JPH09131185A

JPH09131185A - 新規なｎａｄｈキナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びｎａｄｈキナーゼの製造法

Info

Publication number: JPH09131185A
Application number: JP7261586A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Ono; 剛大野; Ikuko Nishimura; 郁子西村
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Priority date: 1995-09-06
Filing date: 1995-10-09
Publication date: 1997-05-20

Abstract

(57)【要約】【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列、又
は該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が
付加、欠失もしくは置換されたものであって、且つNADH
キナーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするNADH
キナーゼ遺伝子、該NADHキナーゼ遺伝子がベクターDNA
に挿入されたものであることを特徴とする新規な組み換
え体DNA 、該組み換え体DNA を含有するエッシェリシア
属に属する微生物を培地に培養し、培養物からNADHキナ
ーゼを採取することを特徴とするNADHキナーゼの製造
法。【効果】 NADHキナーゼを効率よく生産することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なNADHキナー
ゼ遺伝子、新規な組み換え体DNA 及びNADHキナーゼの製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】NADHキナーゼは、ATP の存在下でNADHを
リン酸化してNADPH を生成する反応を触媒する酵素であ
り、NAD ⁺依存性デヒトロゲナーゼ反応の基質、又は酵
素を高感度に測定する目的で使用されている（特開平4-
252200号）。従来、NADHキナーゼは、例えば、ピキア属
の酵母を培地に培養し、培養物からNADHキナーゼを採取
する事により製造されている（特開平 4-252182 号) 。

【０００３】しかしながら、上記のNADHキナーゼの製造
法によるときには、NADHキナーゼの収率が不充分である
等の問題点があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、NADHキナーゼを効率よく生産すべく、その生産の元
となるNADHキナーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組み換え体
DNA 、及び該組み換え体DNA を用いるNADHキナーゼの製
造法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ピキア属酵母由来
のNADHキナーゼ遺伝子を単離及び構造決定することに成
功し、更に、遺伝子工学の手法を用いてNADHキナーゼを
効率よく生産する方法を確立し、本発明を完成した。

【０００６】即ち、本発明の第１の発明は、配列番号１
で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において
１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換さ
れたものであって、且つNADHキナーゼ活性をもたらすア
ミノ酸配列をコードするNADHキナーゼ遺伝子であり、第
２の発明は、上記NADHキナーゼ遺伝子がベクターDNAに
挿入されたものであることを特徴とする新規な組み換え
体DNA であり、第３の発明は、上記組み換え体DNA を含
有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養
し、培養物からNADHキナーゼを採取することを特徴とす
るNADHキナーゼの製造法である。

【０００７】以下、ピキア属酵母の染色体DNA のライブ
ラリー（以下「ゲノミックDNA ライブラリー」という）
からNADHキナーゼ遺伝子をクローニングする方法を例に
とり、本発明を詳細に説明する。

【０００８】1. ピキア属酵母の染色体DNA の調製ピキア属酵母からNADHキナーゼ遺伝子を含む染色体DNA
を抽出する方法としては、公知のいずれの方法もが使用
できる。その例としては、Hoffman 等の方法（Gene,57,
267-272, 1987 ）等が挙げられる。

【０００９】ピキア属酵母としては、例えばPichia mem
branaefaciens YS27 （FERM BP-3208）が使用できる。
ピキア酵母菌は、例えばＹＰＧ培地等で培養したものを
使用することができるが、培養した菌体を集菌後に凍結
保存した保存試料を使用することも可能である。

【００１０】得られた染色体DNA を制限酵素ＡｐａＩに
より完全消化し、染色体DNA のＡｐａＩ断片（以下「Ａ
ｐａＩ断片」という）を得る。次いで、ＡｐａＩ断片を
通常のアガロースゲル電気泳動法に供し、NADHキナーゼ
遺伝子の一部に対応するオリゴヌクレオチドをプローブ
としたサザンブロット分析により確認したNADHキナーゼ
遺伝子を含有する3.0 〜3.5 kbの鎖長のＡｐａＩ断片を
含むゲルを切り出す。

