JPH03285683A - 変異型ホタルルシフェラーゼ、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、変異型ホタルルシフェラーゼ、変異型ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及び変
異型ホタルルシフェラーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、野生型ホタルルシフェラーゼとしては、例えば、
ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル等由来の
ルシフェラーゼか知られており、これらルシフェラーゼ
をルシフェリンと反応させた場合、黄緑色（波長５６０
ｎｍ前後）の光を発する。

しかしながら、黄緑色以外の光を発するホタル由来ルシ
フェラーゼは、全く知られていないのが実情である。

〔本発明が解決しようとする課題〕

そして、野生型ホタルルシフェラーゼを用いて、赤色等
の有色溶液中の物質、例えば、血液中のＡＴＰ含有量を
測定する場合、著しく測定感度が低下する等の欠点があ
った。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、先に本発明者等は、黄緑色以外の光を発する変
異型ホタルルシフェラーゼを取得すべく種々検討した結
果、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を変異処理して
変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を取得し、該遺伝子
をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、
変異型ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエツジエリ
シア属に属する微生物を培地に培養すれば、野生型ホタ
ルルシフェラーゼの発光する波長とは全く異なる、例え
ば、赤色、オレンジ色等の光を発光することのできる変
異型ホタルルシフェラーゼを効率よく得ることができる
こと等の知見を得、特許出願を行った（特願平２−７５
６９６号）。

更に、本発明者等は、上記以外の光を発する変異型ホタ
ルルシフェラーゼを取得すべく種々検討した結果、野生
型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を取得し、該遺伝子をベ
クターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、変異
型ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエツジエリシア
属に属する微生物を培地に培養すれば、緑の光を発光す
ることのできる変異型ホタルルシフェラーゼを効率よく
得ることができることの知見を得、更にまた、上記した
赤色、オレンジ色及び緑色の光を発光することのできる
変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を夫々単離、構造決
定することに成功し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、次の構成を含むものである。

（１）野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を変異処理す
ることを特徴とする変異型ホタルルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の取得法。

（２）変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子
が、ルシフェリンと反応する際、赤色、オレンジ色又は
緑色等の野生型ホタルルシフェラーゼとは異なる色の光
を発光する変異型ホタルルシフェラーゼをコードするも
のである請求項１記載の遺伝子の取得法。

（３）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて２３３位のバリンがイソロイシンに、２３９位のバ
リンがイソロイシンに、２８６位のセリンがアスパラギ
ンに、３２６位のグリシンがセリンに、４３３位のヒス
チジンがチロシンに、または４５２位のプロリンがセリ
ンに変異されているアミノ酸配列をコードする変異型ホ
タルルシフェラーゼ遺伝子。

（４）上記（３）記載の変異型ホタルルシフェラーゼ遺
伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規
な組み換え体ＤＮＡ０ （５）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の２
３３位においてバリンがイソロイシンに、２３９位にお
いてバリンがイソロイシンに、２８６位のセリンがアス
パラギンに、３２６位のグリシンがセリンに、４３３位
においてヒスチジンがチロシンに、または４５２位にお
いてプロリンかセリンに変異されているアミノ酸配列を
コードする変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクタ
ーＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、変異型ホ
タルルシフェラーゼ生産能を有するエッシャリシア属に
属する微生物を培地に培養し、培養物より、変異型ホタ
ルルシフェラーゼを採取することを特徴とする変異型ホ
タルルシフェラーゼの製造法。

（６）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いてその２３３位のバリンかイソロイシンに、２３９位
においてバリンがイソロイシンに、２８６位のセリンが
アスパラギンに、３２６位のグリシンがセリンに、　４
３３位のヒスチジンかチロシンに、または４５２位のプ
ロリンがセリンに変異されていることを特徴とする変異
型ホタルルシフェラーゼ。

以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、本発明に用いられる野生型ホタルルシフェラーゼ
遺伝子としては、ホタル由来のものであれば、如何なる
ものでもよく、例えは、ゲンジボタル、ヘイケボタル、
アメリカホタル等由来のものが挙げられる。

そして、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を変異処理
して変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を得るのである
。

この変異処理においては、野生型ホタルルシフェラーゼ
遺伝子をそのまま変異処理してもよ（、また、該遺伝子
を、プラスミドベクターあるいはバクテリオファージベ
クター等のベクターＤＮＡに組み込んで得られる組み換
え体ＤＮＡを変異処理してもよい。

上記野生型ゲンジボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮ
Ａは、特開平１−５１０８６号公報記載の方法あるいは
野生型へイケボタル遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは
、特開昭６３−３２２０２９号公報記載の方法等により
得ることができる。

次いで、上記変異処理としては、例えば、野生型ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子あるいは該遺伝子の組み込まれた
組み換え体ＤＮＡと、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ
−メチル−Ｎ　ニトロ−Ｎニトロソグアニジン、亜硝酸
、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシル等の
薬剤とを（接触作用させる量としては、如何なる量でも
よく、好ましくは、０．５〜１２Ｍである。）、例えば
、温度２０〜８０°Ｃて１０分間以上、好ましくは１０
〜１８０分間接触作用させるか、あるいは上記遺伝子あ
るいは組み換え体ＤＮＡに、紫外線を例えば、ｌＯ〜６
０分間程度照射等の処理等が挙げられ、また有機合成、
酵素合成による合成りＮＡを用いることもできる。

上述の如くして得られた変異型ホタルルシフェラーゼ遺
伝子を、常法により特開平１−５１０８６号公報あるい
は特願昭６３−３２２０２９号明細書記載のプラスミド
、バクテリオファージベクター等のベクターＤＮＡに組
み込み、組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体ＤＮＡ
又は上述の如くして得られた変異型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡを用いて、例
えば、エフシエリシア属に属する微生物、例えば、大腸
菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＪＭ　１０１（ＡＴＣＣ３３８７
６）、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＩ　１（ＡＴＣＣ３
３８４９）、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１（
ＡＴＣＣ３３６９４）等をハナハン（Ｈａｎａ−ｈａｎ
）の方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８
５））等により形質転換するか、あるいはモレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｏｏｎｉｎｇ
）、第２５６〜２６８頁、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙＸ１９８２）記載の方法等により形質導入
して形質転換株あるいは形質導入株を得る。

そして、上記菌株より変異型ホタルルシフェラーゼ生産
能を有する菌株をスクリーニングすることにより、変異
型ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入
した組み換え体ＤＮＡを含み、変異型ホタルルシフェラ
ーゼ生産能を有するエフシェリシア属に属する菌株を得
ることかできる。

このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー（Ｐ、
　Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法［ジェイ、バクテリオロジ−
（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１
０６４〜１０６６頁（１９７３年）］、デー・ビー・フ
レウェル（Ｄ、　Ｂ。

Ｃｌｅｗｅｌｌ）の方法［ジェイ、バクテリオロジー第
１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）］などに
より得ること０ ができる。

そして、このようにして得られた組み換え体ＤＮＡより
変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを
得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに制限酵素、例
えばＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ　Ｉを温度３０〜４０°Ｃ１
好ましくは３７°Ｃで１〜２４時間、好ましくは２時間
作用させて、反応終了液をアガロースゲル電気泳動法〔
［モレキュラー・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０頁、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）
記載〕で処理することにより得ることができる。

一方、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列の
決定は実施例の項目１７に示す方法行うことができる。

上記のようにして得られた変異型ホタルルシフェラーゼ
遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを
含み、変異型ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエツ
ジエリシア属に属する菌株を用いて変異型ホタルルシフ
ェラーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法
で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培
養するのか好ましい。

