JP3048466B2 - 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 - Google Patents
耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、耐熱性ホタルルシフェ
ラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組
み換え体ＤＮＡ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造
法に関する。
ラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組
み換え体ＤＮＡ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ルシフェラーゼは、発光素であるルシフ
ェリンの酸化を触媒して、これを発光させる発光酵素で
ある。そして、ルシフェリンの発光の際にＡＴＰ等の物
質を必要とする、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリ
カボタル等由来のホタルのルシフェラーゼは、当該性質
に基づいて、上記ＡＴＰ等の微量定量に利用されてい
る。
ェリンの酸化を触媒して、これを発光させる発光酵素で
ある。そして、ルシフェリンの発光の際にＡＴＰ等の物
質を必要とする、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリ
カボタル等由来のホタルのルシフェラーゼは、当該性質
に基づいて、上記ＡＴＰ等の微量定量に利用されてい
る。
【０００３】しかしながら、一般的にルシフェラーゼ
は、熱に対して不安定なため、試薬として保存する際に
失活しやすいという欠点を有する。かかる欠点を克服す
るための手段の一つとして、試薬に塩等を添加して、あ
る程度ルシフェラーゼを安定に保存することは可能であ
る。しかし、この場合にも、ルシフェラーゼの塩による
反応障害が惹起され勝ちであるという欠点が存在する。
は、熱に対して不安定なため、試薬として保存する際に
失活しやすいという欠点を有する。かかる欠点を克服す
るための手段の一つとして、試薬に塩等を添加して、あ
る程度ルシフェラーゼを安定に保存することは可能であ
る。しかし、この場合にも、ルシフェラーゼの塩による
反応障害が惹起され勝ちであるという欠点が存在する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、耐
熱性を有するホタルルシフェラーゼを開発することを主
たる課題とする。
熱性を有するホタルルシフェラーゼを開発することを主
たる課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
ついて鋭意検討した結果、野生型ホタルルシフェラーゼ
における特定のアミノ酸残基を特定の疎水性アミノ酸残
基に変換することにより、上記課題を解決し得ることを
見出した。すなわち、本願は、以下の発明を提供するも
のである。 （１）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、２１７位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくは
ヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７位と同等位置の
アミノ酸が疎水性アミノ酸（アラニンを除く）に変異さ
れているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子。 （２）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若し
くはゲンジボタルのルシフェラーゼである（１）記載の
耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 （３）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、若し
くはバリンである（１）又は（２）記載のホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子。 （４）（１）又は（２）記載の耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とす
る組み換え体ＤＮＡ。 （５）（４）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタル
ルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼの製造法。 （６）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、２１７位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくは
ヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７位と同等位置の
アミノ酸が疎水性アミノ酸（アラニンを除く）に変異さ
れていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラー
ゼ。 （７）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若し
くはゲンジボタルのルシフェラーゼである（６）記載の
耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
ついて鋭意検討した結果、野生型ホタルルシフェラーゼ
における特定のアミノ酸残基を特定の疎水性アミノ酸残
基に変換することにより、上記課題を解決し得ることを
見出した。すなわち、本願は、以下の発明を提供するも
のである。 （１）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、２１７位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくは
ヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７位と同等位置の
アミノ酸が疎水性アミノ酸（アラニンを除く）に変異さ
れているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子。 （２）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若し
くはゲンジボタルのルシフェラーゼである（１）記載の
耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 （３）疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、若し
くはバリンである（１）又は（２）記載のホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子。 （４）（１）又は（２）記載の耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とす
る組み換え体ＤＮＡ。 （５）（４）記載の組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタル
ルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼの製造法。 （６）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、２１７位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくは
ヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７位と同等位置の
アミノ酸が疎水性アミノ酸（アラニンを除く）に変異さ
れていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラー
ゼ。 （７）野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若し
くはゲンジボタルのルシフェラーゼである（６）記載の
耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
【０００６】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明における遺伝子の改変による耐熱性ルシフェラーゼ
が提供される前提として、野生型のホタルの遺伝子及び
その組み換え体ＤＮＡを調製することが必要である。野
生型ホタルの遺伝子等の種類は、提供が企図される耐熱
性ルシフェラーゼ遺伝子の種類に応じて用いられる。そ
して、ホタル由来のものであれば、如何なるものでも用
いることが可能であり、例えば、ゲンジボタル、ヘイケ
ボタル等由来のものを用いることが可能である。
発明における遺伝子の改変による耐熱性ルシフェラーゼ
が提供される前提として、野生型のホタルの遺伝子及び
その組み換え体ＤＮＡを調製することが必要である。野
生型ホタルの遺伝子等の種類は、提供が企図される耐熱
性ルシフェラーゼ遺伝子の種類に応じて用いられる。そ
して、ホタル由来のものであれば、如何なるものでも用
いることが可能であり、例えば、ゲンジボタル、ヘイケ
ボタル等由来のものを用いることが可能である。
【０００７】これらの遺伝子等は、すでに公知の方法に
従って調製される。例えば、野生型ゲンジボタル遺伝子
及びその組み換え体ＤＮＡは、特開平１-51086号公報に
記載の方法により調製することが可能である。本発明に
おいて、「ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフ
ェラーゼの217位と同等位置のアミノ酸」とは、確定し
たルシフェラーゼのアミノ酸配列をゲンジボタル若しく
はヘイケボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列を比較
した場合に、ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシ
フェラーゼの217位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意
味するものである。
従って調製される。例えば、野生型ゲンジボタル遺伝子
及びその組み換え体ＤＮＡは、特開平１-51086号公報に
記載の方法により調製することが可能である。本発明に
おいて、「ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフ
ェラーゼの217位と同等位置のアミノ酸」とは、確定し
たルシフェラーゼのアミノ酸配列をゲンジボタル若しく
はヘイケボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列を比較
した場合に、ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシ
フェラーゼの217位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意
味するものである。
【０００８】具体的には、既製のアミノ酸の相同性の解
析用ソフト、例えば、Micro GenieT M（ベックマン社
製）により、各々のルシフェラーゼのアミノ酸配列とゲ
ンジボタル若しくはヘイケボタルのアミノ酸配列の相同
性を比較することにより決定される。当該アミノ酸とし
ては、例えば、スレオニン若しくはアラニンが挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。
析用ソフト、例えば、Micro GenieT M（ベックマン社
製）により、各々のルシフェラーゼのアミノ酸配列とゲ
ンジボタル若しくはヘイケボタルのアミノ酸配列の相同
性を比較することにより決定される。当該アミノ酸とし
ては、例えば、スレオニン若しくはアラニンが挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。
【０００９】さらに、本発明において、「疎水性アミノ
酸」としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチ
オニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリ
ン、システイン等を挙げることができる。そして、これ
らの中でも、イソロイシン、ロイシン、又はバリンは、
疎水性値が高いという点で特に好ましいものとして挙げ
ることができる。
酸」としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチ
オニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリ
ン、システイン等を挙げることができる。そして、これ
らの中でも、イソロイシン、ロイシン、又はバリンは、
疎水性値が高いという点で特に好ましいものとして挙げ
ることができる。
【００１０】野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の変異
処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行
ない得る。すなわち、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝
子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡ
と変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線
照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆
使する方法等を広く用いることができる。
処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行
ない得る。すなわち、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝
子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡ
と変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線
照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆
使する方法等を広く用いることができる。
【００１１】上記変異処理に用いられる変異原となる薬
剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル
−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、
亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシ
ル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件
は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能
であり、現実に所望の変異を野生型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定さ
れない。通常、好ましくは0.５〜12Ｍの上記薬剤濃度に
おいて、20〜80℃の反応温度下で10分間以上、好ましく
は10〜180分間接触・作用させることで、所望の変異を
惹起可能である。
剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル
−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、
亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシ
ル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件
は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能
であり、現実に所望の変異を野生型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定さ
れない。通常、好ましくは0.５〜12Ｍの上記薬剤濃度に
おいて、20〜80℃の反応温度下で10分間以上、好ましく
は10〜180分間接触・作用させることで、所望の変異を
惹起可能である。
【００１２】紫外線照射を行なう場合においても、上記
の通り常法に従うことができる（現代化学、pp24〜30、
1989年６月号）。蛋白質工学的手法を駆使する方法とし
ては、一般的に、サイト−スペシフィック ミュータジ
ェネシス (Site-Specific Mutagenesis)として知られる
手法を用いることができる。例えば、Kramer法（Krame
r, W. et al., Nucleic Acids Res, vol.12, pp9441-94
56 （1984）：Kramer, W. et al., Methods Enzymol, v
ol.154, pp350-367（1987）：Bauer, C. E. et al., Ge
ne, vol.37, pp73-81 (1985)), Eckstein法（Taylor,
J. W. et al., Nucleic Acids Res, vol.13, pp.8749-8
764 (1985)：Taylor, J. W. et al., Nucleic Acids Re
s, vol.13, 8765-8785(1985) ：Nakamaye, K. L. et a
l., Nucleic Acids Res, vol.14, pp.9679-9698 (198
6)) 、Kunkel法（Kunkel. T. A., Proc. Natl. Acid. S
ci. U.S.A., vol.82, pp488-492 (1985)：Kunkel. T.
A. et al., Methods Enzymol, vol.154, pp.367-382 (1
987))等が挙げられる。
の通り常法に従うことができる（現代化学、pp24〜30、
1989年６月号）。蛋白質工学的手法を駆使する方法とし
ては、一般的に、サイト−スペシフィック ミュータジ
ェネシス (Site-Specific Mutagenesis)として知られる
手法を用いることができる。例えば、Kramer法（Krame
r, W. et al., Nucleic Acids Res, vol.12, pp9441-94
56 （1984）：Kramer, W. et al., Methods Enzymol, v
ol.154, pp350-367（1987）：Bauer, C. E. et al., Ge
ne, vol.37, pp73-81 (1985)), Eckstein法（Taylor,
J. W. et al., Nucleic Acids Res, vol.13, pp.8749-8
764 (1985)：Taylor, J. W. et al., Nucleic Acids Re
s, vol.13, 8765-8785(1985) ：Nakamaye, K. L. et a
l., Nucleic Acids Res, vol.14, pp.9679-9698 (198
6)) 、Kunkel法（Kunkel. T. A., Proc. Natl. Acid. S
ci. U.S.A., vol.82, pp488-492 (1985)：Kunkel. T.
A. et al., Methods Enzymol, vol.154, pp.367-382 (1
987))等が挙げられる。
【００１３】なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成
法又は酵素合成法により、直接所望の改変ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子を合成し得ることはもちろんである。上
記方法により得られる所望のホタルルシフェラーゼ遺伝
子の塩基配列の決定・確認は、例えばマキサム−ギルバ
ートの化学修飾法〔Maxam-Gilbert, Meth.Enzym., vol.
65, pp.499-560(1980）〕やＭ13ファージを用いるジデ
オキシヌクレオチド鎮終結法〔Messing et al., Gene,
vol. 19., pp.269-276(1982)〕等により行ない得る。
法又は酵素合成法により、直接所望の改変ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子を合成し得ることはもちろんである。上
記方法により得られる所望のホタルルシフェラーゼ遺伝
子の塩基配列の決定・確認は、例えばマキサム−ギルバ
ートの化学修飾法〔Maxam-Gilbert, Meth.Enzym., vol.
65, pp.499-560(1980）〕やＭ13ファージを用いるジデ
オキシヌクレオチド鎮終結法〔Messing et al., Gene,
vol. 19., pp.269-276(1982)〕等により行ない得る。
【００１４】上述の如くして得られた耐熱性ホタルルシ
フェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファー
ジ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転
換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各
々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換・
形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エ
ッシェリア属に属する微生物、例えば大腸菌（E.coli）
JM101 (ATCC 33876)、大腸菌（E.coli）DH１（ATCC 338
49）、大腸菌（E.coli）HB 101（ATCC 33694）等を選択
する場合には、ハナハン（Hana-han）の方法〔ディーエ
ヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Cloning）、第１巻、第
109〜135頁（1985）〕等により形質転換するか、あるい
は「モレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g)、第256〜268頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory) (198
2）」記載の方法等により形質導入することにより形質
転換株あるいは形質導入株を得ることが可能である。
フェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファー
ジ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転
換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各
々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換・
形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エ
ッシェリア属に属する微生物、例えば大腸菌（E.coli）
JM101 (ATCC 33876)、大腸菌（E.coli）DH１（ATCC 338
49）、大腸菌（E.coli）HB 101（ATCC 33694）等を選択
する場合には、ハナハン（Hana-han）の方法〔ディーエ
ヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Cloning）、第１巻、第
109〜135頁（1985）〕等により形質転換するか、あるい
は「モレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g)、第256〜268頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory) (198
2）」記載の方法等により形質導入することにより形質
転換株あるいは形質導入株を得ることが可能である。
【００１５】そして、上記菌株より耐熱性ホタルルシフ
ェラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすること
により、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクター
ＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属
する菌株を得ることができる。このようにして得られた
菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るに
は、例えばピー・グーリー(P.Guerry)等の方法〔ジェ
イ. バクテリオロジー(J.Bacteriology) 第116巻、第10
64〜1066頁（1973年) 〕、デー・ビー・クレウェル(D.
B.Clewell)の方法〔ジェイ. バクテリオロジー（J.Bact
eriology）第110巻、第667〜676頁(1972年）〕、などに
より得ることができる。
ェラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすること
により、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクター
ＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属
する菌株を得ることができる。このようにして得られた
菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るに
は、例えばピー・グーリー(P.Guerry)等の方法〔ジェ
イ. バクテリオロジー(J.Bacteriology) 第116巻、第10
64〜1066頁（1973年) 〕、デー・ビー・クレウェル(D.
