JPS63214187A - 新規な遺伝子ｄｎａおよびアルカリ性プロテア−ゼの製造法 - Google Patents
新規な遺伝子ｄｎａおよびアルカリ性プロテア−ゼの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分計〕
本発明のＤＮＡはバチルス・リケニホルミスに由来し、
より大量のアルカリ性プロテアーゼを分泌生産させるた
めに使用されるＤＮＡであって、かつ該遺伝子ＤＮＡを
含む組換えＤＮＡにより形質転換されたバチルス属細菌
を用いてアルカリ性プロテアーゼを効率よ＜ａａする方
法に関するものである。
より大量のアルカリ性プロテアーゼを分泌生産させるた
めに使用されるＤＮＡであって、かつ該遺伝子ＤＮＡを
含む組換えＤＮＡにより形質転換されたバチルス属細菌
を用いてアルカリ性プロテアーゼを効率よ＜ａａする方
法に関するものである。
アルカリ性プロテアーゼは強アルカリ性領域でもポリペ
プチドを分解する能力をもつ酵素であり、たとえば洗浄
補助剤として洗剤などに添加され広く利用されている。
プチドを分解する能力をもつ酵素であり、たとえば洗浄
補助剤として洗剤などに添加され広く利用されている。
従来、アルカリ性プロテアーゼは該酵素の高生産性の細
菌、例えばバチルス會リケニホルミス、バチルス・アミ
ロリキエファシエンス、バチルス・ズブチリス、バチル
ス・サッカリティカスなどを培養して、その培養上清か
らアルカリ性プロテアーゼを回収する方法で製造されて
きた。しかしながら、これらの微生物はアルカリ性プロ
テアーゼの他に、アミラーゼ、中性プロテアーゼ、レバ
ンシュクラーゼ等の酵素も多量に菌体外に分泌するため
、培養上清からアルカリ性プロテアーゼの回収ｅ精製ｔ
こは繁雑な工程を必要とする。さらに、アルカリ性プロ
テアーゼを洗剤に利用する場合にアレルギーを起こす夾
雑物質を生産することなどの問題もあった。
菌、例えばバチルス會リケニホルミス、バチルス・アミ
ロリキエファシエンス、バチルス・ズブチリス、バチル
ス・サッカリティカスなどを培養して、その培養上清か
らアルカリ性プロテアーゼを回収する方法で製造されて
きた。しかしながら、これらの微生物はアルカリ性プロ
テアーゼの他に、アミラーゼ、中性プロテアーゼ、レバ
ンシュクラーゼ等の酵素も多量に菌体外に分泌するため
、培養上清からアルカリ性プロテアーゼの回収ｅ精製ｔ
こは繁雑な工程を必要とする。さらに、アルカリ性プロ
テアーゼを洗剤に利用する場合にアレルギーを起こす夾
雑物質を生産することなどの問題もあった。
アルカリ性プロテアーゼの生産に使用されている微生物
は、通常、細胞内にアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を１
個（１コピー）持っている。
は、通常、細胞内にアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を１
個（１コピー）持っている。
しかしながら、組換えＤＮＡの手法によってアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子を単離し、バチルス属細菌で保持さ
れるベクタープラスミドに連結した組換えプラスミドを
作製してバチルス属細菌を形質転換すると菌体内に多数
のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子をもつ形質転換体を得
ることができる。このようなバチルス属細菌を培養する
と遺伝子増幅効果によってアルカリ性プロテアーゼの生
産性のみを特異的に増大させることができ、しかも、バ
チルス属細菌はタンパク質を菌体外に分泌する性質を有
するためアルカリ性プロテアーゼの回収・精製が非常に
容易に行うことができるようになる。また、アルカリ性
プロテアーゼ以外のタンパク質やアレルギーの原因物質
などの生産能の低いバチルス属細菌に前記の組換えプラ
スミドを導入した形質転換体を用いれば、培養物からの
アルカＩＪ 性プロテアーゼの回収ψ精製はさらに容易
になる。
プロテアーゼ遺伝子を単離し、バチルス属細菌で保持さ
れるベクタープラスミドに連結した組換えプラスミドを
作製してバチルス属細菌を形質転換すると菌体内に多数
のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子をもつ形質転換体を得
ることができる。このようなバチルス属細菌を培養する
と遺伝子増幅効果によってアルカリ性プロテアーゼの生
産性のみを特異的に増大させることができ、しかも、バ
チルス属細菌はタンパク質を菌体外に分泌する性質を有
するためアルカリ性プロテアーゼの回収・精製が非常に
容易に行うことができるようになる。また、アルカリ性
プロテアーゼ以外のタンパク質やアレルギーの原因物質
などの生産能の低いバチルス属細菌に前記の組換えプラ
スミドを導入した形質転換体を用いれば、培養物からの
アルカＩＪ 性プロテアーゼの回収ψ精製はさらに容易
になる。
また、従来よりヒト成長ホルモンなどの異種生物由来の
有用タンパク質を大量生産するためにエシェリヒア・コ
リを宿主とする組換え体による生産が試みられているが
、エシェリヒア拳コリにはべ体寄生性の問題やタンパク
質を菌体外に分泌しないために得られる製品へのエンド
トキシンの混入の問題などがある。反面、バチルス属細
菌は従来から工業的に大量培養が行われ、その安全性が
確認されており、しかもタンパク質を菌体外に分泌する
性質を有するので、前記のような問題を生じない。
有用タンパク質を大量生産するためにエシェリヒア・コ
リを宿主とする組換え体による生産が試みられているが
、エシェリヒア拳コリにはべ体寄生性の問題やタンパク
質を菌体外に分泌しないために得られる製品へのエンド
トキシンの混入の問題などがある。反面、バチルス属細
菌は従来から工業的に大量培養が行われ、その安全性が
確認されており、しかもタンパク質を菌体外に分泌する
性質を有するので、前記のような問題を生じない。
バチルス・リケニホルミスはアルカリ性プロテアーゼを
大量に菌体外に分泌生産するので、アルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子のプロモーター領域、菌体外分泌に関与する
領域等の塩基配列はタンパク質の大量生産に適した構造
になっているものと考えられるので、このような領域が
単離されれば上記の目的にも使用することができる。
大量に菌体外に分泌生産するので、アルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子のプロモーター領域、菌体外分泌に関与する
領域等の塩基配列はタンパク質の大量生産に適した構造
になっているものと考えられるので、このような領域が
単離されれば上記の目的にも使用することができる。
バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子はヤコブスらＣＭ 、 ＪａｃｏｂｓｅｔａＪ、：
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、１５．８９
１５ （１９８５））によってバチルス・リケニホルミ
スＮＣＴ８ ６８１６ からクローニングされ、その
塩基配列が報告されているが、アルカリ性プロテアーゼ
の発現に必要なプロモーター領域を欠如しているため、
クローニングされた遺伝子自体ではアルカリ性プロテア
ーゼを生産させることができない。このような遺伝子で
は、強力な発現制御領域をもつアルカリ性プロテア−一
ゼや有用タンパク質の生産を行うことができない。
伝子はヤコブスらＣＭ 、 ＪａｃｏｂｓｅｔａＪ、：
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、１５．８９
１５ （１９８５））によってバチルス・リケニホルミ
スＮＣＴ８ ６８１６ からクローニングされ、その
塩基配列が報告されているが、アルカリ性プロテアーゼ
の発現に必要なプロモーター領域を欠如しているため、
クローニングされた遺伝子自体ではアルカリ性プロテア
ーゼを生産させることができない。このような遺伝子で
は、強力な発現制御領域をもつアルカリ性プロテア−一
ゼや有用タンパク質の生産を行うことができない。
本発明では、このような問題点を解決するために、アル
カリ性プロテアーゼを発現させる能力を有するプロモー
ター領域（以下プロモーターの全領域と記すこともある
）を有するアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を提供し、さ
らにこの遺伝子が挿入された組換えプラスミドで形質転
換されたバチルス属細菌を培養することによるアルカリ
性プロテアーゼの製造法を提供することを目的とする。
カリ性プロテアーゼを発現させる能力を有するプロモー
ター領域（以下プロモーターの全領域と記すこともある
）を有するアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を提供し、さ
らにこの遺伝子が挿入された組換えプラスミドで形質転
換されたバチルス属細菌を培養することによるアルカリ
性プロテアーゼの製造法を提供することを目的とする。
〔問題点を解決するための手段・作用〕バチルス・リケ
ニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の発現に必
要な領域を有する塩基配列をもつ遺伝子ＤＮＡのクロー
ニングは、たとえば次の手順で行われる。
ニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の発現に必
要な領域を有する塩基配列をもつ遺伝子ＤＮＡのクロー
ニングは、たとえば次の手順で行われる。
遺伝子の供与体としては、バチルス・リケニホルミスが
使用される。この微生物を使用することは、たとえば洗
浄補助剤に適した性質な有するアルカリ性プロテアーゼ
を生産するために好適である。
使用される。この微生物を使用することは、たとえば洗
浄補助剤に適した性質な有するアルカリ性プロテアーゼ
を生産するために好適である。
また、アルカリ性プロテアーゼの生産能の高い菌株はど
、強力なプロモーターを持っていることが期待できるの
で、突然変異処理などにより生産能の高くなった菌株な
使用することが望ましい。本発明ではバチルス・リケニ
ホルミスの公知菌株をニトロソグアニジンを変異誘起剤
として変異させて、プロテアーゼ生産能の高くなった変
異株を使用している。
、強力なプロモーターを持っていることが期待できるの
で、突然変異処理などにより生産能の高くなった菌株な
使用することが望ましい。本発明ではバチルス・リケニ
ホルミスの公知菌株をニトロソグアニジンを変異誘起剤
として変異させて、プロテアーゼ生産能の高くなった変
異株を使用している。
選ばれたアルカリ性プロテアーゼ生産菌株からアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子をクローニングするには、この生
産菌株の染色体ＤＮＡを制限酵素で切断して断片化した
のちバチルス拳ズブチリスで保持されるベクタープラス
ミドに連結してバチルス・ズブチリスのプロテアーゼ低
生産株を形質転換し、得られた形質転換体の中からプロ
テアーゼ生産能が高めちれた菌株を選択する方法がある
。しかしバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子にお、Ｖテては周辺に特殊な塩基配列が存
在するためと思われるので、この方法ではクローニング
することかできない。
性プロテアーゼ遺伝子をクローニングするには、この生
産菌株の染色体ＤＮＡを制限酵素で切断して断片化した
のちバチルス拳ズブチリスで保持されるベクタープラス
ミドに連結してバチルス・ズブチリスのプロテアーゼ低
生産株を形質転換し、得られた形質転換体の中からプロ
テアーゼ生産能が高めちれた菌株を選択する方法がある
。しかしバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子にお、Ｖテては周辺に特殊な塩基配列が存
在するためと思われるので、この方法ではクローニング
することかできない。
本発明ではこの問題を克服するために、エシェリヒア・
コリを宿主とする組換え体を作成して、バチルス・リケ
ニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子と相同なり
ＮＡを利用したコロニー・ハイブリダイゼーション法に
よってバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子をクローニングした。
コリを宿主とする組換え体を作成して、バチルス・リケ
ニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子と相同なり
ＮＡを利用したコロニー・ハイブリダイゼーション法に
よってバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子をクローニングした。
コロニーハイブリダイゼーションに用いるバチルス・リ
ケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子と相同な
りＮＡとしては次のようなものを用いることができる。
ケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子と相同な
りＮＡとしては次のようなものを用いることができる。
すなわち、バチルス参りケニホルミスのアルカリ性プロ
テアーゼのアミノ酸配列が既に明らかになっている（Ｍ
、 ０ｔｔｅｎｓｅｎ、 １．５ｖｅｎｄ−ｓｅｎ
： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｅ上
９．１９９ 。
テアーゼのアミノ酸配列が既に明らかになっている（Ｍ
、 ０ｔｔｅｎｓｅｎ、 １．５ｖｅｎｄ−ｓｅｎ
： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｅ上
９．１９９ 。
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９７９） ）ので、このうちの任意の位置の連続す
る５個〜６個穆度のアミノ酸の配列に対応する塩基配列
をもつ、通常、１４個〜１８個程度の塩基からなる一本
鎖のオリゴヌクレオチドを相同なりＮＡとして用いるこ
とがで診る。ただし、一つのアミノ酸に対応するコドン
はアミノ酸の種類に応じて１個〜６個存在するので、前
記のオリゴヌクレオチドは通常複数種類となるので、前
記のアミノ酸配列は、それに対応するオリゴヌクレオチ
ドの種類が最も少なくなる領域を選ぶことが望ましい。
（１９７９） ）ので、このうちの任意の位置の連続す
る５個〜６個穆度のアミノ酸の配列に対応する塩基配列
をもつ、通常、１４個〜１８個程度の塩基からなる一本
鎖のオリゴヌクレオチドを相同なりＮＡとして用いるこ
とがで診る。ただし、一つのアミノ酸に対応するコドン
はアミノ酸の種類に応じて１個〜６個存在するので、前
記のオリゴヌクレオチドは通常複数種類となるので、前
記のアミノ酸配列は、それに対応するオリゴヌクレオチ
ドの種類が最も少なくなる領域を選ぶことが望ましい。
例えば、Ｎ末端から１３４番目から１３８番目までのア
ミノ酸配列（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ１６種の１４塩基
のオリゴヌクレオチドの混合物があげられる。オリゴヌ
クレオチドの合成は市販のＤＮＡ合成機を使用するか、
公知の同相ホスホトリエステル法（Ｈ、Ｔｔｏ ｅｔａ
ｌ、： Ｎｕ −ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、、上０． １７５５（１９８２） ）などによって行
うことができる。合成されたＤＮＡは高速液体クロマト
グラフィーなどによって精製したのち、ｒＰ−ＡＴＰ
とで４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端を
ＰでｌＩ識する。一方、バチルス・リケニホルミスの
尋務脣ｎ→菌体から染色体ＤＮＡを調製する。染色体Ｄ
ＮＡは、菌体をリゾチーム処理後ドデシル硫酸ナトリウ
ムを加えて加熱することにより溶菌させたのちクロロホ
ルム抽出を行うＭａｒ−ｍａｒの方法ＣＪ 、 Ｍａｒ
ｍｕｒ ： Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、３゜２０８（
１９６１））などにより調製される。
ミノ酸配列（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ１６種の１４塩基
のオリゴヌクレオチドの混合物があげられる。オリゴヌ
クレオチドの合成は市販のＤＮＡ合成機を使用するか、
公知の同相ホスホトリエステル法（Ｈ、Ｔｔｏ ｅｔａ
ｌ、： Ｎｕ −ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、、上０． １７５５（１９８２） ）などによって行
うことができる。合成されたＤＮＡは高速液体クロマト
グラフィーなどによって精製したのち、ｒＰ−ＡＴＰ
とで４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端を
ＰでｌＩ識する。一方、バチルス・リケニホルミスの
尋務脣ｎ→菌体から染色体ＤＮＡを調製する。染色体Ｄ
ＮＡは、菌体をリゾチーム処理後ドデシル硫酸ナトリウ
ムを加えて加熱することにより溶菌させたのちクロロホ
ルム抽出を行うＭａｒ−ｍａｒの方法ＣＪ 、 Ｍａｒ
ｍｕｒ ： Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、３゜２０８（
１９６１））などにより調製される。
のを必要としないが、断片を連結して組換えプラスミド
を作成するのに用いるベクターの中に１ケ所の藺識部位
が存在する制限酵素が適している。例えば大腸菌のプラ
スミドｐＢＲ３２２をベクターとして用いる場合にはＥ
ｃｏ几ＩＨｉｎｄＩＩ 、 ＢａｍＨＴ、 ｐｓｔｌ、
Ｐｖｕｌ などの制限酵素があと異なる塩基配列を堅
識する制限酵素であるが、切断されて生ずるＤＮＡ断片
の末端はそれぞれ／Ｔ、Ｇ／Ｃのペアーを形成しうる４
塩基からなる粘着末端となるため、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ
ＩＪガーゼを作用させると互いに連結することができ
るので、このような制限酵素を用いれば染色体ＤＮＡを
切断する制限酵素と、ベクタープラスミドを切断する制
限酵素が異なっても差支えない。
を作成するのに用いるベクターの中に１ケ所の藺識部位
が存在する制限酵素が適している。例えば大腸菌のプラ
スミドｐＢＲ３２２をベクターとして用いる場合にはＥ
ｃｏ几ＩＨｉｎｄＩＩ 、 ＢａｍＨＴ、 ｐｓｔｌ、
Ｐｖｕｌ などの制限酵素があと異なる塩基配列を堅
識する制限酵素であるが、切断されて生ずるＤＮＡ断片
の末端はそれぞれ／Ｔ、Ｇ／Ｃのペアーを形成しうる４
塩基からなる粘着末端となるため、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ
ＩＪガーゼを作用させると互いに連結することができ
るので、このような制限酵素を用いれば染色体ＤＮＡを
切断する制限酵素と、ベクタープラスミドを切断する制
限酵素が異なっても差支えない。
また、Ｐｖｕｌ やＳｍａＩのようにＤＮＡの両鏡を同
じ位置で切断して平滑末端を生ずる制限酵素の場合にも
異なる制限酵素を組合せて使用することができる。他方
、エシェリヒア・コリで保持されるベクタープラスミド
、例えばｐＢＲ３２２やＰＵＣ１９などを染色体ＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素あるいは互いに連結すること
ができる切断末端を生ずる制限酵素で切断して線状とし
、次いでアルカリ性フォスファターゼで処理して５′末
端のリン犠ヲ脱離させる。この脱リン酸処理により、あ
とで加えるＴ ４ ＤＮＡリガーゼによりプラスミドが
元の環状ＤＮＡに戻るのを防ぐ。次いで、染色体ＤＮＡ
断片と脱リン酸化された線状プラスミドを混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを加えて反応させることにより両ＤＮＡ
の間でリン酸結合を形成させて環状の組換えプラスミド
を作製する。なお、制限酵素で切断した染色体ＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動で分画したのち、ＤＮＡを
ニトロセルロースフィルターに移しとったフィルターに
対して、先に合成して浄で標識されたオリゴヌクレオチ
ドをハイブリダイズさせたのちオートラジオグラフィー
を行うことによってオリゴヌクレオチドと相同性のある
塩基配列をもつ染色体ＤＮＡ断片を検出するサザンハイ
プリダイゼーション法（Ｅ 、 Ｍ 、 ５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ： ＪｌＭｏｌ−Ｂｉｏｌ−＊旦、５０３（１９７
５））により、アルカリテ 性プロ士アーゼ遺伝子の存在する断片の長さを求めてお
けば、染色体ＤＮＡ断片を予め分画して、この長さの断
片を濃縮して使用すれば、後で述べるコロニーハイブリ
ダイゼーションを効気泳動で分画したのち、目的の長さ
の断片の泳動位置に相当する部分のゲルを切り出し、電
気泳動溶出法（Ｔ 、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔａｌ、
： ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ 、 ｐ、１６
４． Ｃｏ１ｄ ８ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（１９８２） ）などによりＤＮＡ断片を
溶出することによって行うことができる。
じ位置で切断して平滑末端を生ずる制限酵素の場合にも
異なる制限酵素を組合せて使用することができる。他方
、エシェリヒア・コリで保持されるベクタープラスミド
、例えばｐＢＲ３２２やＰＵＣ１９などを染色体ＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素あるいは互いに連結すること
ができる切断末端を生ずる制限酵素で切断して線状とし
、次いでアルカリ性フォスファターゼで処理して５′末
端のリン犠ヲ脱離させる。この脱リン酸処理により、あ
