JPH0771485B2 - ルシフェラーゼの製造法 - Google Patents

ルシフェラーゼの製造法

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JPH0771485B2
JPH0771485B2 JP21622988A JP21622988A JPH0771485B2 JP H0771485 B2 JPH0771485 B2 JP H0771485B2 JP 21622988 A JP21622988 A JP 21622988A JP 21622988 A JP21622988 A JP 21622988A JP H0771485 B2 JPH0771485 B2 JP H0771485B2
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    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata、
ゲンジボタル）由来のルシフェラーゼの製造法に関す
る。
〔従来の技術〕
ルシオラ（Luciola）属ホタルのルシフェラーゼは、収
集されたルシオラ属ホタルより分離、精製されて得られ
ているに過ぎない〔「プロク・ナトル・アカド・サイ」
（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第74巻、第７号、第2799〜2
802頁（1977）〕。
上記ルシフェラーゼは、例えば、ATPの定量用酵素とし
て極めて有用な酸素である。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかしながら、上記ルシフェラーゼは、昆虫由来である
ため、その製造には、ルシオラ属ホタルを自然界より採
取するか、あるいは、該ホタルを養殖し、得られた該ホ
タルよりルシフェラーゼを分離、精製しなければなら
ず、その製造には、多大な時間と労力を要するものであ
った。
〔課題を解決するための手段〕
そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決するべく種
々検討した結果、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を
有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを
得、この組み換え体DNAをエッシェリシア（Escherichi
a）属に属する微生物に含ませたルシフェラーゼ生産能
を有する微生物を培地に培養することにより、短時間の
うちに効率よくルシフェラーゼが生産されることを知り
特許出願を行なった（特願昭62−187724号及び特願昭62
−187725号明細書） しかし、上述のルシフェラーゼをコードする遺伝子は、
Ｎ末端より９個のアミノ酸に対応する塩基配列を欠失し
ており、また、上記遺伝子は、その欠失部分に大腸菌由
来のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端のアミノ酸配列等が
結合しているため、総酵素活性において充分満足すべき
ものではなかった。
そこで、更に、本発明者等は、上記課題を解消するため
鋭意検討した結果、下記に示されるアミノ酸配列をコー
ドする完全なルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿
入した組み換え体DNAを含み、ルシフェラーゼ生産能を
有するエッシェリシア属に属する微生物を、培地に培養
すれば、先の特許出願の方法に比較して、酵素活性にお
いて約10倍以上のルシフェラーゼが生産されること等の
知見を得、本発明を完成した。
すなわち本発明は、下記に示されるアミノ酸配列をコー
ドするルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入した
組み換え体DNAを含み、ルシフェラーゼ生産能を有する
エッシェリシア属に属する微生物を、培地に培養し、培
養物よりルシフェラーゼを採取することを特徴とするル
シフェラーゼの製造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）のル
シフェラーゼをコードする遺伝子を含有するDNAを検索
する際、プローブとしてホタルの１種であるフォティナ
ス・ピラリス（Photinus Pyaralis）由来のルシフェラ
ーゼをコードする遺伝子を含有するDNAを使用するため
にその調整法について述べる。
ホタルの１種であるフォティナス・ピラリスの尾部より
ｍ−RNAを調製するには、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング」（Molecular Cloning）、第196頁、「コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー」（Cold Spr
ing Harbor Laboratory）（1982）及び「分子遺伝学実
験法」小関治男、志村令郎、第66〜67頁（1983）記載の
方法等により得ることができる。
得られたｍ−RNAよりルシフェラーゼをコードするｍ−R
NAを濃縮するには、例えば、「バイオメディカル・リサ
ーチ」（Biomedical Research）、第３巻、第534〜540
頁（1982）記載の方法により行なうことができる。
なお、この際、ルシフェラーゼに対する抗ルシフェラー
ゼ血清を使用するのであるが、該血清は、例えば、「免
疫化学」、山村雄一、第43〜50頁（1973）記載の方法に
より得ることができる。
ルシフェラーゼをコードするｍ−RNAよりｃ−DNAを合成
するには、例えば、「モル・セル・バイオル」（Mol.Ce
ll Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及び「ジーン」
（Gene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法により
行なうことができる。
次いで、このようにして得られたｃ−DNAをベクターDN
A、例えば、プラスミドpMCE10DNA［プラスミドpKN305
〔「アグル・バイオル・ケム」（Agr.Biol.Chem.）、第
50巻、第271頁（1986）記載の大腸菌トリプトファンオ
ペロンのプロモーター有するプラスミド〕及びプラスミ
ドpMC1843〔「メソズ・イン・エンザイモロジー」（Met
hods in Enzymology）、第100巻、第293〜308頁（198
3）記載の大腸菌β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を有
するプラスミド〕を用いて作製したプラスミド］等に組
み込み、種々の組み換え体プラスミドDNAを得、該DNAを
用いて例えば、大腸菌（E.coli）DH1（ATCC33849）、大
腸菌（E.coli）HB101（ATCC33694）等をハナハン（Hana
han）の方法〔「ディーエヌエイ・クローニング」DNA C
loning）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により形質
転換し、種々の形質転換株を得る。
なお、このようにして得られた形質転換株の有する組み
換え体プラスミドDNAは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ
構造遺伝子の途中にｃ−DNAが組み込まれたプラスミド
であって、ｃ−DNAによりコードされているペプチド
は、β−ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として発現
するものである。
上記の種々な形質転換株よりルシフェラーゼをコードす
るｃ−DNAを検出するには、形質転換を培養することに
より、菌体蛋白質を発現させ、抗ルシフェラーゼ血清と
交差する蛋白質が存在するか否かにより検出することが
でき、例えば、「アグリック・バイオル・ケム」（Agri
c.Biol.Chem.）、第50巻、第271頁（1986）及びアナル
・バイオケム（Anal.Biochem.）、第112巻、第195頁（1
981）記載の方法等により行なうことができる。
次いで、不完全なルシフェラーゼのｃ−DNAを32Pを用い
てニックトランスレーション法〔「モレキュラー・クロ
ーニング」（Molecular Cloning）、第109〜112頁、
「コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー」
（Cold Spring Habor Laboratory）、（1982）及び「ジ
ェイ・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第
237〜251頁（1977）〕により標識したのち、該ｃ−DNA
をプローブとしてコロニーハイブリダイゼイション法
〔「蛋白質、核酸、酵素」、第26巻、第575〜579頁（19
81）〕によりプラスミド、pUC19DNAをベクターとして作
成したｃ−DNAのジーンバンクのライブラリーより1.8Kb
のルシフェラーゼをコードするｃ−DNAを含有するプラ
スミドDNAを得ることができる。
そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
DNAよりフォティナス・ピラリス由来のルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するDNAを得るには、該プラ
スミドDNAに、制限酵素、例えばEcoRI及びClaIを温度30
〜40℃、好ましくは37℃で１〜24時間、好ましくは２時
間作用させて反応終了液を、アガロースゲル電気泳動法
〔「モレキュラー・クローニング」（Molecular Clonin
g）、第150頁、「コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー」（Cold Spring Habor Laboratory）（198
2）記載〕によりフォティナス・ピラリス由来のルシフ
ェラーゼをコードする遺伝子を含有するDNAを得ること
ができる。
次に、本発明に用いられる新規な組み換え体DNAの調製
法等について述べる。
先ず、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の由来は、如
何なるものでもよく、例えば、ルシオラ・クルシアタ
（Luciola cruciata、ゲンジボタル）等が挙げられ、殊
に該ホタルの尾部が好ましい。
そして、上記ホタルの尾部からのｍ−RNAの調製及びｍ
−RNAからのｃ−DNAの合成は、例えば、上述したフォテ
ィナス・ピラリスのｍ−RNAの調製法及びｃ−DNAの合成
法の全く同様にして行なうことができる。
次いで、このようにして得られたｃ−DNAをベクターDN
A、例えば、プラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）等に組
み込み、種々の組み換え体プラスミドDNAを得、該DNAを
用いて例えば、大腸菌（E.coli）DH1（ATCC33849）、大
腸菌（E.coli）HB101（ATCC33694）等をハナハン（Hana
han）の方法〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA
Cloning）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により形
質転換し、種々の形質転換株を得る。
次いで、フォティナス・ピラリス由来のルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するDNAを32Pを用いニックト
ランスレーション法〔「モレキュラー・クローニング」
（Molecular Cloning）、第109〜112頁、「コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー」（Cold Spring
Habor Laboratory）（1982）及び「ジェイ・モル・バイ
オル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237〜251頁（197
7）〕により標識したのち、該ｃ−DNAをプローブとした
コロニーハイブリダイゼイション法〔「蛋白質・核酸・
酵素」、第26巻、第575〜579頁（1981）〕により、プラ
スミドpUC19DNAをベクターとして作成したルシオクラ・
セイアシタ由来のｃ−DNAのジーンンクのライブラリー
より2.0Kbのルシフェラーゼをコードするｃ−DNAを含有
するプラスミドDNAを得ることができる。
次いで、上記ルシオラ・クルシアタ由来で2.0Kbのルシ
フェラーゼをコードするｃ−DNAを制限酵素Sssp1で処理
して得られる1.7Kb c−DNA断片、すなわち、Ｎ末端より
９個のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失したルシフ
ェラーゼ遺伝子、プロモーター〔例えば、大腸菌由来の
トリプ（trp）プロモーター等〕、ベクターDNA及びルシ
フェラーゼ遺伝子のＮ末端より９個のアミノ酸をコード
する塩基配列を有する合成法を用いて、制限酵素、例え
ばSspI（ニューイングラインドバイオラボ社製）等及び
T4DNAリガーゼ（宝酒造社製）等によりルシオラ・クル
シアタ由来のルシフェラーゼ遺伝子を完全にコードする
塩基配列を有する組み換え体DNAを得ることができる。
上記ベクターDNAとしては、如何なるものでもよく、例
えば、プラスミドベクターDNA、バクテリオファージベ
クターDNA等が挙げられるが、具体的には、例えば、pUC
18（宝酒造社製）、pUC19（宝酒造社製）、λc I857 h80att λsRI▲λ0 3▼sRI▲λ0 2▼sRI▲λ0 1▼（特公昭
61−37917号公報記載）等が挙げられる。
そして、このようにして得られた新規な組み換え体DNA
を用いて、エッシェリシア（Escherichia）属の微生
物、例えば、大腸菌JM101（ATCC33876）等を、コーエン
（Cohen）等の方法〔「ジェイ・バク」（J.Bac.）、第1
19巻、第1072〜1074頁（1974）〕により、形質転換する
か、あるいは、「モレキュラー・クローニング（Moqecu
lar Cloning）、第256〜268頁、コールド、スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Habor Labora
tory）（1982）記載の方法により形質導入してルシフェ
ラーゼをコードする遺伝子を含有するDNAをベクターDNA
に挿入した新規な組み換え体DNAを含みルシフェラーゼ
生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を得
る。
このようにして得られた微生物より純化された新規な組
み換え体DNAを得るには、例えば、「プロク・ナトル・
アカド・サイ」（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第62巻、第1
159〜1166頁（1969）記載の方法などにより得ることが
できる。
次いで、上記微生物を培地に培養し、培養物よりルシフ
ェラーゼを採取するのである。
培地としては、例えば、エッシェリア属に属する微生物
の培養に用いられるものであれば、如何なるものでもよ
く、例えば、トリプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5％
（W/V）及びNaCl0.5％（W/V）等が挙げられる。
また、培養温度は、例えば、30〜40℃、好ましくは37℃
程度で、培養時間は、例えば、４〜８時間、好ましくは
４時間程度である。
そして、培養物より菌体を例えば、8,000r.p.m.で10分
間程度の遠心分離処理により集菌し、得られた菌体を、
例えば、「メソズ・イン・エンザイモロジー」（Method
s in Enzymology）第133巻、第３〜14頁（1986）記載の
方法により破砕し、粗酵素液を得る。
そして、粗酵素液は、そのままでも使用可能であるが、
必要により硫安分画，疎水クロマトグラフ法、例えば、
ブチル−トヨパール650C等，ゲル濾過法、例えば、ウル
トロゲルAcA34等により精製して、純化されたルシフェ
ラーゼを得る。
このようにして得られたルシフェラーゼの理化学的性質
は、以下に示す通りである。
作用： 下記の酵素反応式で示されるように酵素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である。
基質特異性： ADP、CTP、UTP及びGTPには作用しない。
至適pH及び安定pH範囲： 至適pHは、ルシフェリンを基質とし、25mMグリシルグリ
シンのpH6.5〜11.5迄変化させ、温度30℃で反応させ、2
0秒間発光量（フォトン数）を測定した場合、pH8.0〜9.