B.Clewell)の方法〔ジェイ. バクテリオロジー（J.Bact
eriology）第110巻、第667〜676頁(1972年）〕、などに
より得ることができる。
【００１６】そして、このようにして得られた組み換え
体ＤＮＡより耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有
するＤＮＡを得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに
制限酵素、例えばEcoRI及びPstＩを温度30〜40℃、好ま
しくは37℃程度で１〜24時間、好ましくは２時間程度作
用させて、反応終了液をアガロースゲル電気泳動法〔モ
レキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、第150
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー (Co
ld Spring Harbor Laboratory)(1982)記載で処理するこ
とにより得ることができる。
体ＤＮＡより耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有
するＤＮＡを得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに
制限酵素、例えばEcoRI及びPstＩを温度30〜40℃、好ま
しくは37℃程度で１〜24時間、好ましくは２時間程度作
用させて、反応終了液をアガロースゲル電気泳動法〔モ
レキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、第150
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー (Co
ld Spring Harbor Laboratory)(1982)記載で処理するこ
とにより得ることができる。
【００１７】上記のようにして得られた耐熱性ホタルル
シフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能
を有するエッシェリシア属に属する菌株を用いて耐熱性
ホタルルシフェラーゼを生産するには、この菌株を通常
の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養
法を採用して培養するのが好ましい。
シフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能
を有するエッシェリシア属に属する菌株を用いて耐熱性
ホタルルシフェラーゼを生産するには、この菌株を通常
の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養
法を採用して培養するのが好ましい。
【００１８】また、上記菌株を培養する培地としては、
例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、
コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふす
まの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、
リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あ
るいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したも
のが用いられる。
例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、
コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふす
まの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、
リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あ
るいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したも
のが用いられる。
【００１９】なお、培地の初発 pＨは、 pＨ７〜９に調
整するのが適当である。また培養は30〜42℃、好ましく
は37℃前後で４〜24時間、好ましくは６〜８時間で、通
気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施する
のが好ましい。培養終了後、該培養物より耐熱性ホタル
ルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を
用いて得ることができる。
整するのが適当である。また培養は30〜42℃、好ましく
は37℃前後で４〜24時間、好ましくは６〜８時間で、通
気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施する
のが好ましい。培養終了後、該培養物より耐熱性ホタル
ルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を
用いて得ることができる。
【００２０】例えば、常法により菌体を、超音波破壊処
理、磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶菌
酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の
存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行わせ本酵素
を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液
を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要によ
りストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸
マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、ア
ルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取
し、粗酵素を得る。
理、磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶菌
酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の
存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行わせ本酵素
を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液
を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要によ
りストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸
マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、ア
ルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取
し、粗酵素を得る。
【００２１】上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得る
には、例えばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバ
イオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる
吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳
動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖
密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマト法；
分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適
宜選択し、またこれらを組合わせて実施することによ
り、精製された酵素標品を得ることが出来る。
には、例えばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバ
イオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる
吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳
動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖
密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマト法；
分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適
宜選択し、またこれらを組合わせて実施することによ
り、精製された酵素標品を得ることが出来る。
【００２２】このようにして、所望の耐熱性ホタルルシ
フェラーゼを得ることができる。そして、当該耐熱性ホ
タルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、特開平
1-141592号公報記載の野性型ゲンジボタルのルシフェラ
ーゼ、又は特開平1-262791号公報記載のヘイケボタルの
ルシフェラーゼと同様である。 作用適温の範囲：０〜65℃である。 pＨ、温度等による失活の条件： ｉ） pＨ4.0 以下又は pＨ12.0以上で４時間後完全に失
活する。
フェラーゼを得ることができる。そして、当該耐熱性ホ
タルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、特開平
1-141592号公報記載の野性型ゲンジボタルのルシフェラ
ーゼ、又は特開平1-262791号公報記載のヘイケボタルの
ルシフェラーゼと同様である。 作用適温の範囲：０〜65℃である。 pＨ、温度等による失活の条件： ｉ） pＨ4.0 以下又は pＨ12.0以上で４時間後完全に失
活する。
【００２３】ii） pＨ7.8 において温度65℃、60分間の
熱処理により完全に失活する。 熱安定性：温度50℃、20分間の処理で80％以上の残存
酵素活性を有し、温度50℃、60分間の処理でも65％以上
の残存酵素活性を有する。
熱処理により完全に失活する。 熱安定性：温度50℃、20分間の処理で80％以上の残存
酵素活性を有し、温度50℃、60分間の処理でも65％以上
の残存酵素活性を有する。
【００２４】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。なお、以下に述べる項目１〜10には、ホタル
の１種であるフォティナス・ピラリスのルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ (該ＤＮＡは、ル
シオラ・クルシアタのルシフェラーゼをコードする遺伝
子を含有するＤＮＡを検索する際、プローブとして使用
されるものである。) の調製について述べる。 １．ｍ−ＲＮＡの調製 ホタルの１種であるフォティナス・ピラリス(Photinus
pyralis)の乾燥尾部 (シグマ社製) １ｇを乳鉢及び乳棒
を用いて充分破砕したものに、溶解緩衝液５ml〔20mMト
リス−塩酸緩衝液(pＨ7.4)／10mM NaCl／３mM酢酸マグ
ネシウム／５％(w/v) ショ糖／1.２％(V/V) トリトンＸ
-100／10mMバナジルヌクレオシド錯体 (ニューイングラ
ンド バイオラボ社製) 〕を添加し、更に、上記と同様
に破砕してフォティナス・ピラリス尾部破砕物含有溶液
を得た。
説明する。なお、以下に述べる項目１〜10には、ホタル
の１種であるフォティナス・ピラリスのルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ (該ＤＮＡは、ル
シオラ・クルシアタのルシフェラーゼをコードする遺伝
子を含有するＤＮＡを検索する際、プローブとして使用
されるものである。) の調製について述べる。 １．ｍ−ＲＮＡの調製 ホタルの１種であるフォティナス・ピラリス(Photinus
pyralis)の乾燥尾部 (シグマ社製) １ｇを乳鉢及び乳棒
を用いて充分破砕したものに、溶解緩衝液５ml〔20mMト
リス−塩酸緩衝液(pＨ7.4)／10mM NaCl／３mM酢酸マグ
ネシウム／５％(w/v) ショ糖／1.２％(V/V) トリトンＸ
-100／10mMバナジルヌクレオシド錯体 (ニューイングラ
ンド バイオラボ社製) 〕を添加し、更に、上記と同様
に破砕してフォティナス・ピラリス尾部破砕物含有溶液
を得た。
【００２５】このようにして得た溶液５mlをカップ型ブ
レンダー(日本精機製作所社製)に入れ、5,000r.p.m. で
５分間処理したものに、12mlのグアニジンイソチオシア
ネート溶液 (６Ｍグアニジンイソチオシアネート／37.5
mMクエン酸ナトリウム（p Ｈ7.0)／0.75％(W/V) Ｎ−ラ
ウロイルザルコシンナトリウム／0.15M β−メルカプト
エタノール) を添加する。この溶液をさらに上記ブレン
ダーを用い3,000r.p.m. で10分間処理し、３重のガーゼ
を用いて濾過して濾液を得た。次に、超遠心分離機用チ
ューブ (日立工機社製) ４本に、予め1.２mlの5.７Ｍの
塩化セシウム溶液を夫々重層し、その上に、上記濾液を
重層するように夫々分注し、超遠心分離機 (日立工機社
製、ＳＣＰ55Ｈ）を用いて温度15℃、30,000r.p.m.で16
時間遠心分離して沈澱物を得た。得られた沈澱物を、冷
70％(V/V) エタノールを用いて洗浄し、10mMトリス緩衝
液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.4)／５mMＥＤＴＡ／
１％ドデシル硫酸ナトリウム〕４mlに懸濁したものに、
同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを４対１（容
量比）混液を添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.
で10分間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離した。
この有機溶媒層に上記10mMトリス緩衝液４mlを添加し、
上記抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返した。
得られた水層に、1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウム(pＨ5.2)
及び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−20℃
で２時間放置したのち、常法により8,000r.p.m. で20分
間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱させた。得られたＲＮＡを
４mlの水に溶解し、上記エタノール沈澱操作を行なっ
た。得られたＲＮＡをさらに１mlの水に溶解し、3.75mg
のＲＮＡを得た。
レンダー(日本精機製作所社製)に入れ、5,000r.p.m. で
５分間処理したものに、12mlのグアニジンイソチオシア
ネート溶液 (６Ｍグアニジンイソチオシアネート／37.5
mMクエン酸ナトリウム（p Ｈ7.0)／0.75％(W/V) Ｎ−ラ
ウロイルザルコシンナトリウム／0.15M β−メルカプト
エタノール) を添加する。この溶液をさらに上記ブレン
ダーを用い3,000r.p.m. で10分間処理し、３重のガーゼ
を用いて濾過して濾液を得た。次に、超遠心分離機用チ
ューブ (日立工機社製) ４本に、予め1.２mlの5.７Ｍの
塩化セシウム溶液を夫々重層し、その上に、上記濾液を
重層するように夫々分注し、超遠心分離機 (日立工機社
製、ＳＣＰ55Ｈ）を用いて温度15℃、30,000r.p.m.で16
時間遠心分離して沈澱物を得た。得られた沈澱物を、冷
70％(V/V) エタノールを用いて洗浄し、10mMトリス緩衝
液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.4)／５mMＥＤＴＡ／
１％ドデシル硫酸ナトリウム〕４mlに懸濁したものに、
同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを４対１（容
量比）混液を添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.
で10分間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離した。
この有機溶媒層に上記10mMトリス緩衝液４mlを添加し、
上記抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返した。
得られた水層に、1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウム(pＨ5.2)
及び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−20℃
で２時間放置したのち、常法により8,000r.p.m. で20分
間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱させた。得られたＲＮＡを
４mlの水に溶解し、上記エタノール沈澱操作を行なっ
た。得られたＲＮＡをさらに１mlの水に溶解し、3.75mg
のＲＮＡを得た。
【００２６】そして、以上の操作を再度繰り返すことに
より合計７mgのＲＮＡを調製した。このＲＮＡ中よりｍ
−ＲＮＡを選択するために、７mgのＲＮＡを、オリゴ(d
Ｔ）−セルロース (ニューイングランドバイオラボ社
製) カラムクロマトグラムにかけた。このカラムクロマ
トグラムにおいて、カラムとして2.５mlテルモシリンジ
（テルモ社製）を用いた。このカラムに、樹脂0.５ｇを
溶出緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.6)／１mMＤ
ＥＴＡ／0.１％(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム〕で膨潤
させたのち充填し、結合緩衝液〔10mMトリス−塩酸(pＨ
7.6)／１mMＥＤＴＡ／0.４M NaCl／0.１％ドデシル硫酸
ナトリウム〕で平衡化して調製した。
より合計７mgのＲＮＡを調製した。このＲＮＡ中よりｍ
−ＲＮＡを選択するために、７mgのＲＮＡを、オリゴ(d
Ｔ）−セルロース (ニューイングランドバイオラボ社
製) カラムクロマトグラムにかけた。このカラムクロマ
トグラムにおいて、カラムとして2.５mlテルモシリンジ
（テルモ社製）を用いた。このカラムに、樹脂0.５ｇを
溶出緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.6)／１mMＤ
ＥＴＡ／0.１％(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム〕で膨潤
させたのち充填し、結合緩衝液〔10mMトリス−塩酸(pＨ
7.6)／１mMＥＤＴＡ／0.４M NaCl／0.１％ドデシル硫酸
ナトリウム〕で平衡化して調製した。
【００２７】７mgのＲＮＡに、同量の緩衝液〔10mMトリ
ス−塩酸(pＨ7.6)／１mMＥＤＴＡ／0.８M NaCl／0.１％
ドデシル硫酸ナトリウム〕を添加し、温度65℃で10分間
加熱処理し、氷中で急冷した。これを前記調製したオリ
ゴ(dＴ) −セルロースカラムにかけ、結合緩衝液で樹脂
を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及びｔ−ＲＮＡを完全に
洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−ＲＮＡを溶出してｍ−
ＲＮＡ４０μg を得た。 ２．ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮 次に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりルシフェラーゼ
ｍ−ＲＮＡを濃縮した。
ス−塩酸(pＨ7.6)／１mMＥＤＴＡ／0.８M NaCl／0.１％
ドデシル硫酸ナトリウム〕を添加し、温度65℃で10分間
加熱処理し、氷中で急冷した。これを前記調製したオリ
ゴ(dＴ) −セルロースカラムにかけ、結合緩衝液で樹脂
を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及びｔ−ＲＮＡを完全に
洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−ＲＮＡを溶出してｍ−
ＲＮＡ４０μg を得た。 ２．ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮 次に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりルシフェラーゼ
ｍ−ＲＮＡを濃縮した。
【００２８】10〜25％(W/V) のショ糖密度勾配は、ベッ
クマン社製のローターＳＷ41用ポリアロマチューブに40
％(W/V) ショ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／
20mMNaCl ／１mMＥＤＴＡ／40％(W/V）ショ糖〕0.５ml
を入れ、その上に2.４mlずつ25％(W/V)、20％(W/V)、15
％(W/V) 及び10％(W/V) のショ糖液を重層し、４℃で24
時間放置することにより作製した。このショ糖密度勾配
に、ｍ−ＲＮＡ30μgを重層し、ＳＷ41ローター（ベッ
クマン社製）を用い、常法により30,000r.p.m.、温度18
℃で18時間遠心分離を行なった。遠心分離操作ののち、
0.５mlずつ分画し、エタノール沈澱法によりｍ−ＲＮＡ
を回収し、10μＬの水に溶解した。
クマン社製のローターＳＷ41用ポリアロマチューブに40
％(W/V) ショ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／
20mMNaCl ／１mMＥＤＴＡ／40％(W/V）ショ糖〕0.５ml
を入れ、その上に2.４mlずつ25％(W/V)、20％(W/V)、15
％(W/V) 及び10％(W/V) のショ糖液を重層し、４℃で24
時間放置することにより作製した。このショ糖密度勾配
に、ｍ−ＲＮＡ30μgを重層し、ＳＷ41ローター（ベッ
クマン社製）を用い、常法により30,000r.p.m.、温度18
℃で18時間遠心分離を行なった。遠心分離操作ののち、
0.５mlずつ分画し、エタノール沈澱法によりｍ−ＲＮＡ
を回収し、10μＬの水に溶解した。
【００２９】次に、ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白
質を調べることにより、ルシフェラーゼのｍ−ＲＮＡが
濃縮されている画分の同定を行なった。分画したＲＮＡ
１μＬ 、ウサギ網状赤血球ライセート (アマシャム社
製) ９μＬ 及び〔35Ｓ〕メチオニン１μＬ （アマシ
ャム社製）を混合し、30℃で30分間反応させた。これに
150μＬ のＮＥＴ緩衝液〔150mM NaCl／５mMＥＤＴＡ
／0.02％ (W/V)NaN3／20mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.4)
／0.05％(W/V) ノニデットＰ-40(ベセスダリサーチラボ
ラトリー社製、界面活性剤) 〕を添加し、更に、１μＬ
の抗ルシフェラーゼ血清 (後述のようにして調製した
もの。) を添加し、４℃で18時間放置した。これに10mg
のプロティンＡセファロース (ファルマシア社製) を添
加し、温度20℃で30分間放置したものを、常法により1
2,000r.p.m.で１分間遠心分離処理し、樹脂を回収し
た。
質を調べることにより、ルシフェラーゼのｍ−ＲＮＡが
濃縮されている画分の同定を行なった。分画したＲＮＡ
１μＬ 、ウサギ網状赤血球ライセート (アマシャム社
製) ９μＬ 及び〔35Ｓ〕メチオニン１μＬ （アマシ
ャム社製）を混合し、30℃で30分間反応させた。これに
150μＬ のＮＥＴ緩衝液〔150mM NaCl／５mMＥＤＴＡ
