JPH0213379A

JPH0213379A - 新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェラーゼの製造法

Info

Publication number: JPH0213379A
Application number: JP16240288A
Authority: JP
Inventors: Hiroki Tatsumi; 宏樹辰巳; Naoki Kajiyama; 直樹梶山; Eiichi Nakano; 中野　衛一
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1988-07-01
Filing date: 1988-07-01
Publication date: 1990-01-17
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: JPH082305B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規な組み換え体ＤＮＡ及び該ＤＮＡを用い
るルシフェラーゼの製造法に関する。

（従来の技術〕ルシオラ（Ｌｕｃｉｏｌａ）属ホタルのルシフェラーゼ
は、収集されたルシオラ属ホタルより分離、精製されて
得られているに過ぎない〔「ブロク・ナトル・アカド・
サイＪ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）
　、第７４巻、第７号、第２７９９〜２８０２頁（１９
７７）　）。

上記ルシフェラーゼは、例えば、ＡＴＰの定量用酵素と
して極めて有用な酵素である。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、上記ルシフェラーゼは、昆虫由来である
ため、その製造には、ルシオラ属ホタルを自然界より採
取するか、あるいは、該ホタルを養殖し、得られた該ホ
タルよりルシフェラーゼを分離、精製しなければならず
、その製造には、多大な時間と労力を要するものであっ
た。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、ルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ
　Ｉａｔｅｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼをコード
する遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入し
た組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体ＤＮＡをエツ
ジエリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生
物に含ませ、該微生物を培地に培養することにより、短
期間のうちに効率よくルシフェラーゼが生産されること
等の知見を得、本発明を完成した。

すなわち本発明は、ルシオラ・ラテラリス（Ｌｕ−ｃｉ
ｏｌａ　１ａｔｅｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼを
コードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した新規な組
み換え体ＤＮＡであり、また本発明は、ルシオラ・ラテ
ラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ　Ｉａｔｅｒａｌｉｓ）由来の
ルシフェラーゼをコードする遺伝子をベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含むエツジエリシア属に属
する微生物を培地中で培養し、該培養物よりルシフェラ
ーゼを採取することからなるルシフェラーゼの製造法で
ある。

以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、ルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ　１ａｔ
ｅｒａ−１ｉｓ）　（ヘイケボタル）のルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを検索する際、プ
ローブとしてホタルの１種である同属のルシオラ・クル
シアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ　ｃｒｕｃｉａｔａ）　（ゲン
ジボタル）のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有
するＤＮＡを使用し、また、ルシオラ・クルシアタのル
シフェラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを検
索する際、プローブとしてホタルの１種であるフォティ
ナス・ビラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）
（アメリカホタル）のルシフェラーゼをコードする遺伝
子を含有するＤＮＡを使用する。

従って、以下に先ずフォティナス・ビラリスのルシフェ
ラーゼをコードする遺伝子の調製法について述べ、次に
、ルシオラ・クルシアタ（ｌｕＣｉｏｌａｃｒｕｃｉａ
ｔａ）のルシフェラーゼをコードする遺伝子の調製法に
ついて述べ、最後に、ルシオラ・ラテラリスのルシフェ
ラーゼをコードする遺伝子の調製法について述べる。

ホタルの１種であるフォテイナス・ビラリスの連部より
ｍ−ＲＮＡを調製するには、例えば、「モレキュラー・
クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ−ｉ
ｎｇ）、第１９６　Ｌ　ｒコールド・スプリング・ハー
バ−、ラボラトリ−Ｊ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｔｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）及び
「分子遺伝学実験法」小関治男、志村令部、第６６〜６
７頁（１９８３）記載の方法等により得ることができる
。

得られたｍ−ＲＮＡよりルシフェラーゼをコードするｍ
−ＲＮＡを濃縮するには、例えば、「バイオメディカル
・リサーチ」（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ）、第３巻、第５３４〜５４０頁（１９８２）記載の
方法により行なうことができる。

なお、この際、ルシフェラーゼに対する抗ルシフェラー
ゼ血清を使用するのであるが、該血清は、例えば、「免
疫化学」山村雄−１第４３〜５０頁（１９７３）記載の
方法により得ることができる。

ルシフェラーゼをコードするｍ−ＲＮＡよりｃ−ＤＮＡ
を合成するには、例えば、「モル・セル・パイオルＪ　
（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１
頁（１９８２）及びジーン（Ｇｅｎｅ）　、第２５巻、
第２６３頁（１９８３）記載の方法により行なうことが
できる。

次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡ、プラ
スミドｐＫＮ３０５　（’アグル・パイオル・ケムＪ　
（Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第５０巻、第２７
１頁（１９８６）記載の大腸菌トリプトファンオペロン
のプロモーターを有するプラスミド〕及びプラスミドｐ
Ｍ　Ｃ１８４３（ｒメソズ・イン・エンザイモロジー」
（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｔｏｇｙ）、第１
００巻、第２９３〜３０８頁（１９８３）記載の大腸菌
β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を有するプラスミド〕
を用いて作製したプラスミド］等に組み込み、種々の組
み換え体プラスミドＤＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例え
ば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（Ａ　Ｔ　ＣＣ
３３８４９）、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｔ）　ＨＢ　１０１　　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３６９
４）等をハナハン（４１ａｎａｈａｎ）の方法〔「ディ
ーエヌエイ・クローニング」（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｔｎｇ
）　、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）　）に
より形質転換し、種々の形質転換株を得る。

なお、このようにして得られた形質転換株の有する組み
換え体プラスミドＤＮＡは、大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ構造遺伝子の途中にｃ−ＤＮＡが組み込まれたプラス
ミドであって、ｃ−ＤＮＡによりコードされているペプ
チドは、β−ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として
発現するものである。

上記の種々な形質転換株よりルシフェラーゼをコードす
るｃ−ＤＮＡを検出するには、形質転換株を培養するこ
とにより、菌体蛋白質を発現させ、抗ルシフェラーゼ血
清と交差する蛋白質が存在するか否かにより検出するこ
とができ、例えば、「アゲリック・パイオル・ケムＪ　
　（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）、第５０巻、第２７１頁（１９８６）及び
「アナル・バイオケム」（＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、
）、第１１２巻、第１９５頁（１９８１）記載の方法等
により行なうことができる。

次いで、不完全なルシフェラーゼのｃ−ＤＮＡを３２Ｐ
を用いニックトランスレーション法〔「モレキュラー・
クローニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第１０９〜１１２頁、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ａｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、（１９８２）及び「ジ
エイ・モル・パイオルＪ　　（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）　、第１１３巻、第２３〜２５１頁（１９
７７）　）により標識したのち、８亥ｃ−ＤＮＡをブロ
ーフ゛としてコロニーハイブリダイゼイション法〔「蛋
白質、核酸、酵素」第２６巻、第５７５〜５７９頁（１
９８１）　）によりプラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡ　（宝
酒造社製）をベクターとして作成したｃ−ＤＮＡのシー
ンバンクのライブラリーより１’、　８　Ｋ　ｂのルシ
フェラーゼをコードするｃ−ＤＮＡを含有するプラスミ
ドＤＮＡを得ることができる。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡよりフォティナス・ビラリス由来のルシフェラー
ゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを得るには、該
プラスミドＤＮＡに、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ及び
Ｃ１ａＩを温度３０〜４０°Ｃ１好ましくは３７°Ｃで
１〜２４時間、好ましくは２時間作用させ得られる反応
終了液を、アガロースゲル電気泳動法〔「モレキュラー
・クローニング　」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）　、第１５０頁、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）記載］で処理
することにより得ることができる。

