JP3681911B2 - 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 - Google Patents
耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ルシフェラーゼは、発光素であるルシフェリンの酸化を触媒して、これを発光させる発光酵素である。そして、ルシフェリンの発光の際にＡＴＰ等の物質を必要とする、ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米ボタル等由来のホタルのルシフェラーゼは、当該性質に基づいて、上記ＡＴＰ等の微量定量に利用されている。
【０００３】
しかしながら、一般的にルシフェラーゼは、熱に対して不安定なため、試薬として保存する際に失活しやすいという欠点を有する。かかる欠点を克服するための手段の一つとして、試薬に塩等を添加して、ある程度ルシフェラーゼを安定に保存することは可能である。しかし、この場合にも、ルシフェラーゼの塩による反応障害が惹起されがちであるという欠点が存在する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者等は、耐熱性ホタルルシフェラーゼを開発することを主たる課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題について鋭意検討した結果、野性型ホタルルシフェラーゼにおける特定のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に変換することにより、上記課題を解決し得ることを見出した。
すなわち、本願は、以下の発明を提供するものである。
（１）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（２）野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタルのルシフェラーゼである（１）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（３）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリン若しくはフェニルアラニンである（１）又は（２）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（４）（１）又は（２）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
（５）（４）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。
（６）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
（７）野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタルのルシフェラーゼである（６）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
（８）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、２１７及び３１５位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（９）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである（８）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（１０）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリン若しくはフェニルアラニンである（８）又は（９）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（１１）（８）又は（９）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
（１２）（１１）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。
（１３）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、２１７及び３１５位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
（１４）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである（１３）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明における遺伝子の改変による耐熱性ルシフェラーゼが提供される前提として、野性型のホタルのルシフェラーゼ遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡを調製することが必要である。
野性型ホタルの遺伝子等の種類は、提供が企図される耐熱性ルシフェラーゼ遺伝子の種類に応じて用いられる。そして、ホタル由来のものであれば、如何なるものでも用いることが可能であり、例えば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米ボタル等由来のものを用いることが可能である。
【０００７】
これらの遺伝子等は、既に公知の方法に従って調製される。例えば、野性型ゲンジボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは、特開平１−５１０８６号公報に記載の方法により調製することが可能であり、また、ヘイケボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは、特公平７−１１２４３４号公報に記載の方法により調製することが可能であり、また更に、北米ボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは、東洋紡績（株）より購入することが可能である。
本発明において、「北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸」とは、確定したルシフェラーゼのアミノ酸配列を、北米ボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。
また本発明において、「ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位と同等位置のアミノ酸」とは、確定したルシフェラーゼのアミノ酸配列を、ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。
【０００８】
具体的には、既製のアミノ酸の相同性の解析用ソフト、例えばＭｉｃｒｏ ＧｅｎｉｅTM（ベックマン社製）により、各々のルシフェラーゼのアミノ酸配列とゲンジボタル若しくはヘイケボタルのアミノ酸配列の相同性を比較することにより決定される。当該アミノ酸としては、例えばアラニンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０００９】
さらに、本発明において、「疎水性アミノ酸」としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン又はシステイン等を挙げることができる。そして、これらの中でも、イソロイシン、ロイシン、バリン又はフェニルアラニンは、疎水性値が高いという点で特に好ましいものとして挙げることができる。
【００１０】
野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行ない得る。
すなわち、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００１１】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異を野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。
【００１２】
