JP2666561B2 - 変異型ホタルルシフェラーゼ、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造法 - Google Patents
変異型ホタルルシフェラーゼ、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、変異型ホタルルシフェラーゼ、変異型ホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体DNA及び変
異型ホタルルシフェラーゼの製造法に関する。
ルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体DNA及び変
異型ホタルルシフェラーゼの製造法に関する。
従来、野生型ホタルルシフェラーゼとしては、例え
ば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカボタル等由
来のルシフェラーゼが知られており、これらルシフェラ
ーゼをルシフェリンと反応させた場合、黄緑色（波長56
0nm前後）の光を発する。
ば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカボタル等由
来のルシフェラーゼが知られており、これらルシフェラ
ーゼをルシフェリンと反応させた場合、黄緑色（波長56
0nm前後）の光を発する。
しかしながら、黄緑色以外の光を発するホタル由来ル
シフェラーゼは、全く知られていないのが実情である。
シフェラーゼは、全く知られていないのが実情である。
そして、野生型ホタルルシフェラーゼを用いて、赤色
等の有色溶液中の物質、例えば、血液中のATP含有量を
測定する場合、著しく測定感度が低下する等の欠点があ
った。
等の有色溶液中の物質、例えば、血液中のATP含有量を
測定する場合、著しく測定感度が低下する等の欠点があ
った。
そこで、先に本発明者等は、黄緑色以外の光を発する
変異型ホタルルシフェラーゼを取得すべく種々検討した
結果、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を変異処理し
て変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を取得し、該遺伝
子をベクターDNAに挿入した組み換え体NDAを含み、変異
型ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア
属に属する微生物を培地に培養すれば、野生型ホタルル
シフェラーゼの発光する波長とは全く異なる、例えば、
赤色、オレンジ色等の光を発光することのできる変異型
ホタルルシフェラーゼを効率よく得ることができること
等の知見を得、特許出願を行った（特願平２−75696
号）。
変異型ホタルルシフェラーゼを取得すべく種々検討した
結果、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を変異処理し
て変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を取得し、該遺伝
子をベクターDNAに挿入した組み換え体NDAを含み、変異
型ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア
属に属する微生物を培地に培養すれば、野生型ホタルル
シフェラーゼの発光する波長とは全く異なる、例えば、
赤色、オレンジ色等の光を発光することのできる変異型
ホタルルシフェラーゼを効率よく得ることができること
等の知見を得、特許出願を行った（特願平２−75696
号）。
更に、本発明者等は、上記以外の光を発する変異型ホ
タルルシフェラーゼを取得すべく種々検討した結果、野
生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を取得し、該遺伝子を
ベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含み、変異型ホ
タルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養すれば、緑の光を発光するこ
とのできる変異型ホタルルシフェラーゼを効率よく得る
ことができることの知見を得、更にまた、上記した赤
色、オレンジ色及び緑色の光を発光することのできる変
異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を夫々単離、構造決定
することに成功し、本発明を完成した。
タルルシフェラーゼを取得すべく種々検討した結果、野
生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を取得し、該遺伝子を
ベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含み、変異型ホ
タルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養すれば、緑の光を発光するこ
とのできる変異型ホタルルシフェラーゼを効率よく得る
ことができることの知見を得、更にまた、上記した赤
色、オレンジ色及び緑色の光を発光することのできる変
異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を夫々単離、構造決定
することに成功し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、次の構造を含むものである。
（１） ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼの
アミノ酸配列においてその233位のバリンがイソロイシ
ンに、239位のバリンがイソロイシンに、286位のセリン
がアスパラギンに、326位のグリシンがセリンに、433位
のヒスチジンがチロシンに、または452位のプロリンが
セリンに変異されているアミノ酸配列をコードする変異
型ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
アミノ酸配列においてその233位のバリンがイソロイシ
ンに、239位のバリンがイソロイシンに、286位のセリン
がアスパラギンに、326位のグリシンがセリンに、433位
のヒスチジンがチロシンに、または452位のプロリンが
セリンに変異されているアミノ酸配列をコードする変異
型ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
（２） 上記（１）記載の変異型ホタルルシフェラーゼ
遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み
換え体DNA。
遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み
換え体DNA。
（３） ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼの
アミノ酸配列においてその233位のバリンがイソロイシ
ンに、239位のバリンがイソロイシンに、286位のセリン
がアスパラギンに、326位のグリセリンがセリンに、433
位のヒスチジンがチロシンに、または452位のプロリン
がセリンに変異されているアミノ酸配列をコードする変
異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入
した組み換え体DNAを含み、変異型ホタルルシフェラー
ゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培
地に培養し、培養物より、変異型ホタルルシフェラーゼ
を採取することを特徴とする変異型ホタルルシフェラー
ゼの製造法。
アミノ酸配列においてその233位のバリンがイソロイシ
ンに、239位のバリンがイソロイシンに、286位のセリン
がアスパラギンに、326位のグリセリンがセリンに、433
位のヒスチジンがチロシンに、または452位のプロリン
がセリンに変異されているアミノ酸配列をコードする変
異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入
した組み換え体DNAを含み、変異型ホタルルシフェラー
ゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培
地に培養し、培養物より、変異型ホタルルシフェラーゼ
を採取することを特徴とする変異型ホタルルシフェラー
ゼの製造法。
（４） ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼの
アミノ酸配列においてその233位のバリンがイソロイシ
ンに、239位のバリンがイソロイシンに、286位のセリン
がアスパラギンに、326位のグリシンがセリンに、433位
のヒスチジンがチロシンに、または452位のプロリンが
セリンに変異されていることを特徴とする変異型ホタル
ルシフェラーゼ。
アミノ酸配列においてその233位のバリンがイソロイシ
ンに、239位のバリンがイソロイシンに、286位のセリン
がアスパラギンに、326位のグリシンがセリンに、433位
のヒスチジンがチロシンに、または452位のプロリンが
セリンに変異されていることを特徴とする変異型ホタル
ルシフェラーゼ。
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明に用いられる野生型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子としては、ホタル由来のものであれば、如何な
るものでもよく、例えは、ゲンジボタル、ヘイケボタ
ル、アメリカボタル等由来のものが挙げられる。
ゼ遺伝子としては、ホタル由来のものであれば、如何な
るものでもよく、例えは、ゲンジボタル、ヘイケボタ
ル、アメリカボタル等由来のものが挙げられる。
そして、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を変異処
理して変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を得るのであ
る、 この変異処理においては、野生型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子をそのまま変異処理してもよく、また、該遺伝
子を、プラスミドベクターあるいはバクテリオファージ
ベクター等のベクターDNAに組み込んで得られる組み換
え体DNAを変異処理してもよい。
理して変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を得るのであ
る、 この変異処理においては、野生型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子をそのまま変異処理してもよく、また、該遺伝
子を、プラスミドベクターあるいはバクテリオファージ
ベクター等のベクターDNAに組み込んで得られる組み換
え体DNAを変異処理してもよい。
上記野生型ゲンジボタル遺伝子及びその組み換え体DN
Aは、特開平１−51086号公報記載の方法あるいは野生型
ヘイケボタル遺伝子及びその組み換え体DNAは、特願昭6
3−322029号明細書記載の方法等により得ることができ
る。
Aは、特開平１−51086号公報記載の方法あるいは野生型
ヘイケボタル遺伝子及びその組み換え体DNAは、特願昭6
3−322029号明細書記載の方法等により得ることができ
る。
次いで、上記変異処理としては、例えば、野生型ホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子あるいは該遺伝子の組み込まれ
た組み換え体DNAと、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ
−メチル−Ｎ ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝
酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシル等
の薬剤とを（接触作用させる量としては、如何なる量で
もよく、好ましくは、0.5〜12Mである。）例えば、温度
20〜80℃で10分間以上、好ましくは10〜180分間接触作
用させるか、あるいは上記遺伝子あるいは組み換え体DN
Aに、紫外線を例えば、10〜60分間程度照射等の処理等
が挙げられ、また有機合成、酵素合成による合成DNAを
用いることもできる。
ルルシフェラーゼ遺伝子あるいは該遺伝子の組み込まれ
た組み換え体DNAと、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ
−メチル−Ｎ ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝
酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシル等
の薬剤とを（接触作用させる量としては、如何なる量で
もよく、好ましくは、0.5〜12Mである。）例えば、温度
20〜80℃で10分間以上、好ましくは10〜180分間接触作
用させるか、あるいは上記遺伝子あるいは組み換え体DN
Aに、紫外線を例えば、10〜60分間程度照射等の処理等
が挙げられ、また有機合成、酵素合成による合成DNAを
用いることもできる。
上述の如くして得られた変異型ホタルルシフェラーゼ
遺伝子を、常法により特開平１−51086号公報あるいは
特願昭63−322029号明細書記載のプラスミド、バクテリ
オファージベクター等のベクターDNAに組み込み、組み
換え体DNAを得、この組み換え体DNA又は上述の如くして
得られた変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の組み込ま
れた組み換え体DNAを用いて、例えば、エッシェリシア
属に属する微生物、例えば、大腸菌（E.coli）JM 101
（ATCC 33876）、大腸菌（E.coli）DH 1（ATCC 3384
9）、大腸菌（E.coli）HB 101（ATCC 33694）等をハナ
ハン（Hana−han）の方法〔ディーエヌエイ．クローニ
ング（DNA Cloning）、第１巻、第109〜135頁（198
5）〕等により形質転換するか、あるいはモレキュラー
・クローニング（Molecular Cloning）、第256〜268
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）記載の方
法等により形質導入して形質転換株あるいは形質導入株
を得る。
遺伝子を、常法により特開平１−51086号公報あるいは
特願昭63−322029号明細書記載のプラスミド、バクテリ
オファージベクター等のベクターDNAに組み込み、組み
換え体DNAを得、この組み換え体DNA又は上述の如くして
得られた変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の組み込ま
れた組み換え体DNAを用いて、例えば、エッシェリシア
属に属する微生物、例えば、大腸菌（E.coli）JM 101
（ATCC 33876）、大腸菌（E.coli）DH 1（ATCC 3384
9）、大腸菌（E.coli）HB 101（ATCC 33694）等をハナ
ハン（Hana−han）の方法〔ディーエヌエイ．クローニ
ング（DNA Cloning）、第１巻、第109〜135頁（198
5）〕等により形質転換するか、あるいはモレキュラー
・クローニング（Molecular Cloning）、第256〜268
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）記載の方
法等により形質導入して形質転換株あるいは形質導入株
を得る。
そして、上記菌株より変異型ホタルルシフェラーゼ生
産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、変
異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNA挿入し
た組み換え体DNAを含み、変異型ホタルルシフェラーゼ
生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を得るこ
とができる。
産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、変
異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNA挿入し
た組み換え体DNAを含み、変異型ホタルルシフェラーゼ
生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を得るこ
とができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組
み換え体DNAを得るには、例えばピー・グーリー（P.Gue
rry）等の方法［ジェイ．バクテリオロジー（J.Bacteri
ology）第116巻、第1064〜1066頁（1973年）］、デー・
ビー・クレウェル（D.B.Clewell）の方法［ジェイ．バ
クテリオロジー第110巻、第667〜676頁（1972年）］な
どにより得ることができる。
み換え体DNAを得るには、例えばピー・グーリー（P.Gue
rry）等の方法［ジェイ．バクテリオロジー（J.Bacteri
ology）第116巻、第1064〜1066頁（1973年）］、デー・
ビー・クレウェル（D.B.Clewell）の方法［ジェイ．バ
クテリオロジー第110巻、第667〜676頁（1972年）］な
どにより得ることができる。
そして、このようにして得られた組み換え体DNAより
変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するDNAを得
るには、例えば、該プラスミドDNAに制限酵素、例えばE
coR I及びPst Iを温度30〜40℃、好ましくは37℃で１〜
24時間、好ましくは２時間作用させて、反応終了液をア
ガロースゲル電子泳動法〔「モレキュラー・クローニン
