JPH082305B2 - 新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェラーゼの製造法 - Google Patents
新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェラーゼの製造法Info
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- JPH082305B2 JPH082305B2 JP63162402A JP16240288A JPH082305B2 JP H082305 B2 JPH082305 B2 JP H082305B2 JP 63162402 A JP63162402 A JP 63162402A JP 16240288 A JP16240288 A JP 16240288A JP H082305 B2 JPH082305 B2 JP H082305B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な組み換え体DNA及び該DNAを用いるル
シフェラーゼの製造法に関する。
シフェラーゼの製造法に関する。
ルシオラ（Luciola）属ホタルのルシフェラーゼは、
収集されたルシオラ属ホタルより分離、精製されて得ら
れているに過ぎない〔「プロク・ナトル・アカド・サ
イ」（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第74巻、第７号、第279
9〜2802頁（1977）〕。
収集されたルシオラ属ホタルより分離、精製されて得ら
れているに過ぎない〔「プロク・ナトル・アカド・サ
イ」（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第74巻、第７号、第279
9〜2802頁（1977）〕。
上記ルシフェラーゼは、例えば、ATPの定量用酵素と
して極めて有用な酵素である。
して極めて有用な酵素である。
しかしながら、上記ルシフェラーゼは、昆虫由来であ
るため、その製造には、ルシオラ属ホタルを自然界より
採取するか、あるいは、該ホタルを養殖し、得られた該
ホタルよりルシフェラーゼを分離、精製しなければなら
ず、その製造には、多大な時間と労力を要するものであ
った。
るため、その製造には、ルシオラ属ホタルを自然界より
採取するか、あるいは、該ホタルを養殖し、得られた該
ホタルよりルシフェラーゼを分離、精製しなければなら
ず、その製造には、多大な時間と労力を要するものであ
った。
そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種
々検討した結果、ルシオラ・ラテラリス（Luciola late
ralis）由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含
有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを
得、この組み換え体DNAをエッシェリシア（Escherichi
a）属に属する微生物に含ませ、該微生物を培地に培養
することにより、短期間のうちに効率よくルシフェラー
ゼが生産されること等の知見を得、本発明を完成した。
々検討した結果、ルシオラ・ラテラリス（Luciola late
ralis）由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含
有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを
得、この組み換え体DNAをエッシェリシア（Escherichi
a）属に属する微生物に含ませ、該微生物を培地に培養
することにより、短期間のうちに効率よくルシフェラー
ゼが生産されること等の知見を得、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ルシオラ・ラテラリス（Luciola
lateralis）由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子
を含み、下記の制限酵素地図を有し、且つその塩基長が
2,000bpであるDNAをベクターDNAに挿入したことを特徴
とする新規な組み換え体DNAである。
lateralis）由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子
を含み、下記の制限酵素地図を有し、且つその塩基長が
2,000bpであるDNAをベクターDNAに挿入したことを特徴
とする新規な組み換え体DNAである。
（式中、EIはEcoRI,SはSspI,EVはEcoRV,AはApaI,HはHpa
Iをそれぞれ示す） また本発明は、前記組み換え体DNAを含むエッシェリ
シア属に属する微生物を培地中で培養し、該培養物より
ルシフェラーゼを採取することを特徴とするルシフェラ
ーゼの製造法である。
Iをそれぞれ示す） また本発明は、前記組み換え体DNAを含むエッシェリ
シア属に属する微生物を培地中で培養し、該培養物より
ルシフェラーゼを採取することを特徴とするルシフェラ
ーゼの製造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、ルシオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）
（ヘイケボタル）のルシフェラーゼをコードする遺伝子
を含有するDNAを検索する際、プローブとしてホタルの
１種である同属のルシオラ・クルシアタ（Luciola cruc
iata）（ゲンジボタル）のルシフェラーゼをコードする
遺伝子を含有するDNAを使用し、また、ルシオラ・クル
シアタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する
DNAを検索する際、プローブとしてホタルの１種である
フォテイナス・ピラリス（Photinus pyralis）（アメリ
カホタル）のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有
するDNAを使用する。
（ヘイケボタル）のルシフェラーゼをコードする遺伝子
を含有するDNAを検索する際、プローブとしてホタルの
１種である同属のルシオラ・クルシアタ（Luciola cruc
iata）（ゲンジボタル）のルシフェラーゼをコードする
遺伝子を含有するDNAを使用し、また、ルシオラ・クル
シアタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する
DNAを検索する際、プローブとしてホタルの１種である
フォテイナス・ピラリス（Photinus pyralis）（アメリ
カホタル）のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有
するDNAを使用する。
従って、以下に先ずフォティナス・ピラリスのルシフ
ェラーゼをコードする遺伝子の調製法について述べ、次
に、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）のルシ
フェラーゼをコードする遺伝子の調製法について述べ、
最後に、ルシオラ・ラテラリスのルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の調製法について述べる。
ェラーゼをコードする遺伝子の調製法について述べ、次
に、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）のルシ
フェラーゼをコードする遺伝子の調製法について述べ、
最後に、ルシオラ・ラテラリスのルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の調製法について述べる。
ホタルの１種であるフォティナス・ピラリスの尾部よ
りｍ−RNAを調製するには、例えば、「モレキュラー・
クローニング」（Molecular Cloning）、第196頁、「コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー」（Cold
Spring Harbor Laboratory）（1982）及び「分子遺伝
学実験法」小関治男、志村令郎、第66〜67頁（1983）記
載の方法等により得ることができる。
りｍ−RNAを調製するには、例えば、「モレキュラー・
クローニング」（Molecular Cloning）、第196頁、「コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー」（Cold
Spring Harbor Laboratory）（1982）及び「分子遺伝
学実験法」小関治男、志村令郎、第66〜67頁（1983）記
載の方法等により得ることができる。
得られたｍ−RNAよりルシフェラーゼをコードするｍ
−RNAを濃縮するには、例えば、「バイオメディカル・
リサーチ」（Biomedical Research）、第３巻、第534〜
540頁（1982）記載の方法により行なうことができる。
−RNAを濃縮するには、例えば、「バイオメディカル・
リサーチ」（Biomedical Research）、第３巻、第534〜
540頁（1982）記載の方法により行なうことができる。
なお、この際、ルシフェラーゼに対する抗ルシフェラ
ーゼ血清を使用するのであるが、該血清は、例えば、
「免疫化学」山村雄一、第43〜50頁（1973）記載の方法
により得ることができる。
ーゼ血清を使用するのであるが、該血清は、例えば、
「免疫化学」山村雄一、第43〜50頁（1973）記載の方法
により得ることができる。
ルシフェラーゼをコードするｍ−RNAよりｃ−DNAを合
成するには、例えば、「モル・セル・バイオル」（Mol.
Cell.Biol）、第２巻、第161頁（1982）及びジーン（Ge
ne）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法により行な
うことができる。
成するには、例えば、「モル・セル・バイオル」（Mol.
Cell.Biol）、第２巻、第161頁（1982）及びジーン（Ge
ne）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法により行な
うことができる。
次いで、このようにして得られたｃ−DNAをベクターD
NA、例えば、プラスミドpMCE10DNA,プラスミドpKN305
〔「アグル・バイオル・ケム」（Agr.Biol.Chem.）、第
50巻、第271頁（1986）記載の大腸菌トリプトファンオ
ペロンのプロモーターを有するプラスミド〕及びプラス
ミドpMC1843〔「メソズ・イン・エンザイモロジー」（M
ethodsin Enzymology）、第100巻、第293〜308頁（198
3）記載の大腸菌β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を有
するプラスミド〕を用いて作製したプラスミド］等に組
み込み、種々の組み換え体プラスミドDNAを得、該DNAを
用いて例えば、大腸菌（E.Coli）DH1（ATCC33849）、大
腸菌（E.coli）HB101（ATCC33694）等をハナハン（Hana
han）の方法〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA
Cloning）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により形
質転換し、種々の形質転換株を得る。
NA、例えば、プラスミドpMCE10DNA,プラスミドpKN305
〔「アグル・バイオル・ケム」（Agr.Biol.Chem.）、第
50巻、第271頁（1986）記載の大腸菌トリプトファンオ
ペロンのプロモーターを有するプラスミド〕及びプラス
ミドpMC1843〔「メソズ・イン・エンザイモロジー」（M
ethodsin Enzymology）、第100巻、第293〜308頁（198
3）記載の大腸菌β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を有
するプラスミド〕を用いて作製したプラスミド］等に組
み込み、種々の組み換え体プラスミドDNAを得、該DNAを
用いて例えば、大腸菌（E.Coli）DH1（ATCC33849）、大
腸菌（E.coli）HB101（ATCC33694）等をハナハン（Hana
han）の方法〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA
Cloning）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により形
質転換し、種々の形質転換株を得る。
なお、このようにして得られた形質転換株の有する組
み換え体プラスミドDNAは、大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ構造遺伝子の途中にｃ−DNAが組み込まれたプラスミ
ドであって、ｃ−DNAによりコードされているペプチド
は、β−ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として発現
するものである。
み換え体プラスミドDNAは、大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ構造遺伝子の途中にｃ−DNAが組み込まれたプラスミ
ドであって、ｃ−DNAによりコードされているペプチド
は、β−ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として発現
するものである。
上記の種々な形質転換株よりルシフェラーゼをコード
するｃ−DNAを検出するには、形質転換株を培養するこ
とにより、菌体蛋白質を発現させ、抗ルシフェラーゼ血
清と交差する蛋白質が存在するか否かにより検出するこ
とができ、例えば、「アグリック・バイオル・ケム」
（Agric.Biol.Chem.）、第50巻、第271頁（1986）及び
「アナル・バイオケム」（Anal.Biochem.）、第112巻、
第195頁（1981）記載の方法等により行なうことができ
る。
するｃ−DNAを検出するには、形質転換株を培養するこ
とにより、菌体蛋白質を発現させ、抗ルシフェラーゼ血
清と交差する蛋白質が存在するか否かにより検出するこ
とができ、例えば、「アグリック・バイオル・ケム」
（Agric.Biol.Chem.）、第50巻、第271頁（1986）及び
「アナル・バイオケム」（Anal.Biochem.）、第112巻、
第195頁（1981）記載の方法等により行なうことができ
る。
次いで、不完全なルシフェラーゼのｃ−DNAを32Pを用
いニックトランスレーション法〔「モレキュラー・クロ
ーニング」（Molecular Cloning）、第109〜112頁、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S
pring Habor Laboratory）、（1982）及び「ジェイ・モ
ル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第23〜251
頁（1977）〕により標識したのち、該ｃ−DNAをプロー
ブとしてコロニーハイブリダイゼイション法〔「蛋白
質、核酸、酵素」第26巻、第575〜579頁（1981）〕によ
りプラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）をベクターとして
作成したｃ−DNAのジーンバンクのライブラリーより1.8
Kbのルシフェラーゼをコードするｃ−DNAを含有するプ
ラスミドDNAを得ることができる。
いニックトランスレーション法〔「モレキュラー・クロ
ーニング」（Molecular Cloning）、第109〜112頁、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S
pring Habor Laboratory）、（1982）及び「ジェイ・モ
ル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第23〜251
頁（1977）〕により標識したのち、該ｃ−DNAをプロー
ブとしてコロニーハイブリダイゼイション法〔「蛋白
質、核酸、酵素」第26巻、第575〜579頁（1981）〕によ
りプラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）をベクターとして
作成したｃ−DNAのジーンバンクのライブラリーより1.8
Kbのルシフェラーゼをコードするｃ−DNAを含有するプ
ラスミドDNAを得ることができる。
そして、このようにして得られた組み換え体プラスミ
ドDNAよりフォティナス・ピラリス由来のルシフェラー
ゼをコードする遺伝子を含有するDNAを得るには、該プ