次に、ルシオラ・クルシアタのルシフェラーゼをコード
する遺伝子の調製法等について述べる。

ルシオラ・クルシアタの連部からのｍ−ＲＮＡの調製及
びｍ−ＲＮＡからのｃ−ＤＮＡの合成は、例えば、上述
したフォティナス・ビラリスのｍ−ＲＮＡの調製法及び
ｃ−ＤＮＡの合成法と全く同様にして行なうことができ
る。

次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡ等に組み
込み、種々の組み換え体プラスミドＤＮＡを得、該ＤＮ
Ａを用いて例えば、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９）、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１　（Ａ　Ｔ　ＣＣ
３３６９４）等をハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法〔
「ディーエヌエイ・クローニング」（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）　
）により形質転換し、種々の形質転換株を得る。

次いで、フオテイナス・ビラリス由来のルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを３２Ｐを用いニ
ックトランスレーション法〔［モレキュラー・クローニ
ングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第
１０９〜１１２頁、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ａｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）及び「ジエイ・モ
ル・パイオルＪ　　（Ｊ、ＭＯｌ。

Ｂｉｏｌ、）　、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１
９７７）　）により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプロ
ーブとしたコロニーハイブリダイゼイション法〔「蛋白
質・核酸・酵素」第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９
８１）　）により、プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡをベク
ターとして作成したルシオラ・クルシアタ由来のｃ−Ｄ
ＮＡのシーンバンクのライブラリーよりルシフェラーゼ
をコードするｃ　−Ｄ　ＮＡ（２，０Ｋｂ）を含有する
プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を得ることができる
。

このようにして得られた微生物より純化された組み換え
体ＤＮＡを得るには、例えば、「ブロク・ナトル・アカ
ド・サイＪ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、）、第６２巻、第１１５９〜１１６６頁（１９６９）
記載の方法などにより得ることができる。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡよりルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを得るには、該プ
ラスミドＤＮＡに、制限酵素、例えばＰｓｔｌを温度３
０〜４０℃、好ましくは３７°Ｃで１時〜２４時間、好
ましくは２時間作用させて反応終了液を、アガロースゲ
ル電気泳動法〔「モレキュラー・クローニング」（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０１、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）（１９８２）記載〕で処理することにより得ることが
できる。

次に、ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼをコ
ードする遺伝子の調製法等について述べる。

ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼをコードす
るｍ−ＲＮＡは、ルシオラ・ラテラリス連部に存在する
ため該尾部は、ｍ−ＲＮＡ採取源として好ましい。

ルシオラ・ラテラリスの尾部からのｍ−ＲＮＡの調製及
びｍ−ＲＮＡからのｃ−ＤＮＡの合成は、例えば、上述
したフォテイナス・ビラリスのｍ−ＲＮＡの調製法及び
ｃ−ＤＮＡの合成法と全く同様にして行なうことができ
る。

次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＵｃ１１９ＤＮＡ等に組
み込み、種々の組み換え体プラスミドＤＮＡを得、該Ｄ
ＮＡを用いて例えば、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｔ）　Ｄ　Ｈ１（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９）、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１　（Ａ　Ｔ　ＣＣ
３３６９４）等をハナハン（）Ｉａｎａｈａｎ）の方法
〔「ディーエヌエイ・クローニングＪ　　（ＤＮＡ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８
５）　）により形質転換し、種々の形質転換株を得る。

次いで、前述の如くして得られたルシオラ・クルシアタ
由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡを３２ｐを用いニックトランスレーション法〔「モ
レキュラー・クローニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）　、第１０９〜１１２頁、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　１ａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２
）及び「ジエイ・モル・パイオルＪ　（Ｊ、Ｍｏ１．８
ｉｏ１．）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７
７）　）により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプローブ
としたコロニーハイブリダイゼイション法〔「蛋白質・
核酸・酵素」第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９８１
）　〕により、プラスミドｐＵｃ１１９ＤＮＡをベクタ
ーとして作成したルシオラ・ラテラリス由来のｃ−ＤＮ
Ａのシーンバンクのライブラリーよりルシフェラーゼを
コードするｃ−ＤＮＡ（２，０Ｋｂ）を含有するプラス
ミドＤＮＡを含有する大腸菌を得ることができる。

次いで、上記微生物を培地中で培養し、培養物よりルシ
フェラーゼを採取する。

培地としては、例えば、エツシェリア属に属する微生物
の培養に用いられるものであれば、如何なるものでもよ
く、例えば、トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０
．５％（Ｗ／Ｖ）　、ＮａＣｌ　Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）及
び１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド等
が挙げられる。

また、培養温度は、例えば、３０〜４０″Ｃ１好ましく
は３７°Ｃ程度で、培養時間は、例えば、４〜８時間、
好ましくは４時間程度である。

そして、培養物より菌体を例えば、８．０００ｒ、ｐ、
ｍ。

で１０分間程度の遠心分離処理により集関し、得られた
菌体を、例えば、「メンズ・イン・エンサイモロジー」
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１
３３巻、第３〜１４頁（１９８６）記載の方法により破
砕し、粗酵素液を得る。

そして、粗酵素液は、そのままでも使用可能であるが、
必要により硫安分画、疎水クロマトグラフ法、例えば、
ブチル−トヨパール６５００等、ゲル濾過法、例えば、
ウルトロゲルＡｃＡ３４等により精製して、純化された
ルシフェラーゼを得る。

このようにして得られたルシフェラーゼの理化学的性質
は、以下に示す通りである。

０作　用：下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である。

本酵素／［／　’／　７　ｓ　Ｕ　７　＋　Ａ　Ｔ　Ｐ　＋　
Ｏｚ　　ｂオキジルシフェリン＋ＡＭＰ＋ピロリン酸＋
ＣＯ□＋光 ■基質特異性：ＡＤＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰには作用しない。

■至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは、ルシフェリンを基質とし、２５ｎ＋Ｍグリ
シルグリシンのｐＨをｐＨ６，５〜１１．５迄変化させ
、温度３０°Ｃで反応させ、２０秒間発光量（フォトン
数）を測定した場合、第１図に示す如（ｐＨ７，５〜９
．５であり、また安定ｐＨ範囲は、ルシフェリンを含有
する緩衝液（ｐ　Ｈ４，６〜８．０　：　２５ｍＭリン
酸緩衝液、ｐ　Ｈ８，０〜１１．５　：　２５ａ＋Ｍグ
リシン・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液をそ
れぞれ使用。なお、それぞれの緩衝液には１０％飽和と
なる如く硫酸アンモニウムを添加したものである。）に
酵素を添加し、温度０°Ｃで４時間作用させた場合、第
２図に示す如く、６．０〜１０．５である。なお、第２
図において、Ｈ及びト→は、それぞれ２５ｍＭリン酸緩
衝液、及び２５ｍＭグリシン・塩化ナトリウム−水酸化
ナトリウム緩衝液を使用した場合の活性を示す。