グ」（Molecular Cloning）、第150頁、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）（1982）記載〕で処理することにより得
ることができる。
変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するDNAを得
るには、例えば、該プラスミドDNAに制限酵素、例えばE
coR I及びPst Iを温度30〜40℃、好ましくは37℃で１〜
24時間、好ましくは２時間作用させて、反応終了液をア
ガロースゲル電子泳動法〔「モレキュラー・クローニン
グ」（Molecular Cloning）、第150頁、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）（1982）記載〕で処理することにより得
ることができる。
一方、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列
の決定は実施例の項目17に示す方法行うことができる。
の決定は実施例の項目17に示す方法行うことができる。
上記のようにして得られた変異型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子をベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含
み、変異型ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシ
ェリシア属に属する菌株を用いて変異型ホタルルシフェ
ラーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で
培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養
するのが好ましい。
ゼ遺伝子をベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含
み、変異型ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシ
ェリシア属に属する菌株を用いて変異型ホタルルシフェ
ラーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で
培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養
するのが好ましい。
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば酵母
エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンステ
ィープリカーあるいは大豆もしくは小麦の浸出液等の１
種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウ
ム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガ
ン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖
質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンステ
ィープリカーあるいは大豆もしくは小麦の浸出液等の１
種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウ
ム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガ
ン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖
質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発pHは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜
24時間、好ましくは６〜８時間、通気撹拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
ある。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜
24時間、好ましくは６〜８時間、通気撹拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
培養終了後、該培養物より変異型ホタルルシフェラー
ゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得るこ
とができる。
ゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得るこ
とができる。
例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処
理などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用い
て本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振
盪もしくは放置して自己消化を行わせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
品を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
理などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用い
て本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振
盪もしくは放置して自己消化を行わせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
品を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得るには、例え
ばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等
を用いるゲル濾過法、イオン交換体を用いる吸着溶出
法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒ
ドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配
遠心法等の沈降法、アフィニティクロマト法、分子ふる
い膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択
し、組合わせて実施することにより、精製された酵素標
品を得ることが出来る。
ばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等
を用いるゲル濾過法、イオン交換体を用いる吸着溶出
法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒ
ドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配
遠心法等の沈降法、アフィニティクロマト法、分子ふる
い膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択
し、組合わせて実施することにより、精製された酵素標
品を得ることが出来る。
上述の如くして得られた変異型ホタルルシフェラーゼ
の理化学的性質は、ルシフェラーゼをルシフェリンと反
応させた後、発光する光の波長が560nm前後から例え
ば、595nm,607nm（オレンジ色）,609nm,612nm（赤色）,
558nm（緑色）に変化する以外は変異型ゲンジボタルル
シフェラーゼは：特開平１−141592号公報記載の理化学
的性質と、また、変異型ヘイケボタルルシフェラーゼ
は、特開平１−262791号公報記載の理化学的性質と同様
である。
の理化学的性質は、ルシフェラーゼをルシフェリンと反
応させた後、発光する光の波長が560nm前後から例え
ば、595nm,607nm（オレンジ色）,609nm,612nm（赤色）,
558nm（緑色）に変化する以外は変異型ゲンジボタルル
シフェラーゼは：特開平１−141592号公報記載の理化学
的性質と、また、変異型ヘイケボタルルシフェラーゼ
は、特開平１−262791号公報記載の理化学的性質と同様
である。
上述したことから明らかなように、本発明野生型ホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入した組み
換え体DNAを含み、変異型ホタルルシフェラーゼ生産能
を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養
することにより、野生型ホタルルシフェラーゼの発光す
る波長とは全く異なる、例えば、赤色、オレンジ色、緑
色等の光を発光することのできる変異型ホタルルシフェ
ラーゼを効率よく得ることができるので本発明は産業上
極めて有用である。
ルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入した組み
換え体DNAを含み、変異型ホタルルシフェラーゼ生産能
を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養
することにより、野生型ホタルルシフェラーゼの発光す
る波長とは全く異なる、例えば、赤色、オレンジ色、緑
色等の光を発光することのできる変異型ホタルルシフェ
ラーゼを効率よく得ることができるので本発明は産業上
極めて有用である。
また、本発明において得られる変異型ホタルルシフェ
ラーゼは、従来の野生型ホタルルシフェラーゼと比較し
て赤色（例えば、血液等）、オレンジ色、緑色等の溶液
中のATP含有量を著しく高感度に測定することができる
ので極めて有用なものである。
ラーゼは、従来の野生型ホタルルシフェラーゼと比較し
て赤色（例えば、血液等）、オレンジ色、緑色等の溶液
中のATP含有量を著しく高感度に測定することができる
ので極めて有用なものである。
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明す
る。
る。
なお、以下にのべる項目１〜10には、ホダルの１種で
あるフォティナス・ピラリスのルシフェラーゼをコード
する遺伝子を含有するDNA（該DNAは、ルシオラ・クルシ
アタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有するDN
Aを検索する際、プローブとして使用されるものであ
る。）の調製についてのべる。
あるフォティナス・ピラリスのルシフェラーゼをコード
する遺伝子を含有するDNA（該DNAは、ルシオラ・クルシ
アタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有するDN
Aを検索する際、プローブとして使用されるものであ
る。）の調製についてのべる。
1.m−RNAの調製 ホタルの１種であるフォティナス・ピラリス（Photin
us pyralis）の乾燥尾部（シグマ社製）1gを乳鉢及び乳
棒を用いて充分破砕したものに、溶解緩衝液5ml〔20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）/10mM NaCl/3mM酢酸マグ
ネシウム/5％（w/v）ショ糖/1.2％（V/V）トリトンＸ−
100/10mMバナジルヌクレオシド錯体（ニューイングラン
ド バイオラボ社製）〕を添加し、更に、上記と同様に
破砕してフォティナス・ピラリス尾部破砕物含有溶液を
得た。
us pyralis）の乾燥尾部（シグマ社製）1gを乳鉢及び乳
棒を用いて充分破砕したものに、溶解緩衝液5ml〔20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）/10mM NaCl/3mM酢酸マグ
ネシウム/5％（w/v）ショ糖/1.2％（V/V）トリトンＸ−
100/10mMバナジルヌクレオシド錯体（ニューイングラン
ド バイオラボ社製）〕を添加し、更に、上記と同様に
破砕してフォティナス・ピラリス尾部破砕物含有溶液を
得た。
このようにして得た溶液5mlを、カップ型ブレンダー
（日本精機製作所社製）に入れ、5,000r.p.m.で５分間
処理したものに、12mlのグアニジンイソチオシアネート
溶液（6Mグアニジンイソチオシアネート/37.5mMクエン
酸ナトリウム（pH7.0）/0.75（W/V）Ｎ−ラウロイルザ
ルコシンナトリウム/0.15M β−メルカプトエタノー
ル）を添加し、更に、上記ブレンダーを用い3,000r.p.
m.で10分間処理して得た溶液を、３重のガーゼを用いて
濾過し、濾液を得、超遠心分離機用チューブ（日立工機
社製）４本に、予め1.2mlの5.7Mの塩化セシウム溶液を
夫々重層し、その上に、上記濾液を重層するように夫々
分注し、超遠心分離機（日立工機社製、SCP55H）を用い
て温度15℃、30,000r.p.m.で16時間遠心分離して沈澱物
を得た。得られた沈澱物を、冷70％（V/V）エタノール
を用いて洗浄をしたものを、10mMトリス緩衝液〔10mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.4）/5mM EDTA/1％ドデシル硫酸
ナトリウム〕4mlに懸濁したものに、同量のｎ−ブタノ
ール及びクロロフォルムを４対１（容量比）となる如く
混合したものを添加して抽出し、常法により3,000r.p.
m.で10分間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、
この有機溶媒層に上記10mMトリス緩衝液4mlを添加し、
上記抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得
られた水層に、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及
び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−20℃で
２時間放置したのち、常法により8,000r.p.m.で20分間
遠心分離し、RNAを沈澱させ、得られたRNAを4mlの水に
溶解し、上記エタノール沈澱操作を行なったのち、得ら
れたRNAを1mlの水に溶解し、3.75mgのRNAを得た。
（日本精機製作所社製）に入れ、5,000r.p.m.で５分間
処理したものに、12mlのグアニジンイソチオシアネート
溶液（6Mグアニジンイソチオシアネート/37.5mMクエン
酸ナトリウム（pH7.0）/0.75（W/V）Ｎ−ラウロイルザ
ルコシンナトリウム/0.15M β−メルカプトエタノー
ル）を添加し、更に、上記ブレンダーを用い3,000r.p.
m.で10分間処理して得た溶液を、３重のガーゼを用いて
濾過し、濾液を得、超遠心分離機用チューブ（日立工機
社製）４本に、予め1.2mlの5.7Mの塩化セシウム溶液を
夫々重層し、その上に、上記濾液を重層するように夫々
分注し、超遠心分離機（日立工機社製、SCP55H）を用い
て温度15℃、30,000r.p.m.で16時間遠心分離して沈澱物
を得た。得られた沈澱物を、冷70％（V/V）エタノール
を用いて洗浄をしたものを、10mMトリス緩衝液〔10mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.4）/5mM EDTA/1％ドデシル硫酸
ナトリウム〕4mlに懸濁したものに、同量のｎ−ブタノ
ール及びクロロフォルムを４対１（容量比）となる如く
混合したものを添加して抽出し、常法により3,000r.p.
m.で10分間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、
この有機溶媒層に上記10mMトリス緩衝液4mlを添加し、
上記抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得
られた水層に、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及
び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−20℃で
２時間放置したのち、常法により8,000r.p.m.で20分間
遠心分離し、RNAを沈澱させ、得られたRNAを4mlの水に
溶解し、上記エタノール沈澱操作を行なったのち、得ら
れたRNAを1mlの水に溶解し、3.75mgのRNAを得た。
そして、以上の操作を再度繰り返すことにより合計7m
gのRNAを調製し、このRNA中よりｍ−RNAを選択するため
に、7mgのRNAを、オリゴ（dT）−セルロース（ニューイ
ングランドバイオラボ社製）カラムクロマトグラムにか
けた。
gのRNAを調製し、このRNA中よりｍ−RNAを選択するため
に、7mgのRNAを、オリゴ（dT）−セルロース（ニューイ
ングランドバイオラボ社製）カラムクロマトグラムにか
けた。
カラムとして2.5mlテルモシリンジ（テルモ・社・
製）を用い、樹脂0.5gは、溶出緩衝液〔10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.6）/1mM DETA/0.1％（W/V）ドデシル硫
酸ナトリウム〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結
合緩衝液〔10mMトリス−塩酸（pH7.6）/1mM EDTA/0.4M
NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナトリウム〕で平衡化したもの
である。
製）を用い、樹脂0.5gは、溶出緩衝液〔10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.6）/1mM DETA/0.1％（W/V）ドデシル硫
酸ナトリウム〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結
合緩衝液〔10mMトリス−塩酸（pH7.6）/1mM EDTA/0.4M
NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナトリウム〕で平衡化したもの
である。
7mgのRNAに、同量の緩衝液〔10mMトリス−塩酸（pH7.