【００１１】切り出したゲル中のDNA を、GENE CLEAN I
I（フナコシ社製）等により精製し、更にエタノール沈
殿等により濃縮して純化されたＡｐａＩ断片を得る。純
化されたＡｐａＩ断片を、適当なベクターDNA のＡｐａ
Ｉ部位に挿入して組み換え体DNA を作成し、該組み換え
体DNA を用いて、宿主細胞を形質転換、又は形質導入す
れば、ゲノミックDNA ライブラリーを作成することがで
きる。

【００１２】ＡｐａＩ断片を挿入するためのベクターDN
A は、宿主細胞で複製可能なものであれば如何なるもの
でもよく、例えば、プラスミドDNA 、バクテリオファー
ジDNA 等が挙げられる。例えば、宿主細胞が大腸菌であ
る場合は、プラスミドpBluescript SK+(Stratagene社
製)、pMAL-C2（NEW England Labs社製）、pGEX-5X-1
（ファルマシア社製）、pXa1（ベーリンガー社製）等を
用いることができる。

【００１３】染色体DNA のＡｐａＩ断片を挿入するため
に、上記プラスミドDNA を例えば制限酵素ＡｐａＩ（宝
酒造社）を用いて消化し、切断されたベクターDNA を得
る。次いで、ＡｐａＩ断片と、切断されたベクターDNA
とを混合し、これに、例えばT4 DNAリガーゼ（ベーリン
ガーマンハイム社製）を作用させて組み換え体DNA を得
る。

【００１４】このようにして得られた組み換え体DNA を
用いて、宿主細胞を形質転換して種々の遺伝子断片を保
有する形質転換体のコロニーを得ることができる。宿主
細胞としては、真核細胞及び原核細胞のいずれをも用い
ることができる。真核細胞としては動物、植物、昆虫、
酵母等の細胞が、原核細胞としては大腸菌、枯草菌、放
線菌等が挙げらる。具体的にはエッシェリシア属に属す
る微生物、例えば大腸菌JM109（宝酒造社製）、HB101(A
TCC33694)等が好適に使用されうる。

【００１５】本発明においては、形質転換は、例えばD.
M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326-3
31, 1979) により、形質導入は、例えばB.Hohnの方法
（Method in Enzymology, 68, 299-309, 1979)により行
うことができる。

【００１６】2. クローンの選別上記で作成したゲノミックDNA ライブラリーより、NADH
キナーゼ遺伝子を含有する形質転換株をスクリーニング
するには、NADHキナーゼ遺伝子の一部に対応するオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして、コロニーハイブリダイ
ゼーション〔Current Protocols in Molecular Biology
(WILEY Interscience,1989)〕を行えばよい。

【００１７】プローブとして用いるオリゴヌクレオチド
は、NADHキナーゼの部分アミノ酸配列に基づいてプライ
マーを合成し、染色体DNA を鋳型としてＰＣＲを行うこ
とより得られる。尚、プローブは、〔γ−³²Ｐ〕ATP(ア
マシャムジャパン社製）等の放射性同位体、或いはジ
ゴキシゲニン（ベーリンガーマンハイム社製）等の非放
射性物質により標識することができる。

【００１８】このようにしてベクタープラスミドにNADH
キナーゼ遺伝子が組み込まれた組み換え体ＤＮＡを有す
る形質転換株を得ることができる。NADHキナーゼ遺伝子
を含有する形質転換株より、純化された組み換え体DNA
を得るには、例えば超遠心塩化セシウム濃度勾配分離法
等の方法を用いればよい。

【００１９】3. 遺伝子の解析上記の組み換え体DNA に挿入されているNADHキナーゼ遺
伝子の塩基配列の解析は、例えばジデオキシ法(Methods
in Enzymology, 101, 20-78, 1983) 、具体的には実施
例項目（２）記載の方法により行うことができる。決定
したNADHキナーゼ遺伝子の塩基配列を有する遺伝子によ
って翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を確定す
る。このアミノ酸配列は、配列番号１に示される通りで
ある。このようにして確定されたアミノ酸配列をコード
する遺伝子が本発明のNADHキナーゼ遺伝子である。