■力価の測定法：２５ｍＭグリシルグリシン（ｐＨ’７．８）８ｍｆ、硫
酸マグネシウム溶液（２５ｍＭグリシルグリシン（ｐＨ
７，８）に硫酸マグネシウムを０．１Ｍとなる如く添加
した溶液３０．５ｍｌ及びルシフェリン溶液（２５ｍＭ
グリシルグリシン（ｐＨ７，８）にルシフェリンを１ｍ
Ｍとなる如く添加した溶液）０．８ｒｒＩｌを混合して
ルシフェリン混合液を調製する。

このようにして得たルシフェリン混合液４００μｉ及び
測定するルシフェラーゼ１０μ２を混合したものに、Ａ
ＴＰ溶液（２５ｍＭグリシルグリシン（ｐＨ７，８）に
ＡＴＰを１０ｍＭとなる如く添加したもの。）　８０μ
ｌを注入すると同時に、ルミノメータ−（アロ力社製、
ルミネッセンスリーダ　Ｂ　Ｌ　Ｒ−２０１）により発
生するフォトン数を２０秒間積算して求める。

■作用適温の範囲：ｐＨ７，８のちとに、各温度で反応させ２０秒間発光量
（フォトン数）を測定した場合、０〜５０″Ｃの範囲内
にある。

■ｐＨによる失活の条件：ｐＨ５，０以下及びｐＨ１２，０以上で４時間後完全に
失活する。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明によれば、本発
明の新規な組み換え体ＤＮＡを含むエツジエリシア属に
属する微生物を培地に培養することにより、極めて短期
間のうちに、ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラー
ゼを効率よく製造することができるので、本発明は産業
上極めて有用である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。

実施例なお、以下に述べる項目１〜１０には、ホタルの１種で
あるフォティナス・ビラリスのルシフェラーゼをコード
する遺伝子を含有するＤＮＡ（該ＤＮＡは、ルシオラ・
クルシアタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有
するＤＮＡを検索する際、プローブとして使用されるも
のである。）の調製について述べ、また、以下の項目１
１〜１３には、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラ
ーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ　（該ＤＮＡ
は、ルシオラ・ラテラリスのルシフェラーゼをコードす
る遺伝子を含有するＤＮＡを検索する際、プローブとし
て使用されるものである。）の調製について述べる。

１、ｍ−ＲＮＡの調製ホタルの１種であるフォティナス・ビラリス（Ｐｈｏｔ
ｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）の乾燥用部（シグマ社製）
１ｇを乳鉢及び乳棒を用いて充分破砕したものに、溶解
緩衝液５　ｔｎｌ　（２０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（
ｐ）１７．４）／　１０ｍＭ　ＮａＣ１／　３ｍＭ酢酸
マグネシウム１５％（Ｗ／Ｖ）’ｉ　ｇｗ！／　１．２
％（Ｖ／Ｖ）　　）リド７　Ｘ　−１００／　１０ｍＭ
バナジルヌクレオシド錯体にューイングランド　バイオ
ラボ社製）〕を添加し、更に、上記と同様に破砕してフ
ォティナス・ピラリス連部破砕物含有溶液を得た。

このようにして得た溶液５−を、カップ型プレンダ−（
日本精機製作所社製）に入れ、５．００Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で５分間処理したものに、１２−のグアニジンイソチオ
シアネート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシアネート／
３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）１０．
７５％（Ｗ／Ｖ）　Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウ
ム１０．１５Ｍ　β−メルカプトエタノール）を添加し
、更に、上記ブレンダーを用い３，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、
で１０分間処理して得た溶液を、３重のガーゼを用いて
濾過し、濾液を得、超遠心分離機用チューブ（日立工機
社製）４本に、予め１．２　ｍＺの５．７Ｍの塩化セシ
ウム溶液を夫々重層し、その上に、上記濾液を重層する
ように夫々分注し、超遠心分離機（日立工機社製、５Ｃ
Ｐ５５Ｈ）を用いて温度１５°Ｃ，３０，０００ｒ、ｐ
、ｔ’ｍ、で１６時間遠心分離して沈澱物を得た。

得られた沈澱物を、冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを用
いて洗浄したものを、１０ｍＭ　）リス緩衝液（１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１５ｍＭＥＤＴＡ
／１％ドデシル硫酸ナトリウム〕４ｍｌに懸濁したもの
に、同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを４対１
（容量比）となる如く混合したものを添加して抽出し、
常法により３．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離
し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機溶媒層に上
記１０ｍＭ　）　’Ｊス緩衝液４−を添加し、上記抽出
及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得られた水
層に、１／１０１０３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）
及び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−２０
″Ｃで２時間放置したのち、常法により８．００Ｏｒ、
ｐ、ｍ、で２０分間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱させ、得
られたＲＮＡを４ｍＺの水に溶解し、上記エタノール沈
澱操作を行なったのち、得られたＲＮＡを１−の水に溶
解し、３．７５ｍｇのＲＮＡを得た。

そして、以上の操作を再度繰り返すことにより合計７■
のＲＮＡを調製し、このＲＮＡ中よりｍ−ＲＮＡを選択
するために、７■のＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロ
ースにューイングランドバイオラボ社製）カラムクロマ
トグラムにかけた。

カラムとして２．５−テルモシリンジ（テルモ社製）を
用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液（１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／１ｍＭＤＰＴＡ１０．１％
（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム］で膨潤させた
のち、カラムに充填し、結合緩衝液〔１０１１Ｍトリス
−塩酸（ｐＨ７，６）／　１　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ／　
０．４Ｍ　ＮａＣ１／　０．１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕で平衡化したものである。

７■のＲＮＡに、同量の緩衝液〔１０１１Ｍトリス−塩
酸（ｐＨ７，６）／　１＋＋＋ＭＥＤＴＡ１０．８Ｍ　
ＮａＣｌ１０．１％ドデシル硫酸ナトリウム］を添加し
、温度６５°Ｃで１０分間加熱処理し、水中で急、冷し
、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかけたのち、結
合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及びｔ−
ＲＮＡを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−ＲＮＡ
を溶出し、４０Ｍｇのｍ７ＲＮＡを得た。

２、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮次に、シｇ稠密度勾配遠心分離法によりルシフェラーゼ
ｍ−ＲＮＡを濃縮した。

１０〜２５％（Ｗ／Ｖ）のショ糖密度勾配は、ベックマ
ン社製のローターＳ　Ｗ４１用ポリアロマチューブに４
０％（Ｗ／Ｖ）　シｇｔＦｔ液（５０ｍＭ　）リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）／２０ｍＭ　ＮａＣ１／　１　
ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ／４０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖）０．５
ｍＺを入れ、その上に２．４　ｍＩずつ２５％（Ｗ／Ｖ
）、２０％（Ｗ／Ｖ）、１５％（Ｗ／Ｖ）及び１０％（
Ｗ／Ｖ）　（７）　シ！！糖液を重層し、温度４°Ｃで
２４時間放置することにより作製した。このシ＝＋　１
１密度勾配に、ｍｍ−ＲＮＡ３０ｕを重層し、ベックマ
ン社製のＳ　Ｗ４１０−ターを用い、常法により３０．
０ＯＯｒ、ｐ、ｍ９、温度１８”Ｃ”ｒ１８１８時間遠
心を行なった。遠心分離操作ののち、０．５−ずつ分画
し、エタノール沈澱法によりｍ−ＲＮＡを回収し、１０
μｌの水に溶解した。