とで加えるＴ ４ ＤＮＡリガーゼによりプラスミドが
元の環状ＤＮＡに戻るのを防ぐ。次いで、染色体ＤＮＡ
断片と脱リン酸化された線状プラスミドを混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを加えて反応させることにより両ＤＮＡ
の間でリン酸結合を形成させて環状の組換えプラスミド
を作製する。なお、制限酵素で切断した染色体ＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動で分画したのち、ＤＮＡを
ニトロセルロースフィルターに移しとったフィルターに
対して、先に合成して浄で標識されたオリゴヌクレオチ
ドをハイブリダイズさせたのちオートラジオグラフィー
を行うことによってオリゴヌクレオチドと相同性のある
塩基配列をもつ染色体ＤＮＡ断片を検出するサザンハイ
プリダイゼーション法（Ｅ 、 Ｍ 、 ５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ： ＪｌＭｏｌ−Ｂｉｏｌ−＊旦、５０３（１９７
５））により、アルカリテ 性プロ士アーゼ遺伝子の存在する断片の長さを求めてお
けば、染色体ＤＮＡ断片を予め分画して、この長さの断
片を濃縮して使用すれば、後で述べるコロニーハイブリ
ダイゼーションを効気泳動で分画したのち、目的の長さ
の断片の泳動位置に相当する部分のゲルを切り出し、電
気泳動溶出法（Ｔ 、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔａｌ、
： ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ 、 ｐ、１６
４． Ｃｏ１ｄ ８ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（１９８２） ）などによりＤＮＡ断片を
溶出することによって行うことができる。
染色体ＤＮＡ断片とベクタープラスミドとをれやすくし
た宿主微生物エシェリヒア・コリに移入して組換えプラ
スミドを保有する形質転換体を得る。形質転換体は、使
用したベクタープラスミドに存在する薬剤耐性遺伝子の
発現、すなわち、例えばｐＢＲ，５２２にＨｉｎｄｌｌ
ｌで切断した染色体ＤＮＡ断片を連結して作成した組換
えプラスミドが移入されたエシェリヒア・コリがアンピ
シリンを含有する培地上でも生育できるようになること
を利用して選択することができる。このようにして選択
された多数（通常３゜０００〜１ｏ、ｏｏｏ）の形質転
換体の中からコロニーハイブリダイゼーションＣＭ、Ｇ
ｒｕｎｓ−ｔｅｉｎ、 Ｊ、 Ｗａｌｌｓ ： Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ −１ｏｇｙｅ ６８．
３７９． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、。
た宿主微生物エシェリヒア・コリに移入して組換えプラ
スミドを保有する形質転換体を得る。形質転換体は、使
用したベクタープラスミドに存在する薬剤耐性遺伝子の
発現、すなわち、例えばｐＢＲ，５２２にＨｉｎｄｌｌ
ｌで切断した染色体ＤＮＡ断片を連結して作成した組換
えプラスミドが移入されたエシェリヒア・コリがアンピ
シリンを含有する培地上でも生育できるようになること
を利用して選択することができる。このようにして選択
された多数（通常３゜０００〜１ｏ、ｏｏｏ）の形質転
換体の中からコロニーハイブリダイゼーションＣＭ、Ｇ
ｒｕｎｓ−ｔｅｉｎ、 Ｊ、 Ｗａｌｌｓ ： Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ −１ｏｇｙｅ ６８．
３７９． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）） ニよってア／Ｌ、
カリ性プロテアーゼ遺伝子を保有する形質転換体が選択
される。アルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株を検出す
るためのプローブとして、先に合成して Ｐで標識され
たオリゴヌクレオチドを用いると、オートラジオグラフ
ィーによってアルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株のコ
ロニーに対応する位置のフィルムがハイブリダイズした
プローブの Ｐの放射線によって感光して黒いシグナル
として検出される。コロニーハイブリダイゼーションを
行う前にコロニーが形成されたニトロセルロースフィル
ターから、別の新しいニトロセルロースフィルターにレ
プリカをとっておくことによって、対応するアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子保有株が得られる。
カリ性プロテアーゼ遺伝子を保有する形質転換体が選択
される。アルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株を検出す
るためのプローブとして、先に合成して Ｐで標識され
たオリゴヌクレオチドを用いると、オートラジオグラフ
ィーによってアルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株のコ
ロニーに対応する位置のフィルムがハイブリダイズした
プローブの Ｐの放射線によって感光して黒いシグナル
として検出される。コロニーハイブリダイゼーションを
行う前にコロニーが形成されたニトロセルロースフィル
ターから、別の新しいニトロセルロースフィルターにレ
プリカをとっておくことによって、対応するアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子保有株が得られる。
しかし、また一方、次のようなりＮＡを用いてコロニー
ハイブリダイゼーションを行ってもバチルス・リケニホ
ルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子をクローニング
することができる。
ハイブリダイゼーションを行ってもバチルス・リケニホ
ルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子をクローニング
することができる。
すなわちスコバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プ
ロテアーゼと７０％の相同性のあるアルカリ性プロテア
ーゼを生産するバチルス拳アミロＩＪ ＋エファシエン
スのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子は、バチルス−リケ
ニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子と塩基配列
の上でも相同性が高いものと推測される。バチ／Ｌ、ス
ーアミロリキエファシエンスの一菌株ＡＴＣＣ２３Ｂ４
４株のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列は既に
明らかになっている［Ｊ。
ロテアーゼと７０％の相同性のあるアルカリ性プロテア
ーゼを生産するバチルス拳アミロＩＪ ＋エファシエン
スのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子は、バチルス−リケ
ニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子と塩基配列
の上でも相同性が高いものと推測される。バチ／Ｌ、ス
ーアミロリキエファシエンスの一菌株ＡＴＣＣ２３Ｂ４
４株のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列は既に
明らかになっている［Ｊ。
Ｗｅｌｌｓ ｅｔａｌ ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、、 ＩＬ７９１１ （１９８３）参照〕
ので、この塩基配列の中で、アルカリ性プロテアーゼの
成熟タンパクの部分に対応する領域のうちから連続する
１４個〜１８個程度の塩遍基配列を任意に選び、これと
同じ配列をもつ一本鎖のオリゴヌクレオチドを合成して
、前記のバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子のクローニングと全く同じ方法でバチルス
・アミロリキエファシエンスのアルカリ性プロテアーゼ
遺伝子でクローニングする。次に、この遺伝子を用いて
、これと相同性があると推測されるバチルス・リケニホ
ルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子がクローニング
される。
ｄｓ Ｒｅｓ、、 ＩＬ７９１１ （１９８３）参照〕
ので、この塩基配列の中で、アルカリ性プロテアーゼの
成熟タンパクの部分に対応する領域のうちから連続する
１４個〜１８個程度の塩遍基配列を任意に選び、これと
同じ配列をもつ一本鎖のオリゴヌクレオチドを合成して
、前記のバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子のクローニングと全く同じ方法でバチルス
・アミロリキエファシエンスのアルカリ性プロテアーゼ
遺伝子でクローニングする。次に、この遺伝子を用いて
、これと相同性があると推測されるバチルス・リケニホ
ルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子がクローニング
される。
バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子のクローニングは、コロニーハイブリダイゼーショ
ンのプローブとしてバチルス・アミロリキエファシェン
スのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を使用する以外は、
基本的には前記のバチルス・リケニホルミスのアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子のクローニングと同じ方法で行わ
れる。すなわち、バチルス・リケニホルミスの染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素で切断したＤＮＡ断片あるいはアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を濃縮した両分
とベクタープラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した
組換えプラスミドを用いてエシェリヒア・コリＬＥ３９
２を形質転換して得られる形質転換体ノ中カらコロニー
・ハイブリダイゼーションによってアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子を保有する形質転換体が選択される。コロニ
ーハイブリダイゼーションに使用されるプローブは、バ
チルス・アミロリキエファシェンスのアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子を保有する形質転換体から抽出されたプラ
スミドを制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で
分画してアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含む断片を調
製し、ニックトランスレーション（Ｐ 、 Ｗ 、 Ｊ
、 Ｒｉｇｂｙ ｅｔｌ。
伝子のクローニングは、コロニーハイブリダイゼーショ
ンのプローブとしてバチルス・アミロリキエファシェン
スのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を使用する以外は、
基本的には前記のバチルス・リケニホルミスのアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子のクローニングと同じ方法で行わ
れる。すなわち、バチルス・リケニホルミスの染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素で切断したＤＮＡ断片あるいはアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を濃縮した両分
とベクタープラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した
組換えプラスミドを用いてエシェリヒア・コリＬＥ３９
２を形質転換して得られる形質転換体ノ中カらコロニー
・ハイブリダイゼーションによってアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子を保有する形質転換体が選択される。コロニ
ーハイブリダイゼーションに使用されるプローブは、バ
チルス・アミロリキエファシェンスのアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子を保有する形質転換体から抽出されたプラ
スミドを制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で
分画してアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含む断片を調
製し、ニックトランスレーション（Ｐ 、 Ｗ 、 Ｊ
、 Ｒｉｇｂｙ ｅｔｌ。
： Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、ｅｌ １３ 、２３７（
１９７７））によって Ｐで標識されたものが用いられ
る。
１９７７））によって Ｐで標識されたものが用いられ
る。
なお、この場合プローブのＤＮＡすなわちバチルス・ア
ミロリキエファシェンスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子とバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアー
ゼ遺伝子は、塩基配列が完全に同じではないのでハイブ
リダイゼーションによって形成されるハイブリッドの安
定性は、全く同じ塩基配列をもつＤＮＡのハイブリッド
に比べて低くなるので、ハイブリダイゼーションを行う
温度は通常の温度４２℃よりも下げ、２５〜３０℃付近
で行う必要がある。
ミロリキエファシェンスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子とバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアー
ゼ遺伝子は、塩基配列が完全に同じではないのでハイブ
リダイゼーションによって形成されるハイブリッドの安
定性は、全く同じ塩基配列をもつＤＮＡのハイブリッド
に比べて低くなるので、ハイブリダイゼーションを行う
温度は通常の温度４２℃よりも下げ、２５〜３０℃付近
で行う必要がある。
このようにしてコロニーハイブリダイゼーションによっ
て選択された形質転換体がアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子を保有することは、この形質転換体からプラスミドを
抽出して、適当な制限酵素１例えば染色体ＤＮＡの切断
に使用した制限酵素で切断し、コロニーハイブリダイゼ
ーションに使用した標識ＤＮＡをプローブとしてサザン
・ハイブリダイゼーションを行い、オートラジオグラフ
ィーでシグナルを与える断片が検出されることによって
確められる。
て選択された形質転換体がアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子を保有することは、この形質転換体からプラスミドを
抽出して、適当な制限酵素１例えば染色体ＤＮＡの切断
に使用した制限酵素で切断し、コロニーハイブリダイゼ
ーションに使用した標識ＤＮＡをプローブとしてサザン
・ハイブリダイゼーションを行い、オートラジオグラフ
ィーでシグナルを与える断片が検出されることによって
確められる。
さらに、この組換えプラスミド上に存在するアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子がその全領域を含むかどうかは、組
換えプラスミドを制限酵素で切断して挿入されている染
色体ＤＮＡ断片を切り出し、この断片をバチルス属細菌
で保持されるベクタープラスミド、例えばｐＵＢｌ １
０やバチルス属細菌とエシェリヒア・コリの両方で保持
されるシャトルベクター、例えばｐＨＹ３００ ＰＬＫ
などに連結してバチルス・ズブチリスのプロテアーゼ低
生産株を形質転換して、組換えプラスミドが導入された
形質転換体のプロテアーゼ生産能が高くなるかどうかを
見ることによって確められる。
プロテアーゼ遺伝子がその全領域を含むかどうかは、組
換えプラスミドを制限酵素で切断して挿入されている染
色体ＤＮＡ断片を切り出し、この断片をバチルス属細菌
で保持されるベクタープラスミド、例えばｐＵＢｌ １
０やバチルス属細菌とエシェリヒア・コリの両方で保持
されるシャトルベクター、例えばｐＨＹ３００ ＰＬＫ
などに連結してバチルス・ズブチリスのプロテアーゼ低
生産株を形質転換して、組換えプラスミドが導入された
形質転換体のプロテアーゼ生産能が高くなるかどうかを
見ることによって確められる。
本発明ではこのプロテアーゼ低生産株として、バチルス
・ズブチリス几Ｍ １２５ ［Ｔ 、 Ｕｏｚｕｍｉｅ
ｔａｌ ： Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
、 １５２．６５（１９７７））をＮ−エチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ ）で変異
処理して得たバチルス・ズブチリスＰＷ１０ （微工研
菌寄第９１７６号）を用いている。この菌株は１％カゼ
インを含むニュートリエンド寒天平板（カゼインプレー
ト）に接種して３７℃で一晩培養しても、プロテアーゼ
の作用によって形成されるハロー（混濁した環）を作ら
ないので、プロテアーゼ生産能の高くなった形質転換体
はハローを形成することで確マすることができる。
・ズブチリス几Ｍ １２５ ［Ｔ 、 Ｕｏｚｕｍｉｅ
ｔａｌ ： Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
、 １５２．６５（１９７７））をＮ−エチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ ）で変異
処理して得たバチルス・ズブチリスＰＷ１０ （微工研
菌寄第９１７６号）を用いている。この菌株は１％カゼ
インを含むニュートリエンド寒天平板（カゼインプレー
ト）に接種して３７℃で一晩培養しても、プロテアーゼ
の作用によって形成されるハロー（混濁した環）を作ら
ないので、プロテアーゼ生産能の高くなった形質転換体
はハローを形成することで確マすることができる。
組換えプラスミドによるバチルス・ズブチリスの形質転
換は、リゾチーム処理によりプロトプラストを形成して
ポリエチレングリコール存在下でＤＮＡを取り込ませる
プロトプラスト法Ｃ８、Ｃｈａｎｇ、 Ｓ、Ｎ、 Ｃｏ
ｈｅｎ ： Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ。
換は、リゾチーム処理によりプロトプラストを形成して
ポリエチレングリコール存在下でＤＮＡを取り込ませる
プロトプラスト法Ｃ８、Ｃｈａｎｇ、 Ｓ、Ｎ、 Ｃｏ
ｈｅｎ ： Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、、 １６８．１１１ （１９７９））あ
るいはグルコース最小培地で生育させることによりＤＮ
Ａを受は入れやすくなったコンピテントセルを用いる方
法ＣＤ 、 Ｄｕｂｎａｎ、 Ｒ，Ｄ、Ａｂｅｌｓｏｎ
：Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ５６ 、２０９（１９
７１））などによって行われる。
るいはグルコース最小培地で生育させることによりＤＮ
Ａを受は入れやすくなったコンピテントセルを用いる方
法ＣＤ 、 Ｄｕｂｎａｎ、 Ｒ，Ｄ、Ａｂｅｌｓｏｎ
：Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ５６ 、２０９（１９
７１））などによって行われる。
バチルス・ズブチリスに導入して、プロテアーゼ生産能
が発現し、生産されたプロテアーゼがバチルス・リケニ
ホルミスのアルカリ性プロテアーゼと同じ性質、例えば
、分子量や免疫学的性質が同じものであれば、アルカリ
性プロテアーゼ遺伝子の全領域がクローニングされたと
判断される。しかし、バチルス番ズブチリスに移入して
もプロテアーゼ生産能が発現しない場合には、遺伝子の
一部が欠如しているので、欠如しだ部分をクローニング
するために再度コロニーノ・イブリダイゼーションが行
われる。
が発現し、生産されたプロテアーゼがバチルス・リケニ
ホルミスのアルカリ性プロテアーゼと同じ性質、例えば
、分子量や免疫学的性質が同じものであれば、アルカリ
性プロテアーゼ遺伝子の全領域がクローニングされたと
判断される。しかし、バチルス番ズブチリスに移入して
もプロテアーゼ生産能が発現しない場合には、遺伝子の
一部が欠如しているので、欠如しだ部分をクローニング
するために再度コロニーノ・イブリダイゼーションが行
われる。
この時には、組換えプラスミドを作成するのに使用する
染色体ＤＮＡ断片は、はじめに用いられた制限酵素と異
なる種類のものを用いて切断されたものを使用すれば、
ここでクローニングされたアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子の一部を含む断片をプローブとしてコロニーハイブリ
ダイゼーションを行うことができ、この断片に隣接する
領域すなわちアルカリ性プロテアーゼ遺伝子のうちの欠
如している領域を含む遺伝子を保有する形質転換体を効
率良くスフＩＪ ＝ソゲすることができる。
染色体ＤＮＡ断片は、はじめに用いられた制限酵素と異
なる種類のものを用いて切断されたものを使用すれば、
ここでクローニングされたアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子の一部を含む断片をプローブとしてコロニーハイブリ
ダイゼーションを行うことができ、この断片に隣接する