／0.02％ (W/V)NaN3／20mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.4)
／0.05％(W/V) ノニデットＰ-40(ベセスダリサーチラボ
ラトリー社製、界面活性剤) 〕を添加し、更に、１μＬ
の抗ルシフェラーゼ血清 (後述のようにして調製した
もの。) を添加し、４℃で18時間放置した。これに10mg
のプロティンＡセファロース (ファルマシア社製) を添
加し、温度20℃で30分間放置したものを、常法により1
2,000r.p.m.で１分間遠心分離処理し、樹脂を回収し
た。
【００３０】回収した樹脂を 200μＬ のＮＥＴ緩衝液
で３回洗浄し、次いで、40μＬ のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用
サンプル緩衝液〔62.5mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ6.8)／
10％(V/V) グリセロール／２％(W/V) ドデシル硫酸ナト
リウム／５％(V/V) メルカプトエタノール／0.02％(W/
V) ブロムフェノールブルー〕を添加し、温度 100℃で
３分間煮沸し、常法により12,000r.p.m.で１分間遠心分
離処理した。この遠心分離処理で得られた上清を回収
し、全量を7.５％(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲルに乗せてラエムリ(Laemmli) の方法
〔「ネーチュアー」(Nature)、第227頁、第680頁(197
0)〕でゲル電気泳動を行った。
で３回洗浄し、次いで、40μＬ のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用
サンプル緩衝液〔62.5mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ6.8)／
10％(V/V) グリセロール／２％(W/V) ドデシル硫酸ナト
リウム／５％(V/V) メルカプトエタノール／0.02％(W/
V) ブロムフェノールブルー〕を添加し、温度 100℃で
３分間煮沸し、常法により12,000r.p.m.で１分間遠心分
離処理した。この遠心分離処理で得られた上清を回収
し、全量を7.５％(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲルに乗せてラエムリ(Laemmli) の方法
〔「ネーチュアー」(Nature)、第227頁、第680頁(197
0)〕でゲル電気泳動を行った。
【００３１】ゲル電気泳動を行なった後のゲルを10％(V
/V) の酢酸に30分間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水
に30分間浸漬し、更に、１Ｍサリチル酸ナトリウム溶液
に30分間浸漬し、乾燥して乾燥ゲルを得、次いでＸ線フ
ィルム (フジ写真フィルム社製、ＲＸ）を用いてフルオ
ログラフィーを行なった。以上の操作により、ルシフェ
ラーゼｍ−ＲＮＡの存在する画分のＲＮＡを用いた場合
にのみ、ルシフェラーゼ蛋白質のバンドがＸ線フィルム
上に認められ、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されて
いる画分が同定できた。 ３．抗ルシフェラーゼ血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラーゼ
血清は、以下の方法により調製した。
/V) の酢酸に30分間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水
に30分間浸漬し、更に、１Ｍサリチル酸ナトリウム溶液
に30分間浸漬し、乾燥して乾燥ゲルを得、次いでＸ線フ
ィルム (フジ写真フィルム社製、ＲＸ）を用いてフルオ
ログラフィーを行なった。以上の操作により、ルシフェ
ラーゼｍ−ＲＮＡの存在する画分のＲＮＡを用いた場合
にのみ、ルシフェラーゼ蛋白質のバンドがＸ線フィルム
上に認められ、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されて
いる画分が同定できた。 ３．抗ルシフェラーゼ血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラーゼ
血清は、以下の方法により調製した。
【００３２】3.２mg／ml濃度のルシフェラーゼ溶液〔シ
グマ社製ルシフェラーゼを0.５Ｍグリシルグリシン溶液
(pＨ7.8)に溶解したもの〕0.７mlを、等量のフロイント
(Freund)完全アジェバントで懸濁したもの2.24mgを、抗
原として体重２kgの日本白色種ウサギの指掌部に投与し
飼育した。飼育２週間経過した後、初回と同量の抗原を
背部皮内へ投与し、更に、飼育１週間経過したのち、同
様の操作を行ない、更に、飼育１週間後全採血を行なっ
た。
グマ社製ルシフェラーゼを0.５Ｍグリシルグリシン溶液
(pＨ7.8)に溶解したもの〕0.７mlを、等量のフロイント
(Freund)完全アジェバントで懸濁したもの2.24mgを、抗
原として体重２kgの日本白色種ウサギの指掌部に投与し
飼育した。飼育２週間経過した後、初回と同量の抗原を
背部皮内へ投与し、更に、飼育１週間経過したのち、同
様の操作を行ない、更に、飼育１週間後全採血を行なっ
た。
【００３３】そして、得られた血液を、温度４℃で18時
間放置したものを、常法により3,000r.p.m. で15分間遠
心分離し、上清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。 ４．ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−ＤＮＡの合成は、アマシャム社製キットを用いて行
なった。上述の如くして得られたｍ−ＲＮＡ２μg を用
いてアマシャム社の指示する「モル・セル・バイオル」
(Mol.Cell Biol.)、第２巻、第161頁(1982)及び「ジー
ン」(Gene)、第25巻、第263 頁(1983)記載の方法に従い
処理して、 300ngの２本鎖ｃ−ＤＮＡを得た。
間放置したものを、常法により3,000r.p.m. で15分間遠
心分離し、上清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。 ４．ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−ＤＮＡの合成は、アマシャム社製キットを用いて行
なった。上述の如くして得られたｍ−ＲＮＡ２μg を用
いてアマシャム社の指示する「モル・セル・バイオル」
(Mol.Cell Biol.)、第２巻、第161頁(1982)及び「ジー
ン」(Gene)、第25巻、第263 頁(1983)記載の方法に従い
処理して、 300ngの２本鎖ｃ−ＤＮＡを得た。
【００３４】このｃ−ＤＮＡ 150ngを７μＬ のＴＥ緩
衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／１mMＥＤＴ
Ａ〕に溶解したものに、11μＬ の混液〔280mM カコジ
ル酸ナトリウム(pＨ6.８)／60mM トリス−塩酸緩衝液(p
Ｈ6.8)／２mM塩化コバルト〕及び3.８μＬ のティリン
グ混液〔10mMジチオスレイトール7.５μＬ ／10ng／ml
ポリ (poly) Ａ１μＬ ／５mM dＣＴＰ２μＬ ／水 1
10μＬ 〕を夫々添加し、更に、29ユニットのターミナ
ルトランスフェラーゼ (ベーリンガーマンハイム社製)
を添加し、30℃で10分間反応させ、次いで、2.4μＬ の
0.25M ＥＤＴＡ及び2.４μＬ の10％(W/V) ドデシル硫
酸ナトリウムを夫々添加して反応を停止させた。
衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／１mMＥＤＴ
Ａ〕に溶解したものに、11μＬ の混液〔280mM カコジ
ル酸ナトリウム(pＨ6.８)／60mM トリス−塩酸緩衝液(p
Ｈ6.8)／２mM塩化コバルト〕及び3.８μＬ のティリン
グ混液〔10mMジチオスレイトール7.５μＬ ／10ng／ml
ポリ (poly) Ａ１μＬ ／５mM dＣＴＰ２μＬ ／水 1
10μＬ 〕を夫々添加し、更に、29ユニットのターミナ
ルトランスフェラーゼ (ベーリンガーマンハイム社製)
を添加し、30℃で10分間反応させ、次いで、2.4μＬ の
0.25M ＥＤＴＡ及び2.４μＬ の10％(W/V) ドデシル硫
酸ナトリウムを夫々添加して反応を停止させた。
【００３５】この反応停止液に25μＬ の水飽和フェノ
ールを用いて除蛋白処理を行なった。回収した水層に、
25μＬ の４Ｍ酢酸アンモニウム及び 100μＬ の冷エ
タノールを夫々添加し、−70℃で15分間放置し、12,000
r.p.m.で10分間遠心分離してｃ−ＤＮＡを回収した。こ
れを10μＬ のＴＥ緩衝液に溶解し、ｃ−ＤＮＡ溶解液
を得た。
ールを用いて除蛋白処理を行なった。回収した水層に、
25μＬ の４Ｍ酢酸アンモニウム及び 100μＬ の冷エ
タノールを夫々添加し、−70℃で15分間放置し、12,000
r.p.m.で10分間遠心分離してｃ−ＤＮＡを回収した。こ
れを10μＬ のＴＥ緩衝液に溶解し、ｃ−ＤＮＡ溶解液
を得た。
【００３６】以上の如くしてデオキシシチジンのテイル
が付いたｃ−ＤＮＡ100ngを得た。 ５．ベクターに使用する組み換え体プラスミド pＭＣＥ
10ＤＮＡの調製 大腸菌Ｗ3110株(ATCC 27325)、プラスミド pＢＲ325(Ｂ
ＲＬ社製）及びプラスミド pＢＲ322 ＤＮＡ(宝酒造社
製)を用いてティー・マスダ等 (T.Masuda et.al.)「ア
グリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー」(Ag
ricultural Biological Chemistry) 、第50巻、第271〜
279頁 (1986) 記載の方法により作製したプラスミド p
ＫＮ305 ＤＮＡ並びにプラスミド pＭＣ1403-3ＤＮＡ
(特開昭61-274683 号公報記載) を作製した。夫々のプ
ラスミド１μg を、10μＬ の混液〔50mMトリス−塩酸
緩衝液(pＨ7.5)／10mM MgCl2／100mM NaCl／１mMジチオ
スレイトール〕に添加し、更に、これに、HindIII及びS
alI （いずれも宝酒造社製) を夫々２ユニットずつ添加
し、37℃で１時間反応させて切断処理し、常法によるフ
ェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を
得た。この沈澱物を、10μＬ のライゲーション緩衝液
〔20mM MgCl2／66mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.6)／１mM
ＡＴＰ／15mMジチオスレイトール〕に溶解し、この溶液
にさらに１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）を添加し、20℃で４時間連結反応を行なった。次い
で、この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジー
(J.Bacteriology、第119巻、第1072頁〜第1074頁(1974
年）」記載の形質転換法により、大腸菌ＪＭ 101(ATCC
33876)株を形質転換し、薬剤耐性 (アンピシリン耐性及
びテトラサイクリン感受性) 及びβ−ガラクトシダーゼ
活性を検討し、形質転換株を得た。この形質転換株に含
まれる組み換え体プラスミドＤＮＡを pＭＣＥ10と命名
した。この組み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡを含
有する大腸菌ＪＭ101 株を、トリプトン１％(W/V) 、酵
母エキス0.５％(W/V) 、及びNaCl0.5 ％(W/V) からなる
培地１Ｌ に、該培地を用い37℃で16〜24時間前培養し
て得た大腸菌ＪＭ101 (pＭＣＥ10) の培養液20mlを接種
し、37℃で３時間振盪培養したのち、0.2gのクロラムフ
ェニコールを添加し、更に同一温度で20時間同培養を行
ない、培養液を得た。
が付いたｃ−ＤＮＡ100ngを得た。 ５．ベクターに使用する組み換え体プラスミド pＭＣＥ
10ＤＮＡの調製 大腸菌Ｗ3110株(ATCC 27325)、プラスミド pＢＲ325(Ｂ
ＲＬ社製）及びプラスミド pＢＲ322 ＤＮＡ(宝酒造社
製)を用いてティー・マスダ等 (T.Masuda et.al.)「ア
グリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー」(Ag
ricultural Biological Chemistry) 、第50巻、第271〜
279頁 (1986) 記載の方法により作製したプラスミド p
ＫＮ305 ＤＮＡ並びにプラスミド pＭＣ1403-3ＤＮＡ
(特開昭61-274683 号公報記載) を作製した。夫々のプ
ラスミド１μg を、10μＬ の混液〔50mMトリス−塩酸
緩衝液(pＨ7.5)／10mM MgCl2／100mM NaCl／１mMジチオ
スレイトール〕に添加し、更に、これに、HindIII及びS
alI （いずれも宝酒造社製) を夫々２ユニットずつ添加
し、37℃で１時間反応させて切断処理し、常法によるフ
ェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を
得た。この沈澱物を、10μＬ のライゲーション緩衝液
〔20mM MgCl2／66mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.6)／１mM
ＡＴＰ／15mMジチオスレイトール〕に溶解し、この溶液
にさらに１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）を添加し、20℃で４時間連結反応を行なった。次い
で、この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジー
(J.Bacteriology、第119巻、第1072頁〜第1074頁(1974
年）」記載の形質転換法により、大腸菌ＪＭ 101(ATCC
33876)株を形質転換し、薬剤耐性 (アンピシリン耐性及
びテトラサイクリン感受性) 及びβ−ガラクトシダーゼ
活性を検討し、形質転換株を得た。この形質転換株に含
まれる組み換え体プラスミドＤＮＡを pＭＣＥ10と命名
した。この組み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡを含
有する大腸菌ＪＭ101 株を、トリプトン１％(W/V) 、酵
母エキス0.５％(W/V) 、及びNaCl0.5 ％(W/V) からなる
培地１Ｌ に、該培地を用い37℃で16〜24時間前培養し
て得た大腸菌ＪＭ101 (pＭＣＥ10) の培養液20mlを接種
し、37℃で３時間振盪培養したのち、0.2gのクロラムフ
ェニコールを添加し、更に同一温度で20時間同培養を行
ない、培養液を得た。
【００３７】次いで、この培養液を、常法により6,000
r.p.m. で10分間遠心分離して湿潤菌体２ｇを得た。こ
れを20mlの25％(W/V) ショ糖を含有する350mM トリス−
塩酸緩衝液(pＨ8.0)に懸濁したのち、更に、これに、リ
ゾチーム10mg、0.25M ＥＤＴＡ溶液(pＨ8.0)８ml及び20
％(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム溶液８mlを夫々添加
し、60℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
r.p.m. で10分間遠心分離して湿潤菌体２ｇを得た。こ
れを20mlの25％(W/V) ショ糖を含有する350mM トリス−
塩酸緩衝液(pＨ8.0)に懸濁したのち、更に、これに、リ
ゾチーム10mg、0.25M ＥＤＴＡ溶液(pＨ8.0)８ml及び20
％(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム溶液８mlを夫々添加
し、60℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
【００３８】この溶菌液に、５M NaCl溶液13mlを添加
し、温度４℃で16時間処理したものを常法により15,000
r.p.m.で30分間遠心分離して抽出液を得、常法によりフ
ェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱
物を得た。次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理し
た後、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液
６ml(pＨ7.5)に溶解し、更に、これに、塩化セシウム６
ｇ及びエチジウムブロマイド溶液(10mg/ml) 0.２mlを添
加した。これを超遠心分離機を用いて常法により39,000
r.p.m.で42時間平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組
み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡ含有物を単離し
た。次いで組み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡ含有
物からｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマイド
を除去したのち、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−
塩酸緩衝液(pＨ7.5)に対して透析を行ない純化した組み
換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡ500μg を得た。 ６．ベクターＤＮＡの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミド pＭＣＥ
10ＤＮＡ15μg を、前記項目４記載のＴＥ緩衝液90μＬ
に溶解しＭed緩衝液〔100 mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ
7.5)／100mM MgCl2 ／10mMジチオスレイトール／500mM
NaCl〕10μＬを添加したのち制限酵素ＡccI(宝酒造社
製) 30ユニットを更に加え、37℃で１時間切断処理を行
ない切断処理物を得た。この切断処理物に、100μＬ の
水飽和フェノールを加え除蛋白操作を行なったのち、水
層を回収した。この水層に、1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム(pＨ7.5)及び２倍量の冷エタノールを加え、−70℃で
15分間放置したのち、12,000r.p .m. で10分間遠心分離
し、ＤＮＡを回収した。
し、温度４℃で16時間処理したものを常法により15,000
r.p.m.で30分間遠心分離して抽出液を得、常法によりフ
ェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱
物を得た。次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理し
た後、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液
６ml(pＨ7.5)に溶解し、更に、これに、塩化セシウム６
ｇ及びエチジウムブロマイド溶液(10mg/ml) 0.２mlを添
加した。これを超遠心分離機を用いて常法により39,000
r.p.m.で42時間平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組
み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡ含有物を単離し
た。次いで組み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡ含有
物からｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマイド
を除去したのち、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−
塩酸緩衝液(pＨ7.5)に対して透析を行ない純化した組み
換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡ500μg を得た。 ６．ベクターＤＮＡの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミド pＭＣＥ
10ＤＮＡ15μg を、前記項目４記載のＴＥ緩衝液90μＬ
に溶解しＭed緩衝液〔100 mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ
7.5)／100mM MgCl2 ／10mMジチオスレイトール／500mM
NaCl〕10μＬを添加したのち制限酵素ＡccI(宝酒造社
製) 30ユニットを更に加え、37℃で１時間切断処理を行
ない切断処理物を得た。この切断処理物に、100μＬ の
水飽和フェノールを加え除蛋白操作を行なったのち、水
層を回収した。この水層に、1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム(pＨ7.5)及び２倍量の冷エタノールを加え、−70℃で
15分間放置したのち、12,000r.p .m. で10分間遠心分離
し、ＤＮＡを回収した。
【００３９】このＤＮＡを、ＴＥ緩衝液10μＬ に溶か
し、混液〔280mM カコジル酸ナトリウム(pＨ6.8)／60mM
トリス−塩酸緩衝液(pＨ6.8)／２mM塩化コバルト〕15μ
Ｌを加えたのち、更に、ティリング混液(項目４記載)
(５mM dＧＴＰを用いた) ５μＬ 及びターミナルトラ
ンスフェラーゼ (宝酒造社製) ５ユニットを添加し、37
℃で15分間反応させた。前記項目４記載のｃ−ＤＮＡテ
ィリング反応と同様の後処理を行なうことにより組み換
え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡのＡccIサイトにデオ
キシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡを調製した。
し、混液〔280mM カコジル酸ナトリウム(pＨ6.8)／60mM
トリス−塩酸緩衝液(pＨ6.8)／２mM塩化コバルト〕15μ
Ｌを加えたのち、更に、ティリング混液(項目４記載)
(５mM dＧＴＰを用いた) ５μＬ 及びターミナルトラ
ンスフェラーゼ (宝酒造社製) ５ユニットを添加し、37
℃で15分間反応させた。前記項目４記載のｃ−ＤＮＡテ
ィリング反応と同様の後処理を行なうことにより組み換
え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡのＡccIサイトにデオ
キシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡを調製した。
【００４０】一方、プラスミド pＵＣ19ＤＮＡのＰstI
サイ６にデオキシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡの
調製も同時に行なった。プラスミド pＵＣ19ＤＮＡ (宝
酒造社製)30μg を、 350μＬ のＴＥ緩衝液に溶解し
たものに、40μＬ のＭed緩衝液及び制限酵素ＰstI
(宝酒造社製)120ユニットを夫々添加し、37℃で１時間
切断処理したのち、常法によりフェノールによる除蛋白
処理及びエタノール沈澱処理によりＤＮＡを回収した。
サイ６にデオキシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡの
調製も同時に行なった。プラスミド pＵＣ19ＤＮＡ (宝
酒造社製)30μg を、 350μＬ のＴＥ緩衝液に溶解し
たものに、40μＬ のＭed緩衝液及び制限酵素ＰstI
(宝酒造社製)120ユニットを夫々添加し、37℃で１時間
切断処理したのち、常法によりフェノールによる除蛋白
処理及びエタノール沈澱処理によりＤＮＡを回収した。
【００４１】得られたＤＮＡを、35μＬ のＴＥ緩衝液
に溶解したものに、50μＬ の混液〔280mM カコジル酸
ナトリウム(pＨ 6.8) ／60mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ6.