紫外線照射を行なう場合においても、上記の通り常法に従うことができる（現代化学、ｐｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、サイト−スペシフィック ミュータジュネシス（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）として知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ９４４１−９４５６（１９８４）：Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ３５０−３６７（１９８７）：Ｂａｕｅｒ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ７３−８１（１９８５）），Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ８７４９−８７６４（１９８５）：Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ８７６５−８７８５（１９８５）：Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ９６７９−９６９８（１９８６））），Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄｓ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．８２，ｐｐ４８８−４９２（１９８５）：Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ３６７−３８２（１９８７））等が挙げられる。
【００１３】
なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の改変ホタルルシフェラーゼ遺伝子を合成し得ることはもちろんである。
上記方法により得られる所望のホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列の決定・確認は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法〔Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，ｖｏｌ．６５，ｐｐ４９９−５６０（１９８０）〕やＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ２６９−２７６（１９８２）〕等により行ない得る。
【００１４】
上述の如くして得られた耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換・形質導入をすることができる。
例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ ３３８７６）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１（ＡＴＣＣ ３３８４９）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ １０１（ＡＴＣＣ３３６９４）等を選択する場合には、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈａｎ）の方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）〕等により形質転換するか、あるいは「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第２５６〜２６８頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）」記載の方法等により形質導入することにより形質転換株あるいは形質導入株を得ることが可能である。
【００１５】
そして、上記菌株より耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエシェリシア属に属する菌株を得ることができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー（Ｐ．Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法〔ジェイ．バクテイオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０６４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・クレウェル（Ｄ．Ｂ．Ｃｌｅｗｅｌｌ）の方法〔ジェイ．バクテイオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕等により得ることができる。
【００１６】
そして、このようにして得られた組み換え体ＤＮＡより耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを温度３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で１〜２４時間、好ましくは２時間程度作用させて、反応終了液をアガロースゲル電気泳動法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）〕記載で処理することにより得ることができる。
【００１７】
上記のようにして得られた耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエシェリシア属に属する菌株を用いて耐熱性ホタルルシフェラーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【００１８】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００１９】
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間で、通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
培養終了後、培養物より耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。
【００２０】
例えば、常法により菌体を、超音波破砕処理、磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
【００２１】
上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得るには、例えばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマト法；分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またこれらを組合わせて実施することにより、精製された酵素標品を得ることが出来る。
【００２２】
このようにして、所望の耐熱性ホタルルシフェラーゼを得ることができる。そして、当該耐熱性ホタルルシフェラーゼのうち耐熱性ゲンジ及びヘイケボタルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、特開平１−１４１５９２号公報記載の野性型ゲンジボタルのルシフェラーゼ、又は特開平１−２６２７９１号公報記載の野性型ヘイケボタルのルシフェラーゼと同様である。
▲１▼作用適温の範囲：０〜６５℃である。
▲２▼ｐＨ、温度等による失活の条件：
ｉ）ｐＨ４．０以下はｐＨ１２．０以上で４時間後完全に失活する。
【００２３】
ｉｉ）ｐＨ７．８において温度６５℃、６０分間の熱処理により完全に失活する。
▲３▼熱安定性：温度５２℃、２０分間の処理で８０％以上の残存酵素活性を有し、温度５２℃、６０分間の処理でも６５％以上の残存酵素活性を有する。
▲４▼発光波長：６２０±５ｎｍ
また、当該耐熱性ホタルルシフェラーゼのうち耐熱性北米ボタルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、Ｄｅｌｕｃａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７２，３−１５（１９７８）記載の野生型北米ボタルのルシフェラーゼと同様である。