領域すなわちアルカリ性プロテアーゼ遺伝子のうちの欠
如している領域を含む遺伝子を保有する形質転換体を効
率良くスフＩＪ ＝ソゲすることができる。
このようにして隣接する遺伝子断片が得られれば、この
断片とはじめに得られた遺伝子断片とを連結して、アル
カリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を有する遺伝子を構
成することができる。勿論、あとで得られた組換えプラ
スミドに挿入された断片内にアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子の全領域が含まれている場合には上記の操作は必ず
しも必要ではない。
断片とはじめに得られた遺伝子断片とを連結して、アル
カリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を有する遺伝子を構
成することができる。勿論、あとで得られた組換えプラ
スミドに挿入された断片内にアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子の全領域が含まれている場合には上記の操作は必ず
しも必要ではない。
前記のようにクローニングされた遺伝子あるいは再構成
された遺伝子がアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域
を含むことは、この遺伝子をバチルス属細菌で保持され
るベクタープラスミドに連結して、バチルス−ズブチリ
スのプロテアーゼ低生産株を形質転換して、アルカリ性
プロテアーゼの生産能が発現することを指標にして確め
られる。
された遺伝子がアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域
を含むことは、この遺伝子をバチルス属細菌で保持され
るベクタープラスミドに連結して、バチルス−ズブチリ
スのプロテアーゼ低生産株を形質転換して、アルカリ性
プロテアーゼの生産能が発現することを指標にして確め
られる。
このよう・にして得られたアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子を含む組換えプラスミドは、必要に応じてさらにアル
カリ性プロテアーゼの発現に不要な領域を除いて組換え
プラスミドの縮小が行われる。このような組換えプラス
ミドの縮小は塩基配列の決定の労力の軽減と組換えプラ
スミドを保有する宿主細菌の負担を軽減して遺伝子の発
現を効率良く行わせるために有効である。
子を含む組換えプラスミドは、必要に応じてさらにアル
カリ性プロテアーゼの発現に不要な領域を除いて組換え
プラスミドの縮小が行われる。このような組換えプラス
ミドの縮小は塩基配列の決定の労力の軽減と組換えプラ
スミドを保有する宿主細菌の負担を軽減して遺伝子の発
現を効率良く行わせるために有効である。
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を含むＤＮＡ断
片の塩基配列は、当該断片を含む組換えプラスミドを保
有するエシェリヒアｅフリＬＥ３９２あるいはバチルス
やズブチリスの対数増殖期の菌体からＣｌｅｗｅｌｌと
Ｈｅ１ｉｎｓｌ＜ｉの方法ＣＤ 、 Ｂ 、 Ｃｌｅｗ
ｅ１１． Ｄ、Ｒ，Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ ：Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ Ｃ６
２，１１５９（１９６９）’］などによって組換えプラ
スミドを抽出、精製し、制限酵素で切断してアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子を含む断片を回収して、Ｍ１３ジデ
オキシチェインターミネーション法しＴ 、Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｆ３ｎｚｙｍｏ
１．＋１０１．２０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３） ｅ、 Ｆ、Ｓａｎ
ｇｅｒ ： ５ｃｉｅｎｃｅ＋ ２１’４＋１２０５（
１９８１））などによって決定される。
片の塩基配列は、当該断片を含む組換えプラスミドを保
有するエシェリヒアｅフリＬＥ３９２あるいはバチルス
やズブチリスの対数増殖期の菌体からＣｌｅｗｅｌｌと
Ｈｅ１ｉｎｓｌ＜ｉの方法ＣＤ 、 Ｂ 、 Ｃｌｅｗ
ｅ１１． Ｄ、Ｒ，Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ ：Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ Ｃ６
２，１１５９（１９６９）’］などによって組換えプラ
スミドを抽出、精製し、制限酵素で切断してアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子を含む断片を回収して、Ｍ１３ジデ
オキシチェインターミネーション法しＴ 、Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｆ３ｎｚｙｍｏ
１．＋１０１．２０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３） ｅ、 Ｆ、Ｓａｎ
ｇｅｒ ： ５ｃｉｅｎｃｅ＋ ２１’４＋１２０５（
１９８１））などによって決定される。
また、組換えプラスミドを導入する際のバチルス属細菌
としては特ｔこ制限はないが、アミラーゼ、レバンシュ
ークラーゼや中性プロテアーゼなどの生産能あ低い菌株
あるいは、アレルギーの原因物質の生産能の低い菌株を
使用して形質転換体を作製してこれを培養すれば、アル
カリ性プロテアーゼの回収、精製がさら會こ容易に行う
ことができるようになるので好ましい。
としては特ｔこ制限はないが、アミラーゼ、レバンシュ
ークラーゼや中性プロテアーゼなどの生産能あ低い菌株
あるいは、アレルギーの原因物質の生産能の低い菌株を
使用して形質転換体を作製してこれを培養すれば、アル
カリ性プロテアーゼの回収、精製がさら會こ容易に行う
ことができるようになるので好ましい。
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を含む遺伝子Ｄ
ＮＡが連結された組換えプラスミドを移入して形質転換
されたバチルス属細菌を用いてアルカリ性プロテアーゼ
を生産するには常法でよい。すなわち、炭素源、窒素源
、無機イオン、さらに必要に応じてビタミン等の微量有
機栄養源を含有する培地を用いて、好気的条件下でｐＨ
，温度を適宜調節しながら所望のアルカリ性プロテアー
ゼが蓄積されるまで培養を行えば良い。
ＮＡが連結された組換えプラスミドを移入して形質転換
されたバチルス属細菌を用いてアルカリ性プロテアーゼ
を生産するには常法でよい。すなわち、炭素源、窒素源
、無機イオン、さらに必要に応じてビタミン等の微量有
機栄養源を含有する培地を用いて、好気的条件下でｐＨ
，温度を適宜調節しながら所望のアルカリ性プロテアー
ゼが蓄積されるまで培養を行えば良い。
培養液からのアルカリ性プロテアーゼの回収についても
通常の方法で行うことができる。すなわち、培養終了後
、遠心分離などの方法で菌体を除去した上清にエタノー
ルやアセトンなどの有機溶媒あるいは硫酸アンモニウム
などの無機塩類を加えて生ずる沈殿を回収すれば良い。
通常の方法で行うことができる。すなわち、培養終了後
、遠心分離などの方法で菌体を除去した上清にエタノー
ルやアセトンなどの有機溶媒あるいは硫酸アンモニウム
などの無機塩類を加えて生ずる沈殿を回収すれば良い。
また、クローニングされたバチルス・リケニホルミスの
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を利用して成長ホルモン
などの異種生物由来の有用タンパク質を分泌生産するた
めには、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター
の全領域、リボゾーム結合領域および構造遺伝子内の分
泌に関与する領域を含む組換えプラスミドに、該有用タ
ンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつＤＮ
Ａ断片を分泌に関与する領域の下流域に隣接して連結し
た組換えプラスミドを作成して、バチルス属細菌に導入
して得られる形質転換体を培養すれば良い。
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を利用して成長ホルモン
などの異種生物由来の有用タンパク質を分泌生産するた
めには、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター
の全領域、リボゾーム結合領域および構造遺伝子内の分
泌に関与する領域を含む組換えプラスミドに、該有用タ
ンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつＤＮ
Ａ断片を分泌に関与する領域の下流域に隣接して連結し
た組換えプラスミドを作成して、バチルス属細菌に導入
して得られる形質転換体を培養すれば良い。
以下、実施例によりさらに具体的に本発明を説明するが
、本発明はこれらに限定されるべきものではない。
、本発明はこれらに限定されるべきものではない。
なお、本発明で使用する制限酵素およびＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、アルカリ性フォ
スファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼエなどのＤＮＡ修飾
酵素はすべて市販品として入手でき、例えば宝酒造株式
会社、東洋紡績株式会社などより購入することができる
。
オチドキナーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、アルカリ性フォ
スファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼエなどのＤＮＡ修飾
酵素はすべて市販品として入手でき、例えば宝酒造株式
会社、東洋紡績株式会社などより購入することができる
。
またベクタープラスミドも市販されているものであるが
、本発明では市販品の他、当該プラスミドを保有するエ
シェリヒア中コリあるいはバチルス・ズブチリスから抽
出して精製したものも使用している。
、本発明では市販品の他、当該プラスミドを保有するエ
シェリヒア中コリあるいはバチルス・ズブチリスから抽
出して精製したものも使用している。
実施例 １
バチルス・アミロリキエファシエンスのアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子のクローニング（１） プローブ用オ
リゴヌクレオチドの合成と Ｐによる標識 バチルス・アミロリキエファシエンス ＡＴＣＣ２３８
４４のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列はＪ
、 Ａ 、 Ｗｅｉｌｓらによって報告されている（Ｊ
、 Ａ 、 Ｗｅｌｌｓ ｅｔａｌ、： Ｎｕｃｌｅ
ｉＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、、 １１．７９１１ （１９Ｆ
３５ ））。
テアーゼ遺伝子のクローニング（１） プローブ用オ
リゴヌクレオチドの合成と Ｐによる標識 バチルス・アミロリキエファシエンス ＡＴＣＣ２３８
４４のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列はＪ
、 Ａ 、 Ｗｅｉｌｓらによって報告されている（Ｊ
、 Ａ 、 Ｗｅｌｌｓ ｅｔａｌ、： Ｎｕｃｌｅ
ｉＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、、 １１．７９１１ （１９Ｆ
３５ ））。
報告された塩基配列のうちアルカリ性プロテアーゼの成
熟タンパクのＮ末端から８番目から１３番目のアミノ酸
に対応する領域にある、ＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧ
ＣＣなる塩基配列をもつ１６個の塩基からなるオリゴヌ
クレオチドをプローブとして選び、固相ホスホトリエス
テル法によって合成した。オリゴヌクレオチドの合成に
は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社製の５種の３′−クロロフェニルリン酸保護デ
オキシジヌクレオチド（ＧＣ，ＡＡ％ＴＴ、ＣＡおよび
ＡＴ）と同位化学研究所製の完全保護デオキシモノヌク
レオチド（Ａ）および和光紬薬工業製のポリスチレンサ
ポート保護ヌクレオシド（Ｃ−レジン）を用いた。
熟タンパクのＮ末端から８番目から１３番目のアミノ酸
に対応する領域にある、ＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧ
ＣＣなる塩基配列をもつ１６個の塩基からなるオリゴヌ
クレオチドをプローブとして選び、固相ホスホトリエス
テル法によって合成した。オリゴヌクレオチドの合成に
は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社製の５種の３′−クロロフェニルリン酸保護デ
オキシジヌクレオチド（ＧＣ，ＡＡ％ＴＴ、ＣＡおよび
ＡＴ）と同位化学研究所製の完全保護デオキシモノヌク
レオチド（Ａ）および和光紬薬工業製のポリスチレンサ
ポート保護ヌクレオシド（Ｃ−レジン）を用いた。
５ 、５ｊｌＧ’（０、５５Ｍモル）ノＣ−レジ７Ｃ１
Ｍ臭化亜鉛のジクロルメタン−インプロパツール（８５
：１５、Ｖ／Ｖ ）溶液 ０．６−を加え室温（２０〜
３０°Ｃ）で３分間反応させたのち、反応液を除！？１
珂／のジクロルメタン−イソプロパツール（８５：１５
Ｖ／Ｖ）でレジンを洗浄した。前記の操作をさらに２回
繰返したあと、レジンをさらに１１のジクロルメタン−
イソプロパツール（８５：１５Ｖ／Ｖ）で３回、１−ｎ
ｔの０．５Ｍ１−リエタノールアミンー酢酸（ｐＨ７，
５）で３回、１ｄの乾燥ピリジンで２回、１ｍ／の乾燥
テトラヒドロフランで２回で順次洗浄した。洗浄後のレ
ジンを減圧乾燥したのち、１００ｍＭのＧＣ溶液（０，
４５Ｍ１−リメチルベンゼンスルホニルニトロトリアソ
リドー乾燥ピリジン溶液に溶解）を５５ｕｔ加え、３７
℃で４００分間反応せてＣ−レジンに塩基を付加した。
Ｍ臭化亜鉛のジクロルメタン−インプロパツール（８５
：１５、Ｖ／Ｖ ）溶液 ０．６−を加え室温（２０〜
３０°Ｃ）で３分間反応させたのち、反応液を除！？１
珂／のジクロルメタン−イソプロパツール（８５：１５
Ｖ／Ｖ）でレジンを洗浄した。前記の操作をさらに２回
繰返したあと、レジンをさらに１１のジクロルメタン−
イソプロパツール（８５：１５Ｖ／Ｖ）で３回、１−ｎ
ｔの０．５Ｍ１−リエタノールアミンー酢酸（ｐＨ７，
５）で３回、１ｄの乾燥ピリジンで２回、１ｍ／の乾燥
テトラヒドロフランで２回で順次洗浄した。洗浄後のレ
ジンを減圧乾燥したのち、１００ｍＭのＧＣ溶液（０，
４５Ｍ１−リメチルベンゼンスルホニルニトロトリアソ
リドー乾燥ピリジン溶液に溶解）を５５ｕｔ加え、３７
℃で４００分間反応せてＣ−レジンに塩基を付加した。
次に反応液を除き、ｉ ｍｌの乾燥ピリジンで洗浄後、
キャッピング溶液（乾燥テトラヒドロフラン：無水酢酸
：乾燥ピリジン＝７：１：２、Ｖ／Ｖ）ｔ：溶解Ｌ？：
３５ 、５１９／ｒｑ／！ジメチルアミノピリジンを０
．６１１１／加えて室温で５分間反応させて未反応の５
′−水酸基をアセチル化した。反応液を除いたあとｊ
ｍｌのジクロルメタン−イソプロピルアルコール（８５
：１５Ｖ／Ｖ ）でレジンな４回洗浄した。これまでの
工程で、レジンに３個の塩基が結合したＧＣＣち 一レジンが得られ士。これまでの一連の工程を１サイク
ルとして、各サイクルで塩基が付加されたレジンを次の
サイクルの出発物質として、所定のジヌクレオチドまた
はモノヌクレオチドすなわち、ＡＡ、ＡｌＴＴ、ＡＡ、
ＣＡ、ＣＡ。
キャッピング溶液（乾燥テトラヒドロフラン：無水酢酸
：乾燥ピリジン＝７：１：２、Ｖ／Ｖ）ｔ：溶解Ｌ？：
３５ 、５１９／ｒｑ／！ジメチルアミノピリジンを０
．６１１１／加えて室温で５分間反応させて未反応の５
′−水酸基をアセチル化した。反応液を除いたあとｊ
ｍｌのジクロルメタン−イソプロピルアルコール（８５
：１５Ｖ／Ｖ ）でレジンな４回洗浄した。これまでの
工程で、レジンに３個の塩基が結合したＧＣＣち 一レジンが得られ士。これまでの一連の工程を１サイク
ルとして、各サイクルで塩基が付加されたレジンを次の
サイクルの出発物質として、所定のジヌクレオチドまた
はモノヌクレオチドすなわち、ＡＡ、ＡｌＴＴ、ＡＡ、
ＣＡ、ＣＡ。
ＡＴを付加する反応を順次繰返すことによってＡＴＣＡ
ＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣ−レジンが合成された。
ＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣ−レジンが合成された。
このようにして合成されたオリゴ−ヌクレオチドが固定
されたレジンを１ｍ／の乾燥ピリジンで３回洗浄後、０
．５Ｍテトラメチルグア；ジン−０，５Ｍニトリロベン
ズアルドキシムの５０％ジオキサン溶液 ５ａａｕｔを
加えて、３７℃で１８時間保ち、レジンからオリゴヌク
レオチドを切り出すと共にリン酸基の脱保護を行った。
されたレジンを１ｍ／の乾燥ピリジンで３回洗浄後、０
．５Ｍテトラメチルグア；ジン−０，５Ｍニトリロベン
ズアルドキシムの５０％ジオキサン溶液 ５ａａｕｔを
加えて、３７℃で１８時間保ち、レジンからオリゴヌク
レオチドを切り出すと共にリン酸基の脱保護を行った。
次に反応液を回収し、レジンを５ｏｏｕｚの５０％ピリ
ジンで２回洗浄した洗浄液と混合して減圧乾燥した。こ
れに２８％アンモニア水０．６１／を加えて５５℃で６
時間保ち塩基の脱００μｔまで濃縮し、これに２．６ｔ
ｔｔの２Ｍトリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７，０）を加
えた。
ジンで２回洗浄した洗浄液と混合して減圧乾燥した。こ
れに２８％アンモニア水０．６１／を加えて５５℃で６
時間保ち塩基の脱００μｔまで濃縮し、これに２．６ｔ
ｔｔの２Ｍトリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７，０）を加
えた。
こノ溶液をゾルパックスＯＤＳカラム（ＤｕＦｏｎｔ社
製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、５０
ｍＭトリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７、０）＋ｌＩ液中
１０−４０％のアセトニトリル直線濃度勾配によって分
画し、メインピークに相当する両分を回収した。回収し
た画分な減圧乾燥したのちｊ ｍｌの８０％酢酸を加え
て室温で２０分間保ち５′末端の脱保護を行い、減圧下
で酢酸を除いて精製オリゴヌクレオチド １６０μｇを
得た。
製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、５０
ｍＭトリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７、０）＋ｌＩ液中
１０−４０％のアセトニトリル直線濃度勾配によって分
画し、メインピークに相当する両分を回収した。回収し
た画分な減圧乾燥したのちｊ ｍｌの８０％酢酸を加え
て室温で２０分間保ち５′末端の脱保護を行い、減圧下
で酢酸を除いて精製オリゴヌクレオチド １６０μｇを
得た。
このようにして得た精製オリゴヌクレオチド９６ｎｆｌ
にｒ Ｐ −ＡＴＰ （５０００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌＡ
ｍｅ ｒ ｓ ｈ ａｍ社製）１００μＣｉ、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ２．２ユニツトおよびキナーゼ緩
衝液（）シＯｍＭ）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７゜５．１０
ｍ Ｍ Ｍ、！ｉ’ｃｔｚ、１０ｍＭジチオスレイト
ール、濃度は最終濃度）を加えた反応液５０μｔを３７
℃で６０分間保ち、５′末端を Ｐで標識した。反応液
に２０μｇの酵母ｔＲＮＡと７５μｔのエタノールを加
えてオリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心分離により回
収した沈殿をエタノールで洗浄し、乾燥後、１００μｔ
のＴｇ緩衝液（１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液 ｐＨ８，
０，１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解して、５′末端が標識され
たオリゴヌクレオチドの溶液（０゜３μＣｉ／μｔ）を
得た。
にｒ Ｐ −ＡＴＰ （５０００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌＡ
ｍｅ ｒ ｓ ｈ ａｍ社製）１００μＣｉ、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ２．２ユニツトおよびキナーゼ緩
衝液（）シＯｍＭ）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７゜５．１０
ｍ Ｍ Ｍ、！ｉ’ｃｔｚ、１０ｍＭジチオスレイト
ール、濃度は最終濃度）を加えた反応液５０μｔを３７
℃で６０分間保ち、５′末端を Ｐで標識した。反応液
に２０μｇの酵母ｔＲＮＡと７５μｔのエタノールを加
えてオリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心分離により回
収した沈殿をエタノールで洗浄し、乾燥後、１００μｔ
のＴｇ緩衝液（１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液 ｐＨ８，
０，１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解して、５′末端が標識され
たオリゴヌクレオチドの溶液（０゜３μＣｉ／μｔ）を