ラスミドDNAに、制限酵素、例えばEcoRI及びClaIを温度
30〜40℃、好ましくは37℃で１〜24時間、好ましくは２
時間作用させ得られる反応終了液を、アガロースゲル電
気泳動法〔「モレキュラー・クローニング」（Molecula
r Cloning）、第150頁、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）
（1982）記載〕で処理することにより得ることができ
る。
ドDNAよりフォティナス・ピラリス由来のルシフェラー
ゼをコードする遺伝子を含有するDNAを得るには、該プ
ラスミドDNAに、制限酵素、例えばEcoRI及びClaIを温度
30〜40℃、好ましくは37℃で１〜24時間、好ましくは２
時間作用させ得られる反応終了液を、アガロースゲル電
気泳動法〔「モレキュラー・クローニング」（Molecula
r Cloning）、第150頁、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）
（1982）記載〕で処理することにより得ることができ
る。
次に、ルシオラ・クルシアタのルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の調製法等について述べる。
ドする遺伝子の調製法等について述べる。
ルシオラ・クルシアタの尾部からのｍ−RNAの調製及
びｍ−RNAからのｃ−DNAの合成は、例えば、上述したフ
ォティナス・ピラリスのｍ−RNAの調製法及びｃ−DNAの
合成法と全く同様にして行なうことができる。
びｍ−RNAからのｃ−DNAの合成は、例えば、上述したフ
ォティナス・ピラリスのｍ−RNAの調製法及びｃ−DNAの
合成法と全く同様にして行なうことができる。
次いで、このようにして得られたｃ−DNAをベクターD
NA、例えば、プラスミドpUC19DNA等に組み込み、種々の
組み換え体プラスミドDNAを得、該DNAを用いて例えば、
大腸菌（E.coli）DH1（ATCC33849）、大腸菌（E.coli）
HB101（ATCC33694）等をハナハン（Hanahan）の方法
〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により形質転換
し、種々の形質転換株を得る。
NA、例えば、プラスミドpUC19DNA等に組み込み、種々の
組み換え体プラスミドDNAを得、該DNAを用いて例えば、
大腸菌（E.coli）DH1（ATCC33849）、大腸菌（E.coli）
HB101（ATCC33694）等をハナハン（Hanahan）の方法
〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により形質転換
し、種々の形質転換株を得る。
次いで、フォティナス・ピラリス由来のルシフェラー
ゼをコードする遺伝子を含有するDNAを32Pを用いニック
トランスレーション法〔「モレキュラー・クローニン
グ」（Molecular Cloning）、第109〜112頁、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Habor Laboratory）（1982）及び「ジェイ・モル・バイ
オル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237〜251頁（197
7）〕により標識したのち、該ｃ−DNAをプローブとした
コロニーハイブリダイゼイション法〔「蛋白質・核酸・
酵素」第26巻、第575〜579頁（1981）〕により、プラス
ミドpUC19DNAをベクターとして作成したルシオラ・クル
シアタ由来のｃ−DNAのジーンバンクのライブラリーよ
りルシフェラーゼをコードするｃ−DNA（2.0Kb）を含有
するプラスミドDNAを含有する大腸菌を得ることができ
る。
ゼをコードする遺伝子を含有するDNAを32Pを用いニック
トランスレーション法〔「モレキュラー・クローニン
グ」（Molecular Cloning）、第109〜112頁、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Habor Laboratory）（1982）及び「ジェイ・モル・バイ
オル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237〜251頁（197
7）〕により標識したのち、該ｃ−DNAをプローブとした
コロニーハイブリダイゼイション法〔「蛋白質・核酸・
酵素」第26巻、第575〜579頁（1981）〕により、プラス
ミドpUC19DNAをベクターとして作成したルシオラ・クル
シアタ由来のｃ−DNAのジーンバンクのライブラリーよ
りルシフェラーゼをコードするｃ−DNA（2.0Kb）を含有
するプラスミドDNAを含有する大腸菌を得ることができ
る。
このようにして得られた微生物より純化された組み換
え体DNAを得るには、例えば、「プロク・ナトル・アカ
ド・サイ」（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第62巻、第1159
〜1166頁（1969）記載の方法などにより得ることができ
る。
え体DNAを得るには、例えば、「プロク・ナトル・アカ
ド・サイ」（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第62巻、第1159
〜1166頁（1969）記載の方法などにより得ることができ
る。
そして、このようにして得られた組み換え体プラスミ
ドDNAよりルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するDNAを得るには、該プラ
スミドDNAに、制限酵素、例えばPstＩを温度30〜40℃、
好ましくは37℃で１時〜24時間、好ましくは２時間作用
させて反応終了液を、アガロースゲル電気泳動法〔「モ
レキュラー・クローニング」（Molecular Cloning）、
第150頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）記
載〕で処理することにより得ることができる。
ドDNAよりルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するDNAを得るには、該プラ
スミドDNAに、制限酵素、例えばPstＩを温度30〜40℃、
好ましくは37℃で１時〜24時間、好ましくは２時間作用
させて反応終了液を、アガロースゲル電気泳動法〔「モ
レキュラー・クローニング」（Molecular Cloning）、
第150頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）記
載〕で処理することにより得ることができる。
次に、ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼを
コードする遺伝子の調製法等について述べる。
コードする遺伝子の調製法等について述べる。
ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼをコード
するｍ−RNAは、ルシオラ・ラテラリス尾部に存在する
ため該尾部は、ｍ−RNA採取源として好ましい。
するｍ−RNAは、ルシオラ・ラテラリス尾部に存在する
ため該尾部は、ｍ−RNA採取源として好ましい。
ルシオラ・ラテラリスの尾部からのｍ−RNAの調製及
びｍ−RNAからのｃ−DNAの合成は、例えば、上述したフ
ォティナス・ピラリスのｍ−RNAの調製法及びｃ−DNAの
合成法と全く同様にして行なうことができる。
びｍ−RNAからのｃ−DNAの合成は、例えば、上述したフ
ォティナス・ピラリスのｍ−RNAの調製法及びｃ−DNAの
合成法と全く同様にして行なうことができる。
次いで、このようにして得られたｃ−DNAをベクターD
NA、例えば、プラスミドpUC119DNA等に組み込み、種々
の組み換え体プラスミドDNAを得、該DNAを用いて例え
ば、大腸菌（E.coli）DH1（ATCC33849）、大腸菌（E.co
li）HB101（ATCC33694）等をハナハン（Hanahan）の方
法〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により形質転換
し、種々の形質転換株を得る。
NA、例えば、プラスミドpUC119DNA等に組み込み、種々
の組み換え体プラスミドDNAを得、該DNAを用いて例え
ば、大腸菌（E.coli）DH1（ATCC33849）、大腸菌（E.co
li）HB101（ATCC33694）等をハナハン（Hanahan）の方
法〔「ディーエヌエイ・クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により形質転換
し、種々の形質転換株を得る。
次いで、前述の如くして得られたルシオラ・クルシア
タ由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する
DNAを32Pを用いニックトランスレーション法〔「「モレ
キュラー・クローニング」（Molecular Cloning）、第1
09〜112頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Cold Spring Habor Laboratory）（1982）及び
「ジェイ・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113
巻、第237〜251頁（1977）〕により標識したのち、該ｃ
−DNAをプローブとしたコロニーハイブリダイゼイショ
ン法〔「蛋白質・核酸・酵素」第26巻、第575〜579頁
（1981）〕により、プラスミドpUC119DNAをベクターと
して作成したルシオラ・ラテラリス由来のｃ−DNAのジ
ーンバンクのライブラリーよりルシフェラーゼをコード
するｃ−DNA（2.0Kb）を含有するプラスミドDNAを含有
する大腸菌を得ることができる。
タ由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する
DNAを32Pを用いニックトランスレーション法〔「「モレ
キュラー・クローニング」（Molecular Cloning）、第1
09〜112頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Cold Spring Habor Laboratory）（1982）及び
「ジェイ・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113
巻、第237〜251頁（1977）〕により標識したのち、該ｃ
−DNAをプローブとしたコロニーハイブリダイゼイショ
ン法〔「蛋白質・核酸・酵素」第26巻、第575〜579頁
（1981）〕により、プラスミドpUC119DNAをベクターと
して作成したルシオラ・ラテラリス由来のｃ−DNAのジ
ーンバンクのライブラリーよりルシフェラーゼをコード
するｃ−DNA（2.0Kb）を含有するプラスミドDNAを含有
する大腸菌を得ることができる。
このようにして得られた微生物より純化された組み換
え体DNAを得るには、例えば、「プロク・ナトル・アカ
ド・サイ」（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第62巻、第1159
〜1166頁（1969）記載の方法などにより得ることができ
る。
え体DNAを得るには、例えば、「プロク・ナトル・アカ
ド・サイ」（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第62巻、第1159
〜1166頁（1969）記載の方法などにより得ることができ
る。
次いで、上記微生物を培地中で培養し、培養物よりル
シフェラーゼを採取する。
シフェラーゼを採取する。
培地としては、例えば、エッシェリア属に属する微生
物の培養に用いられるものであれば、何如なるものでも
よく、例えば、トリプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5
％（W/V）、NaCl0.5％（W/V）及び1mMのイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド等が挙げられる。
物の培養に用いられるものであれば、何如なるものでも
よく、例えば、トリプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5
％（W/V）、NaCl0.5％（W/V）及び1mMのイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド等が挙げられる。
また、培養温度は、例えば、30〜40℃、好ましくは37
℃程度で、培養時間は、例えば、４〜８時間、好ましく
は４時間程度である。
℃程度で、培養時間は、例えば、４〜８時間、好ましく
は４時間程度である。
そして、培養物より菌体を例えば、8,000r.p.m.で10
分間程度の遠心分離処理により集菌し、得られた菌体
を、例えば、「メソズ・イン・エンザイモロジー」（Me
thods in Enzymology）第133巻、第３〜14頁（1986）記
載の方法により破砕し、粗酵素液を得る。
分間程度の遠心分離処理により集菌し、得られた菌体
を、例えば、「メソズ・イン・エンザイモロジー」（Me
thods in Enzymology）第133巻、第３〜14頁（1986）記
載の方法により破砕し、粗酵素液を得る。
そして、粗酵素液は、そのままでも使用可能である
が、必要により硫安分画，疎水クロマトグラフ法、例え
ば、ブチル−トヨパール650C等，ゲル濾過法、例えば、
ウルトロゲルAcA34等により精製して、純化されたルシ
フェラーゼを得る。
が、必要により硫安分画，疎水クロマトグラフ法、例え
ば、ブチル−トヨパール650C等，ゲル濾過法、例えば、
ウルトロゲルAcA34等により精製して、純化されたルシ
フェラーゼを得る。
このようにして得られたルシフェラーゼの理化学的性
質は、以下に示す通りである。
質は、以下に示す通りである。
作用： 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるル
シフェリンの酸化を触媒する酵素である。
シフェリンの酸化を触媒する酵素である。
基質特異性： ADP、CTP、UTO及びGTPには作用しない。
至適pH及び安定pH範囲： 至適pHは、ルシフェリンを基質とし、25mMグルシルグリ
シンのpHをpH6.5〜11.5迄変化させ、温度30℃で反応さ
せ、20秒間発光量（フォトン数）を測定した場合、第１
図に示す如くpH7.5〜9.5であり、また安定pH範囲は、ル
シフェリンを含有する緩衝液（pH4.6〜8.0:25mMリン酸
緩衝液、pH8.0〜11.5:25mMグリシン・塩化ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用。なお、それぞ
れの緩衝液には10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを
添加したものである。）に酵素を添加し、温度０℃で４
時間作用させた場合、第２図に示す如く、6.0〜10.5で
ある。なお、第２図において、 は、それぞれ25mMリン酸緩衝液、及び25mMグリシン・塩
化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合
の活性を示す。
シンのpHをpH6.5〜11.5迄変化させ、温度30℃で反応さ
せ、20秒間発光量（フォトン数）を測定した場合、第１
図に示す如くpH7.5〜9.5であり、また安定pH範囲は、ル
シフェリンを含有する緩衝液（pH4.6〜8.0:25mMリン酸
緩衝液、pH8.0〜11.5:25mMグリシン・塩化ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用。なお、それぞ
れの緩衝液には10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを
添加したものである。）に酵素を添加し、温度０℃で４
時間作用させた場合、第２図に示す如く、6.0〜10.5で
ある。なお、第２図において、 は、それぞれ25mMリン酸緩衝液、及び25mMグリシン・塩
化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合
の活性を示す。
力価の測定法： 25mMグリシルグリシン（pH7.8）8ml、硫酸マグネシウム
溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）に硫酸マグネシ
ウムを0.1Mとなる如く添加した溶液〕0.5ml及びルシフ
ェリン溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）にルシフ