次に、ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、ルシフェラーゼのｍ−ＲＮＡが濃縮されてい
る画分の同定を行なった。分画したＲＮＡＩμ１１ウサ
ギ網状赤血球ライセード（アマジャム社製）９μ！及び
（”Ｓ）メチオニン１μｌ（アマジャム社製）を混合し
、温度３０°Ｃで３０分間反応させたものに、１５０μ
２ＯＮＥＴＩＩ衝液（１５０ａＭ　ＮａＣ１／　５　ｍ
ＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ１０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＮａＮｚ／　
２０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１０．０
５％（Ｗ／Ｖ）ノニデットＰ−４０（ベセスダリサーチ
ラボラトリー社製、界面活性剤）〕を添加し、更に、１
μｌの抗ルシフェラーゼ血清（後述のようにして調製し
たもの。）を添加し、温度４°Ｃで１８時間放置したも
のに、１０■のプロティンＡセファロース（ファルマシ
ア社製）を添加し、温度２０°Ｃで３０分間放置したも
のを、常法により１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１分間遠
心分離処理し、樹脂を回収した。

回収した樹脂を、２００μ２のＮＥＴ緩衝液で３回洗浄
し、この樹脂に、４０ｕｌの５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプ
ル緩衝液（６２，５ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ
６，８）　／　１０％（Ｖ／Ｖ）グ＋Ｊ　（Ｆ　ｏ　−
／Ｌ／／　２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム１５
％（Ｖ／Ｖ）メルカプトエタノール１０．０２％（Ｗ／
Ｖ）　７’ロムフエノールブルー］を添加し、温度１０
０°Ｃで３分間煮沸し、常法により１２．００Ｏｒ、ｐ
、ｍ、で１分間遠心分離処理し、上清を回収し、全量を
７．５％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲルに乗せた。

ゲル電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法〔
「ネーチュアーＪ　（Ｎａｔｕｒｅ）、第２２７頁、第
６８０頁（１９７０）　）で行ない、泳動したのちのゲ
ルは、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋白
質を固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍサ
リチル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して乾
燥ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フィルム社製、Ｒ
Ｘ）を用いてフルオログラフィーを行なった。

以上の操作により、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの存在す
る両分のＲＮＡを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ蛋
白質のバンドがＸ線フィルム上に認められ、ルシフェラ
ーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されている両分が同定できた。

３、抗血清の調製精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラーゼ
血清は、以下の方法により調製した。

３．２■／ｄ’ａ度のルシフェラーゼ溶液〔シグマ社製
ルシフェラーゼを０．５Ｍグリシルグリシン溶液（ｐＨ
７，８）に溶解したもの）０．７ｒＢｌを、等量のフレ
ンド（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジユバントで懸濁したちの
２．２４■を、抗原として体重２ｋｇの日本内色種ウサ
ギの指軍部に投与し、飼育２週間経過し、たのち、初回
と同量の抗原を背部及内へ投与し、更に、飼育１週間経
過したのち、同様の操作を行ない、また更に、飼育１週
間後全採血を行なった。

そして、得られた血液を、温度４°Ｃで１８時間放置し
たものを、常法により３．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１５分
間遠心分離し、上清として抗ルシフェラーゼ血清を得た
。

４、ｃ−ＤＮＡの合成ｃ−ＤＮＡの合成は、アマジャム社製キットを用いて行
なったものである。

上述の如くして得られたｍ−ＲＮＡ２μｇを用いてアマ
ジャム社の指示する「モル・セル・パイオルＪ　（Ｍｏ
１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（１
９８２）及び「ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第
２６３頁（１９８３）記載の方法に従い行なった結果、
３００ｎＨの２末鎖ｃ−ＤＮＡが得られた。

このｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａ１５０ｎｇを、７ａｆのＴＥｆｆ
ｌ衝液〔１１０１１Ｉトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）／　１　ｍＭＥ　Ｄ　ＴＡ）に溶解したものに、１１
μｌの混液（２８０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐ　Ｈ
６，８）／　６０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ６
，８）　／　２　ｍＭ塩化コバルト〕及び３．８μ２の
ティリング混液（１０ｍＭジチオスレイトール７、５１
１１　／　１０ｎｇ　／−ポリ　（ｐｏｌｙ）　　Ａ　
１　ｕ　Ｅ　／　５　ｎ＋ＭｄＣＴＰ２μ２／水１１０
μ！〕を夫々水加１０μ！〕２９ユニツトのターミナル
トランスフェラーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）
を添加し、温度３０℃で１０分間反応させたのち、２．
４μ２の０．２５ＭＥＤＴＡ及び２．４ｕｌＯ）１０％
（Ｗ／Ｖ）　　ドブ’／）Ｌ／硫酸ナトリウムを夫々添
加して反応を停止させた。

反応停止液に２５μｌの水飽和フェノールを用いて除蛋
白処理を行なったのち、回収した水層に、２５μｌの４
Ｍ酢酸アンモニウム及び１００μｌの冷エタノールを夫
々添加し、温度−７０°Ｃで１５分間放置し、１２．０
０Ｏｒ、ｐ、ｎ＋、で１０分間遠心分離してｃ−ＤＮＡ
を回収し、１０μ２のＴＥ緩衝液に溶解し、Ｃ−ＤＮＡ
溶解液を得た。

以上の如くしてデオキシシチジンのティルの付いたｃ　
−Ｄ　Ｎ　Ａｌｏｏｎｇを得た。

５、ベクターに使用する組み換え体プラスミドｐＭｃＥ
ｌｏＤＮＡの調製大腸菌Ｗ３１１０株（Ａ　Ｔ　ＣＣ２７３２５）、プラ
スミドｐＢ　Ｒ３２５（Ｂ　ＲＬ社製）及びプラスミド
ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　（全酒造社製）を用いてティー・
マスダ等（Ｔ、Ｍａｓｕｄａ　ｅｔ、ａｌ、）　　’ア
グリカルチエラル・バイオロジカル・ケミストリーＪ　
　（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏ−１ｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５０巻、第２７１〜２７
９頁（１９８６）記載の方法により作製したプラスミド
ｐＫＮ３０５ＤＮＡ並びにプラスミドｐＭｃ１４０３−
３ＤＮＡ（特開昭６１−２７４６８３号公報記載）夫々
ｌμｇを、１０μｌの混液〔５０ＩＩＩＭトリスー塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）／１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１００
ｍＭ　ＮａＣ１／　１　ｍＭジチオスレイトール］に添
加し、更に、これに、Ｈｉｎｄ　ｍ及び５ａｌＩ　（い
ずれも全酒造社製）を夫々２ユニツトずつ添加し、温度
３７°Ｃで１時間反応させて切断処理し、常法によるフ
ェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を
得た。この沈澱物を、１０μｌのライゲーション緩衝液
（２０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　／６６ｍＭ　）リス−塩酸緩
衝液（ｐ　Ｈ７，６）　／　１　ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ　／　
１５ｍＭジチオスレイトール〕に溶解し、溶液を得、更
に、１ユニツトの７４ＤＮＡリガーゼ〔全酒造社製〕を
添加し、温度２０℃で４時間連結反応を行なった。