8)／１mM塩化コバルト〕、19μＬ の項目４記載のティ
リング混液(dＧＴＰ含有) 並びに60ユニットのターミナ
ルトランスフェラーゼ(宝酒造社製) を夫々添加し、37
℃で10分間反応させたのち、常法によりフェノール処理
及びエタノール沈澱を行なうことによりＤＮＡを回収し
た。 ７．アニーリング及び形質転換 合成したｃ−ＤＮＡ15ng及び上記の方法で得た二種のベ
クターＤＮＡ 200ngを、35μＬ のアニール緩衝液〔10
mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／100 mM NaCl／１mMＥ
ＤＴＡ〕に溶解し、65℃で２分間、46℃で２時間、37℃
で１時間及び20℃で18時間放置する操作によりｃ−ＤＮ
ＡとベクターＤＮＡをアニールした。
に溶解したものに、50μＬ の混液〔280mM カコジル酸
ナトリウム(pＨ 6.8) ／60mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ6.
8)／１mM塩化コバルト〕、19μＬ の項目４記載のティ
リング混液(dＧＴＰ含有) 並びに60ユニットのターミナ
ルトランスフェラーゼ(宝酒造社製) を夫々添加し、37
℃で10分間反応させたのち、常法によりフェノール処理
及びエタノール沈澱を行なうことによりＤＮＡを回収し
た。 ７．アニーリング及び形質転換 合成したｃ−ＤＮＡ15ng及び上記の方法で得た二種のベ
クターＤＮＡ 200ngを、35μＬ のアニール緩衝液〔10
mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／100 mM NaCl／１mMＥ
ＤＴＡ〕に溶解し、65℃で２分間、46℃で２時間、37℃
で１時間及び20℃で18時間放置する操作によりｃ−ＤＮ
ＡとベクターＤＮＡをアニールした。
【００４２】アニールしたＤＮＡを用いて、ハナハン(H
ana-han)の方法〔デイ−エヌエイクローニング（ＤＮＡ
Cloning) 、第１巻、第109〜135頁(1985)〕により大腸
菌ＤＨ１株(ATCC 33849)を形質転換し、プラスミド pＵ
Ｃ19ＤＮＡ及び組み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡ
をベクターとしたｃ−ＤＮＡバンクを夫々作製した。 ８．ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索 組み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡのＡccI部位
は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする部
位にあるので、この部位に組み込まれたｃ−ＤＮＡはβ
−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を作った。また組み
換え体プラスミドpＭＣＥ10のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子のプロモーターは前述した様に大腸菌トリプトファ
ン遺伝子のプロモーターに変換してある。
ana-han)の方法〔デイ−エヌエイクローニング（ＤＮＡ
Cloning) 、第１巻、第109〜135頁(1985)〕により大腸
菌ＤＨ１株(ATCC 33849)を形質転換し、プラスミド pＵ
Ｃ19ＤＮＡ及び組み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡ
をベクターとしたｃ−ＤＮＡバンクを夫々作製した。 ８．ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索 組み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡのＡccI部位
は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする部
位にあるので、この部位に組み込まれたｃ−ＤＮＡはβ
−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を作った。また組み
換え体プラスミドpＭＣＥ10のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子のプロモーターは前述した様に大腸菌トリプトファ
ン遺伝子のプロモーターに変換してある。
【００４３】組み換え体プラスミド pＭＣＥ10ＤＮＡを
ベクターとするｃ−ＤＮＡバンクのコロニー96個をＭ９
カザミノ酸培地〔「モレキュラー・クローニング」(Mol
ecular Cloning) 、第440〜441 頁、「コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー」(Cold Spring Harbor La
boratory)(1982) 〕にチアミン (10μg/ml) を加えた培
地中、37℃で10時間振盪培養し、常法により集菌したの
ち、前記項目２記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝
液 200μＬ に懸濁し、１00℃で５分間煮沸した。
ベクターとするｃ−ＤＮＡバンクのコロニー96個をＭ９
カザミノ酸培地〔「モレキュラー・クローニング」(Mol
ecular Cloning) 、第440〜441 頁、「コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー」(Cold Spring Harbor La
boratory)(1982) 〕にチアミン (10μg/ml) を加えた培
地中、37℃で10時間振盪培養し、常法により集菌したの
ち、前記項目２記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝
液 200μＬ に懸濁し、１00℃で５分間煮沸した。
【００４４】この懸濁液40μＬ を、7.５％(W/V) ポリ
アクリルアミドゲルを用いて、常法により電気泳動を行
なった。泳動終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウエス
タンブロット法〔「アナル・バイオケム」(Anal.Bioch
m.)、第112 巻、第195 頁(1981)〕によりニトロセルロ
ースのフィルターに転写し、このニトロセルロースフィ
ルターをイミューンブロットアッセイキット (バイオラ
ッド社製) を用いて抗ルシフェラーゼ血清で染色した。
この方法は、バイオラッド社の操作法に従った。
アクリルアミドゲルを用いて、常法により電気泳動を行
なった。泳動終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウエス
タンブロット法〔「アナル・バイオケム」(Anal.Bioch
m.)、第112 巻、第195 頁(1981)〕によりニトロセルロ
ースのフィルターに転写し、このニトロセルロースフィ
ルターをイミューンブロットアッセイキット (バイオラ
ッド社製) を用いて抗ルシフェラーゼ血清で染色した。
この方法は、バイオラッド社の操作法に従った。
【００４５】即ちニトロセルロースのフィルターを、ブ
ロッキング溶液［ＴＢＳ緩衝液〔20mMトリス−塩酸緩衝
液/500mM NaCl(pＨ7.5)〕に３％(W/V) のゼラチンを溶
かした溶液］ 100ml中、25℃で、30分間振盪した。次
に、このニトロセルロースフィルターを25mlの一次抗体
溶液〔ルシフェラーゼ抗血清を１％(W/V) のゼラチンを
ＴＢＳ緩衝液に溶かした溶液で25倍(V/V) に希釈した溶
液〕に移し、25℃で90分間振盪した。これを 100mlのツ
ィーン(Tween) −20洗液〔ＴＢＳ緩衝液に0.05％(W/V)
のツィーン(Tween) −20を溶かした溶液〕中に移し、25
℃で10分間振盪する操作を２回行なった。次いで、この
ようにして得たニトロセルロースフィルターを60mlの二
次抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗
ウサギ抗体(バイオラッド社製) を１％(W/V) のゼラチ
ンをＴＢＳ緩衝液に溶かした溶液で3000倍(V/V) に希釈
した溶液〕中に移し、25℃で60分間振盪したのち、 100
mlのツィーン(Tween) −20洗液でニトロセルロースフィ
ルターを洗う上記操作を２回繰り返した。このようにし
て得たニトロセルロースフィルターを、 120mlの発色液
〔60mgの４−クロロ−１−ナフトールを20mlの冷メタノ
ールに溶解した溶液及び60μＬ の30％(V/V) 過酸化水
素水を 100mlのＴＢＳ緩衝液に添加した溶液を混合した
溶液〕中に移し、25℃で10分間発色させた。
ロッキング溶液［ＴＢＳ緩衝液〔20mMトリス−塩酸緩衝
液/500mM NaCl(pＨ7.5)〕に３％(W/V) のゼラチンを溶
かした溶液］ 100ml中、25℃で、30分間振盪した。次
に、このニトロセルロースフィルターを25mlの一次抗体
溶液〔ルシフェラーゼ抗血清を１％(W/V) のゼラチンを
ＴＢＳ緩衝液に溶かした溶液で25倍(V/V) に希釈した溶
液〕に移し、25℃で90分間振盪した。これを 100mlのツ
ィーン(Tween) −20洗液〔ＴＢＳ緩衝液に0.05％(W/V)
のツィーン(Tween) −20を溶かした溶液〕中に移し、25
℃で10分間振盪する操作を２回行なった。次いで、この
ようにして得たニトロセルロースフィルターを60mlの二
次抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗
ウサギ抗体(バイオラッド社製) を１％(W/V) のゼラチ
ンをＴＢＳ緩衝液に溶かした溶液で3000倍(V/V) に希釈
した溶液〕中に移し、25℃で60分間振盪したのち、 100
mlのツィーン(Tween) −20洗液でニトロセルロースフィ
ルターを洗う上記操作を２回繰り返した。このようにし
て得たニトロセルロースフィルターを、 120mlの発色液
〔60mgの４−クロロ−１−ナフトールを20mlの冷メタノ
ールに溶解した溶液及び60μＬ の30％(V/V) 過酸化水
素水を 100mlのＴＢＳ緩衝液に添加した溶液を混合した
溶液〕中に移し、25℃で10分間発色させた。
【００４６】この様にして96個のコロニーを１グループ
としたものの４グループについて、同様の方法を行なっ
たところ、２つのグループでルシフェラーゼ抗血清で染
まる蛋白質バンドが認められた。次に、この２つのグル
ープに属する96個のコロニーを12個のコロニーずつ８グ
ループに分け同様の操作を行なったところ夫々１グルー
プに抗ルシフェラーゼ血清と反応する蛋白質が認められ
た。最後に、このグループに含まれる12個のコロニー
を、１個のコロニーずつ同様の操作を行ないルシフェラ
ーゼ抗血清と反応する蛋白質を作るコロニーを同定し
た。以上の操作によりルシフェラーゼｃ−ＤＮＡをもつ
２個のコロニーが得られた。この２個のコロニーより前
記項目５記載の方法でプラスミドＤＮＡを調製した。得
られた組み換え体プラスミドＤＮＡは、pＡＬf ２Ｂ８
及びpＡＬf ３Ａ６と夫々命名した。 ９．大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−ＤＮＡの
プローブの作製 組み換え体プラスミド pＡＬf３Ａ６ＤＮＡ100 μgを、
330μＬ のＴＥ緩衝液に溶解し、これに40μＬ のLow
緩衝液〔100mM トリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／100mM M
gCl2 ／10mMジチオスレイトール〕、130ユニットの Pst
I(宝酒造社製)及び120ユニットのＳacI (ベーリンガー
マンハイム社製) を添加し、37℃で1.５時間切断した。
としたものの４グループについて、同様の方法を行なっ
たところ、２つのグループでルシフェラーゼ抗血清で染
まる蛋白質バンドが認められた。次に、この２つのグル
ープに属する96個のコロニーを12個のコロニーずつ８グ
ループに分け同様の操作を行なったところ夫々１グルー
プに抗ルシフェラーゼ血清と反応する蛋白質が認められ
た。最後に、このグループに含まれる12個のコロニー
を、１個のコロニーずつ同様の操作を行ないルシフェラ
ーゼ抗血清と反応する蛋白質を作るコロニーを同定し
た。以上の操作によりルシフェラーゼｃ−ＤＮＡをもつ
２個のコロニーが得られた。この２個のコロニーより前
記項目５記載の方法でプラスミドＤＮＡを調製した。得
られた組み換え体プラスミドＤＮＡは、pＡＬf ２Ｂ８
及びpＡＬf ３Ａ６と夫々命名した。 ９．大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−ＤＮＡの
プローブの作製 組み換え体プラスミド pＡＬf３Ａ６ＤＮＡ100 μgを、
330μＬ のＴＥ緩衝液に溶解し、これに40μＬ のLow
緩衝液〔100mM トリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／100mM M
gCl2 ／10mMジチオスレイトール〕、130ユニットの Pst
I(宝酒造社製)及び120ユニットのＳacI (ベーリンガー
マンハイム社製) を添加し、37℃で1.５時間切断した。
【００４７】このＤＮＡ全量を0.７％(W/V) アガロース
ゲルを用いた電気泳動により分離した。アガロースゲル
電気泳動はティー・マニアテス(T.Maniatis)等の方法
〔「モレキュラー・クローニング」(Molecular Cloning)
、第156〜161頁、「コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー」(Cold Spring Habor Laboratory)(198
4)〕に従って行なった。ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを含
むＤＮＡバンドを切り出し、透析チューブに入れ、２ml
のＴＥ緩衝液を加えたのち、透析チューブをシールし、
電気泳動により、ゲル中より緩衝液中にＤＮＡを溶出し
た。この溶液に等容量の水飽和フェノールを加え、攪拌
したのち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収した。
ゲルを用いた電気泳動により分離した。アガロースゲル
電気泳動はティー・マニアテス(T.Maniatis)等の方法
〔「モレキュラー・クローニング」(Molecular Cloning)
、第156〜161頁、「コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー」(Cold Spring Habor Laboratory)(198
4)〕に従って行なった。ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを含
むＤＮＡバンドを切り出し、透析チューブに入れ、２ml
のＴＥ緩衝液を加えたのち、透析チューブをシールし、
電気泳動により、ゲル中より緩衝液中にＤＮＡを溶出し
た。この溶液に等容量の水飽和フェノールを加え、攪拌
したのち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収した。
【００４８】得られたＤＮＡフラグメント10μgを、126
μＬのＴＥ緩衝液に溶かし、Ｍed緩衝液16μｌ及びＳau
３ＡI (宝酒造社製)64 ユニットを加え、37℃で２時間
反応させたのち、その全量を５％(W/V) ポリアクリルア
ミドゲルを用いた電気泳動にかけて、ＤＮＡ断片の分離
を行なった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、エイ
・マクサム(A.Maxam)の方法〔「メソズ・イン・エンザイモ
ロジー」(Methodsin Enzymology)、第65巻、第506 頁(1
980)〕に従って行なった。190bp のＤＮＡフラグメント
を前述と同様の方法で単離し、１μg のＳau３ＡIルシ
フェラーゼｃ−ＤＮＡフラグメントが得られた。
μＬのＴＥ緩衝液に溶かし、Ｍed緩衝液16μｌ及びＳau