6）/1mM EDTA/0.8M NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕を添加し、温度65℃で10分間加熱処理し、氷中で急
冷し、オリゴ（dT）−セルロースカラムにかけたのち、
結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−RNA及びｔ−R
NAを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−RNAを溶出
し、40μｇのｍ−RNAを得た。
6）/1mM EDTA/0.8M NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕を添加し、温度65℃で10分間加熱処理し、氷中で急
冷し、オリゴ（dT）−セルロースカラムにかけたのち、
結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−RNA及びｔ−R
NAを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−RNAを溶出
し、40μｇのｍ−RNAを得た。
2.ルシフェラーゼｍ−RNAの濃縮 次に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりルシフェラー
ゼｍ−RNAを濃縮した。
ゼｍ−RNAを濃縮した。
10〜25％（W/V）のショ糖密度勾配は、ベックマン社
製のローターSW41用ポリアロマチューブに40％（W/V）
ショ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/20mM NaC
l/1mM EDTA/40％（W/V）ショ糖〕0.5mlを入れ、その上
に2.4mlずつ25％（W/V）、20％（W/V）、15％（W/V）及
び10％（W/V）のショ糖液を重層し、温度４℃で24時間
放置することにより作製した。このショ糖密度勾配に、
ｍ−RNA30μｇを重層し、ベックマン・社・製のSW41ロ
ーターを用い、常法により30,000r.p.m.、温度18℃で18
時間遠心分離を行なった。遠心分離操作ののち、0.5ml
ずつ分画し、エタノール沈澱法によりｍ−RNAを回収
し、10μの水に溶解した。
製のローターSW41用ポリアロマチューブに40％（W/V）
ショ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/20mM NaC
l/1mM EDTA/40％（W/V）ショ糖〕0.5mlを入れ、その上
に2.4mlずつ25％（W/V）、20％（W/V）、15％（W/V）及
び10％（W/V）のショ糖液を重層し、温度４℃で24時間
放置することにより作製した。このショ糖密度勾配に、
ｍ−RNA30μｇを重層し、ベックマン・社・製のSW41ロ
ーターを用い、常法により30,000r.p.m.、温度18℃で18
時間遠心分離を行なった。遠心分離操作ののち、0.5ml
ずつ分画し、エタノール沈澱法によりｍ−RNAを回収
し、10μの水に溶解した。
次に、ｍ−RNAにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、ルシフェラーゼのｍ−RNAが濃縮されている
画分の同定を行なった。分画したRNA1μ、ウサギ網状
赤血球ライセート（アマシャム社製）９μ及び
〔35S〕メチオニン１μ（アマシャム社製）を混合
し、温度30℃で30分間反応させたものに、150μのNET
緩衝液〔150mM NaCl/5mM EDTA/0.02％（W/V）/20mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.4）/0.05％（W/V）ノニデットＰ
−40（ベセスダリサーチラボラトリー社製、界面活性
剤）〕を添加し、更に、１μの抗ルシフェラーゼ血清
（後述のようにして調製したもの。）を添加し、温度４
℃で18時間放置したものに、10mgのプロティンＡセファ
ロース（ファルマシア社製）を添加し、温度20℃で30分
間放置したものを、常法により12,000r.p.m.で１分間遠
心分離処理し、樹脂を回収した。
とにより、ルシフェラーゼのｍ−RNAが濃縮されている
画分の同定を行なった。分画したRNA1μ、ウサギ網状
赤血球ライセート（アマシャム社製）９μ及び
〔35S〕メチオニン１μ（アマシャム社製）を混合
し、温度30℃で30分間反応させたものに、150μのNET
緩衝液〔150mM NaCl/5mM EDTA/0.02％（W/V）/20mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.4）/0.05％（W/V）ノニデットＰ
−40（ベセスダリサーチラボラトリー社製、界面活性
剤）〕を添加し、更に、１μの抗ルシフェラーゼ血清
（後述のようにして調製したもの。）を添加し、温度４
℃で18時間放置したものに、10mgのプロティンＡセファ
ロース（ファルマシア社製）を添加し、温度20℃で30分
間放置したものを、常法により12,000r.p.m.で１分間遠
心分離処理し、樹脂を回収した。
回収した樹脂を、200μのNET緩衝液で３回洗浄し、
この樹脂に、40μのSDS−PAGE用サンプル緩衝液〔62.
5mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/10％（V/V）グリセロ
ール/2％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム/5％（V/V）メ
ルカプトエタノール/0.02％（W/V）ブロムフェノールブ
ルー〕を添加し、温度100℃で３分間煮沸し、常法によ
り12,000r.p.m.で１分間遠心分離処理し、上清を回収
し、全量を7.5％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲルに乗せた。
この樹脂に、40μのSDS−PAGE用サンプル緩衝液〔62.
5mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/10％（V/V）グリセロ
ール/2％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム/5％（V/V）メ
ルカプトエタノール/0.02％（W/V）ブロムフェノールブ
ルー〕を添加し、温度100℃で３分間煮沸し、常法によ
り12,000r.p.m.で１分間遠心分離処理し、上清を回収
し、全量を7.5％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲルに乗せた。
ゲル電気泳動は、ラエムリ（Laemmli）の方法〔「ネ
ーチュアー」（Nature）、第227頁、第680頁（1970）〕
で行ない、泳動したのちのゲルは、10％（V/V）の酢酸
に30分間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水に30分間浸
漬し、更に、1Mサリチル酸ナトリウム溶液に30分間浸漬
し、乾燥して乾燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フ
ィルム社製、RX）を用いてフルオログラフィーを行なっ
た。
ーチュアー」（Nature）、第227頁、第680頁（1970）〕
で行ない、泳動したのちのゲルは、10％（V/V）の酢酸
に30分間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水に30分間浸
漬し、更に、1Mサリチル酸ナトリウム溶液に30分間浸漬
し、乾燥して乾燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フ
ィルム社製、RX）を用いてフルオログラフィーを行なっ
た。
以上の操作により、ルシフェラーゼｍ−RNAの存在す
る画分のRNAを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ蛋白
質のバンドがＸ線フィルム上に認められ、ルシフェラー
ゼｍ−RNAの濃縮されている画分が同定できた。
る画分のRNAを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ蛋白
質のバンドがＸ線フィルム上に認められ、ルシフェラー
ゼｍ−RNAの濃縮されている画分が同定できた。
3.抗ルシフェラーゼ血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラー
ゼ血清は、以下の方法により調製した。
ゼ血清は、以下の方法により調製した。
3.2mg/ml濃度のルシフェラーゼ溶液〔シグマ社製ルシ
フェラーゼを0.5Mグリシルグリシン溶液（pH7.8）に溶
解したもの〕0.7mlを、等量のフレンド（Freund）完全
アジェバンで懸濁したもの2.24mgを、抗原として体重2k
gの日本白色種ウサギの指掌部に投与し、飼育２週間経
過したのち、初回と同量の抗原を背部皮内へ投与し、更
に、飼育１週間経過したのち、同様の操作を行ない、ま
更に、飼育１週間後全採血を行なった。
フェラーゼを0.5Mグリシルグリシン溶液（pH7.8）に溶
解したもの〕0.7mlを、等量のフレンド（Freund）完全
アジェバンで懸濁したもの2.24mgを、抗原として体重2k
gの日本白色種ウサギの指掌部に投与し、飼育２週間経
過したのち、初回と同量の抗原を背部皮内へ投与し、更
に、飼育１週間経過したのち、同様の操作を行ない、ま
更に、飼育１週間後全採血を行なった。
そして、得られた血液を、温度４℃で18時間放置した
ものを、常法により3,000r.p.m.で15分間遠心分離し、
上清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。
ものを、常法により3,000r.p.m.で15分間遠心分離し、
上清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。
4.c−DNAの合成 ｃ−DNAの合成は、アマシャム・社・製キットを用い
て行なったものである。
て行なったものである。
上述の如くして得られたｍ−RNA2μｇを用いてアマシ
ャム社の指示する「モル・セル・バイオル」（Mol.Cell
Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及び「ジーン」（G
ene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に従い行な
った結果、300ngの２本鎖ｃ−DNAが得られた。
ャム社の指示する「モル・セル・バイオル」（Mol.Cell
Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及び「ジーン」（G
ene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に従い行な
った結果、300ngの２本鎖ｃ−DNAが得られた。
このｃ−DNA150ngを、７μのTE緩衝液〔10mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.5）/1mM EDTA〕に溶解したものに、
11μの混液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.8）/6
0mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕及
び3.8μのティリング混液〔10mMジチオスレイトール
7.5μ/10ng/mlポリ（poly）A1μ/5mM dCTP2μ／
水110μ〕を夫々添加し、更に、29ユニットのターミ
ナルトランスフェラーゼ（ベーリンガーマンハイム社
製）を添加し、温度30℃で10分間反応させたのち、2.4
μの0.25M EDTA及び2.4μの10％（W/V）ドデシル硫
酸ナトリウムを夫々添加して反応を停止させた。
−塩酸緩衝液（pH7.5）/1mM EDTA〕に溶解したものに、
11μの混液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.8）/6
0mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕及
び3.8μのティリング混液〔10mMジチオスレイトール
7.5μ/10ng/mlポリ（poly）A1μ/5mM dCTP2μ／
水110μ〕を夫々添加し、更に、29ユニットのターミ
ナルトランスフェラーゼ（ベーリンガーマンハイム社
製）を添加し、温度30℃で10分間反応させたのち、2.4
μの0.25M EDTA及び2.4μの10％（W/V）ドデシル硫
酸ナトリウムを夫々添加して反応を停止させた。
反応停止液に25μの水飽和フェノールを用いて除蛋
白処理を行なったのち、回収した水層に、25μの4M酢
酸アンモニウム及び100μの冷エタノールを夫々添加
し、温度−70℃で15分間放置し、12,000r.p.m.で10分間
遠心分離してｃ−DNAを回収し、10μのTE緩衝液に溶
解し、ｃ−DNA溶解液を得た。
白処理を行なったのち、回収した水層に、25μの4M酢
酸アンモニウム及び100μの冷エタノールを夫々添加
し、温度−70℃で15分間放置し、12,000r.p.m.で10分間
遠心分離してｃ−DNAを回収し、10μのTE緩衝液に溶
解し、ｃ−DNA溶解液を得た。
以上の如くしてデオキシシチジンのテイルの付いたｃ
−DNA100ngを得た。
−DNA100ngを得た。
5.ベクターに使用する組み換え体プラスミドpMCE10DNA
の調製 大腸菌W3110株（ATCC 27325）、プラスミドpBR325（B
RL社製）及びプラスミドpBR322DNA（宝酒造社製）を用
いてティー・マスダ等（T.Masuda et.al）「アグリカル
チュラス・バイオロジカル・ケミストリー」（Agricult
ural Biological Chemistry）、第50巻、第271〜279頁
（1986）記載の方法により製作したプラスミドpKN305DN
A並びにプラスミドpMC1403−3DNA（特開昭61−274683号
公報記載）夫々１μｇを、10μの混液〔50mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.5）/10mMMgCl2/100mM NaCl/1mMジチオ
スレイトール〕に添加し、更に、これに、Hind III及び
Sal I（いずれも宝酒造社製）を夫々２ユニットずつ添
加し、温度37℃で１時間反応させて切断処理し、常法に
よるフェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈
澱物を得た。この沈澱物を、10μのライゲーション緩
衝液〔20mM MgCl2/66mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）/1