次いで、この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジ
ー」（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ−、第１１９巻、
第１０７２頁〜第１０７４頁（１９７４年））記載の形
質転換法により、大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ３３８７６）株を形質転換し、薬剤耐性（アンピシリ
ン耐性及びテトラサイクリン感受性）及びβ−ガラクト
シダーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有
する組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＭｃＥｌｏと命名
した。

この組み換え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡを含有す
る大腸菌ＪＭＩＯＩ株を、トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、
酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）　、及びＮａＣ１０，５
％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１２に、該培地を用い温度３
７°Ｃで１６〜２４時間前培養して得た大腸菌Ｊ　ＭＩ
ＯＩ　（ｐＭ　ＣＥｌｏ）の培養液２０−を接種し、温
度３７°Ｃで３時間振盪培養したのち、０．２ｇのクロ
ラムフェニコールを添加し、更に同一温度で２０時時間
項養を行ない、培養液を得た。

次いで、この培養液を、常法により６．００Ｏｒ、ｐ、
ｍ。

で１０分間遠心分離して湿潤菌体２ｇを得、これを２０
−の２５％（Ｗ／Ｖ）　　シーＩ９ｆＩＭを含有する３
５０ｍＭ　　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁
したのち、更に、これに、リゾチーム１０■、０．２５
Ｍ　ＥＤＴＡ熔液（ｐＨ８，０）　８　ｄ及び２０％（
Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８−を夫々添
加し、温度６０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液
を得た。

この溶菌液に、５ＭＮａＣｌ溶液１３ｍＺを添加し、温
度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５．０
０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得、
常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理
を行ない沈澱物を得た。

次いで、この沈澱物を、通常の減圧乾燥処理したものを
、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　）リス−塩酸緩
衝液６　ｍｌ　（ｐ　Ｈ７，５）に溶解し、更に、これ
に、塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド溶液（
１０ｍｇ／ｉｆ）　０．２　ｍｌを添加したものを、常
法により３９．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分
離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み
換え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡを単離し、また更
に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを
除去したのち、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０μ！Ｍト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない
純化された組み換え体プラスミドｐＭ　ＣＥＩＯＤ　Ｎ
　Ａ３００μｇを得た。

６、ベクターＤＮＡの調製以上の様にして得られた組み換え体プラスミドｐＭ　Ｃ
ＥＩＯＤ　Ｎ　Ａ１５μｇを、９０μ２の項目４記載の
ＴＥ緩衝液に溶解し、１０μ！のＭｅｄ緩衝液〔１００
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）　／　１００
ｍＭ　ＭｇＣ１□／１０ｍＭジチオスレイトール１５０
０ｍＭ　ＮａＣＩ）を添加したのち３０ユニツトの制限
酵素Ａｃｃ　Ｉ　（全酒造社製）を更に加え、温度３７
℃で１時間切断処理を行ない切断処理物を得た。この切
断処理物に、１００μｌの水飽和フェノールを加え除蛋
白操作を行なったのち、水層を回収し、これに、１／１
０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，５）及び２倍量の
冷エタノールを加え、温度−７０°Ｃで１５分間放置し
たのち、１２．００Ｏｒ、ｐ、ｎ＋、で１０分間遠心分
離し、ＤＮＡを回収した。

このＤＮＡを、１０ｕＲのＴＥ緩衝液に溶かし、１５μ
！の混液（２８０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６、
８）　／　６０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，
８）　／　２　ｍＭ塩化コバルト）を加えたのち、更に
、５μ２のティリング混液（項目４記載）（５ｍＭｄＧ
ＴＰを用いた）を加え、また更に、５ユニツトのターミ
ナルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）を添加し、温度
３７°Ｃで１５分間反応させた。項目４記載のｃ−ＤＮ
Ａティリング反応と同様の後処理を行なうことにより組
み換え体プラスミドｐＭＣＥＩＯＤＮＡのＡｃｃＩサイ
トにデオキシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡを調製
した。

一方、プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡのＰｓｔｌサイトに
デオキシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡの調製も同
時に行なった。

プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡ　（宝酒造社製）３０μｇ
を、３５０μ２のＴＥｌｊｌ衝液に溶解したものに、４
０μ２のＭｅｄ緩衝液及び制限酵素上１０　（宝酒造社
製）１２０ユニツトを夫々添加し、温度３７°Ｃで１時
間切断処理したのち、常法によりフェノールによる除蛋
白処理及びエタノール沈澱処理によりＤＮＡを回収した
。

得られたＤＮＡを、３５μ２のＴＥ緩衝液に溶解したも
のに、５０μ２の混液（２８０ｍＭカコジル酸ナトリウ
ム（ｐＨ６，８）　７６０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（
ｐＨ６，８）／１ｍＭ塩化コバルト〕、１９μｌの項目
４記載のティリング混液（ｄＧＴＰ含有）並びに６０ユ
ニツトのターミナルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）
を夫々添加し、温度３７°Ｃで１０分間反応させたのち
、常法によりフェノール処理及びエタノール沈澱を行な
うことによりＤＮＡを回収した。

７．７二−リング及び形質転換合成したｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａ１５ｎｇ及びベクターＤ　Ｎ
　Ａ２００ｎｇを、３５μｌのアニール緩衝液（１０ｍ
Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／１００ｍＭ　
ＮａＣ１／　ｌ　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）に溶解し、温
度６５°Ｃで２分間、温度４６°Ｃで２時間、温度３７
°Ｃで１時間及び温度２０゛Ｃで１８時間放置する操作
によりｃ−ＤＮＡとベクターＤＮＡをアニールした。

アニールしたＤＮＡを用いて、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈ
ａｎ）の方法〔「ディーエヌエイ　クローニング」（Ｄ
　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３
５頁（１９８５）　）により大腸菌ＤＨＩ株（Ａ　Ｔ　
ＣＣ３３８４９）を形質転換し、プラスミドｐＵｃ１９
ＤＮＡ及び組み換え体プラスミドｐＭ　ＣＥＩＯＤ　Ｎ
　ＡをベクターとしたＣ−ＤＮＡバンクを夫々作製した
。

８、ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索組み換え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡのＡｃｃ１部
位は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする
部位にあるので、この部位に組み込まれたｃ−ＤＮＡは
β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を作る。また組み
換え体プラスミドｐＭＣＥＩＯのβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子のプロモーターは前述した様に大腸菌トリプトフ
ァン遺伝子のプロモーターに変換しである。

組み換え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡを、ベクター
とするｃ−ＤＮＡバンクのコロニー９６個を１０−のＭ
９カザミノ酸培地〔「モレキュラー・クローニング」（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第４４０〜
４４１頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト
リ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）　　）にチアミン（１０
μｇ／ｍＺ）を加えた培地を用い温度３７°Ｃで１０時
間振盪培養し、常法により集菌したのち、２００μ！の
項目２記載の５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液に懸濁
し、温度１００″Ｃで５分間煮沸した。

この懸濁液４０μ２を、７．５％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリ
ルアミドゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった
。泳動終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウェスタンプ
ロット法〔「アナル・バイオケム・」（Ａｎａｌ、Ｂｉ
ｏｃｈ＠、）、第１１２巻、第１９５頁（１９８１）　
）によりニトロセルロースのフィルターに転写し、この
ニトロセルロースフィルターをイミューンプロットアッ
セイキット　（バイオランド社製）を用いて抗ルシフェ
ラーゼ血清で染色した。方法は、バイオランド社の操作
法に従った。