また、上記菌株を培養する培地としては、例えば酵母エ
キス、トリジ１−ン、ペプトン、肉エキス、コーンステ
イープリカーあるいは大豆もしくは小麦　の浸出液等の
１種以上の窒素源に、塩化すトリウム、リン酸第１カリ
ウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マ
グネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マン
ガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により
糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる
。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７°Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間、通気攪拌
深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好
ましい。

培養終了後、該培養物より変異型ホタルルシフェラーゼ
を採取するには、通常の酵素採取手段を１ ２ 用いて得ることかできる。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行わせ本酵素を菌体外に排
出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部分
を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロ
タミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸したの
ち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分
画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。

上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得るには、例えば
セファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を
用いるゲル濾過法、イオン交換体を用いる吸着溶出法、
ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロ
キシアパタイトを用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心
法等の沈降法、アフィニティクロマト法、分子ふるい膜
もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、組
合わせて実施することにより、精製された酵素標品を得
ることが出来る。

上述の如（して得られた変異型ホタルルシフェラーゼの
理化学的性質は、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応
させた際、発光する光の波長が５６０ｎｍ前後から例え
ば、５９５ｎｍ、　６０７ｎｍ　（オレンジ色）、　６
０９ｎｍ、　６１２ｎｍ（赤色）、　５５８ｎｍ　（緑
色）に変化する以外は変異型ゲンジボタルルシフェラー
ゼは。

特開平１−１４１５９２号公報記載の理化学的性質と、
また、変異型へイケボタルルシフェラーゼは、特開平１
−２６２７９１号公報記載の理化学的性質と同様である
。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかなように、本発明野生型ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡを含み、変異型ホタルルシフェラーゼ生産
能を有するエツジエリシア属に属する微生物を培地に培
養することにより、野生型ホタルルシフェラーゼの発光
する波長とは全く異なる、例えば、赤色、オレンジ色、
緑色等の光を発光することのできる変異型ホタルルシフ
３ ４ ェラーゼを効率よく得ることができるので本発明は産業
上極めて有用である。

また、本発明において得られる変異型ホタルルシフェラ
ーゼは、従来の野生型ホタルルシフェラーゼと比較して
赤色（例えば、血液等）、オレンジ色、緑色等の溶液中
のＡＴＰ含有量を著しく高感度に測定することかできる
ので極めて有用なものである。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

なお、以下にのべる項目１〜１０には、ホタルの１種で
あるフォティナス・ビラリスのルシフェラーゼをコード
する遺伝子を含有するＤＮＡ　（該ＤＮＡは、ルシオラ
・クルシアタのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡを検索する際、プローブとして使用される
ものである。）の調製についてのべる。

１、ｍ−ＲＮＡの調製 ホタルの１種であるフオティナス・ビラリス（Ｐｈｏｔ
ｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）の乾燥足部（シグマ社製）
１ｇを乳鉢及び乳棒を用いて充分破砕したものに、溶解
緩衝液５　ｍｎ　（２０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）／　１０ｍＭ　ＮａＣ１，／　３　ｍＭ酢酸
マグネシウム１５％（ｗ／ｖ）ショ糖／１．２％（Ｖ／
Ｖ）　　）リドンＸ　−１００／　１０ｍＭバナジルヌ
クレオシド錯体にューイングランド　バイオラボ社製）
〕を添加し、更に、上記と同様に破砕してフォティナス
・ピラリス足部破砕物含有溶液を得た。

このようにして得た溶液５ｍｌを、カップ型ブレンダ−
（日本精機製作所社製）に入れ、５．００Ｏｒ、　ｐ、
　ｍ。

で５分間処理したものに、１２ｒｎｌのグアニジンイソ
チオシアネート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシアネー
１−　／　３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，
０）　１０．７５％（Ｗ／Ｖ）　Ｎ−ラウロイルザルコ
シンナトリウム１０．１５Ｍβ−メルカプトエタノール
）を添加し、更に、上記ブレンダーを用い３．０００ｒ
、　ｐ、　ｍ、で１０分間処理して得た溶液を、３重の
ガーゼを用いて濾過し、濾液を得、超遠心分離機用チュ
ーブ（日立工種社製）４本に、予め１．２　ｍｌの５．
７Ｍの塩化セ５ 】　６ シウム溶液を夫々重層し、その上に、上記濾液を重層す
るように夫々分注し、超遠心分離機（日立工種社製、５
ＣＰ５５Ｈ）を用いて温度１５°Ｃ，３０，０００ｒ、
　ｐ、　ｍ、で１６時間遠心分離して沈澱物を得た。得
られた沈澱物を、冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを用い
て洗浄したものを、１０ｍＭ　トリス緩衝液（１０ｍＭ
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）／　５　ｍＭＥ　Ｄ
　Ｔ　Ａ／　１％ドデシル硫酸ナトリウム）４ｍｊに懸
濁したものに、同量のｎ−ブタノール及びクロロフォル
ムを４対１　（容量比）となる如（混合したものを添加
して抽出し、常法により３．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で
１０分間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、こ
の有機溶媒層に上記１０ｍＭ　トリス緩衝液４ｍｊを添
加し、上記抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返
して得られた水層に、１／ｌＯ量の３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５，２）及び２倍量の冷エタノールを添加したも
のを温度−２０°Ｃで２時間放置したのち、常法により
８．０００ｒ、　ｐ、　ｍ、て２０分間遠心分離し、Ｒ
ＮＡを沈澱させ、得られたＲＮＡを４７ｎ１の水に溶解
し、上記エタノール沈澱操作を行なったのち、得られた
ＲＮＡを１ｍｇの水に溶解し、３．７５ｍｇのＲＮＡを
得た。

そして、以上の操作を再度繰り返すことにより合計７■
のＲＮＡを調製し、このＲＮＡ中よりｍＲＮＡを選択す
るために、７■のＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
スにューイングランドバイオラボ社製）カラムクロマト
グラムにかけた。

カラムとして２．５　ｍｌテルモシリンジ（テルモ・社
・製）を用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液（１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／　１　ｍＭＤ　Ｅ
　Ｔ　Ａ　１０、１％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウ
ム〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液（
］ＯｍＭ）リス−塩酸（１）Ｈ７，６）／　１　ｍＭＥ
　Ｄ　Ｔ　Ａ／　０．４　Ｍ　ＮａＣ１１，１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム〕で平衡化したものである。

７ｍｇのＲＮＡに、同量の緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７，６）／　１ｍＭＥＤ　ＴＡｌｏ、　８Ｍ　Ｎ
ａＣ１１０，１％ドデシル硫酸ナトリウム〕を添加し、
温度６５°Ｃで１０分間加熱処理し、水中で急冷し、オ
リゴ（ｄＴ）セルロースカラムにかけたのち、結合緩衝
液て７ ８ 樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及びｔ　−ＲＮＡを
完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液てｍ−ＲＮＡを溶出し
、４０μｇのｍ−ＲＮＡを得た。

２、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮 衣に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりルシフェラーゼ
ｍ−ＲＮＡを濃縮した。