得た。
（２）染色体ＤＮＡの調製
２０−のニュートリエンドブロス（肉エキス０．５ｗｔ
％、ポリペプトンＳ １ ｗｔ％、 ＮａＣ１０，５
ｗｔ％、ｐ）Ｔ ７．０ ）にバチルス・アミロリ
キエファシエンス ＡＴＣＣ２５８４４を寒天斜面から
１白金耳接種し、３７℃で一晩前培養を行った。次いで
その５１１＋／を５００ ｌｌｌ１の同培地に接種して
約２．５時間培養し、得られた菌体な遠心分離により集
めた。この菌体な５０ｍ１の１５０ｍＭ ＮａＣ４／１
００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８）で洗浄後、２５ｍ／
の同溶液に懸濁し、１０ダのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ社
製）を加えて６７°Ｃで３０分間保持した。次いで２０
％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） ２．５＋＊／
を加えてゆっくりと混合したのち６０℃で１０分間保ち
溶菌させた。溶菌液を室温まで冷却後、５Ｍ過塩素酸ナ
トリウム ６．６Ｒ１とりａロポルムーイソアミルアル
コール（２４： １ 、Ｖ／Ｖ）混合液 ５１．６ｒｄ
を加え、ゆっくりと混合して均一なエマルジョンとした
。これを１０．００Ｏｒｐｍ、１０分の遠心分離にかけ
て水層、中間層、有機層の三層に分け、水層を採取した
。
％、ポリペプトンＳ １ ｗｔ％、 ＮａＣ１０，５
ｗｔ％、ｐ）Ｔ ７．０ ）にバチルス・アミロリ
キエファシエンス ＡＴＣＣ２５８４４を寒天斜面から
１白金耳接種し、３７℃で一晩前培養を行った。次いで
その５１１＋／を５００ ｌｌｌ１の同培地に接種して
約２．５時間培養し、得られた菌体な遠心分離により集
めた。この菌体な５０ｍ１の１５０ｍＭ ＮａＣ４／１
００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８）で洗浄後、２５ｍ／
の同溶液に懸濁し、１０ダのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ社
製）を加えて６７°Ｃで３０分間保持した。次いで２０
％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） ２．５＋＊／
を加えてゆっくりと混合したのち６０℃で１０分間保ち
溶菌させた。溶菌液を室温まで冷却後、５Ｍ過塩素酸ナ
トリウム ６．６Ｒ１とりａロポルムーイソアミルアル
コール（２４： １ 、Ｖ／Ｖ）混合液 ５１．６ｒｄ
を加え、ゆっくりと混合して均一なエマルジョンとした
。これを１０．００Ｏｒｐｍ、１０分の遠心分離にかけ
て水層、中間層、有機層の三層に分け、水層を採取した
。
この水層に２倍容のエタ／−ルを加え、生じた糸状沈殿
をガラス棒に巻き取り、この沈殿を７０％および９９．
５％エタノールで順次洗浄したのち減圧乾燥した。これ
を１５ゴの０．１×８８Ｃ（ＩＸＳＳＣは１５０ ｍＭ
ＮａＣｔ、 １５ｍＭクエン酸三ナトリウムに相当し
、０．ｌＸ５ＳＣの数字は各成分のＩ Ｘ８８Ｃに対す
る濃度比を表わす。すなわち０ 、Ｉ Ｘ５ＳＣは１×
ＳＳＣの１／１０の濃度の溶液であることを示す。
をガラス棒に巻き取り、この沈殿を７０％および９９．
５％エタノールで順次洗浄したのち減圧乾燥した。これ
を１５ゴの０．１×８８Ｃ（ＩＸＳＳＣは１５０ ｍＭ
ＮａＣｔ、 １５ｍＭクエン酸三ナトリウムに相当し
、０．ｌＸ５ＳＣの数字は各成分のＩ Ｘ８８Ｃに対す
る濃度比を表わす。すなわち０ 、Ｉ Ｘ５ＳＣは１×
ＳＳＣの１／１０の濃度の溶液であることを示す。
以下この表示方法に準する）に溶解後ＩＱＸ３ＳＣ１，
５ｍを加え、これに、９０℃で１０分間加熱処理して混
在するＤＮａｓｅを失活させた５１９／ｄの几Ｎａ５ｅ
Ａ （Ｓｉｇｍａ社製）１６５μｔを加えて３７℃で５
０分間保ち混入するＲＮ人を分解した。ＲＮａｓｅＡを
除くために等容のフェノール−クロロホルム（１：１．
Ｖ／Ｖ、０゜１ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液ｐＨ７、５で飽
和）を加えてゆっくりと混合して均一なエマルジョンを
形成させ、遠心分離を行って分離する水層を採取した。
５ｍを加え、これに、９０℃で１０分間加熱処理して混
在するＤＮａｓｅを失活させた５１９／ｄの几Ｎａ５ｅ
Ａ （Ｓｉｇｍａ社製）１６５μｔを加えて３７℃で５
０分間保ち混入するＲＮ人を分解した。ＲＮａｓｅＡを
除くために等容のフェノール−クロロホルム（１：１．
Ｖ／Ｖ、０゜１ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液ｐＨ７、５で飽
和）を加えてゆっくりと混合して均一なエマルジョンを
形成させ、遠心分離を行って分離する水層を採取した。
この水層に等容のクロロホルム−イソアミルアルコール
（２４：１．Ｖ／Ｖ）を加えて前記同様抽出を行って水
層な採取する操作を２回繰返した。このようにして得ら
れた水層に２倍容のエタノールを加えて生じた糸状沈殿
を前記と同様にして回収して、エタノール洗浄及び乾燥
した。これを１０ｄのＴＥ緩衝液に溶解して染色体ＤＮ
Ａ溶液（ＤＮＡ ５．６■）を得た。
（２４：１．Ｖ／Ｖ）を加えて前記同様抽出を行って水
層な採取する操作を２回繰返した。このようにして得ら
れた水層に２倍容のエタノールを加えて生じた糸状沈殿
を前記と同様にして回収して、エタノール洗浄及び乾燥
した。これを１０ｄのＴＥ緩衝液に溶解して染色体ＤＮ
Ａ溶液（ＤＮＡ ５．６■）を得た。
（３） アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の存在する染
色体ＤＮＡ断片の長さの算出 前記（２）で得られた染色体ＤＮＡ ６０μｇと１２
０ユニツトのＨｉｎｄｕ及びＨｉｎｄｌｌ１反応緩衝液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −塩酸緩衝液 ｐＨ７，５
，７ｍＭＭｇＣＬ２．６０ｍＭＮａＣＬ、濃度は最終濃
度）を含む反応液 ６００μｔを５７℃で３時間保持し
てＤＮＡを切断したのち、２゜５倍量のエタノールを加
えてＤＮＡを沈殿させた。遠心分離により沈殿を回収し
て、１８０μｔのＴＥ緩衝液に溶解して染色体Ｄ Ｎ
Ａ ｆ） Ｈｉｎｄｌｌｌ断片溶液を得た。この溶液
１５μｔをアガロースゲル電気泳動で分画した。この時
、ＤＮＡ断片の長さを算出するための分子量マーカーと
してλフアージＤＮＡをＢｉｎｄｌｌ で切断したＤ
ＮＡ１μｇを同時に泳動した。泳動後、ゲルを１μ９／
ＷＬｌのエチジウムプロミド溶液に浸漬してＤＮＡを染
色したのち、ゲルの３倍容の０．２５ＮＨＣＬ％ ０．
５Ｎ ＮａＯＨ−ＩＭ ＮａＣｔおよび０゜５Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）−１ＭＮａＣＬで１
５分間、２回ずつ順次処理してＤＮＡを変性させた。こ
のゲルにニトロセルロースフィルターを密着させ ２紙
を通じてゲルの下より２０Ｘ８８Ｃを供給しながら約１
６時間放置してニトロセルロースフィルターにＤＮＡな
移しとった。このフィルターを乾燥後、減圧下８０°Ｃ
で２時間処理してＤＮＡをフィルターに固定した。
色体ＤＮＡ断片の長さの算出 前記（２）で得られた染色体ＤＮＡ ６０μｇと１２
０ユニツトのＨｉｎｄｕ及びＨｉｎｄｌｌ１反応緩衝液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −塩酸緩衝液 ｐＨ７，５
，７ｍＭＭｇＣＬ２．６０ｍＭＮａＣＬ、濃度は最終濃
度）を含む反応液 ６００μｔを５７℃で３時間保持し
てＤＮＡを切断したのち、２゜５倍量のエタノールを加
えてＤＮＡを沈殿させた。遠心分離により沈殿を回収し
て、１８０μｔのＴＥ緩衝液に溶解して染色体Ｄ Ｎ
Ａ ｆ） Ｈｉｎｄｌｌｌ断片溶液を得た。この溶液
１５μｔをアガロースゲル電気泳動で分画した。この時
、ＤＮＡ断片の長さを算出するための分子量マーカーと
してλフアージＤＮＡをＢｉｎｄｌｌ で切断したＤ
ＮＡ１μｇを同時に泳動した。泳動後、ゲルを１μ９／
ＷＬｌのエチジウムプロミド溶液に浸漬してＤＮＡを染
色したのち、ゲルの３倍容の０．２５ＮＨＣＬ％ ０．
５Ｎ ＮａＯＨ−ＩＭ ＮａＣｔおよび０゜５Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）−１ＭＮａＣＬで１
５分間、２回ずつ順次処理してＤＮＡを変性させた。こ
のゲルにニトロセルロースフィルターを密着させ ２紙
を通じてゲルの下より２０Ｘ８８Ｃを供給しながら約１
６時間放置してニトロセルロースフィルターにＤＮＡな
移しとった。このフィルターを乾燥後、減圧下８０°Ｃ
で２時間処理してＤＮＡをフィルターに固定した。
このフィルターをビニール袋に収納し、プレハイブリダ
イゼーション溶液（５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ液（Ｉ Ｘ
Ｄｅｎｈａｒｄｔ液は０．０２ｗｔ％ フィコール、
Ｑ、０２ｗｔ％！Ｐ−血清アルブミン、０．０２ｗｔ％
ポリビニルピロリドン）、５ｘｓｓｃ。
イゼーション溶液（５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ液（Ｉ Ｘ
Ｄｅｎｈａｒｄｔ液は０．０２ｗｔ％ フィコール、
Ｑ、０２ｗｔ％！Ｐ−血清アルブミン、０．０２ｗｔ％
ポリビニルピロリドン）、５ｘｓｓｃ。
５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６，５，１００μｇ／ｍｌ変
性サケ精液ＤＮＡ） ２０ｍ／を加えてビニール袋
を密封し、５５°Ｃで一晩保持してプレハイブリダイゼ
ーションを行った。次いで、ビニール袋からプレハイブ
リダイゼーション溶液を除き、戸イブリダイゼーション
溶液〔組成はプレハイブリダイゼーション溶液と同じ〕
４ゴと、前記（１）で得られた Ｐで標識されたオ
リゴヌクレオチド ２μＣｉを９５℃で５分間熱処理後
、急冷した溶液を加えてビニール袋を密封した。袋中の
溶液をよく混合したのち、３７℃で約１６時間保持して
ノ・イブリダイゼーションを行った。その後、フィルタ
ーをとり出し約２００ゴの４ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳ
溶液中で室温で１０分間ずつ３回洗浄し、乾燥後、フィ
ルターにＸ線フィルムを密着させて一８０℃で１６時間
感光させた。Ｘ線フィルムを、現像して黒化した部分を
分子量マーカーの泳動位置と比較して、アルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子の存在す（４）染色体ＤＮＡ断片の分画 前記（３）で調製された染色体ＤＮＡのＨ４ｎｄｕ断片
の溶液１５０μｔ（ＤＮＡ断片約ｇ）をアガロースゲル
電気泳動で分画し、エチジウムプロミドで染色したのち
、ゲルに紫外線ランプを照射し、分子量マーカーのλフ
アージＤＮＡの断片の位置より算出される１、８〜４
、５ ｋｂの断片に相当する位置のゲル片を切り出した
。
性サケ精液ＤＮＡ） ２０ｍ／を加えてビニール袋
を密封し、５５°Ｃで一晩保持してプレハイブリダイゼ
ーションを行った。次いで、ビニール袋からプレハイブ
リダイゼーション溶液を除き、戸イブリダイゼーション
溶液〔組成はプレハイブリダイゼーション溶液と同じ〕
４ゴと、前記（１）で得られた Ｐで標識されたオ
リゴヌクレオチド ２μＣｉを９５℃で５分間熱処理後
、急冷した溶液を加えてビニール袋を密封した。袋中の
溶液をよく混合したのち、３７℃で約１６時間保持して
ノ・イブリダイゼーションを行った。その後、フィルタ
ーをとり出し約２００ゴの４ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳ
溶液中で室温で１０分間ずつ３回洗浄し、乾燥後、フィ
ルターにＸ線フィルムを密着させて一８０℃で１６時間
感光させた。Ｘ線フィルムを、現像して黒化した部分を
分子量マーカーの泳動位置と比較して、アルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子の存在す（４）染色体ＤＮＡ断片の分画 前記（３）で調製された染色体ＤＮＡのＨ４ｎｄｕ断片
の溶液１５０μｔ（ＤＮＡ断片約ｇ）をアガロースゲル
電気泳動で分画し、エチジウムプロミドで染色したのち
、ゲルに紫外線ランプを照射し、分子量マーカーのλフ
アージＤＮＡの断片の位置より算出される１、８〜４
、５ ｋｂの断片に相当する位置のゲル片を切り出した
。
このゲル片を透析膜に入れＴＥ緩衝液２１Ｉｔを満たし
てシールしたのち、トリスＯホウ酸緩衝液（９０ｍＭ）
リズマベース、９０ ｍＭホウ酸、４ｍＭ ＢＤＴＡ、
ｐＨ８，５）中で１００Ｖ。
てシールしたのち、トリスＯホウ酸緩衝液（９０ｍＭ）
リズマベース、９０ ｍＭホウ酸、４ｍＭ ＢＤＴＡ、
ｐＨ８，５）中で１００Ｖ。
１時間電気泳動を行ってＤＮＡをゲルから溶出させた。
溶出液を回収して２．５倍量のエタノールを加えてＤＮ
Ａを沈殿させ、遠心分離により沈殿を回収して、乾燥後
、４０μｔのＴＥ緩衝液に溶雫して１．８〜４ 、５
ｋｂの染色体ＤＮＡ断片約８μ９を得た。
Ａを沈殿させ、遠心分離により沈殿を回収して、乾燥後
、４０μｔのＴＥ緩衝液に溶雫して１．８〜４ 、５
ｋｂの染色体ＤＮＡ断片約８μ９を得た。
（５）ベクタープラスミドの調製
プラスミドｐＢＲ３２２を保有するエシェリヒア・コリ
ＬＥ、３９２ＣｋＴＣＣ５５５７２）を１ｔのＮＺＹＭ
培地（ＮＺアミン拳タイプＡ（和光紬薬工業） １ ｗ
ｔ％ 、ポリペプトンＳＯ，５ｗｔ％、 ＮａＣ１０、
５ｗｔ％ １０ｍＭＭ９ＣＬｚ、ｐＨ７，２）に５０μ
９７ｍｌのアンピシリンを加え培地で３７℃で１０ 菌
体／ｄまで培養し、これにクロラムフェニコールを１０
０η加え、さらに１６時間培養した。遠心分離により集
めた菌体からＣｌｅｗｅｌｌとＨｅ１ｉｎｓｋｉの方法
ＣＤ 、 Ｂ 、 Ｃ１ｅｖｒｅ１１． Ｄ、几、Ｈｅ
１ｉｎｓｋｉ：亀 Ｐｒｏｉｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃ−１−ｄ、 Ｓｃｉ、、
ＵＳＡ、６２．１１５９（１９６９））によって粗プ
ラスミド画分の抽出及びＣ５ＣＬ−エチジウムプロミド
平衡密度勾配遠心分離（日立分離用超遠心分離機 ８５
Ｐ。
ＬＥ、３９２ＣｋＴＣＣ５５５７２）を１ｔのＮＺＹＭ
培地（ＮＺアミン拳タイプＡ（和光紬薬工業） １ ｗ
ｔ％ 、ポリペプトンＳＯ，５ｗｔ％、 ＮａＣ１０、
５ｗｔ％ １０ｍＭＭ９ＣＬｚ、ｐＨ７，２）に５０μ
９７ｍｌのアンピシリンを加え培地で３７℃で１０ 菌
体／ｄまで培養し、これにクロラムフェニコールを１０
０η加え、さらに１６時間培養した。遠心分離により集
めた菌体からＣｌｅｗｅｌｌとＨｅ１ｉｎｓｋｉの方法
ＣＤ 、 Ｂ 、 Ｃ１ｅｖｒｅ１１． Ｄ、几、Ｈｅ
１ｉｎｓｋｉ：亀 Ｐｒｏｉｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃ−１−ｄ、 Ｓｃｉ、、
ＵＳＡ、６２．１１５９（１９６９））によって粗プ
ラスミド画分の抽出及びＣ５ＣＬ−エチジウムプロミド
平衡密度勾配遠心分離（日立分離用超遠心分離機 ８５
Ｐ。
ローターＲＰ８５Ｔ、３３．００Ｏｒｐｍ 、４０時間
、２０℃）による分画を行いプラスミド画分を得た。こ
の両分を等容のイソプロパツールで抽出してエチジウム
プロミドを除去したのち、ＴＥ緩衝液１ｔに対して１時
間ずつ２回透析して精製プラスミドルＢ几３２２を１．
５ダ得た。
、２０℃）による分画を行いプラスミド画分を得た。こ
の両分を等容のイソプロパツールで抽出してエチジウム
プロミドを除去したのち、ＴＥ緩衝液１ｔに対して１時
間ずつ２回透析して精製プラスミドルＢ几３２２を１．
５ダ得た。
このプラスミドｐＢＲ３２２２０μＩを４０ユニツトの
Ｈｉｎｄｌｔｌ と３７°Ｃで３時間反応させて切断
後、エタノール沈殿および乾燥を行い２００μｔの１０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液 ｐＨ８，０に溶解した。これ
に０．２ユニツトの大腸菌アルカリ性フォスファターゼ
を加えて６５℃で５０分間反応させた。反応後、等容の
フェノール・クロロホルム（１：１．ｖ／ｖ）を加えて
５分間振とうして抽出した。遠心分離により二層を分離
し、水層を採ホした。この水層を再度フェノール・クロ
ロホルム抽出したのち、等容のクロロホルム・イソアミ
ルアルコール（２４：１．Ｖ／Ｖ）で同様に２回抽出し
た。水層に５００μｔのエタノールを加えてＤＮＡを沈
殿させ、遠心分離により沈殿を回収して乾燥後、１００
μｔの水に溶解した。このようにしてＨｉ Ｏｄ Ｉｌ
ｌ で切断され、５′末端が脱リン酸化された線状の
ベクタープラスミドｐＢＲ３２２を得た。
Ｈｉｎｄｌｔｌ と３７°Ｃで３時間反応させて切断
後、エタノール沈殿および乾燥を行い２００μｔの１０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液 ｐＨ８，０に溶解した。これ
に０．２ユニツトの大腸菌アルカリ性フォスファターゼ
を加えて６５℃で５０分間反応させた。反応後、等容の
フェノール・クロロホルム（１：１．ｖ／ｖ）を加えて
５分間振とうして抽出した。遠心分離により二層を分離
し、水層を採ホした。この水層を再度フェノール・クロ
ロホルム抽出したのち、等容のクロロホルム・イソアミ
ルアルコール（２４：１．Ｖ／Ｖ）で同様に２回抽出し
た。水層に５００μｔのエタノールを加えてＤＮＡを沈
殿させ、遠心分離により沈殿を回収して乾燥後、１００
μｔの水に溶解した。このようにしてＨｉ Ｏｄ Ｉｌ
ｌ で切断され、５′末端が脱リン酸化された線状の
ベクタープラスミドｐＢＲ３２２を得た。
（６）組換えプラスミドの作製
前記（４）で得られた１、８〜４．５ｋｂの染色体ＤＮ
Ａ断片約４μｇ（２０μｔ）と、前記（５）で得られた
Ｈｉｎｄｍ で切断され５１末端が脱リン酸化された
線状のベクタープラスミドｐＢ８３２２２μｇ（１０μ
Ｌ）どを混合し、これに０．８ユニツトのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼおよびリガーゼ緩衝液（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩
酸緩衝液ｐＨ７，６，６゜６ｍＭＭｇＣ４２，１０ｍＭ
ジチオスレイトール、２ｍＭＡＴＰ、濃度は最終濃度〕
を加えた反応液４０μＬを５℃で１６時間保ち、両ＤＮ
Ａな連結して組換えプラスミドを作製した。
Ａ断片約４μｇ（２０μｔ）と、前記（５）で得られた
Ｈｉｎｄｍ で切断され５１末端が脱リン酸化された
線状のベクタープラスミドｐＢ８３２２２μｇ（１０μ
Ｌ）どを混合し、これに０．８ユニツトのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼおよびリガーゼ緩衝液（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩
酸緩衝液ｐＨ７，６，６゜６ｍＭＭｇＣ４２，１０ｍＭ
ジチオスレイトール、２ｍＭＡＴＰ、濃度は最終濃度〕
を加えた反応液４０μＬを５℃で１６時間保ち、両ＤＮ
Ａな連結して組換えプラスミドを作製した。
（））組換えプラスミドによるエシェリヒア・コリの形
質転換およびアルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株の選
択 エシェリヒア・フ’Ｊ Ｌ Ｅ ５９２をＮＺＹＭ培地
５ｄに接種して一晩培養した前培養液０．２−を、２０
ＩＩＩｌのＮＺＹＭ培地に接種して３７℃で２．５時間
培養した。遠心分離により菌体を集め１０１１Ｉｌの１
０ｍＭ ＮａＣ６で洗浄後、１０ａｔのＭｎ−Ｃａ溶液
（７０ｍＭ ＭｎＣ４２，３０ｍＭＣａＣｔ２．４０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ５，６）に懸濁して水中で１５
分間保ったのち、遠心分離で菌体を集め０．５ゴのＭｎ
Ｃａ溶液に懸濁して、ＤＮＡを受は入れやすくした細胞
を得た。
質転換およびアルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株の選
択 エシェリヒア・フ’Ｊ Ｌ Ｅ ５９２をＮＺＹＭ培地
５ｄに接種して一晩培養した前培養液０．２−を、２０
ＩＩＩｌのＮＺＹＭ培地に接種して３７℃で２．５時間
培養した。遠心分離により菌体を集め１０１１Ｉｌの１
０ｍＭ ＮａＣ６で洗浄後、１０ａｔのＭｎ−Ｃａ溶液
（７０ｍＭ ＭｎＣ４２，３０ｍＭＣａＣｔ２．４０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ５，６）に懸濁して水中で１５
分間保ったのち、遠心分離で菌体を集め０．５ゴのＭｎ
Ｃａ溶液に懸濁して、ＤＮＡを受は入れやすくした細胞
を得た。
この懸濁液０．４−に、前記（６）で得られた組換えプ
ラスミド溶液３０μｔ（ＤＮＡ約４．５μｇ）を加えて
混合し、水中で６０分間保ったのち、５７℃で２分間加
温して細胞に組換えプラスミドを取込ませた。これにＮ
ＺＹＭ培地１．６ｄを加えて５７°Ｃで５０分間振とう
したのち、２５μ９７Ｉｌｌ のアンピシリンを含む
ＮＺＹＭ寒天平板上にニトロセルロースフィルターを敷
いたプレート上に１００μＬずつ塗布した。このプレー
トを３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性となった形
質転換体のコロニーを７９００個得た０次に、このフィ
ルターをマスターフィルターとして、この上に新しいニ
トロセルロースフィルターを密着させてレプリカをとっ
た。両フィルターを新しい寒天平板（２５μ９／ｙｓｌ
アンピシリン含有ＮＺＹＭ培地）上に移して３７℃で一
トは保存＋÷。一方、レプリカフィルターは２００μ９
／Ｗｌ のクロラムフェニフールヲ含ｔｒＮＺＹＭ寒
天平板に移し、さらに３７℃で一晩培養を継続した。
ラスミド溶液３０μｔ（ＤＮＡ約４．５μｇ）を加えて
混合し、水中で６０分間保ったのち、５７℃で２分間加
温して細胞に組換えプラスミドを取込ませた。これにＮ
ＺＹＭ培地１．６ｄを加えて５７°Ｃで５０分間振とう
したのち、２５μ９７Ｉｌｌ のアンピシリンを含む
ＮＺＹＭ寒天平板上にニトロセルロースフィルターを敷
いたプレート上に１００μＬずつ塗布した。このプレー
トを３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性となった形