ェリンを1mMとなる如く添加した溶液〕0.8mlを混合して
ルシフェリン混合液を調製する。
溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）に硫酸マグネシ
ウムを0.1Mとなる如く添加した溶液〕0.5ml及びルシフ
ェリン溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）にルシフ
ェリンを1mMとなる如く添加した溶液〕0.8mlを混合して
ルシフェリン混合液を調製する。
このようにして得たルシフェリン混合液400μｌ及び
測定するルシフェラーゼ10μｌを混合したものに、ATP
溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）にATPを10mMとな
る如く添加したもの。〕80μｌを注入すると同時に、ル
ミノメーター（アロカ社製、ルミネッセンスリーダBLR
−201）により発生するフォトン数を20秒間積算して求
める。
測定するルシフェラーゼ10μｌを混合したものに、ATP
溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）にATPを10mMとな
る如く添加したもの。〕80μｌを注入すると同時に、ル
ミノメーター（アロカ社製、ルミネッセンスリーダBLR
−201）により発生するフォトン数を20秒間積算して求
める。
作用適温の範囲： pH7.8のもとに、各温度で反応させ20秒間発光量（フ
ォトン数）を測定した場合、０〜50℃の範囲内にある。
ォトン数）を測定した場合、０〜50℃の範囲内にある。
pHによる失活の条件： pH5.0以下及びpH12.0以上で４時間後完全に失活す
る。
る。
上述したことから明らかな如く、本発明によれば、本
発明の新規な組み換え体DNAを含むエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養することにより、極めて短期
間のうちに、ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラー
ゼを効率よく製造することができるので、本発明は産業
上極めて有用である。
発明の新規な組み換え体DNAを含むエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養することにより、極めて短期
間のうちに、ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラー
ゼを効率よく製造することができるので、本発明は産業
上極めて有用である。
以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。
実施例 なお、以下に述べる項目１〜10には、ホタルの１種で
あるフォティナス・ピラリスのルシフェラーゼをコード
する遺伝子を含有するDNA（該DNAは、ルシオラ・クルシ
アタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有するDN
Aを検索する際、プローブとして使用されるものであ
る。）の調製について述べ、また、以下の項目11〜13に
は、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子を含有するDNA（該DNAは、ルシオラ・ラテ
ラリスのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する
DNAを検索する際、プローブとして使用されるものであ
る。）の調製について述べる。
あるフォティナス・ピラリスのルシフェラーゼをコード
する遺伝子を含有するDNA（該DNAは、ルシオラ・クルシ
アタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有するDN
Aを検索する際、プローブとして使用されるものであ
る。）の調製について述べ、また、以下の項目11〜13に
は、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子を含有するDNA（該DNAは、ルシオラ・ラテ
ラリスのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する
DNAを検索する際、プローブとして使用されるものであ
る。）の調製について述べる。
1.m−RNAの調製 ホタルの１種であるフォティナス・ピラリス（Photin
us Pyralis）の乾燥尾部（シグマ社製）1gを乳鉢及び乳
棒を用いて充分破砕したものに、溶解緩衝液5ml〔20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）/10mM NaCl/3mM酢酸マグ
ネシウム/5％（W/V）ジョ糖/1.2％（V/V）トリトンＸ−
100/10mMバナジルヌクレオシド錯体（ニューイングラン
ド バイオラボ社製）〕を添加し、更に、上記と同様に
破砕してフォティナス・ピラリス尾部破砕物含有溶液を
得た。
us Pyralis）の乾燥尾部（シグマ社製）1gを乳鉢及び乳
棒を用いて充分破砕したものに、溶解緩衝液5ml〔20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）/10mM NaCl/3mM酢酸マグ
ネシウム/5％（W/V）ジョ糖/1.2％（V/V）トリトンＸ−
100/10mMバナジルヌクレオシド錯体（ニューイングラン
ド バイオラボ社製）〕を添加し、更に、上記と同様に
破砕してフォティナス・ピラリス尾部破砕物含有溶液を
得た。
このようにして得た溶液5mlを、カップ型ブレンダー
（日本精機製作所社製）に入れ、5,000r.p.m.で５分間
処理したものに、12mlのグアニジンイソチオシアネート
溶液（6Mグアニジンイソチオシアネート/37.5mMクエン
酸ナトリウム（pH7.0）/0.75％（W/V）Ｎ−ラウロイル
ザルコシンナトリウム/0.15Mβ−メルカプトエタノー
ル）を添加し、更に、上記ブレンダーを用い3,000r.p.
m.で10分間処理して得た溶液を、３重のガーゼを用いて
濾過し、濾液を得、超遠心分離機用チューブ（日立工機
社製）４本に、予め1.2mlの5.7Mの塩化セシウム溶液を
夫々重層し、その上に、上記濾液を重層するように夫々
分注し、超遠心分離機（日立工機社製、SCP55H）を用い
て温度15℃、30,000r.p.m.で16時間遠心分離して沈澱物
を得た。
（日本精機製作所社製）に入れ、5,000r.p.m.で５分間
処理したものに、12mlのグアニジンイソチオシアネート
溶液（6Mグアニジンイソチオシアネート/37.5mMクエン
酸ナトリウム（pH7.0）/0.75％（W/V）Ｎ−ラウロイル
ザルコシンナトリウム/0.15Mβ−メルカプトエタノー
ル）を添加し、更に、上記ブレンダーを用い3,000r.p.
m.で10分間処理して得た溶液を、３重のガーゼを用いて
濾過し、濾液を得、超遠心分離機用チューブ（日立工機
社製）４本に、予め1.2mlの5.7Mの塩化セシウム溶液を
夫々重層し、その上に、上記濾液を重層するように夫々
分注し、超遠心分離機（日立工機社製、SCP55H）を用い
て温度15℃、30,000r.p.m.で16時間遠心分離して沈澱物
を得た。
得られた沈澱物を、冷70％（V/V）エタノールを用い
て洗浄したものを、10mMトリス緩衝液〔10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.4）/5mMEDTA/1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕4mlに懸濁したものに、同量のｎ−ブタノール及び
クロロフォルムを４対１（容量比）となる如く混合した
ものを添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.で10分
間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機
溶媒層に上記10mMトリス緩衝液4mlを添加し、上記抽出
及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得られた水
層に、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び２倍量
の冷エタノールを添加したものを温度−20℃で２時間放
置したのち、常法により8,000r.p.m.で20分間遠心分離
し、RNAを沈澱させ、得られたRNAを4mlの水に溶解し、
上記エタノール沈澱操作を行なったのち、得られたRNA
を1mlの水に溶解し、3.75mgのRNAを得た。
て洗浄したものを、10mMトリス緩衝液〔10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.4）/5mMEDTA/1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕4mlに懸濁したものに、同量のｎ−ブタノール及び
クロロフォルムを４対１（容量比）となる如く混合した
ものを添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.で10分
間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機
溶媒層に上記10mMトリス緩衝液4mlを添加し、上記抽出
及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得られた水
層に、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び２倍量
の冷エタノールを添加したものを温度−20℃で２時間放
置したのち、常法により8,000r.p.m.で20分間遠心分離
し、RNAを沈澱させ、得られたRNAを4mlの水に溶解し、
上記エタノール沈澱操作を行なったのち、得られたRNA
を1mlの水に溶解し、3.75mgのRNAを得た。
そして、以上の操作を再度繰り返すことにより合計7m
gのRNAを調製し、このRNA中よりｍ−RNAを選択するため
に、7mgのRNAを、オリゴ（dT）−セルロース（ニューイ
ングランドバイオラボ社製）カラムクロマトグラムにか
けた。
gのRNAを調製し、このRNA中よりｍ−RNAを選択するため
に、7mgのRNAを、オリゴ（dT）−セルロース（ニューイ
ングランドバイオラボ社製）カラムクロマトグラムにか
けた。
カラムとして2.5mlテルモシリンジ（テルモ社製）を
用い、樹脂0.5gは、溶出緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH7.6）/1mMDETA/0.1％（W/V）ドデシル硫酸ナトリ
ウム〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液
〔10mMトリス−塩酸（pH7.6）/1mMEDTA/0.4M NaCl/0.1
％ドデシル硫酸ナトリウム〕で平衡化したものである。
用い、樹脂0.5gは、溶出緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH7.6）/1mMDETA/0.1％（W/V）ドデシル硫酸ナトリ
ウム〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液
〔10mMトリス−塩酸（pH7.6）/1mMEDTA/0.4M NaCl/0.1
％ドデシル硫酸ナトリウム〕で平衡化したものである。
7mgのRNAに、同量の緩衝液〔10mMトリス−塩酸（pH7.
6）/1mMEDTA/0.8M NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕を添加し、温度65℃で10分間加熱処理し、氷中で急
冷し、オリゴ（dT）−セルロースカラムにかけたのち、
結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−RNA及びｔ−R
NAを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−RNAを溶出
し、40μｇのｍ−RNAを得た。
6）/1mMEDTA/0.8M NaCl/0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕を添加し、温度65℃で10分間加熱処理し、氷中で急
冷し、オリゴ（dT）−セルロースカラムにかけたのち、
結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−RNA及びｔ−R
NAを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−RNAを溶出
し、40μｇのｍ−RNAを得た。
2.ルシフェラーゼｍ−RNAの濃縮 次に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりルシフェラー
ゼｍ−RNAを濃縮した。
ゼｍ−RNAを濃縮した。
10〜25％（W/V）のショ糖密度勾配は、ベックマン社
製のローターSW41用ポリアロマチューブに40％（W/V）
ショ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/20mM NaC
l/1mMEDTA/40％（W/V）ショ糖〕0.5mlを入れ、その上に
2.4mlずつ25％（W/V）、20％（W/V）、15％（W/V）及び
10％（W/V）のショ糖液を重層し、温度４℃で24時間放
置することにより作製した。このショ糖密度勾配に、ｍ
−RNA30μｇを重層し、ベックマン社製のSW41ローター
を用い、常法により30.000r.p.m.、温度18℃で18時間遠
心分離を行なった。遠心分離操作ののち、0.5mlずつ分
画し、エタノール沈澱法によりｍ−RNAを回収し、10μ
ｌの水に溶解した。
製のローターSW41用ポリアロマチューブに40％（W/V）
ショ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/20mM NaC
l/1mMEDTA/40％（W/V）ショ糖〕0.5mlを入れ、その上に
2.4mlずつ25％（W/V）、20％（W/V）、15％（W/V）及び
10％（W/V）のショ糖液を重層し、温度４℃で24時間放
置することにより作製した。このショ糖密度勾配に、ｍ
−RNA30μｇを重層し、ベックマン社製のSW41ローター
を用い、常法により30.000r.p.m.、温度18℃で18時間遠
心分離を行なった。遠心分離操作ののち、0.5mlずつ分
画し、エタノール沈澱法によりｍ−RNAを回収し、10μ
ｌの水に溶解した。
次に、ｍ−RNAにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、ルシフェラーゼのｍ−RNAが濃縮されている
画分の同定を行なった。分画したRNA1μｌ、ウサギ網状
赤血球ライセート（アマシャム社製）９μｌ及び
〔35S〕メチオニン１μｌ（アマシャム社製）を混合
し、温度30℃で30分間反応させたものに、150μｌのNET
緩衝液〔150mM NaCl/5mMEDTA/0.02％（W/V）NaN3/20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）/0.05％（W/V）ノニデッ
トＰ−40（ベセスダリサーチラボラトリー社製、界面活
性剤）〕を添加し、更に、１μｌの抗ルシフェラーゼ血
清（後述のようにして調製したもの。）を添加し、温度
４℃で18時間放置したものに、10mgのプロティンＡセフ
ァロース（ファルマシア社製）を添加し、温度20℃で30
分間放置したものを、常法により12,000r.p.m.で１分間
遠心分離処理し、樹脂を回収した。
とにより、ルシフェラーゼのｍ−RNAが濃縮されている
画分の同定を行なった。分画したRNA1μｌ、ウサギ網状
赤血球ライセート（アマシャム社製）９μｌ及び
〔35S〕メチオニン１μｌ（アマシャム社製）を混合
し、温度30℃で30分間反応させたものに、150μｌのNET
緩衝液〔150mM NaCl/5mMEDTA/0.02％（W/V）NaN3/20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）/0.05％（W/V）ノニデッ
トＰ−40（ベセスダリサーチラボラトリー社製、界面活
性剤）〕を添加し、更に、１μｌの抗ルシフェラーゼ血
清（後述のようにして調製したもの。）を添加し、温度
４℃で18時間放置したものに、10mgのプロティンＡセフ
ァロース（ファルマシア社製）を添加し、温度20℃で30
分間放置したものを、常法により12,000r.p.m.で１分間
遠心分離処理し、樹脂を回収した。
回収した樹脂を、200μｌのNET緩衝液で３回洗浄し、
この樹脂に、40μｌのSDS−PAGE用サンプル緩衝液〔62.
5mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/10％（V/V）グリセロ
ール/2％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム/5％（V/V）メ
ルカプトエタノール/0.02％（W/V）ブロムフェノールブ
ルー〕を添加し、温度100℃で３分間煮沸し、常法によ
り12,000r.p.m.で１分間遠心分離処理し、上清を回収
し、全量を7.5％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム−ボリ
アクリルアミドゲルに乗せた。
この樹脂に、40μｌのSDS−PAGE用サンプル緩衝液〔62.
5mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/10％（V/V）グリセロ
ール/2％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム/5％（V/V）メ
ルカプトエタノール/0.02％（W/V）ブロムフェノールブ
ルー〕を添加し、温度100℃で３分間煮沸し、常法によ
り12,000r.p.m.で１分間遠心分離処理し、上清を回収
し、全量を7.5％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム−ボリ
アクリルアミドゲルに乗せた。
ゲル電気泳動は、ラエムリ（Laemmli）の方法〔「ネ
ーチュアー」（Nature）、第227頁、第680頁（1970）〕
で行ない、泳動したのちのゲルは、10％（V/V）の酢酸
に30分間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水に30分間浸
漬し、更に、1Mサリチル酸ナトリウム溶液に30分間浸漬
し、乾燥して乾燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フ
ィルム社製、RX）を用いてフルオログラフィーを行なっ
た。
ーチュアー」（Nature）、第227頁、第680頁（1970）〕
で行ない、泳動したのちのゲルは、10％（V/V）の酢酸
に30分間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水に30分間浸
漬し、更に、1Mサリチル酸ナトリウム溶液に30分間浸漬
し、乾燥して乾燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フ
ィルム社製、RX）を用いてフルオログラフィーを行なっ
た。
以上の操作により、ルシフェラーゼｍ−RNAの存在す
る画分のRNAを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ蛋白
質のバンドがＸ線フィルム上に認められ、ルシフェラー
ゼｍ−RNAの濃縮されている画分が同定できた。
る画分のRNAを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ蛋白
質のバンドがＸ線フィルム上に認められ、ルシフェラー
ゼｍ−RNAの濃縮されている画分が同定できた。
3.抗血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラー
ゼ血清は、以下の方法により調製した。
ゼ血清は、以下の方法により調製した。
3.2mg/ml濃度のルシフェラーゼ溶液〔シグマ社製ルシ
フェラーゼを0.5Mグリシルグリシン溶液（pH7.8）に溶
解したもの〕0.7mlを、等量のフレンド（Freund）完全
アジェバントで懸濁したもの2.24mgを、抗原として体重
2kgの日本白色種ウサギの指掌部に投与し、飼育２週間
経過したのち、初回と同量の抗原を背部皮内へ投与し、
更に、飼育１週間経過したのち、同様の操作を行ない、
また更に、飼育１週間後全採血を行なった。
フェラーゼを0.5Mグリシルグリシン溶液（pH7.8）に溶
解したもの〕0.7mlを、等量のフレンド（Freund）完全
アジェバントで懸濁したもの2.24mgを、抗原として体重
2kgの日本白色種ウサギの指掌部に投与し、飼育２週間
経過したのち、初回と同量の抗原を背部皮内へ投与し、
更に、飼育１週間経過したのち、同様の操作を行ない、
また更に、飼育１週間後全採血を行なった。
そして、得られた血液を、温度４℃で18時間放置した
ものを、常法により3,000r.p.m.で15分間遠心分離し、
上清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。
ものを、常法により3,000r.p.m.で15分間遠心分離し、
上清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。
4.c−DNAの合成 ｃ−DNAの合成は、アマシャム社製キットを用いて行
なったものである。
なったものである。
上述の如くして得られたｍ−RNA2μｇを用いてアマシ
ャム社の指示する「モル・セル・バイオル」（Mol.Cell
Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及び「ジーン」（G
ene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に従い行な
った結果、300ngの２本鎖ｃ−DNAが得られた。
ャム社の指示する「モル・セル・バイオル」（Mol.Cell
Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及び「ジーン」（G
ene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に従い行な
った結果、300ngの２本鎖ｃ−DNAが得られた。
このｃ−DNA150ngを、７μｌのTE緩衝液〔10mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.5）/1mMEDTA〕に溶解したものに、1
1μｌの混液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.8）/60
mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕及
び3.8μｌのティリング混液〔10mMジチオスレイトール
7.5μl/10ng/mlポリ（poly）A1μl/5mMdCTP2μl/水110
μｌ〕を夫々添加し、更に、29ユニットのターミナルト
ランスフェラーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）を
添加し、温度30℃で10分間反応させたのち、2.4μｌの
0.25MEDTA及び2.4μｌの10％（W/V）ドデシル硫酸ナト
リウムを夫々添加して反応を停止させた。
−塩酸緩衝液（pH7.5）/1mMEDTA〕に溶解したものに、1
1μｌの混液〔280mMカコジル酸ナトリウム（pH6.8）/60
mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕及
び3.8μｌのティリング混液〔10mMジチオスレイトール
7.5μl/10ng/mlポリ（poly）A1μl/5mMdCTP2μl/水110
μｌ〕を夫々添加し、更に、29ユニットのターミナルト
ランスフェラーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）を
添加し、温度30℃で10分間反応させたのち、2.4μｌの
0.25MEDTA及び2.4μｌの10％（W/V）ドデシル硫酸ナト
リウムを夫々添加して反応を停止させた。
反応停止液に25μｌの水飽和フェノールを用いて除蛋
白処理を行なったのち、回収した水層に、25μｌの4M酢
酸アンモニウム及び100μｌの冷エタノールを夫々添加
し、温度−70℃で15分間放置し、12,000r.p.m.で10分間
遠心分離してｃ−DNAを回収し、10μｌのTE緩衝液に溶
解し、ｃ−DNA溶解液を得た。
白処理を行なったのち、回収した水層に、25μｌの4M酢
酸アンモニウム及び100μｌの冷エタノールを夫々添加
し、温度−70℃で15分間放置し、12,000r.p.m.で10分間
遠心分離してｃ−DNAを回収し、10μｌのTE緩衝液に溶
解し、ｃ−DNA溶解液を得た。
以上の如くしてデオキシシチジンのテイルの付いたｃ
−DNA100ngを得た。
−DNA100ngを得た。
5.ベクターに使用する組み換え体プラスミドpMCE10DNA
の調製 大腸菌W3110株（ATCC27325）、プラスミドpBR325（BR
L社製）及びプラスミドpBR322DNA（宝酒造社製）を用い
てティー・マスダ等（T.Masuda et.al.）「アグリカル
チュラル・バイオロジカル・ケミストリー」（Agricult
ural Biological Chemistry）、第５巻、第271〜279頁
（1986）記載の方法により作製したプラスミドpKN305DN
A並びにプラスミドpMC1403−3DNA（特開昭61−274683号
公報記載）夫々１μｇを、10μｌの混液〔50mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.5）/10mM MgCl2/100mM NaCl/1mMジチ
オスレイトール〕に添加し、更に、これに、HindIII及
びSalI（いずれも宝酒造社製）を夫々２ユニットずつ添
加し、温度37℃で１時間反応させて切断処理し、常法に
よるフェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈
澱物を得た。この沈澱物を、10μｌのライゲーション緩
衝液〔20mM MgCl2/66mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）/1
mMATP/15mMジチオスレイトール〕に溶解し、溶液を得、
更に、１ユニットのT4DNAリガーゼ〔宝酒造社製〕を添
加し、温度20℃で４時間連結反応を行なった。次いで、
この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジー」（J.
Bacteriology、第119巻、第1072頁〜第1074頁（1974
年）〕記載の形質転換法により、大腸菌JM101（ATCC338
76）株を形質転換し、薬剤耐性（アンピシリン耐性及び
テトラサイクリン感受性）及びβ−ガラクトシダーゼ活
性を検討し、形質転換株を得、その株の含有する組み換
え体プラスミドDNAをpMCE10と命名した。この組み換え
体プラスミドpMCE10DNAを含有する大腸菌JM101株を、ト
リプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5％（W/V）、及びN
aCl0.5％（W/V）からなる培地１に、該培地を用い温
度37℃で16〜24時間前培養して得た大腸菌JM101（pMCE1
0）の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間振盪培養
したのち、0.2gのクロラムフェニコールを添加し、更に
同一温度で20時間同培養を行ない、培養液を得た。
の調製 大腸菌W3110株（ATCC27325）、プラスミドpBR325（BR
L社製）及びプラスミドpBR322DNA（宝酒造社製）を用い
てティー・マスダ等（T.Masuda et.al.）「アグリカル
チュラル・バイオロジカル・ケミストリー」（Agricult
ural Biological Chemistry）、第５巻、第271〜279頁
（1986）記載の方法により作製したプラスミドpKN305DN
A並びにプラスミドpMC1403−3DNA（特開昭61−274683号
公報記載）夫々１μｇを、10μｌの混液〔50mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.5）/10mM MgCl2/100mM NaCl/1mMジチ
オスレイトール〕に添加し、更に、これに、HindIII及
びSalI（いずれも宝酒造社製）を夫々２ユニットずつ添
加し、温度37℃で１時間反応させて切断処理し、常法に
よるフェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈
澱物を得た。この沈澱物を、10μｌのライゲーション緩
衝液〔20mM MgCl2/66mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）/1
mMATP/15mMジチオスレイトール〕に溶解し、溶液を得、
更に、１ユニットのT4DNAリガーゼ〔宝酒造社製〕を添
加し、温度20℃で４時間連結反応を行なった。次いで、
この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジー」（J.
