JPH0265780A - ルシフェラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、ルシオラ・クルシアタ　（Ｌｕｃｉｏｌａｃ
ｒｕｃｉａｔａ、ゲンジボタル）由来のルシフェラーゼ
の製造法に関する。

〔従来の技術〕

ルシオラ（Ｌｕｃｉｏｌａ）属ホタルのルシフェラーゼ
は、収集されたルシオラ属ホタルより分離、精製されて
得られているに過ぎない〔「ブロク・ナトル・アカド・
サイＪ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）
　、第７４巻、第７号、第２７９９〜２８０２頁（１９
７７）　）。

上記ルシフェラーゼは、例えば、ＡＴＰの定量用酵素と
して掻めて有用な酵素である。

［発明が解決しようとする課題〕 しかしながら、上記ルシフェラーゼは、昆虫由来である
ため、その製造には、ルシオラ属ホタルを自然界より採
取するか、あるいは、該ホタルを養殖し、得られた該ホ
タルよりルシフェラーゼを分離、精製しなければならず
、その製造には、多大な時間と労力を要するものであっ
た。

（課題を解決するための手段〕 そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを得、この組み換え体ＤＮＡをエッシェリシア（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物に含ませたル
シフェラーゼ生産能を有する微生物を培地に培養するこ
とにより、短期間のうちに効率よくルシフェラーゼが生
産されることを知り特許出願を行なった（特願昭６２−
１８７７２４号及び特願昭６２−１８７７２５号明細書
）しかし、上述のルシフェラーゼをコードする遺伝子は
、Ｎ末端より９個のアミノ酸に対応する塩基配列を欠失
しており、また、上記遺伝子は、その欠失部分に大腸菌
由来のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端のアミノ酸配列等
が結合しているため、総酵素活性において充分満足すべ
きものではなかった。

そこで、更に、本発明者等は、上記課題を解消するため
鋭意検討した結果、下記に示されるアミノ酸配列をコー
ドする完全なルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、ルシフェラーゼ生産
能を有するエッシェリシア属に属する微生物を、培地に
培養すれば、先の特許出願の方法に比較して、酵素活性
において約１０倍以上のルシフェラーゼが生産されるこ
と等の知見を得、本発明を完成した。

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Ｇｌｕ　　１ｉｅＬｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ
ｏ　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｍｅｔすなわち本
発明は、下記に示されるアミノ酸配列をコードするルシ
フェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを含み、ルシフェラーゼ生産能を有する工ンシ
ェリシア属に属する微生物を、培地に培養し、培養物よ
りルシフェラーゼを採取することを特徴とするルシフェ
ラーゼの製造法である。

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　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　
　Ｍｅｔ以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ　ｃｒｕ
ｃｉａｔａ）のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡを検索する際、プローブとしてホタルの１
種であるフォティナス・ビラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　
ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡを使用するためにその調製法につ
いて述べる。

ホタルの１種であるフォティナス・ビラリスの尾部より
ｍ−ＲＮＡを調製するには、例えば、モレキュラー・ク
ローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第ｔ９６頁、「コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−Ｊ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）及び「分
子遺伝学実験法」小関治男、志村令部、第６６〜６７頁
（１９８３）記載の方法等により得ることができる。

得られたｍ−ＲＮＡよりルシフェラーゼをコードするｍ
−ＲＮＡを濃縮するには、例えば、「バイオメディカル
・リサーチＪ　（Ｂｉｏｎ＋ｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ）、第３巻、第５３４〜５４０頁（１９８２）記
載の方法により行なうことができる。

なお、この際、ルシフェラーゼに対する抗ルシフェラー
ゼ血清を使用するのであるが、該血清は、例えば、「免
疫化学」、山村ａ−１第４３〜５０頁（１９７３）記載
の方法により得ることができる。

ルシフェラーゼをコードするｍ−ＲＮＡよりＣ−ＤＮＡ
を合成するには、例えば、１モル・セル・パイオル」（
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁
（１９８２）及び「ジーン」（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、
第２６３頁（１９８３）記載の方法により行なうことが
できる。

次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡ　［プ
ラスミドｐＫＮ３０５　（ｒアグル・パイオル・ケムＪ
　（Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩＩ＋、）、第５０巻、
第２７１頁（１９８６）記載の大腸菌トリプトファンオ
ペロンのプロモーターを有するプラスミド〕及びプラス
ミドｐＭ　Ｃ１８４３（ｒメソズ・イン・エンザイモロ
ジー」（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）　、第１００巻、第２９３〜３０８頁（１９８３）記
載の大腸菌β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を有するプ
ラスミド）を用いて作製したプラスミド］等に組み込み
、種々の組み換え体プラスミドＤＮＡを得、　該Ｄ　Ｎ
　Ａを用いて例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ日１
　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９）、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
）　ＨＢ　１０１　　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３６９４）等を
ハナハン（）ｌａｎａｈａｎ）の方法〔「デイーエヌエ
イ・り１：７−−−ング」Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第１巻、第１．０９〜１３５頁（１９８５）　）に
より形質転換し、種々の形質転換株を得る。

なお、このようにして得られた形質転換株の有する組み
換え体プラスミドＤＮＡは、大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ構造遺伝子の途中にｃ−ＤＮＡが組み込まれたプラス
ミドであって、ｃ−ＤＮＡによりコードされているペプ
チドは、β−ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として
発現するものである。

上記の種々な形質転換株よりルシフェラーゼをコードす
るｃ−ＤＮＡを検出するには、形質転換株を培養するこ
とにより、菌体蛋白質を発現させ、抗ルシフェラーゼ血
清と交差する蛋白質が存在するか否かにより検出するこ
とができ、例えば、「アゲリンク・ハイオル・ケム」（
八ｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、）、第５０巻、第２７１頁（１９８６）及び
アナル・バイオケム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　
、第１１２巻、第１９５頁（＋９８１）記載の方法等に
より行なうことができる。

次いで、不完全なルシフェラーゼのｃ−ＤＮＡを”Ｐを
用いニックトランスレーション法〔「モレキュラー・ク
ローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第１０９〜１１２頁、「コールド・スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−Ｊ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｔｎｇ　
Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、（１９８２）
及び「ジェイ・モル・パイオル」（Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ
１．）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１，９７７
）　）により標識したのち、該ｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａをプロ
ーブとしてコロニーハイブリダイゼイション法［「蛋白
質、核酸、酵素」、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１
９８１））によりプラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡをベクタ
ーとして作成したｃ−ＤＮＡのシーンバンクのライブラ
リーより１．８Ｋｂのルシフェラーゼをコードするｃ−
ＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを得ることができる
。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡよりフォティナス・ビラリス由来のルシフェラー
ゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを得るには、該
プラスミドＤＮＡに、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ及び
ＣＩａＩを温度３０〜４０°Ｃ１好ましくは３７°Ｃで
１〜２４時間、好ましくは２時間作用させて反応終了液
を、アガロースゲル電気泳動法（「モレキュラー・クロ
ーニングＪ　（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、
第１５０頁、「コールド・スプリング・ハーバ’　−−
ラボラトリ−Ｊ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａ　ｔｏｒｙ）　（１９８２）記載〕
によりフォティナス・ビラリス由来のルシフェラーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡを得ることができる
。

次に、本発明に用いられる新規な組み換え体ＤＮＡの調
製法等について述べる。

先ず、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の由来は、如
何なるものでもよく、例えば、ルシオラ・クルシアタ（
Ｌｕｃｉｏｌａ　ｃｒｕｃｉａｔａ、ゲンジボタル）等
が挙げられ、殊に該ホタルの尾部が好ましい。

そして、上記ホタルの尾部からのｍ−ＲＮＡの調製及び
ｍ−ＲＮＡからのｃ−ＤＮＡの合成は、例えば、上述し
たフォティナス・ビラリスのｍ−ＲＮＡの調製法及びｃ
−ＤＮＡの合成法と全く同様にして行なうことができる
。

次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡ　（全酒
造社製）等に組み込み、種々の組み換え体プラスミドＤ
ＮＡを得、該Ｄ　Ｎ　Ａを用いて例えば、大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９）、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１（Ａ　Ｔ　ＣＣ３
３６９４）等をハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法〔［
ディーエヌエイ・クロニック」（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）　）に
より形質転換し、種々の形質転換株を得る。