mM ATP/15mMジチオスレイトール〕に溶解し、溶液を
得、更に、１ユニットのT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）
を添加し、温度20℃で４時間連結反応を行なった。次い
で、この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジー」
（J.Bacteriology、第119巻、第1072頁〜第1074頁（197
4年）〕記載の形質転換法により、大腸菌JM101（ATCC 3
3876）株を形質転換し、薬剤耐性（アンピシリン耐性及
びテトラサイクリン感受性）及びβ−ガラクトシダーゼ
活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有する組み
換え体プラスミドDNAをpMCE10と命名した。この組み換
え体プラスミドpMCE10DNAを含有する大腸菌JM101株を、
トリプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5（W/V）、及びN
aCl0.5％（W/V）からなる培地１に、該培地を用い温
度37℃で16〜24時間前培養して得た大腸菌JM101（pMCE1
0）の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間振盪培養
したのち、0.2gのクロラムフェニコールを添加し、更に
同一温度で20時間同培養を行ない、培養液を得た。
の調製 大腸菌W3110株（ATCC 27325）、プラスミドpBR325（B
RL社製）及びプラスミドpBR322DNA（宝酒造社製）を用
いてティー・マスダ等（T.Masuda et.al）「アグリカル
チュラス・バイオロジカル・ケミストリー」（Agricult
ural Biological Chemistry）、第50巻、第271〜279頁
（1986）記載の方法により製作したプラスミドpKN305DN
A並びにプラスミドpMC1403−3DNA（特開昭61−274683号
公報記載）夫々１μｇを、10μの混液〔50mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.5）/10mMMgCl2/100mM NaCl/1mMジチオ
スレイトール〕に添加し、更に、これに、Hind III及び
Sal I（いずれも宝酒造社製）を夫々２ユニットずつ添
加し、温度37℃で１時間反応させて切断処理し、常法に
よるフェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈
澱物を得た。この沈澱物を、10μのライゲーション緩
衝液〔20mM MgCl2/66mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）/1
mM ATP/15mMジチオスレイトール〕に溶解し、溶液を
得、更に、１ユニットのT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）
を添加し、温度20℃で４時間連結反応を行なった。次い
で、この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジー」
（J.Bacteriology、第119巻、第1072頁〜第1074頁（197
4年）〕記載の形質転換法により、大腸菌JM101（ATCC 3
3876）株を形質転換し、薬剤耐性（アンピシリン耐性及
びテトラサイクリン感受性）及びβ−ガラクトシダーゼ
活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有する組み
換え体プラスミドDNAをpMCE10と命名した。この組み換
え体プラスミドpMCE10DNAを含有する大腸菌JM101株を、
トリプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5（W/V）、及びN
aCl0.5％（W/V）からなる培地１に、該培地を用い温
度37℃で16〜24時間前培養して得た大腸菌JM101（pMCE1
0）の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間振盪培養
したのち、0.2gのクロラムフェニコールを添加し、更に
同一温度で20時間同培養を行ない、培養液を得た。
次いで、この培養液を、常法により6,000r.p.m.で10
分間遠心分離して湿潤菌体2gを得、これを20mlの25％
（W/V）ショ糖を含有する350mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10m
g、0.25M EDTA溶液（pH8.0）8ml及び20％（W/V）ドデジ
ル硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加し、温度60℃で30
分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
分間遠心分離して湿潤菌体2gを得、これを20mlの25％
（W/V）ショ糖を含有する350mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10m
g、0.25M EDTA溶液（pH8.0）8ml及び20％（W/V）ドデジ
ル硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加し、温度60℃で30
分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、5M NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃
で16時間処理したものを常法により15,000r.p.m.で30分
間遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出
処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。
で16時間処理したものを常法により15,000r.p.m.で30分
間遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出
処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。
次いで、この沈澱物を、通常の減圧乾燥処理したもの
を、1mM EDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液6ml（p
H7.5）に溶解し、更に、これに、塩化セシウム6g及びエ
チジウムブロマイド溶液（10mg/ml）0.2mlを添加したも
のを、常法により39,000r.p.m.で42時間超遠心分離機を
用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体
プラスミドpMCE10DNAを単離し、また更に、ｎ−ブタノ
ールを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、
1mM EDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
に対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミド
pMCE10DNA500μｇを得た。
を、1mM EDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液6ml（p
H7.5）に溶解し、更に、これに、塩化セシウム6g及びエ
チジウムブロマイド溶液（10mg/ml）0.2mlを添加したも
のを、常法により39,000r.p.m.で42時間超遠心分離機を
用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体
プラスミドpMCE10DNAを単離し、また更に、ｎ−ブタノ
ールを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、
1mM EDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
に対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミド
pMCE10DNA500μｇを得た。
6.ベクターDNAの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミドpMCE10
DNA15μｇを、90μの項目４記載のTE緩衝液に溶解し3
10μのMed緩衝液〔100mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）/100mM MgCl2/10mMジチオスレイトール/500mM NaC
l〕を添加したのち30ユニットの制限酵素Acc I（宝酒造
社製）を更に加え、温度37℃で１時間切断処理を行ない
切断処理物を得た。この切断処理物に、100μの水飽
和フェノールを加え除蛋白操作を行なったのち、水層を
回収し、これに、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH7.5）
及び２倍量の冷エタノールを加え、温度−70℃で15分間
放置したのち、12,000r.p.m.で10分間遠心分離し、DNA
を回収した。
DNA15μｇを、90μの項目４記載のTE緩衝液に溶解し3
10μのMed緩衝液〔100mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）/100mM MgCl2/10mMジチオスレイトール/500mM NaC
l〕を添加したのち30ユニットの制限酵素Acc I（宝酒造
社製）を更に加え、温度37℃で１時間切断処理を行ない
切断処理物を得た。この切断処理物に、100μの水飽
和フェノールを加え除蛋白操作を行なったのち、水層を
回収し、これに、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH7.5）
及び２倍量の冷エタノールを加え、温度−70℃で15分間
放置したのち、12,000r.p.m.で10分間遠心分離し、DNA
を回収した。
このDNAを、10μのTE緩衝液に溶かし、15μの混
液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.8）/60mMトリス
−塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕を加えたの
ち、更に、５μのティリング混液（項目４記載）（5m
M dGTPを用いた）を加え、また更に、５ユニットのター
ミナルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）を添加し、温
度37℃で15分間反応させた。項目４記載のｃ−DNAティ
リング反応と同様の後処理を行なうことにより組み換え
体プラスミドpMCE10DNAのAcc Iサイトにデオキシグアノ
シンのテイルが付いたDNAを調製した。
液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.8）/60mMトリス
−塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕を加えたの
ち、更に、５μのティリング混液（項目４記載）（5m
M dGTPを用いた）を加え、また更に、５ユニットのター
ミナルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）を添加し、温
度37℃で15分間反応させた。項目４記載のｃ−DNAティ
リング反応と同様の後処理を行なうことにより組み換え
体プラスミドpMCE10DNAのAcc Iサイトにデオキシグアノ
シンのテイルが付いたDNAを調製した。
一方、プラスミドpUC19DNAのPst Iサイ６にデオキシ
グアノシンのテイルが付いたDNAの調製も同時に行なっ
た。
グアノシンのテイルが付いたDNAの調製も同時に行なっ
た。
プラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）30μｇを、350μ
のTE緩衝液に溶解したものに、40μのMed緩衝液及
び制限酵素Pst I（宝酒造社製）120ユニットを夫々添加
し、温度37℃で１時間切断処理したのち、常法によりフ
ェノールによる除蛋白処理及びエタノール沈澱処理によ
りDNAを回収した。
のTE緩衝液に溶解したものに、40μのMed緩衝液及
び制限酵素Pst I（宝酒造社製）120ユニットを夫々添加
し、温度37℃で１時間切断処理したのち、常法によりフ
ェノールによる除蛋白処理及びエタノール沈澱処理によ
りDNAを回収した。
得られたDNAを、35μのTE緩衝液に溶解したもの
に、50μの混液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.
8）/60mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/1mM塩化コバル
ト〕、19μの項目４記載のティリング混液（dGTP含
有）並びに60ユニットのターミナルトランスフェラーゼ
（宝酒造社製）を夫々添加し、温度37℃で10分間反応さ
せたのち、常法によりフェノール処理及びエタノール沈
澱を行なうことによりDNAを回収した。
に、50μの混液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.
8）/60mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/1mM塩化コバル
ト〕、19μの項目４記載のティリング混液（dGTP含
有）並びに60ユニットのターミナルトランスフェラーゼ
（宝酒造社製）を夫々添加し、温度37℃で10分間反応さ
せたのち、常法によりフェノール処理及びエタノール沈
澱を行なうことによりDNAを回収した。
7.アニーリング及び形質転換 合成したｃ−DNA15ng及び上記の方法で得た二種のベ
クターDNA200ngを、35μのアニール緩衝液〔10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mM NaCl/1mM EDTA〕に溶
解し、温度65℃で２分間、温度46℃で２時間、温度37℃
で１時間及び温度20℃で18時間放置する操作によりｃ−
DNAとベクターDNAをアニールした。
クターDNA200ngを、35μのアニール緩衝液〔10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mM NaCl/1mM EDTA〕に溶