▲１▼温度等による失活の条件：
ｐＨ７．８において温度５５℃、６０分間の熱処理により完全に失活する。
▲２▼熱安定性：温度４０℃、２０分間及び６０分間の処理で夫々８０％以上及び６５％以上の残存酵素活性を有する。
▲３▼発光波長：６２０±５ｎｍ
【００２４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
（実施例）
なお、項目１及び２には、既に取得された耐熱性ヘイケボタルルシフェラーゼの３１５番目のＡｌａを疎水性アミノ酸残基に置換することにより、更なるルシフェラーゼの耐熱化を示した。
また、項目３には、野性型北米ボタルルシフェラーゼのヘイケボタルルシフェラーゼの３１５番目と同等位置である３１３番目のＡｌａを疎水性アミノ酸残基に置換して耐熱化を行なった例を示した。
【００２５】
１．組み換え体プラスミドｐＨＬｆ７ＤＮＡの変異
先ず、組み換え体ｐＨＬｆ７−２１７ＬｅｕＤＮＡ〔プラスミドｐＵＣ１１９ＤＮＡに２１７番目のＡｌａがＬｅｕに置換された耐熱変異のヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子（特開平５−２４４９４２号公報記載）が挿入されたもの。〕の１本鎖ＤＮＡをヘルパーファージＭ１３ Ｋ０７（宝酒造社・製）を用いて調製し、ＤＮＡＭｏｄｅｌ３９２シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて合成したオリゴヌクレオチドＳＬＦ１５（ＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＴ）とオリゴヌクレオチド−ダイレクティッド インビトロ ミュータジェネシス システム バージョン２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社・製）を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は変えずにルシフェラーゼ遺伝子の内部に存在するＥｃｏＲＩ部位を除去した組み換え体プラスミドｐＨＬｆ１０７ＤＮＡを得た。
【００２６】
組み換え体プラスミドｐＨＬｆ１０７ＤＮＡ３０μｇを、ヒドロキシルアミン溶液〔０．８Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）／１ｍＭＤＴＡ〕１００μＬに溶解し、６５℃で２時間変異処理したのち、常法によりエタノール沈澱を行ない沈澱物を回収した。この沈澱物をＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭＤＴＡ〕に溶解し、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈａｎ）の方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）〕により、大腸菌ＪＭ１０１株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（Ｗ／Ｖ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及び１．４％（Ｗ／Ｖ）寒天〕に接種し、３７℃で培養した。１２時間後、出現してきたコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（Ｗ／Ｖ）、及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）〕３ｍｌ中、３７℃で１８時間振盪培養を行なった。この培養液０．５ｍｌを１０ｍｌの上記ＬＢ−ａｍｐ培地に接種し、３７℃で４時間振盪培養したのち、８０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫々２０ｍｇずつ得た。
回収した菌体を、０．１０ＭＫＨ2ＰＯ4（pH7.8）、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジテオスレイトール、及び０．２ｍｇ／ｍｌプロタミン硫酸からなる緩衝液０．９ｍｌに懸濁し、更に、これに、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液１００μＬを添加し、氷中に１５分間放置した。次に、この懸濁液をメタノール、ドライアイス浴中で凍結し、次いで温度２５℃に放置し、完全に解凍した。更に、１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離操作を行なうことにより、上清として粗酵素１ｍｌを得た。
【００２７】
このようにして得られたルシフェラーゼを含む粗酵素液を５５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて、特開平１−１４１５９２号公報記載の方法で力価の測定を行なった。その結果２１７番目のＡｌａがＬｅｕに置換されている耐熱性ヘイケボタルルシフェラーゼ（以下、ＬｌＬ−２１７Ｌと略称する）より熱安定性に優れているものを得た。
更に、この粗酵素液を特開平１−１４１５９２号公報記載の方法で精製し、上記の方法で熱処理し、力価を測定した結果、ＬｌＬ−２１７Ｌより熱安定性に優れていことが判明した。以上の如くして新たに得られた耐熱性ルシフェラーゼをコードする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＨＬｆ１０７Ｖと命名し、該組み換え体プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｖ）は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６８６６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４５号より移管）として寄託されている。
【００２８】
なお、特開平５−２４４９４２号公報記載の方法によりｐＨＬｆ１０７ＶＤＮＡに含まれる変異ＬｌＬ−２１７Ｌ遺伝子の塩基配列の決定を行なったところ、このようにして得られた変異型ホタルルシフェラーゼはＬｌＬ−２１７Ｌのアミノ酸配列において３１５位のＡｌａがＶａｌに置換されていることが判明した。精製した本酵素１００キロカウント（Ｋｃｏｕｎｔ）含有する酵素液１００μｌ〔１００ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、２ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０％グリセリン、ｐＨ７．５〕を温度５５℃で３０分間保持して残存する酵素活性を測定した。その結果本酵素は上記条件で５．９％の残存酵素活性を保持していた。
なお、対照としてＬｌＬ−２１７Ｌについても上記と同様にして残存酵素活性を測定したところ残存酵素活性は１．１％であった。
【００２９】
２．部位特異的変換
次にＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のアラニンを疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換させる方法を記載する。
大腸菌ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７）にヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（宝酒造社製）を感染させることにより、メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法〔メソズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１０１巻、第２０〜７８項（１９８３）〕に従って１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖ＤＮＡによる部位特異的変換はインビトロ ミュータジェネシス システム バージョン２．０（アマシャム社製）を用いて行なった。なお、部位特異的変換のプライマーとして用いる為に、合成ＤＮＡＳＬＦ１２９（配列番号１記載）を合成した。なお、ＳＬＦ１２９内のｎがｇの場合ＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のＡｌａがＬｅｕに置換される。同様にｔの場合にはＩｌｅ、ａの場合にはＰｈｅに置換される。