【００２０】配列番号１のアミノ酸配列おいて、NADHキ
ナーゼ活性を失うことのない限り、１もしくは複数のア
ミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されていてもよい。
NADHキナーゼ活性を失うことのない範囲でアミノ酸配列
が変異されたNADHキナーゼをコードする遺伝子は、全て
本発明に含まれる。

【００２１】上記のような変異されたNADHキナーゼをコ
ードする遺伝子は、野生型NADHキナーゼ遺伝子に変異を
導入することにより得られる。遺伝子に変異を導入する
方法としては、野生型遺伝子と変異原となる薬剤、具体
的にはヒドロキシルアミン、亜硝酸、亜硫酸、５−ブロ
モウラシル等を接触させる方法を挙げることができる。
この他、紫外線照射法、カセット変異法、ＰＣＲ法を用
いた部位特異的変異導入法等の方法を広く用いることが
できる。更には、化学合成したDNA をアニーリングして
所望の部位に変異を有する変異型NADHキナーゼ遺伝子を
構築することも可能である。

【００２２】4. NADHキナーゼ生産能を有する組み換え
微生物の作成上記の方法により得られたNADHキナーゼ遺伝子を含有す
る形質転換株は、そのままではNADHキナーゼを生産しな
い。そこで、以下の方法によりNADHキナーゼ生産能を有
する組み換え微生物を作成する。

【００２３】先ず、NADHキナーゼ遺伝子の塩基配列から
予想されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の10アミノ
酸に対応する30塩基を含むオリゴヌクレオチド（Ｃ末端
側は相補鎖である。）を合成し、これらをＰＣＲ用プラ
イマーとする。プライマー中にＮｄｅＩ部位を組み込ん
でおき、ＰＣＲ産物をＮｄｅＩで消化した際に、NADHキ
ナーゼのコーディング領域のみが得られるようにしてお
く。次いで、上記のプライマーを用い、NADHキナーゼ遺
伝子を含有するＡｐａＩ断片が挿入されている組み換え
体DNA 、或いは染色体DNA を鋳型としてＰＣＲを行った
後、ＰＣＲ産物をＮｄｅＩで消化し、NADHキナーゼのコ
ーディング領域のみからなるDNA を得る。該DNA を、発
現用ベクターDNA のＮｄｅＩ部位に挿入し、発現用の組
み換え体DNA を調製する。

【００２４】発現用ベクターDNA は、大腸菌ラクトース
オペロン等に由来するプロモーター／オペレーター及び
リボソーム結合部位等の発現調節領域を含むDNA 配列を
保有するものであれば、プラスミドDNA でもバクテリオ
ファージDNA でもよい。具体的には、実施例の項目
（６）記載のプラスミドpUTE500K’を用いることができ
る。

【００２５】得られた発現用の組み換え体DNA を用い
て、宿主細胞、例えば大腸菌XL1-Blue（Stratagene社
製）、JM109（宝酒造社製）、HB101(ATCC33694)等を形
質転換又は形質導入すれば、NADHキナーゼ生産能を有す
る組み換え微生物を得ることができる。

【００２６】5. NADHキナーゼの生産上記のNADHキナーゼ生産能を有する組み換え微生物を培
養すれば、NADHキナーゼを生産することができる。培養
方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採
用することが好ましい。又、培地としては、例えば酵母
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー
あるいは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上
の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄ある
いは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更
に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したもの
が用いられる。又、必要により培地にＩＰＴＧ等を添加
して、NADHキナーゼ遺伝子の発現を誘導してもよい。

【００２７】培地の初発ｐＨは７〜９に調節するのが適
当である。培養は、30〜42℃、好ましくは37℃前後で６
〜24時間、通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等により
行うことが好ましい。

【００２８】培養終了後、培養物よりNADHキナーゼを採
取するには、通常の酵素採取手段を用いることができ
る。すなわち、リゾチーム等の酵素を用いた溶菌処理、
超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を破壊し、NADH
キナーゼを菌体外に排出させる。次いで、ろ過又は遠心
分離などにより不溶物を除去することにより、NADHキナ
ーゼを含有する粗酵素液を得ることができる。