１０〜２５％（Ｗ／Ｖ）のショ糖密度勾配は、ベックマ
ン社製のローターＳＷ旧用ポリアロマチューブに４０％
（Ｗ／Ｖ）ショ糖液（５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（
１）Ｈ７，５）／２０ｍＭ　ＮａＣ１／　１　ｍＭＥ　
Ｄ　Ｔ　Ａ／　４０％（Ｗ／Ｖ）シヨ糖３０．５ｍｌを
入れ、その上に２．４　ｒｎ（！ずつ２５％（Ｗ／Ｖ）
、２０　％　（Ｗ／Ｖ）、１５％（Ｗ／Ｖ）及び１０％
（Ｗ／Ｖ）　（７）ショ糖液を重層し、温度４°Ｃで２
４時間放置することにより作製した。このショ糖密度勾
配に、ｍＲＮ　Ａ　３０μｇを重層し、ベックマン・社
・製の５Ｗ４１０−ターを用い、常法により３０．００
Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、、温度１８°Ｃで１８時間遠心分離
を行なった。１遠心分離操作ののち、０．５　ｍｌずつ
分画し、エタノール沈澱法によりｍ−ＲＮＡを回収し、
ｌＯμｌの水に溶解した。

次に、ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、ルシフェラーゼのｍ−ＲＮＡが濃縮されてい
る両分の同定を行なった。分画したＲＮＡ　１μ！、ウ
サギ網状赤血球ライセード（アマジャム社製）９μｌ及
び〔３５Ｓ〕メチオニン１μβ（アマジャム社製）を混
合し、温度３０’Ｃで３０分間反応させたものに、１５
０μｐのＮＥＴ緩衝液（１５０＋＋＋ＭＮａＣ１／　５
　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　１０．０２％　（Ｗ／Ｖ）Ｎａ
Ｎ３／　２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）
／　０．０５％（Ｗ／Ｖ）ノニデットＰ−４０（ベセス
ダリサーチラボラトリー社製、界面活性剤）〕を添加し
、更に、１μｌの抗ルシフェラーゼ血清（後述のように
して調製したもの。）を添加し、温度４°Ｃで１８時間
放置したものに、１０■のプロティンＡセファロース（
ファルマシア社製）を添加し、温度２０’Ｃて３０分間
放置したものを、常法により１２．０００ｒ、　ｐ、　
ｍ、で１分間遠心分離処理し、樹脂を回収した。

回収した樹脂を、２００μｌのＮＥＴ緩衝液で３回洗浄
シ、コノ樹脂ニ、４０μＡ（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サ
ンプル緩衝液（６２，５ｍＭ　Ｉ・リス−塩酸緩衝液９ ０ （ｐＨ６，８）／　１０％　（Ｖ／Ｖ）グリ（？Ｏ−ル
／　２　％　（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム１５％
（Ｖ／Ｖ）メルカプトエタノール１０．０２％（Ｗ／Ｖ
）ブロムフェノールブルー〕を添加し、温度１００°Ｃ
で３分間煮沸し、常法により１２．０００ｒ、　ｐ、　
ｍ、て１分間遠心分離処理し、上清を回収し、全量を７
．５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲルに乗せた。

ゲル電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法〔
「ネーチュアーＪ　（Ｎａｔｕｒｅ）、第２２７頁、第
６８０頁（１９７０））で行ない、泳動したのちのゲル
は、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋白質
を固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍサリ
チル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して乾燥
ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フィルム社製、ＲＸ
）を用いてフルオログラフィーを行なった。

以」二の操作により、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの存在
する画分のＲＮＡを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ
蛋白質のバンドがＸ線フィルム」二に認められ、ルシフ
ェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されている両分が同定できた
。

３、抗ルシフェラーゼ血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラーゼ
血清は、以下の方法により調製した。

３．２■／艷濃度のルシフェラーゼ溶液〔シグマ社製ル
シフェラーゼを０．５Ｍグリシルグリシン溶液（ｐＨ７
，８）に溶解したもの〕０．７ｍｌを、等量のフレンド
（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジユバントで懸濁したもの２．
２４■を、抗原として体重２ｋｇの日本白色種ウサギの
指掌部に投与し、飼育２週間経過したのち、初回と同量
の抗原を背部皮内へ投与し、更に、飼育１週間経過した
のち、同様の操作を行ない、ま更に、飼育１週間後全採
血を行なった。

そして、得られた血液を、温度４°Ｃで１８時間放置し
たものを、常法により３．０００ｒ、　ｐ、　ｍ、て１
５分間遠心分離し、上清として抗ルシフェラーゼ血清を
得た。

４、ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−ＤＮＡの合成は、アマジャム・社・製キットを用い
て行なったものである。

上述の如（して得られたｍ−ＲＮＡ２μｇを用１ ２ いてアマジャム社の指示する「モル・セル・パイオルＪ
　（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６
１頁（＋　９８２）及び「ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、第
２５巻、第２６３頁（１９８３）記載の方法に従い行な
った結果、３００ｎｇの２重鎖ｃ−ＤＮＡか得られた。

このｃ−ＤＮＡ　１５０ｎｇを、７μβのＴＥ緩衝液（
１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（１）Ｈ７，５）／　］　
ｍＭＥ　Ｄ　ＴＡ〕に溶解したものに、１１μβの混液
（２８０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６，８）／　
６０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６，８）／　２　
ｍＭ塩化コバルト〕及び３．８μｌのティリング混液（
１０ｍＭジチオスレイト−ル７、５　ｕ　１２　／　ｌ
Ｏｎｇ／　ｙｎｌポリ　（ｐｏｌｙ）　　Ａ　Ｉ　ｔｔ
　！！　／　５　ｍＭｄＣＴＰ２μｌ／水１１０μｌ〕
を夫水添１０μｌ〕、２９ユニツトのターミナルトラン
スフェラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を添加し
、温度３０°Ｃて１０分間反応させたのち、２．４μβ
の０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ及び２．４μｌの１０％（Ｗ／
Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを夫々添加して反応を停止
させた。

反応停止液に２５μβの水飽和フェノールを用いて除蛋
白処理を行なったのち、回収した水層に、２５μβの４
Ｍ酢酸アンモニウム及び１００μｌの冷エタノールを夫
々添加し、温度−７０°Ｃで１５分間放置し、１２．０
００ｒ、　ｐ、　ｍ、で１０分間遠心分離してｃ−ＤＮ
Ａを回収し、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、ＣＤＮＡ
溶解液を得た。

以上の如くしてデオキシシチジンのテイルの付いたｃ　
−Ｄ　Ｎ　Ａ　１１００ｎを得た。

５、ベクターに使用する組み換え体プラスミドｐＭｃＥ
１０ＤＮＡの調製 大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、プラスミ
ドｐＢＲ３２５（ＢＲＬ社製）及びプラスミドｐＢＲ３
２２ＤＮＡ（宝酒造社製）を用いてティー・マスダ等（
Ｔ。

Ｍａｓｕｄａ　ｅｔ、ａｌ、）　ｒアグリカルチュラル
・バイオロジカル・ケミストリーＪ　（Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
）　、第５０巻、第２７１〜２７９頁（１，９８６）記
載の方法により作製したプラスミドｐＫＮ３０５　ＤＮ
Ａ並びにプラスミドｐＭｃ１４０３−３ＤＮＡ　（特開
昭６１−２７４６８３号公報記載）夫々ｌμｇを、１０
μｌの混液（５０ｍｌｌリス−塩酸緩衝液（ＩＩＨ７，
５）／１０ｍＭＭｇＣ１２／　１００ｍＭ　ＮａＣ１／
　１　ｍＭジチオスレイトール〕３ ４ に添加し、更に、これに、ＨｉｎｄｌＩＩ及びＳａ、Ｉ
Ｉ（いずれも宝酒造社製）を夫々２ユニツトずつ添加し
、温度３７°Ｃで１時間反応させて切断処理し、常法に
よるフェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈
澱物を得た。この沈澱物を、１０μβのライゲーション
緩衝液（２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２／　６６ｍＭ　）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／　１　ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ’／
　１５ｍＭジチオスレイトール〕に溶解し、溶液を得、
更に、１ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
を添加し、温度２０°Ｃて４時間連結反応を行なった。