質転換体のコロニーを７９００個得た０次に、このフィ
ルターをマスターフィルターとして、この上に新しいニ
トロセルロースフィルターを密着させてレプリカをとっ
た。両フィルターを新しい寒天平板（２５μ９／ｙｓｌ
アンピシリン含有ＮＺＹＭ培地）上に移して３７℃で一
トは保存＋÷。一方、レプリカフィルターは２００μ９
／Ｗｌ のクロラムフェニフールヲ含ｔｒＮＺＹＭ寒
天平板に移し、さらに３７℃で一晩培養を継続した。
次いで、このフィルターを次の４種の溶液で湿めらせた
ｒ紙の上で、順次、１０分間ずつ保ち菌体内のＤＮＡを
溶出させフィルター上に吸着させた。４種の溶液として
、■ ０．５ＮＮａＯＨ■ ＩＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液
ｐＨ８，０■０．５ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐＨ８，
０−ＩＭＮａＣｌ ■ ２ＸＳＳＣをそれぞれ用いた
。
ｒ紙の上で、順次、１０分間ずつ保ち菌体内のＤＮＡを
溶出させフィルター上に吸着させた。４種の溶液として
、■ ０．５ＮＮａＯＨ■ ＩＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液
ｐＨ８，０■０．５ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐＨ８，
０−ＩＭＮａＣｌ ■ ２ＸＳＳＣをそれぞれ用いた
。
このように処理したフィルターを乾燥し、前記（３）と
同様の操作でＤＮＡをフィルターに固定した。
同様の操作でＤＮＡをフィルターに固定した。
次いでこのフィルターを用いて、前記（１）で得られた
Ｐで標識されたオリゴヌクレオチドをプローブとして
前記（３）と同じ方法でプレハイブリダイゼーション、
ノ・イブリダイゼーションオよびオートラジオグラフィ
ーを行った結果、オートラジオグラム上に１個のシグナ
ルが検出された。このシグナルに対応する形質転換体を
マスターフィルターからとりアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子を含む組換えプラスミドを保有する形質転換体を得
た。
Ｐで標識されたオリゴヌクレオチドをプローブとして
前記（３）と同じ方法でプレハイブリダイゼーション、
ノ・イブリダイゼーションオよびオートラジオグラフィ
ーを行った結果、オートラジオグラム上に１個のシグナ
ルが検出された。このシグナルに対応する形質転換体を
マスターフィルターからとりアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子を含む組換えプラスミドを保有する形質転換体を得
た。
（８）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含む組換えプラ
スミドの同定 前記Ｃ７）で得られた形質転換体から、ｐＢＲ３２２と
同じ方法でプラスミドを調製すると、１５ｋｂの長さの
プラスミドが得られ、このプラスミドなｐＡＭＰ３（第
１図参照）と命名した。
スミドの同定 前記Ｃ７）で得られた形質転換体から、ｐＢＲ３２２と
同じ方法でプラスミドを調製すると、１５ｋｂの長さの
プラスミドが得られ、このプラスミドなｐＡＭＰ３（第
１図参照）と命名した。
ｐＡＭＰ３を、第１図に記載の制限酵素で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動で分画して検出された断片のサイズ
を算出した結果をもとにして、第１図の制限酵素地図が
作成され、このプラスミドはベクタープラスミド ｐＢ
Ｒ，５２２２分子と２つの染色体ＤＮＡのＨｉｎｄｌ！
Ｉ 断片（２゜８ｋｂと１．４ｋｂ ）が連結された
ものであることがわかった。
ロースゲル電気泳動で分画して検出された断片のサイズ
を算出した結果をもとにして、第１図の制限酵素地図が
作成され、このプラスミドはベクタープラスミド ｐＢ
Ｒ，５２２２分子と２つの染色体ＤＮＡのＨｉｎｄｌ！
Ｉ 断片（２゜８ｋｂと１．４ｋｂ ）が連結された
ものであることがわかった。
２つの染色体ＤＮＡ断片のうち、２ 、８ ｋｂの断片
（第１図における斜線部分）がサザン・ハイブリダイゼ
ーションでプローブのオリゴヌクレオチドとハイブリダ
イズし、前記（３）で算出された長さと一致することか
ら、この断片にアルカリ性プロテアーゼ遺伝子が含まれ
ていると判断された。
（第１図における斜線部分）がサザン・ハイブリダイゼ
ーションでプローブのオリゴヌクレオチドとハイブリダ
イズし、前記（３）で算出された長さと一致することか
ら、この断片にアルカリ性プロテアーゼ遺伝子が含まれ
ていると判断された。
なお、組換えプラスミドｐＡＭＰ３を保有するエシェリ
ヒア・コリＬＥ５９２（ｐＡＭＰ３）は微工研菌寄第９
１７５号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。
ヒア・コリＬＥ５９２（ｐＡＭＰ３）は微工研菌寄第９
１７５号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。
実施例 ２
バチルス舎リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子のクローニング （１） プローブ用ＤＮＡ断片の調製と Ｐによる
標識 実施例１で得られた組換えプラスミド ｐＡＭＰ３をＨ
ｉｎｄｌｌｌで切断して得られる２、８ｋｂの断片には
、バチルス・アミロリキエファシェンスのアルカリ性プ
ロテアーゼ遺伝子が存在するので、この断片をプローブ
として用いた。
伝子のクローニング （１） プローブ用ＤＮＡ断片の調製と Ｐによる
標識 実施例１で得られた組換えプラスミド ｐＡＭＰ３をＨ
ｉｎｄｌｌｌで切断して得られる２、８ｋｂの断片には
、バチルス・アミロリキエファシェンスのアルカリ性プ
ロテアーゼ遺伝子が存在するので、この断片をプローブ
として用いた。
３０μｙのｐＡＭＩ’５を、６０ユニツトのＨｉ ｎｄ
ｌ と３７℃で３時間反応させて切断したのち、２．
５倍容のエタ／−ルを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠心
分離により沈殿を回収し、１５０μｔのＴＥ緩衝液に溶
解してアガロースゲル電気泳動により分画した。エチジ
ウムプロミドでゲルを染色し、紫外線ランプを照射する
と３本のバンドが検出された。これらのうち、２ 、８
ｋｂの長さをもつ真中のバンドを切り出し、実施例１
（４）と同様ｔこ電気泳動法でＤＮＡを溶出させ、エタ
ノール沈殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡを乾燥後６
０μｔのＴＥ緩衝液に溶解して約６Ｌ１９のＤＮＡ断片
溶液を得た。
ｌ と３７℃で３時間反応させて切断したのち、２．
５倍容のエタ／−ルを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠心
分離により沈殿を回収し、１５０μｔのＴＥ緩衝液に溶
解してアガロースゲル電気泳動により分画した。エチジ
ウムプロミドでゲルを染色し、紫外線ランプを照射する
と３本のバンドが検出された。これらのうち、２ 、８
ｋｂの長さをもつ真中のバンドを切り出し、実施例１
（４）と同様ｔこ電気泳動法でＤＮＡを溶出させ、エタ
ノール沈殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡを乾燥後６
０μｔのＴＥ緩衝液に溶解して約６Ｌ１９のＤＮＡ断片
溶液を得た。
このＤＮＡ断片溶液１０μＡ（ＤＮＡ約１μ９）にα３
２Ｐ−ｄ ＣＴ Ｐ （４１０Ｃｉ／ｍｍｏｔ、Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）５０μＣｉ 、 １２０ ｎ９７ＩＲ
Ｉ ＤＮａｓｅ Ｉ（べ−リンガ−・マンハイム・山之
内社製）２．５μｔおよびニックトランスレーション緩
衝−１ｅｔ、 ［５０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐＨ
７，８，５ｍＭＭ！ＩＣ１２，１０ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール、１５１Ｊ／ａｔ 牛血清アルブミン、
０ 、６ ｍＭｄＡＴＰ、０ 、６ｍＭ ｄＧＴＰ、０
、６ｍＭｄＴＴＰ、濃度は最終濃度〕を加えた反応液
５０μｔを２７℃で３０分間保温したのち、５ユニツト
のＤＮＡポリメラーゼ■を加えて１４℃で、さらに６０
分間ニックトランスレーション〔Ｐ。
２Ｐ−ｄ ＣＴ Ｐ （４１０Ｃｉ／ｍｍｏｔ、Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）５０μＣｉ 、 １２０ ｎ９７ＩＲ
Ｉ ＤＮａｓｅ Ｉ（べ−リンガ−・マンハイム・山之
内社製）２．５μｔおよびニックトランスレーション緩
衝−１ｅｔ、 ［５０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐＨ
７，８，５ｍＭＭ！ＩＣ１２，１０ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール、１５１Ｊ／ａｔ 牛血清アルブミン、
０ 、６ ｍＭｄＡＴＰ、０ 、６ｍＭ ｄＧＴＰ、０
、６ｍＭｄＴＴＰ、濃度は最終濃度〕を加えた反応液
５０μｔを２７℃で３０分間保温したのち、５ユニツト
のＤＮＡポリメラーゼ■を加えて１４℃で、さらに６０
分間ニックトランスレーション〔Ｐ。
Ｗ 、 Ｊ 、 Ｒｉｇｂｙ ｅｔａｌ、 ： Ｊ ８
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。
１１３．２３７（１９７７））を行って Ｐで標識され
たＤＮＡを合成した。
たＤＮＡを合成した。
この反応生成液に２０μｇの酵母ｔ ＲＮＡと１２５μ
ｔのエタノールとを加えてＤＮＡを沈殿させ、遠心分離
によりＤＮＡを回収して乾燥後、１００μｔのＴＥ緩衝
液に溶解して Ｐで標識されたプローブＤＮＡ（０，２
μＣｉ／μｔ）を得た。
ｔのエタノールとを加えてＤＮＡを沈殿させ、遠心分離
によりＤＮＡを回収して乾燥後、１００μｔのＴＥ緩衝
液に溶解して Ｐで標識されたプローブＤＮＡ（０，２
μＣｉ／μｔ）を得た。
（２）遺伝子供与体の調製
バチルス・リケニホルミスの公知菌株を検索し、プロテ
アーゼ生産能の高い菌株としてＴＰｏ １２１９６株
を選んだ。
アーゼ生産能の高い菌株としてＴＰｏ １２１９６株
を選んだ。
バチルスＱリケニホルミス ＩＦＯ１２１９６をＮ−エ
チル−背−ニドローＮ−二トロソグアニジンを変異誘起
剤として通常に行われる変異処理を行い、カゼイン１ｗ
ｔ％ を含むニュートリエンドアガー（肉エキス ０
、５ ｗｔ”ｏｓペプトン １ ｗｔ覧ＮａＣｔＯ、５
ｗｔ％、寒天 １ 、５ ｗｔ９’ｏ、 ｐＨ７、０）
上で大きな７１０−を形成する変異株ＨＰ１９６１１を
誘導して、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の供与体とし
た。
チル−背−ニドローＮ−二トロソグアニジンを変異誘起
剤として通常に行われる変異処理を行い、カゼイン１ｗ
ｔ％ を含むニュートリエンドアガー（肉エキス ０
、５ ｗｔ”ｏｓペプトン １ ｗｔ覧ＮａＣｔＯ、５
ｗｔ％、寒天 １ 、５ ｗｔ９’ｏ、 ｐＨ７、０）
上で大きな７１０−を形成する変異株ＨＰ１９６１１を
誘導して、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の供与体とし
た。
バチルス・リケニホルミス ＨＰｌ ９６１１は微工研
菌寄第９１７７号として工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。
菌寄第９１７７号として工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。
（３）染色体ＤＮＡの調製
バチルス０リケニホルミス ＨＰ１９６１１の染色体Ｄ
ＮＡは、実施例１（２）と全く同じ方法で調製し、９．
７■の染色体ＤＮＡを得た。
ＮＡは、実施例１（２）と全く同じ方法で調製し、９．
７■の染色体ＤＮＡを得た。
（４） アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の存在する染
色体ＤＮＡ断片の長さの算出 前記（３）で得られた染色体ＤＮＡ ６０μｇ と１
２０ユニツトのＥｃｏＲｒ及びＥｃｏＲｒ 反応緩衝液
［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐＨ７゜５．７
ｍＭ ＦｉｉＣ２２，５０ｍＭ ＮａＣ！、 ７ｍＭ
２−メルカプトエタノール、０．０１ｗｔ％牛血清
アルブミン、濃度は最終濃度〕を含む反応液６００μｔ
を３７℃で３時間保持してＤＮＡを切断したのち、２．
５倍量のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠心
分離により沈殿を回収して％１８０μｔのＴＥ緩衝液に
溶解して染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＴ断片溶液を得た。こ
の溶液１５μｔを、実施例１（３）と全く同じ方法で電
気泳動およびニトロセルロースフィルターへのＤＮＡの
転写、固定を行った。
色体ＤＮＡ断片の長さの算出 前記（３）で得られた染色体ＤＮＡ ６０μｇ と１
２０ユニツトのＥｃｏＲｒ及びＥｃｏＲｒ 反応緩衝液
［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐＨ７゜５．７
ｍＭ ＦｉｉＣ２２，５０ｍＭ ＮａＣ！、 ７ｍＭ
２−メルカプトエタノール、０．０１ｗｔ％牛血清
アルブミン、濃度は最終濃度〕を含む反応液６００μｔ
を３７℃で３時間保持してＤＮＡを切断したのち、２．
５倍量のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠心
分離により沈殿を回収して％１８０μｔのＴＥ緩衝液に
溶解して染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＴ断片溶液を得た。こ
の溶液１５μｔを、実施例１（３）と全く同じ方法で電
気泳動およびニトロセルロースフィルターへのＤＮＡの
転写、固定を行った。
このようにして作成されたフィルターを用いてハイブリ
ダイゼーションを行った。フィルターをビニール袋に収
納してプレハイブリダイゼーション溶液〔５０％ホルム
アミド、５ＸＤｅｎ−ｈａｒｄｔ液、５ＸＳＳＣ，５０
ｍＭ リン酸緩衝液ｐ）（６，５，１ｗｔ％グリシン
、５００μ９７ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡ〕２０ｍ／を加
えて密封して、４２°Ｃで一晩保持してプレノ・イブリ
ダイゼーションを行った。
ダイゼーションを行った。フィルターをビニール袋に収
納してプレハイブリダイゼーション溶液〔５０％ホルム
アミド、５ＸＤｅｎ−ｈａｒｄｔ液、５ＸＳＳＣ，５０
ｍＭ リン酸緩衝液ｐ）（６，５，１ｗｔ％グリシン
、５００μ９７ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡ〕２０ｍ／を加
えて密封して、４２°Ｃで一晩保持してプレノ・イブリ
ダイゼーションを行った。
次いで、ビニール袋からプレ／・イブリダイゼーション
溶液を除き、ハイブリダイゼーション溶液〔５０％ホル
ムアミド、Ｉ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、５ＸＳＳＣ，
２０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ６，５，１００ａｆｉｆｉ
！変性サケ精液ＤＮＡ、１０％テキストラン硫酸ナトリ
ウム〕４ｄと、前記（１）で得られた Ｐで標識された
プローブＤＮＡ ２ＩＩｃｉ混合したのち、２５℃で
１６時間保持してハイブリダイゼーションを行った。
溶液を除き、ハイブリダイゼーション溶液〔５０％ホル
ムアミド、Ｉ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、５ＸＳＳＣ，
２０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ６，５，１００ａｆｉｆｉ
！変性サケ精液ＤＮＡ、１０％テキストラン硫酸ナトリ
ウム〕４ｄと、前記（１）で得られた Ｐで標識された
プローブＤＮＡ ２ＩＩｃｉ混合したのち、２５℃で
１６時間保持してハイブリダイゼーションを行った。
その後、フィルターをとり出し約２００ ｒｘｌの２Ｘ
８ＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液中で室温で１０分間ずつ３
回洗浄後、乾燥して実施例１Ｃ３）と同様にオートラジ
オグラフィーを行った。オートラジオグラムのシグナル
の位置からペチルスＯリケニホルミスのアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子の存在する染色体ＤＮＡ断片の長さは３
．４ｋｂ と算出された。
８ＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液中で室温で１０分間ずつ３
回洗浄後、乾燥して実施例１Ｃ３）と同様にオートラジ
オグラフィーを行った。オートラジオグラムのシグナル
の位置からペチルスＯリケニホルミスのアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子の存在する染色体ＤＮＡ断片の長さは３
．４ｋｂ と算出された。
（５）染色体ＤＮＡ断片の分画
前記（４）で得られた染色体ＤＮＡのＦｉｃｏＲＩ断片
溶液１５０μｚ （ＤＮＡ５０μＩＩ） を用いて
実施例１（４）と同様の処理を行って、３〜４ ｋｂの
染色体ＤＮＡ断片約５μｇ（２５μｔ）を得た。
溶液１５０μｚ （ＤＮＡ５０μＩＩ） を用いて
実施例１（４）と同様の処理を行って、３〜４ ｋｂの
染色体ＤＮＡ断片約５μｇ（２５μｔ）を得た。
（６）ベクタープラスミドの調製
実施例１（５）で得られたプラスミド ＰＢＦＬ５２２
２０μｌを、４０ユニツトのＥｃｏＲｒ と３７℃で
３時間反応させて切断した。以後、実施例１（５）と同
様の処理を行って、ＥｃｏＲｒで切断され、５′末端が
脱リン酸化された線状のベクタープラスミド ｐＢ几３
２２を得た。
２０μｌを、４０ユニツトのＥｃｏＲｒ と３７℃で
３時間反応させて切断した。以後、実施例１（５）と同
様の処理を行って、ＥｃｏＲｒで切断され、５′末端が
脱リン酸化された線状のベクタープラスミド ｐＢ几３
２２を得た。
（７）組換えプラスミドの作製
前記（５）で得られた３〜４ｋｂ の染色体ＤＮＡ断片
約４μｇ（２０μｔ）と、前記（６）で得られたｇｅｏ
几工で切断され５１末端が脱リン酸化された線状のベク
タープラスミド ｐＢＲ，３２２２μ９（１０μｔ）と
を混合し、実施例１（６）と同様にＴ４ Ｄ Ｎ Ａ
リガーゼを作用させて組換えプラスミドを作製した。
約４μｇ（２０μｔ）と、前記（６）で得られたｇｅｏ
几工で切断され５１末端が脱リン酸化された線状のベク
タープラスミド ｐＢＲ，３２２２μ９（１０μｔ）と
を混合し、実施例１（６）と同様にＴ４ Ｄ Ｎ Ａ
リガーゼを作用させて組換えプラスミドを作製した。
（８）組換えプラスミドによるエシェリヒア・コリの形
質転換およびアルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株の選
択 前記（７）で得られた組換えプラスミド溶液３０μｔ（
Ｄ Ｎ Ａ約４．５μｇ）を用いて、実施例１（７）と
同様にＭｎＣａ 処理されたエシェリヒア・コリ ＬＢ
３９２を形質転換して、アンピシリン耐性の形質転換体
のコロニーを５８００個得た０コロニーが形成されたフ
ィルターを実施例１（７）と同課に処理してＤＮＡの固
定を行ったのち、前記（４）と同じ条件でハイブリダイ
ゼーションを行い、オートラジオグラム上に６個のシグ
ナルを検出した。
質転換およびアルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株の選
択 前記（７）で得られた組換えプラスミド溶液３０μｔ（
Ｄ Ｎ Ａ約４．５μｇ）を用いて、実施例１（７）と
同様にＭｎＣａ 処理されたエシェリヒア・コリ ＬＢ
３９２を形質転換して、アンピシリン耐性の形質転換体
のコロニーを５８００個得た０コロニーが形成されたフ
ィルターを実施例１（７）と同課に処理してＤＮＡの固
定を行ったのち、前記（４）と同じ条件でハイブリダイ
ゼーションを行い、オートラジオグラム上に６個のシグ
ナルを検出した。
これらのシグナルに対応する６株の形質転換体をマスタ
ーフィルターから分離し、実施例１（８）と同様にして
これらの形質転換体の保有する組換えプラスミドの同定
を行うと、これらにはすべてプローブのバチルス争アミ
ロリキエファシエンスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子
とハイブリダイズする３ 、 ４ ｋｂ のＥｃｏＲＩ
断片が挿入されていた。これらのうちの１株の保有する
組換えプラスミドをｐＬＰ３ （第２図参照）と命名し
たａ゛このプラスミドを保有するエシェリヒア争コリ
ＬＢ３９２（ｐＬＰ３）は微工研菌寄第９１７８号とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
ーフィルターから分離し、実施例１（８）と同様にして
これらの形質転換体の保有する組換えプラスミドの同定
を行うと、これらにはすべてプローブのバチルス争アミ
ロリキエファシエンスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子
とハイブリダイズする３ 、 ４ ｋｂ のＥｃｏＲＩ
断片が挿入されていた。これらのうちの１株の保有する
組換えプラスミドをｐＬＰ３ （第２図参照）と命名し
たａ゛このプラスミドを保有するエシェリヒア争コリ
ＬＢ３９２（ｐＬＰ３）は微工研菌寄第９１７８号とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
組換えプラスミド ｐＬＰ３に含まれる３゜４ｋｂのＨ
ｅ ＯＲＩ断片を、バチルス属細菌で保持されるベクタ
ープラスミド ｐＵ］３１１０に連結してバチルス・ズ