次いで、フォティナス・ビラリス由来のルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを”　Ｐ　ヲ用い
ニックトランスレーション法〔「モレキュラー・クロー
ニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第
１０９〜１１２　頁、「コールド・スプリング・バーバ
ー・ラボラトリ−Ｊ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）及び「
ジェイ・モル・パイオル」（Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、第１１３巻、第２３７〜２５１
頁（１９７７）　〕により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡ
をプローブとしたコロニーハイブリダイゼイション法〔
「蛋白質・核酸・酵素」、第２６巻、第５７５〜５７９
頁（１９８１）　：１により、プラスミドｐＵｃ１９Ｄ
ＮＡをベクターとして作成したルシオクラ・セイシアタ
由来のＣ−ＤＮＡのシーンバンクのライブラリーより２
．ＯＫｂのルシフェラーゼをコードするｃ−ＤＮＡを含
有するプラスミドＤＮＡを得ることができる。

次いで、上記ルシオラ・クルシアタ由来で２．０Ｋｂの
ルシフェラーゼをコードするｃ　−ＤＮＡを制限酵素５
ｓｓｐｌで処理して得られる１、７Ｋｂｃ−ＤＮＡ断片
、すなわち、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする塩
基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子、プロモーター
〔例えば、大腸菌由来のトリゾ（ｔｒｐ）プロモーター
等］、ベクターＤＮＡ及びルシフェラーゼ遺伝子のＮ末
端より９個のアミノ酸をコードする塩基配列を有する合
成法を用いて、制限酵素、例えば５ｓｐＩ　　にューイ
ングランドハイオラボ社製）等及びＴ４ＤＮＡリガーゼ
（全酒造社製）等によりルシオラ・クルシアタ由来のル
シフェラーゼ遺伝子を完全にコードする塩基配列を有す
る組み換え体ＤＮＡを得ることができる。

上記ベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、
例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、ハタテリオファー
ジベクターＤＮＡ等が挙げられるが、具体的には、例え
ば、ｐＵｃ１８（全酒造社製）、ｐＵｃ１９（全酒造社
製）、λｃ１８５７ｈ８０ａｔｔ　λｓＲ［λ９ｓＲＩ
λ：ｓＲＩλ？（特公昭６１−３７９１７号公報記載）
等が挙げられる。

そして、このようにして得られた新規な組み換え体ＤＮ
Ａを用いて、エンシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉ
ａ）属の微生物、例えば、大腸菌ＪＭＩＯＩ（ＡＴＣＣ
３３８７６）等を、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）等の方法〔
「ジェイ・バクＪ　（Ｊ、Ｂａｃ、）、第１１９巻、第
１０７２〜１０７４頁（１９７４）　）により、形質転
換するか、あるいは、「モレキュラー・クローニングＪ
（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、第２５６〜２
６８頁、コールド、スプリング・ハーバ−・ラボラトリ
−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）　（１９８２）記載の方法により形質導入
してルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮ
ＡをベクターＤＮＡに挿入した新規な期み換え体ＤＮＡ
を含みルシフェラーゼ生産能を有するエンシェリンア属
に属する微生物を得る。

このようにして得られた微生物より純化された新規な組
み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、「ブロク・ナトル
・アカド・サイＪ　　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　、第６２巻、第１１５９〜１
１６６頁（１９６９）記載の方法などにより得ることが
できる。

次いで、上記微生物を培地に培養し、培養物よりルシフ
ェラーゼを採取するのである。

培地としては、例えば、エッシェシリア属に属する微生
物の培養に用いられるものであれば、如何なるものでも
よく、例えば、トリプトン１％（Ｗ／ν）、酵母エキス
０．５％（Ｗ／Ｖ）及びＮａＣｌ　０．５％（Ｗ／Ｖ）
等が挙げられる。

また、培養温度は、例えば、３０〜４０°Ｃ１好ましく
は３７°Ｃ程度で、培養時間は、例えば、４〜８時間、
好ましくは４時間程度である。

そして、培養物より菌体を例えば、８，０００ｒ、ｐ、
ｍ。

で１０分間程度の遠心分離処理により集菌し、得られた
菌体を、例えば、「メンズ・イン・エンサイモロジーＪ
　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第
１３３巻、第３〜１４頁（１９８６）記載の方法により
破砕し、粗酵素液を得る。

そして、粗酵素液は、そのままでも使用可能であるが、
必要により硫安分画、疎水クロマＩ−グラフ法、例えば
、ブチル−トヨバール６５０　Ｃ等、ゲル濾過法、例え
ば、ウル１ヘロゲルＡ　ｃ　Ａ　３４等により精製して
、純化されたルシフェラーゼを得る。

このようにして得られたルシフェラーゼの理化学的性質
は、以下に示す通りである。

■作用： 下記の酵素反応式で示されるように酵素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である。

ルシフェラーゼ ｋ　’／　７　ｓ　’）　７　＋　Ａ　Ｍ　Ｐ　＋　Ｏ
ｚ　　−ｍ−「−オキジルシフェリン＋ＡＴＰ＋ビロリ
ン１＋ｃｏ□＋光 ■基質特異性： ＡＤＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰには作用しない。

■至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは、ルシフェリンを基質とし、２５ｍＭグツシ
ルグリシンのｐＨをｐＨ６，５〜１１．５迄変化させ、
温度３０°Ｃで反応させ、２０秒間発発光灯フォトン数
）を測定した場合、ｐＨ８，０〜９．５であり、また安
定ｐＨ範囲は、ルシフェリンを含有する緩衝液（ｐＨ４
，６〜８．　Ｏ：　２５１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８，０
〜１１．５　：　２５ｍＭグリシン・塩化ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用。なお、それぞ
れの緩衝液には１０％飽和となる如く硫酸アンモニウム
を添加したものである。）に酵素を添加し、温度Ｏ′Ｃ
で４時間作用させた場合、６，５〜９，０である。

■力価の測定法： ２５ｍ門グリシルグリシン（ｐＨ７，８）８ａ／、硫酸
マグネシウム溶液（２５ｍＭグリシルグリシン（ｐＨ７
，８）に硫酸マグネシウムを０．１　Ｍとなる如く添加
した溶液〕０．５−およびルシフェリン溶液（２５＋Ｍ
グリシルグリシン（ｐ　Ｈ７，８）に硫酸ルシフェリン
を１ｍＭとなる如く添加した溶液）０．８ｍｌを混合し
てルシフェリン混合液を調製する。

このようにして得たルシフェリン混合液４００μｌ及び
測定するルシフェラーゼ１０μＰを混合したものに、Ａ
ＴＰ溶液（２５ｎ＋Ｍグリシルグリシン（ｐＨ７，８）
にＡＴＰを１０ｍＭとなる如く添加したもの。〕８０μ
２を注入すると同時に、ルミノメータ−（アロカ社製、
ルミネッセンスリーダー　Ｂ　Ｌ　Ｒ−２０１）により
発生するフォトン数を２０秒間積算して求める。

■作用温度の範囲： ｐＨ７，８のもとに、各温度で反応させた２０秒間光量
（フォトン数）を測定した場合、０〜５０°Ｃの範囲内
にある。

■ｐＨ１温度などによる失活の条件 （イ）ｐＨによる失活の条件 ｐＨ５，０以下及びｐＨ１１，０以上で４時間後完全に
失活する。

（ロ）温度による失活の条件 ｐ　Ｈ７，８において、温度５０°Ｃ，１５分間の熱処
理により完全に失活する。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明によれば、ルシ
オラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ遺伝子を完全に
コードする遺伝子を含有する組み換え体ＤＮＡを含むエ
ンシェリシア属に属する微生物を培地に培養することに
より、極めて短期間のうちに、ルシフェラーゼを効率よ
く製造することができるので、本発明は、産業上極めて
有用である。

以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。

実施例 なお、以下にのべる項目１〜１０には、ホタルの１種で
あるフォティナス・ビラリスのルシフェラーゼをコード
する遺伝子を含有するＤＮＡ　（該ＤＮＡは、ルシオラ
・クルシアタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡを検索する際、プローブとして使用される
ものである。）の調製についてのべる。

１、ｍ−ＲＮＡの調製 ホタルの１種であるフォティナス・ビラリス（Ｐｈｏｔ
ｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）の乾燥圧部（シグマ社製）
１ｇを乳鉢及び乳棒を用いて充分破砕したものに、溶解
緩衝液５　ｍＦ　（２０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
ｌ＋７．４）／　１０ｍＭ　ＮａＣ１／　３　ｍＦ酢酸
マグネシウム１５％（ｗ／ｖ）シーｚ　＄Ｊ！／　１．
２％（Ｖ／Ｖ）　　トリドア　Ｘ　−Ｉｏｏ　／　ＩＯ
ｍＦバナジルヌクレオシド錯体にューイングランド　バ
イオラボ社製）〕を添加し、更に、上記と同様に破砕し
てフォティナス・ピラリス圧部破砕物含有溶液を得た。