5であり、また安定pH範囲は、ルシフェリンを含有する
緩衝液（pH4.6〜8.0:25mMリン酸緩衝液、pH8.0〜11.5:2
5mMグリシン・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液をそれぞれ使用。なお、それぞれの緩衝液には10％飽
和となる如く硫酸アンモニウムを添加したものであ
る。）に酵素を添加し、温度０℃で４時間作用させた場
合、6.5〜9.0である。
力価の測定法： 25mMグリシルグリシン（pH7.8）8ml、硫酸マグネシウム
溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）に硫酸マグネシ
ウムを0.1Mとなる如く添加した溶液〕0.5mlおよびルシ
フェリン溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）に硫酸
ルシフェリンを1mMとなる如く添加した溶液〕0.8mlを混
合してルシフェリン混合液を調製する。
このようにして得たルシフェリン混合液400μおよび
測定するルシフェラーゼ10μを混合したものに、ATP
溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）にATPを10mMとな
る如く添加したもの。〕80μを注入すると同時に、ル
ミノメーター（アロカ社製、ルミネッセンスリーダー
BLR−201）により発生するフォトン数を20秒間積算して
求める。
作用温度の範囲： pH7.8のもとに、各温度で反応させた20秒間光量（フォ
トン量）を測定した場合、０〜50℃の範囲内にある。
pH、温度などによる失活の条件 （イ）pHによる失活の条件 pH5.0以下及びpH11.0以上で４時間後完全に失活する。
（ロ）温度による失活の条件 pH7.8において、温度50℃、15分間の熱処理により完全
に失活する。
〔発明の効果〕
上述したことから明らかな如く、本発明によれば、ルシ
オラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ遺伝子を完全に
コードする遺伝子を含有する組み換え体DNAを含むエッ
シェリシア属に属する微生物を培地に培養することによ
り、極めて短期間のうちに、ルシフェラーゼを効率よく
製造することができるので、本発明は、産業上極めて有
用である。
以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。
実施例 なお、以下にのべる項目１〜10には、ホタルの１種であ
るフォティナス・ピラリスのルシフェラーゼをコードす
る遺伝子を含有するDNA（該DNAは、ルシオラ・クルシア
タのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有するDNA
を検索する際、プローブとして使用されるものであ
る。）の調製についてのべる。
1.m−RNAの調製 ホタルの１種であるフォティナス・ピラリス（Photinus
Pralis）の乾燥尾部（シグマ社製）1gを乳鉢及び乳棒
を用いて充分破砕したものに、溶解緩衝液5ml〔20mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.4）/10mM NaCl/3mM酢酸マグネ
シウム/5％（w/v）ショ糖/1.2％（V/V）トリトンＸ−10
0/10mMバナジルヌクレオシド錯体（ニューイングランド
バイオラボ社製）〕を添加し、更に、上記と同様に破
砕してフォティナス・ピラリス尾部破砕物含有溶液を得
た。
このようにして得た溶液5mlを、カップ型ブレンダー
（日本精機製作所社製）に入れ、5,000r.p.m.で５分間
処理したものに、12mlのグアニジンイソチオシアネート
溶液（6Mグアニジンイソチオシアネート/37.5mMクエン
酸ナトリウム（pH7.0）/0.75％（W/V）Ｎ−ラウロイル
ザルコシンナトリウム/0.15M β−メルカプトエタノー
ル）を添加し、更に、上記ブレンダーを用い3,000r.p.
m.で10分間処理して得た溶液を、３重のガーゼを用いて
濾過し、瀘液を液、超遠心分離機用チューブ（日立工機
社製）４本に、予め1.2mlの5.7Mの塩化セシウム溶液を
夫々重層し、その上に、上記瀘液を重層するように夫々
分注し、超遠心分離機（日立工機社製、SCP55H）を用い
て温度15℃、30,000r.p.m.で16時間遠心分離して沈澱物
を得た。得られた沈澱物を、冷70％（V/V）エタノール
を用いて洗浄したものを、10mMトリス緩衝液〔10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.4）/5mM EDTA/1％ドデシル硫酸ナ
トリウム〕4mlに懸濁したものに、同量のｎ−ブタノー
ル及びクロロフォルムを４対１（容量比）となく如く混
合したものを添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.
で10分間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、こ
の有機溶媒層に上記10mMトリス緩衝液4mlを添加し、上
記抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得ら
れた水層に、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び
２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−20℃で２
時間放置したのち、常法により8,000r.p.m.で20分間遠
心分離し、RNAを沈澱させ、得られたRNAを4mlの水に溶
解し、上記エタノール沈澱操作を行なったのち、得らえ
たRNAを1mlの水に溶解し、3.75mgのRNAを得た。
そして、以上の操作を再度繰り返すことにより合計7mg
のRNAを調製し、このRNA中よりｍ−RNAを選択するため
に、7mgのRNAを、オリゴ（dT）−セルロース（ニューイ
ングランドバイオラボ社製）カラムクロマトグラムにか
けた。
カラムとして2.5mlテルモシリンジ（テルモ・社・製）
を用い、樹脂0.5gは、溶出緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩
衝液（pH7.6）/1mM DETA/0.1％（W/V）ドデシル硫酸ナ
トリウム〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩
衝液〔10mMトリス−塩酸（pH7.6）/1mM EDTA/0.4M NaCl
/0.1％ドデシル硫酸ナトリウム〕で平衡化したものであ
る。
7mgのRNAに、同量の緩衝液〔10mMトリス−塩酸（pH7.
6）/1mM EDTA/0.8M NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕を添加し、温度65℃で10分間加熱処理し、氷中で急
冷し、オリゴ（dT）−セルロースカラムにかけたのち、
結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−RNA及びｔ−R
NAを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−RNAを溶出
し、40μｇのｍ−RNAを得た。
2.ルシフェラーゼｍ−RNAの濃縮 次に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりルシフェラーゼ
ｍ−RNAを濃縮した。
10〜25％（W/V）のショ糖密度勾配は、ベックマン社製
のローターSW41用ポリアロマチューブに40％（W/V）シ
ョ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/20mM NaCl/
1mM EDTA/40％（W/V）ショ糖〕0.5mlを入れ、その上に
2.4mlずつ25％（W/V）、20％（W/V）、15％（W/V）及び
10％（W/V）のショ糖液を重層し、温度４℃で24時間放
置することにより作製した。このショ糖密度勾配に、ｍ
−RNA30μｇを重層し、ベックマン・社・製のSW41ロー
ターを用い、常法により30,000r.p.m.、温度18℃で18時
間遠心分離を行なった。遠心分離操作ののち、0.5mlず
つ分画し、エタノール沈澱法によりｍ−RNAを回収し、1
0μの水に溶解した。
次に、ｍ−RNAにコードされている蛋白質を調べること
により、ルシフェラーゼのｍ−RNAが濃縮されている画
分の同定を行なった。分画したRNA1μ、ウサギ網状赤
血球ライセート（アマシャム社製）９μ及び〔35S〕