次いて、この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジ
ー」（Ｊ、ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇＹ、第１１９巻、第
１０７２頁〜第１０７４頁（１９７４年）〕記載の形質
転換法により、大腸菌ＪＭ１．０１（ＡＴＣＣ３３８７
６）株を形質転換し、薬剤耐性（アンピシリン耐性及び
テトラサイクリン感受性）及びβ−ガラクトシダーゼ活
性を検討し、形質転換株を得、その株の含有する組み換
え体プラスミドＤＮＡをｐＭｃＥｌｏと命名した。この
組み換え体プラスミドｐＭＣＥＩＯＤＮＡを含有する大
腸菌５Ｍ１０１株を、ｌ・リプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、
酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）　、及びＮａＣ１０，５
％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１ｐに、該培地を用い温度３
７°Ｃで１６〜２４時間前培養して得た大腸菌ＪＭＩＯ
Ｉ　（Ｉ）ＭＣＥＩＯ）の培養液２０ｍ１を接種し、温
度３７°Ｃで３時間振盪培養したのち、０．２ｇのクロ
ラムフェニコールを添加し、更に同一温度で２０時間同
培養を行ない、培養液を得た。

次いで、この培養液を、常法により６．０００ｒ、　ｐ
、　ｍ。

で１０分間遠心分離して湿潤菌体２ｇを得、これを２０
艷の２５％（Ｗ／Ｖ）ショ糖を含有する３５０ｍＭ　）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更に、
これに、リゾチーム１０ｍｇ、　０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ
溶液（ｐＨ８、０）　８　ｍｌ！及び２０％（Ｗ／Ｖ）
　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８７７１１を夫々添加
し、温度６０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液を
得た。

この溶菌液に、５ＭＮａＣ１溶液１３ｍ１を添加し、温
度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５．０
０Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、て３０分間遠心分離して抽出液を
得、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱
処理を行ない沈澱物を得た。

５ ６ 次いで、この沈澱物を、通常の減圧乾燥処理したものを
、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝
液６　ｍｌ（ｐＨ７，５）に溶解し、更に、これに、塩
化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド溶液（１０ｍ
ｇ／艷）　０．２　ｙｎρを添加したものを、常法によ
り３９、０００ｒ、　ｐ、　ｍ、て４２時間超遠心分離
機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換
え体プラスミドｐＭｃＥ］０ＤＮＡを単離し、また更に
、ｎブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去
したのち、１ｍＭＥＤＴＡを含有するｌＯｍＭＩ・リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化
された組み換え体プラスミド１１ＭＣＥＩＯＤＮＡ５０
０μｇを得た。

６、ベクターＤＮＡの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミドｐＭｃＥ
１０ＤＮＡ１５μｇを、９０μβの項目４記載のＴＥ緩
衝液に溶解し３１０μｌのＭｅｄ緩衝液〔１００ｍＭ）
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／　１００ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２／１０ｍＭジチオスレイトール１５００ｍＭ　Ｎ
ａＣ１）を添加したのち３０ユニツトの制限酵素、Ａ、
ｃｃＩ（宝酒造社製）を更に加え、温度３７°Ｃで１時
間切断処理を行ない切断処理物を得た。この切断処理物
に、１００μｌの水飽和フェノールを加え除蛋白操作を
行なったのち、水層を回収し、これに、１／１０量の３
Ｍ酢酸すｌ・リウム（ｐＨ７，５）及び２倍量の冷エタ
ノールを加え、温度−７０°Ｃで１５分間放置したのち
、１２．０００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離し、Ｄ
ＮＡを回収した。

このＤＮＡを、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶かし、１５μ
ｌの混液（２８ＯｍＭカコジル酸すトリウム（ｐＨ６、
８）／　６０ｍＭ　ｌ・リス−塩酸緩衝液（ｐＨ６，８
）／　２　ｍＭ塩化コバルト〕を加えたのち、更に、５
μｌのティリング混液（項目４記載）（５ｍＭｄＧＴＰ
を用いた）を加え、また更に、５ユニツトのターミナル
トランスフェラーゼ（宝酒造社製）を添加し、温度３７
°Ｃで１５分間反応させた。項目４記載のｃ−ＤＮＡテ
ィリング反応と同様の後処理を行なうことにより組み換
え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡのＡｃｃエサイトに
デオキシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡを調製した
。

一方、プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡのＰｓｔＩサイア ６にデオキシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡの調製
も同時に行なった。

プラスミドｐＵＣ］９ＤＮＡ　（宝酒造社製）３０μｇ
を、３５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、４０μ
βのＭｅｄ緩衝液及び制限酵素Ｐｓｔｌ　　（宝酒造社
製）１２０ユニツトを夫々添加し、温度３７°Ｃで１時
間切断処理したのち、常法によりフェノールによる除蛋
白処理及びエタノール沈澱処理によりＤＮＡを回収した
。

得られたＤＮＡを、３５μｌのＴＥ緩衝液に溶解したも
のに、５０μｌの混液（２８ＯｍＭカコジル酸ナトリウ
ム（ｐＨ　６．　８）／　６０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ６、　８）／　Ｉ　ｍＭ塩化コバルト）、１９
μｊ７の項目４記載のティリング混液（ｄＧＴＰ含有）
並びに６０ユニツトのターミナルトランスフェラーゼ（
宝酒造社製）を夫々添加し、温度３７°Ｃで１０分間反
応させたのち、常法によりフェノール処理及びエタノー
ル沈澱を行なうことによりＤＮＡを回収した。

７、アニーリング及び形質転換 合成したｃ−ＤＮＡ］５ｎｇ及び上記の方法で得た二種
のベクターＤＮＡ　２００ｎｇを、３５μβのアニル緩
衝液［１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ　７．　５）
／　１００ｍＭ　ＮａＣ１　／　１　ｍＭＥ　Ｄ　ＴＡ
）に溶解し、温度６５°Ｃで２分間、温度４６℃で２時
間、温度３７°Ｃで１時間及び温度２０°Ｃで１８時間
放置する操作によりｃ−ＤＮＡとベクターＤＮＡをアニ
ールした。

アニールしたＤＮＡを用いて、ハナハン（Ｈａｎａｈａ
ｎ）の方法〔ディーエヌエイ　クローニング（ＤＮＡＣ
ｌｏｎｉｎｇ）　、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９
８５））により大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ　３３８４９
）を形質転換し、プラスミドｐＵ　Ｃ　１９Ｄ　Ｎ　Ａ
及び組み換え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡをベクタ
ーとしたｃ−ＤＮＡバンクを夫々作製した。

８、ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索 組み換え体プラスミドｌ）ＭＣＥＩＯＤＮＡのＡｃｅ■
部位は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードす
る部位にあるので、この部位に組み込まれたｃ−ＤＮＡ
はβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を作る。また組
み換え体プラスミドｐＭＣＥＩＯのβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子のプロモータ９ ０ は前述した様に大腸菌トリプトファン遺伝子のプロモー
ターに変換しである。