このようにして得た溶液５ｍＺを、カップ型ブレンダー
（日本精機製作所社製）に入れ、５，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ
。

で５分間処理したものに、１２ｍのグアニジンイソチオ
シアネートン容液（６Ｍグアニジンイソチオンアネート
／３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）　１
０．７５％（Ｗ／Ｖ）　Ｎ−ラウロイルザルコシンナト
リウム１０．１５Ｍ　β−メルカプトエタノール）を添
加し、更に、上記プレンダーを用い３．００Ｏｒ、ｐ、
ｍ、で１０分間処理して得た溶液を、３重のガーゼを用
いて濾過し、濾液を得、超遠心分離機用チューブ（日立
１機社製）４本に、予め１．２　ｍＦの５，７Ｍの塩化
セシウム溶液を夫々重層し、その上に、上記濾液を重層
するように夫々分注し、超遠心骨Ｍ機（日立１機社製、
５ＣＰ５５Ｈ）を用いて温度１５°Ｃ１３０，０００ｒ
、ｐ、ｍ、で１６時間遠心分離して沈澱物を得た。得ら
れた沈澱物を、冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを用いて
洗浄したものを、１０ｍＭ　）リス緩衝液（１０ｄ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１５ｍＭＥＤＴＡ／１％
ドデシル硫酸ナトリウム］４−に懸濁したものに、同量
のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを４対１　（容量
比）となる如く混合したものを添加して抽出し、常法に
より３，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離し、水
層及び有機溶媒層に分離し、この有機溶媒層に上記１０
１トリス緩衝液４−を添加し、上記抽出及び分離操作を
行なう操作を２回繰り返して得られた水層に、１７１０
量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｔ４５．２）及び２倍量の
冷エタノールを添加したものを温度−２０°Ｃで２時間
放置したのち、常法により８，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で２
０分間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱させ、得られたＲＮＡ
を４ｆｆ１／の水に溶解し、上記エタノール沈澱操作を
行なったのち、得られたＲＮＡを１−の水に溶解し、３
．７５■のＲＮＡを得た。

そして、以上の操作を再度繰り返すことにより合計７■
のＲＮＡを調製し、このＲＮＡ中よりｍ−ＲＮＡを選択
するために、７ｆｆ１ｇのＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−
セルロース　にューイングランドバイオラボ社製）カラ
ムクロマトグラムにかけた。

カラムとして２．５　＋ｎｌテルモシリンジ（テルモ・
社・製）を用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液（１０１
ｎ？Ｉトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／１ｍＭＤＥ
ＴＡ１０．１％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム
〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液（１
０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７，６）／　１　ｍＭＥ　
Ｄ　Ｔ　Ａ　／　０．４　Ｍ　ＮａＣ１１０，１％ドデ
シル硫酸ナトリウム〕で平衡化したものである。

７■のＲＮＡに、同量の緩衝液〔１１０１１Ｉトリス−
塩酸（ｐＨ７，６）／　１ｍＭＥ　ＤＴＡｌｏ、　８Ｍ
　ＮａＣｌ１０．１％ドデシル硫酸ナトリウム〕を添加
し、温度６５°Ｃで１０分間加熱処理し、水中で象、冷
し、オリゴ（ｄ　Ｔ　）−セルロースカラムにかけたの
ち、結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及
びｔ−ＲＮＡを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−
ＲＮＡを溶出し、４０％ｇのｍ−ＲＮＡを得た。

２、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮 次に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりルシフェラーゼ
ｍ−ＲＮＡを濃縮した。

１０〜２５％（Ｗ／Ｖ）のショ糖密度勾配は、ベンクマ
ン社製のローターＳ　Ｗ４１用ポリアロマチューブに４
０％（臀／Ｖ）　　ショ糖液（５０ｍＭ　トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）／２０ｍＭ　ＮａＣｌ　／　１　
ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ／４０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖）０．５
ｍを入れ、その上に２．４　ｗｌずつ２５％（Ｗ／Ｖ）
、２０％（Ｗ／Ｖ）、１５％（Ｗ／Ｖ）及び１０％（Ｗ
／Ｖ）　（７）ショ糖液を重層し、温度４°Ｃで２４時
間放置することにより作製した。このシー！稠密度勾配
に、ｍ−ＲＮＡ３０μｇを重層し、ヘックマン・社・製
の５Ｗ４Ｈ：ｌ−ターを用い、常法により３０．００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、、温度１８°Ｃで１８時間遠心分離を行な
った。遠心分離操作ののち、０．５ｄずつ分画し、エタ
ノール沈澱法によりｍ−ＲＮＡを回収し、１０μ２の水
に溶解した。

次に、ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、ルシフェラーゼのｍ−ＲＮＡが濃縮されてい
る両分の同定を行なった。分画したＲＮＡＩμｌ、ウサ
ギ網状赤血球ライセード（アマジャム社製）９μ２及び
（３５３）メチオニン１μ！（アマジャム社製）を混合
し、温度３０゛Ｃで３０分間反応させたものに、１５０
μｌのＮＥＴ！１衝液（１５０ｍＭ、　ＮａＣｌ／　５
　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　１０．０２％（Ｗ／Ｖ）Ｎａ
Ｎ　３　／　２０ＴＩＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，４）１０．０５％（−／ν）ノニデットＰ−４０（ベ
セスダリサーチラボラトリー社製、界面活性剤））を添
加し、更に、ｌμｆの抗ルシフェラーゼ血清（後述のよ
うにして調製したもの。）を添加し、温度４°Ｃで１８
時間放置したものに、１０ｍｇのプロティンＡセファロ
ース（ファルマシア社製）を添加し、温度２０°Ｃで３
０分間放置したものを、常法により１２．０００ｒ、ｐ
、＋＋＋、で１分間遠心分離処理し、樹脂を回収した。

回収した樹脂を、２００μ２のＮＥＴ緩衝液で３回洗浄
し、この樹脂に、４０ｕ１．の５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サン
プル緩衝液（６２，５ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　
Ｈ６，８）　／　１０％（Ｖ／Ｖ）グリセｏ−／ｌ／／
２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム１５％（Ｖ／Ｖ
）メルカプトエタノール１０．０２％（Ｗ／Ｖ）ブロム
フェノールブルー〕を添加し、温度ｔｏｏ’ｃで３分間
煮沸し、常法により１２，０００ｒ、ｐ、ｍ、で１分間
遠心分離処理し、上清を回収し、全量を７．５％（Ｗ／
Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲルに乗せた。

ゲル電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法〔
「ネーチュアーＪ　（Ｎａｔｕｒｅ）、第２２７頁、第
６８０頁（１，９７０）　）で行ない、泳動したのちの
ゲルは、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋
白質を固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍ
サリチル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して
乾燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フィルム社製、
ＲＸ）を用いてフルオログラフィーを行なった。

以上の操作により、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの存在す
る画分のＲＮＡを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ蛋
白質のハンドがＸ線フィルム上に認められ、ルシフェラ
ーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されている両分が同定できた。

３、抗ルシフェラーゼ血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラーゼ
血清は、以下の方法により調製した。

３．２ｍｇ／ｍ濃度のルシフェラーゼ溶液〔シグマ社製
ルシフェラーゼを０．５Ｍグリシルグリシン溶液（ｐＨ
７，８）に溶解したもの）０．７ｍ／を、等量のフレン
ド（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジユバントで懸濁したちの２
．２４ｍｇを、抗原として体重２　ｋｇの日本内色種ウ
サギの指掌部に投与し、飼育２週間経過したのち、初回
と同量の抗原を背部皮肉へ投与し、更に、飼育１週間経
過したのち、同様の操作を行ない、ま更に、飼育１週間
後全採血を行なった。

そして、得られた血液を、温度４°Ｃで１８時間放置し
たものを、常法により３．０００ｒ、ｐ、ａ＋、で１５
分間遠心分離し、上清として抗ルシフェラーゼ血清を得
た。

４、ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−ＤＮＡの合成は、アマジャム・社・製キットを用い
て行なったものである。