３ＡI (宝酒造社製)64 ユニットを加え、37℃で２時間
反応させたのち、その全量を５％(W/V) ポリアクリルア
ミドゲルを用いた電気泳動にかけて、ＤＮＡ断片の分離
を行なった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、エイ
・マクサム(A.Maxam)の方法〔「メソズ・イン・エンザイモ
ロジー」(Methodsin Enzymology)、第65巻、第506 頁(1
980)〕に従って行なった。190bp のＤＮＡフラグメント
を前述と同様の方法で単離し、１μg のＳau３ＡIルシ
フェラーゼｃ−ＤＮＡフラグメントが得られた。
【００４９】この１μg のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ
を、〔α−32Ｐ〕 dＣＴＰ (アマシャム社製) を用いて
ニックトランスレーション法により標識した。ニックト
ランスレーションは宝酒造社製のキットを用い、宝酒造
社の指示する〔「ジェイ・モル・バイオル」(J.Mol.Bio
l.) 、第113 巻、第237〜251 頁 (1977) 〕及び〔「モ
レキュラー・クローニング」(Molecular Cloning) 、第
109 〜112 頁、「コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー」(Cold Spring Habor Laboratory)(1982)〕
記載の方法に従って行なった。 10. 大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−コロニー
ハイブリダイゼーション 前述の方法で調製した32Ｐで標識したルシフェラーゼｃ
−ＤＮＡ断片を、プローブとして用い、組み換え体プラ
スミド pＵＣ19ＤＮＡをベクターとするフォティナス・
ピラリス尾部ｃ−ＤＮＡバンクを、コロニーハイブリダ
イゼーション法(「蛋白質・核酸・酵素」、第26巻、第5
75〜579頁(1981)）で検索し、ルシフェラーゼｃ−ＤＮ
Ａを有するコロニーを得た。そのうちの１個のコロニー
の有する組み換え体プラスミドＤＮＡを pＡＬf ３と命
名し、前記項目５記載の方法でプラスミドＤＮＡを調製
した。該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌
を大腸菌ＤＨ１(pＡＬf 3)と命名した。なお、該形質転
換大腸菌はＡＴＣＣ67462として寄託されている。
を、〔α−32Ｐ〕 dＣＴＰ (アマシャム社製) を用いて
ニックトランスレーション法により標識した。ニックト
ランスレーションは宝酒造社製のキットを用い、宝酒造
社の指示する〔「ジェイ・モル・バイオル」(J.Mol.Bio
l.) 、第113 巻、第237〜251 頁 (1977) 〕及び〔「モ
レキュラー・クローニング」(Molecular Cloning) 、第
109 〜112 頁、「コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー」(Cold Spring Habor Laboratory)(1982)〕
記載の方法に従って行なった。 10. 大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−コロニー
ハイブリダイゼーション 前述の方法で調製した32Ｐで標識したルシフェラーゼｃ
−ＤＮＡ断片を、プローブとして用い、組み換え体プラ
スミド pＵＣ19ＤＮＡをベクターとするフォティナス・
ピラリス尾部ｃ−ＤＮＡバンクを、コロニーハイブリダ
イゼーション法(「蛋白質・核酸・酵素」、第26巻、第5
75〜579頁(1981)）で検索し、ルシフェラーゼｃ−ＤＮ
Ａを有するコロニーを得た。そのうちの１個のコロニー
の有する組み換え体プラスミドＤＮＡを pＡＬf ３と命
名し、前記項目５記載の方法でプラスミドＤＮＡを調製
した。該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌
を大腸菌ＤＨ１(pＡＬf 3)と命名した。なお、該形質転
換大腸菌はＡＴＣＣ67462として寄託されている。
【００５０】そして、上記組み換え体プラスミドpＡＬf
３ＤＮＡを、ＸbaI、ＨindIII、ＢamＨI、ＥcoＲI及び
ＰstI (いずれも宝酒造社製) を用いて、単一消化及び
２重消化した。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動法により移動度パターン分析し、得られた移動度
パターンとλＤＮＡ (宝酒造社製) をHind III により
消化して得られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンとを
対比した。この結果、得られた分子量は 1,700bpであっ
た。そして、上記プラスミドの制限酵素地図は、図１に
示すとおりであった。 11. ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）のｍ
−ＲＮＡの調製 生きたルシオラ・クルシアタ (ゲンジボタル・株式会社
・西武百貨店より購入) 10ｇを超低温冷凍庫に入れ、凍
結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部２
ｇに、18mlのグアニジンイソチオシアネート溶液を添加
し、前記項目１記載の方法に従って1.１mgのＲＮＡを調
製した。このＲＮＡ1.１mgを前記項目１記載の方法に従
ってオリゴ(dＴ) −セルロースのカラムクロマトグラフ
ィーを行ない30μg のルシオラ・クルシアタ尾部ｍ−Ｒ
ＮＡを調製した。 12. ルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−ＤＮＡバンクの作製 ｃ−ＤＮＡの合成はアマシャム社より購入したキットを
用い、アマシャム社の指示する「モル・セル・バイオ
ル」(Mol.Cell Biol.)、第２巻、第161 頁(1982)及び
「ジーン」(Gene)、第25巻、第263頁(1983)記載の方法
に従って合成した。
３ＤＮＡを、ＸbaI、ＨindIII、ＢamＨI、ＥcoＲI及び
ＰstI (いずれも宝酒造社製) を用いて、単一消化及び
２重消化した。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動法により移動度パターン分析し、得られた移動度
パターンとλＤＮＡ (宝酒造社製) をHind III により
消化して得られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンとを
対比した。この結果、得られた分子量は 1,700bpであっ
た。そして、上記プラスミドの制限酵素地図は、図１に
示すとおりであった。 11. ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）のｍ
−ＲＮＡの調製 生きたルシオラ・クルシアタ (ゲンジボタル・株式会社
・西武百貨店より購入) 10ｇを超低温冷凍庫に入れ、凍
結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部２
ｇに、18mlのグアニジンイソチオシアネート溶液を添加
し、前記項目１記載の方法に従って1.１mgのＲＮＡを調
製した。このＲＮＡ1.１mgを前記項目１記載の方法に従
ってオリゴ(dＴ) −セルロースのカラムクロマトグラフ
ィーを行ない30μg のルシオラ・クルシアタ尾部ｍ−Ｒ
ＮＡを調製した。 12. ルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−ＤＮＡバンクの作製 ｃ−ＤＮＡの合成はアマシャム社より購入したキットを
用い、アマシャム社の指示する「モル・セル・バイオ
ル」(Mol.Cell Biol.)、第２巻、第161 頁(1982)及び
「ジーン」(Gene)、第25巻、第263頁(1983)記載の方法
に従って合成した。
【００５１】２μg のルシオラ・クルシアタ尾部ＲＮＡ
より0.９μg の二本鎖ｃ−ＤＮＡが合成された。このｃ
−ＤＮＡ0.３μg に前記項目４記載の方法を用いてポリ
デオキシシチジンのテイルを付加した。このｃ−ＤＮＡ
20ngと前記項目６で調製したポリグアノシンのテイルを
そのＰstI部位に付加した pＵＣ19プラスミドＤＮＡ500
ng とを、前記項目７記載の方法でアニールし、得られ
るＤＮＡで大腸菌ＤＨ１株 (ATCC 33849) をハナハン(H
anahan) の方法〔「ディエヌエイ・クローニング」（Ｄ
ＮＡ Cloning): 第１巻、第109〜135頁(1985)〕で形質
転換し、ルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−ＤＮＡバンクを
作製した。 13. ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−Ｄ
ＮＡの検索 前記項目10で得られた組み換え体プラスミド pＡＬf ３
ＤＮＡ10μg を、ＴＥ緩衝液90μＬ に溶解し、Ｍed緩
衝液10μＬ 、制限酵素ＥcoＲI25ユニット及び制限酵
素のＣlaI (いずれも宝酒造社製) 25ユニットを添加
し、37℃で２時間反応を行ないＤＮＡを切断した。切断
した組み換え体プラスミド pＡＬf ３ＤＮＡよりフォテ
ナス・ピラリス (アメリカホタル) 由来のルシフェラー
ゼｃ−ＤＮＡ部分を含む 800bpのＥcoＲI／ＣlaIＤＮＡ
フラグメントを、前記項目９記載のアガロースゲル電気
泳動法を用いる方法に従って単離し、１μg のＥcoＲI
／ＣlaIＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡ１μg
を、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ三燐酸（アマシャム社製）を
用いて前記項目９記載のニックトランスレーション法に
より32Ｐで標識した。32Ｐで標識したＥcoＲI／ＣlaIＤ
ＮＡフラグメントをプローブとして、ルシオラ・クルシ
アタ尾部ｃ−ＤＮＡバンクを項目10記載のコロニーハイ
ブリダイゼーション法で検索することによりルシオラ・
クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを有する大
腸菌を選択した。その結果、プローブとハイブリダイズ
する大腸菌コロニーを数個得た。この中の１コロニーの
有する組み換え体プラスミドＤＮＡを pＧＬf １と命名
し、前記項目５記載の方法に従い組み換え体プラスミド
ＤＮＡを単離した。該組み換え体プラスミドＤＮＡを含
有する大腸菌を大腸菌ＤＨ１(pＧＬf １) と命名した。
なお、該形質転換株はＡＴＣＣ67482 として寄託されて
いる。
より0.９μg の二本鎖ｃ−ＤＮＡが合成された。このｃ
−ＤＮＡ0.３μg に前記項目４記載の方法を用いてポリ
デオキシシチジンのテイルを付加した。このｃ−ＤＮＡ
20ngと前記項目６で調製したポリグアノシンのテイルを
そのＰstI部位に付加した pＵＣ19プラスミドＤＮＡ500
ng とを、前記項目７記載の方法でアニールし、得られ
るＤＮＡで大腸菌ＤＨ１株 (ATCC 33849) をハナハン(H
anahan) の方法〔「ディエヌエイ・クローニング」（Ｄ
ＮＡ Cloning): 第１巻、第109〜135頁(1985)〕で形質
転換し、ルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−ＤＮＡバンクを
作製した。 13. ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−Ｄ
ＮＡの検索 前記項目10で得られた組み換え体プラスミド pＡＬf ３
ＤＮＡ10μg を、ＴＥ緩衝液90μＬ に溶解し、Ｍed緩
衝液10μＬ 、制限酵素ＥcoＲI25ユニット及び制限酵
素のＣlaI (いずれも宝酒造社製) 25ユニットを添加
し、37℃で２時間反応を行ないＤＮＡを切断した。切断
した組み換え体プラスミド pＡＬf ３ＤＮＡよりフォテ
ナス・ピラリス (アメリカホタル) 由来のルシフェラー
ゼｃ−ＤＮＡ部分を含む 800bpのＥcoＲI／ＣlaIＤＮＡ
フラグメントを、前記項目９記載のアガロースゲル電気
泳動法を用いる方法に従って単離し、１μg のＥcoＲI
／ＣlaIＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡ１μg
を、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ三燐酸（アマシャム社製）を
用いて前記項目９記載のニックトランスレーション法に
より32Ｐで標識した。32Ｐで標識したＥcoＲI／ＣlaIＤ
ＮＡフラグメントをプローブとして、ルシオラ・クルシ
アタ尾部ｃ−ＤＮＡバンクを項目10記載のコロニーハイ
ブリダイゼーション法で検索することによりルシオラ・
クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを有する大
腸菌を選択した。その結果、プローブとハイブリダイズ
する大腸菌コロニーを数個得た。この中の１コロニーの
有する組み換え体プラスミドＤＮＡを pＧＬf １と命名
し、前記項目５記載の方法に従い組み換え体プラスミド
ＤＮＡを単離した。該組み換え体プラスミドＤＮＡを含
有する大腸菌を大腸菌ＤＨ１(pＧＬf １) と命名した。
なお、該形質転換株はＡＴＣＣ67482 として寄託されて
いる。
【００５２】組み換え体プラスミドpＧＬf１ＤＮＡをＨ
paI，ＨindIII, ＥcoＲＶ, ＤraI,ＡflII, ＨincII,
ＰstI (いずれも宝酒造社製) 及ＳspI （ニューイング
ランドバイオラボ社製) を用い、単一消化及び二重消化
した。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法
により移動度パターン分析し、得られた移動度パターン
とλファージＤＮＡ(宝酒造社製) をHindIIIにより消化
して 得られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンとを対
比した。その結果、得られた分子量は、 2,000bpであっ
た。そして、上記プラスミドの制限酵素地図は図２に示
す通りである。 14. ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−Ｄ
ＮＡの塩基配列の解析 組み換え体プラスミド pＧＬf １ＤＮＡ10μg を制限酵
素ＰstI (宝酒造社製)で切断し、ルシフェラーゼｃ−Ｄ
ＮＡを含む2.０Ｋb ＤＮＡ断片を2.５μｇを得た。この
ＤＮＡ断片を、プラスミドpＵＣ119ＤＮＡ (宝酒造社
製) のＰstI部位にクローニングし、得られたプラスミ
ドＤＮＡはｃ−ＤＮＡの挿入方向の違いにより夫々 pＧ
Ｌf ２及び pＧＬf ３と命名した。組み換え体プラスミ
ド pＧＬf １ＤＮＡ及びプラスミド pＵＣ119 ＤＮＡの
ＰstIによる切断処理(前記項目６記載の方法)、ルシフ
ェラーゼｃ−ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動法を
用いた単離 (前記項目９記載の方法) 、プラスミド pＵ
Ｃ119 ＤＮＡ及びルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ断片の連結
反応 (前記項目５記載の方法)、連結反応液を用いた大
腸菌ＪＭ101 株（ATCC 33876) の形質転換 (前記項目５
記載の方法) 、並びに組み換え体プラスミド pＧＬf ２
及び pＧＬf ３ＤＮＡの調製 (前記項目５記載の方法)
は、それぞれ前述の方法に従った。
paI，ＨindIII, ＥcoＲＶ, ＤraI,ＡflII, ＨincII,
ＰstI (いずれも宝酒造社製) 及ＳspI （ニューイング
ランドバイオラボ社製) を用い、単一消化及び二重消化
した。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法
により移動度パターン分析し、得られた移動度パターン
とλファージＤＮＡ(宝酒造社製) をHindIIIにより消化