Bacteriology、第119巻、第1072頁〜第1074頁（1974
年）〕記載の形質転換法により、大腸菌JM101（ATCC338
76）株を形質転換し、薬剤耐性（アンピシリン耐性及び
テトラサイクリン感受性）及びβ−ガラクトシダーゼ活
性を検討し、形質転換株を得、その株の含有する組み換
え体プラスミドDNAをpMCE10と命名した。この組み換え
体プラスミドpMCE10DNAを含有する大腸菌JM101株を、ト
リプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5％（W/V）、及びN
aCl0.5％（W/V）からなる培地１に、該培地を用い温
度37℃で16〜24時間前培養して得た大腸菌JM101（pMCE1
0）の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間振盪培養
したのち、0.2gのクロラムフェニコールを添加し、更に
同一温度で20時間同培養を行ない、培養液を得た。
次いで、この培養液を、常法により6,000r.p.m.で10
分間遠心分離して湿潤菌体2gを得、これを20mlの25％
（W/V）ショ糖を含有する350mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10m
g、0.25M EDTA溶液（pH8.0）8ml及び20％（W/V）ドデシ
ル硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加し、温度60℃で30
分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
分間遠心分離して湿潤菌体2gを得、これを20mlの25％
（W/V）ショ糖を含有する350mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10m
g、0.25M EDTA溶液（pH8.0）8ml及び20％（W/V）ドデシ
ル硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加し、温度60℃で30
分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、5M NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃
で16時間処理したものを常法により15,000r.p.m.で30分
間遠心分離して抽出液を得、常法によるフェノール抽出
処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。
で16時間処理したものを常法により15,000r.p.m.で30分
間遠心分離して抽出液を得、常法によるフェノール抽出
処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。
次いで、この沈澱物を、通常の減圧乾燥処理したもの
を、1mMEDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液6ml（pH
7.5）に溶解し、更に、これに、塩化セシウム6g及びエ
チジウムブロマイド溶液（10mg/ml）0.2mlを添加したも
のを、常法により39,000r.p.m.で42時間超遠心分離機を
用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体
プラスミドpMCE10DNAを単離し、また更に、ｎ−ブタノ
ールを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、
1mMEDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に
対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミドpM
CE10DNA500μｇを得た。
を、1mMEDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液6ml（pH
7.5）に溶解し、更に、これに、塩化セシウム6g及びエ
チジウムブロマイド溶液（10mg/ml）0.2mlを添加したも
のを、常法により39,000r.p.m.で42時間超遠心分離機を
用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体
プラスミドpMCE10DNAを単離し、また更に、ｎ−ブタノ
ールを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、
1mMEDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に
対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミドpM
CE10DNA500μｇを得た。
6.ベクターDNAの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミドpMCE10
DNA15μｇを、90μｌの項目４記載のTE緩衝液に溶解
し、10μｌのMed緩衝液〔100mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）/100mM MgCl2/10mMジチオスレイトール/500mM NaC
l〕を添加したのち30ユニットの制限酵素AccI（宝酒造
社製）を更に加え、温度37℃で１時間切断処理を行ない
切断処理物を得た。この切断処理物に、100μｌの水飽
和フェノールを加え除蛋白操作を行なったのち、水層を
回収し、これに、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH7.5）
及び２倍量の冷エタノールを加え、温度−70℃で15分間
放置したのち、12,000r.p.m.で10分間遠心分離し、DNA
を回収した。
DNA15μｇを、90μｌの項目４記載のTE緩衝液に溶解
し、10μｌのMed緩衝液〔100mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）/100mM MgCl2/10mMジチオスレイトール/500mM NaC
l〕を添加したのち30ユニットの制限酵素AccI（宝酒造
社製）を更に加え、温度37℃で１時間切断処理を行ない
切断処理物を得た。この切断処理物に、100μｌの水飽
和フェノールを加え除蛋白操作を行なったのち、水層を
回収し、これに、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH7.5）
及び２倍量の冷エタノールを加え、温度−70℃で15分間
放置したのち、12,000r.p.m.で10分間遠心分離し、DNA
を回収した。
このDNAを、10μｌのTE緩衝液に溶かし、15μｌの混
液〔280mM カコジル酸ナトリウム（pH6.8）/60mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕を加えた
のち、更に、５μｌのティリング混液（項目４記載）
（5mM dGTPを用いた）を加え、また更に、５ユニットの
ターミナルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）を添加
し、温度37℃で15分間反応させた。項目４記載のｃ−DN
Aティリング反応と同様の後処理を行なうことにより組
み換え体プラスミドpMCE10DNAのAccIサイトにデオキシ
グアノシンのテイルが付いたDNAを調製した。
液〔280mM カコジル酸ナトリウム（pH6.8）/60mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH6.8）/2mM塩化コバルト〕を加えた
のち、更に、５μｌのティリング混液（項目４記載）
（5mM dGTPを用いた）を加え、また更に、５ユニットの
ターミナルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）を添加
し、温度37℃で15分間反応させた。項目４記載のｃ−DN
Aティリング反応と同様の後処理を行なうことにより組
み換え体プラスミドpMCE10DNAのAccIサイトにデオキシ
グアノシンのテイルが付いたDNAを調製した。
一方、プラスミドpUC19DNAのPstIサイトにデオキシグ
アノシンのテイルが付いたDNAの調製も同時に行なっ
た。
アノシンのテイルが付いたDNAの調製も同時に行なっ
た。
プラスミドpUC19DNA（宝酒造社製）30μｇを、350μ
ｌのTE緩衝液に溶解したものに、40μｌのMed緩衝液及
び制限酵素PstＩ（宝酒造社製）12ユニットを夫々添加
し、温度37℃で１時間切断処理したのち、常法によりフ
ェノールによる除蛋白処理及びエタノール沈澱処理によ
りDNAを回収した。
ｌのTE緩衝液に溶解したものに、40μｌのMed緩衝液及
び制限酵素PstＩ（宝酒造社製）12ユニットを夫々添加
し、温度37℃で１時間切断処理したのち、常法によりフ
ェノールによる除蛋白処理及びエタノール沈澱処理によ
りDNAを回収した。
得られたDNAを、35μｌのTE緩衝液に溶解したもの
に、50μｌの混液〔280mM カコジル酸ナトリウム（pH
6.8）/60mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/1mM塩化コバ
ルト〕、19μｌの項目４記載のティリング混液（dGTP含
有）並びに60ユニットのターミナルトランスフェラーゼ
（宝酒造社製）を夫々添加し、温度37℃で10分間反応さ
せたのち、常法によりフェノール処理及びエタノール沈
澱を行なうことによりDNAを回収した。
に、50μｌの混液〔280mM カコジル酸ナトリウム（pH
6.8）/60mMトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）/1mM塩化コバ
ルト〕、19μｌの項目４記載のティリング混液（dGTP含
有）並びに60ユニットのターミナルトランスフェラーゼ
（宝酒造社製）を夫々添加し、温度37℃で10分間反応さ
せたのち、常法によりフェノール処理及びエタノール沈
澱を行なうことによりDNAを回収した。
7.アニーリング及び形質転換 合成したｃ−DNA15ng及びベクターDNA200ngを、35μ
ｌのアニール緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）/100mM NaCl/1mMEDTA〕に溶解し、温度65℃で２分
間、温度46℃で２時間、温度37℃で１時間及び温度20℃
で18時間放置する操作によりｃ−DNAとベクターDNAをア
ニールした。
ｌのアニール緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）/100mM NaCl/1mMEDTA〕に溶解し、温度65℃で２分
間、温度46℃で２時間、温度37℃で１時間及び温度20℃
で18時間放置する操作によりｃ−DNAとベクターDNAをア
ニールした。
アニールしたDNAを用いて、ハナハン（Hanahan）の方
法〔「デイーエヌエイ クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DH1
株（ATCC33849）を形質転換し、プラスミドpUC19DNA及
び組み換え体プラスミドpMCE10DNAをベクターとしたｃ
−DNAバンクを夫々作製した。
法〔「デイーエヌエイ クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DH1
株（ATCC33849）を形質転換し、プラスミドpUC19DNA及
び組み換え体プラスミドpMCE10DNAをベクターとしたｃ
−DNAバンクを夫々作製した。
8.ルシフェラーゼｃ−DNAの検索 組み換え体プラスミドpMCE10DNAのAccI部位は、大腸
菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする部位にある
ので、この部位に組み込まれたｃ−DNAはβ−ガラクト
シダーゼとの融合蛋白質を作る。また組み換え体プラス
ミドpMCE10のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモータ
ーは前述した様に大腸菌トリプトファン遺伝子のプロモ
ーターに変換してある。
菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする部位にある
ので、この部位に組み込まれたｃ−DNAはβ−ガラクト
シダーゼとの融合蛋白質を作る。また組み換え体プラス
ミドpMCE10のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモータ
ーは前述した様に大腸菌トリプトファン遺伝子のプロモ
ーターに変換してある。
組み換え体プラスミドpMCE10DNAを、ベクターとする
ｃ−DNAバンクのコロニー96個を10mlのM9カザミノ酸培
地〔「「モレキュラー・クローニング」（Molecular Cl
oning）、第440〜441頁、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）（1982）〕にチアミン（10μg/ml）を加えた培地を
用い温度37℃で10時間振盪培養し、常法により集菌した
のち、200μｌの項目２記載のSDS−PAGE用サンプル緩衝
液に懸濁し、温度100℃で５分間煮沸した。
ｃ−DNAバンクのコロニー96個を10mlのM9カザミノ酸培
地〔「「モレキュラー・クローニング」（Molecular Cl
oning）、第440〜441頁、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）（1982）〕にチアミン（10μg/ml）を加えた培地を
