JPH09289893A - 耐熱性アミラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 実質的に配列番号１に示したアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする耐熱性アミラーゼ
遺伝子。該耐熱性アミラーゼ遺伝子を有する組換えベク
ター。該組換えベクターにより形質転換された形質転換
体。該形質転換体を培地に培養し、培養物中に配列番号
１に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成蓄
積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを
特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。 【効果】 極めて高い耐熱性を有し、且つデンプンに作
用してマルトース及びマルトトリオースを生成するアミ
ラーゼをコードする遺伝子である。該遺伝子を有する形
質転換体は、簡単な組成の培地中、低い温度で好気的に
培養することができ、アミラーゼの生産量が多く、かつ
その一部を菌体外に分泌するなど、アミラーゼを効率良
く生産できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、工業用酵素として
有用な耐熱性アミラーゼをコードする遺伝子、その遺伝
子を含有する組換えベクター、その組換えベクターによ
り形質転換された形質転換体及びその形質転換体を用い
る耐熱性アミラーゼの製造方法に関する。アミラーゼ
は、食品工業、繊維工業などにおいて、デンプンを加水
分解してグルコース又はオリゴ糖を製造するために利用
される酵素である。

【０００２】

【従来の技術】アミラーゼは、デンプンを加水分解して
グルコース又はそのオリゴ糖を生成する酵素である。こ
のアミラーゼの作用を利用して、食品工業及び繊維工業
においてさまざまな用途がある。工業用アミラーゼとし
ては主として微生物が生産したものが用いられており、
かかるアミラーゼ生産に使用する微生物は一般的には常
温菌である。しかしながら、工業用酵素には高い温度で
安定した活性を示すものが望まれるが、常温菌を用いて
得られる酵素は耐熱性が低い。

【０００３】耐熱性のアミラーゼを得るために、80℃以
上の高温度域で生育する超好熱菌からアミラーゼを取得
する研究がなされてきた。これまで、ピロコッカス フ
リオサス（Pyrococcus furiosus)、ピロコッカス ボウ
ゼイ（Pyrococcus woesei)などの超好熱菌からのアミラ
ーゼなど、少数の例が報告されている（特開平7-143880
号公報、Appl. Environ. Microbiol., 56, 1985-1991
(1990) 、Arch. Microbiol., 155, 572-578 (1991) 等
参照）。しかしながら、これらピロコッカス属細菌由来
のアミラーゼは、デンプンに作用して主としてデキスト
リンを生成するいわゆる液化型酵素であり、グルコース
又はそのオリゴ糖を生成する作用はない。そのため、グ
ルコース又はそのオリゴ糖を製造するには、さらに糖化
型酵素を作用させるプロセスが必要となる。また、ピロ
コッカス フリオサス由来の酵素は菌体外に分泌されな
いため、酵素の単離精製の操作が複雑になる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、高い耐熱性を有し、かつデンプンに作用して一
段階のプロセスにてマルトース及び／又はマルトトリオ
ースを生成するアミラーゼをコードする遺伝子を提供す
ることである。また、本発明の課題は、上記耐熱性アミ
ラーゼの生産量が高く、その単離精製が容易である微生
物を提供することである。更に、本発明の課題は、耐熱
性アミラーゼを効率よく製造する方法を提供することで
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、先に超好
熱菌テルモコッカス プロファンダス(Thermococcuspro
fundus) DT5432 株を深海熱水湧水帯より採取し、該菌
が生産するアミラーゼの単離精製に成功した（Syst. Ap
pl. Microbiol., 17, 232-236 (1994)) 。さらにかかる
アミラーゼの諸性質についても報告した(Appl. Enviro
n. Microbiol.,61, 1502-1506 (1995))。テルモコッカ
ス プロファンダス DT5432 が生産するアミラーゼは、
硫酸アンモニウム塩析、DEAE−トーヨーパールイオン交
換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィー
により精製し、単一タンパクとして単離できた。純化さ
れたアミラーゼは、至適作用温度を80℃に有し、耐熱性
は活性半減時間で示すと５mMカルシウムイオン存在下90
℃で４時間であり、極めて耐熱性の高い酵素であること
がわかった。該アミラーゼは、pH5.5 、80℃にてデンプ
ンに作用させるとマルトースとマルトトリオースを生成
する。