メチオニン１μ（アマシャム社製）を混合し、温度30
℃で30分間反応させたものに、150μのNET緩衝液〔15
0mM NaCl/5mM EDTA/0.02％（W/V）NaN3/20mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.4）/0.05％（W/V）ノニデットＰ−40
（ベセスダリサーチラボラトリー社製、界面活性剤）〕
を添加し、更に、１μの抗ルシフェラーゼ血清（後述
のようにして調製したもの。）を添加し、温度４℃で18
時間放置したものに、10mgのプロティンＡセファロース
（ファルマシア社製）を添加し、温度20℃で30分間放置
したものを、常法により12,000r.p.m.で１分間遠心分離
処理し、樹脂を回収した。
回収した樹脂を、200μのNET緩衝液で３回洗浄し、こ
の樹脂に、40μのSDS−PAGE用サンプル緩衝液〔62.5m
Mトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/10％（V/V）グリセロー
ル/2％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム/5％（V/V）メル
カプトエタノール/0.02％（W/V）ブロムフェノールブル
ー〕を添加し、温度100℃で３分間煮沸し、常法により1
2,000r.p.m.で１分間遠心分離処理し、上清を回収し、
全量を7.5％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲルに乗せた。
ゲル電気泳動は、ラエムリ（Laemmli）の方法〔「ネー
チュアー」（Nature）、第227頁、第680頁（1970）〕で
行ない、泳動したのちのゲルは、10％（V/V）の酢酸に3
0分間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水に30分間浸漬
し、更に、1Mサリチル酸ナトリウム溶液に30分間浸漬
し、乾燥して乾燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フ
ィルム社製、RX）を用いてフルオログラフィーを行なっ
た。
以上の操作により、ルシフェラーゼｍ−RNAの存在する
画分のRNAを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ蛋白質
のバンドがＸ線フィルム上に認められ、ルシフェラーゼ
ｍ−RNAの濃縮されている画分が同定できた。
3.抗ルシフェラーゼ血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラーゼ
血清は、以下の方法により調製した。
3.2mg/ml濃度のルシフェラーゼ溶液〔シグマ社製ルシフ
ェラーゼを0.5Mグリシルグリシン溶液（pH7.8）に溶解
したもの〕0.7mlを、等量のフレンド（Freund）完全ア
ジェバントで懸濁したもの2.24mgを、抗原として体重2k
gの日本白色種ウサギの指掌部に投与し、飼育２週間経
過したのち、初回と同量の抗原を背部皮内へ投与し、更
に、飼育１週間経過したのち、同様の操作を行ない、ま
更に、飼育１週間後全採血を行なった。
そして、得られた血液を、温度４℃で18時間放置したも
のを、常法により3,000r.p.m.で15分間遠心分離し、上
清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。
4.c−DNAの合成 ｃ−DNAの合成は、アマシャム・社・製キットを用いて
行なったものである。
上述の如くして得られたｍ−RNA2μｇを用いてアマシャ
ム社の指示する「モル・セル・バイオル」（Mol.Cell.B
iol.）、第２巻、第161頁（1982）及び「ジーン」（Gen
e）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に従い行なっ
た結果、300ngの２本鎖ｃ−DNAが得られた。
このｃ−DNA150mgを、７μのTE緩衝液〔10mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.5）/1mM EDTA〕に溶解したものに、11
μの混液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.8）/60m
Mトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕及び
3.8μのティリング混液〔10mMジチオスレイトール7.5
μ/10ng/mlポリ（poly）A1μ/5mM dCTP2μ／水11
0μ〕を夫々添加し、更に、29ユニットのターミナル
トランスフェラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を
添加し、温度30℃で10分間反応させたのち、2.4μの
0.25M EDTA及び2.4μの10％（W/V）ドデシル硫酸ナト
リウムを夫々添加して反応を停止させた。
反応停止液に25μの水飽和フェノールを用いて除蛋白
処理を行なったのち、回収した水層に、25μの4M酢酸
アンモニウム及び100μの冷エタノールを夫々添加
し、温度−70℃で15分間放置し、12,000r.p.m.で10分間
遠心分離してｃ−DNAを回収し、10μのTE緩衝液に溶
解し、ｃ−DNA溶解液を得た。
以上の如くしてデオキシシチジンのテイルの付いたｃ−
DNA100ngを得た。
5.ベクターに使用すう組み換え体プラスミド pMCE10DNAの調製 大腸菌W3110株（ATCC27325）、プラスミドpBR325（BRL
社製）及びプラスミドpBR322DNA（宝酒造社製）を用い
てティー・マスダ等（T.Masuda et.al.）「アグリカル
チュラル・バイオロジカル・ケミストリー」（Agricult
ural Biological Chemistry）、第50巻、第271〜279頁
（1986）記載の方法により作製したプラスミドpKN305 D
NA並びにプラスミドpMC1403−3DNA（特開昭61−274683
号公報記載）夫々１μｇを、10μの混液〔50mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.5）/10mM MgCl2/100mM NgCl/1mMジ
チオスレイトール〕に添加し、更に、これに、Hind III
及びSalI（いずれも宝酒造社製）を夫々２ユニットずつ
添加し、温度37℃で１時間反応させて切断処理し、常法
によるフェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない
沈澱物を得た。この沈澱物を、10μのライゲーション
緩衝液〔20mM MgCl2/66mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）
/1mM ATP/15mMジチオスレイトール〕に溶解し、溶液を
得、更に、１ユニットのT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）
を添加し、温度20℃で４時間連結反応を行なった。次い
で、この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジー」
（J.Bacteriology、第119巻、第1072頁〜第1074頁（197
4年）〕記載の計質転換法により、大腸菌JM101（ATCC33
876）株を形質転換し、薬剤耐性（アンピシリン耐性及
びテトラサイクリン感受性）及びβ−ガラクトシダーゼ
活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有する組み
変え体プラスミドDNAをpMCE10と命名した。この組み変
え体プラスミドpMCE10DNAを含有する大腸菌JM101株を、
トリプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5％（W/V）、及
びNaCl0.5％（W/V）からなる培地１に、該培地を用い
温度37℃で16〜24時間前培養して得た大腸菌JM101（pMC
Е10）の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間振盪培
養したのち、0.2gのクロラムフェニコールを添加し、更
に同一温度で20時間同培養を行ない、培養液を得た。
次いで、この培養液を、常法により6,000r.p.m.で10分
間遠心分離して湿潤菌体2gを得、これを20mlの25％（W/
V）ショ糖を含有する350mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.
