％）が５０％以上であるグルコース脱水素酵素を
いい、好ましくは、当該耐熱性が実施例１２に記載の条
件中熱処理時間が１時間の場合に相対活性（％）が１０
％以上であり且つ当該耐アルカリ性が実施例１３に記載
の条件中ｐＨが９．５の場合において相対活性（％）が
８０％以上であるグルコース脱水素酵素、もしくは当該
耐熱性が実施例１２に記載の条件中熱処理時間が１時間
の場合に相対活性（％）が５０％以上であり且つ当該耐
アルカリ性が実施例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の
場合において相対活性（％）が５０％以上であるグルコ
ース脱水素酵素をいい、より好ましくは、当該耐熱性が
実施例１２に記載の条件中熱処理時間が１時間の場合に
相対活性（％）が５０％以上であり且つ当該耐アルカリ
性が実施例１３に記載の条件中ｐＨが９．５の場合にお
いて相対活性(％)が８０％以上であるグルコース脱水素
酵素をいう。
【００１２】無機塩、好ましくは塩化ナトリウムの非存
在下での耐熱性および改善された比活性を有するグルコ
ース脱水素酵素とは、具体的には当該耐熱性が実施例１
２に記載の条件中熱処理時間が１時間の場合に相対活性
（％）が１０％以上であり且つ当該比活性が１５０ｕ／
ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであるグルコース脱水素酵素をい
い、好ましくは、当該耐熱性が実施例１２に記載の条件
中熱処理時間が１時間の場合に相対活性（％）が５０％
以上であり且つ当該比活性が１５０ｕ／ｍｇ〜１９０ｕ
／ｍｇであるグルコース脱水素酵素をいう。
在下での耐熱性および改善された比活性を有するグルコ
ース脱水素酵素とは、具体的には当該耐熱性が実施例１
２に記載の条件中熱処理時間が１時間の場合に相対活性
（％）が１０％以上であり且つ当該比活性が１５０ｕ／
ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇであるグルコース脱水素酵素をい
い、好ましくは、当該耐熱性が実施例１２に記載の条件
中熱処理時間が１時間の場合に相対活性（％）が５０％
以上であり且つ当該比活性が１５０ｕ／ｍｇ〜１９０ｕ
／ｍｇであるグルコース脱水素酵素をいう。
【００１３】本発明のグルコース脱水素酵素をコードす
る遺伝子は、微生物の遺伝子を用いた遺伝子シャフリン
グ等の公知の手法又はこれに準ずる方法で得ることがで
きる。以下に、本発明のグルコース脱水素酵素をコード
する遺伝子の採取手順を例示する。 １． 本発明の遺伝子のクローニング （１）バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由来の変異体グルコース脱
水素酵素、即ち当該株が生産するグルコース脱水素酵素
のアミノ酸配列（特開平２−８６７７９号参照）の252
番目のグルタミン残基がロイシン残基に置換されたもの
（以下、「グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌ」ともい
う。）の遺伝子の取得 グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子は、独立行政
法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０
５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第
６）にＦＥＲＭ ＢＰ−２５８４として寄託されている
エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０５から常法により抽出したプラスミドｐＧ
ＤＡ２から、常法によりグルコース脱水酵素遺伝子断片
（約０．９ｋｂｐ）を得、クローニングして得た組換え
体から一本鎖ＤＮＡを調製する。この一本鎖ＤＮＡに亜
硝酸ナトリウム、ギ酸等の変異処理剤を作用させて変異
処理ＤＮＡを得る。この変異処理ＤＮＡに逆転写酵素を
作用させて変異二本鎖遺伝子を常法に従い回収する。次
に変異二本鎖遺伝子を発現ベクターに組込み、大腸菌を
形質転換し、グルコース脱水素酵素活性を指標にグルコ
ース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子保持株を選択し、こ
の株からグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子を含
むプラスミドｐＧＤＡ２Ｆ−２０を常法により採取する
（特開平２−８６７７９号参照）。
る遺伝子は、微生物の遺伝子を用いた遺伝子シャフリン
グ等の公知の手法又はこれに準ずる方法で得ることがで
きる。以下に、本発明のグルコース脱水素酵素をコード
する遺伝子の採取手順を例示する。 １． 本発明の遺伝子のクローニング （１）バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由来の変異体グルコース脱
水素酵素、即ち当該株が生産するグルコース脱水素酵素
のアミノ酸配列（特開平２−８６７７９号参照）の252
番目のグルタミン残基がロイシン残基に置換されたもの
（以下、「グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌ」ともい
う。）の遺伝子の取得 グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子は、独立行政
法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０
５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第
６）にＦＥＲＭ ＢＰ−２５８４として寄託されている
エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０５から常法により抽出したプラスミドｐＧ
ＤＡ２から、常法によりグルコース脱水酵素遺伝子断片
（約０．９ｋｂｐ）を得、クローニングして得た組換え
体から一本鎖ＤＮＡを調製する。この一本鎖ＤＮＡに亜
硝酸ナトリウム、ギ酸等の変異処理剤を作用させて変異
処理ＤＮＡを得る。この変異処理ＤＮＡに逆転写酵素を
作用させて変異二本鎖遺伝子を常法に従い回収する。次
に変異二本鎖遺伝子を発現ベクターに組込み、大腸菌を
形質転換し、グルコース脱水素酵素活性を指標にグルコ
ース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子保持株を選択し、こ
の株からグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子を含
むプラスミドｐＧＤＡ２Ｆ−２０を常法により採取する
（特開平２−８６７７９号参照）。
【００１４】（２）バチルス属細菌バチルス・リケニホ
ルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）IFO 12200株, バチルス・メガテリウム （Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IFO 15308株およびバ
チルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）IFO13719株由来のグルコース脱水素酵素遺伝子の
取得 バチルス属細菌バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）IFO 12200株, バ
チルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔ
ｅｒｉｕｍ）IFO 15308株およびバチルス・スブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）IFO13719株の
ゲノムDNAについて、公開されているそれぞれの細菌の
近縁種由来のグルコース脱水素酵素遺伝子のN末端とC末
端相当部分の遺伝子配列をもとに適宜設計したプライマ
ーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」とも
いう。）によりそれぞれの株由来のグルコース脱水素酵
素をコードする遺伝子を取得する。
ルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）IFO 12200株, バチルス・メガテリウム （Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IFO 15308株およびバ
チルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）IFO13719株由来のグルコース脱水素酵素遺伝子の
取得 バチルス属細菌バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）IFO 12200株, バ
チルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔ
ｅｒｉｕｍ）IFO 15308株およびバチルス・スブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）IFO13719株の
ゲノムDNAについて、公開されているそれぞれの細菌の
近縁種由来のグルコース脱水素酵素遺伝子のN末端とC末
端相当部分の遺伝子配列をもとに適宜設計したプライマ
ーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」とも
いう。）によりそれぞれの株由来のグルコース脱水素酵
素をコードする遺伝子を取得する。
【００１５】（３）キメラ遺伝子ライブラリーの作製
グルコース脱水素酵素は、現在までにバチルス属細菌由
来のものが複数報告されており、それらの塩基配列は互
いに類似性が高く、互いに８０％以上の相同性を示して
いることが報告されている（Lampel, K.A., et al.
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６, 238-243 (1986), He
ilmann, H.J., et al. Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１７４, 485-490 (1988), Makino, Y., et al Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４, 6381-6385 (1989), Nagao,
T.et al. Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４, 5013-5020
(1992)）。グルコース脱水素酵素の塩基配列は、ま
た、遺伝子バンクにより多数公開されている。そして、
各種のグルコース脱水素酵素生産菌株を比較すると、そ
れらの間には少数の構成アミノ酸に違いが存在するのみ
であり、残りの構成アミノ酸は実質的に同一であること
が知られている。
来のものが複数報告されており、それらの塩基配列は互
いに類似性が高く、互いに８０％以上の相同性を示して
いることが報告されている（Lampel, K.A., et al.
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６, 238-243 (1986), He
ilmann, H.J., et al. Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１７４, 485-490 (1988), Makino, Y., et al Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４, 6381-6385 (1989), Nagao,
T.et al. Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４, 5013-5020
(1992)）。グルコース脱水素酵素の塩基配列は、ま
た、遺伝子バンクにより多数公開されている。そして、
各種のグルコース脱水素酵素生産菌株を比較すると、そ
れらの間には少数の構成アミノ酸に違いが存在するのみ
であり、残りの構成アミノ酸は実質的に同一であること
が知られている。
【００１６】本発明者は、これらの事実に注目し、バチ
ルス属に属する複数のグルコース脱水素酵素生産菌由来
のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子間でランダ
ムな組換えを行い親株のグルコース脱水素酵素生産菌と
異なる配列の遺伝子が得られるようにすることにより、
これまでに見出されたグルコース脱水素酵素生産菌に見
られない無機塩、好ましくは塩化ナトリウムの非存在下
での耐熱性を有するグルコース脱水素酵素（キメラ酵
素）をコードするキメラ遺伝子、好ましくは当該耐熱性
に加えて更に耐アルカリ性および／または改善された比
活性を有するグルコース脱水素酵素（キメラ酵素）をコ
ードするキメラ遺伝子を調製する手法を確立した。
ルス属に属する複数のグルコース脱水素酵素生産菌由来
のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子間でランダ
ムな組換えを行い親株のグルコース脱水素酵素生産菌と
異なる配列の遺伝子が得られるようにすることにより、
これまでに見出されたグルコース脱水素酵素生産菌に見
られない無機塩、好ましくは塩化ナトリウムの非存在下
での耐熱性を有するグルコース脱水素酵素（キメラ酵
素）をコードするキメラ遺伝子、好ましくは当該耐熱性
に加えて更に耐アルカリ性および／または改善された比
活性を有するグルコース脱水素酵素（キメラ酵素）をコ
ードするキメラ遺伝子を調製する手法を確立した。
【００１７】本発明に従い、複数の異なるグルコース脱
水素酵素生産菌由来の遺伝子間でランダムな組換えを生
じさせキメラ遺伝子を得るには、遺伝子シャフリングと
呼ばれる手法を用いる。遺伝子シャフリングとは、Stem
mer によって案出された遺伝子の組換え法であり（Ｗ．
Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８
９−３９１（１９９４；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：
１０７４７−１０７５１（１９９４）））、組換えを行
おうとする複数種の遺伝子を混ぜ合わせてランダムに断
片化し、得られた小断片遺伝子に対しプライマーを入れ
ない自己プライミングＰＣＲ（ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎ
ｇ ＰＣＲ）を行わせて再構成した遺伝子を増幅するこ
とによりキメラ遺伝子を調製するものである。
水素酵素生産菌由来の遺伝子間でランダムな組換えを生
じさせキメラ遺伝子を得るには、遺伝子シャフリングと
呼ばれる手法を用いる。遺伝子シャフリングとは、Stem
mer によって案出された遺伝子の組換え法であり（Ｗ．
Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８
９−３９１（１９９４；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：
１０７４７−１０７５１（１９９４）））、組換えを行
おうとする複数種の遺伝子を混ぜ合わせてランダムに断
片化し、得られた小断片遺伝子に対しプライマーを入れ
ない自己プライミングＰＣＲ（ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎ
ｇ ＰＣＲ）を行わせて再構成した遺伝子を増幅するこ
とによりキメラ遺伝子を調製するものである。
【００１８】かかる遺伝子シャフリング法を用いて本発
明のキメラ遺伝子を構築する工程を以下に説明する。 （１） 異種のグルコース脱水素酵素生産菌から得られ
た複数個の遺伝子を混合し、ＤＮａｓｅＩのようなエン
ドヌクレアーゼでランダムに断片化して、小断片ＤＮＡ
を回収する。 （２）上記の工程で得られた小断片ＤＮＡにプライマー
を用いないでＰＣＲを行う。これによって、小断片ＤＮ
Ａ自身がお互いにプライマーとして働き、複数の遺伝子
間で組換えが生じて再構築されたキメラ遺伝子群が得ら
れる。このＰＣＲ反応において用いるＤＮＡポリメラー
ゼとしては、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ等のＤＮＡポリメラーゼがグルコース脱水素酵素
を発現するクローン採取頻度が高まる点で好ましい。 （３）次いで、得られたキメラ遺伝子群をプライマーを
用いるＰＣＲに供して増幅し、約０．７９ｋｂｐのキメ
ラ遺伝子ライブラリーを得る。 （４）以上のような遺伝子シャフリング法によって得ら
れたキメラ遺伝子をプラスミドベクターに連結し、これ
を用いて大腸菌を形質転換しグルコース脱水素酵素を生
成するクローンを選択する。 （５）選択したクローンのキメラ遺伝子を上記（４）と
同様にプラスミドベクターに連結し、これを用いて大腸
菌を形質転換し発現させ本発明のグルコース脱水素酵素
を得る。
明のキメラ遺伝子を構築する工程を以下に説明する。 （１） 異種のグルコース脱水素酵素生産菌から得られ
た複数個の遺伝子を混合し、ＤＮａｓｅＩのようなエン
ドヌクレアーゼでランダムに断片化して、小断片ＤＮＡ
を回収する。 （２）上記の工程で得られた小断片ＤＮＡにプライマー
を用いないでＰＣＲを行う。これによって、小断片ＤＮ
Ａ自身がお互いにプライマーとして働き、複数の遺伝子
間で組換えが生じて再構築されたキメラ遺伝子群が得ら
れる。このＰＣＲ反応において用いるＤＮＡポリメラー
ゼとしては、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ等のＤＮＡポリメラーゼがグルコース脱水素酵素
を発現するクローン採取頻度が高まる点で好ましい。 （３）次いで、得られたキメラ遺伝子群をプライマーを
用いるＰＣＲに供して増幅し、約０．７９ｋｂｐのキメ
ラ遺伝子ライブラリーを得る。 （４）以上のような遺伝子シャフリング法によって得ら
れたキメラ遺伝子をプラスミドベクターに連結し、これ
を用いて大腸菌を形質転換しグルコース脱水素酵素を生
成するクローンを選択する。 （５）選択したクローンのキメラ遺伝子を上記（４）と
同様にプラスミドベクターに連結し、これを用いて大腸
菌を形質転換し発現させ本発明のグルコース脱水素酵素
を得る。
【００１９】本発明に従えば、以上のように遺伝子シャ
フリングを利用して異種のグルコース脱水素酵素生産菌
由来のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子をラン
ダムに組換えることにより、グルコース脱水素酵素をコ
ードするキメラ遺伝子を得ることができる。本発明は、
これまで分離されているいずれのグルコース脱水素酵素
生産菌にも適用できるが、グルコース脱水素酵素生産菌
株が複数報告されているバチルス属に属する細菌由来の
グルコース脱水素酵素遺伝子を使用するのが好ましい。
フリングを利用して異種のグルコース脱水素酵素生産菌
由来のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子をラン
ダムに組換えることにより、グルコース脱水素酵素をコ
ードするキメラ遺伝子を得ることができる。本発明は、
これまで分離されているいずれのグルコース脱水素酵素
生産菌にも適用できるが、グルコース脱水素酵素生産菌
株が複数報告されているバチルス属に属する細菌由来の
グルコース脱水素酵素遺伝子を使用するのが好ましい。
【００２０】本発明が適用される異種のグルコース脱水
素酵素遺伝子の組合せで特に好ましい例は、バチルス・
メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕ
ｍ）IWG3株由来の変異グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌ
の遺伝子、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）IFO 12200株、 バチ
ルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅ
ｒｉｕｍ）IFO 15308株およびバチルス・スブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）IFO13719株由
来のグルコース脱水素酵素遺伝子である。
素酵素遺伝子の組合せで特に好ましい例は、バチルス・
メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕ
ｍ）IWG3株由来の変異グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌ
の遺伝子、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）IFO 12200株、 バチ
ルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅ
ｒｉｕｍ）IFO 15308株およびバチルス・スブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）IFO13719株由
来のグルコース脱水素酵素遺伝子である。
【００２１】本発明に従いバチルス・メガテリウム（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由来の
グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子、バチルス・
リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ）IFO 12200株, バチルス・メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IFO 15308
株およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）IFO13719株由来のグルコース脱水素酵
素遺伝子を用いて得られるグルコース脱水素酵素をコー
ドするキメラ遺伝子の好ましい具体例は、配列番号４で
表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、または配列
番号３で表される塩基配列から成る遺伝子である。この
遺伝子は、塩化ナトリウムの非存在下での耐熱性、耐ア
ルカリ性および改善された比活性を有するグルコース脱
水素酵素をコードするキメラ遺伝子であることが確かめ
られている。本発明の原理は他のグルコース脱水素酵素
生産菌株を用いる場合にも同様に適用され得るものであ
る。
ａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由来の
グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子、バチルス・
リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ）IFO 12200株, バチルス・メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IFO 15308
株およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）IFO13719株由来のグルコース脱水素酵
素遺伝子を用いて得られるグルコース脱水素酵素をコー
ドするキメラ遺伝子の好ましい具体例は、配列番号４で
表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、または配列
番号３で表される塩基配列から成る遺伝子である。この
遺伝子は、塩化ナトリウムの非存在下での耐熱性、耐ア
ルカリ性および改善された比活性を有するグルコース脱
水素酵素をコードするキメラ遺伝子であることが確かめ
られている。本発明の原理は他のグルコース脱水素酵素
生産菌株を用いる場合にも同様に適用され得るものであ
る。
【００２２】次に、これらのキメラ遺伝子を大腸菌に導
入し、大腸菌により寒天培地上に単一クローンによる多
数のコロニーを形成させる。発現ベクターの発現プロモ
ーターに依存した誘導方法、例えばpTrc99Aの場合には
培地中にイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド
（以下、「ＩＰＴＧ」ともいう。）を添加し変異酵素を発
現させる。コロニーをペーパーフィルターに転写し熱処
理を加えた後、NADHの発色反応により各コロニーの持つ
残存グルコース脱水素酵素活性を測定する。高い残存活
性を示したコロニーを培養してプラスミドを単離、コー
ドされたグルコース脱水素酵素変異遺伝子の全塩基配列
を決定する。塩基配列の決定はサンガー法やマキサム・
ギルバート法等の一般的な方法によって決定できる。以
上の手順により翻訳開始コドンから終止コドンを含む本
発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子の全長
を単離することができる。
入し、大腸菌により寒天培地上に単一クローンによる多
数のコロニーを形成させる。発現ベクターの発現プロモ
ーターに依存した誘導方法、例えばpTrc99Aの場合には
培地中にイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド
（以下、「ＩＰＴＧ」ともいう。）を添加し変異酵素を発
現させる。コロニーをペーパーフィルターに転写し熱処
理を加えた後、NADHの発色反応により各コロニーの持つ
残存グルコース脱水素酵素活性を測定する。高い残存活
性を示したコロニーを培養してプラスミドを単離、コー
ドされたグルコース脱水素酵素変異遺伝子の全塩基配列
を決定する。塩基配列の決定はサンガー法やマキサム・
ギルバート法等の一般的な方法によって決定できる。以
上の手順により翻訳開始コドンから終止コドンを含む本
発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子の全長
を単離することができる。
【００２３】本発明のグルコース脱水素酵素をコードす
る遺伝子の塩基配列が明らかとなったことから、当該遺
伝子は化学合成法により取得することができる。また、
配列番号４で表されるアミノ酸配列の１４５番目のセリ
ン、１５８番目のチロシンおよび１６２番目のリジンが
保持され、当該アミノ酸配列のうち当該３個のアミノ酸
以外のアミノ酸の１乃至複数個、好ましくは１乃至数個
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグ
ルコース脱水素酵素をコードする遺伝子であって、無機
塩、好ましくは塩化ナトリウムの非存在下での耐熱性を
有するグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、好ま
しくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性および／ま
たは改善された比活性を有するグルコース脱水素酵素を
コードする遺伝子並びに配列番号４で表されるアミノ酸
配列の１４５番目のセリン、１５８番目のチロシン、１
６２番目および１７０番目のリジン並びに２５２番目の
ロイシンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当該５個
のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃至複数個、好ましくは
１乃至数個が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列を含むグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子であ
って、無機塩、好ましくは塩化ナトリウムの非存在下で
の耐熱性を有するグルコース脱水素酵素をコードする遺
伝子、好ましくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性
および／または改善された比活性を有するグルコース脱
水素酵素をコードする遺伝子は、Kunkel法、Gapped dup
lex法、あるいはPCRを利用した方法等の公知の手法又は
これに準ずる方法、例えば部位特異的突然変異誘発法を
利用した変異導入用キット、例えばMutant-K(宝酒造株
式会社製）、Mutant-G(宝酒造株式会社製）、あるいはL
APCR in vitro Mutagenesis シリーズキット（宝酒造株
式会社製）を用いて得ることができる。更に、バチルス
・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉ
ｕｍ）IWG3株のＤＮＡを鋳型として、このＤＮＡ配列に
基づいて合成した適当なプライマーを用いて、ＰＣＲを
行ないグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を取得
し、上記の本願の出願時において常用される技術、例え
ば、部位特異的変異導入法を用いて本発明のグルコース
脱水素酵素の遺伝子を取得することもできる。
る遺伝子の塩基配列が明らかとなったことから、当該遺
伝子は化学合成法により取得することができる。また、
配列番号４で表されるアミノ酸配列の１４５番目のセリ
ン、１５８番目のチロシンおよび１６２番目のリジンが
保持され、当該アミノ酸配列のうち当該３個のアミノ酸
以外のアミノ酸の１乃至複数個、好ましくは１乃至数個
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグ
ルコース脱水素酵素をコードする遺伝子であって、無機
塩、好ましくは塩化ナトリウムの非存在下での耐熱性を
有するグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、好ま
しくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性および／ま
たは改善された比活性を有するグルコース脱水素酵素を
コードする遺伝子並びに配列番号４で表されるアミノ酸
配列の１４５番目のセリン、１５８番目のチロシン、１
６２番目および１７０番目のリジン並びに２５２番目の
ロイシンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当該５個
のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃至複数個、好ましくは
１乃至数個が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列を含むグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子であ
って、無機塩、好ましくは塩化ナトリウムの非存在下で
の耐熱性を有するグルコース脱水素酵素をコードする遺
伝子、好ましくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性
および／または改善された比活性を有するグルコース脱
水素酵素をコードする遺伝子は、Kunkel法、Gapped dup