【０００６】このようにテルモコッカス プロファンダ
ス DT5432 株から純化酵素標品を得ることができたこと
により、種々の遺伝子工学的手法を駆使して該酵素の遺
伝子を単離及び構造決定することができ、本発明を完成
するに至った。本発明は、実質的に配列番号１に示した
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする耐熱性
アミラーゼ遺伝子である。また、本発明は、上記耐熱性
アミラーゼ遺伝子を有する組換えベクターである。更
に、本発明は、上記組換えベクターにより形質転換され
た形質転換体である。

【０００７】更に、本発明は、上記形質転換体を培地に
培養し、培養物中に配列番号１に示したアミノ酸配列を
有するポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポ
リペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチ
ドの製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の耐熱性アミラーゼ遺伝子
がコードするポリペプチドは、実質的に配列番号１に示
したアミノ酸配列を有するものである。本発明において
「実質的に配列番号１に示したアミノ酸配列を有する」
とは、上記ポリペプチドが耐熱性アミラーゼの酵素活性
を有する限りアミノ酸のいくつかについて欠失、置換、
付加等の変化があってもよいことを意味する。本発明に
よる耐熱性アミラーゼ遺伝子は、例えば、配列番号２で
示される塩基配列を有するものが挙げられる。尚、本発
明による耐熱性アミラーゼ遺伝子は、配列番号２で示さ
れる塩基配列を有するものの他に、縮重コドンにおいて
のみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体
をも包含するものであることはいうまでもない。

【０００９】本発明の耐熱性アミラーゼ遺伝子は、例え
ば、超好熱菌テルモコッカス プロファンダス DT5432
株の染色体ＤＮＡから分離することができる。このテル
モコッカス プロファンダス DT5432 は、沖縄県奄美大
島西方約10kmの伊平屋海丘群（北緯27°33′、東経 126
°58′）の深海熱水湧水帯（深度1400ｍ）から採取した
ものである。テルモコッカス プロファンダス DT5432
株からの耐熱性アミラーゼ遺伝子の分離は、例えば、以
下のようにして行うことができる。

【００１０】先ず、テルモコッカス プロファンダス D
T5432 株から耐熱性アミラーゼを単離・精製し、その耐
熱性アミラーゼのＮ末端側からアミノ酸配列の一部を決
定する。その決定されたアミノ酸配列に基づいて、それ
をコードする塩基配列を有するＤＮＡプローブを化学合
成する。一方、テルモコッカス プロファンダス DT543
2 を所定の方法（例えば、Syst. Appl. Microbiol., 1
7, 232-236 (1994); Appl. Environ, Microbiol., 61,
1502-1506(1995)参照) にて培養して菌体を集め、フェ
ノール法によるＤＮＡ抽出法（Biochim. Biophys. Act
a, 72, 619-629(1963) 参照) により染色体ＤＮＡを抽
出精製する。精製染色体ＤＮＡを制限酵素Sac I により
切断してＤＮＡ断片混合物を得る。上記合成ＤＮＡプロ
ーブを用いたサザンハイブリダイゼーション法により、
このＤＮＡ断片混合物からＤＮＡプローブとハイブリッ
ド形成し、アミラーゼ遺伝子が含まれると考えられるSa
c I 切断ＤＮＡ断片のサイズが 2.5kbであることがわか
る。このようにして、耐熱性アミラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片の存在とサイズが明らかになり、アミラーゼ遺
伝子が取得できる。

【００１１】上記のようにして取得されたSac I 切断Ｄ
ＮＡ断片を、公知のプラスミドベクターに挿入ないし連
結することにより組換えプラスミドベクターが得られ
る。プラスミドベクターとしては、pUC118、pUC119のよ
うなSac I 制限酵素部位を有するものを用いることがで
きる。また、従来公知の方法にしたがって、得られた組
換えプラスミドベクターを用いて微生物の形質転換を行
い、コロニーハイブリダイゼーション法により目的とす
る形質転換体を得ることができる。微生物としては、例
えば、大腸菌を用いることができる。大腸菌としては、
具体的には、エシェリキア・コリ(Escherichiacoli) HB
101、同JM109 、同MV1184、同DH5 等を用いることがで
きる。