上述の如くして得られたｍ−ＲＮＡ２μｇを用いてアマ
ジャム社の指示する「モル・セル・ハイオルＪ（Ｍｏ１
．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（１９
８２）及び［ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２
６３頁（１９８３）記載の方法に従い行なった結果、３
００ｎｇの２本積ｃ−ＤＮＡが得られた。

このｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａ１５０ｎｇを、７μ２のＴＥ緩衝
液［１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／　１
ｍＭＥ　Ｄ　ＴＡ〕に溶解したものに、１１μ尼の混液
［２８Ｏｎ＋Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐ　Ｈ６，８）
／　６０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）　
／　２　ｍＭ塩化コバルト］及び３．８１ｔ　（２のテ
ィリング混液（１０ｍＭジチオスレイトール７、５　ｕ
　ＩＩ　／　Ｌｏｎｇ　／　ｃｄポリ　（ｐｏｌｙ）　
　Ａ　１　ｕ　Ｅ　／　５　ｍＭｄｃＴＰ２ｕｌ／水１
１０ｕＥ）を夫水添１０ｕＥに、２９ユニツトのターミ
ナルトランスフェラーゼ（ヘーリンガーマンハイム社製
）を添加し、温度３０°Ｃで１０分間反応させたのち、
２．４μｌの０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ及び２．４μ℃の１
０％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウムを夫々添加
して反応を停止させた　。

反応停止液に２５μｌの水飽和フェノールを用いて除蛋
白処理を行なったのち、回収した水層に、２５μでの４
Ｍ酢酸アンモニウム及びｌＯＯμ尼の冷エタノールを夫
々添加し、温度−７０°Ｃで１５分間放置し、１２．０
ＯＯｒ、　ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離してｃ−ＤＮＡ
を回収し、１０μ２のＴＥ緩衝液に溶解し、Ｃ−ＤＮＡ
溶解液を得た。

以上の如くしてデオキシシチジンのテイルの付いたｃ　
−Ｄ　Ｎ　Ａ　１１００ｎを得た。

５、ベクターに使用する組み換え体プラスミドｐＭ　Ｃ
ＥＩＯＤ　Ｎ　Ａの調製 大腸菌Ｗ３１１０株（Ａ　Ｔ　ＣＣ２７３２５）、プラ
スミドｐＢ　Ｒ３２５（Ｂ　ＲＬ社製）及びプラスミド
ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（宝酒造社製）を用いてティー・マ
スダ等（Ｔ、Ｍａｓｕｄａ　ｅｔ、ａ！、）　　’アグ
リ力ルチュラ／Ｌ／−バイオロジカル・ケミストリーＪ
　　（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、第５０巻、第２７１〜２７
９頁（１９８６）記載の方法により作製したプラスミド
ｐＫＮ３０５　ＤＮＡ並びにプラスミドｐＭ　Ｃ１４０
３−３ＤＮＡ　（特開昭６１−２７４６８３号公報記載
）夫々ｌμｇを、１０μ！の混液（５０１１１Ｍ　）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）　／　１０ｍＭ　Ｍｇ
ＣＩｚ／　１００ｍＭ　ＮａＣｌ　／　１　ｍＭジチオ
スレイトール〕に添加し、更に、これに、Ｈｉｎｄ■及
び５ａｌｔ（いずれも宝酒造社製）を夫々２ユニツトず
つ添加し、温度３７°Ｃで１時間反応させて切断処理し
、常法によるフェノール抽出及びエタノール沈澱処理を
行ない沈澱物を得た。この沈澱物を、１０ｕｌのライゲ
ーション緩衝液（２０１ＲＭ　ＭｇＣＩｚ／６６ｍＭ１
−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／　１　ｍＭＡ　Ｔ
　Ｐ／１５ｍＦＸジチオスレイトール〕に溶解し、溶液
を得、更に、■ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社製）を添加し、温度２０゛Ｃで４時間連結反応を行
なった。次いで、この反応液を用い、［ジェイ・バクテ
リオロジー」（Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１１
９巻、第１０７２頁〜第１０７４頁（１９７４年）］記
載の形質転換法により、大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（Ａ　
Ｔ　ＣＣ３３８７６）株を形質転換し、薬剤耐性（アン
ピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性）及びβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その株
の含有する組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＭｃＥｌｏ
と命名した。この組み換え体プラスミドｐＭｃＥ１０Ｄ
ＮＡを含有する大腸菌ＪＭＩＯＩ株を、トリプトン１％
（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキ、２．０．５％（Ｗ／Ｖ）　、
及びＮａＣｌ０．５％艶ハ）からなる培地ｌｊ２に、該
培地を用い温度３７°Ｃで１６〜２４時間前培養して得
た大腸菌ＪＭ１０１　（ｐＭｃＥｌｏ）の培養液２０Ｉ
！１／を接種し、温度３７°Ｃで３時間振盪培養したの
ち、０．２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更に同
一温度で２０時時間項養を行ない、培養液を得た。

次いで、この培養液を、常法により６．０ＯＯｒ、ｐ、
ｍ。

で１０分間遠心分離して湿潤菌体２ｇを得、これを２０
−の２５％（讐／Ｖ）　ショ糖を含有する３５０ｍＭ　
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更
に、これに、リゾチーム１０＋ｎｇ、　０．２５Ｍ　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ溶液（ｐＨ８，０）　８　＋ｎ／及び２０
％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ｍｌを
夫々添加し、温度６０“Ｃで３０分間保温して溶菌し、
溶菌液を得た。

この溶菌液に、５？ＩＮａＣ］溶液１３ｍ／を添加し、
温度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５．
００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得
、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱処
理を行ない沈澱物を得た。

次いで、この沈澱物を、通常の減圧乾燥処理したものを
、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝
液６　ｍ／　（ｐ　Ｈ７，５）に溶解し、更に、これに
、塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド溶液（１
０ｍｇ／ｍ／）　０．２　ｍｌを添加したものを、常法
により３９．０ＯＯｒ、ｐｌｍ、で４２時間超遠心分離
機を用いて平衡宙度勾配遠心分離処理を行ない、組み換
え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡを単離し、また更に
、ｎブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去
したのち、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１（１ｍＭ　ｌ−
リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）に対して透析を行な
い純化された組み換え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡ
５００μｇを得た。

６、ベクターＤＮＡの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミドｐＭｃＥ
１０ＤＮＡ１５μｇを、９０μｐの項目４記載のＴＥ緩
衝液に溶解し３１０μｌのＭｅｄ緩衝液〔１００ｍＭ）
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／１００ｍＭ　ＭｇＣ
Ｉｚ　／１０ＴＩＩＭジチオスレイトール１５００ｍＭ
　ＮａＣ１）を添加したのち３０ユニツトの制限酵素Ａ
ｃｃｌ（全酒造社製）を更に加え、温度３７°Ｃで１時
間切断処理を行ない切断処理物を得た。この切断処理物
に、１００μ２の水飽和フェノールを加え除蛋白操作を
行なったのち、水層を回収し、これに、Ｉ／１０ｆの３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，５）及び２倍量の冷エタノ
ールを加え、温度−７０°Ｃで１５分間放置したのち、
１２．００゜ｒ、ｐ　、ｍ、で１０分間遠心分離し、Ｄ
ＮＡを回収した。

このＤＮＡを、１０μｉのＴＥＩＩ衝液に溶かし、１５
μ！の混液（２８０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６
、８）　／　６０ａＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ６
，８）　／　２　ｍＭ塩化コバルト〕を加えたのち、更
に、５μ２のティリング混液（項目４記載）（５ｍＭｄ
ＧＴＰを用いた）を加え、また更に、５ユニツトのター
ミナルトランスフェラーゼ（全酒造社製）を添加し、温
度３７°Ｃで１５分間反応させた。項目４記載のｃ−Ｄ
ＮＡティリング反応と同様の後処理を行なうことにより
組み換え体プラスミドｐＭ　ＣＥＩＯＤ　Ｎ　ＡのＡｃ
ｃＩサイトにデオキシグアノシンのテイルが付いたＤＮ
Ａを調製した。

一方、プラスミドｐＬＪｃ１９ＤＮＡのＰｓＬＩサイト
にデオキシグアノシンのティルが付いたＤＮＡの調製も
同時に行なった。

７’ラスミｌ’　ｐＵｃ１９ＤＮＡ　（全酒造社製）３
０ｕｇを、３５０μｅのＴＥ緩衝液に溶解したものに、
４０μＰのＭｅｄ緩衝液及び制限酵素Ｐｓｔｌ　　（全
酒造社製）１２０ユニントを夫々添加し、温度３７゛ｃ
で１時間切断処理したのち、常法によりフェノールによ
る除蛋白処理及びエタノール沈澱処理によりＤＮＡを回
収した。