lex法、あるいはPCRを利用した方法等の公知の手法又は
これに準ずる方法、例えば部位特異的突然変異誘発法を
利用した変異導入用キット、例えばMutant-K(宝酒造株
式会社製）、Mutant-G(宝酒造株式会社製）、あるいはL
APCR in vitro Mutagenesis シリーズキット（宝酒造株
式会社製）を用いて得ることができる。更に、バチルス
・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉ
ｕｍ）IWG3株のＤＮＡを鋳型として、このＤＮＡ配列に
基づいて合成した適当なプライマーを用いて、ＰＣＲを
行ないグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を取得
し、上記の本願の出願時において常用される技術、例え
ば、部位特異的変異導入法を用いて本発明のグルコース
脱水素酵素の遺伝子を取得することもできる。
【００２４】２．組換えグルコース脱水素酵素発現ベク
ターおよび形質転換体の作製 （１） 組換えグルコース脱水素酵素発現ベクターの作
製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で
複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラ
スミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。プラスミド
DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド、例えば、pET
系（宝酒造株式会社製）、pGEX系（アマシャム・バイオ
サイエンス製等）、ファージDNAとしてはλファージ（C
haron4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、
λZAP等）、枯草菌由来のプラスミドとしては、例えばp
UB110、pTP5等、酵母由来のプラスミドとしては、例え
ば、pAUR系（宝酒造株式会社製等)などが挙げられる。
さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスなど
の動物ウイルス、バキュロウイルスBacVector（宝酒造
株式会社製）などの昆虫ウイルスベクターを用いること
もできる。
ターおよび形質転換体の作製 （１） 組換えグルコース脱水素酵素発現ベクターの作
製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で
複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラ
スミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。プラスミド
DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド、例えば、pET
系（宝酒造株式会社製）、pGEX系（アマシャム・バイオ
サイエンス製等）、ファージDNAとしてはλファージ（C
haron4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、
λZAP等）、枯草菌由来のプラスミドとしては、例えばp
UB110、pTP5等、酵母由来のプラスミドとしては、例え
ば、pAUR系（宝酒造株式会社製等)などが挙げられる。
さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスなど
の動物ウイルス、バキュロウイルスBacVector（宝酒造
株式会社製）などの昆虫ウイルスベクターを用いること
もできる。
【００２５】ベクターに本発明の遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位またはマルチクロー
ニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが
採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発
揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子等
の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位またはマルチクロー
ニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが
採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発
揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子等
の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００２６】（２）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるもので
はない。例えば、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス
・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas
putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテ
ィ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌
が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyc
escerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosa
ccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、動物細胞ある
いはＳｆ９等の昆虫細胞が挙げられる。
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるもので
はない。例えば、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス
・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas
putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテ
ィ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌
が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyc
escerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosa
ccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、動物細胞ある
いはＳｆ９等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２７】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ colｉ) JM109などが挙げ
られ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げら
れるが、これらに限定されるものではない。
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ colｉ) JM109などが挙げ
られ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げら
れるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現
できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrp
プロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PR
プロモーター、T7プロモーターなどの、大腸菌やファー
ジに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモー
ターなどのように、人為的に設計改変されたプロモータ
ーを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法
は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定される
ものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法
〔Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
69：2110(1972)〕、エレクトロポレーション法等が挙げ
られる。
できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrp
プロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PR
プロモーター、T7プロモーターなどの、大腸菌やファー
ジに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモー
ターなどのように、人為的に設計改変されたプロモータ
ーを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法
は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定される
ものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法
〔Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
69：2110(1972)〕、エレクトロポレーション法等が挙げ
られる。
【００２９】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用い
られる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できる
ものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモータ
ー、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プ
ロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、P
GKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、
AOX1プロモーター等を用いることができる。酵母への組
換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法
であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーショ
ン法〔Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 19
4： 182(1990)〕、スフェロプラスト法〔Hinnen, A. et
al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(197
8)〕、酢酸リチウム法〔Itoh, H.：J.Bacteriol., 15
3：163(1983)〕等が挙げられる。
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用い
られる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できる
ものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモータ
ー、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プ
ロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、P
GKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、
AOX1プロモーター等を用いることができる。酵母への組
換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法
であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーショ
ン法〔Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 19
4： 182(1990)〕、スフェロプラスト法〔Hinnen, A. et
al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(197
8)〕、酢酸リチウム法〔Itoh, H.：J.Bacteriol., 15
3：163(1983)〕等が挙げられる。
【００３０】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用い
られる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プ
ロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用
いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子
プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベ
クターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーシ
ョン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が
挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞な
どが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方
法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクシ
ョン法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用い
られる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プ
ロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用
いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子
プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベ
クターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーシ
ョン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が
挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞な
どが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方
法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクシ
ョン法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００３１】遺伝子の宿主への組込みの確認は、PCR
法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブ
リダイゼーション法等により行うことができる。例え
ば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマー
を設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製す
るために使用した条件と同様の条件で行うことができ
る。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳
動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリ
ー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等
により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検
出することにより、形質転換されたことを確認すること
ができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライ
マーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもで
きる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を
結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認す
る方法も採用することができる。
法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブ
リダイゼーション法等により行うことができる。例え
ば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマー
を設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製す
るために使用した条件と同様の条件で行うことができ
る。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳
動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリ
ー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等
により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検
出することにより、形質転換されたことを確認すること
ができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライ
マーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもで
きる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を
結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認す
る方法も採用することができる。
【００３２】３．本発明のグルコース脱水素酵素の生産
本発明のグルコース脱水素酵素は、配列番号４で表され
るアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素である。ま
た、本発明のグルコース脱水素酵素は、配列番号４で表
されるアミノ酸配列の１４５番目のセリン、１５８番目
のチロシンおよび１６２番目のリジンが保持され、当該
アミノ酸配列のうち当該３個のアミノ酸以外のアミノ酸
の１乃至複数個、好ましくは１乃至数個が欠失、置換も
しくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素
酵素であって、無機塩、好ましくは塩化ナトリウムの非
存在下での耐熱性を有するグルコース脱水素酵素、好ま
しくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性および／ま
たは改善された比活性を有するグルコース脱水素酵素も
含まれる。更に、本発明のグルコース脱水素酵素には、
配列番号４で表されるアミノ酸配列の１４５番目のセリ
ン、１５８番目のチロシン、１６２番目および１７０番
目のリジンならびに２５２番目のロイシンが保持され、
当該アミノ酸配列のうち当該５個のアミノ酸以外のアミ
ノ酸の１乃至複数個、好ましくは１乃至数個が欠失、置
換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱
水素酵素であって、無機塩、好ましくは塩化ナトリウム
の非存在下での耐熱性を有するグルコース脱水素酵素、
好ましくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性および
／または改善された比活性を有するグルコース脱水素酵
素も含まれる。
るアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素である。ま
た、本発明のグルコース脱水素酵素は、配列番号４で表
されるアミノ酸配列の１４５番目のセリン、１５８番目
のチロシンおよび１６２番目のリジンが保持され、当該
アミノ酸配列のうち当該３個のアミノ酸以外のアミノ酸
の１乃至複数個、好ましくは１乃至数個が欠失、置換も
しくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素
酵素であって、無機塩、好ましくは塩化ナトリウムの非
存在下での耐熱性を有するグルコース脱水素酵素、好ま
しくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性および／ま
たは改善された比活性を有するグルコース脱水素酵素も
含まれる。更に、本発明のグルコース脱水素酵素には、
配列番号４で表されるアミノ酸配列の１４５番目のセリ
ン、１５８番目のチロシン、１６２番目および１７０番
目のリジンならびに２５２番目のロイシンが保持され、
当該アミノ酸配列のうち当該５個のアミノ酸以外のアミ
ノ酸の１乃至複数個、好ましくは１乃至数個が欠失、置
換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱
水素酵素であって、無機塩、好ましくは塩化ナトリウム
の非存在下での耐熱性を有するグルコース脱水素酵素、
好ましくは当該耐熱性に加えて更に耐アルカリ性および
／または改善された比活性を有するグルコース脱水素酵
素も含まれる。
【００３３】例えば、本発明のグルコース脱水素酵素の
好適例として、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由来のNAD(Ｐ)+依
存性グルコース脱水素酵素の252番目のグルタミン残基
がロイシン残基に、170番目のグルタミン酸残基がリジ
ン残基に置換されたことにより塩化ナトリウムの非存在
下での耐熱性、耐アルカリ性および改善された比活性を
有するグルコース脱水素酵素MbiF20が挙げられる。当該
グルコース脱水素酵素MbiF20は、溶液中にNaClが存在し
ない場合でも非常に高い耐熱性を示すという従来見られ
ない優れた性質を持っている。
好適例として、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由来のNAD(Ｐ)+依
存性グルコース脱水素酵素の252番目のグルタミン残基
がロイシン残基に、170番目のグルタミン酸残基がリジ
ン残基に置換されたことにより塩化ナトリウムの非存在
下での耐熱性、耐アルカリ性および改善された比活性を
有するグルコース脱水素酵素MbiF20が挙げられる。当該
グルコース脱水素酵素MbiF20は、溶液中にNaClが存在し
ない場合でも非常に高い耐熱性を示すという従来見られ
ない優れた性質を持っている。
【００３４】本発明のグルコース脱水素酵素は、前記の
形質転換体を培養し、その培養物から採取することによ
り得ることができる。「培養物」とは、培養上清、ある
いは培養細胞もしくは培養菌体または細胞もしくは菌体
の破砕物のいずれをも意味するものである。
形質転換体を培養し、その培養物から採取することによ
り得ることができる。「培養物」とは、培養上清、ある
いは培養細胞もしくは培養菌体または細胞もしくは菌体
の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００３５】本発明の形質転換体を培養する方法は、宿
主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大
腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換
体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素
源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を
効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合
成培地のいずれを用いてもよい。
主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大
腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換
体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素
源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を
効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合
成培地のいずれを用いてもよい。
【００３６】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピ
オン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアル
コール類が挙げられる。窒素源としては、無機酸若しく
は有機酸のアンモニウム塩（例えばアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム等）が挙げられ、その他含窒素化合物
（例えばペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー
等）が挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリ
ウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン
ガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
ス、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピ
オン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアル
コール類が挙げられる。窒素源としては、無機酸若しく
は有機酸のアンモニウム塩（例えばアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム等）が挙げられ、その他含窒素化合物
（例えばペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー
等）が挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリ
ウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン
ガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００３７】培養は、振盪培養又は通気攪拌培養などの
好気的条件下、通常１０〜５０℃、好ましくは２５〜４
５℃の培養温度、通常ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６
〜８の培養ｐＨ、通常１０〜１５０時間、好ましくは１
０〜７０時間の培養時間で行う。なお、培地のpHの調整
は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培
養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等
の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとし
て誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転
換した微生物を培養する場合は、必要に応じてＩＰＴ
Ｇ、インドール酢酸(以下、「ＩＡＡ」ともいう。)等の
インデューサーを培地に添加してもよい。
好気的条件下、通常１０〜５０℃、好ましくは２５〜４
５℃の培養温度、通常ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６
〜８の培養ｐＨ、通常１０〜１５０時間、好ましくは１
０〜７０時間の培養時間で行う。なお、培地のpHの調整
は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培
養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等
の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとし
て誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転
換した微生物を培養する場合は、必要に応じてＩＰＴ
Ｇ、インドール酢酸(以下、「ＩＡＡ」ともいう。)等の
インデューサーを培地に添加してもよい。
【００３８】培養後、形質転換体の培養物から本発明の
グルコース脱水素酵素を採取するには、本発明のグルコ
ース脱水素酵素が菌体外又は細胞外に生産される場合に
は、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌
体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製
に用いられる通常のタンパク質精製法、例えば、熱処
理、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水
クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、電気泳動法等を単独で又は適宜組み合わせ
て用いることにより、前記培養物中から本発明のグルコ
ース脱水素酵素を単離精製することができる。また、本
発明のグルコース脱水素酵素が菌体内又は細胞内で生産
される場合には、菌体又は細胞を超音波破砕処理、磨砕
処理等で破砕することにより、本発明のグルコース脱水
素酵素の抽出液を調製し、その後は上記の精製手法と同
様にして行うことができる。
グルコース脱水素酵素を採取するには、本発明のグルコ