解し、温度65℃で２分間、温度46℃で２時間、温度37℃
で１時間及び温度20℃で18時間放置する操作によりｃ−
DNAとベクターDNAをアニールした。
アニールしたDNAを用いて、ハナハン（Hana−han）の
方法〔デイ−エヌエイ クローニング（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DH1
株（ATCC 33849）を形質転換し、プラスミドpUC19DNA及
び組み換え体プラスミドpMCE10DNAをベクターとしたｃ
−DNAバンクを夫々作製した。
方法〔デイ−エヌエイ クローニング（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DH1
株（ATCC 33849）を形質転換し、プラスミドpUC19DNA及
び組み換え体プラスミドpMCE10DNAをベクターとしたｃ
−DNAバンクを夫々作製した。
8.ルシフェラーゼｃ−DNAの検索 組み換え体プラスミドpMCE10DNAのAcc I部位は、大腸
菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする部位にある
ので、この部位に組み込まれたｃ−DNAはβ−ガラクト
シダーゼとの融合蛋白質を作る。また組み換え体プラス
ミドpMCE10のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモータ
ーは前述した様に大腸菌トリプトファン遺伝子のプロモ
ーターに変換してある。
菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする部位にある
ので、この部位に組み込まれたｃ−DNAはβ−ガラクト
シダーゼとの融合蛋白質を作る。また組み換え体プラス
ミドpMCE10のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモータ
ーは前述した様に大腸菌トリプトファン遺伝子のプロモ
ーターに変換してある。
組み換え体プラスミドpMCE10DNAを、ベクターとする
ｃ−DNAバンクのコロニー96個を10mlのM9カザミノ酸培
地〔「モレキュラー・クローニング」（Molecular Clon
ing）、第440〜441頁、「コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー」（Cold Spring Harbor Laborator
y）（1982）〕にチアミン（10μg/ml）を加えた培地を
用い温度37℃で10時間振盪培養し、常法により集菌した
のち、200μの項目２記載のSDS−PAGE用サンプル緩衝
液に懸濁し、温度100℃で５分間煮沸した。
ｃ−DNAバンクのコロニー96個を10mlのM9カザミノ酸培
地〔「モレキュラー・クローニング」（Molecular Clon
ing）、第440〜441頁、「コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー」（Cold Spring Harbor Laborator
y）（1982）〕にチアミン（10μg/ml）を加えた培地を
用い温度37℃で10時間振盪培養し、常法により集菌した
のち、200μの項目２記載のSDS−PAGE用サンプル緩衝
液に懸濁し、温度100℃で５分間煮沸した。
この懸濁液40μを、7.5％（W/V）ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった。泳動
終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウエスタンブロット
法〔「アナル・バイオケム」（Anal.Biochm.）、第112
巻、第195頁（1981）〕によりニトロセルロースのフィ
ルターに転写し、このニトロセルロースフィルターをイ
ミューンブロットアッセイキット（バイオラッド社製）
を用いて抗ルシフェラーゼ血清で染色した。方法は、バ
イオラッド社の操作法に従った。
ドゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった。泳動
終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウエスタンブロット
法〔「アナル・バイオケム」（Anal.Biochm.）、第112
巻、第195頁（1981）〕によりニトロセルロースのフィ
ルターに転写し、このニトロセルロースフィルターをイ
ミューンブロットアッセイキット（バイオラッド社製）
を用いて抗ルシフェラーゼ血清で染色した。方法は、バ
イオラッド社の操作法に従った。
即ちニトロセルロースのフィルターを、100mlのブロ
ッキング溶液［TBS緩衝液〔20mMトリス−塩酸緩衝液/50
0mM NaCl（pH7.5）〕に３％（W/V）のゼラチンを溶かし
た溶液］中温度25℃で、30分間振盪した。次に、このニ
トロセルロースフィルターを25mlの一次抗体溶液〔ルシ
フェラーゼ抗血清を１％（W/V）のゼラチンをTBS緩衝液
に溶かした溶液で25倍（V/V）に希釈した溶液〕に移
し、温度25℃で90分間振盪したものを、100mlのツィー
ン（Tween）−20洗液〔TBS緩衝液に0.05％（W/V）のツ
ィーン（Tween）−20を溶かした溶液〕中に移し、温度2
5℃で10分間振盪する操作を２回行なった。次いで、こ
のようにして得たニトロセルロースフィルターを60mlの
二次抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した
抗ウサギ抗体（バイオラッド社製）を１％（W/V）のゼ
ラチンをTBS緩衝液に溶かした溶液で3000倍（V/V）に希
釈した溶液〕中に移し、温度25℃で60分間振盪したの
ち、100mlのツィーン（Tween）−20洗液でニトロセルロ
ースフィルターを洗う上記操作を２回繰り返し、このよ
うにして得たニトロセルロースフィルターを、120mlの
発色液〔60mgの４−クロロ−１−ナフトールを20mlの冷
メタノールに溶解した溶液及び60μの30％（V/V）過
酸化水素水を100mlのTBS緩衝液に添加した溶液を混合し
た溶液〕中に移し、温度25℃で10分間発色させた。
ッキング溶液［TBS緩衝液〔20mMトリス−塩酸緩衝液/50
0mM NaCl（pH7.5）〕に３％（W/V）のゼラチンを溶かし
た溶液］中温度25℃で、30分間振盪した。次に、このニ
トロセルロースフィルターを25mlの一次抗体溶液〔ルシ
フェラーゼ抗血清を１％（W/V）のゼラチンをTBS緩衝液
に溶かした溶液で25倍（V/V）に希釈した溶液〕に移
し、温度25℃で90分間振盪したものを、100mlのツィー
ン（Tween）−20洗液〔TBS緩衝液に0.05％（W/V）のツ
ィーン（Tween）−20を溶かした溶液〕中に移し、温度2
5℃で10分間振盪する操作を２回行なった。次いで、こ
のようにして得たニトロセルロースフィルターを60mlの
二次抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した
抗ウサギ抗体（バイオラッド社製）を１％（W/V）のゼ
ラチンをTBS緩衝液に溶かした溶液で3000倍（V/V）に希
釈した溶液〕中に移し、温度25℃で60分間振盪したの
ち、100mlのツィーン（Tween）−20洗液でニトロセルロ
ースフィルターを洗う上記操作を２回繰り返し、このよ
うにして得たニトロセルロースフィルターを、120mlの
発色液〔60mgの４−クロロ−１−ナフトールを20mlの冷
メタノールに溶解した溶液及び60μの30％（V/V）過
酸化水素水を100mlのTBS緩衝液に添加した溶液を混合し
た溶液〕中に移し、温度25℃で10分間発色させた。
この様にして96個のコロニーを１グループとして４グ
ループについて同様の方法を行なったところ、２つのグ
ループでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが
認められた。次に、この２つのグループに属する96個の
コロニーを12個のコロニーずつ８グループに分け同様の
操作を行なったところ夫々１グループに抗ルシフェラー
ゼ血清と反応する蛋白質が認められた。最後に、このグ
ループに含まれる12個のコロニーを、１個のコロニーず
つ同様の操作を行ないルシフェラーゼ抗血清と反応する
蛋白質を作るコロニーを同定した。以上の操作によりル
シフェラーゼｃ−DNAをもつ２個のコロニーが得られ
た。この２個のコロニーより項目５記載の方法でプラス
ミドDNAを調製した。得られた組み換え体プラスミドDNA
は、pALf2B8及びpALf3A6と夫々命名した。
ループについて同様の方法を行なったところ、２つのグ
ループでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが
認められた。次に、この２つのグループに属する96個の
コロニーを12個のコロニーずつ８グループに分け同様の
操作を行なったところ夫々１グループに抗ルシフェラー
ゼ血清と反応する蛋白質が認められた。最後に、このグ
ループに含まれる12個のコロニーを、１個のコロニーず
つ同様の操作を行ないルシフェラーゼ抗血清と反応する
蛋白質を作るコロニーを同定した。以上の操作によりル
シフェラーゼｃ−DNAをもつ２個のコロニーが得られ
た。この２個のコロニーより項目５記載の方法でプラス
ミドDNAを調製した。得られた組み換え体プラスミドDNA
は、pALf2B8及びpALf3A6と夫々命名した。
9.大きなルシフェラーゼｃ−DNAの検索−DNAのプローブ
の作製 組み換え体プラスミドpALf3A6DNA100μｇを、330μ
のTE緩衝液に溶解し、これに40μのLow緩衝液〔100mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mM MgCl2/10mMジチオ
スレイトール〕、130ユニットのPst I（宝酒造社製）及
び120ユニットのSac I（ベーリンガーマンハイム社製）
を添加し、温度37℃で1.5時間切断した。
の作製 組み換え体プラスミドpALf3A6DNA100μｇを、330μ
のTE緩衝液に溶解し、これに40μのLow緩衝液〔100mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mM MgCl2/10mMジチオ
スレイトール〕、130ユニットのPst I（宝酒造社製）及
び120ユニットのSac I（ベーリンガーマンハイム社製）
を添加し、温度37℃で1.5時間切断した。
このDNA全量を0.7％（W/V）アガロースゲルを用いた
電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動はティー
・マニアテス（T.Maniatis）等の方法〔「モレキュラー
・クローニング」（Molecular Cloning）、第156〜161
頁、「コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー」（Cold Spring Harbor Laboratory）（1984）〕に
従って行なった。ルシフェラーゼｃ−DNAを含むDNAバン
ドを切り出し、透析チューブに入れ、2mlのTE緩衝液を
加えたのち、透析チューブをシールし、電気泳動によ
り、ゲル中より緩衝液中にDNAを溶出した。この溶液に
等容量の水飽和フェノールを加え、撹拌したのち、水層
を回収し、常法に従いエタノール沈澱によりDNAを回収
した。
電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動はティー
・マニアテス（T.Maniatis）等の方法〔「モレキュラー
・クローニング」（Molecular Cloning）、第156〜161
頁、「コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー」（Cold Spring Harbor Laboratory）（1984）〕に
従って行なった。ルシフェラーゼｃ−DNAを含むDNAバン
ドを切り出し、透析チューブに入れ、2mlのTE緩衝液を
加えたのち、透析チューブをシールし、電気泳動によ
り、ゲル中より緩衝液中にDNAを溶出した。この溶液に
等容量の水飽和フェノールを加え、撹拌したのち、水層
を回収し、常法に従いエタノール沈澱によりDNAを回収
した。
得られたDNAフラグメント10μｇを、126μのTE緩衝
液に溶かし、16μのMed緩衝液及び64ユニットのSau3A I
（宝酒造社製）を加え、温度37℃で２時間反応させたの
ち、全量を５％（W/V）ポリアクリルアミドゲルを用い
た電気泳動により、DNA断片の分離を行なった。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動は、エイ・マクサム（A.Maxa
m）の方法〔「メンズ・イン・エンザイモロジー」（Met
hods in Enzymology）、第65巻、第506頁（1980）〕に
従って行なった。190bpのDNAフラグメントを前述と同様
の方法で単離し、１μｇのSau3A Iルシフェラーゼｃ−D
NAフラグメントが得られた。
液に溶かし、16μのMed緩衝液及び64ユニットのSau3A I
（宝酒造社製）を加え、温度37℃で２時間反応させたの
ち、全量を５％（W/V）ポリアクリルアミドゲルを用い
た電気泳動により、DNA断片の分離を行なった。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動は、エイ・マクサム（A.Maxa
m）の方法〔「メンズ・イン・エンザイモロジー」（Met
hods in Enzymology）、第65巻、第506頁（1980）〕に
従って行なった。190bpのDNAフラグメントを前述と同様
の方法で単離し、１μｇのSau3A Iルシフェラーゼｃ−D
NAフラグメントが得られた。
この１μｇのルシフェラーゼｃ−DNAを、〔α−32P〕
dCTP（アマシャム社製）を用いてニックトランスレーシ
ョン法により標識した。ニックトランスレーションは宝
酒造社製のキットを用い、宝酒造社の指示する「ジェイ
・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237
〜251頁（1977）及び「モレキュラー・クローニング」
（Molecular Cloning）、第109〜112頁、「コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー」（Cold Spring
Harbor Laboratory）（1982）記載の方法に従って行な
った。
dCTP（アマシャム社製）を用いてニックトランスレーシ
ョン法により標識した。ニックトランスレーションは宝
酒造社製のキットを用い、宝酒造社の指示する「ジェイ
・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237