【００３０】
また、部位特異的変換遺伝子のシークエンシングは、ダイプライマー タックシークェンシング キット（アプライド バイオシステムズ社製）を用いて反応を行ない、ＡＢＩ３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（アプライド バイオシステムズ社製）で泳動、解析を行なった。このようにして得られた部位特異的変換遺伝子は、ＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換さているアミノ酸配列をコードしており、夫々のプラスミドをｐＨＬｆ１０７Ｌ、ｐＨＬｆ１０７Ｉ及びｐＨＬｆ１０７Ｆと命名した。
【００３１】
これらのプラスミドを夫々保有する大腸菌ＪＭ１０１より項目１記載の方法により粗酵素液を得、更にこの粗酵素液を精製した。このようにして得られた精製ルシフェラーゼを、項目１記載の方法にて５５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて残存する酵素活性を測定したところ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｌ）由来ルシフェラーゼは、２．１％残存酵素活性を保持し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｉ）由来ルシフェラーゼは、５．１％残存酵素活性を保持し、また大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｆ）由来ルシフェラーゼは、２．１％残存酵素活性を保持した。いずれも対照のＬｌＬ−２１７Ｌの残存酵素活性１．１％を上回った。
【００３２】
３．組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３０１ＤＮＡの変異
次に北米ボタルのルシフェラーゼのヘイケボタルの３１５位と同等の位置の残基を疎水性アミノ酸であるバリン、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換させる方法を記載する。
北米ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬ）のアミノ酸配列において、ヘイケボタルルシフェラーゼ（ＬｌＬ）の３１５位のアミノ酸残基と同等の位置を見い出すために、ベックマン社製のアミノ酸相同性解析用ソフトＭｉｃｒｏ ＧｅｎｉｅTMを用いて両者のアミノ酸配列を解析したところ、ＰｐＬの３１３位のＡｌａがＬｌＬの３１５位に相当することが明らかになった。
組み換え体ＤＮＡプラスミドｐＴ３／Ｔ７−ＬＵＣ（東洋紡・社・製）〔野性型北米ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬ）の遺伝子を含有する〕よりＰｐＬ遺伝子を含有する１．９ＫｂのＢａｍＨＩを切り出し、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造社・製）のＢａｍＨＩ部位にＰｐＬ遺伝子の転写方向をラクトースプロモーターの転写方向と同じ向きに挿入した組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３０１を得た。
【００３３】
このようにして得られた大腸菌より項目２記載の方法で１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖ＤＮＡによる部位特異的変換は、インビトロ ミュータジェネシス システム バージョン−２．０（アマシャム社製）を用いて行なった。なお、部位特異的変換のプライマーとして用いる為に、以下の合成ＤＮＡＳＬＦ１２７（配列番号２記載）を合成した。なお、ＳＬＦ１２７内のｎがｃの場合，ＰｐＬの３１３番目のＡｌａがＶａｌに置換される。同様にｇの場合はＬｅｕ、ｔの場合はＩｌｅ，ａの場合はＰｈｅに置換される。
【００３４】
また、部位特異的変換遺伝子のシークエンシングは、ダイプライマータックシークエンシングキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行ない、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）で泳動解析を行なった。このようにして得られた組み換え体プラスミドにおけるルシフェラーゼの部位特異的変換遺伝子は、ＰｐＬの３１３番目のアミノ酸に相当する遺伝子部分がバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンに変換さているアミノ酸配列をコードしており、夫々ｐＡＬｆ３０３、ｐＡＬｆ３０４、ｐＡＬｆ３０６、ｐＡＬｆ３０５と命名した。
【００３５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＡＬｆ３０３）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４４号より移管）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。この形質転換体及び野性型ＰｐＬを生産する組み換え体ＪＭ１０１（ｐＡＬｆ３０１）より項目１記載の方法により粗酵素液を得、更に、この粗酵素液を精製した。このようにして得られた精製ルシフェラーゼを、項目１記載の緩衝液中、４５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて残存する酵素活性を測定したところ、野性型ＰｐＬが３．２％の残存活性しか示さなかったのに対し、３１３番目のＡｌａを夫々Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅに置換された変異型ＰｐＬは夫々５１．６％、９．１％、２４．４％、２９．１％の残存活性を示した。
上記より明らかな如く本発明は、対照に比し著しく耐熱性を有するルシフェラーゼであることが判った。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、この遺伝子を組み換え体ＤＮＡ及び該組み換え体ＤＮＡを含む微生物により耐熱性ホタルルシフェラーゼを製造する方法並びにそのようにして得られた新規な耐熱性ホタルルシフェラーゼが提供された。そして、本発明の方法により、耐熱性ホタルルシフェラーゼを効率よく生産することができるので、本発明は産業上極めて有用である。
【００３７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KIKKOMAN CORPORATION
<120> THERMOSTABLE LUCIFERASE OF FIREFLY, THERMOSTABLE LUCIFERASE GENE OF FIREFLY,NOVEL RECOMBINANT DNA, AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF THERMOSTABLE LUCIFERASE OF FIREFLY
<130> P2036
<160> 2
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gataaaggag ctccgccaga aanaatttca actaaatttg 40
【００３８】
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaggtgcacc cccagaaana atttcgtgta aattaga 37
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ルシフェラーゼは、発光素であるルシフェリンの酸化を触媒して、これを発光させる発光酵素である。そして、ルシフェリンの発光の際にＡＴＰ等の物質を必要とする、ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米ボタル等由来のホタルのルシフェラーゼは、当該性質に基づいて、上記ＡＴＰ等の微量定量に利用されている。
【０００３】