ース脱水素酵素が菌体外又は細胞外に生産される場合に
は、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌
体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製
に用いられる通常のタンパク質精製法、例えば、熱処
理、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水
クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、電気泳動法等を単独で又は適宜組み合わせ
て用いることにより、前記培養物中から本発明のグルコ
ース脱水素酵素を単離精製することができる。また、本
発明のグルコース脱水素酵素が菌体内又は細胞内で生産
される場合には、菌体又は細胞を超音波破砕処理、磨砕
処理等で破砕することにより、本発明のグルコース脱水
素酵素の抽出液を調製し、その後は上記の精製手法と同
様にして行うことができる。
【００３９】４．グルコース脱水素酵素を含むグルコー
スアッセイキット 本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を含むグルコ
ースアッセイキットである。本発明のグルコースアッセ
イキットは、本発明のグルコース脱水素酵素を少なくと
も１回のアッセイに十分な量含む。具体的には、キット
は、本発明のグルコース脱水素酵素に加えて、アッセイ
に必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーション
カーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用
の指針を含む。本発明のグルコース脱水素酵素は種々の
形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適
切な保存溶液中の溶液としてあるいはまたセンサースト
リップとして提供することができる。
スアッセイキット 本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を含むグルコ
ースアッセイキットである。本発明のグルコースアッセ
イキットは、本発明のグルコース脱水素酵素を少なくと
も１回のアッセイに十分な量含む。具体的には、キット
は、本発明のグルコース脱水素酵素に加えて、アッセイ
に必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーション
カーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用
の指針を含む。本発明のグルコース脱水素酵素は種々の
形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適
切な保存溶液中の溶液としてあるいはまたセンサースト
リップとして提供することができる。
【００４０】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はその技術的範囲が以下の実施例に限
定されるものではない。
明するが、本発明はその技術的範囲が以下の実施例に限
定されるものではない。
【００４１】［実施例１］グルコース脱水素酵素Ｑ２５
２Ｌの遺伝子の調製 （１） 一本鎖ＤＮＡの調製 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ
ー（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番３
号 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−２５８４として寄託さ
れているエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５から常法により抽出したプラスミ
ドｐＧＤＡ２を制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩによって
切断し、グルコース脱水素酵素遺伝子断片約０．９ｋｂ
ｐを得、Ｍ１３ファージｍｐ１８を用いてクローニング
を行い得られた組換え体より常法に従って一本鎖ＤＮＡ
を調製した。 （２） 一本鎖ＤＮＡの化学試薬による変異処理 上記により得られた一本鎖ＤＮＡ４０μｇを０．５Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．３）５０μＬに溶解し、２Ｍ亜硝酸
ナトリウム溶液５０μＬを加えて２０℃、１〜３時間の
処理を行った。また同様に亜硝酸ナトリウムの代わりに
１２Ｍのギ酸を１００μＬ添加して２０℃、５〜２０分
間処理したり、他にも６０％ヒドラジン１００μＬ加え
て同様に２０℃、５〜２０分間処理した。反応の停止は
上記処理液にそれぞれ２０μｇのｔＲＮＡを含む２．５
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μＬを添加すること
により行い、続いて各反応液に蒸留水２００μＬを加え
た後、氷冷エタノール１ｍＬを加えて変異処理ＤＮＡを
沈殿させ、さらに氷冷７０％エタノールで３回洗浄し
た。 （３） 変異二本鎖遺伝子の調製 前工程により得られた変異処理ＤＮＡ１０μｇに１０倍
濃度の逆転写酵素用緩衝液〔７０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ塩化マグネシウム、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、２０ｍＭジチオスレイトール〕１０μ
Ｌと２０ｐｍｏｌのプライマーを含む溶液２μＬと蒸留
水７４μＬを加えて８５℃、５分間、４０℃、１５分間
保温した後、１０ｍＭのｄＮＴＰ１３μＬと逆転写酵素
１μＬ(２０U)を加えて３７℃で反応を行った。１時間
後フェノール抽出を行った後エタノール沈殿を行い、沈
殿物を溶解後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで分解
し、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルより変異二本
鎖遺伝子断片を常法に従い回収した。 （４） グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子保持
株の選択 前工程により得られた変異二本鎖遺伝子断片を発現ベク
ターｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ切断部位
へ組込み、大腸菌エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３を形質転換した。シャ
ーレの培地上に生育したコロニーについて、ろ紙を用い
るレプリカプリント法により酵素活性を調べた。なお、
ろ紙はあらかじめ６０℃、２０分間の加熱処理を行っ
た。ろ紙上に強い発色が認められたクローンについて
は、変異によりグルコース脱水素酵素の遺伝子が変化し
て耐熱化したことが考えられるため、菌株をマスタープ
レートから鈎菌する。次に上記方法により選択された菌
株を各々２ＸＴＹ培地（組成：トリプトン１．６％（ｗ
／ｖ）、酵母エキス１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウ
ム０．５％（ｗ／ｖ））５ｍＬに接種し３７℃、１８時
間振盪培養を行い、集菌洗浄後、菌体懸濁液を超音波処
理し、遠心分離を行って上清液を得た。この上清液につ
いて６０℃、２０分間の加熱処理を行い、残存活性を測
定してグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子保持株
を選択した。（５） グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌ
の遺伝子の塩基配列決定と変異の同定グルコース脱水素
酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子保持株よりプラスミドＤＮＡ
ｐＧＤＡ２Ｆ−２０を調製し、常法に従って遺伝子断片
の塩基配列の決定を行い、変異点を明らかにし、グルコ
ース脱水素酵素のアミノ酸配列上の変化を確認し、塩基
配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および配
列番号２に示した。
２Ｌの遺伝子の調製 （１） 一本鎖ＤＮＡの調製 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ
ー（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番３
号 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−２５８４として寄託さ
れているエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５から常法により抽出したプラスミ
ドｐＧＤＡ２を制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩによって
切断し、グルコース脱水素酵素遺伝子断片約０．９ｋｂ
ｐを得、Ｍ１３ファージｍｐ１８を用いてクローニング
を行い得られた組換え体より常法に従って一本鎖ＤＮＡ
を調製した。 （２） 一本鎖ＤＮＡの化学試薬による変異処理 上記により得られた一本鎖ＤＮＡ４０μｇを０．５Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．３）５０μＬに溶解し、２Ｍ亜硝酸
ナトリウム溶液５０μＬを加えて２０℃、１〜３時間の
処理を行った。また同様に亜硝酸ナトリウムの代わりに
１２Ｍのギ酸を１００μＬ添加して２０℃、５〜２０分
間処理したり、他にも６０％ヒドラジン１００μＬ加え
て同様に２０℃、５〜２０分間処理した。反応の停止は
上記処理液にそれぞれ２０μｇのｔＲＮＡを含む２．５
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μＬを添加すること
により行い、続いて各反応液に蒸留水２００μＬを加え
た後、氷冷エタノール１ｍＬを加えて変異処理ＤＮＡを
沈殿させ、さらに氷冷７０％エタノールで３回洗浄し
た。 （３） 変異二本鎖遺伝子の調製 前工程により得られた変異処理ＤＮＡ１０μｇに１０倍
濃度の逆転写酵素用緩衝液〔７０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ塩化マグネシウム、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、２０ｍＭジチオスレイトール〕１０μ
Ｌと２０ｐｍｏｌのプライマーを含む溶液２μＬと蒸留
水７４μＬを加えて８５℃、５分間、４０℃、１５分間
保温した後、１０ｍＭのｄＮＴＰ１３μＬと逆転写酵素
１μＬ(２０U)を加えて３７℃で反応を行った。１時間
後フェノール抽出を行った後エタノール沈殿を行い、沈
殿物を溶解後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで分解
し、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルより変異二本
鎖遺伝子断片を常法に従い回収した。 （４） グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子保持
株の選択 前工程により得られた変異二本鎖遺伝子断片を発現ベク
ターｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ切断部位
へ組込み、大腸菌エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３を形質転換した。シャ
ーレの培地上に生育したコロニーについて、ろ紙を用い
るレプリカプリント法により酵素活性を調べた。なお、
ろ紙はあらかじめ６０℃、２０分間の加熱処理を行っ
た。ろ紙上に強い発色が認められたクローンについて
は、変異によりグルコース脱水素酵素の遺伝子が変化し
て耐熱化したことが考えられるため、菌株をマスタープ
レートから鈎菌する。次に上記方法により選択された菌
株を各々２ＸＴＹ培地（組成：トリプトン１．６％（ｗ
／ｖ）、酵母エキス１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウ
ム０．５％（ｗ／ｖ））５ｍＬに接種し３７℃、１８時
間振盪培養を行い、集菌洗浄後、菌体懸濁液を超音波処
理し、遠心分離を行って上清液を得た。この上清液につ
いて６０℃、２０分間の加熱処理を行い、残存活性を測
定してグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子保持株
を選択した。（５） グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌ
の遺伝子の塩基配列決定と変異の同定グルコース脱水素
酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子保持株よりプラスミドＤＮＡ
ｐＧＤＡ２Ｆ−２０を調製し、常法に従って遺伝子断片
の塩基配列の決定を行い、変異点を明らかにし、グルコ
ース脱水素酵素のアミノ酸配列上の変化を確認し、塩基
配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および配
列番号２に示した。
【００４２】［実施例２］グルコース脱水素酵素産生株
DNAの取得 バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）IFO 12200株、 バチルス・メガ
テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）
IFO 15308株およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） IFO 13719株を、それぞれ2
ｍＬの栄養培地（nutrient ｂｒｏｔｈ（商品名）、ベ
クトンディキンソン 製）に植菌し、3７℃で １日間培
養した。培養液の600nmにおける吸光度1.0程度まで上昇
したのを確認後、遠心分離により細胞を培養液から単離
し、既知の方法（Ausubel et al. (eds), Current Prot
ocols in Molecular Biology, Chap.2 (1994)）によ
り、それぞれのゲノムDNAを精製した。
DNAの取得 バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）IFO 12200株、 バチルス・メガ
テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）
IFO 15308株およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） IFO 13719株を、それぞれ2
ｍＬの栄養培地（nutrient ｂｒｏｔｈ（商品名）、ベ
クトンディキンソン 製）に植菌し、3７℃で １日間培
養した。培養液の600nmにおける吸光度1.0程度まで上昇
したのを確認後、遠心分離により細胞を培養液から単離
し、既知の方法（Ausubel et al. (eds), Current Prot
ocols in Molecular Biology, Chap.2 (1994)）によ
り、それぞれのゲノムDNAを精製した。
【００４３】［実施例３］グルコース脱水素酵素遺伝子
増幅プライマーの合成 取得したグルコース脱水素酵素産生株DNAよりグルコー
ス脱水素酵素遺伝子をPCR反応により増幅するためのプ
ライマーを合成した。即ち、バチルス・メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由
来のグルコース脱水素酵素の遺伝子塩基配列はすでに公
開されている（GenBank Accession no. J04805）。この
遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下「ORF」
ともいう。）のN末端およびC末端部分の塩基配列を利用
し制限酵素の認識配列として、N末端部分の前にＮｃｏ
Ｉ認識配列を追加したＤＮＡプライマーpTGDH3-N（配列
番号５）およびＣ末端部分の後にＳａｌＩ認識配列を追
加したＤＮＡプライマーpTGDH3-S（配列番号６）を合成
した。
増幅プライマーの合成 取得したグルコース脱水素酵素産生株DNAよりグルコー
ス脱水素酵素遺伝子をPCR反応により増幅するためのプ
ライマーを合成した。即ち、バチルス・メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由
来のグルコース脱水素酵素の遺伝子塩基配列はすでに公
開されている（GenBank Accession no. J04805）。この
遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下「ORF」
ともいう。）のN末端およびC末端部分の塩基配列を利用
し制限酵素の認識配列として、N末端部分の前にＮｃｏ
Ｉ認識配列を追加したＤＮＡプライマーpTGDH3-N（配列
番号５）およびＣ末端部分の後にＳａｌＩ認識配列を追
加したＤＮＡプライマーpTGDH3-S（配列番号６）を合成
した。
【００４４】また、ゲノムDNAを採取した細菌バチルス
・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ） IFO 12200株、 バチルス・メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） IFO 1530
8株およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ） IFO 13719株に近縁であるバチルス・
リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ） MC14株,バチルス・メガテリウム（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） M1286株およびバ
チルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ） W168株に関してはそれぞれグルコース脱水素酵
素の遺伝子配列が公開されている（それぞれGenBank Ac
cession no. U79570、 X12370 および M12276）。これ
らの遺伝子のORFのN末端およびC末端部分の塩基配列を
利用し制限酵素の認識配列として、N末端部分の前にＮ
ｃｏＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマーpTBli-N
（配列番号７）, pTBmM-N（配列番号８）およびpTBsU-N
（配列番号９）、Ｃ末端部分の後にＳａｌＩ認識配列を
追加したＤＮＡプライマーpTBli-S（配列番号１０）、
pTBmM-S（配列番号１１）およびpTBsU-S（配列番号１
２）を合成した。
・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ） IFO 12200株、 バチルス・メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） IFO 1530
8株およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ） IFO 13719株に近縁であるバチルス・
リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ） MC14株,バチルス・メガテリウム（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） M1286株およびバ
チルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ） W168株に関してはそれぞれグルコース脱水素酵
素の遺伝子配列が公開されている（それぞれGenBank Ac
cession no. U79570、 X12370 および M12276）。これ
らの遺伝子のORFのN末端およびC末端部分の塩基配列を
利用し制限酵素の認識配列として、N末端部分の前にＮ
ｃｏＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマーpTBli-N
（配列番号７）, pTBmM-N（配列番号８）およびpTBsU-N
（配列番号９）、Ｃ末端部分の後にＳａｌＩ認識配列を
追加したＤＮＡプライマーpTBli-S（配列番号１０）、
pTBmM-S（配列番号１１）およびpTBsU-S（配列番号１
２）を合成した。
【００４５】［実施例４］遺伝子クロー二ング
実施例２で調製したそれぞれのゲノムＤＮＡ、及び実施
例１で調製したグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝
子を大腸菌発現プラスミドpKK223-3（アマシャムバイオ
サイエンス製）に組み込んだプラスミドDNA pGDA２Ｆ−
２０を鋳型として、実施例３で作製したそれぞれのプラ
イマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の条件
は以下の通りである。PCRの条件：2.5U pfu turbo DNA
polymerase（Stratagen社製）、pfu turbo DNApolymera
seに添付の反応バッファー（1X）、N末端プライマー 40
pmol/mＬ、C末端プライマー 40pmol/mＬ、dNTP 0.25mM
に水を加え、総量50μＬの溶液を作製し、95℃ 1分、58
℃ 45秒、72℃ 1分、30サイクルのプログラムで増幅を
行なった。
例１で調製したグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝
子を大腸菌発現プラスミドpKK223-3（アマシャムバイオ
サイエンス製）に組み込んだプラスミドDNA pGDA２Ｆ−
２０を鋳型として、実施例３で作製したそれぞれのプラ
イマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の条件
は以下の通りである。PCRの条件：2.5U pfu turbo DNA
polymerase（Stratagen社製）、pfu turbo DNApolymera
seに添付の反応バッファー（1X）、N末端プライマー 40
pmol/mＬ、C末端プライマー 40pmol/mＬ、dNTP 0.25mM
に水を加え、総量50μＬの溶液を作製し、95℃ 1分、58
℃ 45秒、72℃ 1分、30サイクルのプログラムで増幅を
行なった。
【００４６】PCR反応産物を1.2%（ｖ／ｖ）濃度のアガ
ロースゲル電気泳動で解析したところ、約0.79kbpのグ
ルコース脱水素酵素の遺伝子配列から予想される長さの
断片が増幅された。即ち、それぞれのPCR反応産物を1.2
%（ｖ／ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動で分離し、
約0.79kbpバンドをゲルより切り出してQIAquick Gel pu
rification kit(Qiagen社製)により精製した後、減圧乾
固し、それぞれ20μＬのトリス-EDTA（以下「ＴＥ」とも
いう。）緩衝液に溶解した。精製したそれぞれのＤＮＡ
断片をクローニングベクターpT7-Blue (Novagen社製)に
Perfectly BluntCloning kits（Novagen社製）を用いて
挿入し、大腸菌NovaBlue SinglesTM コンピテントセル
（Novagen社製）を用いて形質転換した。形質転換細胞
を含む溶液を50μg /mLのアンピシリン、0.1mMのIPTGお
よび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（以下、「X-gal」ともいう。）
を含むLB寒天培地上に塗布し、37℃で1晩培養してコロ
ニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニ
ーを選択し、40mＬのＬＢ培地（50μg /mＬのアンピシ
リンを含む）に植菌し、一晩37℃で振盪培養した。培養
液を遠心分離して集菌後、QIAprep plasmid purificati
on kit(Qiagen社製) により約10μg のプラスミドＤＮ
Ａを精製した。バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株、バチルス・リケ
ニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）IFO 12200株、 バチルス・メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IFO 15308株、バ
チルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）IFO 13719株由来のプラスミドＤＮＡをそれぞれp
T7GDH3, pT7Bli、 pT7BmMおよびpT7BsUと命名した。そ
れぞれうち0.5μgを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩに
より切断し、1.2%（ｖ／ｖ）濃度のアガロースゲル電気
泳動により約0.79kbp挿入断片のあることを確認した。
１サンプルあたり300ngのpT7GDH3、 pT7Bli、 pT7BmMお
よびpT7BsUを鋳型として、BigDye TerminatorCycle Seq
uencing kit （アプライドバイオシステムズ製）を用い
てシークエンス反応を行い、ＤＮＡシークエンサー３７
００Ａ（アプライドバイオシステムズ製）により塩基配
列を決定した。
ロースゲル電気泳動で解析したところ、約0.79kbpのグ
ルコース脱水素酵素の遺伝子配列から予想される長さの
断片が増幅された。即ち、それぞれのPCR反応産物を1.2
%（ｖ／ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動で分離し、
約0.79kbpバンドをゲルより切り出してQIAquick Gel pu
rification kit(Qiagen社製)により精製した後、減圧乾
固し、それぞれ20μＬのトリス-EDTA（以下「ＴＥ」とも
いう。）緩衝液に溶解した。精製したそれぞれのＤＮＡ
断片をクローニングベクターpT7-Blue (Novagen社製)に
Perfectly BluntCloning kits（Novagen社製）を用いて
挿入し、大腸菌NovaBlue SinglesTM コンピテントセル
（Novagen社製）を用いて形質転換した。形質転換細胞
を含む溶液を50μg /mLのアンピシリン、0.1mMのIPTGお
よび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（以下、「X-gal」ともいう。）
を含むLB寒天培地上に塗布し、37℃で1晩培養してコロ
ニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニ
ーを選択し、40mＬのＬＢ培地（50μg /mＬのアンピシ
リンを含む）に植菌し、一晩37℃で振盪培養した。培養
液を遠心分離して集菌後、QIAprep plasmid purificati
on kit(Qiagen社製) により約10μg のプラスミドＤＮ
Ａを精製した。バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株、バチルス・リケ
ニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）IFO 12200株、 バチルス・メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）IFO 15308株、バ
チルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）IFO 13719株由来のプラスミドＤＮＡをそれぞれp
T7GDH3, pT7Bli、 pT7BmMおよびpT7BsUと命名した。そ
れぞれうち0.5μgを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩに
より切断し、1.2%（ｖ／ｖ）濃度のアガロースゲル電気
泳動により約0.79kbp挿入断片のあることを確認した。
１サンプルあたり300ngのpT7GDH3、 pT7Bli、 pT7BmMお
よびpT7BsUを鋳型として、BigDye TerminatorCycle Seq
uencing kit （アプライドバイオシステムズ製）を用い
てシークエンス反応を行い、ＤＮＡシークエンサー３７
００Ａ（アプライドバイオシステムズ製）により塩基配
列を決定した。
【００４７】その結果、pT7Bli、 pT7BmMおよびpT7BsU
にクローニングされた遺伝子のコードされるタンパク質
はそれぞれ公開されているバチルス・リケニホルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）MC1
4株、 バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）M1286株およびバチルス・スブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）W168株の
持つグルコース脱水素酵素と比してアミノ酸配列が完全
に一致したことから、グルコース脱水素酵素であること
が明らかになった。
にクローニングされた遺伝子のコードされるタンパク質
はそれぞれ公開されているバチルス・リケニホルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）MC1
4株、 バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）M1286株およびバチルス・スブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）W168株の
持つグルコース脱水素酵素と比してアミノ酸配列が完全
に一致したことから、グルコース脱水素酵素であること
が明らかになった。
【００４８】［実施例５］組換えグルコース脱水素酵素
発現ベクターの作製 pT7Bli、 pT7BmM、 pT7BsUおよびpT7GDH3のそれぞれに
挿入されたグルコース脱水素酵素遺伝子を制限酵素Ｎｃ
ｏＩとＳａｌＩで切断して分離し、発現ベクターpTrc99
A（アマシャムバイオサイエンス製）に挿入した。即
ち、それぞれ1μgのpT7Bli、 pT7BmM、 pT7BsUおよびpT
7GDH3を各10Uの制限酵素ＮｃｏＩとＳａｌＩを用いて37
℃で2時間切断反応を行った。反応後の溶液を1.2%（ｖ
／ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動により分離し、0.