得られたＤＮＡを、３５μ２のＴＥ緩衝液に溶解したも
のに、５０μｌの混液（２８０ｍＭカコジル酸ナトリウ
ム（ｐＨ６，８）／６抛門トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ６
，８）／１ｍＭ塩化コバルト〕、１９ａ１２の項目４記
載のティリング混液（ｄＧＴＰ含有）並びに６０ユニン
トのターミナルトランスフェラーゼ（全酒造社製）を夫
々添加し、温度３７°Ｃで１０分間反応させたのち、常
法によりフェノール処理及びエタノール沈澱を行なうこ
とによりＤＮＡを回収した。

７．７二−リングルび形質転換 合成したｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ１５ｎｇ及び上記の方法で得た
二種のベクターＤＮＡ　２００ｎｇを、３５μｌのアニ
ル緩衝液（１０ｍｔｆ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７
，５）　／　１００ｍＭＮａＣｌ　／１ｍＭＥＤＴＡ：
ｌに溶解し、温度６５゛ｃで２分間、温度４６°Ｃで２
時間、温度３７゛Ｃで１時間及び温度２０°Ｃで１８時
間放置する操作によりｃ−ＤＮＡとベクターＤＮＡをア
ニールした。

アニールしたＤＮＡを用いて、ハナハン（Ｈａｎａｈａ
ｎ）の方法〔ディーエヌエイ　クローニング（ＤＮＡ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１Ｏ９〜１３５頁（１９
８５）　）により大腸菌ＤＨＩ株　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３
８４９）を形質転換し、プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡ及
び組み換え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡをベクター
としたｃ　−ＤＮＡバンクを夫々作製した。

８、ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索 組み換え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡのＡｅｃ１部
位は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする
部位にあるので、この部位に組み込まれたｃ−ＤＮＡは
β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を作る。また組み
換え体プラスミドｐＭＣＥＩＯのβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子のプロモータ−は前述した様に大腸菌トリプトフ
ァン遺伝子のプロモーターに変換しである。

組み換え体プラスミドρＭＣＥＩＯＤＮＡを、ベクター
とするｃ　　ＤＮＡバンクのコロニー９６個をｌ　Ｑ　
ｍｌのＭ９カザミノ酸培地〔「モレキュラー・クローニ
ングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、
第４４０〜４４１貞、「コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−Ｊ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）　）に
チアミン（１０μｇ／ｍ）を加えた培地を用い温度３７
゛Ｃで１０時間振盪培養し、常法により集菌したのぢ、
２００μ２の項目２記載の５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル
緩衝液に懸濁し、温度１００″Ｃで５分間蒸沸した。

この懸濁液４０ＩＣを、７．５％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリ
ルアミドゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった
。泳動終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウェスタンプ
ロット法（［アナル・ハイオケム」（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｍ、）、第１１２巻、第１９５　ｇ（１９８１）３
にヨリニトロセルロースのフィルターに転写し、このニ
トロセルロースフィルターをイミューンブロントアソセ
イキット　（バイオランド社製）を用いて抗ルシフェラ
ーゼ血清で染色した。方法は、バイオランド社の操作法
に従った。

即チニトロセルロースのフィルターヲ、１００ｍ１のブ
コノキング溶液［ＴＢＳｌ！衝液［２０ｍＭ　）リス−
塩酸緩衝液１５００ｍＭ　ｔＪａｃｌ（ｐＨ７，５））
に３％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンを溶かした溶液］中温度２
５′Ｃで、３０分間振盪した。次に、このニトロセルロ
ースフィルターを２５ｍ１の一次抗体溶液〔ルシフェラ
ーゼ抗血清を１％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンをＴＢＳ緩衝液
に溶かした溶液で２５倍（Ｖ／Ｖ）に希釈した溶液］に
移し、温度２５°Ｃで９０分間振盪したものを、１００
ｒｎｌのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　　２０洗液（ＴＢＳ
ＩＩ衝液に０．０５％（Ｗ／Ｖ）のツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）　　２０を）容かした？容液〕中に移し、温度２５
°Ｃで１０分間振盪する操作を２回行なった。次いで、
このようにして得たニトロセルロースフィルターを６０
ｒｎｌの二次抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで
標識した抗ウサギ抗体（バイオランド社製）を１％（Ｗ
／Ｖ）のゼラチンをＴＢＳ１１衝液に溶かした溶液で３
０００倍（Ｖ／Ｖ）に希釈した溶液〕中に移し、温度２
５°Ｃで６０分間振盪したのち、１００−のツイーン（
Ｔｗｅｅｎ）　−２０洗液でニトロセルロースフィルタ
ーを洗う上記操作を２回繰り返し、このようにして得た
ニトロセルロースフィルターを、１２０ｍ１の発色液［
６０１１１ｇの４−クロロ−１−ナフトールを２０ｄの
冷メタノールに溶解した溶液及び６０μ２０３０％（Ｖ
／Ｖ）過酸化水素水を１００−のＴＢＳ緩衝液に添加し
た溶液を混合した溶液〕中に移し、温度２５°Ｃで１０
分間発色させた。

この様にして９６個のコロニーを１グループとして４グ
ループについて同様の方法を行なったところ、２つのグ
ループでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが
認められた。次に、この２つのグループに属する９６個
のコロニーを１２個のコロニーずつ８グループに分は同
様の操作を行なったところ夫々１グループに抗ルシフェ
ラーゼ血清と反応する蛋白質が認められた。最後に、こ
のグループに含まれる１２個のコロニーを、１個のコロ
ニーずつ同様の操作を行ないルシフェラーゼ抗血清と反
応する蛋白質を作るコロニーを同定した。以上の操作に
よりルシフェラーゼｃ−ＤＮＡをもつ２個のコロニーが
得られた。この２個のコロニーより項目５記載の方法で
プラスミドＤＮＡを調製した。得られた組み換え体プラ
スミドＤＮＡは、ｐＡＬｆ２Ｂ８及びｐＡＬｆ　３Ａ６
と夫々命名した。

９、大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−ＤＮＡの
プローブの作製 組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３Ａ６ＤＮＡ１００μｇ
を、３３０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、これに４０μｆ
のＬｏｗ緩衝液（１００ｎ＋Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）／１００ｍＭ　ＭｇＣＩｚ　／１０ｍＭジ
チオスレイトールＬ１３０ユニットのＰｓｔｌ　　（宝
酒造社製）及び１２０ユニツトの５ａｃｌ（ヘーリンガ
ーマンハイム社製）を添加し、温度３７゛Ｃで１．５時
間切断した。

このＤＮＡ全量を０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルを
用いた電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は
ティー・マニアテス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法
（「モレキュラー・クローニング」（１１ｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、第１５６〜１６１頁、［コール
ド・スプリング・バーバー・ラボラトリ−Ｊ　（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ１１ａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）（１９８４）　）に従って行なった。

ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを含むＤＮＡバンドを切り出
し、透析チューブに入れ、２ｍｌのＴＥ緩衝液を加えた
のち、透析チューブをシールし、電気泳動により、ゲル
中より緩衝液中にＤＮＡを溶出した。この溶液に等容量
の水飽和フェノールを加え、撹拌したのち、水層を回収
し、常法に従いエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した
。

得られたＤＮＡフラグメン目０μｇを、１２６μ尼のＴ
Ｅ緩衝液に溶かし、１６μのＭｅｄｌｉ衝液及び６４ユ
ニツトの５ａｕ３Ａｒ（宝酒造社製）を加え、温度３７
°Ｃで２時間反応させたのち、全量を５％開開口リポリ
アクリルアミドゲル用いた電気泳動により、ＤＮＡ断片
の分離を行なった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は
、エイ・マクサム（Ａ、ＭａｘａＩｌｌ）の方法〔［メ
ンズ・イン・エンザイモロジー」（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６５巻、第５０６　頁（
１９８０））に従って行なった。１９０ｂｐのＤＮＡフ
ラグメントを前述と同様の方法で単離し、１μｇの５ａ
ｕ３ＡＩルシフェラーゼｃ−ＤＮＡフラグメントが得ら
れた。