ブチリスに導入してもアルカリ性プロテアーゼの発現は
見られないので、この断片にはアルカリ性プロテアーゼ
遺伝子の一部しか含まれていないと判断された。また、
組換えプラスミド ｐＬＰ３をＥｌ（ｏＲＩとＢｃ（ｌ
Ｉで切断して、前記（４）と同様にしてサザンハイブ
リダイゼーションを行うと第２図に示される斜線部分の
１．２ｋｂ の断片にプローブがハイブリダイズするの
で、この断片のＥｃｏＲＴ部位に隣接する領域にアルカ
リ性プロテアーゼ遺伝子の欠如している部分が存在する
ことがわかる。そこで、この欠如した部分を改めてクロ
ーニングするために再度組換えプラスミドを作製してコ
ロニーハイブリダイゼーションを行った。
ｅ ＯＲＩ断片を、バチルス属細菌で保持されるベクタ
ープラスミド ｐＵ］３１１０に連結してバチルス・ズ
ブチリスに導入してもアルカリ性プロテアーゼの発現は
見られないので、この断片にはアルカリ性プロテアーゼ
遺伝子の一部しか含まれていないと判断された。また、
組換えプラスミド ｐＬＰ３をＥｌ（ｏＲＩとＢｃ（ｌ
Ｉで切断して、前記（４）と同様にしてサザンハイブ
リダイゼーションを行うと第２図に示される斜線部分の
１．２ｋｂ の断片にプローブがハイブリダイズするの
で、この断片のＥｃｏＲＴ部位に隣接する領域にアルカ
リ性プロテアーゼ遺伝子の欠如している部分が存在する
ことがわかる。そこで、この欠如した部分を改めてクロ
ーニングするために再度組換えプラスミドを作製してコ
ロニーハイブリダイゼーションを行った。
バチルス・リケニホルミス ＨＰ１９６１１の染色体Ｄ
ＮＡ ２０μ夕と、４０ユニツトのＢｇｌｌおよびＢｇ
ｌ１反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐ
Ｈ７、５，７ｍＭ Ｍｇ（、ｔ２．１００ ｍＭ Ｎａ
Ｃ１，７ｍＭ ２ １ルカプトエタノール、濃度は最
終濃度〕を含む反応液２００μｔとを３７℃で３時間保
持してＤＮＡを切断し、６５℃で１０分間加熱処理した
のち、５００μｔのエタノールを加えてＤＮＡを沈殿さ
せた。
ＮＡ ２０μ夕と、４０ユニツトのＢｇｌｌおよびＢｇ
ｌ１反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐ
Ｈ７、５，７ｍＭ Ｍｇ（、ｔ２．１００ ｍＭ Ｎａ
Ｃ１，７ｍＭ ２ １ルカプトエタノール、濃度は最
終濃度〕を含む反応液２００μｔとを３７℃で３時間保
持してＤＮＡを切断し、６５℃で１０分間加熱処理した
のち、５００μｔのエタノールを加えてＤＮＡを沈殿さ
せた。
一方、ベクタープラスミドはｐＢＩ’１２２２０μｇと
４０ユニツトのＢａｍ ＨＩおよびＢａｍＨＩ反応緩衝
液［１０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液ｐＨ８，０，７ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ 、１００ｍＭ ＮａＣＡ。
４０ユニツトのＢａｍ ＨＩおよびＢａｍＨＩ反応緩衝
液［１０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液ｐＨ８，０，７ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ 、１００ｍＭ ＮａＣＡ。
２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０ 、０１ ｗ
ｔ％牛血清アルブミン、濃度は最終濃度〕を含む反応液
２００μｔを３７℃で３時間保持してＤＮＡを切断後、
実施例１（５）と同様の処理を行って、Ｂａｍ ＨＴで
切断され５１ 末端が脱リン酸化された線状のベクター
プラスミド ＰＢＲ３２２を調製した。
ｔ％牛血清アルブミン、濃度は最終濃度〕を含む反応液
２００μｔを３７℃で３時間保持してＤＮＡを切断後、
実施例１（５）と同様の処理を行って、Ｂａｍ ＨＴで
切断され５１ 末端が脱リン酸化された線状のベクター
プラスミド ＰＢＲ３２２を調製した。
このようにして調製された染色体ＤＮＡ断片４μｓと、
ＢａｍＨＴ で切断され５１末端が脱リン酸化されたベ
クタープラスミド ｐＢ几３２２２μｇとを混合し、実
施例１（６）と同様にＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて
組換えプラスミドを作製した。
ＢａｍＨＴ で切断され５１末端が脱リン酸化されたベ
クタープラスミド ｐＢ几３２２２μｇとを混合し、実
施例１（６）と同様にＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて
組換えプラスミドを作製した。
この組換えプラスミド溶液２０μｔ（ＤＮＡ３μｇ）を
用いて実施例１（７）と同様にＭｎＣａ処理されたエシ
ェリヒア・コリＬＥ３９２を形質転換してアンピシリン
耐性の形質転換体のコロニーを７９００個得た０ コロニーが形成されたフィルターを実施例１（７）と同
様に処理したのち、前記（４）と同様の方法でハイブリ
ダイゼーションを−行った。ただし、プローブには、組
換えプラスミドｐＬＰ３をＦｉｃｏ几ＩとＢｇＩ Ｉ
で切断して前記（１）と同様の方法で分画して得られ
た１、２ｋｂ の断片なニックトランスレーションによ
って Ｐで標識されたＤＮＡを用い、ハイブリダイゼー
ションは４２℃で行った。また、フィルターの洗浄は２
×５ＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液中での洗−を行ったあと
、さらに０ 、１ｘＳＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液中で４
２℃で１５分間ずつ２回洗浄を行った。
用いて実施例１（７）と同様にＭｎＣａ処理されたエシ
ェリヒア・コリＬＥ３９２を形質転換してアンピシリン
耐性の形質転換体のコロニーを７９００個得た０ コロニーが形成されたフィルターを実施例１（７）と同
様に処理したのち、前記（４）と同様の方法でハイブリ
ダイゼーションを−行った。ただし、プローブには、組
換えプラスミドｐＬＰ３をＦｉｃｏ几ＩとＢｇＩ Ｉ
で切断して前記（１）と同様の方法で分画して得られ
た１、２ｋｂ の断片なニックトランスレーションによ
って Ｐで標識されたＤＮＡを用い、ハイブリダイゼー
ションは４２℃で行った。また、フィルターの洗浄は２
×５ＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液中での洗−を行ったあと
、さらに０ 、１ｘＳＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液中で４
２℃で１５分間ずつ２回洗浄を行った。
こりようにして、オートラジオグラム上に１個のシグナ
ルを検出した。このシグナルに対応する形質転換株をマ
スターフィルターから分離し、保有する組換えプラスミ
ドを実施例１（８）とと同様の方法で同定すると第３図
の制限酵素地図で示される９ 、 ６ ｋｂ のプラス
ミドであることが示され、この組換えプラスミドをｐＬ
Ｐ５５と命名した。この組換えプラスミドｐＬＰ３５を
保有するエシェリヒア・コリＬＢ３９２（ｐＬＰ３５
）は微工研菌寄第９１７９号として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。
ルを検出した。このシグナルに対応する形質転換株をマ
スターフィルターから分離し、保有する組換えプラスミ
ドを実施例１（８）とと同様の方法で同定すると第３図
の制限酵素地図で示される９ 、 ６ ｋｂ のプラス
ミドであることが示され、この組換えプラスミドをｐＬ
Ｐ５５と命名した。この組換えプラスミドｐＬＰ３５を
保有するエシェリヒア・コリＬＢ３９２（ｐＬＰ３５
）は微工研菌寄第９１７９号として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。
前記の Ｐで標識された１ 、 ２ ｋｂ のＥｃｏ
几１−Ｂｇ１１断片をプローブとして組換えプラスミド
ｐｒ、ｐｓｓｒ一対するサザン・ノ１イブリダイゼーシ
ョンを行うと第３図の斜線部分を含む断片にハイブリダ
イズするので、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のうちの
欠如していたＥｃｏＲＩ部位に隣接する領域が含まれて
いることがわかる。
几１−Ｂｇ１１断片をプローブとして組換えプラスミド
ｐｒ、ｐｓｓｒ一対するサザン・ノ１イブリダイゼーシ
ョンを行うと第３図の斜線部分を含む断片にハイブリダ
イズするので、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のうちの
欠如していたＥｃｏＲＩ部位に隣接する領域が含まれて
いることがわかる。
実施例 ３
バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子の発現の確認 実施例２で得られた組換えプラスミドｐＬＰ３５にアル
カリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域が含まれていること
を確かめるために、バチルス属で保持されるベクタープ
ラスミドに連結してバチルス・ズブチリスＰＷ１０を形
質転換して、形質転換体によるプロテアーゼの生産能を
調べた。
伝子の発現の確認 実施例２で得られた組換えプラスミドｐＬＰ３５にアル
カリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域が含まれていること
を確かめるために、バチルス属で保持されるベクタープ
ラスミドに連結してバチルス・ズブチリスＰＷ１０を形
質転換して、形質転換体によるプロテアーゼの生産能を
調べた。
実施例２で得られた組換えプラスミドｐＬＰ３５には、
第３図における斜線部分の断片（１゜２ ｋｂ）とそれ
に反時計回りの方向に隣接する２゜０ ｋｂ のＥｃ
ｏ ＲＩ断片（第３図におけるしもふり部分）にまたが
ってアルカリ性プロテアーゼ遺伝子が存在すると推定さ
れる。
第３図における斜線部分の断片（１゜２ ｋｂ）とそれ
に反時計回りの方向に隣接する２゜０ ｋｂ のＥｃ
ｏ ＲＩ断片（第３図におけるしもふり部分）にまたが
ってアルカリ性プロテアーゼ遺伝子が存在すると推定さ
れる。
しかし、これらの断片のうち、斜線部分の断片の一方の
末端は、染色体ＤＮＡの８ｇｌｌ切断末端とベクタープ
ラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ切断末端が連結され
たものであるため制限酵素による特異的な切断が困難で
ある。そのために、この断片と同じ断片をもつ組換えプ
ラスミドｐＬＰ３とｐＬＰ３５からアルカリ性プロテア
ーゼ発現用の組換えプラスミドを作製した。
末端は、染色体ＤＮＡの８ｇｌｌ切断末端とベクタープ
ラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ切断末端が連結され
たものであるため制限酵素による特異的な切断が困難で
ある。そのために、この断片と同じ断片をもつ組換えプ
ラスミドｐＬＰ３とｐＬＰ３５からアルカリ性プロテア
ーゼ発現用の組換えプラスミドを作製した。
バチルス属で保持されるベクタープラスミドには、エシ
ェリヒア・コリとバチルス属との両方で保持されるシャ
トルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（全酒造の商品）を使
用した。ｐＨＹ５００ＰＬＫは２種の薬剤耐性遺伝子を
もち、エシェリヒア・コリではアンピシリン耐性とテト
ラサイクリン耐性の画形質が発現し、ノソチルス属細菌
ではテトラサイクリン耐性の形質を発現するものである
。アルカリ性プロテアーゼ発現用組換えプラスミド作製
手順の概略を第４図に示す。
ェリヒア・コリとバチルス属との両方で保持されるシャ
トルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（全酒造の商品）を使
用した。ｐＨＹ５００ＰＬＫは２種の薬剤耐性遺伝子を
もち、エシェリヒア・コリではアンピシリン耐性とテト
ラサイクリン耐性の画形質が発現し、ノソチルス属細菌
ではテトラサイクリン耐性の形質を発現するものである
。アルカリ性プロテアーゼ発現用組換えプラスミド作製
手順の概略を第４図に示す。
組換えプラスミドｐＬＰ５ ５０μＩ、６Ｇユニツトの
［ｃｏＲＪ、６０ユニツトのＢｇｌｌおよびＥｃ ｏＲ
Ｉ反応緩衝液を含む反応液 ３００μｔを３７℃で３時
間保持してプラスミドを切断したのち、７５０μｔのエ
タノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠心分離により
沈殿を回収し、１５０μｔの７ｇ緩衝液に溶解して実施
例２（１）と同様にアガロースゲル電気泳動により断片
を分画して１．２ｋｂの断片約４μｇを得た。
［ｃｏＲＪ、６０ユニツトのＢｇｌｌおよびＥｃ ｏＲ
Ｉ反応緩衝液を含む反応液 ３００μｔを３７℃で３時
間保持してプラスミドを切断したのち、７５０μｔのエ
タノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠心分離により
沈殿を回収し、１５０μｔの７ｇ緩衝液に溶解して実施
例２（１）と同様にアガロースゲル電気泳動により断片
を分画して１．２ｋｂの断片約４μｇを得た。
一方、シャトルベクターｐＨＹ５００ ＰＬＫ５μ、ｊ
７．ＩＱ！ニットのｇｃｏＲ■、１０ユニツトのＢｇｌ
ｌおよびＢｃｏＲＩ反応緩衝液を含む反応液５０μｔを
３７℃で３時間保持してプラスミドを切断し、６５℃で
１０分間加熱処理したのち。
７．ＩＱ！ニットのｇｃｏＲ■、１０ユニツトのＢｇｌ
ｌおよびＢｃｏＲＩ反応緩衝液を含む反応液５０μｔを
３７℃で３時間保持してプラスミドを切断し、６５℃で
１０分間加熱処理したのち。
１２５μｔのエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。
遠心分離により沈殿を回収し、乾燥後２５μｔの水に溶
解してベクターＤＮＡ溶液を得た。
解してベクターＤＮＡ溶液を得た。
前記の１．２ｋｂの断片 ０．２５μ夕 とベクターＤ
ＮＡ １μｇとを混ぜ、０．４ユニツトのＴ４ＤＮＡ
リガーゼおよびリガーゼ緩衝液を加えた反応液２０μｔ
を５℃で１６時間保ち両ＤＮＡを連結した。
ＮＡ １μｇとを混ぜ、０．４ユニツトのＴ４ＤＮＡ
リガーゼおよびリガーゼ緩衝液を加えた反応液２０μｔ
を５℃で１６時間保ち両ＤＮＡを連結した。
このようにして得られたＤＮＡ溶液１０μｔ（ＤＮＡ
０．６２５μｇ）を用いて実施例１（７）と同様にＭ
ｎ−Ｃａ処理されたエシェリヒア嗜コリＬＢ３９２を形
質転換した。
０．６２５μｇ）を用いて実施例１（７）と同様にＭ
ｎ−Ｃａ処理されたエシェリヒア嗜コリＬＢ３９２を形
質転換した。
得られたアンピシリン耐性の形質転換体のうちから１０
株を選び保有するプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩとＢ
ｇｌｌで切断して生ずる断片をアガロースゲル電気泳動
で調べるとすべて１．２ｋｂの断片とベクタープラスミ
ドの４ 、９ ｋｂ断片が検出された。このうちの１株
の保有するプラスミドをｐＨＬＰ３０１ （第４図参照
）と命名した。
株を選び保有するプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩとＢ
ｇｌｌで切断して生ずる断片をアガロースゲル電気泳動
で調べるとすべて１．２ｋｂの断片とベクタープラスミ
ドの４ 、９ ｋｂ断片が検出された。このうちの１株
の保有するプラスミドをｐＨＬＰ３０１ （第４図参照
）と命名した。
次いで、組換えプラスミドｐＨＬＰ３０１１０μｇを２
０ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で３時間反応させて切
断し、６５℃で１０分間加熱処理したのち、２．５倍容
のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠心分離に
より沈殿を回収し、乾燥後５０μｔの水に溶解し、ｇｃ
ｏＲＩで切断されたｐＨＬＰ３０１を得た。
０ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で３時間反応させて切
断し、６５℃で１０分間加熱処理したのち、２．５倍容
のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠心分離に
より沈殿を回収し、乾燥後５０μｔの水に溶解し、ｇｃ
ｏＲＩで切断されたｐＨＬＰ３０１を得た。
一方、組換えプラスミドｐＬＰ５５ １０μｇ、２０ユ
ニツトのＷｃｏＲ＋Ｉ、 ２０ ユニットのＰｖｕｌお
よびＥｃｏ几工反応緩衝液を含む反応液１００μｔを３
７℃で３時間保持しＤＮＡを切断した。ｐＬＰ５５をＢ
ｅ ｏＲＩで切断すると５ 、 Ｏｋｂ１２．６ｋｂ、
２．０ｋｂの３本の断片を生じたが、今必要とされる
断片は２ 、０ ｋｂの断片（第４図における斜線部分
）である。ｐＬＰ３５にＢｃｏＲＴとＰｖｕｌを同時に
作用させると、３本のＲｃｏＲＴ断片のうち不要な２本
の断片はＰｖｕｌによってさらに切断され、一方の末端
が平滑末端となった断片を生じ、ＢｃｏＲＴで切断され
たＤＨＬＰ３０１とは連結されなくなるため、必要な２
、０ ｋｂの断片の連結の効率が高まる。このように
して切断されたＤＮＡ溶液を６５℃で１０分間加熱処理
したのち２５０μｔのエタノールを加えてＤＮＡを沈殿
させた。遠心分離により沈殿を回収し、乾燥後５０μｔ
の氷に溶解した。
ニツトのＷｃｏＲ＋Ｉ、 ２０ ユニットのＰｖｕｌお
よびＥｃｏ几工反応緩衝液を含む反応液１００μｔを３
７℃で３時間保持しＤＮＡを切断した。ｐＬＰ５５をＢ
ｅ ｏＲＩで切断すると５ 、 Ｏｋｂ１２．６ｋｂ、
２．０ｋｂの３本の断片を生じたが、今必要とされる
断片は２ 、０ ｋｂの断片（第４図における斜線部分
）である。ｐＬＰ３５にＢｃｏＲＴとＰｖｕｌを同時に
作用させると、３本のＲｃｏＲＴ断片のうち不要な２本
の断片はＰｖｕｌによってさらに切断され、一方の末端
が平滑末端となった断片を生じ、ＢｃｏＲＴで切断され
たＤＨＬＰ３０１とは連結されなくなるため、必要な２
、０ ｋｂの断片の連結の効率が高まる。このように
して切断されたＤＮＡ溶液を６５℃で１０分間加熱処理
したのち２５０μｔのエタノールを加えてＤＮＡを沈殿
させた。遠心分離により沈殿を回収し、乾燥後５０μｔ
の氷に溶解した。
このようにして得られた両ＤＮＡ溶液 １０μｔ（ＤＮ
Ａ ２μｇ）ずつを混合し、０．８ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼおよびリガーゼ緩衝液を加えた反応液４
０μｔを５℃で１６時間保ちＤＮＡを連結した。
Ａ ２μｇ）ずつを混合し、０．８ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼおよびリガーゼ緩衝液を加えた反応液４
０μｔを５℃で１６時間保ちＤＮＡを連結した。
このようにして得たＤＮＡを用いてプロテアーゼ低生産
株バチルス・ズブチリスＰＷ１０を形質転換した。形質
転換は次のようにプロトプラスト法にて行った。
株バチルス・ズブチリスＰＷ１０を形質転換した。形質
転換は次のようにプロトプラスト法にて行った。
バチルスψズブチリスＰＷ１０をニュートリエンドブロ
ス ５１１！／に接種して一晩培養した前培養液 Ｑ、
３ｍ／を５０ゴのニュートリエンドブロスに接種して３
７℃で１．５時間培養後、遠心分離によって菌体を集め
２．５ｒｔｒｌのＳＭＭＰ ［２ＸＳＭＭと４倍濃度の
Ｐｅｎａｓｓａｙ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）を１
：１で混合したもの、２×ＳＭＭは１Ｍシュクロース、
０ 、０４Ｍマレイン酸、０．０４Ｍ ＭｇＣｌ２、
ｐＨ６，５）に懸濁し、５■のリゾチームを加えて３７
℃で２時間保持してプロトプラストを形成させた。遠心
分離によりプロトプラストを集め、４ゴのＳＭＭＰで１
回洗浄したのち１．５−のＳＭＭＰに懸濁してプロトプ
ラスト懸濁液を得た。
ス ５１１！／に接種して一晩培養した前培養液 Ｑ、
３ｍ／を５０ゴのニュートリエンドブロスに接種して３
７℃で１．５時間培養後、遠心分離によって菌体を集め
２．５ｒｔｒｌのＳＭＭＰ ［２ＸＳＭＭと４倍濃度の
Ｐｅｎａｓｓａｙ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）を１
：１で混合したもの、２×ＳＭＭは１Ｍシュクロース、
０ 、０４Ｍマレイン酸、０．０４Ｍ ＭｇＣｌ２、
ｐＨ６，５）に懸濁し、５■のリゾチームを加えて３７
℃で２時間保持してプロトプラストを形成させた。遠心
分離によりプロトプラストを集め、４ゴのＳＭＭＰで１
回洗浄したのち１．５−のＳＭＭＰに懸濁してプロトプ
ラスト懸濁液を得た。
このプロトプラスト懸濁液 ０．５ｍｌに前記で得られ
た連結ＤＮＡ溶液 ２０μｔ（ＤＮＡ２μｇ）と２ＸＳ
ＭＭに溶解した４０％ポリエチレングリフール４０００
１．５１１７を加えて、しずかに混合しながら２分間
保ちプロトプラストにＤＮＡをとり込ませた。次にこれ
に５１１４の８ＭＭＰを加えて混合したあと遠心分離に
よりプロトプラストを集め、１ｙｒｌのＳＭＭＰに懸濁
して３０℃で１．５時間保持した。
た連結ＤＮＡ溶液 ２０μｔ（ＤＮＡ２μｇ）と２ＸＳ
ＭＭに溶解した４０％ポリエチレングリフール４０００
１．５１１７を加えて、しずかに混合しながら２分間
保ちプロトプラストにＤＮＡをとり込ませた。次にこれ
に５１１４の８ＭＭＰを加えて混合したあと遠心分離に
よりプロトプラストを集め、１ｙｒｌのＳＭＭＰに懸濁
して３０℃で１．５時間保持した。
このプロトプラスト液を２０μｊｉ／１ｆｔｌのテトラ
サイクリンを含むＤＭ５再生培地（０，５Ｍコハク酸ナ
トリウム ｐＨ７，５、Ｑ 、５ｗｔ％グルコース、０
．５ｗｔ％ カザミノ酸、０．５ｗｔ％酵母エキス、０
．０１ｗ１％牛血清アルブミン、０．３５ｗｔ％ リン
酸二カリウム、０゜１５ｗｔ％ リン酸−カリウム、２
０ｍＭ ＭｇＣ４２，０，８ｗｔ％寒天〕上に１００μ
ｔずつ塗布し、３７°Ｃで２日間保持してフロニーを形
成させた。
サイクリンを含むＤＭ５再生培地（０，５Ｍコハク酸ナ
トリウム ｐＨ７，５、Ｑ 、５ｗｔ％グルコース、０
．５ｗｔ％ カザミノ酸、０．５ｗｔ％酵母エキス、０
．０１ｗ１％牛血清アルブミン、０．３５ｗｔ％ リン
酸二カリウム、０゜１５ｗｔ％ リン酸−カリウム、２