して 得られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンとを対
比した。その結果、得られた分子量は、 2,000bpであっ
た。そして、上記プラスミドの制限酵素地図は図２に示
す通りである。 14. ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−Ｄ
ＮＡの塩基配列の解析 組み換え体プラスミド pＧＬf １ＤＮＡ10μg を制限酵
素ＰstI (宝酒造社製)で切断し、ルシフェラーゼｃ−Ｄ
ＮＡを含む2.０Ｋb ＤＮＡ断片を2.５μｇを得た。この
ＤＮＡ断片を、プラスミドpＵＣ119ＤＮＡ (宝酒造社
製) のＰstI部位にクローニングし、得られたプラスミ
ドＤＮＡはｃ−ＤＮＡの挿入方向の違いにより夫々 pＧ
Ｌf ２及び pＧＬf ３と命名した。組み換え体プラスミ
ド pＧＬf １ＤＮＡ及びプラスミド pＵＣ119 ＤＮＡの
ＰstIによる切断処理(前記項目６記載の方法)、ルシフ
ェラーゼｃ−ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動法を
用いた単離 (前記項目９記載の方法) 、プラスミド pＵ
Ｃ119 ＤＮＡ及びルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ断片の連結
反応 (前記項目５記載の方法)、連結反応液を用いた大
腸菌ＪＭ101 株（ATCC 33876) の形質転換 (前記項目５
記載の方法) 、並びに組み換え体プラスミド pＧＬf ２
及び pＧＬf ３ＤＮＡの調製 (前記項目５記載の方法)
は、それぞれ前述の方法に従った。
【００５３】次いで、組み換え体プラスミド pＧＬf ２
及び pＧＬf ３ＤＮＡを用いてキロシークエンス用欠失
キット (宝酒造社製) により、ヘニコフ(Henikoff)の方
法〔「ジーン」(Gene)、第28巻、第351 〜359 (1984)〕
に従いルシフェラーゼｃ−ＤＮＡに種々の欠失が導入さ
れたプラスミドＤＮＡを作製した。これらプラスミドＤ
ＮＡを前記項目５記載の方法で大腸菌JM 101株 (ATCC 3
3876) に導入した。このようにして得られた大腸菌にペ
ルパーファージＭ13ＫＯ７ (宝酒造社製) を感染させ、
メッシング (Messing)の方法〔「メソズ・イン・エンザ
イモロジー」(Methods in Enzymology) 、第101巻、第2
0〜78頁 (1983) 〕に従って１本鎖ＤＮＡを調製した。
得られた１本鎖ＤＮＡによるシークエンシングは、Ｍ13
シークエンシングキット (宝酒造社製) を用いて上記メ
ッシング(Messing) の方法に従い行なった。塩基配列の
解析のためのゲル電気泳動は８％(W/V) ポリアクリルア
ミドゲル (富士写真フィルム社製) を用いて行なった。
及び pＧＬf ３ＤＮＡを用いてキロシークエンス用欠失
キット (宝酒造社製) により、ヘニコフ(Henikoff)の方
法〔「ジーン」(Gene)、第28巻、第351 〜359 (1984)〕
に従いルシフェラーゼｃ−ＤＮＡに種々の欠失が導入さ
れたプラスミドＤＮＡを作製した。これらプラスミドＤ
ＮＡを前記項目５記載の方法で大腸菌JM 101株 (ATCC 3
3876) に導入した。このようにして得られた大腸菌にペ
ルパーファージＭ13ＫＯ７ (宝酒造社製) を感染させ、
メッシング (Messing)の方法〔「メソズ・イン・エンザ
イモロジー」(Methods in Enzymology) 、第101巻、第2
0〜78頁 (1983) 〕に従って１本鎖ＤＮＡを調製した。
得られた１本鎖ＤＮＡによるシークエンシングは、Ｍ13
シークエンシングキット (宝酒造社製) を用いて上記メ
ッシング(Messing) の方法に従い行なった。塩基配列の
解析のためのゲル電気泳動は８％(W/V) ポリアクリルア
ミドゲル (富士写真フィルム社製) を用いて行なった。
【００５４】得られたルシオラ・クルシアタ由来のルシ
フェラーゼｃ−ＤＮＡのみの全塩基配列を配列番号１
に、また、当該ｃ−ＤＮＡから翻訳されるポリペプチド
のアミノ酸配列を配列番号２に夫々示した。 15. 組み換え体プラスミド pＧＬf 37ＤＮＡの構築 先ず、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする塩基配列
を欠失し、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
遺伝子及びベクターＤＮＡを含有するＤＮＡ断片の調製
について述べる。組み換え体プラスミド pＧＬf １ＤＮ
Ａ１μg を、水９０μＬに溶解したものに、Ｍed緩衝液
10μＬ及びＰstＩ (宝酒造社製) 20ユニットを添加し、
37℃で２時間消化する。得られた消化物に、等量の水飽
和フェノールを添加し、常法による除蛋白処理及びエタ
ノール沈澱処理を行った。得られた沈殿物を前記項目５
に記載の方法にて、ライゲーションし、次いで大腸菌Ｊ
Ｍ101(ＡＴＣＣ33876)へ形質転換を行った。
フェラーゼｃ−ＤＮＡのみの全塩基配列を配列番号１
に、また、当該ｃ−ＤＮＡから翻訳されるポリペプチド
のアミノ酸配列を配列番号２に夫々示した。 15. 組み換え体プラスミド pＧＬf 37ＤＮＡの構築 先ず、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする塩基配列
を欠失し、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
遺伝子及びベクターＤＮＡを含有するＤＮＡ断片の調製
について述べる。組み換え体プラスミド pＧＬf １ＤＮ
Ａ１μg を、水９０μＬに溶解したものに、Ｍed緩衝液
10μＬ及びＰstＩ (宝酒造社製) 20ユニットを添加し、
37℃で２時間消化する。得られた消化物に、等量の水飽
和フェノールを添加し、常法による除蛋白処理及びエタ
ノール沈澱処理を行った。得られた沈殿物を前記項目５
に記載の方法にて、ライゲーションし、次いで大腸菌Ｊ
Ｍ101(ＡＴＣＣ33876)へ形質転換を行った。
【００５５】得られた形質転換体から前記項目５に記載
の方法によりＤＮＡを単離した。これをＳspＩ、ＥcoＲ
Ｖ及びＰstＩの制限酵素で単一又は二重消化して、もと
の組み換え体プラスミド pＧＬf １に対してｃ−ＤＮＡ
の向きが逆向きになっている組み換え体プラスミドを選
択し、 pＧＬf 10と命名した。組み換え体プラスミド p
ＧＬf 10ＤＮＡ10μg を、水90μＬに溶解したものに、
Ｍed緩衝液10μＬ及びＳspＩ (ニューイングランドバイ
オラボ社製) 10ユニットを添加し、37℃で30分処理し、
部分分解物を得た。この部分分解物より前記項目９記載
の方法により、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする
塩基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子及びベクター
ＤＮＡの大部分を含有する4.０Ｋb のＤＮＡ断片２μg
を単離した。
の方法によりＤＮＡを単離した。これをＳspＩ、ＥcoＲ
Ｖ及びＰstＩの制限酵素で単一又は二重消化して、もと
の組み換え体プラスミド pＧＬf １に対してｃ−ＤＮＡ
の向きが逆向きになっている組み換え体プラスミドを選
択し、 pＧＬf 10と命名した。組み換え体プラスミド p
ＧＬf 10ＤＮＡ10μg を、水90μＬに溶解したものに、
Ｍed緩衝液10μＬ及びＳspＩ (ニューイングランドバイ
オラボ社製) 10ユニットを添加し、37℃で30分処理し、
部分分解物を得た。この部分分解物より前記項目９記載
の方法により、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする
塩基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子及びベクター
ＤＮＡの大部分を含有する4.０Ｋb のＤＮＡ断片２μg
を単離した。
【００５６】次に、このＤＮＡ断片１μg を水95μＬに
溶解したものに、１Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ8.０) ５μ
Ｌ及びアルカリフォスファターゼ (宝酒造社製) 0.３ユ
ニット (１μＬ) を添加し、65℃で１時間処理し、常法
による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理したのち、両
端を脱リン酸した4.０Ｋb のＤＮＡ断片を１μg 得た。
溶解したものに、１Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ8.０) ５μ
Ｌ及びアルカリフォスファターゼ (宝酒造社製) 0.３ユ
ニット (１μＬ) を添加し、65℃で１時間処理し、常法
による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理したのち、両
端を脱リン酸した4.０Ｋb のＤＮＡ断片を１μg 得た。
【００５７】次に、大腸菌由来のトリプ(trp) プロモー
ターを含有するＤＮＡ断片の調製法について述べる。ト
リププロモーターを含有するプラスミド pＫＮ206 ＤＮ
Ａ〔「アグリク・バイオル・ケム」(Agric.Biol.Che
m.)、第50巻、第271 〜279 頁) (1986年) 記載のも
の〕10μg を、水90μＬに溶解し、Ｍed緩衝液10μＬ及
びＣlaＩ (宝酒造社製) 20ユニットを添加し、37℃で２
時間処理し、完全分解物を得た。これに前述のＳspＩ10
ユニットを添加し、温度37℃で30分間処理し、ＳspＩに
よる部分分解物を得た。これを常法による除蛋白処理及
びエタノール沈澱処理したのち、得られた沈澱を１00μ
ＬのＴＥ緩衝液に溶解し、前記項目９記載の方法によ
り、トリププロモーターの大部分を含有する500bのＤＮ
Ａ断片を単離した。
ターを含有するＤＮＡ断片の調製法について述べる。ト
リププロモーターを含有するプラスミド pＫＮ206 ＤＮ
Ａ〔「アグリク・バイオル・ケム」(Agric.Biol.Che
m.)、第50巻、第271 〜279 頁) (1986年) 記載のも
の〕10μg を、水90μＬに溶解し、Ｍed緩衝液10μＬ及
びＣlaＩ (宝酒造社製) 20ユニットを添加し、37℃で２
時間処理し、完全分解物を得た。これに前述のＳspＩ10
ユニットを添加し、温度37℃で30分間処理し、ＳspＩに
よる部分分解物を得た。これを常法による除蛋白処理及
びエタノール沈澱処理したのち、得られた沈澱を１00μ
ＬのＴＥ緩衝液に溶解し、前記項目９記載の方法によ
り、トリププロモーターの大部分を含有する500bのＤＮ
Ａ断片を単離した。
【００５８】次に合成ＤＮＡの調製について述べる。上
記4.０Ｋb のＤＮＡ断片に含まれるルシフェラーゼ遺伝
子は、塩基配列より推定したところＮ末端より９個のア
ミノ酸をコードする塩基配列を欠失している。また、上
記500bのＤＮＡ断片に含まれるトリププロモーターは、
ＳＤとＡＴＧ間の塩基配列の一部を欠失している。そこ
で、ルシフェラーゼのＮ末端より９個のアミノ酸をコー
ドする塩基配列及びトリププロモーターのＳＤ−ＡＴＧ
間の塩基配列を補うために、以下の２種の合成ＤＮＡ
（配列番号３及び配列番号４）をベッグマン社製のシス
テム１プラスＤＮＡ合成機を用いて合成した。
記4.０Ｋb のＤＮＡ断片に含まれるルシフェラーゼ遺伝
子は、塩基配列より推定したところＮ末端より９個のア
ミノ酸をコードする塩基配列を欠失している。また、上
記500bのＤＮＡ断片に含まれるトリププロモーターは、
ＳＤとＡＴＧ間の塩基配列の一部を欠失している。そこ
で、ルシフェラーゼのＮ末端より９個のアミノ酸をコー
ドする塩基配列及びトリププロモーターのＳＤ−ＡＴＧ
間の塩基配列を補うために、以下の２種の合成ＤＮＡ
（配列番号３及び配列番号４）をベッグマン社製のシス
テム１プラスＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００５９】これらの２種の合成ＤＮＡをデュポン社製
のネンソルブ・プレプ(NENSORB PREP)を用いることによ
り、20μg の精製された合成ＤＮＡを夫々得た。これら
２種の合成ＤＮＡ１μg を夫々水45μＬに溶解し、Ｘ10
カイネーション緩衝液〔0.5Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ7.
6)／0.1Ｍ MgCl250mMジチオスレイトール／10mMＡＴ
Ｐ〕５μＬを添加し、更に、Ｔ４ポリヌクレオチドカイ
ネース (宝酒造社製) 10ユニット (１μＬ) を添加した
のち温度37℃で１時間処理した。これを常法による除蛋
白処理及びエタノール沈澱処理を行い、5'末端をリン酸
化した合成ＤＮＡをそれぞれ１μg ずつ得た。
のネンソルブ・プレプ(NENSORB PREP)を用いることによ
り、20μg の精製された合成ＤＮＡを夫々得た。これら
２種の合成ＤＮＡ１μg を夫々水45μＬに溶解し、Ｘ10
カイネーション緩衝液〔0.5Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ7.
6)／0.1Ｍ MgCl250mMジチオスレイトール／10mMＡＴ
Ｐ〕５μＬを添加し、更に、Ｔ４ポリヌクレオチドカイ
ネース (宝酒造社製) 10ユニット (１μＬ) を添加した
のち温度37℃で１時間処理した。これを常法による除蛋
白処理及びエタノール沈澱処理を行い、5'末端をリン酸
化した合成ＤＮＡをそれぞれ１μg ずつ得た。
【００６０】次に、ライゲーション反応により目的のプ
ラスミドＤＮＡの取得を行った。上記の脱リン酸化した
Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失
したルシフェラーゼ遺伝子、ベクターＤＮＡを含む4.０
Ｋb のＤＮＡ断片１μｇ、上記のトリププロモーターを
含む 500bのＤＮＡ断片１μg 及び上記２種のリン酸化
した合成ＤＮＡ0.１μg を夫々８μＬの水に溶解した。
これにＸ10ライゲーション緩衝液〔200mM MgCl2/660mM
トリス塩酸緩衝液(pＨ7.6)／10mMＡＴＰ／150mM ジチオ
スレイトール〕１μＬの及びＴ４ＤＮＡライゲース (宝
酒造社製)１ユニット (１μＬ) を添加し、温度16℃に
て16時間反応を行った。得られた反応液を用いて前記項
目５に記載の方法にて大腸菌ＪＭ101(ＡＴＣＣ33876)へ
形質転換を行い、得られた形質転換体より、前記項目５
に記載の方法にてプラスミドＤＮＡを単離し、ＳspＩ、
ＥcoＲＶ及びＰstＩの制限酵素で単一又は二重消化し
た。これを、0.７％アガロースゲル電気泳動にて展開
し、トリププロモーターによりルシフェラーゼ遺伝子を
完全にコードするルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラ
スミドを得、該組み換え体プラスミドを、 pＧＬf 37と
命名した。また、該プラスミドを含有する大腸菌は大腸
菌ＪＭ101 (pＧＬf 37)と命名した。 16. 組み換え体プラスミド pＧＬf 37ＤＮＡの変異 組み換え体プラスミド pＧＬf 37ＤＮＡ30μg を、ヒド
ロキシルアミン溶液〔0.8M 塩酸ヒドロキシルアミン／
0.1M リン酸緩衝液(pＨ6.0)／1mM ＥＤＴＡ〕100μＬに
溶解し、65℃で２時間変異処理したのち、常法によりエ
タノール沈澱を行い沈澱物を回収した。この沈澱物をＴ
Ｅ緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／1mM ＥＤ
ＴＡ〕に溶解し、ハナハン（Hana-han) の方法〔ディー
エヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Cloning) 、第１巻、
第109〜135頁(1985)〕により、大腸菌JM 101株(ATCC 33
876)を形質転換し、ＬＢ-amp寒天培地〔バクトトリプト
ン１％(W/V), 酵母エキス0.5％(W/V), NaCl 0.5％(W/
V), アンピシリン(50μg／ml）及び1.4％(W/V)寒天〕に