しかしながら、一般的にルシフェラーゼは、熱に対して不安定なため、試薬として保存する際に失活しやすいという欠点を有する。かかる欠点を克服するための手段の一つとして、試薬に塩等を添加して、ある程度ルシフェラーゼを安定に保存することは可能である。しかし、この場合にも、ルシフェラーゼの塩による反応障害が惹起されがちであるという欠点が存在する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者等は、耐熱性ホタルルシフェラーゼを開発することを主たる課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題について鋭意検討した結果、野性型ホタルルシフェラーゼにおける特定のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に変換することにより、上記課題を解決し得ることを見出した。
すなわち、本願は、以下の発明を提供するものである。
（１）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（２）野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタルのルシフェラーゼである（１）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（３）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリン若しくはフェニルアラニンである（１）又は（２）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（４）（１）又は（２）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
（５）（４）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。
（６）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、３１３位のアミノ酸、又は北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
（７）野生型ホタルルシフェラーゼが北米ボタルのルシフェラーゼである（６）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
（８）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、２１７及び３１５位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（９）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである（８）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（１０）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリン若しくはフェニルアラニンである（８）又は（９）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（１１）（８）又は（９）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
（１２）（１１）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。
（１３）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、２１７及び３１５位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
（１４）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである（１３）記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明における遺伝子の改変による耐熱性ルシフェラーゼが提供される前提として、野性型のホタルのルシフェラーゼ遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡを調製することが必要である。
野性型ホタルの遺伝子等の種類は、提供が企図される耐熱性ルシフェラーゼ遺伝子の種類に応じて用いられる。そして、ホタル由来のものであれば、如何なるものでも用いることが可能であり、例えば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米ボタル等由来のものを用いることが可能である。
【０００７】
これらの遺伝子等は、既に公知の方法に従って調製される。例えば、野性型ゲンジボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは、特開平１−５１０８６号公報に記載の方法により調製することが可能であり、また、ヘイケボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは、特公平７−１１２４３４号公報に記載の方法により調製することが可能であり、また更に、北米ボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは、東洋紡績（株）より購入することが可能である。
本発明において、「北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位と同等位置のアミノ酸」とは、確定したルシフェラーゼのアミノ酸配列を、北米ボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、北米ボタルのルシフェラーゼの３１３位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。
また本発明において、「ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位と同等位置のアミノ酸」とは、確定したルシフェラーゼのアミノ酸配列を、ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７及び３１５位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。
【０００８】
具体的には、既製のアミノ酸の相同性の解析用ソフト、例えばＭｉｃｒｏ ＧｅｎｉｅTM（ベックマン社製）により、各々のルシフェラーゼのアミノ酸配列とゲンジボタル若しくはヘイケボタルのアミノ酸配列の相同性を比較することにより決定される。当該アミノ酸としては、例えばアラニンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０００９】
さらに、本発明において、「疎水性アミノ酸」としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン又はシステイン等を挙げることができる。そして、これらの中でも、イソロイシン、ロイシン、バリン又はフェニルアラニンは、疎水性値が高いという点で特に好ましいものとして挙げることができる。
【００１０】
野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行ない得る。
すなわち、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００１１】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異を野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。
【００１２】