この１μｇのルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを、（α−”Ｐ
）ｄＣＴＰ　　（アマジャム社製）を用いてニックトラ
ンスレーション法により標識した。

−’−７クトランスレーシヨンは宝酒造社製のキットを
用い、宝酒造社の指示する［ジェイ・モル・パイオルＪ
　（Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、）　、第１１３巻、第２３
７〜２５１頁（１９７７）及び「モレキュラー・クロー
ニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、
第１０９〜１１２頁、「コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−」（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）記載の方法
に従って行なった。

１０、大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−コロニ
ーハイブリダイゼーション 前述の方法で調製した３ＺＰで標識したルシフェラーゼ
ｃ−ＤＮＡ断片を、プローブとして用い、組み換え体プ
ラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡをベクターとするフォテイナ
ス・ピラリス連部ｃ−ＤＮＡバンクを、コロニーハイブ
リダイゼーション法（［蛋白質・核酸・酵素」、第２６
巻、第５７５〜５７９頁（１９８１）で検索し、ルシフ
ェラーゼｃ−ＤＮＡを有するコロニーを得た。そのうち
の１個のコロニーの有する組み換え体プラスミドＤＮＡ
をｐＡＬｒ　３と命名し、項目５記載の方法でプラスミ
ドＤＮＡを調製した。該組み換え体プラスミドＤＮＡを
含有する大腸菌を大腸菌Ｄ　Ｈ１（ｐＡ　Ｌｆ　３）と
命名した。なお、該形質転換株はＡ　Ｔ　ＣＣ６７４６
２として寄託されている。

そして、上記組み換え体プラスミドｐＡＬｆ　３ＤＮＡ
を、Ｘｂａ［、Ｈ４ｎｄ　ｍ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ
及びＰｓｔｌ　　（いずれも宝酒造社製）を用い、単−
消化及び２重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動法により移動度パターンを分析し、得られ
た移動度パターンとλＤＮＡ　（宝酒造社製）をＨｉｎ
ｄｌｌＩにより消化して得られたＤＮＡ断片の積率移動
度パターンと対比することにより得られた分子量は、１
　、７００ｂｐであり、上記プラスミドの制限酵素地図
は、第１図に示すとおりであった。

１１、ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ　Ｃｒｕ
ｃｉａｔａ）のｍ−ＲＮＡの調製 生きたルシオラ・クルシアタ　（ゲンジボタル・株式会
社・西武百貨店より購入）１０ｇを超低温冷凍庫に入れ
、凍結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾
部２ｇに、１８−のグアニジンイソチオシアネート溶液
を添加し、項目１記載の方法に従って１．１■のＲＮＡ
を調製した。このＲＮＡ　１．１■を項目１記載の方法
に従ってオリゴ（ｄ　Ｔ　）セルロースのカラムクロマ
トグラフィーを行ない３０ｇｇのルシオラ・クルシアタ
圧部ｍ−ＲＮＡを調製した。

１２、ルシオラ・クルシアタ圧部ｃ−ＤＮＡバンクの作
製 ｃ−ＤＮＡの合成はアマジャム社より購入したキットを
用い、アマジャム社の指示する「モル・セ）Ｌｙ−パイ
オル」（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第
１６１頁（１９８２）及び「ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、
第２５巻、第２６３頁（１９８３）記載の方法に従って
合成した。

２μｇのルシオラ・クルシアタ圧部ＲＮＡより０．９ｌ
ｇの二本１ｉ　ｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａが合成された。このｃ
−ＤＮＡ０．３μｇに項目４記載の方法を用いてポリデ
オキシシチジンのテイルを付加した。

このｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａ２０ｎｇ及び項目６で調製したポ
リグアノシンのテイルをそのＰｓｔＩ部位に付加したｐ
ｔ、Ｊｃ１９プラスミドＤ　Ｎ　Ａ５００ｎｇを、項目
７記載の方法でアニールし、ハナハン（ｔ（ａｎａｈａ
ｎ）の方法〔「ディエヌエイ・クローニングＪ　（ＤＮ
Ａ　ＣＩｏｎ−ｉｎｇ）、第１巻、第１Ｏ９〜１３５頁
（１９８５）　）に従ってアニールしたＤＮＡにより大
腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８４９）を形質転換しルシ
オラ・クルシアタ足部ｃ−ＤＮＡバンクを作製した。

１３、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−
ＤＮＡの検索 項目１０で得られた組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３Ｄ
ＮＡ１０μｇを、９０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、１０
μ２のＭｅｄ緩衝液、２５ユニ７トの制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及び２５ユニツトの制限酵素のＣ１ａＩ（いずれも宝
酒造社製）を添加し、温度３７°Ｃで２時間反応を行な
いＤＮＡを切断した。切断した組み換え体プラスミドｐ
ＡＬｆ　３ＤＮＡよりフオテナス・ビラリス　（アメリ
カホタル）由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ部分を含む
８００ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａｌＤＮＡフラグメント
を、項目９記載のアガロースゲル電気泳動法を用いる方
法に従って単離し、ｌμｇのＥｃｏＲＩ　／　Ｃｌａ　
Ｉ　ＤＮＡフラグメントを得た。この１．ｕｇのＤＮＡ
を、（α−”Ｐ）ｄＣＴＰ三燐酸（アマジャム社製）を
用いて項目９記載の二ックトランスレーシゴン法により
３ｔｐで標識した。２Ｐで標識した足並Ｒ１／旦圏ｌＤ
ＮＡフラグメントをプローブとして、ルシオラ・クルシ
アタ足部ｃ−ＤＮＡバンクを項目１０記載のコロニーハ
イブリダイゼーション法で検索することによりルシオラ
・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを有する
大腸菌を選択した。プローブとハイブリダイズする大腸
菌コロニーを数個得た。

この中の１コロニーの有する組み換え体プラスミドＤＮ
ＡをｐＧＬｆ　　１と命名し、項目５記載の方法に従い
組み換え体プラスミドＤＮＡを単離した。

該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸
菌ＤＨＩ（ｐＧＬｆ　　ｌ）と命名した。なお、該形質
転換株はＡ　Ｔ　ＣＣ６７４８２として寄託されている
。

組み換え体プラスミドｐＧＬｆｌＤＮＡを且胆ｌ且ｉｎ
ｄ　ｍ、ＥｃｏＲＶ、旦ｒａｇ、へｆｌｌＴ、且＋ｎｃ
ＬＰｓｔ（（いずれも宝酒造社製）及旦柱１　　にュー
イングランドバイオラボ・社・製）を用い、単−消化及
び二重消化して得られたＤＮＡＭ片をアガロースゲル電
気泳動法により、移動度パターンを分析し、得られた移
動度パターンとλフアージＤＮＡ（宝酒造社製）をＨｉ
ｎｄＩＩＩにより消化して得られたＤＮＡ＃ｆｒ片の標
準移動度パターンとを対比することにより得られた分子
量は、２．０００ｂρであり、上記プラスミドの制限酵
素地図は、第２図に示す通りである。

１４、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−
ＤＮＡの塩基配列の解析 組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　　ＩＤＮＡｌ０μｇを
制限酵素Ｐｓ口　（宝酒造社製）で切断し、ルシフェラ
ーゼｃ−ＤＮＡを含む２．０ＫｂＤＮＡ断片を２．５μ
ｇを得、このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＬＩｃ１１９
ＤＮＡ　（宝酒造社製）のＰｓ口部位にクローニングし
、ｃ−ＤＮＡの挿入方向の違いにより得られたプラスミ
ドＤＮＡを夫々ｐＣ，Ｌｆ２及びｐＧＬｆ３と命名した
。組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　ｌＤＮＡ及びプラス
ミドｐＵｃ１１．９ＤＮＡの１ｓｔｌによる切断処理（
項目６記載の方法）、ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ断片の
アガロースゲル電気泳動法を用いた単離（項目９記載の
方法）、プラスミドｐＵｃ１１９　ＤＮＡ及びルシフェ
ラーゼｃ−ＤＮＡ断片の連結反応（項目５記載の方法）
、連結反応液を用いた大腸菌ＪＭＩＯＩ株（ＡＴＣＣ３
３８７６）の形質転換（項目５記載の方法）、並びに組
み換え体プラスミドｐＣ，Ｌｆ２及びｐＧＬｆ３ＤＮＡ
の調製（項目５記載の方法）は、カンコ内記載の方法に
従った。