即チニトロセルロースのフィルターヲ、１００ｒｄのブ
ロッキング溶液［ＴＢＳ緩衝液〔２０１１ＩＭトリスー
塩酸緩衝液１５００ｍＭ　ＮａＣ１（Ｐ　Ｈ７，５）　
）に３％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンを溶かした溶液］中温度
２５°Ｃで、３０分間振盪した。次に、このニトロセル
ロースフィルターを２５−の−次抗体溶液〔ルシフェラ
ーゼ抗血清を１％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンをＴＢＳ緩衝液
に溶かした溶液で２５倍（Ｖ／Ｖ）に希釈した溶液〕に
移し、温度２５℃で９０分間振盪したものを、１００ｍ
１のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　　２０洗液（ＴＢＳ緩衝
液に０．０５％（−／ν）のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　
　２０を溶かした溶液）中に移し、温度２５°Ｃで１０
分間振盪する操作を２回行なった。次いで、このように
して得たニトロセルロースフィルターを６０ｍ１の二次
抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウ
サギ抗体（バイオ・ランド社製）を１％（Ｗ／Ｖ）のゼ
ラチンをＴＢＳ緩衝液に溶かした溶液で３０００倍（Ｖ
／Ｖ）に希釈した溶液〕中に移し、温度２５°Ｃで６０
分間振盪したのち、１００ｍｆのツイーン（Ｔｗｅｅｎ
）　　２０洗液でニトロセルロースフィルターを洗う上
記操作ヲ２回繰り返し、このようにして得たニトロセル
ロースフィルターを、１２０−の発色液〔６０■の４−
クロロ−１−ナフトールを２０−の冷メタノールに溶解
した溶液及び６０μ２の３０％（Ｖ／Ｖ）過酸化水素水
を１００ｄのＴＢＳ緩衝液に添加した溶液を混合した溶
液〕中に移し、温度２５℃で１０分間発色させた。

この様にして９６個のコロニーを１グループとして４グ
ループについて同様の方法を行なったところ、２つのグ
ループでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが
認められた。次に、この２つのグループに属する９６個
のコロニーを１２個のコロニーずつ８グループに分は同
様の操作を行なったところ夫々１グループに抗ルシフェ
ラーゼ血清と反応する蛋白質が認められた。最後に、こ
のグループに含まれる１２個のコロニーを、１個のコロ
ニーずつ同様の操作を行ないルシフェラーゼ抗血清と反
応する蛋白質を作るコロニーを同定した。以上の操作に
よりルシフェラーゼｃ−ＤＮＡをもつ２個のコロニーが
得られた。この２個のコロニーより項目５記載の方法で
プラスミドＤＮＡを調製した。得られた組み換え体プラ
スミドＤＮＡは、ｐＡＬｆ２Ｂ８及びｐＡＬｆ３Ａ６と
夫々命名した。

９、大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−ＤＮＡの
プローブの作製組み換え体プラスミドｐＡ　Ｌｆ３　Ａ　６　Ｄ　ＮＡ
１００μｇを、３３０μ２のＴＥ緩衝液に溶解し、これ
に４０μｌのＬｏ−緩衝液（１００ｍＭ　）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）／１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　／１
０ｍＭジチオスレイトール〕、１３０ユニツトのＰｓｔ
ｌ　　（宝酒造社製）及び１２０　ユニッ）（７）Ｓａ
ｃＩ　　（バーリンガー・マンハイム社製）を添加し、
温度３７℃で１．５時間切断した。

このＤＮＡ全量を０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルを
用いた電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は
ティー・マニアテス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法
〔「モレキュラー・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、第１５６〜１６１頁、コールド
・スプリング−／”ｔ−バー・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　
（１９８４）　）に従って行なった。ルシフェラーゼｃ
−ＤＮＡを含むＤＮＡバンドを切り出し、透析チューブ
に入れ、２＠ｌのＴＥ緩衝液を加えたのち、透析チュー
ブをシールし、電気泳動により、ゲル中より緩衝液中に
ＤＮＡを溶出した。

この溶液に等容量の水飽和フェノールを加え、撹拌した
のち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱により
ＤＮＡを回収した。

得られたＤＮＡフラグメント１０μｇを、１２６μρ（
７）ＴＥ緩衝液に溶かし、１６μのＭｅｄ緩衝液及び６
４ユニツトの５ａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）を加え、温度
３７°Ｃで２時間反応させたのち、全量を５％（Ｗ／Ｖ
）ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により、Ｄ
ＮＡ断片の分離を行なった。ポリアクリルアミドゲル電
気泳動は、エイ・マクサム（Ａ、Ｍａｘａｍ）の方法〔
「メソズ・イン・エンサイモロジー」（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６５巻、第５０６頁
（１９８０）　）に従って行なった。１９０ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを前述と同様の方法で単離し、１μｇの
５ａｕ３Ａ■ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡフラグメントが
得られた。

この１μｇのルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを、〔α−”Ｐ
）ｄｃＴＰ　　（アマジャム社製）を用いてニックトラ
ンスレーション法により標識した。

ニックトランスレーションは宝酒造社製のキットを用い
、宝酒造社の指示する［ジエイ・モル・パイオルＪ　（
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　、第１１３巻、第２３７〜
２５１頁（１９７７）及び「モレキュラー・クローニン
グＪ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第１
０９〜１１２頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）記載の方法に従って
行なった。

１０、大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−コロニ
ーハイブリダイゼーション前述の方法で調製した３２Ｐで標識したルシフェラーゼ
ｃ−ＤＮＡ断片を、プローブとして用い、組み換え体プ
ラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡをベクターとするフォティナ
ス・ピラリス連部ｃ−ＤＮＡバンクを、コロニーハイブ
リダイゼーション法（「蛋白質・核酸・酵素」第２６巻
、第５７５〜５７９頁（１９８１）で検索し、ルシフェ
ラーゼｃ−ＤＮＡを有するコロニーを得た。そのうちの
１個のコロニーの有する組み換え体プラスミドＤＮＡを
ｐＡＬｆ３と命名し、項目５記載の方法でプラスミドＤ
ＮＡを調製した。該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有
する大腸菌を大腸菌ＤＨＩ　（ｐＡＬｆ３）と命名した
。なお、該形質転換株はＡ　Ｔ　ＣＣ６７４６２として
寄託されている。

そして、上記組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡを
、Ｘｂａｌ、、ＨｉｎｄＩ［Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ及びＰｓｔｌ　　（いずれも宝酒造社製）を用い、単
一消化及び２重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動法により移動度パターンを分析し、得ら
れた移動度パターンとλＤＮＡ　（宝酒造社製）をＨｉ
ｎｄｌｌＩにより消化して得られたＤＮＡ断片の標準移
動度パターンと対比することにより得られた分子量は、
１，７００ｂｐであり、上記プラスミドの制限酵素地図
は、第３図に示すとおりであった。