79kbに相当するバンドをゲルより切り出してQIAquick G
el purification kit (Qiagen社製)により精製し、それ
ぞれについて20μＬのトリス-EDTA緩衝液により溶解し
た。
発現ベクターの作製 pT7Bli、 pT7BmM、 pT7BsUおよびpT7GDH3のそれぞれに
挿入されたグルコース脱水素酵素遺伝子を制限酵素Ｎｃ
ｏＩとＳａｌＩで切断して分離し、発現ベクターpTrc99
A（アマシャムバイオサイエンス製）に挿入した。即
ち、それぞれ1μgのpT7Bli、 pT7BmM、 pT7BsUおよびpT
7GDH3を各10Uの制限酵素ＮｃｏＩとＳａｌＩを用いて37
℃で2時間切断反応を行った。反応後の溶液を1.2%（ｖ
／ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動により分離し、0.
79kbに相当するバンドをゲルより切り出してQIAquick G
el purification kit (Qiagen社製)により精製し、それ
ぞれについて20μＬのトリス-EDTA緩衝液により溶解し
た。
【００４９】次に1μgのpTrc99A（アマシャムバイオサ
イエンス製）を各10Uの制限酵素ＮｃｏＩとＳａｌＩに
より37℃で4時間切断反応を行い、反応後の溶液をQIAqu
ick Gelpurification kit (Qiagen社製)により精製し、
20μＬのトリス-EDTA緩衝液により溶解した。
イエンス製）を各10Uの制限酵素ＮｃｏＩとＳａｌＩに
より37℃で4時間切断反応を行い、反応後の溶液をQIAqu
ick Gelpurification kit (Qiagen社製)により精製し、
20μＬのトリス-EDTA緩衝液により溶解した。
【００５０】pT7Bli、 pT7BmM、 pT7BsUおよびpT7GDH3
を制限酵素ＮｃｏＩとＳａｌＩで切断して得た0.79kbｐ
DNA断片それぞれ1μＬと、ＮｃｏＩとＳａｌＩで切断し
たpTrc99A1μＬおよび2μＬの Ligation high (TOYOBO
製)を混合し、16℃で30分連結反応を行った。反応後の
溶液それぞれ1μＬを用いて大腸菌NovaBlue SinglesTM
コンピテントセル（Novagen社製）を形質転換した。形
質転換細胞を含む溶液を50μg ／mＬのアンピシリン、
0.1mMのIPTGおよびのX-galを含むLB寒天培地上に塗布
し、37℃で1晩培養してコロニーを形成させた。それぞ
れについて白色の陽性コロニーを選択し、2mＬのＬＢ培
地（50μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌し、一
晩37℃で振盪培養した。培養液を遠心分離して集菌後、
QIAprep plasmid purification kit(Qiagen社製) によ
り約1μg のプラスミドＤＮＡを精製した。それぞれう
ち0.5μgを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩにより切断
し、1.2%（ｖ／ｖ）アガロースゲル電気泳動により約0.
79kbp挿入断片のあることを確認した。それぞれのＰＣ
Ｒ増幅断片由来の領域の塩基配列をシークエンス反応に
より確認したところ、変異は認められなかった。これら
の発現プラスミドを、pT7Bli、 pT7BmM、 pT7BsUおよび
pT7GDH3を用いて製作したものについてそれぞれpGtrc-9
L、pGtrc-9M、 pGtrc-9S、pGtrc-9Gとした。
を制限酵素ＮｃｏＩとＳａｌＩで切断して得た0.79kbｐ
DNA断片それぞれ1μＬと、ＮｃｏＩとＳａｌＩで切断し
たpTrc99A1μＬおよび2μＬの Ligation high (TOYOBO
製)を混合し、16℃で30分連結反応を行った。反応後の
溶液それぞれ1μＬを用いて大腸菌NovaBlue SinglesTM
コンピテントセル（Novagen社製）を形質転換した。形
質転換細胞を含む溶液を50μg ／mＬのアンピシリン、
0.1mMのIPTGおよびのX-galを含むLB寒天培地上に塗布
し、37℃で1晩培養してコロニーを形成させた。それぞ
れについて白色の陽性コロニーを選択し、2mＬのＬＢ培
地（50μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌し、一
晩37℃で振盪培養した。培養液を遠心分離して集菌後、
QIAprep plasmid purification kit(Qiagen社製) によ
り約1μg のプラスミドＤＮＡを精製した。それぞれう
ち0.5μgを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩにより切断
し、1.2%（ｖ／ｖ）アガロースゲル電気泳動により約0.
79kbp挿入断片のあることを確認した。それぞれのＰＣ
Ｒ増幅断片由来の領域の塩基配列をシークエンス反応に
より確認したところ、変異は認められなかった。これら
の発現プラスミドを、pT7Bli、 pT7BmM、 pT7BsUおよび
pT7GDH3を用いて製作したものについてそれぞれpGtrc-9
L、pGtrc-9M、 pGtrc-9S、pGtrc-9Gとした。
【００５１】［実施例６］組換えグルコース脱水素酵素
の活性測定 pGtrc-9L、 pGtrc-9M、 pGtrc-9S、 pGtrc-9Gで大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）JM109株（Yanisc
h-Perron et al.、 Gene、 33、 103-119 (1985)）を形
質転換し、形質転換細胞を含む溶液を50μg/mＬのアン
ピシリンを含むLB寒天培地上に塗布し、37℃で1晩培養
してコロニーを形成させた。それぞれについて単一コロ
ニーを選択し、50μg/mＬのアンピシリンを含む2mLのLB
液体培地に植菌し、一晩37℃で振盪培養した。この培養
液を3000ｘｇ、5分間の遠心操作により細胞を沈殿さ
せ、上清を除いた後、2mＬのＬＢ培地（50μg/mＬのア
ンピシリンを含む）に懸濁し、そのうち0.2mＬを10mＬ
のＬＢ培地（50μg/mＬのアンピシリンを含む）に接種
した。約３時間後、培養液のOD600 が０．６〜０．８に
上昇した事を確認後、10μＬの1 M IPTG溶液を添加し
（最終濃度1 mM）グルコース脱水素酵素遺伝子の発現を
誘導させた。それぞれの培養液をさらに、37℃で一晩振
とう培養し、培養液を3000ｘｇ、１０分間の遠心操作に
より細胞を沈殿させ、上清を除いた後、NaClを含んでな
いリン酸緩衝液（50mM KH2PO4-Na2HPO4 、pH6.5）で２
回洗浄した。超音波破砕機Branson sonifier 250（4
℃、120秒間、dutyratio 20%、 power 3、Branson社
製）でその菌体を破砕し、12000ｘｇで10分間遠心した
後、この遠心上清を粗酵素溶液としてグルコース脱水素
酵素の活性を調べた。反応液の組成は０.０９M Tris-塩
酸緩衝液（pH8.0）、０．１M D(+)グルコース、２ｍM N
AD+とし、3mＬの反応液に50μＬの粗酵素溶液を加える
ことで反応を開始させ、NADHの吸収極大である340nmの
吸収を経時的に測定した。NADHの生成量は340nm におけ
るNADHの分子吸光係数（1mMあたり6.22）をもとに計算
した。25℃における１分間あたり1μmolのNADH生成量を
１単位の酵素活性とし、粗酵素溶液1mＬあたりそれぞれ
0.05(pGtrc-9L)、0.76 (pGtrc-9M)、2.9(pGtrc-9S)、0.
9(pGtrc-9G)単位の活性があった。なお、グルコース脱
水素酵素遺伝子を挿入していないpTrc99Aを導入した大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）JM109株では
酵素活性は認められなかった。
の活性測定 pGtrc-9L、 pGtrc-9M、 pGtrc-9S、 pGtrc-9Gで大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）JM109株（Yanisc
h-Perron et al.、 Gene、 33、 103-119 (1985)）を形
質転換し、形質転換細胞を含む溶液を50μg/mＬのアン
ピシリンを含むLB寒天培地上に塗布し、37℃で1晩培養
してコロニーを形成させた。それぞれについて単一コロ
ニーを選択し、50μg/mＬのアンピシリンを含む2mLのLB
液体培地に植菌し、一晩37℃で振盪培養した。この培養
液を3000ｘｇ、5分間の遠心操作により細胞を沈殿さ
せ、上清を除いた後、2mＬのＬＢ培地（50μg/mＬのア
ンピシリンを含む）に懸濁し、そのうち0.2mＬを10mＬ
のＬＢ培地（50μg/mＬのアンピシリンを含む）に接種
した。約３時間後、培養液のOD600 が０．６〜０．８に
上昇した事を確認後、10μＬの1 M IPTG溶液を添加し
（最終濃度1 mM）グルコース脱水素酵素遺伝子の発現を
誘導させた。それぞれの培養液をさらに、37℃で一晩振
とう培養し、培養液を3000ｘｇ、１０分間の遠心操作に
より細胞を沈殿させ、上清を除いた後、NaClを含んでな
いリン酸緩衝液（50mM KH2PO4-Na2HPO4 、pH6.5）で２
回洗浄した。超音波破砕機Branson sonifier 250（4
℃、120秒間、dutyratio 20%、 power 3、Branson社
製）でその菌体を破砕し、12000ｘｇで10分間遠心した
後、この遠心上清を粗酵素溶液としてグルコース脱水素
酵素の活性を調べた。反応液の組成は０.０９M Tris-塩
酸緩衝液（pH8.0）、０．１M D(+)グルコース、２ｍM N
AD+とし、3mＬの反応液に50μＬの粗酵素溶液を加える
ことで反応を開始させ、NADHの吸収極大である340nmの
吸収を経時的に測定した。NADHの生成量は340nm におけ
るNADHの分子吸光係数（1mMあたり6.22）をもとに計算
した。25℃における１分間あたり1μmolのNADH生成量を
１単位の酵素活性とし、粗酵素溶液1mＬあたりそれぞれ
0.05(pGtrc-9L)、0.76 (pGtrc-9M)、2.9(pGtrc-9S)、0.
9(pGtrc-9G)単位の活性があった。なお、グルコース脱
水素酵素遺伝子を挿入していないpTrc99Aを導入した大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）JM109株では
酵素活性は認められなかった。
【００５２】［実施例７］遺伝子シャフリングによるキ
メラ遺伝子ライブラリーの作製 作製したpGtrc-9L、 pGtrc-9M、 pGtrc-9SおよびpGtrc-
9Gを用いてVal rie Ab cassis等の方法（Val rie Ab ca
ssis et al. Nucleic Acids Res.、 28、 2000）に従い
遺伝子シャフリングによりキメラ遺伝子ライブラリーを
作製した。各2.5μgずつのpGtrc-9L、 pGtrc-9M、 pGtr
c-9SおよびpGtrc-9Gを5μＬの蒸留水で溶解、混合し
た。そこに 0.0560単位のDＮase I（宝酒造株式会社
製）を加え、DＮase I添付のバッファーを加えて全量を
42μＬにした後、20℃で10分間切断反応を行い、90℃で
10分間処理しDＮase Iを失活させ反応を停止させた。そ
の切断反応液をCentrisep gel filtration column（Pri
nceton separation製）で精製し、そのうち39μＬを鋳
型としてPCRを行った。この時プライマーは無添加であ
り、PCR反応の条件は以下の通りである。 PCRの条件：鋳型DNA 39μL、2.5U pfu turbo DNA polym
erase （Stratagene製）、pfu turbo DNA polymerase
に添付の反応バッファー（1X）、dNTP 0.25mMに水を加
え、総量50μＬの溶液を作製し、96℃ 2分処理後、94℃
1分、56℃ 1分、72℃ 1分＋5秒／サイクル、40サイク
ルのプログラムで増幅を行なった。
メラ遺伝子ライブラリーの作製 作製したpGtrc-9L、 pGtrc-9M、 pGtrc-9SおよびpGtrc-
9Gを用いてVal rie Ab cassis等の方法（Val rie Ab ca
ssis et al. Nucleic Acids Res.、 28、 2000）に従い
遺伝子シャフリングによりキメラ遺伝子ライブラリーを
作製した。各2.5μgずつのpGtrc-9L、 pGtrc-9M、 pGtr
c-9SおよびpGtrc-9Gを5μＬの蒸留水で溶解、混合し
た。そこに 0.0560単位のDＮase I（宝酒造株式会社
製）を加え、DＮase I添付のバッファーを加えて全量を
42μＬにした後、20℃で10分間切断反応を行い、90℃で
10分間処理しDＮase Iを失活させ反応を停止させた。そ
の切断反応液をCentrisep gel filtration column（Pri
nceton separation製）で精製し、そのうち39μＬを鋳
型としてPCRを行った。この時プライマーは無添加であ
り、PCR反応の条件は以下の通りである。 PCRの条件：鋳型DNA 39μL、2.5U pfu turbo DNA polym
erase （Stratagene製）、pfu turbo DNA polymerase
に添付の反応バッファー（1X）、dNTP 0.25mMに水を加
え、総量50μＬの溶液を作製し、96℃ 2分処理後、94℃
1分、56℃ 1分、72℃ 1分＋5秒／サイクル、40サイク
ルのプログラムで増幅を行なった。
【００５３】次に、一次PCR産物を鋳型とし、pTrc99Aの
挿入配列の前後の塩基配列を用いて作製したプライマー
pK223P（配列番号１３に示す）とpK223T（配列番号１４
に示す）を用いてPCRを行った。 PCRの条件：鋳型DNA 一次PCR産物2μＬ、5U Ampli Taq
Gold DNA polymerase（アプライドバイオシステムズ社
製）、Taq Gold DNA polymeraseに添付の反応バッファ
ー（1X）、5'プライマー pK223P 25pmol/mＬ、3'プライ
マー pK223T 25pmol/mＬ、dNTP 0.25mMに水を加え、総
量50μＬの溶液を作製し、96℃ 2分処理後、94℃ 30
秒、56℃ 30秒、72℃45秒＋20秒サイクル、25サイクル
のプログラムで増幅を行い、その後72℃で7分間処理し
た。増幅反応後の溶液20μＬを用いて1.2%濃度のアガロ
ースゲル電気泳動を行った結果、目的とした変異グルコ
ース脱水素酵素遺伝子混合物である約１kbｐのDNA断片
が増幅されていることを確認した。この約１kbｐのバン
ドをゲルより切り出してQIAquick Gel purification ki
t(Qiagen製)により精製後、20μＬのトリス-EDTA緩衝液
に溶解した。
挿入配列の前後の塩基配列を用いて作製したプライマー
pK223P（配列番号１３に示す）とpK223T（配列番号１４
に示す）を用いてPCRを行った。 PCRの条件：鋳型DNA 一次PCR産物2μＬ、5U Ampli Taq
Gold DNA polymerase（アプライドバイオシステムズ社
製）、Taq Gold DNA polymeraseに添付の反応バッファ
ー（1X）、5'プライマー pK223P 25pmol/mＬ、3'プライ
マー pK223T 25pmol/mＬ、dNTP 0.25mMに水を加え、総
量50μＬの溶液を作製し、96℃ 2分処理後、94℃ 30
秒、56℃ 30秒、72℃45秒＋20秒サイクル、25サイクル
のプログラムで増幅を行い、その後72℃で7分間処理し
た。増幅反応後の溶液20μＬを用いて1.2%濃度のアガロ
ースゲル電気泳動を行った結果、目的とした変異グルコ
ース脱水素酵素遺伝子混合物である約１kbｐのDNA断片
が増幅されていることを確認した。この約１kbｐのバン
ドをゲルより切り出してQIAquick Gel purification ki
t(Qiagen製)により精製後、20μＬのトリス-EDTA緩衝液
に溶解した。
【００５４】次に、遺伝子シャフリングにより増幅した
変異遺伝子ライブラリーを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）JM109に発現させ、変異遺伝子発現ライ
ブラリーを作製した。即ち、精製した変異遺伝子ライブ
ラリーの全量を各20単位の制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａ
ｌＩで一晩処理した後、１．２％（ｖ／ｖ）濃度のアガ
ロースゲル電気泳動により分離し、約１kbpのバンドを
ゲルより切り出してQIAquick Gel purification kit(Qi
agen製)により精製後、20μＬのＴＥ緩衝液に溶解し
た。次に1μgのpTrc99Aを各10Uの制限酵素ＮｃｏＩとＳ
ａｌＩにより37℃で4時間切断反応を行い、反応後の溶
液をQIAquick Gel purification kit(Qiagen製)により
精製し、20μＬのトリス-EDTA緩衝液により溶解した。
精製したＮｃｏＩとＳａｌＩで切断した1kbｐ断片それ
ぞれ1μＬと、ＮｃｏＩとＳａｌＩで切断したpTrc99A1
μLおよび2μＬの Ligation high (TOYOBO製)を混合
し、16℃で一晩連結反応を行った。反応後の溶液それぞ
れ1μＬを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）JM109を形質転換した。形質転換細胞を含む溶液
を50μg/mＬのアンピシリンおよび1mMのIPTGを含む径9c
mのLB寒天培地上に塗布し、37℃で1晩培養してコロニー
を形成させた。
変異遺伝子ライブラリーを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）JM109に発現させ、変異遺伝子発現ライ
ブラリーを作製した。即ち、精製した変異遺伝子ライブ
ラリーの全量を各20単位の制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａ
ｌＩで一晩処理した後、１．２％（ｖ／ｖ）濃度のアガ
ロースゲル電気泳動により分離し、約１kbpのバンドを
ゲルより切り出してQIAquick Gel purification kit(Qi
agen製)により精製後、20μＬのＴＥ緩衝液に溶解し
た。次に1μgのpTrc99Aを各10Uの制限酵素ＮｃｏＩとＳ
ａｌＩにより37℃で4時間切断反応を行い、反応後の溶
液をQIAquick Gel purification kit(Qiagen製)により
精製し、20μＬのトリス-EDTA緩衝液により溶解した。
精製したＮｃｏＩとＳａｌＩで切断した1kbｐ断片それ
ぞれ1μＬと、ＮｃｏＩとＳａｌＩで切断したpTrc99A1
μLおよび2μＬの Ligation high (TOYOBO製)を混合
し、16℃で一晩連結反応を行った。反応後の溶液それぞ
れ1μＬを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）JM109を形質転換した。形質転換細胞を含む溶液
を50μg/mＬのアンピシリンおよび1mMのIPTGを含む径9c
mのLB寒天培地上に塗布し、37℃で1晩培養してコロニー
を形成させた。
【００５５】［実施例８］耐熱性グルコース脱水素酵素
のスクリーニング 変異遺伝子発現ライブラリーのコロニーを濾紙上に写し
取り、熱処理を加えた後に酵素基質と、反応生成物であ
るNADHと反応して発色する試薬を加えた溶液を加え、残
存活性により発色するコロニーを選択した。即ち、作製
した変異遺伝子発現ライブラリーのコロニーを滅菌した
ラシャ円盤Accutran（Schleicher&Schuell社製）を用い
て別の50μg/mＬのアンピシリンおよび1mMのIPTGを含む
LB寒天培地に複製した後、滅菌したワットマンＮｏ．１
（Whatman #1）濾紙（Whatman製） を10分間被せ、大腸
菌をフィルターに移した。そのフィルターを1mＬの2mg/
mＬ リゾチーム（Sigma製）溶液で30分間室温で処理し
菌体細胞膜を破壊した後、そのフィルターをリン酸緩衝
液（10mM KH2PO4-Na2HPO4 、pH6.5）中で70℃ 1時間熱
処理を行った。反応後フィルターに発色剤（0.5mM 3-
(4'、5'-ジメチルチアゾール-2-イル)-2、5-ジフェニル
テトラゾリウムブロミドおよび0.5mM 5-エチルフェナジ
ニウムエチルスルフェート）と酵素基質（0.1M D-グル