【００２９】上記の粗酵素液から、NADHキナーゼをさら
に精製するには、通常のタンパク質精製法を使用するこ
とができる。具体的には、硫安塩析法、有機溶媒沈澱
法、イオン交換体などによる吸着処理法、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動法等が、単独又は適宜組み合わせて用いら
れる。

【００３０】上記の方法により得られるNADHキナーゼは
以下の通りであり、特開平 4-252182 号公報記載のNADH
キナーゼと同様の性質を有する。 (a) 作用及び基質特異性: Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺の
うち少なくとも１種のイオンの存在下で、NADHとXTP
〔式中、ＸはＡ（アデノシン）、Ｕ（ウリジン）、Ｇ
（グアノシン）、Ｃ（シチジン）、Ｉ（イノシン）、ｄ
Ｔ（チミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＵ
（デオキシウリジン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、
ｄＣ（デオキシシチジン）又はｄＩ（デオキシイノシ
ン）を示す〕を基質としてNADHをリン酸化し、NADPH と
XDP （式中、Ｘは前記と同じ）を生成する反応を触媒す
る。NADHに対して非常に特異的であって、NAD ⁺には作
用しない。

【００３１】(b) 至適pH及び安定pH範囲: 至適pHは、N
ADHを基質とした場合、pH8.0 〜9.0であり、安定pH範囲
は、pH7.0 〜9.0 である。 (c) 作用適温の範囲: 30〜45℃ (d) 熱安定性: 35℃, 10分間の処理で83% 、 40 ℃, 1
0分間の処理で60% 、45℃ 10分間の処理で30% の残存
活性を示す。 (e) 分子量: 約160,000

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるも
のではない。（１）ピキア属酵母の染色体DNA の調製染色体DNA は、Hoffman らの方法に従って調製した。す
なわち、Pichia membranaefaciens YS27 （FERM BP-320
8）をＹＰＧ培地（0.5 ％イーストエキス、１％ペプト
ン、２％グルコース）50 ml に接種して25℃で16時間振
盪培養した後、遠心分離により集菌した。この菌体を3
mlの破砕溶液〔２％トリトンX-100 、１％ドデシル硫酸
ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、0.01 Mトリス塩酸
（pH8.0)、0.01M EDTA〕に懸濁して太型試験管に移した
後、3 mlのTE飽和フェノールークロロホルム（50：50ｖ
／ｖ）を加えた。滅菌した５ｇのグラスビース（直径0.
5 mm）を添加した後、試験管を激しく振盪して菌体を破
砕し、染色体DNA を抽出した。次いで、得られた染色体
DNA をエタノール沈殿により濃縮した。この操作を10回
繰り返し、250 μｇの染色体DNA を得た。

【００３３】（２）サザンブロット分析Pichia membranaefaciens YS27 （FERM BP-3208）の培
養物より、イオン交換カラムクロマトグラフィー、硫安
沈澱、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー等を組み合わせてNADHキナーゼ
を精製し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。又、精製し
たNADHキナーゼを臭化シアン処理してペプチド断片化
し、タンパク質内部のアミノ酸配列を決定した。部分ア
ミノ酸配列の情報に基づき、複数個のＰＣＲ用プライマ
ーをDNA Synthesizer Model 392（アプライドバイオ
システムズ社製）で合成した。次いで、（１）で調製し
た染色体DNA を鋳型とし、Ｔａｑ DNA ポリメラーゼ
（ＴａＫａＲａＴａｑ宝酒造社製）を用いたＰＣＲ
を行った。ＰＣＲ産物の塩基配列を、Taq Dye PrimerCy
cle Sequencing Kit およびTaq DyeDeoxy Terminator
Cycle Sequencing Kit（いずれもアプライドバイオシ
ステムズ社製）を用いて決定した。その結果、1160 bp
のＰＣＲ産物が、NADHキナーゼ遺伝子の一部に対応する
塩基配列を有することが確認された。このＰＣＲ産物を
プローブとして用い、以下の方法により、サザンブロッ
ト分析を行った。