組み換え体プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡを、ベクター
とするｃ−ＤＮＡバンクのコロニー９６個を１０ｍｊの
Ｍ９カサミノ酸培地〔［モレキュラー・クローニングＪ
　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第４４
０〜４４１頁、「コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−Ｊ　（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＸ１９８２）　）にチアミン（
１０μｇ／ｒｎｌ’）を加えた培地を用い温度３７°Ｃ
で１０時間振盪培養し、常法により集菌したのち、２０
０μｌの項目２記載の５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝
液に懸濁し、温度１００°Ｃで５分間煮沸した。

この懸濁液４０μｌを、７．５％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリ
ルアミドゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった
。泳動終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウェスタンプ
ロット法〔「アナル・バイオケム」（Ａｎａｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｍ、　）、第１１２巻、第１９５頁（１９８１）
）によりニトロセルロースのフィルターに転写し、この
ニトロセルロースフィルターをイミューンブロットアッ
セイキット（バイオラッド社製）を用いて抗ルシフェラ
ーゼ血清で染色した。方法は、バイオラッド社の操作法
に従った。

即ちニトロセルロースのフィルターを、　１００ｙＪの
ブロッキング溶液［ＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭ）リス塩酸
緩衝液１５００ｍＭ　ＮａＣ１（ｐＨ７，５））に３％
（Ｗ／Ｖ）のゼラチンを溶かした溶液］中湿度２５°Ｃ
で、３０分間振盪した。次に、このニトロセルロースフ
ィルターを２５ｍＮの一次抗体溶液〔ルシフェラーゼ抗
血清を１％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンをＴＢＳ緩衝液に溶か
した溶液で２５倍（Ｖ／Ｖ）に希釈した溶液〕に移し、
温度２５°Ｃで９０分間振盪したものを、ｌｏｏｍ＆’
のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０洗液（ＴＢＳ緩衝液に
０．０５％（Ｗ／Ｖ）のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　−２
０を溶かした溶液〕中に移し、温度２５℃で１０分間振
盪する操作を２回行なった。次いで、このようにして得
たニトロセルロースフィルターを６０ｍ１の二次抗体溶
液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗
体（バイオラッド社製）を１％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンを
ＴＢＳ緩衝液に溶かした溶液で３０００倍（Ｖ／Ｖ）に
希１ ２ 釈した溶液〕中に移し、温度２５°Ｃて６０分間振盪し
たのち、　１００Ｊのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　−２０
洗液でニトロセルロースフィルターを洗う上記操作を２
回繰り返し、このようにして得たニトロセルロースフィ
ルターを、１２０ｍ１の発色液〔６０■の４−り四ロー
１−ナフトールを２０−の冷メタノールに溶解した溶液
及び６０μｌの３０％（Ｖ／Ｖ）過酸化水素水を１００
ｍｊのＴＢＳ緩衝液に添加した溶液を混合した溶液〕中
に移し、温度２５°Ｃて１０分間発色させた。

この様にして９６個のコロニーを１グループとして４グ
ループについて同様の方法を行なったところ、２つのグ
ループでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが
認められた。次に、この２つのグループに属する９６個
のコロニーを１２個のコロニーずつ８グループに分は同
様の操作を行なったところ夫々１グループに抗ルシフェ
ラーゼ血清と反応する蛋白質が認められた。最後に、こ
のグループに含まれる１２個のコロニーを、１個のコロ
ニーずつ同様の操作を行ないルシフェラーゼ抗血清と反
応する蛋白質を作るコロニーを同定した。以上の操作に
よりルシフェラーゼｃ−ＤＮＡをもつ２個のコロニーが
得られた。この２個のコロニより項目５記載の方法でプ
ラスミドＤＮＡを調製した。得られた組み換え体プラス
ミドＤＮＡは、ｐＡＬｆ２Ｂ８及びｐＡＬｆ３Ａ６と夫
々命名した。

９、大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−ＤＮＡの
プローブの作製 組み換え体プラスミドＩ）ＡＬｆ３　Ａ　６　ＤＮＡ１
００μｇを、３３０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、これに
４０μｌのＬｏｗ緩衝液（１００ｍＭ　）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）／　１００ｍＭ　ＭｇＣＬ　／　１
０ｍＭジチオスレイトル〕、１３０ユニツトのＰｓｔＩ
（宝酒造社製）及び１２０ユニツトの５ａｃＩ（ベーリ
ンガーマンハイム社製）を添加し、温度３７°Ｃで１．
５時間切断した。

このＤＮＡ全量を０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルを
用いた電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は
ティー・マニアテス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方
法〔「モレキュラー・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、第１５６〜１６１頁、［コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−Ｊ　（Ｃｏ
ｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ３ ４ Ｌａｂｏｒａ、ｔｏｒｙＸ１９８４））に従って行なっ
た。ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを含むＤＮＡバンドを切
り出し、透析チューブに入れ、２ｍｌのＴＥ緩衝液を加
えたのち、透析チューブをシールし、電気泳動により、
ゲル中より緩衝液中にＤＮＡを溶出した。

この溶液に等容量の水飽和フェノールを加え、撹拌した
のち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱により
ＤＮＡを回収した。

得られたＤＮＡフラグメントｌＯμｇを、１２６μｍの
ＴＥ緩衝液に溶かし、１６μのＭｅｄ緩衝液及び６４ユ
ニットの５ａｕ３ＡＩ（全酒造社製）を加え、温度３７
°Ｃで２時間反応させたのち、全量を５％（Ｗ／Ｖ）ポ
リアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により、ＤＮＡ
断片の分離を行なった。ポリアクリルアミドゲル電気泳
動は、エイ・マクサム（Ａ、　Ｍａｘａｍ）の方法〔［
メンズ・イン・エンザイモロジーＪ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６５巻、第５０６頁
（１９８０））に従って行なった。１９０ｂｐのＤＮＡ
フラグメントを前述と同様の方法で単離し、１μｇの５
ａｕ３ＡＩルシフェラーゼｃ−ＤＮＡフラグメントが得
られた。

この１μｇのルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを、〔α−３２
Ｐ）ｄＣＴＰ　（アマジャム社製）を用いてニックトラ
ンスレーション法により標識した。

ニックトランスレーションは全酒造社製のキットを用い
、宝酒造社の指示する「ジェイ・モル・パイオルＪ　（
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　、第１１３巻、第２３７〜
２５１頁（１，９７７）及び「モレキュラー・クローニ
ング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉＢ）　、第１
０９〜１１２頁、　［コルド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）記載の方法に従
って行なった。

１０、大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−コロニ
ーハイブリダイゼーション 前述の方法で調製した３２Ｐで標識したルシフェラーゼ
ｃ−ＤＮＡ断片を、プローブとして用い、組み換え体プ
ラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡをベクタとするフォティナス
・ピラリス爪部ｃ−ＤＮＡバンクを、コロニーハイブリ
ダイゼーション法（「蛋白質・核酸・酵素」、第２６巻
、第５７５〜５７９頁（１９８１）で検索し、ルシフェ
ラーゼｃ−ＤＮＡを５ ６ 有するコロニーを得た。そのうちの１個のコロニーの有
する組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＡＬｆ３と命名し
、項目５記載の方法でプラスミドＤＮＡを調製した。該
組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸菌
ＤＨ１（ｐＡＬｆ　３’）と命名した。なお、該形質転
換株はＡ　Ｔ　ＣＣ６７４６２として寄託されている。

そして、上記組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡを
、ＸｂａＩ、）（ｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、Ｅｃ’ｏ
Ｒ■及びＰｓｔＩ　　（いずれも全酒造社製）を用い、
単−消化及び２重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロ
ースゲル電気泳動法により移動度パターンを分析し、得
られた移動度パターンとλＤＮＡ　（全酒造社製）をＨ
ｉｎｄＩｆｆにより消化して得られたＤＮＡ断片の標準
移動度パターンと対比することにより得られた分子量は
、１．７００ｂｐてあり、上記プラスミドの制限酵素地
図は、第１図に示すとおりてあった。