次いで、組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　２及びｐＧＬ
ｆ　３ＤＮＡを用いてキロシーフェンス用欠失キット　
（宝酒造社製）を用い、ヘニコフ　（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ
）の方法〔「ジーン」（Ｇｅｎｅ）、第２８巻、第３５
１〜３５９　（１９８４））に従いルシフェラーゼｃ−
ＤＮＡに種々の欠失が導入されたプラスミドＤＮＡを作
裂し、項目５記載の方法で大腸菌ＪＭＩＯＩ株（Ａ　Ｔ
　ＣＣ３３８７６）に導入した。このようにして得られ
た大腸菌にペルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造社製
）を感染させることによりメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ
）の方法〔「メンズ・イン・エンザイモロジーＪ　（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｉｏｇｙ）　、第１
０１巻、第２０〜７８頁（＋９８３）　Ｅに従ってｉ、
を鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖ＤＮＡによるシ
ーフェンシングは、Ｍ１３シークエンシングキット　（
宝酒造社製）を用いて上記メノシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ
）の方法に従いｉテなった。塩基配列の解析のためのゲ
ル電気泳動は８％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミドゲル（
富士写真フィルム社製）を用いて行なった。

得られたルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ
−ＤＮＡのみの全塩基配列を第３図に、また、３１　ｃ
　−Ｄ　Ｎ　Ａから翻訳されるポリペプチドのアミノ酸
配列を第４図に夫々示した。

１５、　Ｍｉみ換え体プラスミドｐＧＬｆ　３７ＤＮＡ
（７）構築 先ず、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする塩基配列
を欠失し、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
遺伝子及びベクターＤＮＡを含有するＤＮＡ断片の調製
について述べる。組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　ＩＤ
ＮＡｌμｇを、９０μ尼の水に熔解したものに、１０μ
ｌのＭｅｄ緩衝液及び２０ユニツトのｌＩＩ　（宝酒造
社製）を添加し、温度３７°Ｃで２時間消化し、これに
、等量の水飽和フェノールを添加し、常法による除蛋白
処理及びエタノール沈澱処理を行ったのち、項目５に記
載の方法にてライゲーション及び大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１
　（Ａ　ＴＣＣ３３８７６）へ形質転換を行った。

得られた形質転換体から項目５に記載の方法によりＤＮ
Ａを単離し、ヱ且Ｉ、且臼ＲＶ及びｌＩＩ等の制限酵素
で単一又は二重消化することにより、もとの組み換え体
プラスミドｐＧＬｆｌに対してｃ−ＤＮＡの向きが逆向
きになっている組み換え体プラスミドを選択し、ρＧＬ
ｆｌＯと命名した。

１０μｇの組み換え体プラスミドｐＧＬｆｌＯＤＮＡを
、９０μｌの水にン容解したものに、ＩＯμｉのＭｅｄ
ｉｌ衝液及び１０ユニントのｌＩＩにューイングランド
バイオラポ社製）を添加し、温度３７°Ｃで３０分処理
し、部分分解物を得、この部分分解物より項目９記載の
方法により、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする塩
基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子及びベクターＤ
ＮＡの大部分を含有する４、ＯＫｂのＤＮＡ断片２μｇ
を単離した。

次に、このＤＮＡ断片ｌμｇを９５μｌの水に溶解した
ものに、５μ尼のＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
及び０．３ユニツト　（１μｌ）のアルカリフォスファ
ターゼ（宝酒造社製）を添加し、温度６５°Ｃで１時間
処理し、常法による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理
したのち、両端を脱リン酸した４、ＯＫｂのＤＮＡ断片
をｌμｇ得た。

次に、大腸菌由来のトリゾ（ｔｒｐ）プロモーターを含
有するＤＮＡ断片の調製法について述べる。

トリゾプロモーターを含有するプラスミドｐＫＮ２０６
　ＤＮＡ　（ｒアブリフ・パイオル・ケム」（Ａｇｒｉ
ｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第５０Ｓ、第２７１〜２
７９頁）（１９８６年）記載のもの〕１０μｇを、９０
μ２の水に溶解し、１０μｉのＭｅｄｌｌ衝液及び２０
ユニ７）のＣ１ａｆ（宝酒造社製）を添加し、温度３７
°Ｃで２時間処理し、完全分解物を得、これに前述の５
ｓｐｌＩＯユニツトを添加し、温度３７°Ｃで３０分間
処理し、５ｓｐｌによる部分分解物を得、常法による除
蛋白処理及びエタノール沈澱処理したのち、得られた沈
澱を１００μ！のＴＥ緩衝液に溶解し、項目９記載の方
法により、トリゾプロモーターの大部分を含有する５０
０ｂのＤＮＡ断片を単離した。

次に合成りＮＡの調製について述べる。

上記４．ＯＫｂのＤＮＡ断片に含まれるルシフェラーゼ
遺伝子は、塩基配列より推定したところＮ末端より９個
のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失している。

また、上記５００ｂのＤＮＡ断片に含まれるトリゾプロ
モーターは、ＳＤとＡＴＧ間の塩基配列の一部を欠失し
ている。そこで、ルシフェラーゼのＮ末端より９個のア
ミノ酸をコードする塩基配列及びトリゾブロモーターの
５Ｄ−ＡＴＧ間の塩基配列を補うために、以下の２種の
合成りＮＡをへノブマン社製のシステム１プラスＤＮＡ
合成機を用いて合成した。

５’　　ＣＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡ
ＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＴ　　３’５’　　ＡＴＴＴＴＣ
ＡＴＣＧＴＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴ　
　３’これらの２種の合成りＮＡをデュポン社製のネン
ソルブ・ブレブ（ＮＥＮＳＯ１ｉ’Ｂ　ＰＲＥＰ）を用
いることにより、２０ｕｇの積装された合成りＮＡを夫
々得た。

これら２種の合成りＮＡ１Ｍｇを夫々４５μｌの水ニ？
容解し、５μ尼のＸＩＯカイネーション緩衝ン夜（０，
５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）１０．１Ｍ　？Ｉ
ｇＣＩ□５０ｍＭジチオスレイトール／　１０＋ｎＭＡ
　Ｔ　Ｐ　’３　を添加し、史に、１０ユニント　（１
μＰ、）のＴ４ボリヌクレオヂド力イネース（全酒造社
製）を添加したのち温度３７°Ｃで１時間処理し、常法
による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理を行い、５′
末端をリン酸化した合成りＮＡをそれぞれ１Ｍｇずつ得
た。

次に、ライゲーション反応により目的のプラスミドＤＮ
Ａの取得を行った。

上記の脱リン酸化したＮ末端より９個のアミノ酸をコー
ドする塩基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子、ベク
ターＤＮＡを含む４．ＯＫｂのＤＮＡ断片ｌμｇ、上記
のトリブプロモーターを含む５００ｂのＤＮＡ断片１Ｍ
ｇ及び上記２種のリン酸化した合成りＮＡｏ、１Ｍｇを
夫々８７／　ｌの水に溶解した。これに１μｌのχ１０
ライゲーション緩衝液（２００ｍＭ　ＭｇＣＩｚ／６６
０ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／１１Ｍ　
Ａ　Ｔ　Ｐ　／　１５０ｍＭジチオスレイトール］及び
１ユニツトのＴ４ＤＮＡライゲース（全酒造社製）（１
μＰ）を添加し、温度１６°Ｃにて１６時間反応を行っ
た。得られた反応液を用いて項目５に記載の方法にて大
腸菌Ｊ　ＭＩＯＨＡ　Ｔ　ＣＣ３３８７６）へ、形質転
換を行い、得られた形質転換体より、項目５に記載の方
法にてプラスミドＤＮＡを単離し、互」口。

１並ＲＶ及びヱ旦■等の制限酵素で単一又は二重消化し
たのち、０，７％アガロースゲル電気泳動にて展開し、
トリププロモーターによりルシフェラーゼ遺伝子を完全
にコードするルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミ
ドを得、該組み換え体プラスミドを、ｐＧＬｆ３７と命
名し、また、該プラスミドを含有する大腸菌を大腸菌Ｊ
　Ｍ　１０１　（ｐＧ　Ｌｒ３７）と命名した。