〜251頁（1977）及び「モレキュラー・クローニング」
（Molecular Cloning）、第109〜112頁、「コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー」（Cold Spring
Harbor Laboratory）（1982）記載の方法に従って行な
った。
10.大きなルシフェラーゼｃ−DNAの検索−コロニーハイ
ブリダイゼーション 前述の方法で調製した32Pで標識したルシフェラーゼ
ｃ−DNAを断片を、プローブとして用い、組み換え体プ
ラスミドpUC19DNAをベクターとするフォルティナス・ピ
ラリス尾部ｃ−DNAバンクを、コロニーハイブリダイゼ
ーション法（「蛋白質・核酸・酵素」、第26巻、第575
〜579頁（1981）で検索し、ルシフェラーゼｃ−DNAを有
するコロニーを得た。そのうちの１個のコロニーの有す
る組み換え体プラスミドDNAをpALf3と命名し、項目５記
載の方法でプラスミドDNAを調製した。該組み換え体プ
ラスミドDNAを含有する大腸菌を大腸菌DH1（pALf3）と
命名した。なお、該形質転換株はATCC67462として寄託
されている。
ブリダイゼーション 前述の方法で調製した32Pで標識したルシフェラーゼ
ｃ−DNAを断片を、プローブとして用い、組み換え体プ
ラスミドpUC19DNAをベクターとするフォルティナス・ピ
ラリス尾部ｃ−DNAバンクを、コロニーハイブリダイゼ
ーション法（「蛋白質・核酸・酵素」、第26巻、第575
〜579頁（1981）で検索し、ルシフェラーゼｃ−DNAを有
するコロニーを得た。そのうちの１個のコロニーの有す
る組み換え体プラスミドDNAをpALf3と命名し、項目５記
載の方法でプラスミドDNAを調製した。該組み換え体プ
ラスミドDNAを含有する大腸菌を大腸菌DH1（pALf3）と
命名した。なお、該形質転換株はATCC67462として寄託
されている。
そして、上記組み換え体プラスミドpALf3DNAを、Xba
I、Hind III、BamH I、EcoR I及びPst I（いずれも宝酒
造社製）を用い、単一消化及び２重消化して得られたDN
A断片をアガロースゲル電気泳動法により移動度パター
ンを分析し、得られた移動度パターンとλDNA（宝酒造
社製）をHind IIIにより消化して得られたDNA断片の標
準移動度パターンと対比することにより得られた分子量
は、1,700bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図
は、第１図に示すとおりであった。
I、Hind III、BamH I、EcoR I及びPst I（いずれも宝酒
造社製）を用い、単一消化及び２重消化して得られたDN
A断片をアガロースゲル電気泳動法により移動度パター
ンを分析し、得られた移動度パターンとλDNA（宝酒造
社製）をHind IIIにより消化して得られたDNA断片の標
準移動度パターンと対比することにより得られた分子量
は、1,700bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図
は、第１図に示すとおりであった。
11.ルシオラ・クルシアタ（Luciola Cruciata）のｍ−R
NAの調製 生きたルシオラ・クルシアタ（ゲンジボタル・株式会
社・西武百貨店より購入）10gを超低温冷凍庫に入れ、
凍結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部
2gに、18mlのグアニジンイソチオシアネート溶液を添加
し、項目１記載の方法に従って1.1mgのRNAを調製した。
このRNA1.1mgを項目１記載の方法に従ってオリゴ（dT）
−セルロースのカラムクロマトグラフィーを行ない30μ
ｇのルシオラ・クルシアタ尾部ｍ−RNAを調製した。
NAの調製 生きたルシオラ・クルシアタ（ゲンジボタル・株式会
社・西武百貨店より購入）10gを超低温冷凍庫に入れ、
凍結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部
2gに、18mlのグアニジンイソチオシアネート溶液を添加
し、項目１記載の方法に従って1.1mgのRNAを調製した。
このRNA1.1mgを項目１記載の方法に従ってオリゴ（dT）
−セルロースのカラムクロマトグラフィーを行ない30μ
ｇのルシオラ・クルシアタ尾部ｍ−RNAを調製した。
12.ルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−DNAバンクの作製 ｃ−DNAの合成はアマシャム社より購入したキットを
用い、アマシャム社の指示する「モル・セル・バイオ
ル」（Mol.Cell Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及
び「ジーン」（Gene），第25巻、第263頁（1983）記載
の方法に従って合成した。
用い、アマシャム社の指示する「モル・セル・バイオ
ル」（Mol.Cell Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及
び「ジーン」（Gene），第25巻、第263頁（1983）記載
の方法に従って合成した。
２μｇのルシオラ・クルシアタ尾部RNAより0.9μｇの
二本鎖ｃ−DNAが合成された。このｃ−DNA0.3μｇに項
目４記載の方法を用いてポリデオキシシチジンのテイル
を付加した。
二本鎖ｃ−DNAが合成された。このｃ−DNA0.3μｇに項
目４記載の方法を用いてポリデオキシシチジンのテイル
を付加した。
このｃ−DNA20ng及び項目６で調製したポリグアノシ
ンのテイルをそのPst I部位に付加したpUP19プラスミド
DNA500ngを、項目７記載の方法でアニールし、ハナハン
（Hanahan）の方法〔「デイエヌエイ・クローニング」
（DNA Cloning）：第１巻、第109〜135頁（1985）〕に
従ってアニールしたDNAにより大腸菌DH1株（ATCC 3384
9）を形質転換しルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−DNAバン
クを作製した。
ンのテイルをそのPst I部位に付加したpUP19プラスミド
DNA500ngを、項目７記載の方法でアニールし、ハナハン
（Hanahan）の方法〔「デイエヌエイ・クローニング」
（DNA Cloning）：第１巻、第109〜135頁（1985）〕に
従ってアニールしたDNAにより大腸菌DH1株（ATCC 3384
9）を形質転換しルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−DNAバン
クを作製した。
13.ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNA
の検索 項目10で得られた組み換え体プラスミドpALf3DNA10μ
ｇを、90μのTE緩衝液に溶解し、10μのMed緩衝
液、25ユニットの制限酵素EcoR I及び25ユニットの制限
酵素のCla I（いずれも宝酒造社製）を添加し、温度37
℃で２時間反応を行ないDNAを切断した。切断した組み
換え体プラスミドpALf3DNAよりフォテナス・ピラリス
（アメリカホタル）由来のルシフェラーゼｃ−DNA部分
を含む800bpのEcoR I/Cla I DNAフラグメントを、項目
９記載のアガロースゲル電気泳動法を用いる方法に従っ
て単離し、１μｇのEcoR I/Cla I DNAフラグメントを得
た。この１μｇのDNAを、〔α−32P〕dCTP三燐酸（アマ
シャム社製）を用いて項目９記載のニックトランスレー
ション法により32Pで標識した。32Pで標識したEcoR I/C
Ia DNAフラグメントをプローブとして、ルシオラ・クル
シアタ尾部ｃ−DNAバンクを項目10記載のコロニーハイ
ブリダイゼーション法で検索することによりルシオラ・
クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNAを有する大腸
菌を選択した。プローブとハイブリダイズする大腸菌コ
ロニーを数個得た。この中の１コロニーの有する組み換
え体プラスミドDNAをpGLf1と命名し、項目５記載の方法
に従い組み換え体プラスミドDNAを単離した。該組み換
え体プラスミドDNAを含有する大腸菌を大腸菌DH1（pGLf
1）と命名した。なお、該形質転換はATCC67482として寄
託されている。
の検索 項目10で得られた組み換え体プラスミドpALf3DNA10μ
ｇを、90μのTE緩衝液に溶解し、10μのMed緩衝
液、25ユニットの制限酵素EcoR I及び25ユニットの制限
酵素のCla I（いずれも宝酒造社製）を添加し、温度37
℃で２時間反応を行ないDNAを切断した。切断した組み
換え体プラスミドpALf3DNAよりフォテナス・ピラリス
（アメリカホタル）由来のルシフェラーゼｃ−DNA部分
を含む800bpのEcoR I/Cla I DNAフラグメントを、項目
９記載のアガロースゲル電気泳動法を用いる方法に従っ
て単離し、１μｇのEcoR I/Cla I DNAフラグメントを得
た。この１μｇのDNAを、〔α−32P〕dCTP三燐酸（アマ
シャム社製）を用いて項目９記載のニックトランスレー
ション法により32Pで標識した。32Pで標識したEcoR I/C
Ia DNAフラグメントをプローブとして、ルシオラ・クル
シアタ尾部ｃ−DNAバンクを項目10記載のコロニーハイ
ブリダイゼーション法で検索することによりルシオラ・
クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNAを有する大腸
菌を選択した。プローブとハイブリダイズする大腸菌コ
ロニーを数個得た。この中の１コロニーの有する組み換
え体プラスミドDNAをpGLf1と命名し、項目５記載の方法
に従い組み換え体プラスミドDNAを単離した。該組み換
え体プラスミドDNAを含有する大腸菌を大腸菌DH1（pGLf
1）と命名した。なお、該形質転換はATCC67482として寄
託されている。
組み換え体プラスミドpGLf1DNAをHpa I,Hind III,Eco
R V,Dra I,Afl II,Hinc II,Pst I（いずれも宝酒造社
製）及Ssp I（ニューイングランドバイオラボ・社・
製）を用い、単一消化及び二重消化して得られたDNA断
片をアガロースゲル電気泳動法により、移動度パターン
を分析し、得られた移動度パターンとλファージDNA
（宝酒造社製）をHind IIIにより消化して得られたDNA
断片の標準移動度パターンとを対比することにより得ら
れた分子量は、2,000bpであり、上記プラスミドの制限
酵素地図は、第２図に示す通りである。
R V,Dra I,Afl II,Hinc II,Pst I（いずれも宝酒造社
製）及Ssp I（ニューイングランドバイオラボ・社・
製）を用い、単一消化及び二重消化して得られたDNA断
片をアガロースゲル電気泳動法により、移動度パターン
を分析し、得られた移動度パターンとλファージDNA
（宝酒造社製）をHind IIIにより消化して得られたDNA
断片の標準移動度パターンとを対比することにより得ら
れた分子量は、2,000bpであり、上記プラスミドの制限
酵素地図は、第２図に示す通りである。
14.ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNA
の塩基配列の解析 組み換え体プラスミドpGLf1DNA10μｇを制限酵素Pst
I（宝酒造社製）で切断し、ルシフェラーゼｃ−DNAを含
む2.0Kb DNA断片を2.5μｇを得、このDNA断片を、プラ
スミドpUC119DNA（宝酒造社製）のPst I部位にクローニ
ングし、ｃ−DNAの挿入方向の違いにより得られたプラ
スミドDNAを夫々pGLf2及びpGLf3と命名した。組み換え
体プラスミドpGLf1DNA及びプラスミドpUC119DNAのPst I
による切断処理（項目６記載の方法）、ルシフェラーゼ
ｃ−DNA断片のアガロースゲル電気泳動法を用いた単離
（項目９記載の方法）、プラスミドpUC119DNA及びルシ
フェラーゼｃ−DNA断片の連結反応（項目５記載の方
法）、連結反応液を用いた大腸菌JM101株（ATCC 3387
6）の形質転換（項目５記載の方法）、並びに組み換え
体プラスミドpGLf2およびpGLf3DNAの調製（項目５記載
の方法）は、カッコ内記載の方法に従った。
の塩基配列の解析 組み換え体プラスミドpGLf1DNA10μｇを制限酵素Pst
I（宝酒造社製）で切断し、ルシフェラーゼｃ−DNAを含
む2.0Kb DNA断片を2.5μｇを得、このDNA断片を、プラ
スミドpUC119DNA（宝酒造社製）のPst I部位にクローニ
ングし、ｃ−DNAの挿入方向の違いにより得られたプラ
スミドDNAを夫々pGLf2及びpGLf3と命名した。組み換え
体プラスミドpGLf1DNA及びプラスミドpUC119DNAのPst I
による切断処理（項目６記載の方法）、ルシフェラーゼ
ｃ−DNA断片のアガロースゲル電気泳動法を用いた単離
（項目９記載の方法）、プラスミドpUC119DNA及びルシ
フェラーゼｃ−DNA断片の連結反応（項目５記載の方
法）、連結反応液を用いた大腸菌JM101株（ATCC 3387
6）の形質転換（項目５記載の方法）、並びに組み換え
体プラスミドpGLf2およびpGLf3DNAの調製（項目５記載
の方法）は、カッコ内記載の方法に従った。
次いで、組み換え体プラスミドpGLf2及びpGLf3DNAを
用いてシキロークエンス用欠失キット（宝酒造社製）を
用い、ヘニコフ（Henikoff）の方法〔「ジーン」（Gen
e）、第28巻、第351〜359（1984）〕に従いルシフェラ
ーゼｃ−DNAに種々の欠失が導入されたプラスミドDNAを
作製し、項目５記載の方法で大腸菌JM101株（ATCC 3387
6）に導入した。このようにして得られた大腸菌にペル
パーファージM13KO7（宝酒造社製）を感染させることに
よりメッシング（Messing）の方法〔「メソズ・イン・
エンザイモロジー」「Methods in Enzymology）、第101
巻、第20〜78頁（1983）〕に従って１本鎖DNAを調製し
た。得られた１本鎖DNAによるシークエンシングは、M13
シークエンシングキット（宝酒造社製）を用いて上記メ
ッシング（Messing）の方法に従い行なった。塩基配列
の解析のためのゲル電気泳動は８％（W/V）ポリアクリ
ルアミドゲル（富士写真フィルム社製）を用いて行なっ
た。
用いてシキロークエンス用欠失キット（宝酒造社製）を
用い、ヘニコフ（Henikoff）の方法〔「ジーン」（Gen
e）、第28巻、第351〜359（1984）〕に従いルシフェラ
ーゼｃ−DNAに種々の欠失が導入されたプラスミドDNAを
作製し、項目５記載の方法で大腸菌JM101株（ATCC 3387
6）に導入した。このようにして得られた大腸菌にペル
パーファージM13KO7（宝酒造社製）を感染させることに