１１、ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ　Ｃｒｕ
ｃｉ’ａ、ｔａ）のｍ−ＲＮＡの調製 生きたルシオラ・クルシアタ（ゲンジボタル・株式会社
・西武百貨店より購入）１０ｇを超低温冷凍庫に入れ、
凍結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部
２ｇに、１８ｍ１のグアニジンイソチオシアネート溶液
を添加し、項目１記載の方法に従って１．１■のＲＮＡ
を調製した。このＲＮＡ１，１■を項目１記載の方法に
従ってオリゴ（ｄＴ）−セルロースのカラムクロマトグ
ラフィーを行ない３０ｇｇのルシオラ・クルシアタ足部
ｍ−ＲＮＡを調製した。

１２、ルシオう・クルシアタ足部ｃ−ＤＮＡ／＜ンクの
作製 ｃ−ＤＮＡの合成はアマジャム社より購入したキットを
用い、アマジャム社の指示する「モル・セル・パイオル
ｊ　（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１
６１頁（１９８２）及び「ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、第
２５巻、第２６３頁（１９８３）記載の方法に従って合
成した。

２μｇのルシオラ・クルシアタ足部ＲＮＡより０．９μ
ｇの二本鎖ｃ−ＤＮＡが合成された。このｃ−ＤＮＡ０
．３μｇに項目４記載の方法を用いて７ ８ ポリデオキシシチジンのテイルを付加した。

このｃ−ＤＮＡ２０ｎｇ及び項目６で調製したポリグア
ノシンのテイルをそのＰｓｔＩ部位に付加したｐｕ　Ｃ
１９プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　５０００ｇを、項目７記載
の方法でアニールし、ハナハン（ｔ（ａｎａｈａｎ）の
方法〔「ディエヌエイ・クローニングＪ　（ＤＮＡ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）：第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８
５））に従ってアニールしたＤＮＡにより大腸菌ＤＨＩ
株（ＡＴＣＣ３３８４９）を形質転換しルシオラ・クル
シアタ足部ｃ−ＤＮＡバンクを作製した。

１３、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ゛ｃ
−ＤＮＡの検索 項目１０で得られた組み換え体プラスミドｐＡＬｆ　３
ＤＮＡ１０μｇを、９０μｐのＴＥ緩衝液に溶解し、１
０μｐのＭｅｄ緩衝液、２５ユニツトの制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及び２５ユニツトの制限酵素のＣ１ａＩ　　（いず
れも宝酒造社製）を添加し、温度３７°Ｃで２時間反応
を行ないＤＮＡを切断した。切断した組み換え体プラス
ミドｐＡＬｆ　３ＤＮＡよりフォテナス・ビラリス（ア
メリカホタル）由来のルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ部分を
含む８００ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩＤＮＡフラグメ
ントを、項目９記載のアガロースゲル電気泳動法を用い
る方法に従って単離し、１μｇのＥｃｏＲＩ　／　Ｃｌ
ａ　Ｉ　ＤＮＡフラグメントを得た。このｌμｇのＤＮ
Ａを、〔α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ三燐酸（アマジャム社製
）を用いて項目９記載のニックトランスレーション法に
より２２Ｐで標識した。２２Ｐで標識したＥｃｏＲＩ／
Ｃ１ａＩＤＮＡフラグメントをプローブとして、ルシオ
ラ・クルシアタ足部ｃ−ＤＮＡバンクを項目１０記載の
コロニーハイブリダイゼーション法で検索することによ
りルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼＣ−ＤＮ
Ａを有する大腸菌を選択した。プローブとハイブリダイ
ズする大腸菌コロニーを数個得た。

この中の１コロニーの有する組み換え体プラスミドＤＮ
ＡをｐＧＬｆ　　１と命名し、項目５記載の方法に従い
組み換え体プラスミドＤＮＡを単離した。

該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸
菌ＤＨＩ（ｐＧＬｆ　１）と命名した。なお、該形質転
換株はＡ　Ｔ　ＣＣ６７４８２として寄託されて９ ０ いる。

組み換え体プラスミドｐＧＬｆｌＤＮＡをＨｐａＩ。

Ｈｉｎｄ　Ｍ、　ＥｃｏＲＶ、　ＤｒａＩ、　ＡｆｌＩ
Ｉ、　ＨｉｎｃｌＩ。

ＰｓｔＩ　　（いずれも宝酒造社製）及５ｓｐＩ　　に
ューイングランドバイオラボ・社・製）を用い、単−消
化及び二重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロースゲ
ル電気泳動法により、移動度パターンを分析し、得られ
た移動度パターンとλフアージＤＮＡ（宝酒造社製）を
ＨｉｎｄＩ［により消化して得られたＤＮＡ断片の標準
移動度パターンとを対比することにより得られた分子量
は、２．０００１）ｌ）であり、上記プラスミドの制限
酵素地図は、第２図に示す通りである。

１４、　ルシオう・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ
−ＤＮＡの塩基配列の解析 組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　ＩＤＮＡｌ０μｇを制
限酵素ＰｓｔＩ　　（宝酒造社製）で切断し、ルシフェ
ラーゼｃ−ＤＮＡを含む２．０ＫｂＤＮＡ断片を２．５
μｇを得、このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵｃＩＩ９
ＤＮＡ　（宝酒造社製）のＰｓｔＩ部位にクローニング
し、ｃ−ＤＮＡの挿入方向の違いにより得られたプラス
ミドＤＮＡを夫々ｐＧＬｆ　２及びｐＧＬｆ　３と命名
した。組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　ｌＤＮＡ及びプ
ラスミドＩ）ＵＣ１１９ＤＮＡのＰｓｔＩによる切断処
理（項目６記載の方法）、ルシフェラーゼｃ−ＤＮＡ断
片のアガロースゲル電気泳動法を用いた単離（項目９記
載の方法）、プラスミド１）ＵＣ１１９ＤＮＡ及びルシ
フェシーセｃ−ＤＮＡ断片の連結反応（項目５記載の方
法）、連結反応液を用いた大腸菌ＪＭＩＯＩ株（ＡＴＣ
Ｃ３３８７６）の形質転換（項目５記載の方法）、並び
に組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　２及びｐＧＬｆ３Ｄ
ＮＡの調製（項目５記載の方法）は、カッコ内記載の方
法に従った。

次いで、組み換え体プラスミドＩ）ＧＬｆ　２及びｐＧ
Ｌｆ　３ＤＮＡを用いてキロシーフェンス用欠失キット
（宝酒造社製）を用い、ヘニコフ　（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ
）の方法〔「ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、第２８巻、第３
５１〜３５９　（１９８４））に従いルシフェラーゼｃ
−ＤＮＡに種々の欠失が導入されたプラスミドＤＮＡを
作１ ２ 製し、項目５記載の方法で大腸菌ＪＭ　１０１株（ＡＴ
ＣＣ３３８７６）に導入した。このようにして得られた
大腸菌にペルパーファージＭ１３ＫＯ７（全酒造社製）
を感染させることによりメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）
の方法〔「メンズ・イン・エンザイモロジーＪ　（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、第１０
１巻、第２０〜７８頁（１９８３）〕に従って１本鎖Ｄ
ＮＡを調製した。得られた１本鎖ＤＮＡによるシーフェ
ンシングは、Ｍ１３シークエンシングキット（全酒造社
製）を用いて上記メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法
に従い行なった。