用い温度37℃で10時間振盪培養し、常法により集菌した
のち、200μｌの項目２記載のSDS−PAGE用サンプル緩衝
液に懸濁し、温度100℃で５分間煮沸した。
この懸濁液40μｌを、7.5％（W/V）ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった。泳動
終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウエスタンブロット
法〔「アナル・バイオケム・」（Anal.Biochm.）、第11
2巻、第195頁（1981）〕によりニトロセルロースのフィ
ルターに転写し、このニトロセルロースフィルターをイ
ミューンブロットアッセイキット（バイオラッド社製）
を用いて抗ルシフェラーゼ血清で染色した。方法は、バ
イオラッド社の操作法に従った。
ドゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった。泳動
終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウエスタンブロット
法〔「アナル・バイオケム・」（Anal.Biochm.）、第11
2巻、第195頁（1981）〕によりニトロセルロースのフィ
ルターに転写し、このニトロセルロースフィルターをイ
ミューンブロットアッセイキット（バイオラッド社製）
を用いて抗ルシフェラーゼ血清で染色した。方法は、バ
イオラッド社の操作法に従った。
即ちニトロセルロースのフィルターを、100mlのブロ
ッキング溶液［TBS緩衝液〔20mMトリス−塩酸緩衝液/50
0mM NaCl（pH7.5）〕に３％（W/V）のゼラチンを溶かし
た溶液］中温度25℃で、30分間振盪した。次に、このニ
トロセルロースフィルターを25mlの一次抗体溶液〔ルシ
フェラーゼ抗血清を１％（W/V）のゼラチンをTBS緩衝液
に溶かした溶液で25倍（V/V）に希釈した溶液〕に移
し、温度25℃で90分間振盪したものを、100mlのツィー
ン（Tween）−20洗液〔TBS緩衝液に0.05％（W/V）のツ
ィーン（Tween）−20を溶かした溶液〕中に移し、温度2
5℃で10分間振盪する操作を２回行なった。次いで、こ
のようにして得たニトロセルロースフィルターを60mlの
二次抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した
抗ウサギ抗体（バイオ・ラッド社製）を１％（W/V）の
ゼラチンをTBS緩衝液に溶かした溶液で3000倍（V/V）に
希釈した溶液〕中に移し、温度25℃で60分間振盪したの
ち、100mlのツィーン（Tween）−20洗液でニトロセルロ
ースフィルターを洗う上記操作を２回繰り返し、このよ
うにして得たニトロセルロースフィルターを、120mlの
発色液〔60mgの４−クロロ−１−ナフトールを20mlの冷
メタノールに溶解した溶液及び60μｌの30％（V/V）過
酸化水素水を100mlのTBS緩衝液に添加した溶液を混合し
た溶液〕中に移し、温度25℃で10分間発色させた。
ッキング溶液［TBS緩衝液〔20mMトリス−塩酸緩衝液/50
0mM NaCl（pH7.5）〕に３％（W/V）のゼラチンを溶かし
た溶液］中温度25℃で、30分間振盪した。次に、このニ
トロセルロースフィルターを25mlの一次抗体溶液〔ルシ
フェラーゼ抗血清を１％（W/V）のゼラチンをTBS緩衝液
に溶かした溶液で25倍（V/V）に希釈した溶液〕に移
し、温度25℃で90分間振盪したものを、100mlのツィー
ン（Tween）−20洗液〔TBS緩衝液に0.05％（W/V）のツ
ィーン（Tween）−20を溶かした溶液〕中に移し、温度2
5℃で10分間振盪する操作を２回行なった。次いで、こ
のようにして得たニトロセルロースフィルターを60mlの
二次抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した
抗ウサギ抗体（バイオ・ラッド社製）を１％（W/V）の
ゼラチンをTBS緩衝液に溶かした溶液で3000倍（V/V）に
希釈した溶液〕中に移し、温度25℃で60分間振盪したの
ち、100mlのツィーン（Tween）−20洗液でニトロセルロ
ースフィルターを洗う上記操作を２回繰り返し、このよ
うにして得たニトロセルロースフィルターを、120mlの
発色液〔60mgの４−クロロ−１−ナフトールを20mlの冷
メタノールに溶解した溶液及び60μｌの30％（V/V）過
酸化水素水を100mlのTBS緩衝液に添加した溶液を混合し
た溶液〕中に移し、温度25℃で10分間発色させた。
この様にして96個のコロニーを１グループとして４グ
ループについて同様の方法を行なったところ、２つのグ
ループでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが
認められた。次に、この２つのグループに属する96個の
コロニーを12個のコロニーずつ８グループに分け同様の
操作を行なったところ夫々１グループに抗ルシフェラー
ゼ血清と反応する蛋白質が認められた。最後に、このグ
ループに含まれる12個のコロニーを、１個のコロニーず
つ同様の操作を行ないルシフェラーゼ抗血清と反応する
蛋白質を作るコロニーを同定した。以上の操作によりル
シフェラーゼｃ−DNAをもつ２個のコロニーが得られ
た。この２個のコロニーより項目５記載の方法でプラス
ミドDNAを調製した。得られた組み換え体プラスミドDNA
は、pALf2B8及びpALf3A6と夫々命名した。
ループについて同様の方法を行なったところ、２つのグ
ループでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが
認められた。次に、この２つのグループに属する96個の
コロニーを12個のコロニーずつ８グループに分け同様の
操作を行なったところ夫々１グループに抗ルシフェラー
ゼ血清と反応する蛋白質が認められた。最後に、このグ
ループに含まれる12個のコロニーを、１個のコロニーず
つ同様の操作を行ないルシフェラーゼ抗血清と反応する
蛋白質を作るコロニーを同定した。以上の操作によりル
シフェラーゼｃ−DNAをもつ２個のコロニーが得られ
た。この２個のコロニーより項目５記載の方法でプラス
ミドDNAを調製した。得られた組み換え体プラスミドDNA
は、pALf2B8及びpALf3A6と夫々命名した。
9.大きなルシフェラーゼｃ−DNAの検索−DNAのプローブ
の作製 組み換え体プラスミドpALf3A6DNA100μｇを、330μｌ
のTE緩衝液に溶解し、これに40μｌのLow緩衝液〔100mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mM MgCl2/10mMジチ
オスレイトール〕、130ユニットのPstI（宝酒造社製）
及び120ユニットのSacI（ベーリンガー・マンハイム社
製）を添加し、温度37℃で1.5時間切断した。
の作製 組み換え体プラスミドpALf3A6DNA100μｇを、330μｌ
のTE緩衝液に溶解し、これに40μｌのLow緩衝液〔100mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）/100mM MgCl2/10mMジチ
オスレイトール〕、130ユニットのPstI（宝酒造社製）
及び120ユニットのSacI（ベーリンガー・マンハイム社
製）を添加し、温度37℃で1.5時間切断した。
このDNA全量を0.7％（W/V）アガロースゲルを用いた
電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動はティー
・マニアテス（T.Maniatis）等の方法〔「「モレキュラ
ー・クローニング」（Molecular Cloning）、第156〜16
1頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Habor Laboratory）（1984）〕に従って
行なった。ルシフェラーゼｃ−DNAを含むDNAバンドを切
り出し、透析チューブに入れ、2mlのTE緩衝液を加えた
のち、透析チューブをシールし、電気泳動により、ゲル
中より緩衝液中にDNAを溶出した。この溶液に等容量の
水飽和フェノールを加え、攪拌したのち、水層を回収
し、常法に従いエタノール沈澱によりDNAを回収した。
電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動はティー
・マニアテス（T.Maniatis）等の方法〔「「モレキュラ
ー・クローニング」（Molecular Cloning）、第156〜16
1頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Habor Laboratory）（1984）〕に従って
行なった。ルシフェラーゼｃ−DNAを含むDNAバンドを切
り出し、透析チューブに入れ、2mlのTE緩衝液を加えた
のち、透析チューブをシールし、電気泳動により、ゲル
中より緩衝液中にDNAを溶出した。この溶液に等容量の
水飽和フェノールを加え、攪拌したのち、水層を回収
し、常法に従いエタノール沈澱によりDNAを回収した。
得られたDNAフラグメント10μｇを、126μｌのTE緩衝
液に溶かし、16μのMed緩衝液及び64ユニットのSau3AI
（宝酒造社製）を加え、温度37℃で２時間反応させたの
ち、全量を５％（W/V）ポリアクリルアミドゲルを用い
た電気泳動により、DNA断片の分離を行なった。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動は、エイ・マクサム（A.Maxa
m）の方法〔「メソズ・イン・エンザイモロジー」（Met
hodsin Enzymology）、第65巻、第506頁（1980）〕に従
って行なった。190bpのDNAフラグメントを前述と同様の
方法で単離し、１μｇのSau3AIルシフェラーゼｃ−DNA
フラグメントが得られた。
液に溶かし、16μのMed緩衝液及び64ユニットのSau3AI
（宝酒造社製）を加え、温度37℃で２時間反応させたの
ち、全量を５％（W/V）ポリアクリルアミドゲルを用い
た電気泳動により、DNA断片の分離を行なった。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動は、エイ・マクサム（A.Maxa
m）の方法〔「メソズ・イン・エンザイモロジー」（Met
hodsin Enzymology）、第65巻、第506頁（1980）〕に従
って行なった。190bpのDNAフラグメントを前述と同様の
方法で単離し、１μｇのSau3AIルシフェラーゼｃ−DNA
フラグメントが得られた。
この１μｇのルシフェラーゼｃ−DNAを、〔α−32P〕
dCTP（アマシャム社製）を用いてニックトランスレーシ
ョン法により標識した。ニックトランスレーションは宝
酒造社製のキットを用い、宝酒造社の指示する「ジェイ
・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237
〜251頁（1977）及び「「モレキュラー・クローニン
グ」（Molecular Cloning）、第109〜112頁、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Habor Laboratory）（1982）記載の方法に従って行なっ
た。
dCTP（アマシャム社製）を用いてニックトランスレーシ
ョン法により標識した。ニックトランスレーションは宝
酒造社製のキットを用い、宝酒造社の指示する「ジェイ
・モル・バイオル」（J.Mol.Biol.）、第113巻、第237
〜251頁（1977）及び「「モレキュラー・クローニン
グ」（Molecular Cloning）、第109〜112頁、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Habor Laboratory）（1982）記載の方法に従って行なっ
た。
10.大きなルシフェラーゼｃ−DNAの検索−コロニーハイ
ブリダイゼーション 前述の方法で調製した32Pで標識したルシフェラーゼ
ｃ−DNA断片を、プローブとして用い、組み換え体プラ
スミドpUC19DNAをベクターとするフォティナス・ピラリ
ス尾部ｃ−DNAバンクを、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法（「蛋白質・核酸・酵素」第26巻、第575〜579頁
（1981）で検索し、ルシフェラーゼｃ−DNAを有するコ
ロニーを得た。このうちの１個のコロニーの有する組み
換え体プラスミドDNAをpALf3と命名し、項目５記載の方
法でプラスミドDNAを調製した。該組み換え体プラスミ
ドDNAを含有する大腸菌を大腸菌DH1（pALf3）と命名し
た。なお、該形質転換株はATCC67462として寄託されて
いる。
ブリダイゼーション 前述の方法で調製した32Pで標識したルシフェラーゼ
ｃ−DNA断片を、プローブとして用い、組み換え体プラ
スミドpUC19DNAをベクターとするフォティナス・ピラリ
ス尾部ｃ−DNAバンクを、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法（「蛋白質・核酸・酵素」第26巻、第575〜579頁
（1981）で検索し、ルシフェラーゼｃ−DNAを有するコ
ロニーを得た。このうちの１個のコロニーの有する組み
換え体プラスミドDNAをpALf3と命名し、項目５記載の方
法でプラスミドDNAを調製した。該組み換え体プラスミ
ドDNAを含有する大腸菌を大腸菌DH1（pALf3）と命名し
た。なお、該形質転換株はATCC67462として寄託されて
いる。
そして、上記組み換え体プラスミドpALf3DNAを、Xba