コースおよび50μM NAD＋）を含むリン酸緩衝液（10m
M、pH6.5）を加えて室温で発色反応を行った。その結果
1つのコロニーについて強い紫色の発色が観察された。
のスクリーニング 変異遺伝子発現ライブラリーのコロニーを濾紙上に写し
取り、熱処理を加えた後に酵素基質と、反応生成物であ
るNADHと反応して発色する試薬を加えた溶液を加え、残
存活性により発色するコロニーを選択した。即ち、作製
した変異遺伝子発現ライブラリーのコロニーを滅菌した
ラシャ円盤Accutran（Schleicher&Schuell社製）を用い
て別の50μg/mＬのアンピシリンおよび1mMのIPTGを含む
LB寒天培地に複製した後、滅菌したワットマンＮｏ．１
（Whatman #1）濾紙（Whatman製） を10分間被せ、大腸
菌をフィルターに移した。そのフィルターを1mＬの2mg/
mＬ リゾチーム（Sigma製）溶液で30分間室温で処理し
菌体細胞膜を破壊した後、そのフィルターをリン酸緩衝
液（10mM KH2PO4-Na2HPO4 、pH6.5）中で70℃ 1時間熱
処理を行った。反応後フィルターに発色剤（0.5mM 3-
(4'、5'-ジメチルチアゾール-2-イル)-2、5-ジフェニル
テトラゾリウムブロミドおよび0.5mM 5-エチルフェナジ
ニウムエチルスルフェート）と酵素基質（0.1M D-グル
コースおよび50μM NAD＋）を含むリン酸緩衝液（10m
M、pH6.5）を加えて室温で発色反応を行った。その結果
1つのコロニーについて強い紫色の発色が観察された。
【００５６】［実施例９］耐熱性グルコース脱水素酵素
遺伝子の単離 強い発色を示したコロニーを複製したLB寒天培地から選
択し1mＬの50μg/mＬのアンピシリンを含むLB液体培地
で一晩37℃で振盪培養した。培養液を遠心分離して集菌
後、QIAprep plasmid purification kit(Qiagen製) に
より約10μgのプラスミドＤＮＡを精製した。そのうち3
00ngを鋳型とし、プライマーpK223PまたはpK223Tを用い
てBigDye Terminator Cycle Sequencing kit （アプラ
イドバイオシステムズ製）によりシークエンス反応を行
い、ＤＮＡシークエンサー３７００Ａ（アプライドバイ
オシステムズ製）により塩基配列を決定した。
遺伝子の単離 強い発色を示したコロニーを複製したLB寒天培地から選
択し1mＬの50μg/mＬのアンピシリンを含むLB液体培地
で一晩37℃で振盪培養した。培養液を遠心分離して集菌
後、QIAprep plasmid purification kit(Qiagen製) に
より約10μgのプラスミドＤＮＡを精製した。そのうち3
00ngを鋳型とし、プライマーpK223PまたはpK223Tを用い
てBigDye Terminator Cycle Sequencing kit （アプラ
イドバイオシステムズ製）によりシークエンス反応を行
い、ＤＮＡシークエンサー３７００Ａ（アプライドバイ
オシステムズ製）により塩基配列を決定した。
【００５７】その結果このプラスミド（以下、「ｐＧＤ
Ｈ３ＤＮ４６」ともいう。）の持つ変異遺伝子は、グル
コース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子に比べ、塩基配列
の３５７番目のアデニンがシトシンに、３６０番目のチ
ミンがシトシンに、５０１番目のチミンがアデニンに、
および５０８番目のグアニンがアデニンに変化してい
た。特に５０８番目のグアニンがアデニンに変化するこ
とにより、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の１
７０番目のアミノ酸残基がグルタミン酸残基からリジン
残基に置換されていた。従来の変異である２５２番目の
ロイシン残基も維持されていた。従って、この変異遺伝
子はバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由来のグルコース脱水素酵素
に２５２番目のグルタミン残基がロイシン残基に置換し
た変異（Ｑ２５２L)および１７０番目のアミノ酸残基が
グルタミン酸残基からリジン残基に置換した変異（Ｅ１
７０Ｋ）の2つの変異が加わった変異グルコース脱水素
酵素（以下、「グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０」と
もいう。）をコードしていた。このグルコース脱水素酵
素ＭｂｉＦ２０の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番
号３および配列番号４に示す。
Ｈ３ＤＮ４６」ともいう。）の持つ変異遺伝子は、グル
コース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌの遺伝子に比べ、塩基配列
の３５７番目のアデニンがシトシンに、３６０番目のチ
ミンがシトシンに、５０１番目のチミンがアデニンに、
および５０８番目のグアニンがアデニンに変化してい
た。特に５０８番目のグアニンがアデニンに変化するこ
とにより、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の１
７０番目のアミノ酸残基がグルタミン酸残基からリジン
残基に置換されていた。従来の変異である２５２番目の
ロイシン残基も維持されていた。従って、この変異遺伝
子はバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）IWG3株由来のグルコース脱水素酵素
に２５２番目のグルタミン残基がロイシン残基に置換し
た変異（Ｑ２５２L)および１７０番目のアミノ酸残基が
グルタミン酸残基からリジン残基に置換した変異（Ｅ１
７０Ｋ）の2つの変異が加わった変異グルコース脱水素
酵素（以下、「グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０」と
もいう。）をコードしていた。このグルコース脱水素酵
素ＭｂｉＦ２０の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番
号３および配列番号４に示す。
【００５８】［実施例１０］グルコース脱水素酵素Ｍｂ
ｉＦ２０の精製。 ｐＧＤＨ３ＤＮ４６を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転
換細胞を含む溶液を５０μg/mＬのアンピシリンを含むL
B寒天培地上に塗布し、３７℃で１晩培養してコロニー
を形成させた。単一コロニーを選択し、50μg/mＬのア
ンピシリンを含む５mＬ LB液体培地で一晩３７℃で振と
う培養した。この培養液を３０００ｘｇ、10分間遠心分
離し培養上清を除いた後、５ｍＬのＬＢ培地（５０μg/
mＬのアンピシリンを含む）に懸濁、遠心分離し培養上
清を除いた後400mＬのＬＢ培地（50μg/mＬのアンピシ
リンを含む）に懸濁した。約５時間後(OD600 = ０．６
〜０．８) 400μＬの1 M IPTG を添加し（最終濃度1 m
M）さらに３７℃で一晩振とう培養した。その培養液を
３０００ｘｇ、１０分間遠心分離し培養上清を除いた
後、１０mＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭ KH2PO4-Na2HPO4
、pH6.5）による懸濁、遠心分離により２回洗浄し、１
０mＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭ KH2PO4-Na2HPO4 、pH
6.5）に懸濁した。超音波破砕機（Branson sonifier 25
0、Branson製）を用い、４℃、１８０秒間、duty ratio
50%、 power 7の条件でその菌体を破砕した後、１２０
００ｘｇで２２０分間遠心し得られた上清を６０℃で２
０分間処理した。
ｉＦ２０の精製。 ｐＧＤＨ３ＤＮ４６を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転
換細胞を含む溶液を５０μg/mＬのアンピシリンを含むL
B寒天培地上に塗布し、３７℃で１晩培養してコロニー
を形成させた。単一コロニーを選択し、50μg/mＬのア
ンピシリンを含む５mＬ LB液体培地で一晩３７℃で振と
う培養した。この培養液を３０００ｘｇ、10分間遠心分
離し培養上清を除いた後、５ｍＬのＬＢ培地（５０μg/
mＬのアンピシリンを含む）に懸濁、遠心分離し培養上
清を除いた後400mＬのＬＢ培地（50μg/mＬのアンピシ
リンを含む）に懸濁した。約５時間後(OD600 = ０．６
〜０．８) 400μＬの1 M IPTG を添加し（最終濃度1 m
M）さらに３７℃で一晩振とう培養した。その培養液を
３０００ｘｇ、１０分間遠心分離し培養上清を除いた
後、１０mＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭ KH2PO4-Na2HPO4
、pH6.5）による懸濁、遠心分離により２回洗浄し、１
０mＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭ KH2PO4-Na2HPO4 、pH
6.5）に懸濁した。超音波破砕機（Branson sonifier 25
0、Branson製）を用い、４℃、１８０秒間、duty ratio
50%、 power 7の条件でその菌体を破砕した後、１２０
００ｘｇで２２０分間遠心し得られた上清を６０℃で２
０分間処理した。
【００５９】ろ過メンブレンフィルターを通し不純物及
び変性タンパク質を除いた後、HPLCモデル8010（東ソー
製）による陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行
った。濾過後の抽出液をDEAE-5PW（カラムサイズ：21.5
mml.D.X15cm東ソー製）に吸着させ重量/容量比１０％か
ら２５％の塩化ナトリウム濃度勾配をかけたリン酸緩衝
液（５０ｍＭ KH2PO4-Na2HPO4 、pH6.5）によりタンパ
ク質を溶出させた。流出速度は毎分５ｍＬで行い、１０
ｍＬづつ分取した。各ピークに含まれる酵素活性を測定
した結果、およそ２２％の塩化ナトリウム濃度で溶出さ
れるピークに目的とするグルコース脱水素酵素が含まれ
ていた。このピークに相当する溶出画分２０μＬを公知
のレムリー（Laemmli）法によるゲル濃度１２．５％のS
DS-ポリアクリルアミド電気泳動で解析したところグル
コース脱水素酵素に相当する分子量31kDaのバンド（CBB
染色法及び銀染色法）以外の成分がほとんど含まれてい
ないことを確認した。この溶出画分60mＬを分画分子量
５万の限外ろ過メンブランフィルター（セントリコン
（商品名）、ミリポア製）により１０mＬに濃縮し（5mg
/mＬ）、500mＬのリン酸緩衝液（５０mM KH2PO4-Na2HPO
4 、pH６．５）に希釈したもの（100μg/mＬ）を精製グ
ルコース脱水素酵素、即ちグルコース脱水素酵素Ｍｂｉ
Ｆ２０、とした。当該グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２
０の比活性は１７４ｕ／ｍｇであった（表１）。比較対
照として、特開平２−８６７７９号の実施例１に従い製
造し、上記グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０の精製と
同様にして精製した２種のグルコース脱水素酵素、即ち
グルコース脱水素酵素Ｅ９６Ａ（配列番号１５）および
グルコース脱水素酵素Ｅ９６Ｇ（配列番号１６）の比活
性も表１に併せて示した。
び変性タンパク質を除いた後、HPLCモデル8010（東ソー
製）による陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行
った。濾過後の抽出液をDEAE-5PW（カラムサイズ：21.5
mml.D.X15cm東ソー製）に吸着させ重量/容量比１０％か
ら２５％の塩化ナトリウム濃度勾配をかけたリン酸緩衝
液（５０ｍＭ KH2PO4-Na2HPO4 、pH6.5）によりタンパ
ク質を溶出させた。流出速度は毎分５ｍＬで行い、１０
ｍＬづつ分取した。各ピークに含まれる酵素活性を測定
した結果、およそ２２％の塩化ナトリウム濃度で溶出さ
れるピークに目的とするグルコース脱水素酵素が含まれ
ていた。このピークに相当する溶出画分２０μＬを公知
のレムリー（Laemmli）法によるゲル濃度１２．５％のS
DS-ポリアクリルアミド電気泳動で解析したところグル
コース脱水素酵素に相当する分子量31kDaのバンド（CBB
染色法及び銀染色法）以外の成分がほとんど含まれてい
ないことを確認した。この溶出画分60mＬを分画分子量
５万の限外ろ過メンブランフィルター（セントリコン
（商品名）、ミリポア製）により１０mＬに濃縮し（5mg
/mＬ）、500mＬのリン酸緩衝液（５０mM KH2PO4-Na2HPO
4 、pH６．５）に希釈したもの（100μg/mＬ）を精製グ
ルコース脱水素酵素、即ちグルコース脱水素酵素Ｍｂｉ
Ｆ２０、とした。当該グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２
０の比活性は１７４ｕ／ｍｇであった（表１）。比較対
照として、特開平２−８６７７９号の実施例１に従い製
造し、上記グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０の精製と
同様にして精製した２種のグルコース脱水素酵素、即ち
グルコース脱水素酵素Ｅ９６Ａ（配列番号１５）および
グルコース脱水素酵素Ｅ９６Ｇ（配列番号１６）の比活
性も表１に併せて示した。
【００６０】従来のグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌで
は高濃度の塩化ナトリウム（例えば、２Ｍ）が存在する
場合に耐熱性を示しているが、本発明のグルコース脱水
素酵素ＭｂｉＦ２０は、その耐熱性が塩化ナトリウムの
存在の有無に影響されないという性質を有しているた
め、本発明のグルコース脱水素酵素の製造法には、１．
熱処理工程（熱処理により不純物および熱凝固を起こす
タンパク質を沈殿させる工程）において、塩化ナトリウ
ムを添加せずに熱処理を行うことができるという利点
と、２．従来のグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌについ
て必要であった熱処理工程に続く透析工程（脱塩工程）
を設ける必要がないという利点がある。係る利点を有す
る本発明のグルコース脱水素酵素の製造法によれば、本
発明のグルコース脱水素酵素の製造工程の効率化および
簡略化を図ることができる。
は高濃度の塩化ナトリウム（例えば、２Ｍ）が存在する
場合に耐熱性を示しているが、本発明のグルコース脱水
素酵素ＭｂｉＦ２０は、その耐熱性が塩化ナトリウムの
存在の有無に影響されないという性質を有しているた
め、本発明のグルコース脱水素酵素の製造法には、１．
熱処理工程（熱処理により不純物および熱凝固を起こす
タンパク質を沈殿させる工程）において、塩化ナトリウ
ムを添加せずに熱処理を行うことができるという利点
と、２．従来のグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌについ
て必要であった熱処理工程に続く透析工程（脱塩工程）
を設ける必要がないという利点がある。係る利点を有す
る本発明のグルコース脱水素酵素の製造法によれば、本
発明のグルコース脱水素酵素の製造工程の効率化および
簡略化を図ることができる。
【００６１】
【表１】
【００６２】ＭｂｉＦ２０：グルコース脱水素酵素Ｍｂ
ｉＦ２０（以下、表２〜表４において同じ。）、 Ｑ２５２Ｌ：グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌ（以下、
表２〜表４において同じ。）、 Ｅ９６Ａ：グルコース脱水素酵素Ｅ９６Ａ、 Ｅ９６Ｇ：グルコース脱水素酵素Ｅ９６Ｇ。
ｉＦ２０（以下、表２〜表４において同じ。）、 Ｑ２５２Ｌ：グルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌ（以下、
表２〜表４において同じ。）、 Ｅ９６Ａ：グルコース脱水素酵素Ｅ９６Ａ、 Ｅ９６Ｇ：グルコース脱水素酵素Ｅ９６Ｇ。
【００６３】表１から明らかなように、本発明のグルコ
ース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０は、従来のグルコース脱水
素酵素Ｑ２５２Ｌとはほぼ同等の比活性であったが、グ
ルコース脱水素酵素Ｅ９６Ａおよびグルコース脱水素酵
素Ｅ９６Ｇに対しては約２倍の比活性を示している。比
活性の増大により触媒活性が増大し、その結果グルコー
スの測定の迅速化を期待することができる。
ース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０は、従来のグルコース脱水
素酵素Ｑ２５２Ｌとはほぼ同等の比活性であったが、グ
ルコース脱水素酵素Ｅ９６Ａおよびグルコース脱水素酵
素Ｅ９６Ｇに対しては約２倍の比活性を示している。比
活性の増大により触媒活性が増大し、その結果グルコー
スの測定の迅速化を期待することができる。
【００６４】［実施例１１］グルコース脱水素酵素Ｍｂ
ｉＦ２０およびＱ２５２Ｌの各熱処理温度における安定
性 実施例１０記載の精製グルコース脱水素酵（100μg/m
Ｌ）１．０ｍＬを１．５ｍＬ容サンプリングチューブに
入れ４０，５０，６０，６６，７０℃で２０分間熱処理
した。５０mM KH2PO4-Na2HPO4 (pH６．５)、０．１Ｍ D
(+)グルコース、２mＭ NAD+の反応液３ｍＬに熱処理後
の精製酵素溶液（５μｇ／ｍLに希釈）５０μＬを加え
ることで反応を開始させ、NADHの吸収極大である３４０
ｎｍの吸光度を経時的に測定した。熱安定性は、一分間
当たりのNADHの生成量から酵素活性を求め、熱処理前の
耐熱性変異体グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０の活性
値を１００％とし、各処理温度について熱処理後の相対
活性（％）を算出し表２に示した。なお、対照としてグ
ルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌを用いた。
ｉＦ２０およびＱ２５２Ｌの各熱処理温度における安定
性 実施例１０記載の精製グルコース脱水素酵（100μg/m
Ｌ）１．０ｍＬを１．５ｍＬ容サンプリングチューブに
入れ４０，５０，６０，６６，７０℃で２０分間熱処理
した。５０mM KH2PO4-Na2HPO4 (pH６．５)、０．１Ｍ D
(+)グルコース、２mＭ NAD+の反応液３ｍＬに熱処理後
の精製酵素溶液（５μｇ／ｍLに希釈）５０μＬを加え
ることで反応を開始させ、NADHの吸収極大である３４０
ｎｍの吸光度を経時的に測定した。熱安定性は、一分間
当たりのNADHの生成量から酵素活性を求め、熱処理前の
耐熱性変異体グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０の活性
値を１００％とし、各処理温度について熱処理後の相対
活性（％）を算出し表２に示した。なお、対照としてグ
ルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌを用いた。
【００６５】
【表２】
【００６６】表２から明らかなように、従来最も良い耐
熱性を示す変異体であるグルコース脱水素酵素Ｑ２５２
Ｌが、溶液中にＮａＣｌが存在しない場合６０℃、２０
分間の処理で完全に酵素活性を失ってしまうのに対し、
本発明のグルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０は同様な処
理でも全く酵素活性を失わない。即ち、従来のグルコー
ス脱水素酵素は塩化ナトリウム濃度が高い場合に安定性
が認められるが、本発明のグルコース脱水素酵素は、塩
化ナトリウムの存在の有無に影響を受けない耐熱性を有
することが明らかである。従って、本発明のグルコース
脱水素酵素を用いれば、塩化ナトリウム濃度が低い生体
試料の測定において、測定時もしくは事前に当該塩化ナ
トリウムを添加する必要がないこと、および塩化ナトリ
ウム濃度が低い生体試料をそのまま測定できることか
ら、測定データの信頼性、併せて費用の低減をはかるこ
とができる。
熱性を示す変異体であるグルコース脱水素酵素Ｑ２５２
Ｌが、溶液中にＮａＣｌが存在しない場合６０℃、２０
分間の処理で完全に酵素活性を失ってしまうのに対し、
本発明のグルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０は同様な処
理でも全く酵素活性を失わない。即ち、従来のグルコー