【００３４】染色体DNA を制限酵素ＡｐａＩにより完全
消化した後、通常のアガロースゲル電気泳動法に供し、
上記の1160 bp のＰＣＲ産物をプローブとしてサザンブ
ロット分析を行った。その結果、NADHキナーゼ遺伝子を
含有するＡｐａＩ断片の鎖長は、3.0 〜3.5 kb程度であ
ることが確認された。なお、プローブは、DIG-Labeling
Kit（ベーリンガーマンハイム社）を用いてジゴキシゲ
ニン標識した。

【００３５】（３）ゲノミックDNA ライブラリーの作製 100 μｇの染色体DNA を、制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社
製）により完全消化した後、アガロースゲル電気泳動に
供した。次いで、3.0 〜3.5 kbの鎖長のＡｐａＩ断片を
含有するゲルを切り出した後、ゲル中のDNA を、GENE C
LEAN II（フナコシ社製）により回収し、10μｇのＡｐ
ａＩ断片を得た。

【００３６】上記で得られたＡｐａＩ断片10μｇと、Ａ
ｐａＩを用いて切断したプラスミドpBluescript SK+(St
ratagene社製）２μｇとを混合し、T4 DNAリガーゼ（ベ
ーリンガーマンハイム社）１ユニットで連結し、組み換
え体プラスミドを得た。次いで、D.M.Morrisonの方法に
従って大腸菌JM109(宝酒造社製)を形質転換し、約6000
個の大腸菌のコロニーを得た。大腸菌のコロニーを、ア
マシャム社のプロトコールに従いナイロンメンブレンフ
ィルター（Hybond−Ｎ＋アマシャム社製）にブロッテ
ィングした。

【００３７】（４）コロニーハイブリダイゼーションに
よるNADHキナーゼ遺伝子の単離 NADHキナーゼ遺伝子は、（３）で作成したゲノミックDN
A ライブラリーを、（２）のプローブを用いてスクリー
ニングして得た。スクリーニングは、コロニーハイブダ
イゼーション法を用いて行い、陽性コロニー１個を得
た。

【００３８】（５）NADHキナーゼ遺伝子の解析（４）で単離した陽性コロニーに含まれる組み換え体プ
ラスミドを、超遠心塩化セシウム濃度勾配分離法にて調
製し、ＡｐａＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動
法に供した。その結果、該組み換え体プラスミドには、
約3.3 kbのＡｐａＩ断片が挿入されていることがわかっ
た。

【００３９】挿入されているＡｐａＩ断片の塩基配列を
決定したところ、NADHキナーゼ遺伝子は、1440 bp のコ
ーディング領域をもち（配列番号２）、479 個のアミノ
酸をコードしていた（配列番号１）。

【００４０】（６）発現用組み換え体プラスミドの作成先ず、NADHキナーゼのコーディング領域のみからなるDN
A を以下の方法により作成した。予想されるNADHキナー
ゼアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の10アミノ酸に対応
する30塩基を含むプライマー（Ｃ末端側は相補鎖であ
る。又、これらのプライマー中にはＮｄｅＩ部位が組み
込んである。）を合成し、染色体DNA を鋳型として、Ｐ
ＣＲを行った。Ｎ末端及びＣ末端アミノ酸に対応するプ
ライマーの塩基配列を、配列番号３及び配列番号４に示
した。増幅されたＰＣＲ産物をＮｄｅＩで消化し、NADH
キナーゼのコーディング領域のみからなるDNA を得た。

【００４１】一方、発現用プラスミドpUTE500K’を以下
の方法により作成した。プラスミドpBR322（宝酒造社
製）をＮｄｅＩで切断した後、DNA Blunting Kit（宝酒
造社製）を用いて平滑末端とし、T4 DNAリガーゼ（ベー
リンガーマンハイム社製）で環状に戻すことによりＮｄ
ｅＩ部位を消去した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ及び
ＮｒｕＩで切断した後、上記のDNA Blunting Kitを用い
て平滑末端とした。次いで、アガロースゲル電気泳動を
行い、GENE CLEANII（フナコシ社製）により、複製起点
を含む約3.4 kbのプラスミド断片を取得した。得られた
プラスミド断片をT4 DNAリガーゼで環状に戻した後、Ｅ
ｃｏＲＩで切断し、直鎖状とした。