１１、ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ　Ｃｒｕ
ｃｉａｔａ）のｍ−ＲＮＡの調製生きたルシオラ・クルシアタ　（ゲンジボタル・株式会
社・西武百貨店より購入）１０ｇを超低温冷凍庫に入れ
、凍結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾
部２ｇに、１８ｍ１のグアニジンイソチオシアネート溶
液を添加し、項目１記載の方法に従って１．１■のＲＮ
Ａを調製した。このＲＮＡ１．１■を項目１記載の方法
に従ってオリゴ（ｄＴ）−セルロースのカラムクロマト
グラフィーを行ない３０ｇｇのルシオラ・クルシアタ連
部ｍ−ＲＮＡを調製した。

１２、ルシオラ・クルシアタ足部ｃ−ＤＮＡバンクの作
製ｃ−ＤＮＡの合成はアマジャム社より購入したキットを
用い、アマジャム社の指示する「モル・セル・パイオル
Ｊ　（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１
６１頁（１９Ｂ２）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻
、第２６３頁（１９８３）記載の方法に従って合成した
。

２μｇのルシオラ・クルシアタ連部ＲＮＡより０．９μ
ｇの二本鎖ｃ−ＤＮＡが合成された。このｃ−ＤＮＡ０
．３μｇに項目４記載の方法を用いてポリデオキシシチ
ジンのテイルを付加した。

このｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａ２０ｎｇ及び項目６で調製したポ
リグアノシンのテイルをそのＰｓｔＩ部位に付加したｐ
Ｕｃ１９プラスミドＤ　Ｎ　Ａ５００ｎｇを、項目７記
載の方法でアニールし、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の
方法〔［ディエヌエイ・クローニング」（ＤＮＡ　ＣＩ
ｏｎ−ｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８
５）　）に従ってアニールしたＤＮＡにより大腸菌ＤＨ
Ｉ株（ＡＴＣＣ３３８４９）を形質転換しルシオラ・ク
ルシアタ足部ｃ−ＤＮＡバンクを作製した。

１３、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ−
ＤＮＡの検索項目１０で得られた組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３Ｄ
ＮＡ１０μｇを、９０μ！のＴＥ緩衝液に溶解し、１０
μ２のＭｅｄ緩衝液、２５ユニツトの制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及び２５ユニツトの制限酵素のＣ１ａｌ（いずれも宝
酒造・社・製）を添加し、温度３７°Ｃで２時間反応を
行ないＤＮＡを切断した。切断した組み換え体プラスミ
ドｐＡＬｆ３ＤＮＡよりフォテナス・ビラリス（アメリ
カホタル）由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ部分を含む
８００ｂｐの足並ＲＩ／Ｃ１ａＩＤＮＡフラグメントを
、項目９記載のアガロースゲル電気泳動法を用いる方法
に従って単離し、１μｇの旦ｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩＤＮＡ
フラグメントを得た。この１μｇのＤＮＡを、〔α−３
２Ｐ〕ｄＣＴＰ三燐酸（アマジャム社製）を用いて項目
９記載のニックトランスレーション法により３２Ｐで標
識した。３ｔｐで標識した１並Ｒ１／Ｃ１ａｌＤＮＡフ
ラグメントをプローブとして、ルシオラ・クルシアタ連
部ｃ−ＤＮＡバンクを項目１０記載のコロニーハイブリ
ダイゼーション法で検索することによりルシオラ・クル
シアタ由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを有する大腸菌
を選択した。プローブとハイブリダイズする大腸菌コロ
ニーを数個得た。この中の１コロニーの有するプラスミ
ドＤＮＡをｐＧＬｆｌと命名し、項目５記載の方法に従
い組み換え体プラスミドＤＮＡを単離した。

組み換え体プラスミドｐＧＬｆｌＤＮＡを且匹１　。

ＨｉｎｄｌＩ［、ＥｃｏＲＶ、　Ｄｒａ　ｉへｆｌＩ［
、且ｔｎｃｌｌ＋Ｐｓｔｌ　　（いずれも宝酒造社製）
及）距１　　にューイングランドバイオラボ社製）を用
い、単一消化及び二重消化して得られたＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動法により、移動度パターンを分析
し、得られた移動度パターンとλフアージＤＮＡ（宝酒
造社製）を且ｉｎｄ　ｍにより消化して得られたＤＮＡ
断片の標準移動度パターンとを対比することにより得ら
れた分子量は、２．０００ｂｐであり、上記プラスミド
の制限酵素地図は、第４図に示す通りである。

１４、ルシオラ・ラテラリスのｍ−ＲＮＡの調製生きた
ルシオラ・ラテラリス（ヘイケボタル・川原鳥獣貿易よ
り購入）５ｇを超低温冷凍庫に入れ、凍結し、はさみを
用いて尾部を切り離し、得られた尾部１ｇに、１８−の
グアニジンイソチオシアネート溶液を添加し、項目ｌ記
載の方法に従って３４０μｇのＲＮＡを調製した。この
ＲＮＡ３４０μｇを項目１記載の方法に従ってオリゴ（
ｄＴ）　−セルロースのカラムクロマトグラフィーを行
ない６μｇのルシオラ・ラテラリス連部ｍ−ＲＮＡを調
製した。

１５、ルシオラ・ラテラリス連部ｃ−ＤＮＡバンクの作
製ｃ−ＤＮＡの合成は、アマジャム社製キットを用いて行
なったものである。

上述の如くして得られたｍ−ＲＮＡ　２．Ｏｕｇを用い
てアマジャム社の指示する１モル・セル・パイオルＪ　
（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１
頁（１９８２）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第
２６３頁（１９８３）記載の方法に従い行なった結果、
２５０ｎｇの２重鎖ｃ−ＤＮＡが得られた。

このようにして得たｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａ２５０ｎｇに、ア
マジャム社製ｃ−ＤＮＡクローニングキットを用い、ア
マジャム社の指示する方法により制限酵素Ｅｃ。

Ｒ１切断部位のメチル化を行ない、更にｃ−ＤＮＡの両
端にＥｃｏＲＩリンカ−を付着させた。

プラスミドｐＵｃ１１９　ＤＮＡ（宝酒造社製）１００
ｎｇを、８μｌの水に溶解したものに、１μ２のＭｅｄ
緩衝液（１００ｍＭ　　ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）　１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ　／１抛門ジチオスレ
イトール１５００ｍＭ　ＮａＣｌ　）を添加したのち、
更に、これに、１０ユニツト　（１μ！！、）の制限酵
素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を添加し、温度３７°Ｃで
１時間切断処理を行なった。

次いで、この切断処理物に、１μ！の１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）及び０．３ユニツト　（１μ２）
のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加し、
温度６５°Ｃで１時間酵素反応処理し、切断処理物の両
端の脱リン酸化を行ない、これに、１２μ２の水飽和フ
ェノールを添加して除蛋白を行なったのち、回収した水
層に、１μ２の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ　Ｈ５，８）及
び２６μ２の冷エタノールを夫々添加し、温度−７０°
Ｃで１５分間放置し、微量遠心機〔■トミー精工、ＭＲ
Ｘ−１５０：ｌを用い、１２．０００ｒ、ｐ、ｍ、で５
分間遠心分離処理を行ないＤＮＡを回収した。