接種し、37℃で培養した。12時間後、出現してきたコロ
ニーをＬＢ-amp培地〔バクトトリプトン１％(W/V),酵母
エキス0.5％(W/V),NaCl 0.5％(W/V),及びアンピシリン
(50μg／ml)〕３ml中、37℃で18時間振盪培養を行っ
た。この培養液 0.5mlを10mlの上記ＬＢ-amp培地に接種
し、37℃で４時間振盪培養したのち、8000r.p.m で10分
間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫々20mgずつ得た。
ラスミドＤＮＡの取得を行った。上記の脱リン酸化した
Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失
したルシフェラーゼ遺伝子、ベクターＤＮＡを含む4.０
Ｋb のＤＮＡ断片１μｇ、上記のトリププロモーターを
含む 500bのＤＮＡ断片１μg 及び上記２種のリン酸化
した合成ＤＮＡ0.１μg を夫々８μＬの水に溶解した。
これにＸ10ライゲーション緩衝液〔200mM MgCl2/660mM
トリス塩酸緩衝液(pＨ7.6)／10mMＡＴＰ／150mM ジチオ
スレイトール〕１μＬの及びＴ４ＤＮＡライゲース (宝
酒造社製)１ユニット (１μＬ) を添加し、温度16℃に
て16時間反応を行った。得られた反応液を用いて前記項
目５に記載の方法にて大腸菌ＪＭ101(ＡＴＣＣ33876)へ
形質転換を行い、得られた形質転換体より、前記項目５
に記載の方法にてプラスミドＤＮＡを単離し、ＳspＩ、
ＥcoＲＶ及びＰstＩの制限酵素で単一又は二重消化し
た。これを、0.７％アガロースゲル電気泳動にて展開
し、トリププロモーターによりルシフェラーゼ遺伝子を
完全にコードするルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラ
スミドを得、該組み換え体プラスミドを、 pＧＬf 37と
命名した。また、該プラスミドを含有する大腸菌は大腸
菌ＪＭ101 (pＧＬf 37)と命名した。 16. 組み換え体プラスミド pＧＬf 37ＤＮＡの変異 組み換え体プラスミド pＧＬf 37ＤＮＡ30μg を、ヒド
ロキシルアミン溶液〔0.8M 塩酸ヒドロキシルアミン／
0.1M リン酸緩衝液(pＨ6.0)／1mM ＥＤＴＡ〕100μＬに
溶解し、65℃で２時間変異処理したのち、常法によりエ
タノール沈澱を行い沈澱物を回収した。この沈澱物をＴ
Ｅ緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)／1mM ＥＤ
ＴＡ〕に溶解し、ハナハン（Hana-han) の方法〔ディー
エヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Cloning) 、第１巻、
第109〜135頁(1985)〕により、大腸菌JM 101株(ATCC 33
876)を形質転換し、ＬＢ-amp寒天培地〔バクトトリプト
ン１％(W/V), 酵母エキス0.5％(W/V), NaCl 0.5％(W/
V), アンピシリン(50μg／ml）及び1.4％(W/V)寒天〕に
接種し、37℃で培養した。12時間後、出現してきたコロ
ニーをＬＢ-amp培地〔バクトトリプトン１％(W/V),酵母
エキス0.5％(W/V),NaCl 0.5％(W/V),及びアンピシリン
(50μg／ml)〕３ml中、37℃で18時間振盪培養を行っ
た。この培養液 0.5mlを10mlの上記ＬＢ-amp培地に接種
し、37℃で４時間振盪培養したのち、8000r.p.m で10分
間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫々20mgずつ得た。
【００６１】回収した菌体を、0.1M KH2PO4 (pＨ7.8)、
２mMＥＤＴＡ、１mMジテオスレイトール、及び 0.2mg／
mlプロタミン硫酸からなる緩衝液 0.9mlに懸濁し、更
に、これに、10mg／mlのリゾチーム溶液100μＬを添加
し、氷中に15分間放置した。次に、この懸濁液を、メタ
ノール、ドライアイス浴中で凍結し、次いで温度25℃に
放置し、完全に解凍した。更に、12000r.p.m. で５分間
遠心分離操作を行うことにより、上清として粗酵素１ml
を得た。
２mMＥＤＴＡ、１mMジテオスレイトール、及び 0.2mg／
mlプロタミン硫酸からなる緩衝液 0.9mlに懸濁し、更
に、これに、10mg／mlのリゾチーム溶液100μＬを添加
し、氷中に15分間放置した。次に、この懸濁液を、メタ
ノール、ドライアイス浴中で凍結し、次いで温度25℃に
放置し、完全に解凍した。更に、12000r.p.m. で５分間
遠心分離操作を行うことにより、上清として粗酵素１ml
を得た。
【００６２】このようにして得られたルシフェラーゼを
含む粗酵素液を50℃で10分間熱処理し、その中の10μｌ
について、特開平1-141592号公報記載の方法で力価の測
定を行った。その結果野生型ゲンジボタルルシフェラー
ゼより熱安定性に優れているものを得た。更に、この粗
酵素液を特開平1-141592号公報記載の方法で精製し、上
記の方法で熱処理し、力価を測定した結果、野生型の精
製ルシフェラーゼより熱安定性に優れていることが判明
した。以上の如くして得られた耐熱性ルシフェラーゼを
コードする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミド
ＤＮＡを pＧＬf37 Ｔ−Ｍ−２と命名し、該組み換え体
プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌、すなわち大
腸菌 (E. coli) JM101(p ＧＬf37 Ｔ−Ｍ−２）は工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第3452号（FE
RM BP-3452）として寄託されている。
含む粗酵素液を50℃で10分間熱処理し、その中の10μｌ
について、特開平1-141592号公報記載の方法で力価の測
定を行った。その結果野生型ゲンジボタルルシフェラー
ゼより熱安定性に優れているものを得た。更に、この粗
酵素液を特開平1-141592号公報記載の方法で精製し、上
記の方法で熱処理し、力価を測定した結果、野生型の精
製ルシフェラーゼより熱安定性に優れていることが判明
した。以上の如くして得られた耐熱性ルシフェラーゼを
コードする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミド
ＤＮＡを pＧＬf37 Ｔ−Ｍ−２と命名し、該組み換え体
プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌、すなわち大
腸菌 (E. coli) JM101(p ＧＬf37 Ｔ−Ｍ−２）は工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第3452号（FE
RM BP-3452）として寄託されている。
【００６３】なお、このようにして得られた変異型ホタ
ルルシフェラーゼは野生型ホタルルシフェラーゼのアミ
ノ酸配列において217 位のスレオニンがイソロイシンに
置換されている。精製した本酵素１00キロカウント(Kco
unt)含有する酵素液100 μｌ〔10％飽和硫酸アンモニウ
ム、0.2mM エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム及び0.
2 ％（w/v)アルブミンを含有する10mMリン酸緩衝液（ p
Ｈ 7.6）〕を温度50℃で60分間保持して残存する酵素活
性を測定した。その結果本酵素は上記条件で65％の残存
酵素活性を保持していた。
ルルシフェラーゼは野生型ホタルルシフェラーゼのアミ
ノ酸配列において217 位のスレオニンがイソロイシンに
置換されている。精製した本酵素１00キロカウント(Kco
unt)含有する酵素液100 μｌ〔10％飽和硫酸アンモニウ
ム、0.2mM エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム及び0.
2 ％（w/v)アルブミンを含有する10mMリン酸緩衝液（ p
Ｈ 7.6）〕を温度50℃で60分間保持して残存する酵素活
性を測定した。その結果本酵素は上記条件で65％の残存
酵素活性を保持していた。
【００６４】なお、対照として野生型ホタルルシフェラ
ーゼについても上記と同様にして残存酵素活性を測定し
たところ活性は確認できなかった。 17. 部位特異的変換 次にゲンジボタルルシフェラーゼの217番目のスレオニ
ンを疎水性のアミノ酸であるバリン及びロイシンに変換
させる方法を記載する。
ーゼについても上記と同様にして残存酵素活性を測定し
たところ活性は確認できなかった。 17. 部位特異的変換 次にゲンジボタルルシフェラーゼの217番目のスレオニ
ンを疎水性のアミノ酸であるバリン及びロイシンに変換
させる方法を記載する。
【００６５】組み換え体プラスミドpGLf37ＤＮＡ10μg
を制限酵素EcoRI, PstI （いずれも宝酒造社製）で二重
消化し、ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを含む2.1kbＤＮＡ
断片2.5μgを得た。このＤＮＡ断片をプラスミドpUC119
ＤＮＡ（宝酒造社製）にサブクローンし、得られたプ
ラスミドＤＮＡをpGPM-1と命名した。次いで組み換え体
プラスミドpGPM-1を項目5記載の方法で大腸菌JM101( AT
CC33876）に導入した。このようにして得られた大腸菌
にヘルパーファージM13K07(宝酒造社製）を感染させる
ことにより、メッシング（Messing）の方法〔メソズ
イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、
第101巻、第20〜78項（1983）〕に従って１本鎖ＤＮＡ
を調製した。得られた１本鎖ＤＮＡによる部位特異的変
換は、インビトロ ミュータジェネシス システム バ
ージョン2.0（アマシャム社製）を用いて行った。な
お、部位特異的変換のプライマーとして用いる為に、以
下の２種に合成ＤＮＡを項目１５記載の方法で合成し
た。すなわち、バリン用のプライマーとして配列番号５
に示す合成ＤＮＡを、ロイシン用のプライマーとして配
列番号６に示す合成ＤＮＡを部位特異的変異に供するプ
ライマーとして夫々用いた。
を制限酵素EcoRI, PstI （いずれも宝酒造社製）で二重
消化し、ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを含む2.1kbＤＮＡ
断片2.5μgを得た。このＤＮＡ断片をプラスミドpUC119
ＤＮＡ（宝酒造社製）にサブクローンし、得られたプ
ラスミドＤＮＡをpGPM-1と命名した。次いで組み換え体
プラスミドpGPM-1を項目5記載の方法で大腸菌JM101( AT
CC33876）に導入した。このようにして得られた大腸菌
にヘルパーファージM13K07(宝酒造社製）を感染させる
ことにより、メッシング（Messing）の方法〔メソズ
イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、
第101巻、第20〜78項（1983）〕に従って１本鎖ＤＮＡ
を調製した。得られた１本鎖ＤＮＡによる部位特異的変
換は、インビトロ ミュータジェネシス システム バ
ージョン2.0（アマシャム社製）を用いて行った。な
お、部位特異的変換のプライマーとして用いる為に、以
下の２種に合成ＤＮＡを項目１５記載の方法で合成し
た。すなわち、バリン用のプライマーとして配列番号５
に示す合成ＤＮＡを、ロイシン用のプライマーとして配
列番号６に示す合成ＤＮＡを部位特異的変異に供するプ
ライマーとして夫々用いた。
【００６６】また、部位特異的変換遺伝子のシークエン
シングは、ダイプライマー タックシークェンシング
キット（アプライド バイオシステムズ社製）を用いて
反応を行い、ABI373A ＤＮＡシーケンサー（アプライド
バイオシステムズ社製）で泳動、解析を行った。この
ようにして得られた部位特異的変換遺伝子は、野生型ホ
タルルシフェラーゼの217番目のアミノ酸がバリン、ロ
イシンに変換されているアミノ酸配列をコードしてお
り、前者をpGPM-1-Val、後者をpGPM-1-Leuと命名した。
シングは、ダイプライマー タックシークェンシング
キット（アプライド バイオシステムズ社製）を用いて
反応を行い、ABI373A ＤＮＡシーケンサー（アプライド
バイオシステムズ社製）で泳動、解析を行った。この
ようにして得られた部位特異的変換遺伝子は、野生型ホ
タルルシフェラーゼの217番目のアミノ酸がバリン、ロ
イシンに変換されているアミノ酸配列をコードしてお
り、前者をpGPM-1-Val、後者をpGPM-1-Leuと命名した。
【００６７】次に部位特異的遺伝子pGPM-1-ValＤＮＡ及
びpGPM-1-LeuＤＮＡ10μｇを制限酵素EcoRI, PstI （い
ずれも宝酒造社製）で二重消化し、ルシフェラーゼｃ−
ＤＮＡを含む2.1kbＤＮＡ断片を、夫々2.5μgずつ得
た。これらのＤＮＡ断片を夫々組み換え体プラスミドpG
Lf37ＤＮＡを制限酵素EcoRI, PstI（いずれも宝酒造社
製）で二重消化して得たルシフェラーゼｃ─ＤＮＡを含
まないベクター部分にクローニングして得られたプラス
ミドＤＮＡをpGLf37-217Val,pGLf37-217Leuと命名し
た。
びpGPM-1-LeuＤＮＡ10μｇを制限酵素EcoRI, PstI （い
ずれも宝酒造社製）で二重消化し、ルシフェラーゼｃ−
ＤＮＡを含む2.1kbＤＮＡ断片を、夫々2.5μgずつ得
た。これらのＤＮＡ断片を夫々組み換え体プラスミドpG
Lf37ＤＮＡを制限酵素EcoRI, PstI（いずれも宝酒造社
製）で二重消化して得たルシフェラーゼｃ─ＤＮＡを含
まないベクター部分にクローニングして得られたプラス
ミドＤＮＡをpGLf37-217Val,pGLf37-217Leuと命名し
た。
【００６８】次いで、組み換え体プラスミドpGLf37-217
Val 及びpGLf37-217Leu を項目５記載の方法で大腸菌JM
101株（ATCC 33876）に導入し、大腸菌 (E. coli）JM10
１（pGLf37-217Val)及び大腸菌 (E. coli）JM101 (pGLf
37-217Leu）を得た。なお、これらの形質転換体のう
ち、大腸菌 (E. coli）JM10１（pGLf37-217Val)は、微
工研条寄第3647号（FERM BP-3647）として、大腸菌 (E.
coli）JM101 (pGLf37-217Leu）は微工研条寄第3648号
（FERM BP-3648）として、それぞれ工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。これらの形質転換体よ
り項目16記載の方法により粗酵素液を得、更にこの粗酵
素液を特開平1-141592号公報記載の方法で精製した。こ
のようにして得られた精製ルシフェラーゼを50℃で60分
間熱処理し、その中の10μＬについて特開平1-141592号
公報記載の方法で残存する酵素活性を測定したところ、
大腸菌 (E. coli）JM101 (pGLf37-217Val）由来ルシフ
ェラーゼは、65％残存酵素活性を保持し、また、大腸菌
(E. coli）JM101 (pGLf37-217Leu）由来ルシフェラー
ゼは、70％残存酵素活性を保持していた。 18. 組み換え体プラスミド pＨLf７ＤＮＡの変異 次にヘイケボタル（ルシオラ・ラテラリス（Luciola. l
ateralis) ）のルシフェラーゼの 217番目のアラニンを
疎水性のアミノ酸であるバリン、ロイシン及びイソロイ
シンに変換させる方法を記載する。
Val 及びpGLf37-217Leu を項目５記載の方法で大腸菌JM
101株（ATCC 33876）に導入し、大腸菌 (E. coli）JM10
１（pGLf37-217Val)及び大腸菌 (E. coli）JM101 (pGLf
37-217Leu）を得た。なお、これらの形質転換体のう
ち、大腸菌 (E. coli）JM10１（pGLf37-217Val)は、微
工研条寄第3647号（FERM BP-3647）として、大腸菌 (E.