紫外線照射を行なう場合においても、上記の通り常法に従うことができる（現代化学、ｐｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、サイト−スペシフィック ミュータジュネシス（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）として知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ９４４１−９４５６（１９８４）：Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ３５０−３６７（１９８７）：Ｂａｕｅｒ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ７３−８１（１９８５）），Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ８７４９−８７６４（１９８５）：Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ８７６５−８７８５（１９８５）：Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ９６７９−９６９８（１９８６））），Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄｓ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．８２，ｐｐ４８８−４９２（１９８５）：Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ３６７−３８２（１９８７））等が挙げられる。
【００１３】
なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の改変ホタルルシフェラーゼ遺伝子を合成し得ることはもちろんである。
上記方法により得られる所望のホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列の決定・確認は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法〔Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，ｖｏｌ．６５，ｐｐ４９９−５６０（１９８０）〕やＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ２６９−２７６（１９８２）〕等により行ない得る。
【００１４】
上述の如くして得られた耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換・形質導入をすることができる。
例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ ３３８７６）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１（ＡＴＣＣ ３３８４９）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ １０１（ＡＴＣＣ３３６９４）等を選択する場合には、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈａｎ）の方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）〕等により形質転換するか、あるいは「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第２５６〜２６８頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）」記載の方法等により形質導入することにより形質転換株あるいは形質導入株を得ることが可能である。
【００１５】
そして、上記菌株より耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエシェリシア属に属する菌株を得ることができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー（Ｐ．Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法〔ジェイ．バクテイオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０６４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・クレウェル（Ｄ．Ｂ．Ｃｌｅｗｅｌｌ）の方法〔ジェイ．バクテイオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕等により得ることができる。
【００１６】
そして、このようにして得られた組み換え体ＤＮＡより耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを温度３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で１〜２４時間、好ましくは２時間程度作用させて、反応終了液をアガロースゲル電気泳動法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）〕記載で処理することにより得ることができる。
【００１７】
上記のようにして得られた耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエシェリシア属に属する菌株を用いて耐熱性ホタルルシフェラーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【００１８】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００１９】
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間で、通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
培養終了後、培養物より耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。
【００２０】
例えば、常法により菌体を、超音波破砕処理、磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
【００２１】
上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得るには、例えばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマト法；分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またこれらを組合わせて実施することにより、精製された酵素標品を得ることが出来る。
【００２２】
このようにして、所望の耐熱性ホタルルシフェラーゼを得ることができる。そして、当該耐熱性ホタルルシフェラーゼのうち耐熱性ゲンジ及びヘイケボタルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、特開平１−１４１５９２号公報記載の野性型ゲンジボタルのルシフェラーゼ、又は特開平１−２６２７９１号公報記載の野性型ヘイケボタルのルシフェラーゼと同様である。
▲１▼作用適温の範囲：０〜６５℃である。
▲２▼ｐＨ、温度等による失活の条件：
ｉ）ｐＨ４．０以下はｐＨ１２．０以上で４時間後完全に失活する。
【００２３】
ｉｉ）ｐＨ７．８において温度６５℃、６０分間の熱処理により完全に失活する。
▲３▼熱安定性：温度５２℃、２０分間の処理で８０％以上の残存酵素活性を有し、温度５２℃、６０分間の処理でも６５％以上の残存酵素活性を有する。
▲４▼発光波長：６２０±５ｎｍ
また、当該耐熱性ホタルルシフェラーゼのうち耐熱性北米ボタルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、Ｄｅｌｕｃａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７２，３−１５（１９７８）記載の野生型北米ボタルのルシフェラーゼと同様である。
▲１▼温度等による失活の条件：
ｐＨ７．８において温度５５℃、６０分間の熱処理により完全に失活する。
▲２▼熱安定性：温度４０℃、２０分間及び６０分間の処理で夫々８０％以上及び６５％以上の残存酵素活性を有する。
▲３▼発光波長：６２０±５ｎｍ
【００２４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