ス脱水素酵素は塩化ナトリウム濃度が高い場合に安定性
が認められるが、本発明のグルコース脱水素酵素は、塩
化ナトリウムの存在の有無に影響を受けない耐熱性を有
することが明らかである。従って、本発明のグルコース
脱水素酵素を用いれば、塩化ナトリウム濃度が低い生体
試料の測定において、測定時もしくは事前に当該塩化ナ
トリウムを添加する必要がないこと、および塩化ナトリ
ウム濃度が低い生体試料をそのまま測定できることか
ら、測定データの信頼性、併せて費用の低減をはかるこ
とができる。
【００６７】［実施例１２］耐熱性変異体グルコース脱
水素酵素ＭｂｉＦ２０およびＱ２５２Ｌの各熱処理時間
における熱安定性 実施例１０記載の精製グルコース脱水素酵（100μg/m
Ｌ）１．０ｍＬを１．５ｍＬ容サンプリングチューブに
入れ６６℃で０〜８時間熱処理した。５０ mM KH2PO4-N
a2HPO4 (ｐＨ６．５)、０．１M D(+)グルコース、２ｍM
NAD+より成る、３mＬの反応液に１００μｇ／ｍＬの熱
処理後の精製酵素溶液（５μｇ／ｍＬに希釈）５０μＬ
を加えることで反応を開始させ、ＮＡＤＨの吸収極大で
ある３４０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。熱安定性
は、一分間当たりのＮＡＤＨの生成量から酵素活性を求
め、熱処理前の変異体グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２
０の活性値を１００％とし、各熱処理時間について熱処
理後の相対活性（％）を算出し表３に示した。なお、対
照としてグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌを用いた。
水素酵素ＭｂｉＦ２０およびＱ２５２Ｌの各熱処理時間
における熱安定性 実施例１０記載の精製グルコース脱水素酵（100μg/m
Ｌ）１．０ｍＬを１．５ｍＬ容サンプリングチューブに
入れ６６℃で０〜８時間熱処理した。５０ mM KH2PO4-N
a2HPO4 (ｐＨ６．５)、０．１M D(+)グルコース、２ｍM
NAD+より成る、３mＬの反応液に１００μｇ／ｍＬの熱
処理後の精製酵素溶液（５μｇ／ｍＬに希釈）５０μＬ
を加えることで反応を開始させ、ＮＡＤＨの吸収極大で
ある３４０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。熱安定性
は、一分間当たりのＮＡＤＨの生成量から酵素活性を求
め、熱処理前の変異体グルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２
０の活性値を１００％とし、各熱処理時間について熱処
理後の相対活性（％）を算出し表３に示した。なお、対
照としてグルコース脱水素酵素Ｑ２５２Ｌを用いた。
【００６８】
【表３】
【００６９】表３から明らかなように、グルコース脱水
素酵素Ｑ２５２Ｌは６６℃、１時間の加熱処理で酵素活
性が完全に失われるのに対して、本発明のグルコース脱
水素酵素であるグルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０は６
６℃、８時間の加熱処理でも約６０％の相対活性を保持
している。即ち、本発明のグルコース脱水素酵素は、従
来のグルコース脱水素酵素に比べ、塩化ナトリウムの存
在の有無に拘わらず、極めて高い耐熱性を有する。従っ
て、本発明のグルコース脱水素酵素を用いれば、高い温
度でのグルコースの測定が可能となるため、当該測定を
迅速化できるという利点がある。
素酵素Ｑ２５２Ｌは６６℃、１時間の加熱処理で酵素活
性が完全に失われるのに対して、本発明のグルコース脱
水素酵素であるグルコース脱水素酵素ＭｂｉＦ２０は６
６℃、８時間の加熱処理でも約６０％の相対活性を保持
している。即ち、本発明のグルコース脱水素酵素は、従
来のグルコース脱水素酵素に比べ、塩化ナトリウムの存
在の有無に拘わらず、極めて高い耐熱性を有する。従っ
て、本発明のグルコース脱水素酵素を用いれば、高い温
度でのグルコースの測定が可能となるため、当該測定を
迅速化できるという利点がある。
【００７０】［実施例１３］耐熱性変異体グルコース脱
水素酵素ＭｂｉＦ２０の各ｐＨ処理における安定性 実施例１０記載の精製グルコース脱水素酵（100μg/m
Ｌ）を50 mM酢酸緩衝液（pH4〜5.5）、50 mMリン酸緩衝
液 （pH6〜7.5）、50 mM トリス塩酸緩衝液（pH8〜8.
5） 50 mM グリシン水酸化ナトリウム緩衝液 （pH9〜1
0.5） で５μg/mＬに希釈する。それぞれの希釈酵素液
を30℃で2０分間処理した。各pH処理後、各処理pHにつ
いて、下記NADH測定条件下でのグルコース脱水素酵素の
活性を測定し、最も高い値を100%とした相対活性(%)を
算出し、表４に示した。なお、対照としてグルコース脱
水素酵素Ｑ２５２Ｌを用いた。
水素酵素ＭｂｉＦ２０の各ｐＨ処理における安定性 実施例１０記載の精製グルコース脱水素酵（100μg/m
Ｌ）を50 mM酢酸緩衝液（pH4〜5.5）、50 mMリン酸緩衝
液 （pH6〜7.5）、50 mM トリス塩酸緩衝液（pH8〜8.
5） 50 mM グリシン水酸化ナトリウム緩衝液 （pH9〜1
0.5） で５μg/mＬに希釈する。それぞれの希釈酵素液
を30℃で2０分間処理した。各pH処理後、各処理pHにつ
いて、下記NADH測定条件下でのグルコース脱水素酵素の
活性を測定し、最も高い値を100%とした相対活性(%)を
算出し、表４に示した。なお、対照としてグルコース脱
水素酵素Ｑ２５２Ｌを用いた。
【００７１】NADH測定条件: ３ｍＬの反応液(５０ mM T
ris-HCl ｐＨ８．０、０．１M D(+)グルコース、２ｍM
NAD+)に各ｐＨ処理後の精製酵素溶液５０μＬを加える
ことで反応を開始させ、ＮＡＤＨの吸収極大である３４
０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。NADHの生成量は３
４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの分子吸光係数（１ｍＭあた
り６．２２）をもとに計算した。２５℃における１分間
あたり１μｍｏｌのＮＡＤＨ生成量を1単位（１Ｕ）の
酵素活性とした。
ris-HCl ｐＨ８．０、０．１M D(+)グルコース、２ｍM
NAD+)に各ｐＨ処理後の精製酵素溶液５０μＬを加える
ことで反応を開始させ、ＮＡＤＨの吸収極大である３４
０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。NADHの生成量は３
４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの分子吸光係数（１ｍＭあた
り６．２２）をもとに計算した。２５℃における１分間
あたり１μｍｏｌのＮＡＤＨ生成量を1単位（１Ｕ）の
酵素活性とした。
【００７２】
【表４】
【００７３】表４から明らかなように、グルコース脱水
素酵素Ｑ２５２Ｌは溶液のｐＨが９以上のアルカリ領域
では酵素活性を著しく失う（即ち、アルカリ変性を生ず
る）が、本発明のグルコース脱水素酵素であるグルコー
ス脱水素酵素ＭｂｉＦ２０はｐH８．０以上のアルカリ
領域で酵素活性を失わず、ｐH1０．５においてさえもほ
とんど酵素活性を失わないという高いアルカリ耐性も併
せ持っている。即ち、本発明のグルコース脱水素酵素
は、耐アルカリ性を有する。従って、本発明のグルコー
ス脱水素酵素を用いれば、ｐH８．５以上のアルカリ領
域でのグルコース測定で高い精度を期待することができ
る。
素酵素Ｑ２５２Ｌは溶液のｐＨが９以上のアルカリ領域
では酵素活性を著しく失う（即ち、アルカリ変性を生ず
る）が、本発明のグルコース脱水素酵素であるグルコー
ス脱水素酵素ＭｂｉＦ２０はｐH８．０以上のアルカリ
領域で酵素活性を失わず、ｐH1０．５においてさえもほ
とんど酵素活性を失わないという高いアルカリ耐性も併
せ持っている。即ち、本発明のグルコース脱水素酵素
は、耐アルカリ性を有する。従って、本発明のグルコー
ス脱水素酵素を用いれば、ｐH８．５以上のアルカリ領
域でのグルコース測定で高い精度を期待することができ
る。
【００７４】
【発明の効果】本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物
に由来するグルコース脱水素酵素遺伝子を改変したグル
コース脱水素酵素遺伝子を提供する。本発明の遺伝子か
ら作られるグルコース脱水素酵素は、従来のグルコース
脱水素酵素に比し、塩化ナトリウム等の無機塩の非存在
下での耐熱性を有する点、当該耐熱性に加えて更に耐ア
ルカリ性および／または改善された比活性をも保有し得
る点で優れた性質を有している。特に、塩化ナトリウム
等の無機塩の存在の有無に影響されない耐熱性は、従来
のグルコース脱水素酵素には全く認められない顕著な特
性である。
に由来するグルコース脱水素酵素遺伝子を改変したグル
コース脱水素酵素遺伝子を提供する。本発明の遺伝子か
ら作られるグルコース脱水素酵素は、従来のグルコース
脱水素酵素に比し、塩化ナトリウム等の無機塩の非存在
下での耐熱性を有する点、当該耐熱性に加えて更に耐ア
ルカリ性および／または改善された比活性をも保有し得
る点で優れた性質を有している。特に、塩化ナトリウム
等の無機塩の存在の有無に影響されない耐熱性は、従来
のグルコース脱水素酵素には全く認められない顕著な特
性である。
【００７５】かかる性質を有する本発明のグルコース脱
水素酵素を用いることにより血液、尿その他体液および
各種の生体試料抽出物のような塩濃度が低く、且つ比較
的ｐＨ変動が大きい溶液中で反応を行う場合に幅広い温
度で迅速且つ安定したブドウ糖濃度の測定が可能とな
る。即ち、本発明のグルコース脱水素酵素は、安定性に
優れた糖尿病の診断試薬として有用であり、血糖値測
定、糖尿病診断薬および各種センサー等に利用すること
ができる。
水素酵素を用いることにより血液、尿その他体液および
各種の生体試料抽出物のような塩濃度が低く、且つ比較
的ｐＨ変動が大きい溶液中で反応を行う場合に幅広い温
度で迅速且つ安定したブドウ糖濃度の測定が可能とな
る。即ち、本発明のグルコース脱水素酵素は、安定性に
優れた糖尿病の診断試薬として有用であり、血糖値測
定、糖尿病診断薬および各種センサー等に利用すること
ができる。
【００７６】本発明のグルコース脱水素酵素は、塩化ナ
トリウムの存在の有無に影響されない耐熱性を有してい
るため、本発明のグルコース脱水素酵素の製造法によれ
ば、従来必要とされた熱処理工程での塩化ナトリウムを
添加および脱塩工程が不要となり、製造工程の効率化お
よび簡略化を図ることができる。
トリウムの存在の有無に影響されない耐熱性を有してい
るため、本発明のグルコース脱水素酵素の製造法によれ
ば、従来必要とされた熱処理工程での塩化ナトリウムを
添加および脱塩工程が不要となり、製造工程の効率化お
よび簡略化を図ることができる。
【００７７】以下、次の事項を開示する。
（２１）配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の
１４５番目のセリン、１５８番目のチロシンおよび１６
２番目のリジンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当
該３個のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃至数個が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース
脱水素酵素であって、無機塩の非存在下での耐熱性を有
するグルコース脱水素酵素。 （２２）無機塩が塩化ナトリウムである（２１）に記載
のグルコース脱水素酵素。 （２３）（２１）に記載の無機塩の非存在下での耐熱性
が、未熱処理(熱処理時間：０時間)のグルコース脱水素
酵素の溶液（１００μｇ／ｍＬ）および当該グルコース
脱水素酵素を６６℃にて１時間熱処理したものの溶液を
５μｇ／ｍＬに希釈した液５０μＬを、それぞれ５０ m
M KH2PO4-Na2HPO4 (ｐＨ６．５)、０．１M D(+)グルコ
ースおよび２ｍM NAD+からなる反応液３mＬ中に加えた
後、ＮＡＤＨの吸収極大である３４０ｎｍの吸光度を経
時的に測定した際、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量か
ら酵素活性を算出し、未熱処理のグルコース脱水素酵素
の活性値を１００％とした場合における１時間熱処理し
たグルコース脱水素酵素の相対活性（％）を算出し、当
該相対活性が１０％以上の耐熱性である（２１）に 記載のグルコース脱水素酵素。（２４）（２３）に記載
の相対活性が５０％以上である（２３）記載のグルコー
ス脱水素酵素。 （２５）グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を更に有
する（２１）乃至（２４）のいずれかに記載のグルコー
ス脱水素酵素。 （２６）（２５）に記載の耐アルカリ性が、５０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）中ではｐＨ４．０、
４．５、５．０および５．５で、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０〜７．５）中ではｐＨ６．０、６．５、
７．０および７．５、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０〜８．５）中ではｐＨ８．０および８．５並び
にグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１
０．５）中ではｐＨ９．０、９．５、１０および１０．
５で３０℃、２０分間処理して得た各グルコース脱水素
酵素の溶液（5μｇ／ｍＬ）５０μＬを それぞれ５０ m
M トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１M D(+)グ
ルコースおよび２ｍM NAD+ からなる反応液３mＬ中に
加えた後、ＮＡＤＨの吸収極大である３４０ｎｍの吸光
度を経時的に測定した際、１分間当たりのＮＡＤＨの生
成量から酵素活性を算出し、最も高い活性値を１００％
として相対活性（％）を算出した場合において、ｐＨ
９．５で処理したグルコース脱水素酵素の相対活性
（％）が５０％以上の耐アルカリ性である（２５）記載
のグルコース脱水素酵素。
１４５番目のセリン、１５８番目のチロシンおよび１６
２番目のリジンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当
該３個のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃至数個が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース
脱水素酵素であって、無機塩の非存在下での耐熱性を有
するグルコース脱水素酵素。 （２２）無機塩が塩化ナトリウムである（２１）に記載
のグルコース脱水素酵素。 （２３）（２１）に記載の無機塩の非存在下での耐熱性
が、未熱処理(熱処理時間：０時間)のグルコース脱水素
酵素の溶液（１００μｇ／ｍＬ）および当該グルコース
脱水素酵素を６６℃にて１時間熱処理したものの溶液を
５μｇ／ｍＬに希釈した液５０μＬを、それぞれ５０ m
M KH2PO4-Na2HPO4 (ｐＨ６．５)、０．１M D(+)グルコ
ースおよび２ｍM NAD+からなる反応液３mＬ中に加えた
後、ＮＡＤＨの吸収極大である３４０ｎｍの吸光度を経
時的に測定した際、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量か
ら酵素活性を算出し、未熱処理のグルコース脱水素酵素
の活性値を１００％とした場合における１時間熱処理し
たグルコース脱水素酵素の相対活性（％）を算出し、当
該相対活性が１０％以上の耐熱性である（２１）に 記載のグルコース脱水素酵素。（２４）（２３）に記載
の相対活性が５０％以上である（２３）記載のグルコー
ス脱水素酵素。 （２５）グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を更に有
する（２１）乃至（２４）のいずれかに記載のグルコー
ス脱水素酵素。 （２６）（２５）に記載の耐アルカリ性が、５０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）中ではｐＨ４．０、
４．５、５．０および５．５で、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０〜７．５）中ではｐＨ６．０、６．５、
７．０および７．５、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０〜８．５）中ではｐＨ８．０および８．５並び
にグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１
０．５）中ではｐＨ９．０、９．５、１０および１０．
５で３０℃、２０分間処理して得た各グルコース脱水素
酵素の溶液（5μｇ／ｍＬ）５０μＬを それぞれ５０ m
M トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１M D(+)グ
ルコースおよび２ｍM NAD+ からなる反応液３mＬ中に
加えた後、ＮＡＤＨの吸収極大である３４０ｎｍの吸光
度を経時的に測定した際、１分間当たりのＮＡＤＨの生
成量から酵素活性を算出し、最も高い活性値を１００％
として相対活性（％）を算出した場合において、ｐＨ
９．５で処理したグルコース脱水素酵素の相対活性
（％）が５０％以上の耐アルカリ性である（２５）記載
のグルコース脱水素酵素。
【００７８】（２７）（２６）に記載の相対活性が８０
％以上である（２６）記載のグルコース脱水素酵素。 （２８）グルコース脱水素酵素が改善された比活性を更
に有する（２１）乃至（２７）のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素。 （２９）（２８）に記載の改善された比活性が１５０ｕ
／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇの比活性である（２８）記載の
グルコース脱水素酵素。 （３０）配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の
１４５番目のセリン、１５８番目のチロシン、１６２番
目および１７０番目のリジンならびに２５２番目のロイ
シンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当該５個のア
ミノ酸以外のアミノ酸の１乃至数個が欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素
であって、無機塩の非存在下での耐熱性を有するグルコ
ース脱水素酵素。 （３１）無機塩が塩化ナトリウムである（３０）に記載
のグルコース脱水素酵素。 （３２）（３０）に記載の無機塩の非存在下での耐熱性
が、未熱処理(熱処理時間：０時間)のグルコース脱水素
酵素の溶液（１００μｇ／ｍＬ）および当該グルコース
脱水素酵素を６６℃にて１時間熱処理したものの溶液を
５μｇ／ｍＬに希釈した液５０μＬを、それぞれ５０ m
M KH2PO4-Na2HPO4 (ｐＨ６．５)、０．１M D(+)グルコ
ースおよび２ｍM NAD+からなる反応液３mＬ中に加えた
後、ＮＡＤＨの吸収極大である３４０ｎｍの吸光度を経
時的に測定した際、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量か
ら酵素活性を算出し、未熱処理のグルコース脱水素酵素
の活性値を１００％とした場合における１時間熱処理し
たグルコース脱水素酵素の残存活性の相対百分率（％）
を算出し、当該残存活性が１０％以上の耐熱性である
（３０）に記載のグルコース脱水素酵素。 （３３）（３２）に記載の残存活性が５０％以上である
（３２）記載のグルコース脱水素酵素。 （３４）グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を更に有
する（３０）乃至（３３）のいずれかに記載のグルコー
ス脱水素酵素。 （３５）（３４）に記載の耐アルカリ性が、５０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）中ではｐＨ４．０、
４．５、５．０および５．５で、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０〜７．５）中ではｐＨ６．０、６．５、