塩基配列の解析のためのゲル電気泳動は８％（Ｗ／Ｖ）
ポリアクリルアミドゲル（富士写真フィルム社製）を用
いて行なった。

得られたルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼｃ
−ＤＮＡのみの全塩基配列を第３図に、また、該ｃ−Ｄ
ＮＡから翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を第４
図に夫々示した。

１５、組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　３７ＤＮＡの構
築 先ず、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコードする塩基配列
を欠失し、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
遺伝子及びベクターＤＮＡを含有するＤＮＡ断片の調製
について述べる。組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　ＩＤ
ＮＡｌμｇを、９０μｌの水に溶解したものに、１０μ
βのＭｅｄ緩衝液及び２０ユニツトのＰｓｔＩ　　（全
酒造社製）を添加し、温度３７°Ｃで２時間消化し、こ
れに、等量の水飽和フェノールを添加し、常法による除
蛋白処理及びエタノール沈澱処理を行ったのち、項目５
に記載の方法にて、ライゲーション及び大腸菌ＪＭＩＯ
Ｉ（ＡＴ　ＣＣ３３８７６）へ形質転換を行った。

得られた形質転換体から項目５に記載の方法によりＤＮ
Ａを単離し、容重す、１弛ＲＶ及び１旦■の制限酵素で
単一又は二重消化することにより、もとの組み換え体プ
ラスミドｐＧＬｆ　１に対してｃ−ＤＮＡの向きが逆向
きになっている組み換え体プラスミドを選択し、ｐＧＬ
ｆｌＯと命名した。

１０μｇの組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　ｌ０ＤＮＡ
を、９０μｌの水に溶解したものに、１０μｌのＭｅｄ
緩衝液及びＩＯユニットのΣｓｐＩにューイン３ ４ グランドバイオラボ社製）を添加し、温度３７°Ｃで３
０分処理し、部分分解物を得、この部分分解物より項目
９記載の方法により、Ｎ末端より９個のアミノ酸をコー
ドする塩基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子及びベ
クターＤＮＡの大部分を含有する４、ＯＫｂのＤＮＡ断
片２μｇを単離した。

次に、このＤＮＡ断片１μｇを９５μｌの水に溶解した
ものに、５μｌのＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
及び０．３ユニツト（１μｍ２’）のアルカリフォスフ
ァターゼ（全酒造社製）を添加し、温度６５°Ｃで１時
間処理し、常法による除蛋白処理及びエタノール沈澱処
理したのち、両端を脱リン酸した４、ＯＫｂのＤＮＡ断
片を１μｇ得た。

次に、大腸菌由来のトリゾ（ｔｒｐ）プロモーターを含
有するＤＮＡ断片の調製法について述べる。

トリゾプロモーターを含有するプラスミドｐＫＮ２０６
　ＤＮＡ　（ｒアブリフ・パイオル・ケム」（Ａｇｒｉ
ｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、第５０巻、第２７
１〜２７９頁）（１９８６年）記載のもの〕１０μｇを
、９０μｌの水に溶解し、ｌＯμｌのＭｅｄ緩衝液及び
２０ユニツトのＣ１ａＩ　　（全酒造社製）を添加し、
温度３７°Ｃて２時間処理し、完全分解物を得、これに
前述の５ｓｐ１１０ユニツトを添加し、温度３７°Ｃで
３０分間処理し、５ｓｐＩによる部分分解物を得、常法
による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理したのち、得
られた沈澱を１００μβのＴＥ緩衝液に溶解し、項目９
記載の方法により、トリゾプロモーターの大部分を含有
する５００ｂのＤＮＡ断片を単離した。

次に合成りＮＡの調製について述べる。

上記４．ＯＫｂのＤＮＡ断片に含まれるルシフェラーゼ
遺伝子は、塩基配列より推定したところＮ末端より９個
のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失している。

また、上記５００ｂのＤＮＡ断片に含まれるトリゾプロ
モーターは、ＳＤとＡｒ１間の塩基配列の一部を欠失し
ている。そこで、ルシフェラーゼのＮ末端より９個のア
ミノ酸をコードする塩基配列及びトリゾプロモーターの
５Ｄ−Ａｒ１間の塩基配列を補うために、以下の２種の
合成りＮＡをベツグマン社製のシステム１プラスＤＮＡ
合成機を５ ６ 用いて合成した。

５°ＣＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣ
ＧＡＴＧＡＡＡＡＴ　３５’　ＡＴＴＴＴＣＡＴＣＧＴ
ＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴ　３これらの
２種の合成りＮＡをデュポン社製のネンソルブ・プレグ
（ＮＥＮＳＯＲＢ　ＰＲＥＰ）を用いることにより、２
０μｇの精製された合成りＮＡを夫々得た。

これら２種の合成りＮＡＩμｇを夫々４５μｐの水に溶
解し、５μｌのＸＩＯカイネーション緩衝液（０，５Ｍ
＋−リス塩酸緩衝液（１）Ｈ７，６）／　０．１Ｍ　Ｍ
ｇＣＬ５０ｍＭジチオスレイ１ヘール／１０ｍＭＡＴＰ
）を添加し、更に、１０ユニツト（１μｌ）のＴ４ポリ
ヌクレオチドカイネース（宝酒造社製）を添加したのち
温度３７°Ｃて１時間処理し、常法による除蛋白処理及
びエタノール沈澱処理を行い、５゛末端をリン酸化した
合成りＮＡをそれぞれｌμｇずつ得た。

次に、ライゲーション反応により目的のプラスミドＤＮ
Ａの取得を行った。

上記の脱リン酸化したＮ末端より９個のアミノ酸をコー
ドする塩基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子、ベク
ターＤＮＡを含む４．ＯＫｂのＤＮＡ断片１μｇ、上記
のトリププロモーターを含む５００ｂのＤＮＡ断片１μ
ｇ及び上記２種のリン酸化した合成りＮＡｏ、１Ｍｇを
夫々８μｌの水に溶解した。これに１μｌのＸ１０ライ
ゲーシヨン緩衝液（２００ｍＭ　ＭｇＣｌ２／６６０ｍ
Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／　１０ｍＭＡ　
Ｔ　Ｐ　／　１５０ｍＭジチオスレイトール〕及び１ユ
ニツトのＴ４ＤＮＡライゲース（宝酒造社製）（１μｌ
）を添加し、温度１６°Ｃにて１６時間反応を行った。

得られた反応液を用いて項目５に記載の方法にて大腸菌
Ｊ　ＭＩＯＩ（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８７６）へ形質転換を
行い、得られた形質転換体より、項目５に記載の方法に
てプラスミドＤＮＡを単離し、ΣｓｐＩ、ＥｃｏＲＶ及
びＰｓｔＩの制限酵素で単一又は二重消化したのち、０
．７％アガロースゲル電気泳動にて展開し、トリププロ
モーターによりルシフェラーゼ遺伝子を完全にコードす
るルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミドを得、該
組み換え体プラスミドを、　ｐＧＬｆ３７と命名し、ま
た、該プラスミドを含有する大腸菌を大腸菌ＪＭＩＯＩ
　（ｐＧＬｆ３７）と命名した。