０ｍＭ ＭｇＣ４２，０，８ｗｔ％寒天〕上に１００μ
ｔずつ塗布し、３７°Ｃで２日間保持してフロニーを形
成させた。
このようにして得られたテトラサイクリン耐性の形質転
換体約５０００株を２０μ９／Ｉｌｌ のテトラサイ
クリンを含むカゼインプレート〔１ｗｔ％ カゼインを
含むニュートリエントブロス寒天平板〕にレプリカして
３７℃で１６時間培養してハローを形成する株を４株得
た。
換体約５０００株を２０μ９／Ｉｌｌ のテトラサイ
クリンを含むカゼインプレート〔１ｗｔ％ カゼインを
含むニュートリエントブロス寒天平板〕にレプリカして
３７℃で１６時間培養してハローを形成する株を４株得
た。
これら４株からそれぞれ保有するプラスミドを抽出する
と、すべて８ 、１ ｋｂ の長さをもつプラスミド
を保有していた。このうちの１株の保有するプラスミド
をｐＨＬＰ３５１（第４図参照）と命名し、ＥｃｏＲＩ
、 Ｂｇｌ １、Ｓｍａ Ｔ 。
と、すべて８ 、１ ｋｂ の長さをもつプラスミド
を保有していた。このうちの１株の保有するプラスミド
をｐＨＬＰ３５１（第４図参照）と命名し、ＥｃｏＲＩ
、 Ｂｇｌ １、Ｓｍａ Ｔ 。
ｇｃｏｌ’ＬＩ＋Ｂｇｌ Ｉ 、 ＥｃｏＲＩ ＋ ８
ｍａＩおよびＢｇｌ璽十ＳｍａＩで切断して生ずる断片
の長さを調べて第４図に示される制限酵素地図を得、計
画した発現用プラスミドが作製されていることが確昭さ
れた。
ｍａＩおよびＢｇｌ璽十ＳｍａＩで切断して生ずる断片
の長さを調べて第４図に示される制限酵素地図を得、計
画した発現用プラスミドが作製されていることが確昭さ
れた。
前記のように、組換えプラスミドｐＨＬＰ３５１を保有
するバチルス拳ズブチリスＰＷ１０がカゼインプレート
上でハローを形成するようになることから、ｐＨＬＰ３
５１に挿入されている遺伝子断片内にアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子の全領域が含まれていると判断される。
するバチルス拳ズブチリスＰＷ１０がカゼインプレート
上でハローを形成するようになることから、ｐＨＬＰ３
５１に挿入されている遺伝子断片内にアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子の全領域が含まれていると判断される。
実施例 ４
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有組換えプラスミドｐ
ＨＴ、 Ｐ ５５１の縮小実施例５で得られた組換え
プラスミドｐＨＬＰ３５１に挿入されている染色体ＤＮ
Ａ断片は３ 、２ ｋｂにも及ぶ。
ＨＴ、 Ｐ ５５１の縮小実施例５で得られた組換え
プラスミドｐＨＬＰ３５１に挿入されている染色体ＤＮ
Ａ断片は３ 、２ ｋｂにも及ぶ。
一方、バチルス−リケニホルミスのアルカリ性プロテア
ーゼは分子量約２７．５００ダルトンであり、このタン
パクの生産を指令する遺伝子は分泌に必要な領域および
プロモーター領域を含めても２ｋｂ あれば十分である
と考えられ÷ので、不要と思われる断片を欠失させてプ
ラスミドの縮小を行い、２種の縮小プラスミドを作製し
た。プラスミド縮小の手順の概略を第５図および第６図
に示す。
ーゼは分子量約２７．５００ダルトンであり、このタン
パクの生産を指令する遺伝子は分泌に必要な領域および
プロモーター領域を含めても２ｋｂ あれば十分である
と考えられ÷ので、不要と思われる断片を欠失させてプ
ラスミドの縮小を行い、２種の縮小プラスミドを作製し
た。プラスミド縮小の手順の概略を第５図および第６図
に示す。
（１）組換えプラスミドｐＨＬＰ５５２の作製とバチル
ス・ズブチリスへの導入 組換えプラスミドｐＨＬｐ３ｓ１ ５μｇ、２０ユニツ
トのＳｍａ ＩおよびＳｍａＩ反応緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐＨ８，０，７ｍＭＭ９ＣＬ２
．２０ｍＭ ＫＣｌ、 ７ｍＭ ２−メルカプトエタ／
−ル、０．０１ｗｔ％牛血清アルブミン、濃度は最終濃
度〕を含む反応液 ５０μｔを３７℃で３時間保持した
のち、２０ユニツトのＢｇｌ と５μｔの１０倍濃度の
Ｂｇｌ１反応緩衝液を加えてさらに！＋７°Ｃで３時間
反応させてプラスミドを切断し、６５℃で１０分間加熱
処理したノチ、１２５μｔのエタノールを加えてＤＮＡ
を沈殿させた。
ス・ズブチリスへの導入 組換えプラスミドｐＨＬｐ３ｓ１ ５μｇ、２０ユニツ
トのＳｍａ ＩおよびＳｍａＩ反応緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 ｐＨ８，０，７ｍＭＭ９ＣＬ２
．２０ｍＭ ＫＣｌ、 ７ｍＭ ２−メルカプトエタ／
−ル、０．０１ｗｔ％牛血清アルブミン、濃度は最終濃
度〕を含む反応液 ５０μｔを３７℃で３時間保持した
のち、２０ユニツトのＢｇｌ と５μｔの１０倍濃度の
Ｂｇｌ１反応緩衝液を加えてさらに！＋７°Ｃで３時間
反応させてプラスミドを切断し、６５℃で１０分間加熱
処理したノチ、１２５μｔのエタノールを加えてＤＮＡ
を沈殿させた。
一方、ベクタープラスミドｐＨＹ５００ ＰＬＫ ５μ
ｇを前記と同様に処理してＤＮＡを切断し沈殿させた。
ｇを前記と同様に処理してＤＮＡを切断し沈殿させた。
両ＤＮＡの沈殿を遠心分離により回収してそれぞれ２５
μｔの水に溶解し、各１０μｔずつを混合し、０．８ユ
ニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼとリガーゼ緩衝液を加えた
反応液 ４０μｔを５°Ｃで１６時間保ちＤＮＡを連結
した。
μｔの水に溶解し、各１０μｔずつを混合し、０．８ユ
ニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼとリガーゼ緩衝液を加えた
反応液 ４０μｔを５°Ｃで１６時間保ちＤＮＡを連結
した。
この連結ＤＮＡ溶液 ５μｔ（ＤＮＡ ０．５μｇル
用いて、実施例１（７）と同様νこＭ ｎ −Ｃａ処理
したエシェリヒア・コリＬＥ３９２を形質転換し、３７
３株のアンピシリン耐性の形質転換体を得た。
用いて、実施例１（７）と同様νこＭ ｎ −Ｃａ処理
したエシェリヒア・コリＬＥ３９２を形質転換し、３７
３株のアンピシリン耐性の形質転換体を得た。
このうち４８株からプラスミドを抽出し、÷Ｓｍａ Ｔ
と８ｇ１厘で切断して４ 、９ ｋｂ と２．Ｏｋ
ｂ の断片が生ずるプラスミドを保有する菌株を７株得
た。
と８ｇ１厘で切断して４ 、９ ｋｂ と２．Ｏｋ
ｂ の断片が生ずるプラスミドを保有する菌株を７株得
た。
これらのうちの１株の保有するプラスミドをｐＨＬＰ３
５２（第５図参照）と命名した。このプラスミドに挿入
されている染色体ＤＮＡ断片はｐＨＬＰ３５１に挿入さ
れている染色体ＤＮＡ断片からＥｃｏＲＩと８ｍａＩで
切断されて生ずる１ 、 ２ ｋｂ の断片（第５図に
おける白抜き二本線部分）を欠失させたものである。
５２（第５図参照）と命名した。このプラスミドに挿入
されている染色体ＤＮＡ断片はｐＨＬＰ３５１に挿入さ
れている染色体ＤＮＡ断片からＥｃｏＲＩと８ｍａＩで
切断されて生ずる１ 、 ２ ｋｂ の断片（第５図に
おける白抜き二本線部分）を欠失させたものである。
この組換えプラスミドを保有するエシェリヒア・コリＬ
Ｅ１９２（ｐＨＬＰ３５２）は微工研菌寄第９１８０号
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
Ｅ１９２（ｐＨＬＰ３５２）は微工研菌寄第９１８０号
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
次いで、前記の組換えプラスミドｐＨＬＰ３５２ ０．
２μｇを用いて、実施例６と同様にしてプロトプラスト
法によりバチルス・ズブチリスｐｗｉｏを形質転換し、
２５株のテトラサイクリン耐性形質転換体を得た。
２μｇを用いて、実施例６と同様にしてプロトプラスト
法によりバチルス・ズブチリスｐｗｉｏを形質転換し、
２５株のテトラサイクリン耐性形質転換体を得た。
この２３株の形質転換体をテトラサイタリン含有カゼイ
ンプレートに接種して５７℃で１６時間培養するとすべ
ての菌株がハローを形成した、 またこのうち５株の保有するプラスミドを調べるといず
れもｐＨＬＰ３５２を保有していることが確められた。
ンプレートに接種して５７℃で１６時間培養するとすべ
ての菌株がハローを形成した、 またこのうち５株の保有するプラスミドを調べるといず
れもｐＨＬＰ３５２を保有していることが確められた。
ｐＨＬＰ３５２を保有するバチルス−ズブチリスＰＷ１
０ （ｐＨＬＰ３５２ ）は微工研菌寄第９１８１号と
して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
。
０ （ｐＨＬＰ３５２ ）は微工研菌寄第９１８１号と
して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
。
（２）組換えプラスミドｐＵＬＰ５５４０作製ベクター
プラスミドｐＵＢ１１０ ５μｇ１２０ユニットのＢ
ａｍＨＴ、２０ユニツトのＰｖｕｌおよびＢ ａ ｍＨ
丁反応緩衝液を含む反応液５０μｔを３７℃で３時間保
持してＤＮＡを切断し、６５℃で１０分間加熱処理した
のち１２５μｔのエタ／−ルを加えて沈殿させた。遠心
分離により沈殿を回収して２５μｔの水に溶解した。
プラスミドｐＵＢ１１０ ５μｇ１２０ユニットのＢ
ａｍＨＴ、２０ユニツトのＰｖｕｌおよびＢ ａ ｍＨ
丁反応緩衝液を含む反応液５０μｔを３７℃で３時間保
持してＤＮＡを切断し、６５℃で１０分間加熱処理した
のち１２５μｔのエタ／−ルを加えて沈殿させた。遠心
分離により沈殿を回収して２５μｔの水に溶解した。
この溶液 １０μｔと、前記ｆｔ）でＳｍａ Ｉと８ｇ
１厘で切断したｐＨＬＰ３５１の溶液 １０μｔを混合
し、前記（１）と同様にＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガー
ゼを作用させてＤＮＡの連結反応を行った。
１厘で切断したｐＨＬＰ３５１の溶液 １０μｔを混合
し、前記（１）と同様にＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガー
ゼを作用させてＤＮＡの連結反応を行った。
得られたＤＮＡ ０．２μｓを用いて実施例３と同様
にしてプロトプラスト法によりバチルス・ズブチリスＰ
Ｗ１０の形質転換を行った。
にしてプロトプラスト法によりバチルス・ズブチリスＰ
Ｗ１０の形質転換を行った。
プロトプラストを１５０μｇ／ｒｌのカナマイシンを含
む０Ｍ５再生培地で再生させて、２２９株のカナマイシ
ン耐性（Ｋｍ）の形質転換体を得た。
む０Ｍ５再生培地で再生させて、２２９株のカナマイシ
ン耐性（Ｋｍ）の形質転換体を得た。
これら２２９株の形質転換体を１０μ、！ｌｉｔ／ｍｌ
のカナマイシンを含むカゼインプレートにレプリカして
３７℃で１６時間培養すると４株のハローを形成する株
が得られた。
のカナマイシンを含むカゼインプレートにレプリカして
３７℃で１６時間培養すると４株のハローを形成する株
が得られた。
これらの４株の保有するプラスミドを調べる断片（第６
図１おける斜線部分）は前記（１）で得た組換えプラス
ミドｐＨＬＰ３５２に挿入されている染色体ＤＮＡ断片
と同じものである。
図１おける斜線部分）は前記（１）で得た組換えプラス
ミドｐＨＬＰ３５２に挿入されている染色体ＤＮＡ断片
と同じものである。
ｐＵＬＰ３５４を保有するバチルス−ズブチリスＰＷ１
０ （ｐＵＬＰ３５４ ）は微工研菌寄第９１８２号と
して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
。
０ （ｐＵＬＰ３５４ ）は微工研菌寄第９１８２号と
して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
。
実施例 ５
縮小組換えプラスミドを保有するバチルス・ズブチリス
形質転換体によるアルカリ性プロテアーゼの生成 バチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１、バチルス争
ズブチリスＰＷ１０．ベクタープラスミド、ＨＹ’５０
０ ＰＬＫを保有するバチルス・ズブチリスＰＷ１０
（ｐＨＹ５００ ＰＬＫ）、縮小組換えプラスミドｐＨ
ＬＰ５５２を保有するバチルス・ズブチリスＰＷ１０（
ｐＨＬＰ５５２）、ベクタープラスミドｐＵＢ１１０を
保有するバチルス拳ズフチリスＰＷ１０ （ｐＵＢｌｌ
ｏ）および縮小組換えプラスミドｐＵＬＰ３５４を保有
するバチルス・ズブチリスＰＷ１σ、（ｐＵＬＰ３５４
）をそれぞれニュートリエンドブロス ２０ｍを含む１
００ｍ／容三角フラスコに接種し、３７℃で２４時間お
よび４８時間振とり培養した。ｐＨＹ３００ ＰＬＫお
よび１）ＨＬＰ３５２を保有する菌株の培地には２０μ
ｇ／Ｉｌｌのテトラサイクリンを、またｐＵＢｌ １０
およびｐＵＬＰ３５４を保有する菌株の培地には１０μ
ｇ／−のカナマイシンを加えた。
形質転換体によるアルカリ性プロテアーゼの生成 バチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１、バチルス争
ズブチリスＰＷ１０．ベクタープラスミド、ＨＹ’５０
０ ＰＬＫを保有するバチルス・ズブチリスＰＷ１０
（ｐＨＹ５００ ＰＬＫ）、縮小組換えプラスミドｐＨ
ＬＰ５５２を保有するバチルス・ズブチリスＰＷ１０（
ｐＨＬＰ５５２）、ベクタープラスミドｐＵＢ１１０を
保有するバチルス拳ズフチリスＰＷ１０ （ｐＵＢｌｌ
ｏ）および縮小組換えプラスミドｐＵＬＰ３５４を保有
するバチルス・ズブチリスＰＷ１σ、（ｐＵＬＰ３５４
）をそれぞれニュートリエンドブロス ２０ｍを含む１
００ｍ／容三角フラスコに接種し、３７℃で２４時間お
よび４８時間振とり培養した。ｐＨＹ３００ ＰＬＫお
よび１）ＨＬＰ３５２を保有する菌株の培地には２０μ
ｇ／Ｉｌｌのテトラサイクリンを、またｐＵＢｌ １０
およびｐＵＬＰ３５４を保有する菌株の培地には１０μ
ｇ／−のカナマイシンを加えた。
得られた培養液を遠心分離し、その上清のプロテアーゼ
活性を測定した。プロテアーゼ活性はカゼインを基質と
して用いるＵｅｈａｒａらの方法（Ｈ，Ｕｅｈａｒａ
ｅｔａｌ、 ： Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｉ１９゜８
２（１９７４））に従い、３７℃でｐＨ７，０およびｐ
Ｈ１０，０で測定し、１分間に１μ夕のチロシンを遊離
する酵素量を１ユニツトとして活性を表示した。第１表
に結果を示す。
活性を測定した。プロテアーゼ活性はカゼインを基質と
して用いるＵｅｈａｒａらの方法（Ｈ，Ｕｅｈａｒａ
ｅｔａｌ、 ： Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｉ１９゜８
２（１９７４））に従い、３７℃でｐＨ７，０およびｐ
Ｈ１０，０で測定し、１分間に１μ夕のチロシンを遊離
する酵素量を１ユニツトとして活性を表示した。第１表
に結果を示す。
第１表に示されるように縮小組換えプラスミドを保有す
る２種の形質転換体はいずれも宿主であるバチルス瞭ズ
ブチリスｐｗｉ ｏやベクタープラスミドを保有する菌
株に比較して顕著に高いアルカリ性プロテアーゼを生産
した。特にバチルス・ズブチリス（ｐＵＬＰ５５４）は
、ＤＮＡ供与体であるバチルス・リケニホルミスＨＰ１
９６１１を上回るアルカリ性プロテアーゼ生産性を示し
た。
る２種の形質転換体はいずれも宿主であるバチルス瞭ズ
ブチリスｐｗｉ ｏやベクタープラスミドを保有する菌
株に比較して顕著に高いアルカリ性プロテアーゼを生産
した。特にバチルス・ズブチリス（ｐＵＬＰ５５４）は
、ＤＮＡ供与体であるバチルス・リケニホルミスＨＰ１
９６１１を上回るアルカリ性プロテアーゼ生産性を示し
た。
次に、バチルス・ズブチリスＰＷ１０（ｐＨＬＰ３５２
）、バチルス・ズブチリスＰＷ１０（ｐＵＬＰ５５４
）およびバチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１の培
養上清を抗原として、市販のアルカリ性プロテアーゼで
あるズブチリシンーカールスベルグ（Ｓｉｇｍａ 社Ｍ
Ｊ ）に対スル抗血清を用いた免疫二重拡散法によるプ
ロテアーゼの同定を行ったところ、各菌株の産生ずるプ
ロテアーゼの沈降線は互いに融合し、これらの形質転換
体の産生ずるプロテアーゼはバチルス・リケニホルミス
型のものであることが確められた。
）、バチルス・ズブチリスＰＷ１０（ｐＵＬＰ５５４
）およびバチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１の培
養上清を抗原として、市販のアルカリ性プロテアーゼで
あるズブチリシンーカールスベルグ（Ｓｉｇｍａ 社Ｍ
Ｊ ）に対スル抗血清を用いた免疫二重拡散法によるプ
ロテアーゼの同定を行ったところ、各菌株の産生ずるプ
ロテアーゼの沈降線は互いに融合し、これらの形質転換
体の産生ずるプロテアーゼはバチルス・リケニホルミス
型のものであることが確められた。
なお、縮小組換えプラスミドｐＨＬＰ３５２に挿入され
ている２ 、 Ｏｋｂの染色体ＤＮＡ断片をプローブと
して、バチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１の染色
体ＤＮＡをＳｍａＩ とＢｇｌｌで切断して得られる
断片に対してサザン・ハイブリダイゼーションを行うと
、２ 、 Ｏｋｂの断片にハイブリダイズが認められ、
ｐＨＬＰ３５２の挿入断片はバチルス・リケニホルミス
ＨＰ１９６１１の染色体ＤＮＡに由来するものであるこ
とが確められた。
ている２ 、 Ｏｋｂの染色体ＤＮＡ断片をプローブと
して、バチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１の染色
体ＤＮＡをＳｍａＩ とＢｇｌｌで切断して得られる
断片に対してサザン・ハイブリダイゼーションを行うと
、２ 、 Ｏｋｂの断片にハイブリダイズが認められ、
ｐＨＬＰ３５２の挿入断片はバチルス・リケニホルミス
ＨＰ１９６１１の染色体ＤＮＡに由来するものであるこ
とが確められた。
前記の結果より、縮小組換えプラスミドｐＨＬＰ！＋５
２あるいはｐＵＬＰ３５４に挿入されている２ 、 Ｏ
ｋｂの染色体ＤＮＡ断片には、バチルス・リケニホルミ
スＨＰ１９６１１のアルカリ性プロテアーゼの全領域が
含まれていることが明らかとなった。
２あるいはｐＵＬＰ３５４に挿入されている２ 、 Ｏ
ｋｂの染色体ＤＮＡ断片には、バチルス・リケニホルミ
スＨＰ１９６１１のアルカリ性プロテアーゼの全領域が
含まれていることが明らかとなった。
実施例 ６
バチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１のアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子の塩基配列の決定 バチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１のアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子の塩基配列は、実施例２で得られた
２種の組換えプラスミドｐＬＰ５およびＩ）ＬＰ！１５
の挿入断片の塩基配ｌＪＬ′ｖＪ３９２（ｐＬＰ３）お
よびエシェリヒア・コリＬＢ３９２（ｐＬＰ３５）をそ
れぞれ実施例１（５）と同様に培養して精製プラスミド
をそれぞれｐＬＰ５ １．２１１９およびｐＬＰ３５
０゜７ダ得た。
プロテアーゼ遺伝子の塩基配列の決定 バチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１のアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子の塩基配列は、実施例２で得られた
２種の組換えプラスミドｐＬＰ５およびＩ）ＬＰ！１５
の挿入断片の塩基配ｌＪＬ′ｖＪ３９２（ｐＬＰ３）お
よびエシェリヒア・コリＬＢ３９２（ｐＬＰ３５）をそ
れぞれ実施例１（５）と同様に培養して精製プラスミド
をそれぞれｐＬＰ５ １．２１１９およびｐＬＰ３５
０゜７ダ得た。
ｐＬＰ５ ５０μｇに、６ｏユニツトのＥｃｏＲＩ、６
０ユニツトのＢｇｌｌおよびＥｃｏ几■反応緩衝液を加
えた反応液３００μｔを３７℃で３時間保持してＤＮＡ
を切断したのち、７５０μｔのエタノールを加えてＤＮ
Ａを沈殿させた。遠心分離により沈殿を回収し、１５０
μｔのＴＲ緩衝液に溶解して実施例２（１）と同様にア
ガロースゲル電気泳動で分画して１．２ｋｂ のＢｃｏ
ＲｒＴ −Ｂｇ１厘断片約４μｇを得た。
０ユニツトのＢｇｌｌおよびＥｃｏ几■反応緩衝液を加
えた反応液３００μｔを３７℃で３時間保持してＤＮＡ
を切断したのち、７５０μｔのエタノールを加えてＤＮ
Ａを沈殿させた。遠心分離により沈殿を回収し、１５０
μｔのＴＲ緩衝液に溶解して実施例２（１）と同様にア
ガロースゲル電気泳動で分画して１．２ｋｂ のＢｃｏ
ＲｒＴ −Ｂｇ１厘断片約４μｇを得た。
一方、ｐＬＰ３５ ３０Ｂ９Ｃ６０：ｘ、ニットのＳｍ
ａＩと８ｍａＩ 反応緩衝液を加えた反応液３００μ
ｔを５７℃で３時間保持したのち、６０ユニツトのＢｇ
ｌｌと３０μｔの１０倍濃度のＢｇｌ Ｉ反応緩衝液を
加えてさらに３７℃で６時間保持してＤＮＡを切断した
。以後前記ｐＬＰ３の場合と同様に分画して０ 、８
ｋｂのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片約２μｇ を得た。
ａＩと８ｍａＩ 反応緩衝液を加えた反応液３００μ
ｔを５７℃で３時間保持したのち、６０ユニツトのＢｇ
ｌｌと３０μｔの１０倍濃度のＢｇｌ Ｉ反応緩衝液を
加えてさらに３７℃で６時間保持してＤＮＡを切断した
。以後前記ｐＬＰ３の場合と同様に分画して０ 、８
ｋｂのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片約２μｇ を得た。
このようにして得られた両断片の塩基配列を、Ｍ１３ジ
デオキシ−チェインターミネーション法［Ｊ 、 Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｒ＋ｚｙｍｏ
１．＋１０１ 、２０ 、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３） ： Ｆ、 Ｓ
ａｎｇｅｒ ： ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１４゜１２０５