よりメッシング（Messing）の方法〔「メソズ・イン・
エンザイモロジー」「Methods in Enzymology）、第101
巻、第20〜78頁（1983）〕に従って１本鎖DNAを調製し
た。得られた１本鎖DNAによるシークエンシングは、M13
シークエンシングキット（宝酒造社製）を用いて上記メ
ッシング（Messing）の方法に従い行なった。塩基配列
の解析のためのゲル電気泳動は８％（W/V）ポリアクリ
ルアミドゲル（富士写真フィルム社製）を用いて行なっ
た。
得られたルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
ｃ−DNAのみの全塩基配列を第３図に、また、該ｃ−DNA
から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を第４図に
夫々示した。
ｃ−DNAのみの全塩基配列を第３図に、また、該ｃ−DNA
から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を第４図に
夫々示した。
15.組み換え体プラスミドpGLf37DNAの構築 先ず、Ｎ端末より９個のアミノ酸をコードする塩基配
列を欠失し、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラー
ゼ遺伝子及びベクターDNAを含有するDNA断片の調製につ
いて述べる。組み換え体プラスミドpGLf1DNA1μｇを、9
0μの水に溶解したものに、10μのMed緩衝液及び20
ユニットのPst I（宝酒造社製）を添加し、温度37℃で
２時間消化し、これに、等量の水飽和フェノールを添加
し、常法による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理を行
ったのち、項目５に記載の方法にて、ライゲーション及
び大腸菌JM101（ATCC33876）へ形質転換を行った。
列を欠失し、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラー
ゼ遺伝子及びベクターDNAを含有するDNA断片の調製につ
いて述べる。組み換え体プラスミドpGLf1DNA1μｇを、9
0μの水に溶解したものに、10μのMed緩衝液及び20
ユニットのPst I（宝酒造社製）を添加し、温度37℃で
２時間消化し、これに、等量の水飽和フェノールを添加
し、常法による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理を行
ったのち、項目５に記載の方法にて、ライゲーション及
び大腸菌JM101（ATCC33876）へ形質転換を行った。
得られた形質転換体から項目５に記載の方法によりDN
Aを単離し、Ssp I、EcoR V及びPst Iの制限酵素で単一
又は二重消化することにより、もとの組み換え体プラス
ミドpGLf1に対してｃ−DNAの向きが逆向きになっている
組み換え体プラスミドを選択し、pGLf10と命名した。
Aを単離し、Ssp I、EcoR V及びPst Iの制限酵素で単一
又は二重消化することにより、もとの組み換え体プラス
ミドpGLf1に対してｃ−DNAの向きが逆向きになっている
組み換え体プラスミドを選択し、pGLf10と命名した。
10μｇの組み換え体プラスミドpGLf10DNAを、90μ
の水に溶解したものに、10μのMed緩衝液及び10ユニ
ットのSsp I（ニューイングランドバイオラボ社製）を
添加し、温度37℃で30分処理し、部分分解物を得、この
部分分解物より項目９記載の方法により、Ｎ末端より９
個のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失したルシフェ
ラーゼ遺伝子及びベクターDNAの大部分を含有する4.0Kb
のDNA断片２μｇを単離した。
の水に溶解したものに、10μのMed緩衝液及び10ユニ
ットのSsp I（ニューイングランドバイオラボ社製）を
添加し、温度37℃で30分処理し、部分分解物を得、この
部分分解物より項目９記載の方法により、Ｎ末端より９
個のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失したルシフェ
ラーゼ遺伝子及びベクターDNAの大部分を含有する4.0Kb
のDNA断片２μｇを単離した。
次に、このDNA断片１μｇを95μの水に溶解したも
のに、５μの1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）及び0.3ユ
ニット（１μ）のアルカリフォスファターゼ（宝酒造
社製）を添加し、温度65℃で１時間処理し、常法による
除蛋白処理及びエタノール沈澱処理したのち、両端を脱
リン酸した4.0KbのDNA断片を１μｇ得た。
のに、５μの1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）及び0.3ユ
ニット（１μ）のアルカリフォスファターゼ（宝酒造
社製）を添加し、温度65℃で１時間処理し、常法による
除蛋白処理及びエタノール沈澱処理したのち、両端を脱
リン酸した4.0KbのDNA断片を１μｇ得た。
次に、大腸菌由来のトリプ（trp）プロモーターを含
有するDNA断片の調製法について述べる。
有するDNA断片の調製法について述べる。
トリププロモーターを含有するプラスミドpKN206DNA
〔「アグリク・バイオル・ケム」（Agric.Biol.Che
m.）、第50巻、第271〜279頁）（1986年）記載のもの〕
10μｇを、90μの水に溶解し、10μのMed緩衝液及
び20ユニットのCla I（宝酒造社製）を添加し、温度37
℃で２時間処理し、完全分解物を得、これに前述のSsp
I 10ユニットを添加し、温度37℃で30分間処理し、Ssp
Iによる部分分解物を得、常法による除蛋白処理及びエ
タノール沈澱処理したのち、得られた沈澱を100μのT
E緩衝液に溶解し、項目９記載の方法により、トリププ
ロモーターの大部分を含有する500bのDNA断片を単離し
た。
〔「アグリク・バイオル・ケム」（Agric.Biol.Che
m.）、第50巻、第271〜279頁）（1986年）記載のもの〕
10μｇを、90μの水に溶解し、10μのMed緩衝液及
び20ユニットのCla I（宝酒造社製）を添加し、温度37
℃で２時間処理し、完全分解物を得、これに前述のSsp
I 10ユニットを添加し、温度37℃で30分間処理し、Ssp
Iによる部分分解物を得、常法による除蛋白処理及びエ
タノール沈澱処理したのち、得られた沈澱を100μのT
E緩衝液に溶解し、項目９記載の方法により、トリププ
ロモーターの大部分を含有する500bのDNA断片を単離し
た。
次に合成DNAの調製について述べる。
上記4.0KbのDNA断片に含まれるルシフェラーゼ遺伝子
は、塩基配列より推定したところＮ末端より９個のアミ
ノ酸をコードする塩基配列を欠失している。
は、塩基配列より推定したところＮ末端より９個のアミ
ノ酸をコードする塩基配列を欠失している。
また、上記500bのDNA断片に含まれるトリププロモー
ターは、SDとATG間の塩基配列の一部を欠失している。
そこで、ルシフェラーゼのＮ末端より９個のアミノ酸を
コードする塩基配列及びトリププロモーターのSD−ATG
間の塩基配列を補うために、以下の２種類の合成DNAを
ベッグマン社製のシステム１プラスDNA合成機を用いて
合成した。
ターは、SDとATG間の塩基配列の一部を欠失している。
そこで、ルシフェラーゼのＮ末端より９個のアミノ酸を
コードする塩基配列及びトリププロモーターのSD−ATG
間の塩基配列を補うために、以下の２種類の合成DNAを
ベッグマン社製のシステム１プラスDNA合成機を用いて
合成した。
５′CGACAATGGAAAACATGGAAAACGATGAAAAT 3′ ５′ATTTTCATCGTTTTCCATGTTTTCCATTGT 3′ これらの２種の合成DNAをデュポン社製のネンソルブ
・プレプ（NENSORB PREP）を用いることにより、20μｇ
の精製された合成DNAを夫々得た。これら２種の合成DNA
1μｇを夫々45μの水に溶解し、５μのX10カイネー
ション緩衝液〔0.5Mトリス塩酸緩衝液（pH7.6）/0.1M M
gCl250mMジチオスレイトール/10mM ATP〕を添加し、更
に、10ユニット（１μ）とT4ポリヌクレオチドカイネ
ース（宝酒造社製）を添加したのち温度37℃で１時間処
理し、常法による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理を
行い、５′末端をリン酸化した合成DNAをそれぞれ１μ
ｇずつ得た。
・プレプ（NENSORB PREP）を用いることにより、20μｇ
の精製された合成DNAを夫々得た。これら２種の合成DNA
1μｇを夫々45μの水に溶解し、５μのX10カイネー
ション緩衝液〔0.5Mトリス塩酸緩衝液（pH7.6）/0.1M M
gCl250mMジチオスレイトール/10mM ATP〕を添加し、更
に、10ユニット（１μ）とT4ポリヌクレオチドカイネ
ース（宝酒造社製）を添加したのち温度37℃で１時間処
理し、常法による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理を
行い、５′末端をリン酸化した合成DNAをそれぞれ１μ
ｇずつ得た。
次に、ライゲーション反応により目的のプラスミドDN
Aの取得を行った。
Aの取得を行った。
上記の脱リン酸化したＮ末端より９個のアミノ酸をコ
ードする塩基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子、ベ
クターDNAを含む4.0KbのDNA断片１μｇ、上記のトリプ
プロモーターを含む500bのDNA断片１μｇ及び上記２種
のリン酸化した合成DNA0.1μｇを夫々８μの水に溶解
した。これに１μのX10ライゲーション緩衝液〔200mM
MgCl2/660mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）/10mM ATP/150
mMジチオスレイトール〕及び１ユニットのT4DNAライゲ
ース（宝酒造社製）（１μ）を添加し、温度16℃にて
16時間反応を行った。得られた反応液を用いて項目５に
記載の方法にて大腸菌JM101（ATCC33876）へ形質転換を
行い、得られた形質転換体より、項目５に記載の方法に
てプラスミドDNAを単離し、Ssp I、EcoR V及びPst Iの
制限酵素で単一又は二重消化したのち、0.7％アガロー
スゲル電気泳動にて展開し、トリププロモーターにより
ルシフェラーゼ遺伝子を完全にコードするルシフェラー
ゼ遺伝子を発現するプラスミドを得、該組み換え体プラ
スミドを、pGLf37と命名し、また、該プラスミドを含有
する大腸菌を大腸菌JM101（pGLf37）と命名した。
ードする塩基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子、ベ
クターDNAを含む4.0KbのDNA断片１μｇ、上記のトリプ
プロモーターを含む500bのDNA断片１μｇ及び上記２種
のリン酸化した合成DNA0.1μｇを夫々８μの水に溶解
した。これに１μのX10ライゲーション緩衝液〔200mM
MgCl2/660mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）/10mM ATP/150
mMジチオスレイトール〕及び１ユニットのT4DNAライゲ
ース（宝酒造社製）（１μ）を添加し、温度16℃にて
16時間反応を行った。得られた反応液を用いて項目５に
記載の方法にて大腸菌JM101（ATCC33876）へ形質転換を
行い、得られた形質転換体より、項目５に記載の方法に
てプラスミドDNAを単離し、Ssp I、EcoR V及びPst Iの
制限酵素で単一又は二重消化したのち、0.7％アガロー
スゲル電気泳動にて展開し、トリププロモーターにより
ルシフェラーゼ遺伝子を完全にコードするルシフェラー
ゼ遺伝子を発現するプラスミドを得、該組み換え体プラ
スミドを、pGLf37と命名し、また、該プラスミドを含有
する大腸菌を大腸菌JM101（pGLf37）と命名した。
16.組み換え体プラスミドpGLf37DNAの変異 組み換え体プラスミドpGLf37DNA30μｇを、100μの
ヒドロキシルアミン溶液〔0.8M塩酸ヒドロキシルアミン
/0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）/1mM EDTA〕に溶解し、65
℃で２時間変異処理したのち、常法によりエタノール沈
澱を行い沈澱物を回収した。この沈澱物をTE緩衝液〔10
mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/1mM EDTA〕に溶解し、
ハナハン（Hana−han）の方法〔ディーエヌエイ・クロ
ーニング（DNA Cloning）、第１巻、第109〜135頁（198
5）〕により、大腸菌JM101株（ATCC 33876）を形質転換
し、LB−amp寒天培地〔バクトトリプトン１％（W/V），
酵母エキス0.5％（W/V）,NaCl 0.5％（W/V），アンピシ
リン（50μg/ml）及び1.4％（W/V）寒天〕に接種し、37
℃で培養した。12時間後、出現してきたコロニーをLB−
amp培地〔バクトトリプトン１％（W/V），酵母エキス0.
5％（W/V）,NaCl 0.5％（W/V），及びアンピシリン（50
μg/ml）〕3mlにて温度37℃で18時間振盪培養を行っ
た。この培養液0.5mlを10mlの上記LB−amp培地に接種
し、温度37℃で４時間振盪培養したのち、8000r.p.m.で
10分間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫々20mgずつ得
た。
ヒドロキシルアミン溶液〔0.8M塩酸ヒドロキシルアミン
/0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）/1mM EDTA〕に溶解し、65
℃で２時間変異処理したのち、常法によりエタノール沈
澱を行い沈澱物を回収した。この沈澱物をTE緩衝液〔10
mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/1mM EDTA〕に溶解し、
ハナハン（Hana−han）の方法〔ディーエヌエイ・クロ
ーニング（DNA Cloning）、第１巻、第109〜135頁（198
5）〕により、大腸菌JM101株（ATCC 33876）を形質転換
し、LB−amp寒天培地〔バクトトリプトン１％（W/V），
酵母エキス0.5％（W/V）,NaCl 0.5％（W/V），アンピシ
リン（50μg/ml）及び1.4％（W/V）寒天〕に接種し、37
℃で培養した。12時間後、出現してきたコロニーをLB−
amp培地〔バクトトリプトン１％（W/V），酵母エキス0.