１６、組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　１５ＤＮＡの構
築 組み換え体プラスミドｐＧＩＪ　ＩＤＮＡ３μｇを、９
０〃２のＴＥ）１衝液に溶解したものに、ＩＯμでのＭ
ｅｄｌｌ衝液及び２５ユニツトの足踵Ｉを添加し、温度
３７゛Ｃで２時間消化したのち、更に、これに等容量の
水飽和フェノールを添加し、常法に従い除蛋白操作を行
なった。消化した組み換え体プラスミドｐｃｉＪＩＤＮ
Ａよりルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−
ＤＮＡをコードする１、７Ｋｂ　ＤＮＡフラグメントを
項目９記載のアガロースゲル電気泳動を用いる方法を利
用して単離し、１Ｍｇの１．７　Ｋ　ｂ　５」ｕフラグ
メントを得た。

一方、プラスミドｐＵｃ１８ＤＮＡ（全酒造社製）ｌμ
ｇを、１８μｅのＴＥ緩衝液に溶解し、２μＰのＳｍａ
ｌ緩衝液［１００ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）／７０ｍＭ塩化マグネシウム／２００ｍＭ塩化カ
リウム／７０ｍＭ２−メルカプトエタノール７０．１％
ウシ血清アルブミン］及び５ユニツトのＳ＋ｎａｌ（全
酒造社製）を添加し、温度３７°Ｃで１時間消化したの
ち、常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱を行
ない、沈澱物を得た。

０．５μｇのＳｍａｌで消化したプラスミドｐｔＪｃ１
８ＤＮＡ及び０．５μｇの１．７Ｋｂルシオラ・クルシ
アタ由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡフラグメントを、
７μ！の水に溶解し、１３μ尼の混液〔７７ｍＭ）リス
−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）　／　１５ｍ門塩化マグ
ネシウム／１５１ジチオスレイトール１０．１５ｎ＋Ｍ
アデノシン三燐酸〕及び１ユニントのＴ４リガーゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）を添加し、温度８°Ｃで
１８時間連結反応を行った。この反応液を用い、項目７
記載の如くして大腸菌ＪＭＩ旧株（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８
７６）を形質転換し、得られた形質転換株より、項目５
の如くしてプラスミドＤＮＡを単離した。

単離したプラスミドＤＮＡを、ＨｉｎｄｌＩｌ（全酒造
社製）で単一消化し１．５Ｋｂ及び２．９ＫｂのＤＮＡ
断片を生じるプラスミドＤＮＡを選択し、この組み換え
体プラスミドＤＮＡをｐＧＬｆ１５、このプラスミドＤ
ＮＡを有する大腸菌を大腸菌ＪＭＩＯＩ（ｐＧ　Ｌ　ｆ
１５）と命名した。なお、大腸菌ＪＭＩＯＩ（ｐ　Ｇ　
Ｌ　ｆ１５）はＡ　Ｔ　ＣＣ６７４６１トＬテ寄託すレ
テいる。

大腸菌、Ｊ　ＭＩＯＩ　（ｐＧ　Ｌ　ｆ　１５）を項目
５記載の方法で培養し、徂み換え体プラスミドＤＮＡを
単離することによりｌｅの培養液より１．２　ｍｇの純
化された組み換え体ｐＧＬｆ　１５ＤＮＡが得られた。

１７、大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ　（ｐＧ　Ｌｆ　３７）の培
養及び粗酵素液の調製 大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ　（ｐＧ　Ｌｆ　３７）を、Ｌ　Ｂ
−ａｍｐ培地〔バタトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵
母エキス０．５％（Ｗ／ν）、　ＮａＣ１Ｏ，５％（Ｗ
／Ｖ）、　　及びアンピシリン（５０μｇ／ｍ／）　）
　３ｍｌにて温度３７°Ｃで１８時間振盪培養を行なっ
た。この培養液０．５　ｍｌを１０１＋１／の上記しＢ
−ａｍｐ培地に接種し、温度３７°Ｃで４時間振盪培養
したのち、８，０００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間の遠心分
離操作により湿潤菌体２０■を得た。

回収した菌体を、０．１　Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐ　Ｈ７
，８）、２ａ＋ＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール
及び０．２ｍｇ／ｍ！プロタミン硫酸からなる緩衝液０
．９−に懸濁し、更に、これに、１００μ２の１０■／
−のリゾチーム溶液を添加し、水中に１５分間放置した
。次に、この懸濁液を、メタノール・ドライアイス浴中
で凍結し、続いて温度２５°Ｃに放置し、完全に解凍し
た。

更に、１２，０００ｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心分離操作
を行なうことにより上清として粗酵素液１−を得た（本
発明） このようにして得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活
性の測定は、下記記載方法により行ない、その結果を下
表に示した。

得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活性の測定は、ク
リツカ（Ｋｒｉｃｋａ）等の方法〔アチーブス・オブ・
バイオケミストリー・アンド・バイオフィズイクス（Ａ
ｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａ
ｎｄ　Ｂｉ。

ｐｈｙ５１ｃｓ）、第２１７巻、第６７４頁（１９８２
）　）に従って生成するフォトン数を計測することによ
り行なった。

すなわち、２６０μ尼の２５１Ｍグリシルグリシン緩衝
液（ｐＨ７，８）、１６μ！の０．１Ｍ硫酸マグネシウ
ム２４μ！の１ｍ？ルシフェリン（シグマ社製）及び１
０μｅの粗酵素液を混合したのち、１００μ２の２０ｍ
ＭＡＴＰを添加し、発生するフォトン数を２０秒間積算
した値を下表に示した。

なお、比較のため、大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＧ　Ｌ　Ｆ
　１５）（Ａ　Ｔ　ＣＣ６７４６１）を、Ｌ　Ｂ−ａｍ
ｐ培地〔バクトドノブトン１％（−／Ｖ）、酵母エキス
０．５％（誉／Ｖ）。

ＮａＣｌ　Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）、及びアンピシリン（５
０ｕ　ｇ／ｄ）　）３−にて温度３７°Ｃで１８時間振
盪培養を行なった。

この培養液０．５ｄを１０ｍ／の上記Ｌ　Ｂ−ａｍｐ培
地に接種し、更に、これに、１ｍＭのイソプロピル−β
Ｄ−チオガラクトシドを添加し、温度３７°Ｃで４時間
振盪培養したのち、８．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０分間
の遠心分離操作により、湿潤菌体２０ｍｇを得た。

回収した菌体を、Ｏ，ｌ　Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７，
８）、２１１１ＭＥＤＴＡ、１１ジヂオスレイトール及
び０．２■／−プロタミン硫酸からなる緩衝液０．９−
に懸濁し、更に、これに、１００７１ｊ２の１０■／ｍ
ｌのリゾチーム溶液を添加し、水中に１５分間放置した
。次に、この懸濁液を、メタノール・ドライアイス浴中
で凍結し、続いて温度２５°Ｃに放置し、完全に解凍し
た。

更に、１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心分離操作
を行なうことにより上清として粗酵素液１ｍｌを得た（
特願昭６２−１８７７２４号及び特願昭６２−１８７７
２５号）、。

このようにして得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活
性の測定は、前記記載方法により行ない、その結果を下
表に示した。

また、比較のため、プラスミドｐＵｃ１８ＤＮＡを有す
る大腸菌ＪＭＩＯＩ株〔大腸菌ＪＭＩＯＩ　（ｐＵＣ１
８）　）についても同様にルシフェラーゼ活性を測定し
、その結果を下表に示した（対照）。

表 上表より明らかな如く、本発明により得られる培養液の
フォトン数は先願発明及び対照に比し著しく増加してい
るため、本発明に用いた大腸菌菌体中に著量ルシフェラ
ーゼが生産されていることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡの制
限酵素による切断地図を示す図であり、第２図は、組み
換え体プラスミドｐＧＬｆ　　ｌＤＮＡの制限酵素によ
る切断地図を示す図であり、第３図は、本発明に用いる
ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す図であり、第４
図は、本発明に用いるルシフェラーゼ遺伝子から翻訳さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を示す図であり、また
、第５図は、組み換え体プラスミドｐＧＬｆ３７ＤＮＡ
の制限酵素による切断地図を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記に示されるアミノ酸配列をコードするルシフ
   ェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
   ＤＮＡを含み、ルシフェラーゼ生産能を有するエッシェ
   リシア属に属する微生物を、培地に培養し、培養物より
   ルシフェラーゼを採取することを特徴とするルシフェラ
   ーゼの製造法。 【遺伝子配列があります】
2. （２）ルシフェラーゼ遺伝子が下記に示される塩基配列
   で表わされる請求項１記載のルシフェラーゼの製造法。 【遺伝子配列があります。】