（実施例）
なお、項目１及び２には、既に取得された耐熱性ヘイケボタルルシフェラーゼの３１５番目のＡｌａを疎水性アミノ酸残基に置換することにより、更なるルシフェラーゼの耐熱化を示した。
また、項目３には、野性型北米ボタルルシフェラーゼのヘイケボタルルシフェラーゼの３１５番目と同等位置である３１３番目のＡｌａを疎水性アミノ酸残基に置換して耐熱化を行なった例を示した。
【００２５】
１．組み換え体プラスミドｐＨＬｆ７ＤＮＡの変異
先ず、組み換え体ｐＨＬｆ７−２１７ＬｅｕＤＮＡ〔プラスミドｐＵＣ１１９ＤＮＡに２１７番目のＡｌａがＬｅｕに置換された耐熱変異のヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子（特開平５−２４４９４２号公報記載）が挿入されたもの。〕の１本鎖ＤＮＡをヘルパーファージＭ１３ Ｋ０７（宝酒造社・製）を用いて調製し、ＤＮＡＭｏｄｅｌ３９２シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて合成したオリゴヌクレオチドＳＬＦ１５（ＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＴ）とオリゴヌクレオチド−ダイレクティッド インビトロ ミュータジェネシス システム バージョン２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社・製）を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は変えずにルシフェラーゼ遺伝子の内部に存在するＥｃｏＲＩ部位を除去した組み換え体プラスミドｐＨＬｆ１０７ＤＮＡを得た。
【００２６】
組み換え体プラスミドｐＨＬｆ１０７ＤＮＡ３０μｇを、ヒドロキシルアミン溶液〔０．８Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）／１ｍＭＤＴＡ〕１００μＬに溶解し、６５℃で２時間変異処理したのち、常法によりエタノール沈澱を行ない沈澱物を回収した。この沈澱物をＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭＤＴＡ〕に溶解し、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈａｎ）の方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）〕により、大腸菌ＪＭ１０１株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（Ｗ／Ｖ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及び１．４％（Ｗ／Ｖ）寒天〕に接種し、３７℃で培養した。１２時間後、出現してきたコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（Ｗ／Ｖ）、及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）〕３ｍｌ中、３７℃で１８時間振盪培養を行なった。この培養液０．５ｍｌを１０ｍｌの上記ＬＢ−ａｍｐ培地に接種し、３７℃で４時間振盪培養したのち、８０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫々２０ｍｇずつ得た。
回収した菌体を、０．１０ＭＫＨ2ＰＯ4（pH7.8）、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジテオスレイトール、及び０．２ｍｇ／ｍｌプロタミン硫酸からなる緩衝液０．９ｍｌに懸濁し、更に、これに、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液１００μＬを添加し、氷中に１５分間放置した。次に、この懸濁液をメタノール、ドライアイス浴中で凍結し、次いで温度２５℃に放置し、完全に解凍した。更に、１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離操作を行なうことにより、上清として粗酵素１ｍｌを得た。
【００２７】
このようにして得られたルシフェラーゼを含む粗酵素液を５５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて、特開平１−１４１５９２号公報記載の方法で力価の測定を行なった。その結果２１７番目のＡｌａがＬｅｕに置換されている耐熱性ヘイケボタルルシフェラーゼ（以下、ＬｌＬ−２１７Ｌと略称する）より熱安定性に優れているものを得た。
更に、この粗酵素液を特開平１−１４１５９２号公報記載の方法で精製し、上記の方法で熱処理し、力価を測定した結果、ＬｌＬ−２１７Ｌより熱安定性に優れていことが判明した。以上の如くして新たに得られた耐熱性ルシフェラーゼをコードする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＨＬｆ１０７Ｖと命名し、該組み換え体プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｖ）は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６８６６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４５号より移管）として寄託されている。
【００２８】
なお、特開平５−２４４９４２号公報記載の方法によりｐＨＬｆ１０７ＶＤＮＡに含まれる変異ＬｌＬ−２１７Ｌ遺伝子の塩基配列の決定を行なったところ、このようにして得られた変異型ホタルルシフェラーゼはＬｌＬ−２１７Ｌのアミノ酸配列において３１５位のＡｌａがＶａｌに置換されていることが判明した。精製した本酵素１００キロカウント（Ｋｃｏｕｎｔ）含有する酵素液１００μｌ〔１００ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、２ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０％グリセリン、ｐＨ７．５〕を温度５５℃で３０分間保持して残存する酵素活性を測定した。その結果本酵素は上記条件で５．９％の残存酵素活性を保持していた。
なお、対照としてＬｌＬ−２１７Ｌについても上記と同様にして残存酵素活性を測定したところ残存酵素活性は１．１％であった。
【００２９】
２．部位特異的変換
次にＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のアラニンを疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換させる方法を記載する。
大腸菌ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７）にヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（宝酒造社製）を感染させることにより、メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法〔メソズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１０１巻、第２０〜７８項（１９８３）〕に従って１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖ＤＮＡによる部位特異的変換はインビトロ ミュータジェネシス システム バージョン２．０（アマシャム社製）を用いて行なった。なお、部位特異的変換のプライマーとして用いる為に、合成ＤＮＡＳＬＦ１２９（配列番号１記載）を合成した。なお、ＳＬＦ１２９内のｎがｇの場合ＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のＡｌａがＬｅｕに置換される。同様にｔの場合にはＩｌｅ、ａの場合にはＰｈｅに置換される。
【００３０】