【００４２】次いで、以下に示すような大腸菌ラクトー
スオペロン等に由来するプロモーター／オペレーター、
リボソーム結合部位、ターミネーター等の発現調節領域
並びにＮｄｅＩ切断部位及びシークエンスプライマー
（-21M13 Forward Primer）結合部位を含むDNA 配列（T
he Operon,P227,Cold Spring Harbor Laboratory,1980
年を参照）：

【００４３】

【外１】

【００４４】を、DNA Synthesizer Model 392（アプラ
イドバイオシステムズ社製）により合成し、上記のＥ
ｃｏＲＩで切断されたプラスミドと連結して、発現用プ
ラスミドpUTE500K’とした。NADHキナーゼのコーディン
グ領域のみからなるDNA を、発現用プラスミドpUTE500
K’のＮｄｅＩ部位に挿入し、発現用組み換え体プラス
ミド pNADHK500K ’を得た。

【００４５】（７）NADHキナーゼ生産能を有する組み換
え微生物の作成 D.M.Morrisonの方法に従い、組み換え体プラスミドpNAD
HK500K’を用いて大腸菌XL1-Blue（Stratagene社製) を
形質転換した。得られた形質転換株を、大腸菌XL-1Blue
（pNADHK500K’）と命名した。該形質転換株は工業技術
院生命工学工業技術研究所にFERM P-15151として寄託さ
れている。

【００４６】大腸菌XL-1Blue(pNADHK500K’）を、1mM I
PTGを含むTY培地（１％バクト−トリプトン、１％バク
ト−イーストエクストラクト、0.5% NaCl 、pH 7.0) に
て、37℃で16時間振盪培養した。培養物のNADHキナーゼ
活性を以下の方法に従って測定したところ、0.5 mU/ml
であった。

【００４７】（酵素活性測定法）下表の組成のNADHを含
む基質溶液0.9ml を30℃に予備加温し、これに所定の濃
度の本酵素液0.1ml を加えて、30℃で20分間反応させ
た。その後、100 ℃, ２分間の処理で反応を停止して変
性タンパク質を除去し、次いでそれぞれの基質の反応に
よって生成したNADPH の量を測定した。なお対照として
は、基質溶液と本酵素を混合後、直ちに反応を停止した
ものを用いた。

【００４８】NADPH 量の測定を以下に示す。上記反応液
各1ml に、発色液 [10mM G-6-P, 50mM HEPPS緩衝液(pH
8.0), 10mM 塩化マグネシウム, 0.1%牛血清アルブミン,
2.5IU/ml G-6-Pデヒドロゲナーゼ(NADP ⁺依存性), 5I
U/ml ジアホラーゼ, 250 μM2,6-ジクロロフェノールイ
ンドフェノール] 1ml を加えて混合し、直ちにギルフォ
ード社ステーサーIII 型分光光度計の恒温キュベット内
に導き、30℃で反応させた。この際、反応と同時に600n
m における吸光度の変化を経時的に測定し、発色反応後
１分後の吸光度値と２分後の吸光度値との差（ΔOD
_600nm/min) を測定値として得た。予め、濃度既知のNA
DPH 溶液を用いて、ΔOD_600nm/minとNADPH濃度との検
量線を作成しておき、これによって測定値から生成した
NADPH の量を算出した。なお、30℃において1 分間あた
り、１ナノモル量のNADPH を生成する酵素量を１単位と
した。