0）に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10mg、
0.25M EDTA溶液（pH8.0）8ml及び20％（W/V）ドデシル
硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加し、温度60℃で30分
間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、5M NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃で1
6時間処理したものを常法により15,000r.p.m.で30分間
遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出処
理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。
次いで、この沈澱物を、通常の減圧乾燥処理したもの
を、1mM EDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液6ml（p
H7.5）に溶解し、更に、これに、塩化セシウム6g及びエ
チジウムブロマイド溶液（10mg/ml）0.2mlを添加したも
のを、常法により39,000r.p.m.で42時間超遠心分離機を
用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体
プラスミドpMCE10DNAを単離し、また更に、ｎ−ブタノ
ールを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、
1mM EDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
に対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミド
pMCE10DNA500μｇを得た。
6.ベクターDNAの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミドpMCE10DN
A15μｇを、90μの項目４記載のTE緩衝液に溶解し310
μのMed緩衝液〔100mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/
100mM MgCl2/10mMジチオスレイトール/500mM NaCl〕を
添加したのち30ユニットの制限酵素AccI（宝酒造社製）
を更に加え、温度37℃で１時間切断処理を行ない切断処
理物を得た。この切断処理物に、100μの水飽和フェ
ノールを加え除蛋白操作を行なったのち、水層を回収
し、これに、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH7.5）及び
２倍量の冷エタノールを加え、温度−70℃で15分間放置
したのち、12,000r.p.m.で10分間遠心分離し、DNAを回
収した。
このDNAを、10μのTE緩衝液に溶かし、15μの混液
〔280mM カコジル酸ナトリウム（pH6.8）/60mMトリス−
塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕を加えたの
ち、更に、５μのティリング混液（項目４記載）（5m
M dGTPを用いた）を加え、また更に、５ユニットのター
ミナルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）を添加し、温
度37℃で15分間反応させた。項目４記載のｃ−DNAティ
リング反応と同様の後処理を行なうことにより組み換え
体プラスミドpMCE10DNAのAccIサイトにデオキシグアノ
シンのテイルが付いたDNAを調製した。
一方、プラスミドpUC19DNAのPstIサイトにデオキシグア
ノシンのテイルが付いたDNAの調製も同時に行なった。
プラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）30μｇを、350μ
のTE緩衝液に溶解したものに、40μのMed緩衝液及び
制限酵素PstI（宝酒造社製）120ユニットを夫々添加
し、温度37℃で１時間切断処理したのち、常法によりフ
ェノールによる除蛋白処理及びエタノール沈澱処理によ
りDNAを回収した。
得られたDNAを、35μのTE緩衝液に溶解したものに、5
0μの混液〔280mM カコジル酸ナトリウム（pH6.8）/6
0mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/1mM塩化コバルト〕、
19μの項目４記載のティリング混液（dGTP含有）並び
に60ユニットのターミナルトランスフェラーゼ（宝酒造
社製）を夫々添加し、温度37℃で10分間反応させたの
ち、常法によりフェノール処理及びエタノール沈澱を行
なうことによりDNAを回収した。
7.アニーリング及び形質転換 合成したｃ−DNA15ng及び上記の方法で得た二種のベク
ターDNA 200ngを、35μのアニール緩衝液〔10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mM NaCl/1mM EDTA〕に溶
解し、温度65℃で２分間、温度46℃で２時間、温度37℃
で１時間及び温度20℃で18時間放置する操作によりｃ−
DNAとベクターDNAをアニールした。
アニールしたDNAを用いて、ハナハン（Hanahan）の方法
〔デイーエヌエイ クローニング（DNA Cloning）、第
１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DHI株（ATC
C33849）を形質転換し、プラスミドpUC19DNA及び組み換
え体プラスミドpMCE10DNAをベクターとしたｃ−DNAバン
クを夫々作製した。
8.ルシフェラーゼｃ−DNAの検索 組み換え体プラスミドpMCE10DNAのAccI部位は、大腸菌
β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする部位にあるの
で、この部位に組み込まれたｃ−DNAはβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合蛋白質を作る。また組み換え体プラスミ
ドpMCE10のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター
は前述した様に大腸菌トリプトファン遺伝子のプロモー
ターに変換してある。
組み換え体プラスミドpMCE10DNAを、ベクターとするｃ
−DNAバンクのコロニー96個を10mlのM9カザミノ酸培地
〔「モレキュラー・クローニング」（Molecular Clonin
g）、第440〜441頁、「コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー」（Cold Spring Harbor Laborator
y）（1982）〕にチアミン（10μg/ml）を加えた培地を
用い温度37℃で10時間振盪培養し、常法により集菌した
のち、200μの項目２記載のSDS−PAGE用サンプル緩衝
液に懸濁し、温度100℃で５分間煮沸した。
この懸濁液40μを、7.5％（W/V）ポリアクリルアミト
ゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった。泳動終
了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウエスタンブロット法
〔「アナル・バイオケム」（Anal.Biochm.）、第112
巻、第195頁（1981）〕によりニトロセルロースのフィ
ルターに転写し、このニトロセルロースフィルターをイ
ミューンブロットアッセイキット（バイオラッド社製）
を用いて抗ルシフェラーゼ血清で染色した。方法は、バ
イオラッド社の操作法に従った。
即ちニトロセルロースのフィルターを、100mlのブロッ
キング溶液［TBS緩衝液〔20mMトリス−塩酸緩衝液/500m
M NaCl（pH7.5）〕に３％（W/V）のゼラチンを溶かした
溶液］中温度25℃で、30分間振盪した。次に、このニト
ロセルロースフィルターを25mlの一次抗体溶液〔ルシフ
ェラーゼ抗血清を１％（W/V）のゼラチンをTBS緩衝液に
溶かした溶液で25倍（V/V）に希釈した溶液〕に移し、
温度25℃で90分間振盪したものを、100mlのツィーン（T
ween）−20洗液〔TBS緩衝液に0.05％（W/V）のツィーン
（Tween）−20を溶かした溶液〕中に移し、温度25℃で1
0分間振盪する操作を２回行なった。次いで、このよう
にして得たニトロセルロースフィルターを60mlの二次抗
体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサ
ギ抗体（バイオラッド社製）を１％（W/V）のゼラチン
をTBS緩衝液に溶かした溶液で3000倍（V/V）に希釈した