Ｉ、HindIII、BamHＩ、EcoRＩ、及びPstＩ（いずれも宝
酒造社製）を用い、単一消化及び２重消化して得られた
DNA断片をアガロースゲル電気泳動法により移動度パタ
ーンを分析し、得られた移動度パターンとλDNA（宝酒
造社製）をHindIIIにより消化して得られたDNA断片の標
準移動度パターンと対比することにより得られた分子量
は、1,700bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図
は、第３図に示すとおりであった。
Ｉ、HindIII、BamHＩ、EcoRＩ、及びPstＩ（いずれも宝
酒造社製）を用い、単一消化及び２重消化して得られた
DNA断片をアガロースゲル電気泳動法により移動度パタ
ーンを分析し、得られた移動度パターンとλDNA（宝酒
造社製）をHindIIIにより消化して得られたDNA断片の標
準移動度パターンと対比することにより得られた分子量
は、1,700bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図
は、第３図に示すとおりであった。
11.ルシオラ・クルシアタ（Luciola Cruciata）のｍ−R
NAの調製 生きたルシオラ・クルシアタ（ゲンジボタル・株式会
社・西部百貨店より購入）10gを超低温冷凍庫に入れ、
凍結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部
2gに、18mlのグアニジンイソチオシアネート溶液を添加
し、項目１記載の方法に従って1.1mgのRNAを調製した。
このRNA1.1mgを項目１記載の方法に従ってオリゴ（dT）
−セルロースのカラムクロマトグラフィーを行ない30μ
ｇのルシオラ・クルシアタ尾部ｍ−RNAを調製した。
NAの調製 生きたルシオラ・クルシアタ（ゲンジボタル・株式会
社・西部百貨店より購入）10gを超低温冷凍庫に入れ、
凍結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部
2gに、18mlのグアニジンイソチオシアネート溶液を添加
し、項目１記載の方法に従って1.1mgのRNAを調製した。
このRNA1.1mgを項目１記載の方法に従ってオリゴ（dT）
−セルロースのカラムクロマトグラフィーを行ない30μ
ｇのルシオラ・クルシアタ尾部ｍ−RNAを調製した。
12.ルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−DNAバンクの作製 ｃ−DNAの合成はアマシャム社より購入したキットを
用い、アマシャム社の指示する「モル・セル・バイオ
ル」（Mol.Cell.Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及
びジーン（Gene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方
法に従って合成した。
用い、アマシャム社の指示する「モル・セル・バイオ
ル」（Mol.Cell.Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及
びジーン（Gene）、第25巻、第263頁（1983）記載の方
法に従って合成した。
２μｇのルシオラ・クルシアタ尾部RNAより0.9μｇの
日本鎖ｃ−DNAが合成された。このｃ−DNA0.3μｇに項
目４記載の方法を用いてポリデオキシシチジンのテイル
を付加した。
日本鎖ｃ−DNAが合成された。このｃ−DNA0.3μｇに項
目４記載の方法を用いてポリデオキシシチジンのテイル
を付加した。
このｃ−DNA20ng及び項目６で調製したポリグアノシ
ンのテイルをそのPstI部位に付加したpUC19プラスミドD
NA500ngを、項目７記載の方法でアニールし、ハナハン
（Hanahan）の方法〔「ディエヌエイ・クローニング」
（DNA Cloning、第１巻、第109〜135頁（1985）〕に従
ってアニールしたDNAにより大腸菌DH1株（ATCC33849）
を形質転換しルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−DNAバンク
を作製した。
ンのテイルをそのPstI部位に付加したpUC19プラスミドD
NA500ngを、項目７記載の方法でアニールし、ハナハン
（Hanahan）の方法〔「ディエヌエイ・クローニング」
（DNA Cloning、第１巻、第109〜135頁（1985）〕に従
ってアニールしたDNAにより大腸菌DH1株（ATCC33849）
を形質転換しルシオラ・クルシアタ尾部ｃ−DNAバンク
を作製した。
13.ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNA
の検索 項目10で得られた組み換え体プラスミドpALf3DNA10μ
ｇを、90μｌのTE緩衝液に溶解し、10μｌのMed緩衝
液、25ユニットの制限酵素EcoRI及び25ユニットの制限
酵素のClaＩ（いずれも宝酒造・社・製）を添加し、温
度37℃で２時間反応を行ないDNAを切断した。切断した
組み換え体プラスミドpALf3DNAよりフォテナス・ピラリ
ス（アメリカホタル）由来のルシフェラーゼｃ−DNA部
分を含む800bpのEcoRI/ClaIDNAフラグメントを、項目９
記載のアガロースゲル電気泳動法を用いる方法に従って
単離し、１μｇのEcoRI/ClaIDNAフラグメントを得た。
この１μｇのDNAを、〔α−32P〕dCTP三燐酸（アマシャ
ム社製）を用いて項目９記載のニックトランスレーショ
ン法により32Pで標識した。32Pで標識したEcoRI/ClaIDN
Aフラグメントをプローブとして、ルシオラ・クルシア
タ尾部ｃ−DNAバンクを項目10記載のコロニーハイブリ
ダイゼーション法で検索することによりルシオラ・クル
シアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNAを有する大腸菌を
選択した。プローブとハイブリダイズする大腸菌コロニ
ーを数個得た。この中の１コロニーの有するプラスミド
DNAをpGLf1と命名し、項目５記載の方法に従い組み換え
体プラスミドDNAを単離した。
の検索 項目10で得られた組み換え体プラスミドpALf3DNA10μ
ｇを、90μｌのTE緩衝液に溶解し、10μｌのMed緩衝
液、25ユニットの制限酵素EcoRI及び25ユニットの制限
酵素のClaＩ（いずれも宝酒造・社・製）を添加し、温
度37℃で２時間反応を行ないDNAを切断した。切断した
組み換え体プラスミドpALf3DNAよりフォテナス・ピラリ
ス（アメリカホタル）由来のルシフェラーゼｃ−DNA部
分を含む800bpのEcoRI/ClaIDNAフラグメントを、項目９
記載のアガロースゲル電気泳動法を用いる方法に従って
単離し、１μｇのEcoRI/ClaIDNAフラグメントを得た。
この１μｇのDNAを、〔α−32P〕dCTP三燐酸（アマシャ
ム社製）を用いて項目９記載のニックトランスレーショ
ン法により32Pで標識した。32Pで標識したEcoRI/ClaIDN
Aフラグメントをプローブとして、ルシオラ・クルシア
タ尾部ｃ−DNAバンクを項目10記載のコロニーハイブリ
ダイゼーション法で検索することによりルシオラ・クル
シアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNAを有する大腸菌を
選択した。プローブとハイブリダイズする大腸菌コロニ
ーを数個得た。この中の１コロニーの有するプラスミド
DNAをpGLf1と命名し、項目５記載の方法に従い組み換え
体プラスミドDNAを単離した。
組み換え体プラスミドpGLf1DNAをHpaI,HindIII,EcoR
V,DraI,Af1II、HincII,PstＩ（いずれも宝酒造社製）及
びSspＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）を用
い、単一消化及び二重消化して得られたDNA断片をアガ
ロースゲル電気泳動法により、移動度パターンを分析
し、得られた移動度パターンとλファージDNA（宝酒造
社製）をHindIIIにより消化して得られたDNA断片の標準
移動度パターンとを対比することにより得られた分子量
は、2,000bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図
は、第４図に示す通りである。
V,DraI,Af1II、HincII,PstＩ（いずれも宝酒造社製）及
びSspＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）を用
い、単一消化及び二重消化して得られたDNA断片をアガ
ロースゲル電気泳動法により、移動度パターンを分析
し、得られた移動度パターンとλファージDNA（宝酒造
社製）をHindIIIにより消化して得られたDNA断片の標準
移動度パターンとを対比することにより得られた分子量
は、2,000bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図
は、第４図に示す通りである。
14.ルシオラ・ラテラリスのｍ−RNAの調製 生きたルシオラ・ラテラリス（ヘイケボタル・川原鳥
獣貿易より購入）5gを超低温冷凍庫に入れ、凍結し、は
さみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部1gに、18ml
のグアニジンイソチオシアネート溶液を添加し、項目１
記載の方法に従って340μｇのRNAを調製した。このRNA3
40μｇを項目１記載の方法に従ってオリゴ（dT）−セル
ロースのカラムクロマトグラフィーを行ない６μｇのル
シオラ・ラテラリス尾部ｍ−RNAを調製した。
獣貿易より購入）5gを超低温冷凍庫に入れ、凍結し、は
さみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部1gに、18ml
のグアニジンイソチオシアネート溶液を添加し、項目１
記載の方法に従って340μｇのRNAを調製した。このRNA3
40μｇを項目１記載の方法に従ってオリゴ（dT）−セル
ロースのカラムクロマトグラフィーを行ない６μｇのル
シオラ・ラテラリス尾部ｍ−RNAを調製した。
15.ルシオラ・ラテラリス尾部ｃ−DNAバンクの作製 ｃ−DNAの合成は、アマシャム社製キットを用いて行
なったものである。
なったものである。
上述の如くして得られたｍ−RNA2.0μｇを用いてアマ
シャム社の指示する「モル・セル・バイオル」（Mol.Ce
ll.Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及びジーン（Gen
e）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に従い行なっ
た結果、250ngの２本鎖ｃ−DNAが得られた。
シャム社の指示する「モル・セル・バイオル」（Mol.Ce
ll.Biol.）、第２巻、第161頁（1982）及びジーン（Gen
e）、第25巻、第263頁（1983）記載の方法に従い行なっ
た結果、250ngの２本鎖ｃ−DNAが得られた。
このようにして得たｃ−DNA250ngに、アマシャム社製
ｃ−DNAクローニングキットを用い、アマシャム社の指
示する方法により制限酵素EcoRI切断部位のメチル化を
行ない、更にｃ−DNAの両端にEcoRIリンカーを付着させ
た。
ｃ−DNAクローニングキットを用い、アマシャム社の指
示する方法により制限酵素EcoRI切断部位のメチル化を
行ない、更にｃ−DNAの両端にEcoRIリンカーを付着させ
た。
プラスミドpUC119 DNA（宝酒造社製）100ngを、８μ
ｌの水に溶解したものに、１μｌのMed緩衝液〔100mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）100mM MgCl2/10mMジチオ
スレイトール/500mM NaCl〕を添加したのち、更に、こ
れに、10ユニット（１μｌ）の制限酵素EcoRI（宝酒造
社製）を添加し、温度37℃で１時間切断処理を行なっ
た。
ｌの水に溶解したものに、１μｌのMed緩衝液〔100mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）100mM MgCl2/10mMジチオ
スレイトール/500mM NaCl〕を添加したのち、更に、こ
れに、10ユニット（１μｌ）の制限酵素EcoRI（宝酒造
社製）を添加し、温度37℃で１時間切断処理を行なっ
た。
次いで、この切断処理物に、１μｌの1Mトリス−塩酸
緩衝液（pH8.0）及び0.3ユニット（１μｌ）のアルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を添加し、温度65℃で
１時間酵素反応処理し、切断処理物の両端の脱リン酸化
を行ない、これに、12μｌの水飽和フェノールを添加し
て除蛋白を行なったのち、回収した水層に、１μｌの3M
酢酸ナトリウム（pH5.8）及び26μｌの冷エタノールを
夫々添加し、温度−70℃で15分間放置し、微量遠心機
〔（株）トミー精工、MRX−150〕を用い、12,000r.p.m.
で５分間遠心分離処理を行ないDNAを回収した。
緩衝液（pH8.0）及び0.3ユニット（１μｌ）のアルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を添加し、温度65℃で
１時間酵素反応処理し、切断処理物の両端の脱リン酸化
を行ない、これに、12μｌの水飽和フェノールを添加し
て除蛋白を行なったのち、回収した水層に、１μｌの3M
酢酸ナトリウム（pH5.8）及び26μｌの冷エタノールを
夫々添加し、温度−70℃で15分間放置し、微量遠心機
〔（株）トミー精工、MRX−150〕を用い、12,000r.p.m.