【００４９】

【表１】

【００５０】

【発明の効果】本発明によれば、NADHキナーゼを効率よ
く生産することができる。

【００５１】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：４７９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Met Ala Leu Val Leu Arg Arg Phe Phe Ser Gly Ser Val Ala Arg Ala 5 10 15 Thr Ala Pro Ala Ser Leu Ile Lys Leu His Pro Val Ser Gln Leu Lys 20 25 30 Gln Arg Gln Leu Pro Thr Tyr Val Gly Gln Ser Asn Ser Ile Val Lys 35 40 45 Ser Leu Val Trp Thr Thr Pro Pro Ser Asn Val Leu Ile Val Lys Lys 50 55 60 Pro Trp His Ser Lys Val Leu Asp Ala Ala Ile Thr Phe Ile Lys His 65 70 75 80 Leu His Ala Asn Tyr Pro Ser Val Asn Ile Ile Val Val Pro Glu Val 85 90 95 Ala Glu Glu Leu Asn Ser Ile Glu Arg Lys Ser Ser Asp Pro Asp Thr 100 105 110 Pro Ile Gly Ile Tyr Thr Gly Pro Leu Asn Glu Ile Ile Ser Lys Thr 115 120 125 Asp Leu Ile Val Ser Leu Gly Gly Asp Gly Thr Ile Leu Arg Gly Val 130 135 140 Ser Leu Phe Ser Asn Thr Thr Val Pro Pro Val Leu Ser Phe Ser Leu 145 150 155 160 Gly Thr Leu Gly Phe Leu Leu Pro Phe Asp Phe Asn Asn Tyr Ala Glu 165 170 175 Ala Phe Lys Gln Met Phe Glu Ser Arg Ser Ser Ile Leu Lys Arg Glu 180 185 190 Arg Ile Glu Cys His Ile Val Lys Ala Ser Pro Gln Ser Glu Ala Leu 195 200 205 Asn Gln Gln Arg Lys Asp Leu Glu Thr Ser Tyr Gln Asn Thr Arg Ser 210 215 220 Leu Asn Ala Gln Glu Glu Val Glu Arg Leu Lys Arg Leu Ser Ala Ala 225 230 235 240 Met Asp Ala Pro Phe Asp Asn Leu Thr Val Ser Ser Glu Leu Glu Ala 245 250 255 Leu Lys Lys Leu Lys Ile His Ala Met Asn Asp Ile Val Leu His Arg 260 265 270 Gly Ser Leu Pro Gly Leu Val Asn Leu Asp Val Tyr Ile Asn Gly Asn 275 280 285 Leu Leu Thr Arg Thr Thr Ala Asp Gly Leu Ile Phe Ala Thr Pro Thr 290 295 300 Gly Ser Thr Ala Tyr Ser Leu Ser Ala Gly Gly Ser Ile Val His Pro 305 310 315 320 Val Val Lys Cys Ile Leu Leu Thr Pro Ile Cys Pro Arg Ser Leu Ser 325 330 335 Phe Arg Pro Leu Ile Leu Pro Leu Asn Ser His Ile Leu Ile Lys Val 340 345 350 Ile Gly Lys Glu Asn Val Lys Ile Asp Tyr Thr Lys Cys Asn Ala Lys 355 360 365 Leu Ser Ile Asp Gly Ile Pro Gln Leu Lys Met Val Pro Gly Asp Glu 370 375 380 Ile His Ile Ile Ser Glu Ser Val Ser Arg Leu Asn Ser Val Asn Asp 385 390 395 400 Asp Glu Asp Asp Ile Ala Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Pro Asp Cys 405 410 415 Val Asn Ala Ser Thr Thr Val Ser Lys Glu Ser Lys Thr Lys Ser Leu 420 425 430 Gly Arg Arg Arg Gly Val Gln Lys Arg Thr Ala Glu Arg Ser Gly Val 435 440 445 Trp Cys Val Val Gln Ser Lys Gly Asp Trp Val Asn Gly Ile Asn Gly 450 455 460 Met Leu Gly Phe Asn Leu Gly Phe Lys Ser Ser Lys Ser Asn Lys *** 465 470 475