溶液〕中に移し、温度25℃で60分間振盪したのち、100m
lのツィーン（Tween）−20洗液でニトロセルロースフィ
ルターを洗う上記操作を２回繰り返し、このようにして
得たニトロセルロースフィルターを、120mlの発色液〔6
0mgの４−クロロ−１−ナフトールを20mlの冷メタノー
ルに溶解した溶液及び60μの30％（V/V）過酸化水素
水を100mlのTBS緩衝液に添加した溶液を混合した溶液〕
中に移し、温度25℃で10分間発色させた。
この様にして96個のコロニーを１グループとして４グル
ープについて同様の方法を行なったところ、２つのグル
ープでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが認
められた。次に、この２つのグループに属する96個のコ
ロニーを12個のコロニーずつ８グループに分け同様の操
作を行なったところ夫々１グループに抗ルシフェラーゼ
血清と反応する蛋白質が認められた。最後に、このグル
ープに含まれる12個のコロニーを、１個のコロニーずつ
同様の操作を行ないルシフェラーゼ抗血清と反応する蛋
白質を作るコロニーを同定した。以上の操作によりルシ
フェラーゼｃ−DNAをもつ２個のコロニーが得られた。
この２個のコロニーより項目５記載の方法でプラスミド
DNAを調製した。得られた組み換え体プラスミドDNAは、
pALf2B8及びpALf3A6と夫々命名した。
9.大きなルシフェラーゼｃ−DNAの検索−DNAのプローブ
の作製 組み換え体プラスミドpALf3A6DNA100μｇを、330μの
TE緩衝液に溶解し、これに40μのLow緩衝液〔100mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mM MgCl2/10mMジチオ
スレイトール〕、130ユニットのPstI（宝酒造社製）及
び120ユニットのSacI（ベーリンガーマンハイム社製）
を添加し、温度37℃で1.5時間切断した。
このDNA全量を0.7％（W/V）アガロースゲルを用いた電
気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動はティー・
マニアテス（T.Maniatis）等の方法〔「モレキュラー・
クローニング」（Molecular Cloning）、第156〜161
頁、「コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー」（Cold Spring Harbor Laboratory）（1984）〕に
従って行なった。ルシフェラーゼｃ−DNAを含むDNAバン
ドを切り出し、透析チューブに入れ、2mlのTE緩衝液を
加えたのち、透析チューブをシールし、電気泳動によ
り、ゲル中より緩衝液中にDNAを溶出した。この溶液に
等容量の水飽和フェノールを加え、撹拌したのち、水層
を回収し、常法に従いエタノール沈澱によりDNAを回収
した。
得られたDNAフラグメント10μｇを、120μのTE緩衝液
に溶かし、16μのMed緩衝液及び64ユニットのSau3AI
（宝酒造社製）を加え、温度37℃で２時間反応させたの
ち、全量を５％（W/V）ポリアクリルアミドゲルを用い
た電気泳動により、DNA断片の分離を行なった。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動は、エイ・マクサム（A.Maxa
m）の方法〔「メソズ・イン・エンザイモロジー」（Met
hods in Enzymology）、第65巻、第506頁（1980）〕に
従って行なった。190bpのDNAフラグメントを前述と同様
の方法で単離し、１μｇのSau3AIルシフェラーゼｃ−DN
Aフラグメトが得られた。
この１μｇのルシフェラーゼｃ−DNAを、〔α−32P〕dC
TP（アマシャム社製）を用いてニックトランスレーショ
ン法により標識した。ニックトランスレーションは宝酒
造社製のキットを用い、宝酒造社の指示する「ジェイ・
モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237〜2
51頁（1977）及び「モレキュラー・クローニング」（Mo
lecular Cloning）、第109〜112頁、「コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー」（ColdSpring Harbo
r Laboratory）（1982）記載の方法に従って行なった。
10.大きなルシフェラーゼｃ−DNAの検索−コロニーハイ
ブリダイゼーション 前述の方法で調製した32Pで標識したルシフェラーゼｃ
−DNA断片を、プローブとして用い、組み換え体プラス
ミドpUC19DNAをベクターとするフォティナス・ピラリス
尾部ｃ−DNAバンクを、コロニーハイブリダイゼーショ
ン法（「蛋白質・核酸・酵素」、第26巻、第575〜579頁
（1981）で検索し、ルシフェラーゼｃ−DNAを有するコ
ロニーを得た。そのうちの１個のコロニーの有する組み
換え体プラスミドDNAをpALf 3と命令し、項目５記載の
方法でプラスミドDNAを調製した。該組み換え体プラス
ミドDNAを含有する大腸菌を大腸菌DH1（pALf 3）と命令
した。なお、該形質転換株はTACC67462として寄託され
ている。
そして、上記組み換え体プラスミドpALf 3DNAを、Xba
I、Hind III、BamH I、EcoRI及びPstI（いずれも宝酒造
社製）を用い、単一消化及び２重消化して得られたDNA
断片をアガロースゲル電気泳動法により移動度パターン
を分析し、得られた移動度パターンとλDNA（宝酒造社
製）をHind IIIにより消化して得られたDNA断片の標準
移動度パターンと対比することにより得られた分子量、
1,700bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図は、第
１図に示すとおりであった。
11.ルシオラ・クルシアタ（Luciola Cruciata）のｍ−R
NAの調製 生きたルシオラ・クルシアタ（ゲンジボタル・株式会社
・西武百貨店より購入）10gを超低温冷凍庫に入れ、凍
結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部2g
に、18mlのグアニジンイソシオシアネート溶液を添加
し、項目１記載の方法に従って1.1mgのRNAを調製した。
このRNA1.1mgを項目１記載の方法に従ってオリゴ（dT）
−セルロースのカラムクロマトグラフィーを行ない30μ
ｇのルシオラ・クルシアタ尾部ｍ−RNAを調製した。
12.ルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−DNAバンクの作製 ｃ−DNAの合成はアマシャム社より購入したキットを用
い、アマシャム社の指示する「モル・セル・バイオル」
（Mol.Cell Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及び
「ジール」（Gene）、第25巻、第263頁（19 83）記載の
方法に従って合成した。
２μｇのルシオラ・クルシアタ尾部RNAより0.9μｇの二
本鎖ｃ−DNAが合成された。このｃ−DNA0.3μｇに項目
４記載の方法を用いてポリデオキシチジンのテイルを付
加した。
このｃ−DNA20ng及び項目６で調製したポリグアノシン
のテイルをそのPstI部位に付加したpUC19プラスミドDNA
500ngを、項目７記載の方法でアニールし、ハナハン（H
anahan）の方法〔「ディエヌエイ・クローニング」（DN
A Cloning）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕に従っ
てアニールしたDNAにより大腸菌DH1株（ATCC33849）を
形質転換しルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−DNAバンクを
作製した。
13.ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNA
の検索 項目10で得られた組み換え体プラスミドpALf 3DNA10μ
ｇを、90μのTE緩衝液に溶解し、10μのMed緩衝
液、25ユニットの制限酵素EcoRI及び25ユニットの制限
酵素ClaI（いずれも宝酒造社製）を添加し、温度37℃で
２時間反応を行ないDNAを切断した。切断した組み換え
体プラスミドpALf 3DNAよりフォテナス・ピラリス（ア
メリカホタル）由来のルシフェラーゼｃ−DNA部分を含
む800bpのEcoRI/ClaIDNAフラグメントを、項目９記載の
アガロースゲル電気泳動法を用いる方法に従って単離
し、１μｇのEcoRI/ClaIDNAフラグメントを得た。この
１μｇのDNAを、〔α−32P〕dCTP三燐酸（アマシャム社
製）を用いて項目９記載のニックトランスレーション法
により32Pで標識した。32Pで標識したEcoRI/ClaIDNAフ
ラグメントをプローブとして、ルシオラ・クルシアタ尾
部ｃ−DNAバンクを項目10記載のコロニーハイブリダイ