で５分間遠心分離処理を行ないDNAを回収した。
このようにして得られた制限酵素EcoRIで切断し、か
つ両端を脱リン酸化したプラスミドベクターpUC119 DNA
100ngと、項目15で調製したｃ−DNA 250ngを混合した
ものを、８μｌの水に懸濁したのち、これに、１μｌの
×10ライゲーション緩衝液〔200mM MgCl2/660mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.6）/10mM ATP/150mMジチオスイレト
ール〕を添加したものに、１ユニット（１μｌ）のT4DN
Aリガーゼ（宝酒造社製）を添加し、温度16℃で16時間
放置し、プラスミドベクターDNA及びｃ−DNAのライゲー
ションを行ない反応物を得た。
つ両端を脱リン酸化したプラスミドベクターpUC119 DNA
100ngと、項目15で調製したｃ−DNA 250ngを混合した
ものを、８μｌの水に懸濁したのち、これに、１μｌの
×10ライゲーション緩衝液〔200mM MgCl2/660mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.6）/10mM ATP/150mMジチオスイレト
ール〕を添加したものに、１ユニット（１μｌ）のT4DN
Aリガーゼ（宝酒造社製）を添加し、温度16℃で16時間
放置し、プラスミドベクターDNA及びｃ−DNAのライゲー
ションを行ない反応物を得た。
この反応物を用いて、ハナハン（Hanahan）の方法
〔「ディ−エヌエイ・クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DH1
株（ATCC33849）を形質転換し、プラスミドpUC119 DNA
をベクターとしたルシオラ・ラテラリス尾部由来のｃ−
DNAバンクを作製した。
〔「ディ−エヌエイ・クローニング」（DNA Clonin
g）、第１巻、第109〜135頁（1985）〕により大腸菌DH1
株（ATCC33849）を形質転換し、プラスミドpUC119 DNA
をベクターとしたルシオラ・ラテラリス尾部由来のｃ−
DNAバンクを作製した。
16.ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼｃ−DNA
の検索 項目13で得られた組み換え体プラスミドpGLf1DNA10μ
ｇを、90μｌのTE緩衝液に溶解し、10μｌのMed緩衝
液、25ユニットの制限酵素PstI（宝酒造社製）を添加
し、温度37℃で２時間反応を行ないDNAを切断した。切
断した組み換え体プラスミドpGLf1DNAよりルシオラ・ク
ルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNA部分を含む2,000
bpのPstIDNAフラグメントを、項目９記載のアガロース
ゲル電気泳動法を用いる方法に従って単離し、１μｇの
PstIDNAフラグメントを得た。この１μｇのDNAを、〔α
−32P〕dCTP（アマシャム社製）を用いて項目９記載の
ニックトランスレーション法により32Pで標識した。32P
で標識したPstIDNAフラグメントをプローブとして、ル
シオラ・ラテラリス尾部ｃ−DNAバンクを項目10記載の
コロニーハイブリダイゼーション法で検索することによ
りルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼｃ−DNA
を有する大腸菌を選択した。プローブとハイブリダイズ
する大腸菌コロニーを数個得た。この中の１コロニーの
有するプラスミドDNAをpHLf7と命名し、項目５記載の方
法に従い組み換え体プラスミドDNAを単離した。
の検索 項目13で得られた組み換え体プラスミドpGLf1DNA10μ
ｇを、90μｌのTE緩衝液に溶解し、10μｌのMed緩衝
液、25ユニットの制限酵素PstI（宝酒造社製）を添加
し、温度37℃で２時間反応を行ないDNAを切断した。切
断した組み換え体プラスミドpGLf1DNAよりルシオラ・ク
ルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−DNA部分を含む2,000
bpのPstIDNAフラグメントを、項目９記載のアガロース
ゲル電気泳動法を用いる方法に従って単離し、１μｇの
PstIDNAフラグメントを得た。この１μｇのDNAを、〔α
−32P〕dCTP（アマシャム社製）を用いて項目９記載の
ニックトランスレーション法により32Pで標識した。32P
で標識したPstIDNAフラグメントをプローブとして、ル
シオラ・ラテラリス尾部ｃ−DNAバンクを項目10記載の
コロニーハイブリダイゼーション法で検索することによ
りルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼｃ−DNA
を有する大腸菌を選択した。プローブとハイブリダイズ
する大腸菌コロニーを数個得た。この中の１コロニーの
有するプラスミドDNAをpHLf7と命名し、項目５記載の方
法に従い組み換え体プラスミドDNAを単離した。
なお、このようにして得られた大腸菌（E.coli）DH1
（pHLf7）は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第1917号（FERM BP−1917）として寄託されてい
る。
（pHLf7）は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第1917号（FERM BP−1917）として寄託されてい
る。
組み換え体プラスミドpHLf7 DNAをHpaI,EcoRV、ApaI,
HindIII及びEcoRI（いずれも宝酒造社製）及びSspＩ
（ニューイングランドバイオラボ社製）を用い、単一消
化及び二重消化して得られたDNA断片をアガロースゲル
電気泳動法により、移動度パターンを分析し、得られた
移動度パターンとλファージDNA（宝酒造社製）をHindI
IIにより消化して得られたDNA断片の標準移動度パター
ンとを対比することにより得られたルシオラ・ラテラリ
スのルシフェラーゼをコードする遺伝子の分子量は、2,
000bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図は、第５
図に示す通りである。
HindIII及びEcoRI（いずれも宝酒造社製）及びSspＩ
（ニューイングランドバイオラボ社製）を用い、単一消
化及び二重消化して得られたDNA断片をアガロースゲル
電気泳動法により、移動度パターンを分析し、得られた
移動度パターンとλファージDNA（宝酒造社製）をHindI
IIにより消化して得られたDNA断片の標準移動度パター
ンとを対比することにより得られたルシオラ・ラテラリ
スのルシフェラーゼをコードする遺伝子の分子量は、2,
000bpであり、上記プラスミドの制限酵素地図は、第５
図に示す通りである。
17.大腸菌（E.coli）DH1（pHLf7）（FERM BP−1917）の
培養及び粗酵素液の調製 大腸菌（E.coli）DH1（pHLf7）（FERM BP−1917）
を、LB−amp培地〔バクトトリプトン１％（W/V），酵母
エキス0.5％（W/V）,NaCl 0.5％（W/V），及びアンピシ
リン（50μg/ml）〕3mlにて温度37℃で18時間振盪培養
を行なった。この培養液0.5mlを10mlの上記LB−amp培地
に接種し、更に、これに、1mMのイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトシドを添加し、温度37℃で４時間振盪培
養したのち、8,000r.p.m.で10分間の遠心分離操作によ
り湿潤菌体20mgを得た。
培養及び粗酵素液の調製 大腸菌（E.coli）DH1（pHLf7）（FERM BP−1917）
を、LB−amp培地〔バクトトリプトン１％（W/V），酵母
エキス0.5％（W/V）,NaCl 0.5％（W/V），及びアンピシ
リン（50μg/ml）〕3mlにて温度37℃で18時間振盪培養
を行なった。この培養液0.5mlを10mlの上記LB−amp培地
に接種し、更に、これに、1mMのイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトシドを添加し、温度37℃で４時間振盪培
養したのち、8,000r.p.m.で10分間の遠心分離操作によ
り湿潤菌体20mgを得た。
回収した菌体を、0.1M KH2PO4（pH7.8）、2mMEDTA、1
mMジチオスレイトール及び0.2mg/mlプロタミン硫酸から
なる緩衝液0.9mlに懸濁し、更に、これに、100μｌの10
mg/mlのリゾチーム溶液を添加し、氷中に15分間放置し
た。次に、この懸濁液を、メタノール・ドライアイス浴
中で凍結し、続いて温度25℃に放置し、完全に解凍し
た。更に、12,000r.p.m.で５分間遠心分離操作を行なう
ことにより上清として粗酵素液1mlを得た。
mMジチオスレイトール及び0.2mg/mlプロタミン硫酸から
なる緩衝液0.9mlに懸濁し、更に、これに、100μｌの10
mg/mlのリゾチーム溶液を添加し、氷中に15分間放置し
た。次に、この懸濁液を、メタノール・ドライアイス浴
中で凍結し、続いて温度25℃に放置し、完全に解凍し
た。更に、12,000r.p.m.で５分間遠心分離操作を行なう
ことにより上清として粗酵素液1mlを得た。
このようにして得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ
活性の測定は、下記記載の方法により行ない、その結果
を第１表に示した。
活性の測定は、下記記載の方法により行ない、その結果
を第１表に示した。
得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活性の測定は、
クリッカ（Kricka）等の方法〔「アチーブス・オブ・バ
イオケミストリー・アンド・バイオフィズィクス」（Ar
chives of Biochemistry and Biophysics）、第217巻、
第674頁（1982）〕に従って生成するフォトン数を計測
することにより行なった。
クリッカ（Kricka）等の方法〔「アチーブス・オブ・バ
イオケミストリー・アンド・バイオフィズィクス」（Ar
chives of Biochemistry and Biophysics）、第217巻、
第674頁（1982）〕に従って生成するフォトン数を計測
することにより行なった。
すなわち、260μｌの25mMグリシルグリシン緩衝液（p
H7.8）、16μｌの0.1M硫酸マグネシウム、24μｌの1mM
ルシフェリン（シグマ社製）及び10μｌの粗酸素液を混
合したのち、100μｌの20mMATPを添加し、発生するフォ
トン数を20秒間積算した値を第１表に示した。
H7.8）、16μｌの0.1M硫酸マグネシウム、24μｌの1mM
ルシフェリン（シグマ社製）及び10μｌの粗酸素液を混
合したのち、100μｌの20mMATPを添加し、発生するフォ
トン数を20秒間積算した値を第１表に示した。
また、比較のため、プラスミドpUC119 DNAを有する大
腸菌DH1株〔大腸菌DH1（pUC119）〕についても同様にル
シフェラーゼ活性を測定し、その結果を第１表に示し
た。
腸菌DH1株〔大腸菌DH1（pUC119）〕についても同様にル
シフェラーゼ活性を測定し、その結果を第１表に示し
た。
上表より明らかな如く、本発明は、対照に比し、フォ
トン数が増加しているため、本発明に用いた大腸菌菌体
中にルシフェラーゼが生産されていることが判明した。
トン数が増加しているため、本発明に用いた大腸菌菌体
中にルシフェラーゼが生産されていることが判明した。
第１図は、ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼ
の至適pH域を示す図であり、第２図は、ルシオラ・ラテ
ラリス由来のルシフェラーゼの安定pHを示す図であり、
第３図は、組み換え体プラスミドpALf3DNAの制限酵素に
よる切断地図を示す図であり、第４図は、組み換え体プ
ラスミドpGLf1DNAの制限酵素による切断地図を示す図で
あり、第５図は、本発明の新規な組み換え体プラスミド
pHLf7DNAの制限酵素による切断地図を示す図である。
の至適pH域を示す図であり、第２図は、ルシオラ・ラテ
ラリス由来のルシフェラーゼの安定pHを示す図であり、
第３図は、組み換え体プラスミドpALf3DNAの制限酵素に
よる切断地図を示す図であり、第４図は、組み換え体プ
ラスミドpGLf1DNAの制限酵素による切断地図を示す図で
あり、第５図は、本発明の新規な組み換え体プラスミド
pHLf7DNAの制限酵素による切断地図を示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】ルシオラ・ラテラリス（Luciola laterali
s）由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含み、
下記の制限酵素地図を有し、且つその塩基長が2,000bp
であるDNAをベクターDNAに挿入したことを特徴とする新
規な組み換え体DNA。 （式中、EIはEcoRI,SはSspI,EVはEcoRV,AはApaI,HはHpa
Iをそれぞれ示す） - 【請求項２】請求項１記載の組み換え体DNAを含むエッ
シェリシア属に属する微生物を培地中で培養し、培養物
より該ルシフェラーゼを採取することを特徴するルシフ
ェラーゼの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63162402A JPH082305B2 (ja) | 1988-07-01 | 1988-07-01 | 新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェラーゼの製造法 |
| DE1989610036 DE68910036T2 (de) | 1988-07-01 | 1989-06-30 | Luciferase-Gen und neue rekombinante DNA sowie Verfahren zur Herstellung von Luciferase. |
| EP19890111958 EP0353464B1 (en) | 1988-07-01 | 1989-06-30 | Luciferase gene and novel recombinant DNA as well as a method for production of luciferase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63162402A JPH082305B2 (ja) | 1988-07-01 | 1988-07-01 | 新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0213379A JPH0213379A (ja) | 1990-01-17 |
| JPH082305B2 true JPH082305B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=15753927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63162402A Expired - Fee Related JPH082305B2 (ja) | 1988-07-01 | 1988-07-01 | 新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH082305B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07112434B2 (ja) * | 1988-12-22 | 1995-12-06 | キッコーマン株式会社 | ルシフェラーゼ遺伝子 |
| GB2343320B (en) | 1998-10-31 | 2003-03-26 | Ibm | Camera system for three dimentional images and video |
| JP5587644B2 (ja) * | 2010-03-15 | 2014-09-10 | キッコーマン株式会社 | ホタルルシフェラーゼ、その遺伝子、およびホタルルシフェラーゼの製造法 |
-
1988
- 1988-07-01 JP JP63162402A patent/JPH082305B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MOL CELL BIOL=1987 * |
| PROC NATL ACAD SCI=1977 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0213379A (ja) | 1990-01-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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