coli）JM101 (pGLf37-217Leu）は微工研条寄第3648号
（FERM BP-3648）として、それぞれ工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。これらの形質転換体よ
り項目16記載の方法により粗酵素液を得、更にこの粗酵
素液を特開平1-141592号公報記載の方法で精製した。こ
のようにして得られた精製ルシフェラーゼを50℃で60分
間熱処理し、その中の10μＬについて特開平1-141592号
公報記載の方法で残存する酵素活性を測定したところ、
大腸菌 (E. coli）JM101 (pGLf37-217Val）由来ルシフ
ェラーゼは、65％残存酵素活性を保持し、また、大腸菌
(E. coli）JM101 (pGLf37-217Leu）由来ルシフェラー
ゼは、70％残存酵素活性を保持していた。 18. 組み換え体プラスミド pＨLf７ＤＮＡの変異 次にヘイケボタル（ルシオラ・ラテラリス（Luciola. l
ateralis) ）のルシフェラーゼの 217番目のアラニンを
疎水性のアミノ酸であるバリン、ロイシン及びイソロイ
シンに変換させる方法を記載する。
【００６９】特開平2-171189号公報記載の方法で取得し
た組み換え体プラスミド pＨLf７を項目５記載の方法で
大腸菌JM101 (ATCC 33876)に導入した。なお、得られた
ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼc-ＤＮＡの
みの全塩基配列を配列番号７に、また、当該c-ＤＮＡか
ら選定されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号８
に夫々示した。このようにして得られた大腸菌より項目
17記載の方法で１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本
鎖ＤＮＡによる部位特異的変換は、インビトロミュータ
ジェネシスシステム バージョン−2.０ (アマシャム社
製) を用いて行なった。なお部位特異的変換のプライマ
ーとして用いる為に、以下の３種の合成ＤＮＡを項目15
記載の方法で合成した。すなわち、バリン用のプライマ
ーとして配列番号９に示す合成ＤＮＡを、ロイシン用プ
ライマーとして配列番号10に示す合成ＤＮＡを、イソロ
イシン用のプライマーとして配列番号11に示す合成ＤＮ
Ａを部位特異的変異に供するプライマーとして夫々用い
た。また部位特異的変異遺伝子のシークエンシングは、
ダイプライマー タックシークエンシングキット (アプ
ライドバイオシステムズ社製) を用いて反応を行ない、
ABI 373A ＤＮＡシークエンサー (アプライドバイオシ
ステムズ社製) で泳動解析を行なった。このようにして
得られた組み換え体プラスミドにおけるルシフェラーゼ
の部位特異的変換遺伝子は、野生型ヘイケボタルルシフ
ェラーゼの 217番目のアミノ酸に相当する遺伝子部分が
バリン、ロイシン、イソロイシンに変換されているアミ
ノ酸をコードしており、夫々pHLf7-217Val、 pHLf7-217
Leu 、pHLf7-217Ileと命名した。
た組み換え体プラスミド pＨLf７を項目５記載の方法で
大腸菌JM101 (ATCC 33876)に導入した。なお、得られた
ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼc-ＤＮＡの
みの全塩基配列を配列番号７に、また、当該c-ＤＮＡか
ら選定されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号８
に夫々示した。このようにして得られた大腸菌より項目
17記載の方法で１本鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本
鎖ＤＮＡによる部位特異的変換は、インビトロミュータ
ジェネシスシステム バージョン−2.０ (アマシャム社
製) を用いて行なった。なお部位特異的変換のプライマ
ーとして用いる為に、以下の３種の合成ＤＮＡを項目15
記載の方法で合成した。すなわち、バリン用のプライマ
ーとして配列番号９に示す合成ＤＮＡを、ロイシン用プ
ライマーとして配列番号10に示す合成ＤＮＡを、イソロ
イシン用のプライマーとして配列番号11に示す合成ＤＮ
Ａを部位特異的変異に供するプライマーとして夫々用い
た。また部位特異的変異遺伝子のシークエンシングは、
ダイプライマー タックシークエンシングキット (アプ
ライドバイオシステムズ社製) を用いて反応を行ない、
ABI 373A ＤＮＡシークエンサー (アプライドバイオシ
ステムズ社製) で泳動解析を行なった。このようにして
得られた組み換え体プラスミドにおけるルシフェラーゼ
の部位特異的変換遺伝子は、野生型ヘイケボタルルシフ
ェラーゼの 217番目のアミノ酸に相当する遺伝子部分が
バリン、ロイシン、イソロイシンに変換されているアミ
ノ酸をコードしており、夫々pHLf7-217Val、 pHLf7-217
Leu 、pHLf7-217Ileと命名した。
【００７０】次いで、組み換え体プラスミドpHLf7-217V
al、pHLf7-217Leu、pHLf7-217Ileを項目５記載の方法で
大腸菌 JM101株 (ATCC 33876) に導入し、大腸菌 (E. c
oli）JM101 (pHLf7-217Val)、大腸菌 (E. coli）JM101
(pHLf7-217Leu)、及び大腸菌 (E. coli）JM101 (pHLf7-
217Ile)、を得た。なお、これらの形質転換体のうち、
大腸菌 (E.coli) JM101 (pHLf7-217Val)は、微工研条寄
第3839号（FERM BP-3839）として；大腸菌 (E. coli）J
M101 (pHLf7-217Leu)は、微工研条寄第3840号（FERM BP
-3840）として；、大腸菌 (E. coli） JM101 (pHLf7-21
7Ile) は、微工研条寄第3841号（FERM BP-3841）とし
て、夫々工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。これらの形質転換体より項目16記載の方法により
粗酵素液を得、更に、この粗酵素液を特開平1-262791号
公報記載の方法で精製した。このようにして得られた精
製ルシフェラーゼを50℃で60分間熱処理し、その中の10
μl について特開平1-262791号公報記載の方法で残存す
る酵素活性を測定したところ、すべて65％以上の残存活
性を保持していた。
al、pHLf7-217Leu、pHLf7-217Ileを項目５記載の方法で
大腸菌 JM101株 (ATCC 33876) に導入し、大腸菌 (E. c
oli）JM101 (pHLf7-217Val)、大腸菌 (E. coli）JM101
(pHLf7-217Leu)、及び大腸菌 (E. coli）JM101 (pHLf7-
217Ile)、を得た。なお、これらの形質転換体のうち、
大腸菌 (E.coli) JM101 (pHLf7-217Val)は、微工研条寄
第3839号（FERM BP-3839）として；大腸菌 (E. coli）J
M101 (pHLf7-217Leu)は、微工研条寄第3840号（FERM BP
-3840）として；、大腸菌 (E. coli） JM101 (pHLf7-21
7Ile) は、微工研条寄第3841号（FERM BP-3841）とし
て、夫々工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。これらの形質転換体より項目16記載の方法により
粗酵素液を得、更に、この粗酵素液を特開平1-262791号
公報記載の方法で精製した。このようにして得られた精
製ルシフェラーゼを50℃で60分間熱処理し、その中の10
μl について特開平1-262791号公報記載の方法で残存す
る酵素活性を測定したところ、すべて65％以上の残存活
性を保持していた。
【００７１】上記より明らかな如く本発明は、対照に比
し著しく耐熱性を有するルシフェラーゼであることが判
った。
し著しく耐熱性を有するルシフェラーゼであることが判
った。
【００７２】
【発明の効果】本発明により耐熱性ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子、この遺伝子を組み換え体ＤＮＡ及び該組み換
え体ＤＮＡを含む微生物により耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼを製造する方法並びにそのようにして得られた新規
な耐熱性ホタルルシフェラーゼが提供された。そして、
本発明の方法により、耐熱性ホタルルシフェラーゼを効
率よく生産することができるので、本発明は産業上極め
て有用である。
ゼ遺伝子、この遺伝子を組み換え体ＤＮＡ及び該組み換
え体ＤＮＡを含む微生物により耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼを製造する方法並びにそのようにして得られた新規
な耐熱性ホタルルシフェラーゼが提供された。そして、
本発明の方法により、耐熱性ホタルルシフェラーゼを効
率よく生産することができるので、本発明は産業上極め
て有用である。
【００７３】
【配列表】１．配列番号１ (１) 配列の長さ： 1644 (２) 配列の型：核酸 (３) 鎖の数：一本鎖 (４) トポロジー：直鎖状 (５) 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ (６) 起源：ルシオラ・クルシアタ （７）配列： ATG GAA AAC ATG GAA AAC GAT GAA AAT ATT GTA GTT GGA CCT AAA 45 CCG TTT TAC CCT ATC GAA GAG GGA TCT GCT GGA ACA CAA TTA CGC 90 AAA TAC ATG GAG CGA TAT GCA AAA CTT GGC GCA ATT GCT TTT ACA 135 AAT GCA GTT ACT GGT GTT GAT TAT TCT TAC GCC GAA TAC TTG GAG 180 AAA TCA TGT TGT CTA GGA AAA GCT TTG CAA AAT TAT GGT TTG GTT 225 GTT GAT GGC AGA ATT GCG TTA TGC AGT GAA AAC TGT GAA GAA TTT 270 TTT ATT CCT GTA ATA GCC GGA CTG TTT ATA GGT GTA GGT GTT GCA 315 CCC ACT AAT GAG ATT TAC ACT TTA CGT GAA CTG GTT CAC AGT TTA 360 GGT ATC TCT AAA CCA ACA ATT GTA TTT AGT TCT AAA AAA GGC TTA 405 GAT AAA GTT ATA ACA GTA CAG AAA ACA GTA ACT ACT ATT AAA ACC 450 ATT GTT ATA CTA GAT AGC AAA GTT GAT TAT CGA GGA TAT CAA TGT 495 CTG GAC ACC TTT ATA AAA AGA AAC ACT CCA CCA GGT TTT CAA GCA 540 TCC AGT TTC AAA ACT GTG GAA GTT GAC CGT AAA GAA CAA GTT GCT 585 CTT ATA ATG AAC TCT TCG GGT TCT ACC GGT TTG CCA AAA GGC GTA 630 CAA CTT ACT CAC GAA AAT ACA GTC ACT AGA TTT TCT CAT GCT AGA 675 GAT CCG ATT TAT GGT AAC CAA GTT TCA CCA GGC ACC GCT GTT TTA 720 ACT GTC GTT CCA TTC CAT CAT GGT TTT GGT ATG TTC ACT ACT CTA 765 GGG TAT TTA ATT TGT GGT TTT CGT GTT GTA ATG TTA ACA AAA TTC 810 GAT GAA GAA ACA TTT TTA AAA ACT CTA CAA GAT TAT AAA TGT ACA 855 AGT GTT ATT CTT GTA CCG ACC TTG TTT GCA ATT CTC AAC AAA AGT 900 GAA TTA CTC AAT AAA TAC GAT TTG TCA AAT TTA GTT GAG ATT GCA 945 TCT GGC GGA GCA CCT TTA TCA AAA GAA GTT GGT GAA GCT GTT GCT 990 AGA CGC TTT AAT CTT CCC GGT GTT CGT CAA GGT TAT GGT TTA ACA 1035 GAA ACA ACA TCT GCC ATT ATT ATT ACA CCA GAA GGA GAC GAT AAA 1080 CCA GGA GCT TCT GGA AAA GTC GTG CCG TTG TTT AAA GCA AAA GTT 1125 ATT GAT CTT GAT ACC AAA AAA TCT TTA GGT CCT AAC AGA CGT GGA 1170 GAA GTT TGT GTT AAA GGA CCT ATG CTT ATG AAA GGT TAT GTA AAT 1215 AAT CCA GAA GCA ACA AAA GAA CTT ATT GAC GAA GAA GGT TGG CTG 1260 CAC ACC GGA GAT ATT GGA TAT TAT GAT GAA GAA AAA CAT TTC TTT 1305 ATT GTC GAT CGT TTG AAG TCT TTA ATC AAA TAC AAA GGA TAC CAA 1350 GTA CCA CCT GCC GAA TTA GAA TCC GTT CTT TTG CAA CAT CCA TCT 1395 ATC TTT GAT GCT GGT GTT GCC GGC GTT CCT GAT CCT GTA GCT GGC 1440 GAG CTT CCA GGA GCC GTT GTT GTA CTG GAA AGC GGA AAA AAT ATG 1485 ACC GAA AAA GAA GTA ATG GAT TAT GTT GCA AGT CAA GTT TCA AAT 1530 GCA AAA CGT TTA CGT GGT GGT GTT CGT TTT GTG GAT GAA GTA CCT 1575 AAA GGT CTT ACT GGA AAA ATT GAC GGC AGA GCA ATT AGA GAA ATC 1620 CTT AAG AAA CCA GTT GCT AAG ATG 1644 ２．配列番号２ (１) 配列の長さ： 548 (２) 配列の型：アミノ酸 (３) トポロジー：直鎖状 (４) 配列の種類：ペプチド (５) 配列の起源：ルシオラ・クルシアタ （６）配 列： ３. 配列番号３ (１) 配列の長さ：32 (２) 配列の型 ：核酸 (３) 鎖の数 ：一本鎖 (４) トポロジー：直鎖状 (５) 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー (６) 配 列 ：CGA CAA TGG AAA ACA TGG AAA ACG ATG AAA AT ４. 配列番号４ (１) 配列の長さ：30 (２) 配列の型 ：核酸 (３) 鎖の数 ：一本鎖 (４) トポロジー：直鎖状 (５) 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー (６) 配 列 ：ATT TTC ATC GTT TTC CAT GTT TTC CAT TGT ５. 配列番号５ (１) 配列の長さ：38 (２) 配列の型 ：核酸 (３) 鎖の数 ：一本鎖 (４) トポロジー：直鎖状 (５) 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー (６) 配 列 ：CTC TAG CAT GCG AAA ATC TAG TGA CTA CAT TTT CGT GA ６. 配列番号６ (１) 配列の長さ：38 (２) 配列の型 ：核酸 (３) 鎖の数 ：一本鎖 (４) トポロジー：直鎖状 (５) 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー (６) 配 列 ：CTC TAG CAT GCG AAA ATC TAG TGA CGA CAT TTT CGT GA ７．配列番号７ （１）配列の長さ：1644 （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ （６）配列の起源：ルシオラ・ラテラリス （７）配列： ８．配列番号８ （１）配列の長さ： 548 （２）配列の型：アミノ酸 （３）トポロジー：直鎖状 （４）配列の種類：ペプチド （５）配列の起源：ルシオラ・ラテラリス （６）配 列： ９. 配列番号９ (１) 配列の長さ：36 (２) 配列の型 ：核酸 (３) 鎖の数 ：一本鎖 (４) トポロジー：直鎖状 (５) 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー (６) 配 列 ：AGC GTG AGA AAA ACG CGT GAC GAC ATT TTC ACG AGT １０. 配列番号10 (１) 配列の長さ：36 (２) 配列の型 ：核酸 (３) 鎖の数 ：一本鎖 (４) トポロジー：直鎖状 (５) 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー (６) 配 列 ：AGC GTG AGA AAA ACG CGT GAC CAA ATT TTC ACG AGT １１. 配列番号11 (１) 配列の長さ：36 (２) 配列の型 ：核酸 (３) 鎖の数 ：一本鎖 (４) トポロジー：直鎖状 (５) 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー (６) 配 列 ：AGC GTG AGA AAA ACG CGT GAC GAT ATT TTC ACG AGT
【図１】組み換え体プラスミドｐＡＬｆＤＮＡの制限酵
素による切断地図。
素による切断地図。
【図２】組み換え体プラスミドｐＧＬｆＤＮＡの制限酵
素による切断地図。
素による切断地図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−３４５２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４８ (56)参考文献 特開 平３−285683（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−171189（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，77（1989），（２），ｐ. 265−270 Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌ ｕｍｉｎ．，３（1989），（２），ｐ. 75−78 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 C12N 9/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列において、２１７位のアミノ酸、又はゲンジボタル
若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７位と同
等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸（アラニンを除く）
に変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボ
タル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである請求
項１記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項３】 疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシ
ン、若しくはバリンである請求項１又は請求項２記載の
ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項４】 請求項１又は請求項２記載の耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したこ
とを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項４記載の組み換え体ＤＮＡを含
み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシ
ェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より
耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とす
る耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。 - 【請求項６】 野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列において、２１７位のアミノ酸、又はゲンジボタル
若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの２１７位と同
等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸（アラニンを除く）
に変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフ
ェラーゼ。 - 【請求項７】 野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボ
タル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである請求
項６記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/903,047 US5229285A (en) | 1991-06-27 | 1992-06-23 | Thermostable luciferase of firefly, thermostable luciferase gene of firefly, novel recombinant dna, and process for the preparation of thermostable luciferase of firefly |
| DK92110808T DK0524448T3 (da) | 1991-06-27 | 1992-06-26 | Varmestabil luciferase fra en ildflue, gen fra en varmestabil luciferase fra en ildflue, hidtil ukendt rekombinant-DNA og f |
| DE69229376T DE69229376T2 (de) | 1991-06-27 | 1992-06-26 | Thermostabile Luciferase des Leuchtkäfers, Gen der thermostabilen Luciferase des Leuchtkäfers, rekombinante DNS, und Verfahren zur Herstellung der thermostabilen Luciferase des Leuchtkäfers |
| EP92110808A EP0524448B1 (en) | 1991-06-27 | 1992-06-26 | Thermostable luciferase of a firefly, gene of a thermostable luciferase of a firefly, novel recombinant DNA, and process for the preparation of a thermostable luciferase of a firefly |
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|---|---|---|---|
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| JP3-157117 | 1991-11-29 | ||
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Publications (2)
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|---|---|
| JP (1) | JP3048466B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US10851141B2 (en) | 2016-06-21 | 2020-12-01 | Dkk-Toa Corporation | Mutant beetle luciferase, gene, recombinant vector, transformant, and method for preparing mutant beetle luciferase |
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-
1992
- 1992-05-22 JP JP04131057A patent/JP3048466B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，７７（１９８９），（２），ｐ．２６５−２７０ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，３（１９８９），（２），ｐ．７５−７８ |
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Also Published As
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| JPH05244942A (ja) | 1993-09-24 |
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