ゼーション法で検索することによりルシオラ・クルシア
タ由来のルシフェラーゼｃ−DNAを有する大腸菌を選択
した。プローブとハイブリダイズする大腸菌コロニーを
数個得た。この中の１コロニーを有する組み換え体プラ
スミドDNAをpGLf 1と命名し、項目５記載の方法に従い
組み換え体プラスミドDNAを単離した。該組み換え体プ
ラスミドDNAを含有する大腸菌を大腸菌DH1（pGLf 1）と
命名した。なお、該形質転換株はATCC67482として寄託
されている。
組み換え体プラスミドpGLf1DNAをHpaI,Hind III,EcoRV,
Dra I,Afl II,Hinc II,PstI（いずれも宝酒造社製）及
びSspＩ（ニューイングランドバイオラボ・社・製）を
用い、単一消化及び二重消化して得られたDNA断片をア
ガロースゲル電子泳動法により、移動度パターンを分析
し、得られた移動度パターンとλファージDNA（宝酒造
社製）をHind IIIにより消化して得られたDNA断片の標
準移動度パターンとを対比することにより得られた分子
量は、2,000bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図
は、第２図に示す通りである。
14.ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNA
の塩基配列の解析 組み換え体プラスミドpGLf 1DNA10μｇを制限酵素PstI
（宝酒造社製）で切断し、ルシフェラーゼｃ−DNAを含
む2.0Kb DNA断片を2.5μｇを得、このDNA断片を、プラ
スミドpUC119DNA（宝酒造社製）のPstI部位にクローニ
ングし、ｃ−DNAの挿入方向の違いにより得られたプラ
スミドDNAを夫々pGLf 2及びpGLf 3と命名した。組み換
え体プラスミドpGLf 1DNA及びプラスミドpUC119 DNAのP
stＩによる切断処理（項目６記載の方法）、ルシフェラ
ーゼｃ−DNA断片のアガロースゲル電気泳動法を用いた
単離（項目９記載の方法）、プラスミドpUC119 DNA及び
ルシフェラーゼｃ−DNA断片の連結反応（項目５記載の
方法）、連結反応液を用いた大腸菌JM101株（ATCC3387
6）の形質転換（項目５記載の方法）、並びに組み換え
体プラスミドpGLf 2及びpGLf 3DNAの調製（項目５記載
の方法）は、カッコ内記載の方法に従った。
次いで、組み換え体プラスミドpGLf 2及びpGLf 3DNAを
用いてキロシークエンス用欠失キット（宝酒造社製）を
用い、ヘニコフ（Henikoff）の方法〔「ジーン」（Gen
e）、第28巻、第351〜359（1984）に従いルシフェラー
ゼｃ−DNAに種々の欠失が導入されたプラスミドDNAを作
製し、項目５記載の方法で大腸菌JM101株（ATCC33876）
に導入した。このようにして得られた大腸菌にペルパー
ファージM13KO7（宝酒造社製）を感染させることにより
メッシング（Messing）の方法〔「メソズ・イン・エン
ザイモロジー」（Methods in Enzymology）、第101巻、
第20〜78頁（1983）〕に従って１本鎖DNAを調製した。
得られた１本鎖DNAによるシークエンシングは、M13シー
クエンシングキット（宝酒造社製）を用いて上記メッシ
ング（Messing）の方法に従い行なった。塩基配列の解
析のためのゲル電気泳動は８％（W/V）ポリアクリルア
ミドゲル（富士写真フィルム社製）を用いて行なった。
得られたルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ
−DNAのみの全塩基配列を第３図に、また、該ｃ−DNAか
ら翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を第４図に夫
々示した。
15.組み換え体プラスミドpGLf 37DNAの構築 先ず、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする塩基配列
を欠失し、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
遺伝子及びベクターDNAを含有するDNA断片の調製につい
て述べる。組み換え体プラスミドpGLf 1DNA1μｇを、90
μの水に溶解したものに、10μのMed緩衝液及び20
ユニットのPstＩ（宝酒造社製）を添加し、温度37℃で
２時間消化し、これに、等量の水飽和フェノールを添加
し、常法による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理を行
ったのち、項目５に記載の方法にてライゲーション及び
大腸菌JM101（ATCC33876）へ形質転換を行った。
得られた形質転換体から項目５に記載の方法によりDNA
を単離し、PspＩ、EcoRV及びPstＩ等の制限酵素で単一
又は二重消化することにより、もとの組み換え体プラス
ミドpGLf 1に対してｃ−DNAの向きが逆向きになってい
る組み換え体プラスミドを選択し、pGLf 10と命名し
た。
10μｇの組み換え体プラスミドpGLf 10DNAを、90μの
水に溶解したものに、10μのMed緩衝液及び10ユニッ
トのSspＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）を添
加し、温度37℃で30分処理し、部分分解物を得、この部
分分解物より項目９記載の方法により、Ｎ末端より９個
のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失したルシフェラ
ーゼ遺伝子及びベクターDNAの大部分を含有する4.0Kbの
DNA断片２μｇを単離した。
次に、このDNA断片１μｇを95μの水に溶解したもの
に、５μの1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）及び0.3ユニ
ット（１μ）のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社
製）を添加し、温度65℃で１時間処理し、常法により除
蛋白処理及びエターノール沈澱処理したのち、両端を脱
リン酸した4.0KbのDNA断片を１μｇ得た。
次に、大腸菌由来のトリプ（trp）プロモーターを含有
するDNA断片の調製法について述べる。
トリププロモーターを含有するプラスミドpKN206 DNA
〔「アグリク・バイオル・ケム」（Agric.Biol.Che
m.）、第50巻、第271〜279頁）（1986年）記載のもの〕
10μｇを、90μの水に溶解し、10μのMed緩衝液及
び20ユニットのClaI（宝酒造社製）を添加し、温度37℃
で２時間処理し、完全分割物を得、これに前述のSspI10
ユニットを添加し、温度37℃で30分間処理し、SspIによ
る部分分解物を得、常法により除蛋白質処理及びエタノ
ール沈澱処理したのち、得られた沈澱を100μのTE緩
衝液に溶解し、項目９記載の方法により、トリププロモ
ーターの大部分を含有する500bのDNA断片を単離した。
次に合成DNAの調製について述べる。
上記4.0KbのDNA断片に含まれるルシフェラーゼ遺伝子
は、塩基配列より推定したところＮ末端より９個のアミ
ノ酸をコードする塩基配列を欠失している。
また、上記500bのDNA断片に含まれるトリププロモータ
ーは、SDとATG間の塩基配列の一部欠失している。そこ
で、ルシフェラーゼのＮ末端より９個のアミノ酸をコー
ドする塩基配列及びトリププロモーターのSD−ATG間の
塩基配列を補うために、以下の２種の合成DNAをベッグ
マン社製のシステム１プラスDNA合成機を用いて合成し
た。
５′CGACAATGGAAAACATGGAAAACGATGAAAAT 3′ ５′ATTTTCATCGTTTTCCATGTTTTCCATTGT 3′ これらの２種の合成DNAをデュポン社製のネンソルブ・
プレプ（NENSORB PREP）を用いることにより、20μｇの
精製された合成DNAを夫々得た。これら２種の合成DNA1
μｇを夫々45μの水に溶解し、５μのX10カイネー
ション緩衝液〔0.5Mトリス塩酸緩衝液（pH7.6）/0.1M M
gCl250mMジチオスレイトール/10mM ATP〕を添加し、更
に、10ユニット（１μ）のT4ポリヌクレオチドカイネ
ース（宝酒造社製）を添加したのち温度37℃で１時間処
理し、常法による除蛋白質処理及びエタノール沈澱処理
を行い、５′末端をリン酸化した合成DNAをそれぞれ１
μｇずつ得た。
次に、ライゲーション反応により目的のプラスミドDNA
を取得を行った。
上記の脱リン酸化したＮ末端より９個のアミノ酸をコー
ドする塩基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子、ベク
ターDNAを含む4.0KbのDNA断片１μｇ、上記のトリププ
ロモーターを含む500bのDNA断片１μｇ及び上記２種の
リン酸化した合成DNA0.1μｇを夫々８μの水に溶解し
た。これに１μのX10ライゲーション緩衝液〔200mM M