（１９８１））に従って決定した。
デオキシ−チェインターミネーション法［Ｊ 、 Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｒ＋ｚｙｍｏ
１．＋１０１ 、２０ 、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３） ： Ｆ、 Ｓ
ａｎｇｅｒ ： ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１４゜１２０５
（１９８１））に従って決定した。
前記２種の断片およびそれらをさらに制限酵素５ａｎ３
ＡＩ、 Ｈａｅ １．ＡｌｕＩ で切断して得られる
断片をＭ１３ファージｍｐｉ８あるいはｍｐ１９に連結
して、エシェリヒア・プリＪＭ１０９（後記のＭｊ３シ
ークエンシングキットの付属品として購入される）を形
質転換して多数の組換えファージを得た。
ＡＩ、 Ｈａｅ １．ＡｌｕＩ で切断して得られる
断片をＭ１３ファージｍｐｉ８あるいはｍｐ１９に連結
して、エシェリヒア・プリＪＭ１０９（後記のＭｊ３シ
ークエンシングキットの付属品として購入される）を形
質転換して多数の組換えファージを得た。
一方、２ＸＴＹ培地（バタトトリプトン １゜６ｗｔ％
％酵母エキス １ ｗｔ翫ＮａＣｔＯ，５ｗｔ％、ｐＨ
７，４）中で３７℃で→晩培養した前培養液１５μｔを
、１．５プの２ ＸＴＹ培地に植菌したものに、前記の
組換え７アージのプラークを移植して３７℃で５時間培
養後、遠心分離によりファージ粒子を含む上清を得た。
％酵母エキス １ ｗｔ翫ＮａＣｔＯ，５ｗｔ％、ｐＨ
７，４）中で３７℃で→晩培養した前培養液１５μｔを
、１．５プの２ ＸＴＹ培地に植菌したものに、前記の
組換え７アージのプラークを移植して３７℃で５時間培
養後、遠心分離によりファージ粒子を含む上清を得た。
この上清１ ｍｌに２０ｗｔ％ ポリエチレングリコー
ル６０００−２ 、５Ｍ ＮａＣ１を０．２ｍｌ加えて
１５分間放置してファージを沈殿させた。
ル６０００−２ 、５Ｍ ＮａＣ１を０．２ｍｌ加えて
１５分間放置してファージを沈殿させた。
遠心分離により沈殿を回収し、１００μｔのＴＥ緩衝液
に懸濁後、５０μｔのフェノール（ＴＥ緩衝液飽和）を
加えてよく混合してＤＮＡを抽出した。遠心分離により
水層を回収し、これに１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム
と÷倍容のエタ／−ルを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠
心分離により沈殿を回収し、乾燥後５０μｔのＴＥ緩衝
液に溶解して一本鎖のファージＤＮＡ溶液（ＤＮＡ量１
〜２μｇ）を得た。
に懸濁後、５０μｔのフェノール（ＴＥ緩衝液飽和）を
加えてよく混合してＤＮＡを抽出した。遠心分離により
水層を回収し、これに１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム
と÷倍容のエタ／−ルを加えてＤＮＡを沈殿させた。遠
心分離により沈殿を回収し、乾燥後５０μｔのＴＥ緩衝
液に溶解して一本鎖のファージＤＮＡ溶液（ＤＮＡ量１
〜２μｇ）を得た。
この一本鎖ＤＮＡとＭ１３シークエンスキット（宝酒造
製）およびα Ｐ ａｃ’ｒｐ （４１０Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌｓ Ａｍｅ ｒ ｓ ｈ ａｍ社製）を用いて相
補鎖の合成反応を行った。ホルムアミド色素溶液〔９５
Ｖｏ１％ホルムアミド、０．１ｖｒｔ％キシレンシア／
−ル、０．１ｗｔ％ ブロムフェノールブルー〕を加え
て反応停止後、３分間煮沸、急冷し、８％ポリアクリル
アミドゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動を行っ
た後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行い、
オートラジオグラム上の塩基配列を解析して各断片の塩
基配列を決定したのち、これらを連結してアルカリ性プ
ロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
製）およびα Ｐ ａｃ’ｒｐ （４１０Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌｓ Ａｍｅ ｒ ｓ ｈ ａｍ社製）を用いて相
補鎖の合成反応を行った。ホルムアミド色素溶液〔９５
Ｖｏ１％ホルムアミド、０．１ｖｒｔ％キシレンシア／
−ル、０．１ｗｔ％ ブロムフェノールブルー〕を加え
て反応停止後、３分間煮沸、急冷し、８％ポリアクリル
アミドゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動を行っ
た後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行い、
オートラジオグラム上の塩基配列を解析して各断片の塩
基配列を決定したのち、これらを連結してアルカリ性プ
ロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
この結果得られた塩基配列を第７図に示す。
ここに得られた結果によれば、２２４番目から１３６０
番目にポリペプチドをフードする領域があるが、この領
域内でヤコブスらの報告しタハチルス幸リケニホルミス
ＮＣＩＢ ６８１６の遺伝子と７ケ所の塩基の相違が
あった。すなわち、ＨＰ１９６１１株のアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子における２６８番目、７３３番目、７９
５番目、７９５番目、８２０番目、８４２番目および９
１０番目の塩基がそれぞれＮＣＩＢ６８１６株の遺伝子
−ＣｔｔＡ−）Ｃ，Ｇ−）Ａ、Ｇ→Ａ％Ａ→Ｇ、Ｇ→Ａ
、Ｔ→Ａ、Ｃ→Ｔとなっている。また、終止コドン（１
３６１番目から１５６３番目のＴＡＡ）の下流域の１３
８８番目のＡはＮＣＩＢ６Ｂ１６株の遺伝子では欠除し
ている。さらに、最も大きな相違はＮＣＩＢ６８１６株
からクロ伜ニングされた遺伝子に欠如していた１番目か
ら１１５番目までの１１５塩基対が本発明でクローニン
グされた１（ｐ１９６１１株のアルカリ性プロテアーゼ
遺伝子には付加されていることである。この領域の欠如
しているＮＣＩＢ６８１６株の遺伝子ではアルカリ性プ
ロテアーゼが発現せず、この領域が付加されている峯発
号→ＨＰ１９６１１の遺伝子では実施例５に示されたよ
うにアルカリ性プロテアーゼが発現することから、この
領域が遺伝子の発現に不可欠の領域であると考えられる
。また、タンパク合成の開始に必要なリボゾーム結合領
域と思われる配列（ＧＧＡＧＧ）が２０９番目から２１
３番目に見い出され、メツセンジャーＡＮＡ合成の開始
に必要な一３５領域及び−１０領域と思われる配列がそ
れぞれ１４９番目から１５４番目（ＴＴＡＡＣＡ ）お
よび１７２番目から１７７番目（ＴＡＴＡＴＴ ）に見
い出される。したがって、バチルス・リケニホルミスの
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の発現に必要なプロモー
ター領域は１番目から２０８番目までの領域に存在し、
プロモーターの全領域を含むＤＮＡとはこの領域の全部
を含むＤＮＡの他、この領域の一部を欠如させたもので
あってもアルカリ性プロテアーゼを発現させる能力を保
持しているような領域を含むＤＮＡを言う。
番目にポリペプチドをフードする領域があるが、この領
域内でヤコブスらの報告しタハチルス幸リケニホルミス
ＮＣＩＢ ６８１６の遺伝子と７ケ所の塩基の相違が
あった。すなわち、ＨＰ１９６１１株のアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子における２６８番目、７３３番目、７９
５番目、７９５番目、８２０番目、８４２番目および９
１０番目の塩基がそれぞれＮＣＩＢ６８１６株の遺伝子
−ＣｔｔＡ−）Ｃ，Ｇ−）Ａ、Ｇ→Ａ％Ａ→Ｇ、Ｇ→Ａ
、Ｔ→Ａ、Ｃ→Ｔとなっている。また、終止コドン（１
３６１番目から１５６３番目のＴＡＡ）の下流域の１３
８８番目のＡはＮＣＩＢ６Ｂ１６株の遺伝子では欠除し
ている。さらに、最も大きな相違はＮＣＩＢ６８１６株
からクロ伜ニングされた遺伝子に欠如していた１番目か
ら１１５番目までの１１５塩基対が本発明でクローニン
グされた１（ｐ１９６１１株のアルカリ性プロテアーゼ
遺伝子には付加されていることである。この領域の欠如
しているＮＣＩＢ６８１６株の遺伝子ではアルカリ性プ
ロテアーゼが発現せず、この領域が付加されている峯発
号→ＨＰ１９６１１の遺伝子では実施例５に示されたよ
うにアルカリ性プロテアーゼが発現することから、この
領域が遺伝子の発現に不可欠の領域であると考えられる
。また、タンパク合成の開始に必要なリボゾーム結合領
域と思われる配列（ＧＧＡＧＧ）が２０９番目から２１
３番目に見い出され、メツセンジャーＡＮＡ合成の開始
に必要な一３５領域及び−１０領域と思われる配列がそ
れぞれ１４９番目から１５４番目（ＴＴＡＡＣＡ ）お
よび１７２番目から１７７番目（ＴＡＴＡＴＴ ）に見
い出される。したがって、バチルス・リケニホルミスの
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の発現に必要なプロモー
ター領域は１番目から２０８番目までの領域に存在し、
プロモーターの全領域を含むＤＮＡとはこの領域の全部
を含むＤＮＡの他、この領域の一部を欠如させたもので
あってもアルカリ性プロテアーゼを発現させる能力を保
持しているような領域を含むＤＮＡを言う。
また、１３８９番目から１４１９番目には転写の終結部
位に見られるステム−ループ構造をとることのできる配
列をもつターミネータ−構造が見られる。
位に見られるステム−ループ構造をとることのできる配
列をもつターミネータ−構造が見られる。
なお、２２４番目から１３６０番目のポリペプチドをコ
ードする領域のうち５３９番目以降の配列から導かれる
アミノ酸配列は５個のアミノ酸を除いて文献［Ｍ 、
０ｔｔｅｒｓｅｎ＋１．５ｖｅｎｄｓｅｎ：Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ＊１９，１９９．Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ ＊ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９７９） ） ｔｎ報告されているズブチリシン・カー
ルスバーグのアミノ酸配列と一致していることから５３
９番目から１３６０番目までが成熟タンパクをコードし
ている領域と判断される。したがって２２４番目から５
３８番目までが分泌に関与する領域であると思われる。
ードする領域のうち５３９番目以降の配列から導かれる
アミノ酸配列は５個のアミノ酸を除いて文献［Ｍ 、
０ｔｔｅｒｓｅｎ＋１．５ｖｅｎｄｓｅｎ：Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ＊１９，１９９．Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ ＊ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９７９） ） ｔｎ報告されているズブチリシン・カー
ルスバーグのアミノ酸配列と一致していることから５３
９番目から１３６０番目までが成熟タンパクをコードし
ている領域と判断される。したがって２２４番目から５
３８番目までが分泌に関与する領域であると思われる。
バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子の発現に必要なプロモーターの全領域を含むアルカ
リ性プロテアーゼ遺伝子が挿入された組換えプラスミド
ならびにこの組換えプラスミド形質転換されたバチルス
属細−菌が得られたことによって、アルカリ性プロテア
ーゼの生産に際して、アルカリ性プロテアーゼの生産能
を特異的に高めるような培養を行うことが可能となり、
これに伴いアルカリ性プロテアーゼの精製も容易に行う
ことが可能となった。
伝子の発現に必要なプロモーターの全領域を含むアルカ
リ性プロテアーゼ遺伝子が挿入された組換えプラスミド
ならびにこの組換えプラスミド形質転換されたバチルス
属細−菌が得られたことによって、アルカリ性プロテア
ーゼの生産に際して、アルカリ性プロテアーゼの生産能
を特異的に高めるような培養を行うことが可能となり、
これに伴いアルカリ性プロテアーゼの精製も容易に行う
ことが可能となった。
また、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領
域ならびにタンパクの分泌に関与する領域を含む遺伝子
が単離され、その塩基配列が明らかにされたことによっ
て、この領域の下流域に隣接して成長ホルモンなどの有
用タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつ
ＤＮＡ断片を連結した組換えプラスミドを構築すること
が可能となり、この組換えプラスミドを安全性の高いバ
チルス属細菌に導入した形質転換体を培養することによ
って該有用タンパク質の大量分泌生産を安全に実施する
ことが可能となった。
域ならびにタンパクの分泌に関与する領域を含む遺伝子
が単離され、その塩基配列が明らかにされたことによっ
て、この領域の下流域に隣接して成長ホルモンなどの有
用タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつ
ＤＮＡ断片を連結した組換えプラスミドを構築すること
が可能となり、この組換えプラスミドを安全性の高いバ
チルス属細菌に導入した形質転換体を培養することによ
って該有用タンパク質の大量分泌生産を安全に実施する
ことが可能となった。
第１図は組換えプラスミドｐＡＭＰ５の制限酵素地図、
第２図は組換えプラスミドｐＬＰ３の制限酵素地図、第
３図は組換えプラスミドｐＬＰ３５の制限酵素地図、第
４図は組換えプラスミドｐ、ＨＬＰ３５１の構築方法を
説明する模式図、第５図は組換えプラスミドｐＨＬＰ３
５２の構築方法を説明する模式図、第６図は組換えプラ
スミドｐＵυＰ３５４の構築方法を説明する模式図、第
７図はバチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１のアル
カリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を含むＤＮＡの塩基
配列を示す図である。 なお、第１図から第６図において、一本線部分はベクタ
ープラスミドの領域、二本線部分は染色体ＤＮＡに由来
する領域、矢印はベクタープラスミド上の薬剤耐性遺伝
子の存在する領域を示す。 特許出願人 三菱瓦斯化学株式会社 代表者 長野和書
第２図は組換えプラスミドｐＬＰ３の制限酵素地図、第
３図は組換えプラスミドｐＬＰ３５の制限酵素地図、第
４図は組換えプラスミドｐ、ＨＬＰ３５１の構築方法を
説明する模式図、第５図は組換えプラスミドｐＨＬＰ３
５２の構築方法を説明する模式図、第６図は組換えプラ
スミドｐＵυＰ３５４の構築方法を説明する模式図、第
７図はバチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１のアル
カリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を含むＤＮＡの塩基
配列を示す図である。 なお、第１図から第６図において、一本線部分はベクタ
ープラスミドの領域、二本線部分は染色体ＤＮＡに由来
する領域、矢印はベクタープラスミド上の薬剤耐性遺伝
子の存在する領域を示す。 特許出願人 三菱瓦斯化学株式会社 代表者 長野和書
Claims (2)
- （１）バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子において、アルカリ性プロテアーゼを発現さ
せる能力を有するプローモーター領域を有することを特
徴とする新規な遺伝子ＤＮＡ - （２）バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子において、アルカリ性プロテアーゼを発現さ
せる能力を有するプロモーター領域を有することを特徴
とする遺伝子 ＤＮＡを、ベクタープラスミドに連結した組換えプラス
ミドを用いて形質転換されたバチルス属細菌を培養し、
培養液に分泌されたアルカリ性プロテアーゼを回収する
ことを特徴とするアルカリ性プロテアーゼの製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62047637A JPH0787790B2 (ja) | 1987-03-04 | 1987-03-04 | 新規な遺伝子ｄｎａおよびアルカリ性プロテア−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62047637A JPH0787790B2 (ja) | 1987-03-04 | 1987-03-04 | 新規な遺伝子ｄｎａおよびアルカリ性プロテア−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63214187A true JPS63214187A (ja) | 1988-09-06 |
| JPH0787790B2 JPH0787790B2 (ja) | 1995-09-27 |
Family
ID=12780752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62047637A Expired - Lifetime JPH0787790B2 (ja) | 1987-03-04 | 1987-03-04 | 新規な遺伝子ｄｎａおよびアルカリ性プロテア−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0787790B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03285683A (ja) * | 1990-03-27 | 1991-12-16 | Kikkoman Corp | 変異型ホタルルシフェラーゼ、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造法 |
| EP0519229A2 (en) * | 1991-05-22 | 1992-12-23 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Alkaline protease gene from fusarium sp |
| JP2015505463A (ja) * | 2012-01-31 | 2015-02-23 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ | 発現方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6112287A (ja) * | 1984-06-26 | 1986-01-20 | Lion Corp | 組換え体ｄｎａ、その製造方法、それを含む細菌、それを用いた菌体外分泌酵素の製造方法、及び菌体外酵素分泌促進用ｄｎａ |
| JPS6232888A (ja) * | 1985-08-03 | 1987-02-12 | ヘンケル・コマンデイツトゲゼルシヤフト・アウフ・アクチエン | アルカリ性プロテア−ゼ並びにハイブリツドベクタ−および形質転換微生物の調製 |
-
1987
- 1987-03-04 JP JP62047637A patent/JPH0787790B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6112287A (ja) * | 1984-06-26 | 1986-01-20 | Lion Corp | 組換え体ｄｎａ、その製造方法、それを含む細菌、それを用いた菌体外分泌酵素の製造方法、及び菌体外酵素分泌促進用ｄｎａ |
| JPS6232888A (ja) * | 1985-08-03 | 1987-02-12 | ヘンケル・コマンデイツトゲゼルシヤフト・アウフ・アクチエン | アルカリ性プロテア−ゼ並びにハイブリツドベクタ−および形質転換微生物の調製 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03285683A (ja) * | 1990-03-27 | 1991-12-16 | Kikkoman Corp | 変異型ホタルルシフェラーゼ、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造法 |
| JP2666561B2 (ja) * | 1990-03-27 | 1997-10-22 | キッコーマン株式会社 | 変異型ホタルルシフェラーゼ、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造法 |
| US5543322A (en) * | 1991-05-21 | 1996-08-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA coding for alkaline protease |
| EP0519229A2 (en) * | 1991-05-22 | 1992-12-23 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Alkaline protease gene from fusarium sp |
| JP2015505463A (ja) * | 2012-01-31 | 2015-02-23 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ | 発現方法 |
| US9725704B2 (en) | 2012-01-31 | 2017-08-08 | Basf Se | Expression method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0787790B2 (ja) | 1995-09-27 |
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