また、部位特異的変換遺伝子のシークエンシングは、ダイプライマー タックシークェンシング キット（アプライド バイオシステムズ社製）を用いて反応を行ない、ＡＢＩ３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（アプライド バイオシステムズ社製）で泳動、解析を行なった。このようにして得られた部位特異的変換遺伝子は、ＬｌＬ−２１７Ｌの３１５番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換さているアミノ酸配列をコードしており、夫々のプラスミドをｐＨＬｆ１０７Ｌ、ｐＨＬｆ１０７Ｉ及びｐＨＬｆ１０７Ｆと命名した。
【００３１】
これらのプラスミドを夫々保有する大腸菌ＪＭ１０１より項目１記載の方法により粗酵素液を得、更にこの粗酵素液を精製した。このようにして得られた精製ルシフェラーゼを、項目１記載の方法にて５５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて残存する酵素活性を測定したところ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｌ）由来ルシフェラーゼは、２．１％残存酵素活性を保持し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｉ）由来ルシフェラーゼは、５．１％残存酵素活性を保持し、また大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＨＬｆ１０７Ｆ）由来ルシフェラーゼは、２．１％残存酵素活性を保持した。いずれも対照のＬｌＬ−２１７Ｌの残存酵素活性１．１％を上回った。
【００３２】
３．組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３０１ＤＮＡの変異
次に北米ボタルのルシフェラーゼのヘイケボタルの３１５位と同等の位置の残基を疎水性アミノ酸であるバリン、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換させる方法を記載する。
北米ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬ）のアミノ酸配列において、ヘイケボタルルシフェラーゼ（ＬｌＬ）の３１５位のアミノ酸残基と同等の位置を見い出すために、ベックマン社製のアミノ酸相同性解析用ソフトＭｉｃｒｏ ＧｅｎｉｅTMを用いて両者のアミノ酸配列を解析したところ、ＰｐＬの３１３位のＡｌａがＬｌＬの３１５位に相当することが明らかになった。
組み換え体ＤＮＡプラスミドｐＴ３／Ｔ７−ＬＵＣ（東洋紡・社・製）〔野性型北米ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬ）の遺伝子を含有する〕よりＰｐＬ遺伝子を含有する１．９ＫｂのＢａｍＨＩを切り出し、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造社・製）のＢａｍＨＩ部位にＰｐＬ遺伝子の転写方向をラクトースプロモーターの転写方向と同じ向きに挿入した組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３０１を得た。
【００３３】
このようにして得られた大腸菌より項目２記載の方法で１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖ＤＮＡによる部位特異的変換は、インビトロ ミュータジェネシス システム バージョン−２．０（アマシャム社製）を用いて行なった。なお、部位特異的変換のプライマーとして用いる為に、以下の合成ＤＮＡＳＬＦ１２７（配列番号２記載）を合成した。なお、ＳＬＦ１２７内のｎがｃの場合，ＰｐＬの３１３番目のＡｌａがＶａｌに置換される。同様にｇの場合はＬｅｕ、ｔの場合はＩｌｅ，ａの場合はＰｈｅに置換される。
【００３４】
また、部位特異的変換遺伝子のシークエンシングは、ダイプライマータックシークエンシングキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行ない、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）で泳動解析を行なった。このようにして得られた組み換え体プラスミドにおけるルシフェラーゼの部位特異的変換遺伝子は、ＰｐＬの３１３番目のアミノ酸に相当する遺伝子部分がバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンに変換さているアミノ酸配列をコードしており、夫々ｐＡＬｆ３０３、ｐＡＬｆ３０４、ｐＡＬｆ３０６、ｐＡＬｆ３０５と命名した。
【００３５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１（ｐＡＬｆ３０３）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３４４号より移管）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。この形質転換体及び野性型ＰｐＬを生産する組み換え体ＪＭ１０１（ｐＡＬｆ３０１）より項目１記載の方法により粗酵素液を得、更に、この粗酵素液を精製した。このようにして得られた精製ルシフェラーゼを、項目１記載の緩衝液中、４５℃で３０分間熱処理し、その中の１０μｌについて残存する酵素活性を測定したところ、野性型ＰｐＬが３．２％の残存活性しか示さなかったのに対し、３１３番目のＡｌａを夫々Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅに置換された変異型ＰｐＬは夫々５１．６％、９．１％、２４．４％、２９．１％の残存活性を示した。
上記より明らかな如く本発明は、対照に比し著しく耐熱性を有するルシフェラーゼであることが判った。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、この遺伝子を組み換え体ＤＮＡ及び該組み換え体ＤＮＡを含む微生物により耐熱性ホタルルシフェラーゼを製造する方法並びにそのようにして得られた新規な耐熱性ホタルルシフェラーゼが提供された。そして、本発明の方法により、耐熱性ホタルルシフェラーゼを効率よく生産することができるので、本発明は産業上極めて有用である。
【００３７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KIKKOMAN CORPORATION
<120> THERMOSTABLE LUCIFERASE OF FIREFLY, THERMOSTABLE LUCIFERASE GENE OF FIREFLY,NOVEL RECOMBINANT DNA, AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF THERMOSTABLE LUCIFERASE OF FIREFLY
<130> P2036
<160> 2
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gataaaggag ctccgccaga aanaatttca actaaatttg 40
【００３８】
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaggtgcacc cccagaaana atttcgtgta aattaga 37
Claims (4)
- 北米ボタルルシフェラーゼの３１３位のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン、バリン若しくはフェニルアラニンに変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
- 請求項１記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
- 請求項２記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。
- 北米ボタルルシフェラーゼの３１３位のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン、バリン若しくはフェニルアラニンに変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
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