７．０および７．５、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０〜８．５）中ではｐＨ８．０および８．５並び
にグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１
０．５）中ではｐＨ９．０、９．５、１０および１０．
５で３０℃、２０分間処理して得た各グルコース脱水素
酵素の溶液（5μｇ／ｍＬ）５０μＬを それぞれ５０ m
M Tris-HCl（ｐＨ８．０）、０．１M D(+)グルコースお
よび２ｍM NAD+ からなる反応液３mＬ中に加えた後、
ＮＡＤＨの吸収極大である３４０ｎｍの吸光度を経時的
に測定した際、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量から酵
素活性を算出し、最も高い活性値を１００％として相対
活性（％）を算出した場合において、ｐＨ９．５で処理
したグルコース脱水素酵素の相対活性（％）が５０％以
上の耐アルカリ性である（３４）記載のグルコース脱水
素酵素。
％以上である（２６）記載のグルコース脱水素酵素。 （２８）グルコース脱水素酵素が改善された比活性を更
に有する（２１）乃至（２７）のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素。 （２９）（２８）に記載の改善された比活性が１５０ｕ
／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇの比活性である（２８）記載の
グルコース脱水素酵素。 （３０）配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の
１４５番目のセリン、１５８番目のチロシン、１６２番
目および１７０番目のリジンならびに２５２番目のロイ
シンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当該５個のア
ミノ酸以外のアミノ酸の１乃至数個が欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱水素酵素
であって、無機塩の非存在下での耐熱性を有するグルコ
ース脱水素酵素。 （３１）無機塩が塩化ナトリウムである（３０）に記載
のグルコース脱水素酵素。 （３２）（３０）に記載の無機塩の非存在下での耐熱性
が、未熱処理(熱処理時間：０時間)のグルコース脱水素
酵素の溶液（１００μｇ／ｍＬ）および当該グルコース
脱水素酵素を６６℃にて１時間熱処理したものの溶液を
５μｇ／ｍＬに希釈した液５０μＬを、それぞれ５０ m
M KH2PO4-Na2HPO4 (ｐＨ６．５)、０．１M D(+)グルコ
ースおよび２ｍM NAD+からなる反応液３mＬ中に加えた
後、ＮＡＤＨの吸収極大である３４０ｎｍの吸光度を経
時的に測定した際、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量か
ら酵素活性を算出し、未熱処理のグルコース脱水素酵素
の活性値を１００％とした場合における１時間熱処理し
たグルコース脱水素酵素の残存活性の相対百分率（％）
を算出し、当該残存活性が１０％以上の耐熱性である
（３０）に記載のグルコース脱水素酵素。 （３３）（３２）に記載の残存活性が５０％以上である
（３２）記載のグルコース脱水素酵素。 （３４）グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を更に有
する（３０）乃至（３３）のいずれかに記載のグルコー
ス脱水素酵素。 （３５）（３４）に記載の耐アルカリ性が、５０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）中ではｐＨ４．０、
４．５、５．０および５．５で、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０〜７．５）中ではｐＨ６．０、６．５、
７．０および７．５、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０〜８．５）中ではｐＨ８．０および８．５並び
にグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１
０．５）中ではｐＨ９．０、９．５、１０および１０．
５で３０℃、２０分間処理して得た各グルコース脱水素
酵素の溶液（5μｇ／ｍＬ）５０μＬを それぞれ５０ m
M Tris-HCl（ｐＨ８．０）、０．１M D(+)グルコースお
よび２ｍM NAD+ からなる反応液３mＬ中に加えた後、
ＮＡＤＨの吸収極大である３４０ｎｍの吸光度を経時的
に測定した際、１分間当たりのＮＡＤＨの生成量から酵
素活性を算出し、最も高い活性値を１００％として相対
活性（％）を算出した場合において、ｐＨ９．５で処理
したグルコース脱水素酵素の相対活性（％）が５０％以
上の耐アルカリ性である（３４）記載のグルコース脱水
素酵素。
【００７９】（３６）（３５）に記載の相対活性が８０
％以上である（３５）記載のグルコース脱水素酵素。 （３７）グルコース脱水素酵素が改善された比活性を更
に有する（３０）乃至（３６）のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素。 （３８）（３７）に記載の改善された比活性が１５０ｕ
／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇの比活性である（３７）記載の
グルコース脱水素酵素。 （３９）（２１）乃至（３８）のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素をコードする遺伝子。 （４０）（３９）に記載の遺伝子を含む組換えベクタ
ー。 （４１）（４０）に記載の組換えベクターを含む形質転
換体。 （４２）（４１）に記載の形質転換体を培養し、得られ
る培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特
徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。 （４３）（２１）乃至（３８）のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
％以上である（３５）記載のグルコース脱水素酵素。 （３７）グルコース脱水素酵素が改善された比活性を更
に有する（３０）乃至（３６）のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素。 （３８）（３７）に記載の改善された比活性が１５０ｕ
／ｍｇ〜１９０ｕ／ｍｇの比活性である（３７）記載の
グルコース脱水素酵素。 （３９）（２１）乃至（３８）のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素をコードする遺伝子。 （４０）（３９）に記載の遺伝子を含む組換えベクタ
ー。 （４１）（４０）に記載の組換えベクターを含む形質転
換体。 （４２）（４１）に記載の形質転換体を培養し、得られ
る培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特
徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。 （４３）（２１）乃至（３８）のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
【００８０】
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞ Ａｍａｎｏ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｃ． ＜１２０＞ Ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ａ ｃｏ
ｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒｅｏｆ ＜１３０＞ Ｐ０２−６５３ ＜１４０＞ ＜１４１＞ ＜１６０＞ １６ ＜１７０＞ ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｖｅｒ． ２．１ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ ７８６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｇｅｎ ＜４００＞ １ ａｔｇｔａｔａａａｇ ａｔｔｔａｇａａｇｇ ａａａａｇｔａｇｔｇ ｇｔｃ
ａｔａａｃａｇ ｇｔｔｃａｔｃｔａｃ ａｇｇｔｔｔｇｇｇａ ６０ ａａａｔｃａａｔｇｇ ｃｇａｔｔｃｇｔｔｔ ｔｇｃｇａｃａｇａａ ａａａ
ｇｃｃａａａｇ ｔａｇｔｔｇｔｇａａ ｃｔａｔｃｇｔｔｃｔ １２０ ａａｇｇａｇｇａｃｇ ａａｇｃｔａａｃａｇ ｃｇｔｔｔｔａｇａａ ｇａａ
ａｔｔａａａａ ａａｇｔｔｇｇｃｇｇ ａｇａａｇｃａａｔｔ １８０ ｇｃｔｇｔｃａａａｇ ｇｔｇａｔｇｔａａｃ ａｇｔｔｇａｇｔｃｔ ｇａｃ
ｇｔｔａｔｃａ ａｔｔｔａｇｔｔｃａ ａｔｃｔｇｃｔａｔｔ ２４０ ａａａｇａｇｔｔｔｇ ｇａａａｇｃｔａｇａ ｃｇｔｔａｔｇａｔｔ ａａｃ
ａａｃｇｃａｇ ｇｇｔｔａｇａａａａ ｔｃｃｇｇｔｔｔｃａ ３００ ｔｃｔｃａｔｇａａａ ｔｇｔｃｔｔｔａａｇ ｃｇａｔｔｇｇａａｔ ａａａ
ｇｔｃａｔｔｇ ａｔａｃｇａａｃｔｔ ａａｃｇｇｇａｇｃｔ ３６０ ｔｔｔｔｔａｇｇｃａ ｇｃｃｇｔｇａａｇｃ ｇａｔｔａａａｔａｔ ｔｔｔ
ｇｔｇｇａａａ ａｔｇａｔａｔｔａａ ｇｇｇａａｃａｇｔｔ ４２０ ａｔｔａａｃａｔｇｔ ｃｇａｇｔｇｔｔｃａ ｃｇａｇａａａａｔｔ ｃｃｔ
ｔｇｇｃｃａｔ ｔａｔｔｔｇｔｔｃａ ｔｔａｔｇｃａｇｃａ ４８０ ａｇｔａａａｇｇｃｇ ｇｔａｔｇａａｇｃｔ ｔａｔｇａｃｔｇａａ ａｃａ
ｃｔｇｇｃａｔ ｔａｇａａｔａｃｇｃ ｔｃｃａａａａｇｇｔ ５４０ ａｔｔｃｇｔｇｔａａ ａｔａａｃａｔｔｇｇ ａｃｃａｇｇａｇｃｇ ａｔｔ
ａａｔａｃａｃ ｃｇａｔｔａａｃｇｃ ｔｇａｇａａａｔｔｔ ６００ ｇｃｔｇａｔｃｃｔｇ ａｇｃａｇｃｇｔｇｃ ａｇａｔｇｔａｇａａ ａｇｃ
ａｔｇａｔｔｃ ｃａａｔｇｇｇａｔａ ｃａｔｃｇｇａｇａｇ ６６０ ｃｃｇｇａａｇａａａ ｔｔｇｃａｇｃａｇｔ ｔｇｃｔｇｃａｔｇｇ ｃｔａ
ｇｃｔｔｃｔｔ ｃａｇａｇｇｃｇａｇ ｔｔａｔｇｔａａｃａ ７２０ ｇｇａａｔｔａｃｇｃ ｔｃｔｔｔｇｃｔｇａ ｃｇｇｃｇｇｔａｔｇ ａｃａ
ｃｔｇｔａｃｃ ｃａｔｃａｔｔｃｃａ ａｇｃａｇｇａｃｇｃ ７８０ ｇｇａｔａａ
７８６ ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ ２６１ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｇｅｎ ＜４００＞ ２ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ５０ ５５
６０ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ８５
９０ ９５ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ １００ １０５
１１０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ １１５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ １３０ １３５
１４０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ １８０ １８５
１９０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ １９５ ２００
２０５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２１０ ２１５
２２０ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
２６０ ＜２１０＞ ３ ＜２１１＞ ７８６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ
ｓｈａｆｆｌｉｎｇ ＜４００＞ ３ ａｔｇｔａｔａａａｇ ａｔｔｔａｇａａｇｇ ａａａａｇｔａｇｔｇ ｇｔｃ
ａｔａａｃａｇ ｇｔｔｃａｔｃｔａｃ ａｇｇｔｔｔｇｇｇａ ６０ ａａａｔｃａａｔｇｇ ｃｇａｔｔｃｇｔｔｔ ｔｇｃｇａｃａｇａａ ａａａ
ｇｃｃａａａｇ ｔａｇｔｔｇｔｇａａ ｃｔａｔｃｇｔｔｃｔ １２０ ａａｇｇａｇｇａｃｇ ａａｇｃｔａａｃａｇ ｃｇｔｔｔｔａｇａａ ｇａａ
ａｔｔａａａａ ａａｇｔｔｇｇｃｇｇ ａｇａａｇｃａａｔｔ １８０ ｇｃｔｇｔｃａａａｇ ｇｔｇａｔｇｔａａｃ ａｇｔｔｇａｇｔｃｔ ｇａｃ
ｇｔｔａｔｃａ ａｔｔｔａｇｔｔｃａ ａｔｃｔｇｃｔａｔｔ ２４０ ａａａｇａｇｔｔｔｇ ｇａａａｇｃｔａｇａ ｃｇｔｔａｔｇａｔｔ ａａｃ
ａａｃｇｃａｇ ｇｇｔｔａｇａａａａ ｔｃｃｇｇｔｔｔｃａ ３００ ｔｃｔｃａｔｇａａａ ｔｇｔｃｔｔｔａａｇ ｃｇａｔｔｇｇａａｔ ａａａ
ｇｔｃａｔｔｇ ａｔａｃｇａａｃｔｔ ａａｃｇｇｇｃｇｃｃ ３６０ ｔｔｔｔｔａｇｇｃａ ｇｃｃｇｔｇａａｇｃ ｇａｔｔａａａｔａｔ ｔｔｔ
ｇｔｇｇａａａ ａｔｇａｔａｔｔａａ ｇｇｇａａｃａｇｔｔ ４２０ ａｔｔａａｃａｔｇｔ ｃｇａｇｔｇｔｔｃａ ｃｇａｇａａａａｔｔ ｃｃｔ
ｔｇｇｃｃａｔ ｔａｔｔｔｇｔｔｃａ ｔｔａｔｇｃａｇｃａ ４８０ ａｇｔａａａｇｇｃｇ ｇｔａｔｇａａｇｃｔ ａａｔｇａｃｔａａａ ａｃａ
ｃｔｇｇｃａｔ ｔａｇａａｔａｃｇｃ ｔｃｃａａａａｇｇｔ ５４０ ａｔｔｃｇｔｇｔａａ ａｔａａｃａｔｔｇｇ ａｃｃａｇｇａｇｃｇ ａｔｔ
ａａｔａｃａｃ ｃｇａｔｔａａｃｇｃ ｔｇａｇａａａｔｔｔ ６００ ｇｃｔｇａｔｃｃｔｇ ａｇｃａｇｃｇｔｇｃ ａｇａｔｇｔａｇａａ ａｇｃ
ａｔｇａｔｔｃ ｃａａｔｇｇｇａｔａ ｃａｔｃｇｇａｇａｇ ６６０ ｃｃｇｇａａｇａａａ ｔｔｇｃａｇｃａｇｔ ｔｇｃｔｇｃａｔｇｇ ｃｔａ
ｇｃｔｔｃｔｔ ｃａｇａｇｇｃｇａｇ ｔｔａｔｇｔａａｃａ ７２０ ｇｇａａｔｔａｃｇｃ ｔｃｔｔｔｇｃｔｇａ ｃｇｇｃｇｇｔａｔｇ ａｃａ
ｃｔｇｔａｃｃ ｃａｔｃａｔｔｃｃａ ａｇｃａｇｇａｃｇｃ ７８０ ｇｇａｔａａ
７８６ ＜２１０＞ ４ ＜２１１＞ ２６１ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ
ｓｈａｆｆｌｉｎｇ ＜４００＞ ４ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ５０ ５５
６０ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ８５
９０ ９５ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ １００ １０５
１１０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ １１５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ １３０ １３５
１４０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ １８０ １８５
１９０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ １９５ ２００
２０５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２１０ ２１５
２２０ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
２６０ ＜２１０＞ ５ ＜２１１＞ ４０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ ５ ｃａｔｇｃｃａｔｇｇ ｃａａｔｇｔａｔａａ ａｇａｔｔｔａｇａａ ｇｇａ
ａａａｇｔａｇ ４０ ＜２１０＞ ６ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒＰＣＲ ＜４００＞ ６ ｇｔｃｇａｃｇａｇｃ ｔｃｔｔａｔｃｃｇｃ ｇｔｃｃｔｇｃｔｔｇ
３０ ＜２１０＞ ７ ＜２１１＞ ３２ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ ７ ｃａｔｇｃｃａｔｇｇ ｃａａｔｇｔａｔｃｃ ａａｇｔｔｔａｇａｇ ｇｇ
３２ ＜２１０＞ ８ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ ８ ｇｔｃｇａｃｇａｇｃ ｔｃｔｃａｃｃｃｔｔ ｔｔｃｃｃｇｃｔｔｇ
３０ ＜２１０＞ ９ ＜２１１＞ ３７ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ ９ ｃａｔｇｃｃａｔｇｇ ｃａａｔｇｔａｔａｃ ａｇａｔｔｔａａａａ ｇａｔ
ａａａｇ ３７ ＜２１０＞ １０ ＜２１１＞ ３１ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １０ ｇｔｃｇａｃｇａｇｃ ｔｃｔｔａｇｃｃｔｃ ｔｔｃｃｔｇｃｔｔｇ ｇ
３１ ＜２１０＞ １１ ＜２１１＞ ３２ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １１ ｃａｔｇｃｃａｔｇｇ ｃａａｔｇｔａｔｃｃ ｇｇａｔｔｔａａａａ ｇｇ
３２ ＜２１０＞ １２ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １２ ｇｔｃｇａｃｇａｇｃ ｔｃｔｔａａｃｃｇｃ ｇｔｃｃｔｇｃｃｔｇ
３０ ＜２１０＞ １３ ＜２１１＞ １７ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １３ ｔｇｔｇｇａａｔｔｇ ｔｇａｇｃｇｇ
１７ ＜２１０＞ １４ ＜２１１＞ ２３ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １４ ｔｔｃｔｇａｔｔｔａ ａｔｃｔｇｔａｔｃａ ｇｇｃ
２３ ＜２１０＞ １５ ＜２１１＞ ２６１ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｇｅｎ ＜４００＞ １５ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ５０ ５５
６０ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ ８５
９０ ９５ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ １００ １０５
１１０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ １１５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ １３０ １３５
１４０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ １８０ １８５
１９０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ １９５ ２００
２０５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２１０ ２１５
２２０ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
２６０ ＜２１０＞ １６ ＜２１１＞ ２６１ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｇｅｎ ＜３００＞ ＜４００＞ １６ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ５０ ５５
６０ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ８５
９０ ９５ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ １００ １０５
１１０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ １１５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ １３０ １３５