【００５２】配列番号：２配列の長さ：1440 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 ATGGCACTCG TCCTGCGCAG GTTCTTCTCC GGCTCCGTGG CCAGGGCCAC GGCGCCAGCC 60 AGCCTGATCA AGCTCCACCC GGTCTCGCAG CTCAAACAGA GACAGCTGCC CACCTACGTG 120 GGCCAGTCGA ACTCGATCGT GAAGTCGCTG GTGTGGACCA CGCCGCCCAG CAACGTGCTC 180 ATTGTGAAGA AGCCGTGGCA CTCCAAGGTG CTCGACGCCG CCATCACCTT CATCAAGCAT 240 CTCCACGCAA ACTACCCGTC CGTGAACATC ATCGTGGTGC CCGAGGTCGC CGAGGAGCTC 300 AACTCGATCG AACGCAAGAG CTCCGACCCA GACACGCCCA TCGGCATCTA CACAGGCCCG 360 CTCAACGAGA TCATCTCCAA GACAGACCTC ATTGTCTCCC TCGGCGGAGA CGGCACCATC 420 CTCCGGGGCG TGTCGCTCTT CTCCAACACG ACGGTCCCAC CCGTCTTGTC CTTCTCCCTC 480 GGCACACTAG GGTTCCTTCT CCCGTTCGAC TTCAACAACT ACGCGGAGGC GTTCAAACAG 540 ATGTTCGAGT CCCGCTCCAG CATCCTCAAA AGAGAACGCA TAGAGTGCCA CATCGTCAAG 600 GCTAGCCCGC AATCGGAGGC GCTCAACCAG CAGCGGAAGG ACCTCGAAAC GTCCTACCAG 660 AACACACGCT CCCTAAACGC ACAAGAAGAG GTGGAAAGGT TGAAGCGCTT GTCCGCAGCC 720 ATGGATGCTC CGTTCGACAA TCTGACAGTC TCCTCCGAGC TCGAGGCCCT CAAGAAATTG 780 AAAATCCACG CCATGAACGA CATTGTCCTC CACAGAGGCT CTCTCCCGGG ATTGGTCAAC 840 CTCGACGTCT ACATCAACGG CAACCTACTC ACACGGACAA CCGCAGACGG CCTCATCTTT 900 GCCACCCCAA CAGGCTCCAC AGCGTACTCT CTTTCGGCAG GCGGTTCCAT CGTCCACCCA 960 GTCGTCAAGT GCATCCTTCT CACCCCGATC TGTCCGCGAA GCTTGTCCTT CAGGCCCTTG 1020 ATCCTCCCAC TAAACTCCCA TATCTTGATC AAGGTCATCG GCAAGGAAAA CGTGAAGATC 1080 GACTACACCA AGTGCAACGC CAAATTGAGC ATAGACGGAA TTCCGCAACT GAAAATGGTC 1140 CCCGGCGACG AGATCCACAT CATCTCCGAG TCCGTCTCCA GACTTAACTC CGTAAACGAC 1200 GACGAAGACG ACATCGCCTC CGGAACAACT GCAGACGCAC CGGACTGCGT CAATGCTTCC 1260 ACTACTGTCT CGAAGGAATC TAAGACGAAG TCTCTGGGAA GACGCCGTGG CGTCCAAAAG 1320 AGAACCGCCG AACGAAGTGG CGTCTGGTGT GTTGTCCAGA GTAAGGGCGA CTGGGTCAAC 1380 GGCATCAACG GAATGTTGGG ATTCAACCTA GGATTCAAGT CTTCCAAGTC CAACAAATGA 1440

【００５３】配列番号３配列の長さ：４５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列の特徴：合成DNA プライマー配列 ACACCGTCGT ACCATATGGC ACTCGTCCTG CGCAGGTTCT TCTCC 45

【００５４】配列番号４配列の長さ：４８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列の特徴：合成DNA プライマー配列 TAGATGGACC CACATATGTC ATTTGTTGGA CTTGGAAGAC TTGAATCC 48

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１記載のアミノ酸配列、又は該
アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付
加、欠失もしくは置換されたものであって、且つNADHキ
ナーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするNADHキ
ナーゼ遺伝子。
【請求項２】請求項１記載のNADHキナーゼ遺伝子がベ
クターDNA に挿入されたものであることを特徴とする新
規な組み換え体DNA 。
【請求項３】請求項２記載の組み換え体DNA を含有す
るエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培
養物からNADHキナーゼを採取することを特徴とするNADH
キナーゼの製造法。