７ Ｂ １６、組み換え体プラスミドｐＧＬｆ　３７ＤＮＡの変
異 組み換え体プラスミドＩ）ＧＬｆ　３７ＤＮＡ３０μｇ
を、１００μｌのヒドロキシルアミン溶液Ｃ０，８Ｍ塩
酸ヒドロキシルアミン１０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）／１ｍＭ　Ｅ　ＤＴ　Ａ）に溶解し、６５°Ｃで
２時間変異処理したのち、常法によりエタノール沈澱を
行い沈澱物を回収した。この沈澱物をＴＥ緩衝液（ＩＯ
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／　１ｍＭ　Ｅ
　Ｄ　ＴＡ〕に溶解し、ハナハン（Ｈａｎａ−ｈａｎ）
の方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）　、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８
５））により、大腸菌ＪＭ　１０１株（ＡＴＣＣ３３８
７６）を形質転換し、Ｌ　Ｂ　−ａｍｐ寒天培地〔バク
トドリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、　　酵母エキス０．５％
（Ｗ／Ｖ）、　ＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）、アンピシ
リン（５０μｇ／ｍｊ’）及び１．４％（Ｗ／Ｖ）寒天
〕に接種し、３７°Ｃで培養した。１２時間後、出現し
てきたコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地〔バクトドリプトン
１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）、　Ｎ
ａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）、及びアンピシリン（５０μ
ｇ／ｍ１））　３ｍｊ’にて温度３７°Ｃで１８時間振
盪培養を行った。この培養液０．５ｍ（！を１０ｍｊの
上記ＬＢ−ａｍｐ培地に接種し、温度３７°Ｃで４時間
振盪培養したのち、８０００ｒ、　ｐ、　ｍで１０分間
の遠心分離操作により湿潤菌体を夫々２０■ずつ得た。

回収した菌体を、０．１Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４（１）Ｈ７，
８）、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジテオスレイト−ル、及
び０．２ｍｇ／ｍＩプロタミン硫酸からなる緩衝液０．
９ｍ（！に懸濁し、更に、これに、１００μｌのｌ０ｍ
ｇ／ｍｌのりゾチーム溶液を添加し、水中に１５分間放
置した。次に、この懸濁液を、メタノール、ドライアイ
ス浴中で凍結し、次いで温度２５°Ｃに放置し、完全に
解凍した。更に、１２００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で５分間
遠心分離操作を行うことにより、上清として粗酵素１Ｔ
ｎｌを得た。

このようにして得られたルシフェラーゼを含む粗酵素液
５０μｌを、４００μβのルシフェリン−ＡＴＰ混合〔
２６０μｌの２５ｍＭグリシルグリシン緩衝液ＣｐＨ７
，８）／１６μｌの０．１Ｍ硫酸マグネシウム／２４μ
ｌの１ｍＭルシフェリン（シグマ社製）／１００ｍ１の
１０ｍＭ　ＡＴＰ）に加えて発光させ、色を確認した。

その結果、赤色（波長６０９．６１２ｎｍ）　、オレン
ジ色９ ０ （波長５９５．６０７ｎｍ）及び緑色（波長５５８ｎｍ
　２種）に発光するもの計６種を得た。

更に、この粗酵素液を特開平１−１４１５９２号公報の
方法で精製し、上記の方法で発光させた結果、同じ発光
色を示すことか判明した。

以上の如くして得られた赤色（波長６０９ｎｍ、　６］
２ｎｍ）に発光する変異型ルシフェラーゼをコードする
遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡをｐＱＬｆ３７
Ｃ−Ｍ−２及びｐＧＬｆ　３７Ｃ−Ｍ−５と命名し、該
プラスミドで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌（
Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＪＭ　１０１（１０１（ｐＧＬｆ３７
Ｃ−及びＪＭ　１０１（ｌｌ１０１（ｌｌＧＬｆ３７は
、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第２８
２５号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８２５）及び微工研条寄第
３１３６号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３１３６）として寄託さ
れており、また、オレンジ色（波長５９５ｎｍ。

６０７ｎｍ）に発光する変異型ルシフェラーゼをコード
する遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡをｐＧＬｆ
　３７Ｃ−Ｍ−４及びｐＧＬｆ　３７Ｃ−Ｍ−１と命名
し、該プラスミドで形質転換された大腸菌、すなわち大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊλｌ　１０１（１）ＧＬｆ　
３７Ｃ−Ｍ−４）及びＪＭ　１０１（ｐＧＬｆ　３７Ｃ
−Ｍ−１）は、同所に微工研条寄第２８２６号（ＰＥＲ
Ｍ　ＢＰ−２８２６）及び微工研条寄第３１３５号（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−３１３５）として寄託され、更にまた、
緑色（波長５５８ｎｍ）に発光する変異型ルシフェラー
ゼをコードする遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡ
をｐＧＬｆ　３７Ｃ−Ｍ−６及びｐＧＬｆ３７ＣＭ−７
と命名し、該プラスミドで形質転換された大腸菌、すな
わち大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＪＭ　１０１（ｐＧＩ、
ｆ３７Ｃ−Ｍ−６）及びＪＭ　１０１（ｐＧＬｆ　３７
Ｃ−Ｍ−７）は、同所に微工研条寄第３Ｉ３７号（ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−３１３７）及び微工研条寄第３１３８号（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−３１３８）として寄託されている。

なお、このようにして得られた菌株について、色（波長
）、塩基配列の変化（位置）及びアミノ酸配列の変化（
位置）の対応関係を第１表に示した。

（本頁以下余白） １ ２

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡの制
限酵素による切断地図を示す図であり、第２図は、組み
換え体プラスミドｐＧＬｆｌＤＮＡの制限酵素による切
断地図を示す図であり、第３図は、ルシフェラーゼ遺伝
子の塩基配列を示す図であり、また、第４図は、ルシフ
ェラーゼ遺伝子から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸
配列を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を変異処理する
   ことを特徴とする変異型ホタルルシフェラーゼをコード
   する遺伝子の取得法。 ２、変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子が
   、ルシフェリンと反応する際、赤色、オレンジ色又は緑
   色等の野生型ホタルルシフェラーゼとは異なる色の光を
   発光する変異型ホタルルシフェラーゼをコードするもの
   である請求項１記載の遺伝子の取得法。 ３、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列におい
   て２３３位のバリンがイソロイシンに、２３９位のバリ
   ンがイソロイシンに、２８６位のセリンがアスパラギン
   に、３２６位のグリシンがセリンに、４３３位のヒスチ
   ジンがチロシンに、または４５２位のプロリンがセリン
   に変異されているアミノ酸配列をコードする変異型ホタ
   ルルシフェラーゼ遺伝子。 ４、請求項３記載の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子
   をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え
   体ＤＮＡ。 ５、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列におい
   てその２３３位のバリンがイソロイシンに、２３９位の
   バリンがイソロイシンに、２８６位のセリンがアスパラ
   ギンに、３２６位のグリシンがセリンに、４３３位のヒ
   スチジンがチロシンに、または４５２位のプロリンがセ
   リンに変異されているアミノ酸配列をコードする変異型
   ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入し
   た組み換え体ＤＮＡを含み、変異型ホタルルシフェラー
   ゼ生産能を有するエッシャリシア属に属する微生物を培
   地に培養し、培養物より、変異型ホタルルシフェラーゼ
   を採取することを特徴とする変異型ホタルルシフェラー
   ゼの製造法。 ６、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列におい
   てその２３３位のバリンがイソロイシンに、２３９位に
   おいてバリンがイソロイシンに、２８６位のセリンがア
   スパラギンに、３２６位のグリシンがセリンに、４３３
   位のヒスチジンがチロシンに、または４５２位のプロリ
   ンがセリンに変異されていることを特徴とする変異型ホ
   タルルシフェラーゼ。