１４０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ １８０ １８５
１９０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ １９５ ２００
２０５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２１０ ２１５
２２０ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
２６０
＜１１０＞ Ａｍａｎｏ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｃ． ＜１２０＞ Ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ａ ｃｏ
ｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒｅｏｆ ＜１３０＞ Ｐ０２−６５３ ＜１４０＞ ＜１４１＞ ＜１６０＞ １６ ＜１７０＞ ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｖｅｒ． ２．１ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ ７８６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｇｅｎ ＜４００＞ １ ａｔｇｔａｔａａａｇ ａｔｔｔａｇａａｇｇ ａａａａｇｔａｇｔｇ ｇｔｃ
ａｔａａｃａｇ ｇｔｔｃａｔｃｔａｃ ａｇｇｔｔｔｇｇｇａ ６０ ａａａｔｃａａｔｇｇ ｃｇａｔｔｃｇｔｔｔ ｔｇｃｇａｃａｇａａ ａａａ
ｇｃｃａａａｇ ｔａｇｔｔｇｔｇａａ ｃｔａｔｃｇｔｔｃｔ １２０ ａａｇｇａｇｇａｃｇ ａａｇｃｔａａｃａｇ ｃｇｔｔｔｔａｇａａ ｇａａ
ａｔｔａａａａ ａａｇｔｔｇｇｃｇｇ ａｇａａｇｃａａｔｔ １８０ ｇｃｔｇｔｃａａａｇ ｇｔｇａｔｇｔａａｃ ａｇｔｔｇａｇｔｃｔ ｇａｃ
ｇｔｔａｔｃａ ａｔｔｔａｇｔｔｃａ ａｔｃｔｇｃｔａｔｔ ２４０ ａａａｇａｇｔｔｔｇ ｇａａａｇｃｔａｇａ ｃｇｔｔａｔｇａｔｔ ａａｃ
ａａｃｇｃａｇ ｇｇｔｔａｇａａａａ ｔｃｃｇｇｔｔｔｃａ ３００ ｔｃｔｃａｔｇａａａ ｔｇｔｃｔｔｔａａｇ ｃｇａｔｔｇｇａａｔ ａａａ
ｇｔｃａｔｔｇ ａｔａｃｇａａｃｔｔ ａａｃｇｇｇａｇｃｔ ３６０ ｔｔｔｔｔａｇｇｃａ ｇｃｃｇｔｇａａｇｃ ｇａｔｔａａａｔａｔ ｔｔｔ
ｇｔｇｇａａａ ａｔｇａｔａｔｔａａ ｇｇｇａａｃａｇｔｔ ４２０ ａｔｔａａｃａｔｇｔ ｃｇａｇｔｇｔｔｃａ ｃｇａｇａａａａｔｔ ｃｃｔ
ｔｇｇｃｃａｔ ｔａｔｔｔｇｔｔｃａ ｔｔａｔｇｃａｇｃａ ４８０ ａｇｔａａａｇｇｃｇ ｇｔａｔｇａａｇｃｔ ｔａｔｇａｃｔｇａａ ａｃａ
ｃｔｇｇｃａｔ ｔａｇａａｔａｃｇｃ ｔｃｃａａａａｇｇｔ ５４０ ａｔｔｃｇｔｇｔａａ ａｔａａｃａｔｔｇｇ ａｃｃａｇｇａｇｃｇ ａｔｔ
ａａｔａｃａｃ ｃｇａｔｔａａｃｇｃ ｔｇａｇａａａｔｔｔ ６００ ｇｃｔｇａｔｃｃｔｇ ａｇｃａｇｃｇｔｇｃ ａｇａｔｇｔａｇａａ ａｇｃ
ａｔｇａｔｔｃ ｃａａｔｇｇｇａｔａ ｃａｔｃｇｇａｇａｇ ６６０ ｃｃｇｇａａｇａａａ ｔｔｇｃａｇｃａｇｔ ｔｇｃｔｇｃａｔｇｇ ｃｔａ
ｇｃｔｔｃｔｔ ｃａｇａｇｇｃｇａｇ ｔｔａｔｇｔａａｃａ ７２０ ｇｇａａｔｔａｃｇｃ ｔｃｔｔｔｇｃｔｇａ ｃｇｇｃｇｇｔａｔｇ ａｃａ
ｃｔｇｔａｃｃ ｃａｔｃａｔｔｃｃａ ａｇｃａｇｇａｃｇｃ ７８０ ｇｇａｔａａ
７８６ ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ ２６１ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｇｅｎ ＜４００＞ ２ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ５０ ５５
６０ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ８５
９０ ９５ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ １００ １０５
１１０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ １１５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ １３０ １３５
１４０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ １８０ １８５
１９０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ １９５ ２００
２０５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２１０ ２１５
２２０ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
２６０ ＜２１０＞ ３ ＜２１１＞ ７８６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ
ｓｈａｆｆｌｉｎｇ ＜４００＞ ３ ａｔｇｔａｔａａａｇ ａｔｔｔａｇａａｇｇ ａａａａｇｔａｇｔｇ ｇｔｃ
ａｔａａｃａｇ ｇｔｔｃａｔｃｔａｃ ａｇｇｔｔｔｇｇｇａ ６０ ａａａｔｃａａｔｇｇ ｃｇａｔｔｃｇｔｔｔ ｔｇｃｇａｃａｇａａ ａａａ
ｇｃｃａａａｇ ｔａｇｔｔｇｔｇａａ ｃｔａｔｃｇｔｔｃｔ １２０ ａａｇｇａｇｇａｃｇ ａａｇｃｔａａｃａｇ ｃｇｔｔｔｔａｇａａ ｇａａ
ａｔｔａａａａ ａａｇｔｔｇｇｃｇｇ ａｇａａｇｃａａｔｔ １８０ ｇｃｔｇｔｃａａａｇ ｇｔｇａｔｇｔａａｃ ａｇｔｔｇａｇｔｃｔ ｇａｃ
ｇｔｔａｔｃａ ａｔｔｔａｇｔｔｃａ ａｔｃｔｇｃｔａｔｔ ２４０ ａａａｇａｇｔｔｔｇ ｇａａａｇｃｔａｇａ ｃｇｔｔａｔｇａｔｔ ａａｃ
ａａｃｇｃａｇ ｇｇｔｔａｇａａａａ ｔｃｃｇｇｔｔｔｃａ ３００ ｔｃｔｃａｔｇａａａ ｔｇｔｃｔｔｔａａｇ ｃｇａｔｔｇｇａａｔ ａａａ
ｇｔｃａｔｔｇ ａｔａｃｇａａｃｔｔ ａａｃｇｇｇｃｇｃｃ ３６０ ｔｔｔｔｔａｇｇｃａ ｇｃｃｇｔｇａａｇｃ ｇａｔｔａａａｔａｔ ｔｔｔ
ｇｔｇｇａａａ ａｔｇａｔａｔｔａａ ｇｇｇａａｃａｇｔｔ ４２０ ａｔｔａａｃａｔｇｔ ｃｇａｇｔｇｔｔｃａ ｃｇａｇａａａａｔｔ ｃｃｔ
ｔｇｇｃｃａｔ ｔａｔｔｔｇｔｔｃａ ｔｔａｔｇｃａｇｃａ ４８０ ａｇｔａａａｇｇｃｇ ｇｔａｔｇａａｇｃｔ ａａｔｇａｃｔａａａ ａｃａ
ｃｔｇｇｃａｔ ｔａｇａａｔａｃｇｃ ｔｃｃａａａａｇｇｔ ５４０ ａｔｔｃｇｔｇｔａａ ａｔａａｃａｔｔｇｇ ａｃｃａｇｇａｇｃｇ ａｔｔ
ａａｔａｃａｃ ｃｇａｔｔａａｃｇｃ ｔｇａｇａａａｔｔｔ ６００ ｇｃｔｇａｔｃｃｔｇ ａｇｃａｇｃｇｔｇｃ ａｇａｔｇｔａｇａａ ａｇｃ
ａｔｇａｔｔｃ ｃａａｔｇｇｇａｔａ ｃａｔｃｇｇａｇａｇ ６６０ ｃｃｇｇａａｇａａａ ｔｔｇｃａｇｃａｇｔ ｔｇｃｔｇｃａｔｇｇ ｃｔａ
ｇｃｔｔｃｔｔ ｃａｇａｇｇｃｇａｇ ｔｔａｔｇｔａａｃａ ７２０ ｇｇａａｔｔａｃｇｃ ｔｃｔｔｔｇｃｔｇａ ｃｇｇｃｇｇｔａｔｇ ａｃａ
ｃｔｇｔａｃｃ ｃａｔｃａｔｔｃｃａ ａｇｃａｇｇａｃｇｃ ７８０ ｇｇａｔａａ
７８６ ＜２１０＞ ４ ＜２１１＞ ２６１ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ
ｓｈａｆｆｌｉｎｇ ＜４００＞ ４ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ５０ ５５
６０ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ８５
９０ ９５ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ １００ １０５
１１０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ １１５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ １３０ １３５
１４０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ １８０ １８５
１９０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ １９５ ２００
２０５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２１０ ２１５
２２０ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
２６０ ＜２１０＞ ５ ＜２１１＞ ４０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ ５ ｃａｔｇｃｃａｔｇｇ ｃａａｔｇｔａｔａａ ａｇａｔｔｔａｇａａ ｇｇａ
ａａａｇｔａｇ ４０ ＜２１０＞ ６ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒＰＣＲ ＜４００＞ ６ ｇｔｃｇａｃｇａｇｃ ｔｃｔｔａｔｃｃｇｃ ｇｔｃｃｔｇｃｔｔｇ
３０ ＜２１０＞ ７ ＜２１１＞ ３２ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ ７ ｃａｔｇｃｃａｔｇｇ ｃａａｔｇｔａｔｃｃ ａａｇｔｔｔａｇａｇ ｇｇ
３２ ＜２１０＞ ８ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ ８ ｇｔｃｇａｃｇａｇｃ ｔｃｔｃａｃｃｃｔｔ ｔｔｃｃｃｇｃｔｔｇ
３０ ＜２１０＞ ９ ＜２１１＞ ３７ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ ９ ｃａｔｇｃｃａｔｇｇ ｃａａｔｇｔａｔａｃ ａｇａｔｔｔａａａａ ｇａｔ
ａａａｇ ３７ ＜２１０＞ １０ ＜２１１＞ ３１ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １０ ｇｔｃｇａｃｇａｇｃ ｔｃｔｔａｇｃｃｔｃ ｔｔｃｃｔｇｃｔｔｇ ｇ
３１ ＜２１０＞ １１ ＜２１１＞ ３２ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １１ ｃａｔｇｃｃａｔｇｇ ｃａａｔｇｔａｔｃｃ ｇｇａｔｔｔａａａａ ｇｇ
３２ ＜２１０＞ １２ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １２ ｇｔｃｇａｃｇａｇｃ ｔｃｔｔａａｃｃｇｃ ｇｔｃｃｔｇｃｃｔｇ
３０ ＜２１０＞ １３ ＜２１１＞ １７ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １３ ｔｇｔｇｇａａｔｔｇ ｔｇａｇｃｇｇ
１７ ＜２１０＞ １４ ＜２１１＞ ２３ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ＜４００＞ １４ ｔｔｃｔｇａｔｔｔａ ａｔｃｔｇｔａｔｃａ ｇｇｃ
２３ ＜２１０＞ １５ ＜２１１＞ ２６１ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｇｅｎ ＜４００＞ １５ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ５０ ５５
６０ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ ８５
９０ ９５ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ １００ １０５
１１０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ １１５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ １３０ １３５
１４０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ １８０ １８５
１９０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ １９５ ２００
２０５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２１０ ２１５
２２０ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
２６０ ＜２１０＞ １６ ＜２１１＞ ２６１ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｇｅｎ ＜３００＞ ＜４００＞ １６ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ５０ ５５
６０ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ８５
９０ ９５ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ １００ １０５
１１０ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ １１５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ １３０ １３５
１４０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ １８０ １８５
１９０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ １９５ ２００
２０５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２１０ ２１５
２２０ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
２６０
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
(72)発明者 白 桑好
岩手県釜石市平田第３地割75番１ 株式会
社海洋バイオテクノロジー研究所釜石研究
所内
(72)発明者 加々美 修
岩手県釜石市平田第３地割75番１ 株式会
社海洋バイオテクノロジー研究所釜石研究
所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA03 CA07 DA01
DA02 DA06 DA07 DA11 EA04
GA11 HA08
4B050 CC04 DD02 LL03
4B065 AA15Y AA17Y AA19Y AA26X
AA57X AA87X AB01 BA02
CA28 CA46
Claims (15)
- 【請求項１】 配列表の配列番号４で表されるアミノ酸
配列を含むグルコース脱水素酵素。 - 【請求項２】 配列表の配列番号４で表されるアミノ酸
配列の１４５番目のセリン、１５８番目のチロシンおよ
び１６２番目のリジンが保持され、当該アミノ酸配列の
うち当該３個のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃至複数個
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグ
ルコース脱水素酵素であって、無機塩の非存在下での耐
熱性を有するグルコース脱水素酵素。 - 【請求項３】 無機塩が塩化ナトリウムである請求項２
記載のグルコース脱水素酵素。 - 【請求項４】 グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を
更に有する請求項２または３に記載のグルコース脱水素
酵素。 - 【請求項５】 グルコース脱水素酵素が改善された比活
性を更に有する請求項２乃至４のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素。 - 【請求項６】 配列表の配列番号４で表されるアミノ酸
配列の１４５番目のセリン、１５８番目のチロシン、１
６２番目および１７０番目のリジンならびに２５２番目
のロイシンが保持され、当該アミノ酸配列のうち当該５
個のアミノ酸以外のアミノ酸の１乃至複数個が欠失、置
換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むグルコース脱
水素酵素であって、無機塩の非存在下での耐熱性を有す
るグルコース脱水素酵素。 - 【請求項７】 無機塩が塩化ナトリウムである請求項６
記載のグルコース脱水素酵素。 - 【請求項８】 グルコース脱水素酵素が耐アルカリ性を
更に有する請求項６または７に記載のグルコース脱水素
酵素。 - 【請求項９】 グルコース脱水素酵素が改善された比活
性を更に有する請求項６乃至８のいずれかに記載のグル
コース脱水素酵素。 - 【請求項１０】 請求項１乃至９のいずれかに記載のグ
ルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。 - 【請求項１１】 配列表の配列番号３で表される塩基配
列を含む遺伝子。 - 【請求項１２】 請求項１０または１１に記載の遺伝子
を含む組換えベクター。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載の組換えベクターを
含む形質転換体。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の形質転換体を培養
し、得られる培養物からグルコース脱水素酵素を採取す
ることを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。 - 【請求項１５】 請求項１乃至９のいずれかに記載のグ
ルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002128309A JP2003310274A (ja) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | グルコース脱水素酵素およびそれをコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002128309A JP2003310274A (ja) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | グルコース脱水素酵素およびそれをコードする遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003310274A true JP2003310274A (ja) | 2003-11-05 |
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ID=29542109
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002128309A Pending JP2003310274A (ja) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | グルコース脱水素酵素およびそれをコードする遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003310274A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2002
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| KR20140032393A (ko) | 2011-03-30 | 2014-03-14 | 유니티카 가부시끼가이샤 | 개변형 글루코스 데히드로게나제 |
| US9023608B2 (en) | 2011-03-30 | 2015-05-05 | Nipro Corporation | Modified glucose dehydrogenase |
| EP2695939A4 (en) * | 2011-03-30 | 2015-05-06 | Unitika Ltd | MODIFIED GLUCOSE EDHYDROGENASE |
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