このようにして得られた制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、
かつ両端を脱リン酸化したプラスミドベクターｐＵｃ１
１９　ＤＮＡ　１１００ｎと、項目１５で調製したｃ　
−Ｄ　ＮＡ　２５０ｎｇを混合したものを、８μｆの水
に懸濁したのち、これに、１μｌの×１０ライゲーショ
ン緩衝液（２００ＩＩＩＭ　ＭｇＣ１ｚ／６６０ｍＭ　
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／１０ｍＭ　ＡＴ　
Ｐ／１５０ｍＭジチオスイレトール〕を添加したものに
、ｌユニット（１μりのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）を添加し、温度１６°Ｃで１６時間放置し、プラス
ミドベクターＤＮＡ及びｃ−ＤＮＡのライゲーションを
行ない反応物を得た。

この反応物を用いて、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方
法〔「ディーエヌエイ・クローニング、（ＤＮＡＣｌｏ
ｎｉｎｇ）　、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５
）　）により大腸菌ＤＨＩ株（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９
）を形質転換し、プラスミドｐＵｃ１１９　ＤＮＡをベ
クターとしたルシオラ・ラテラリス尾部由来のｃ−ＤＮ
Ａバンクを作製した。

１６、ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼｃ−
ＤＮＡの検索項目１３で得られた組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　Ｉ
　ＤＮＡバンクｇを、９０ｕ１．のＴＥ緩衝液に溶解し
、１０μｌのＭｅｄ緩衝液、２５ユニツトの制限酵素Ｐ
ｓｔＩ　　（全酒造社製）を添加し、温度３７°Ｃで２
時間反応を行ないＤＮＡを切断した。切断した組み換え
体プラスミドｐＧＬ　ｆ　Ｉ　ＤＮＡよりルシオラ・ク
ルシアタ由来のルシフェラーゼα−ＤＮＡ部分を含む２
．ｏｏｏｂｐのＰｓｔｌＤＮＡフラグメントを、項目９
記載のアガロースゲル電気泳動法を用いる方法に従って
単離し、１μｇのＰｓｔｌＤＮＡフラグメントを得た。

この１μｇのＤＮＡを、〔α−”Ｐ）ｄＣＴＰ　（アマ
ジャム社製）を用いて項目９記載のニックトランスレー
ション法により３２ｐで標識した。３２Ｐで標識したＰ
ｓｔｌＤＮＡフラグメントをプローブとして、ルシオラ
・ラテラリス連部ｃ　　Ｄ　Ｎ　Ａバンクを項目１０記
載のコロニーパイプリダイゼーション法で検索すること
によりルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼｃ−
ＤＮＡを有する大腸菌を選択した。プローブとハイブリ
ダイズする大腸菌コロニーを数個得た。この中の１コロ
ニーの有するプラスミドＤＮＡをｐＨＬｆ７と命名し、
項目５記載の方法に従い組み換え体プラスミドＤＮＡを
単離した。

なお、このようにして得られた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
ＤＨＩ（ｐＨＬｆ？）は、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第１９１７号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９
１７）として寄託されている。

組み換え体プラスミドＬ比エエｆ７　ＤＮＡを１匹Ｉ　
。

１匹ＲＶ　、　ｂＩ　、旦１ｎｄｌｎ及び１並ＲＩ（い
ずれも全酒造社製）及び３ＬｉＩ　にューイングランド
バイオラボ社製）を用い、単一消化及び二重消化して得
られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により、
移動度パターンを分析し、得られた移動度パターンとλ
フアージＤＮＡ　（全酒造社製）をＨｉｎｄＩ［Ｉによ
り消化して得られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンと
を対比することにより得られたルシオラ・ラテラリスの
ルシフェラーゼをコードする遺伝子の分子量は、２．０
００ｂｐであり、上記プラスミドの制限酵素地図は、第
５図に示す通りである。

１７、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（ｐＨＬ　ｆ
　？）　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９１７）の培養及び粗酵
素液の調製大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈｌ　（ｐＨＬ　ｆ　７
）　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９１７）を、Ｌ　Ｂ−ａｍｐ
培地〔バタトトリプトン１％（−ハ）１酵母エキス０．
５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）　。

及びアンピシリン（５０ｐｇ／＋ｎＺ）　）　３−にて
温度３７°Ｃで１８時間振盪培養を行なった。この培養
液０．５−を１０ｍ／の上記Ｌ　Ｂ−ａｍｐ培地に接種
し、更に、これに、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトシドを添加し、温度３７°Ｃで４時間振盪培
養したのち、３，０００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間の遠心
分離操作により湿潤菌体２０■を得た。

回収した菌体を、０．　Ｉ　Ｍ　Ｋ１１ｚＰＯ４（ｐＨ
７，８）、２ＩＩＩＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイト
ール及び０．２■／−プロタミン硫酸からなる緩衝液０
．９−に懸濁し、更に、これに、１００μ２の１０■／
−のりゾチーム溶液を添加し、水中に１５分間放置した
。次に、この懸濁液を、メタノール・ドライアイス浴中
で凍結し、続いて温度２５°Ｃに放置し、完全に解凍し
た。

更に、１２．００Ｏｒ、ｐ、ｎ＋、で５分間遠心分離操
作を行なうことにより上清として粗酵素液１−を得た。

このようにして得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活
性の測定は、下記記載の方法により行ない、その結果を
第１表に示した。

得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活性の測定は、ク
リツカ（Ｋｒｉｃｋａ）等の方法（「アチーブス・オブ
・バイオケミストリー・アンド・バイオフイズイクスＪ
（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）　、第２１７巻、第６
７４頁（１９８２）　）に従って生成するフォトン数を
計測することにより行なった。

すなわち、２６０μ２の２５ｍＭグリシルグリシン緩衝
液（ｐＨ７，８）、１６μ２の０．１Ｍ硫酸マグネシウ
ム、２４μｌの１−ルシフェリン（シグマ社製）及び１
０μ！の粗酵素液を混合したのち、１００μ２の２０ｍ
ＭＡＴＰを添加し、発生するフォトン数を２０秒間積算
した値を第１表に示した。

また、比較のため、プラスミドｐＵｃ１１９　ＤＮＡを
有する大腸菌ＤＨＩ株［大腸菌ＤＨＩ（ρＵＣ１１９）
］についても同様にルシフェラーゼ活性を測定し、その
結果を第１表に示した。

（重置以下余白）第１表上表より明らかな如く、本発明は、対照に比し、フォト
ン数が増加しているため、本発明に用いた大腸菌菌体中
にルシフェラーゼが生産されていることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼ
の至適ｐＨ域を示す図であり、第２図は、ルシオラ・ラ
テラリス由来のルシフェラーゼの安定ｐＨを示す図であ
り、第３図は、組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡ
の制限酵素による切断地図を示す図であり、第４図は、
組み換え体プラスミドｐａｔ、ｆ　Ｉ　ＤＮＡの制限酵
素による切断地図を示す図であり、第５図は、本発明の
新規な組み換え体プラスミドｐＨＬｆ７ＤＮＡの制限酵
素による切断地図を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ　ｌａｔ
ｅｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼをコードする遺伝
子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な
組み換え体ＤＮＡ。
（２）請求項１記載の組み換え体ＤＮＡを含むエッシェ
リシア属に属する微生物を培地中で培養し、培養物より
該ルシフェラーゼを採取することを特徴とするルシフェ
ラーゼの製造法。