gCl2/660mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）/10mM ATP/150mM
ジチオスレイトール〕及び１ユニットのT4DNAライゲー
ス（宝酒造社製）（１μ）を添加し、温度16℃にて16
時間反応を行った。得られた反応液を用いて項目５に記
載の方法にて大腸菌JM101（ATCC33876）へ形質転換を行
い、得られた形質転換体より、項目５に記載の方法にて
プラスミドDNAを単離し、SspＩ、EcoRV及びPstＩ等の制
限酵素で単一又は二重消化したのち、0.7％アガロース
ゲル電気泳動にて展開し、トリププロモーターによりル
シフェラーゼ遺伝子を完全にコードするルシフェラーゼ
遺伝子を発現するプラスミドを得、該組み換え体プラス
ミドを、pGLf 37を命名し、また、該プラスミドを含有
する大腸菌を大腸菌JM101（pGLf 37）と命令した。
16.組み換え体プラスミドpGLf 15DNAの構築 組み換え体プラスミドpGLf 1DNA5μｇを、90μのTE緩
衝液に溶解したものに、10μのMed緩衝液及び25ユニ
ットのSspＩを添加し、温度37℃で２時間消化したの
ち、更に、これに等容量の水飽和フェノールを添加し、
常法に従い除蛋白操作を行なった。消化した組み換え体
プラスミドpGLf 1DNAよりルシオラ・クルシアタ由来の
ルシフェラーゼｃ−DNAをコードする1.7Kb DNAフラグメ
ントを項目９記載のアガロースゲル電子泳動を用いる方
法を利用して単離し、１μｇの1.7Kb SspＩフラグメン
トを得た。
一方、プラスミドpUC18DNA（宝酒造社製）１μｇを、18
μのTE緩衝液に溶解し、２μのSmaＩ緩衝液〔100mM
トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）/70mM塩化マグネシウム/2
00mM塩化カリウム/70mM 2−メルカプトエタノール/0.1
％ウシ血清アルブミン〕及び５ユニットのSmaＩ（宝酒
造社製）を添加し、温度37℃で１時間消化したものち、
常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱を行な
い、沈澱物を得た。
0.5μｇのSmaＩで消化したプラスミドpUC18DNA及び0.5
μｇの1.7Kbルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラー
ゼｃ−DNAフラグメントを、７μの水に溶解し、13μ
の混液〔77mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）/15mM塩化
マグネシウム/15mMジチオスレイトール/0.15mMアデノシ
ン三燐酸〕及び１ユニットのT4リガーゼ（ベーリンガー
・マイハイム社製）を添加し、温度８℃で18時間連結反
応を行った。この反応液を用い、項目７記載の如くして
大腸菌JM101株（ATCC33876）を形質転換し、得られた形
質転換株より、項目５の如くしてプラスミドDNAを単離
した。単離したプラスミドDNAを、Hind III（宝酒造社
製）で単一消化し1.5Kb及び2.9KbのDNA断片を生じるプ
ラスミドDNAを選択し、この組み換え体プラスミドDNAを
pGLf 15、このプラスミドDNAを有する大腸菌を大腸菌JM
101（pGLf15）と命名した。なお、大腸菌JM101（p GLf1
5）はATCC67461として寄託されている。
大腸菌JM101（pGLf 15）を項目５記載の方法で培養し、
組み換え体プラスミドDNAを単離することにより１の
培養液より1.2mgの純化された組み換え体pGLf 15DNAが
得られた。
17.大腸菌JM101（pGLf 37）の培養及び粗酵素液の調製 大腸菌JM101（pGLf 37）を、LB−amp培地〔バクトトリ
プトン１％（W/V），酵母エキス0.5％（W/V）,NaCl 0.5
％（W/V），及びアンピシリン（50μg/ml）〕3mlにて温
度37℃で18時間振盪培養を行なった。この培養液0.5ml
を10mlの上記LB−amp培地に接種し、温度37℃で４時間
振盪培養したのち、8,000r.p.m.で10分間の遠心分離操
作により湿潤菌体20mgを得た。
回収した菌体を、0.1M KH2PO4（pH7.8）、2mM EDTA、1m
Mジチオスレイトール及び0.2mg/mlプロタミン硫酸から
なる緩衝液0.9mlに懸濁し、更に、これに、100μ/ml
のリゾチーム溶液を添加し、氷中に15分間放置した。次
に、この懸濁液を、メタノール・ドライアイス浴中で凍
結し、続いて温度25℃に放置し、完全に解凍した。更
に、12,000r.p.m.で５分間遠心分離操作を行なうことに
より上清として粗酵素液1mlを得た（本発明）。
このようにして得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活
性の測定は、下記記載方法により行ない、その結果を下
表に示した。
得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活性の測定は、ク
リッカ（Kricka）等の方法〔アチーブス・オブ・バイオ
ケミストリー・アンド・バイオフィズィクス（Archives
of Biochemistry and Biophysics）、第217巻、第674
頁（1982）〕に従って生成するフォトン数を計測するこ
とにより行なった。
すなわち、260μの25mMグリシルグリシン緩衝液（pH
7.8）、16μの0.1M硫酸マグネシウム24μの1mMルシ
フェリン（シグマ社製）及び10μの粗酵素液を混合し
たのち、100μの20mM ATPを添加し、発生するフォト
ン数を20秒間積算した値を下表に示した。
なお、比較のため、大腸菌JM101（pGLF15）（ATCC6746
1）を、LB−amp培地〔バクトトリプトン１％（W/V），
酵母エキス0.5％（W/V）,NaCl 0.5％（W/V），及びアン
ピシリン（50μg/ml）〕3mlにて温度37℃で18時間振盪
培養を行なった。この培養液0.5mlを10mlの上記LB−amp
培地に接種し、更に、これに、1mMのイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシドを添加し、温度37℃で４時間振
盪培養したのち、8,000r.p.m.で10分間の遠心分離操作
により、湿潤菌体20mgを得た。
回収した菌体を、0.1M KH2PO4（pH7.8）、2mM EDTA、1m
Mジチオスレイトール及び0.2mg/mlプロタミン硫酸から
なる緩衝液0.9mlに懸濁し、更に、これに、100μの10
mg/mlのリゾチーム溶液を添加し、氷中に15分間放置し
た。次に、この懸濁液を、メタノール・ドライアイス浴
中で凍結し、続いて温度25℃に放置し、完全に解凍し
た。更に、12,000r.p.m.で５分間遠心分離操作を行なう
ことにより上清として粗酵素液1mlを得た（特願昭62−1
87724号及び特願昭62−187725号）。
このようにして得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活
性の測定は、前記記載方法により行ない、その結果を下
表に示した。
また、比較のため、プラスミドpUC18DNAを有する大腸菌
JM101株〔大腸菌JM101（pUC18）〕についても同様にル
シフェラーゼ活性を測定し、その結果を下表に示した
（対照）。
上表より明らかな如く、本発明により得られる培養液の
フォトン数は先願発明及び対照に比し著しく増加してい
るため、本発明に用いた大腸菌菌体中に著量ルシフェラ
ーゼが生産されていることが判明した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、組み換え体プラスミドpALf 3DNAの制限酵素
による切断地図を示す図であり、第２図は、組み換え体
プラスミドpGLf 1DNAの制限酵素による切断地図を示す
図であり、第３図は、本発明に用いるルシフェラーゼ遺
伝子の塩基配列を示す図であり、第４図は、本発明に用
いるルシフェラーゼ遺伝子から翻訳されるポリペプチド
のアミノ酸配列を示す図であり、また、第５図は、組み
換え体プラスミドpGLf 37DNAの制限酵素による切断地図
を示す図である。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
    ルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入した組み換
    え体DNAを含み、ルシフェラーゼ生産能を有するエッシ
    ェリシア属に属する微生物を、培地に培養し、培養物よ
    りルシフェラーゼを採取することを特徴とするルシフェ
    ラーゼの製造法。
  2. 【請求項２】ルシフェラーゼ遺伝子が下記に示される塩
    基配列で表わされる請求項１記載のルシフェラーゼの製
    造法。
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