5％（W/V）,NaCl 0.5％（W/V），及びアンピシリン（50
μg/ml）〕3mlにて温度37℃で18時間振盪培養を行っ
た。この培養液0.5mlを10mlの上記LB−amp培地に接種
し、温度37℃で４時間振盪培養したのち、8000r.p.m.で
10分間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫々20mgずつ得
た。
回収した菌体を、0.1M KH2PO4（pH7.8）、2mM EDTA、
1mMジテオスレイトール、及び0.2mg/mlプロタミン硫酸
からなる緩衝液0.9mlに懸濁し、更に、これに、100μ
の10mg/mlのリゾチーム溶液を添加し、氷中に15分間放
置した。次に、この懸濁液を、メタノール、ドライアイ
ス浴中で凍結し、次いで温度25℃に放置し、完全に解凍
した。更に、12000r.p.m.で５分間遠心分離操作を行う
ことにより、上清として粗酵素1mlを得た。
1mMジテオスレイトール、及び0.2mg/mlプロタミン硫酸
からなる緩衝液0.9mlに懸濁し、更に、これに、100μ
の10mg/mlのリゾチーム溶液を添加し、氷中に15分間放
置した。次に、この懸濁液を、メタノール、ドライアイ
ス浴中で凍結し、次いで温度25℃に放置し、完全に解凍
した。更に、12000r.p.m.で５分間遠心分離操作を行う
ことにより、上清として粗酵素1mlを得た。
このようにして得られたルシフェラーゼを含む粗酵素
液50μを、400μのルシフェリン−ATP混合〔260μ
の25mMグリシルグリシン緩衝液（pH7.8）/16μの0.
1M硫酸マグネシウム/24μの1mMルシフェリン（シグマ
社製）/100mlの10mM ATP〕に加えて発光させ、色を確認
した。その結果、赤色（波長609,612nm）、オレンジ色
（波長595,607nm）及び緑色（波長558nm2種）に発光す
るもの計６種を得た。
液50μを、400μのルシフェリン−ATP混合〔260μ
の25mMグリシルグリシン緩衝液（pH7.8）/16μの0.
1M硫酸マグネシウム/24μの1mMルシフェリン（シグマ
社製）/100mlの10mM ATP〕に加えて発光させ、色を確認
した。その結果、赤色（波長609,612nm）、オレンジ色
（波長595,607nm）及び緑色（波長558nm2種）に発光す
るもの計６種を得た。
更に、この粗酵素液を特開平１−141592号公報の方法
で精製し、上記の方法で発光させた結果、同じ発光色を
すことが判明した。
で精製し、上記の方法で発光させた結果、同じ発光色を
すことが判明した。
以上の如くして得られた赤色（波長609nm,612nm）に
発光する変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子の組
み込まれた組み換え体DNAをpGLf37C−Ｍ−２及びpGLf37
C−Ｍ−５と命名し、該プラスミドで形質転換された大
腸菌、すなわち大腸菌（E.coli）JM 101（pGLf37−Ｍ−
２）及びJM 101（pGLf37C−Ｍ−５）は、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研条寄第2825号（FERM BP−2
825）及び微工研条寄第3136号（FERM BP−3136）として
寄託されており、また、オレンジ色（波長595nm,607n
m）に発光する変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝
子の組み込まれた組み換え体DNAをpGLf37C−Ｍ−４及び
pGLf37C−Ｍ−１と命名し、該プラスミドで形質転換さ
れた大腸菌、すなわち大腸菌（E.coli）JM 101（pGLf37
−Ｍ−４）及びJM 101（pGLf37C−Ｍ−１）は、同所に
微工研条寄第2826号（FERM BP−2826）及び微工研条寄
第3135号（FERM BP−3135）として寄託され、更にま
た、緑色（558nm）に発光する変異型ルシフェラーゼを
コードする遺伝子の組み込まれた組み換え体DNAをpGLf3
7C−Ｍ−６及びpGLf37C−Ｍ−７と命名し、該プラスミ
ドで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌（E.coli）
JM 101（pGLf37−Ｍ−６）及びJM 101（pGLf37C−Ｍ−
７）は、同所に微工研条寄第3137号（FERM BP−3137）
及び微工研条寄第3138号（FERM BP−3138）として寄託
されている。
発光する変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子の組
み込まれた組み換え体DNAをpGLf37C−Ｍ−２及びpGLf37
C−Ｍ−５と命名し、該プラスミドで形質転換された大
腸菌、すなわち大腸菌（E.coli）JM 101（pGLf37−Ｍ−
２）及びJM 101（pGLf37C−Ｍ−５）は、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研条寄第2825号（FERM BP−2
825）及び微工研条寄第3136号（FERM BP−3136）として
寄託されており、また、オレンジ色（波長595nm,607n
m）に発光する変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝
子の組み込まれた組み換え体DNAをpGLf37C−Ｍ−４及び
pGLf37C−Ｍ−１と命名し、該プラスミドで形質転換さ
れた大腸菌、すなわち大腸菌（E.coli）JM 101（pGLf37
−Ｍ−４）及びJM 101（pGLf37C−Ｍ−１）は、同所に
微工研条寄第2826号（FERM BP−2826）及び微工研条寄
第3135号（FERM BP−3135）として寄託され、更にま
た、緑色（558nm）に発光する変異型ルシフェラーゼを
コードする遺伝子の組み込まれた組み換え体DNAをpGLf3
7C−Ｍ−６及びpGLf37C−Ｍ−７と命名し、該プラスミ
ドで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌（E.coli）
JM 101（pGLf37−Ｍ−６）及びJM 101（pGLf37C−Ｍ−
７）は、同所に微工研条寄第3137号（FERM BP−3137）
及び微工研条寄第3138号（FERM BP−3138）として寄託
されている。
なお、このようにして得られた菌株について、色（波
長）、塩基配列の変化（位置）及びアミノ酸配列の変化
（位置）の対応関係を第１表に示した。
長）、塩基配列の変化（位置）及びアミノ酸配列の変化
（位置）の対応関係を第１表に示した。
第１図は、組み換え体プラスミドpALf3DNAの制限酵素に
よる切断地図を示す図であり、第２図は、組み換え体プ
ラスミドpGLf1DNAの制限酵素による切断地図を示す図で
あり、第３図は、ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示
す図であり、また、第４図は、ルシフェラーゼ遺伝子か
ら翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を示す図であ
る。
よる切断地図を示す図であり、第２図は、組み換え体プ
ラスミドpGLf1DNAの制限酵素による切断地図を示す図で
あり、第３図は、ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示
す図であり、また、第４図は、ルシフェラーゼ遺伝子か
ら翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を示す図であ
る。
Claims (4)
- 【請求項１】ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラー
ゼのアミノ酸配列においてその233位のバリンがイソロ
イシンに、239位のバリンがイソロイシンに、286位のセ
リンがアスパラギンに、326位のグリシンがセリンに、4
33位のヒスチジンがチロシンに、または452位のプロリ
ンがセリンに変異されているアミノ酸配列をコードする
変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】請求項１記載の変異型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組
み換え体DNA。 - 【請求項３】ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラー
ゼのアミノ酸配列においてその233位のバリンがイソロ
イシンに、239位のバリンがイソロイシンに、286位のセ
リンがアスパラギンに、326位のグリシンがセリンに、4
33位のヒスチジンがチロシンに、または452位のプロリ
ンがセリンに変異されているアミノ酸配列をコードする
変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿
入した組み換え体DNAを含み、変異型ホタルルシフェラ
ーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を
培地に培養し、培養物より、変異型ホタルルシフェラー
ゼを採取することを特徴とする変異型ホタルルシフェラ
ーゼの製造法。 - 【請求項４】ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラー
ゼのアミノ酸配列においてその233位のバリンがイソロ
イシンに、239位のバリンがイソロイシンに、286位のセ
リンがアスパラギンに、326位のグリシンがセリンに、4
33位のヒスチジンがチロシンに、または452位のプロリ
ンがセリンに変異されていることを特徴とする変異型ホ
タルルシフェラーゼ。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/675,211 US5219737A (en) | 1990-03-27 | 1991-03-26 | Mutant luciferase of a firefly, mutant luciferase genes, recombinant dnas containing the genes and a method of producing mutant luciferase |
| EP91302717A EP0449621B1 (en) | 1990-03-27 | 1991-03-27 | Mutant luciferase of a firefly, mutant luciferase genes, novel recombinant DNAS containing the genes and a method of producing mutant luciferase |
| DE69121618T DE69121618T2 (de) | 1990-03-27 | 1991-03-27 | Mutierte Luciferase vom Leuchtkäfer, mutiertes Luciferasegen, rekombinante DNS diese Gene enthaltend, und Verfahren zur Herstellung von mutierter Luciferase |
| US08/076,042 US5330906A (en) | 1990-03-27 | 1993-06-15 | Mutant luciferase of a firefly |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7569690 | 1990-03-27 | ||
| JP2-75696 | 1990-03-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03285683A JPH03285683A (ja) | 1991-12-16 |
| JP2666561B2 true JP2666561B2 (ja) | 1997-10-22 |
Family
ID=13583635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2294258A Expired - Fee Related JP2666561B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-10-30 | 変異型ホタルルシフェラーゼ、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2666561B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007029747A1 (ja) * | 2005-09-06 | 2007-03-15 | Bioenex Inc. | 変異型ホタルルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法 |
| US7915021B2 (en) | 2007-09-26 | 2011-03-29 | Hitachi, Ltd. | Mutant firefly luciferase |
| WO2011058767A1 (ja) | 2009-11-10 | 2011-05-19 | キッコーマン株式会社 | ホタルルシフェラーゼ、その遺伝子、およびホタルルシフェラーゼの製造法 |
| US10851141B2 (en) | 2016-06-21 | 2020-12-01 | Dkk-Toa Corporation | Mutant beetle luciferase, gene, recombinant vector, transformant, and method for preparing mutant beetle luciferase |
| WO2021162123A1 (ja) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | キッコーマン株式会社 | 試料中のａｔｐ、並びにａｍｐ及び／又はａｄｐを測定するための液体組成物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4222636B2 (ja) * | 1997-07-08 | 2009-02-12 | キッコーマン株式会社 | 変異型生物発光タンパク質、および変異型生物発光タンパク質の製造法 |
| WO2016051517A1 (ja) * | 2014-09-30 | 2016-04-07 | オリンパス株式会社 | オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼ |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63214187A (ja) * | 1987-03-04 | 1988-09-06 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 新規な遺伝子ｄｎａおよびアルカリ性プロテア−ゼの製造法 |
| JPH0265780A (ja) * | 1988-09-01 | 1990-03-06 | Kikkoman Corp | ルシフェラーゼの製造法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8916806D0 (en) * | 1989-07-22 | 1989-09-06 | Univ Wales Medicine | Modified proteins |
-
1990
- 1990-10-30 JP JP2294258A patent/JP2666561B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63214187A (ja) * | 1987-03-04 | 1988-09-06 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 新規な遺伝子ｄｎａおよびアルカリ性プロテア−ゼの製造法 |
| JPH0265780A (ja) * | 1988-09-01 | 1990-03-06 | Kikkoman Corp | ルシフェラーゼの製造法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2007029747A1 (ja) * | 2005-09-06 | 2007-03-15 | Bioenex Inc. | 変異型ホタルルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法 |
| US8003350B2 (en) | 2005-09-06 | 2011-08-23 | Bioenex Inc. | Mutant firefly luciferase, gene, recombinant vector, transformant, and method for production of mutant firefly luciferase |
| US7915021B2 (en) | 2007-09-26 | 2011-03-29 | Hitachi, Ltd. | Mutant firefly luciferase |
| WO2011058767A1 (ja) | 2009-11-10 | 2011-05-19 | キッコーマン株式会社 | ホタルルシフェラーゼ、その遺伝子、およびホタルルシフェラーゼの製造法 |
| US10851141B2 (en) | 2016-06-21 | 2020-12-01 | Dkk-Toa Corporation | Mutant beetle luciferase, gene, recombinant vector, transformant, and method for preparing mutant beetle luciferase |
| WO2021162123A1 (ja) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | キッコーマン株式会社 | 試料中のａｔｐ、並びにａｍｐ及び／又はａｄｐを測定するための液体組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03285683A (ja) | 1991-12-16 |
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