【００１２】尚、この形質転換体、エシェリキア・コリ
(Escherichia coli) MV1184(pTAMY830) は、工業技術院
生命工学工業技術研究所に平成８年４月19日付けで寄託
し、受託番号FERM P-15588を得ている。形質転換体を培
養したところ、この形質転換体は耐熱性アミラーゼ活性
を示し、該組換えプラスミドに耐熱性アミラーゼ遺伝子
がクローニングされていることが判明した。この形質転
換株から従来公知の方法にしたがって組換えプラスミド
を抽出・精製した。この組換えプラスミドをpTAMY830と
命名した。この組換えプラスミドpTAMY830の制限酵素地
図を図１に示す。図１中、太線部分がアミラーゼ生成に
必須の 2.5kbのSac I 切断ＤＮＡ挿入断片であり、太線
矢印（amyT) がアミラーゼ遺伝子部分である。また、断
片中の制限酵素切断部位も示した。

【００１３】上記の組換えプラスミドpTAMY830のSac I
切断ＤＮＡ断片(2.5kb) 中のamyTは、配列番号２に示さ
れる塩基配列を有する。このＤＮＡは、配列番号１で示
されるアミノ酸配列をコードするものである。また、耐
熱性アミラーゼの全アミノ酸をコードするオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号２で示される
塩基配列中、１〜1206番目までの1206塩基からなること
も確認された。

【００１４】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。但し、本発明は、これらの実施例により何ら限定さ
れるものではない。

【００１５】〔実施例１〕 (1) 酵素の単離・精製 テルモコッカス プロファンダス DT5432 株からの耐熱
性アミラーゼの単離・精製は、 Appl. Environ. Microb
iol.,61, 1502-1506 (1995) 記載の方法にしたがって、
以下のようにして行った。下記の組成の培地２Ｌをネジ
口ビンに入れ、テルモコッカス プロファンダスDT5432
株を植菌し、密栓して80℃にて20時間嫌気培養した。

【００１６】培地組成（１Ｌ中） Difco トリプトン 5.0 ｇ Difco 酵母エキス 1.0 ｇ 塩化ナトリウム 25.0 ｇ 硫酸マグネシウム 2.0 ｇ 硫酸アンモニウム 1.0 ｇ 塩化カリウム 0.5 ｇ リン酸二水素カリウム 0.5 ｇ 塩化カルシウム 0.1 ｇ 硫酸第一鉄 0.01ｇ 硫黄粉末 10.0 ｇ 硫化ナトリウム 0.4 ｇ レザズリンナトリウム 0.01ｇ （微量元素） 塩化第二銅 0.1 mg 硫酸コバルト 0.05mg モリブデン酸ナトリウム 1.0 mg 臭化ナトリウム 0.5 mg 塩化リチウム 0.5 mg セレン酸ナトリウム ０．０５ｍｇ 硫酸バナジル ０．０５ｍｇ 塩化バリウム 0.05mg 硫酸亜鉛 1.0 mg 塩化マンガン 2.0 mg ヨウ化カリウム 0.05mg ホウ酸ナトリウム 2.0 mg タングステン酸ナトリウム 0.05mg 塩化ストロンチウム 0.05mg 塩化ニッケル 0.1 mg （ビタミン類） サイアミン・塩酸塩 0.25mg ピリドキサミン・塩酸塩 0.15mg パントテン酸カルシウム 0.25mg ニコチン酸 0.50mg ｄ−ビオチン 0.0005mg シアノコバラミン 0.0005mg ピリドキシン・塩酸塩 0.5 mg ピリドキサール 0.15mg リボフラビン 0.10mg ｐ−アミノ安息香酸 0.10mg 葉 酸 0.005mg リポ酸 0.025mg

【００１７】培養後、遠心分離（6,500×ｇ，30分）に
より培養液を菌体と培養上清とに分けた。培養上清に粉
末硫酸アンモニウムを80％飽和になるように加えて４℃
にて一夜放置した。沈澱した塩析物を遠心分離（7,000
×ｇ，30分）にて分離し、50mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）に溶解した。これを同緩衝液に対して一夜透析し
て硫酸アンモニウムを除去した。透析酵素液をDEAE−ト
ーヨーパール 650M カラムに注入し、 3.5Ｍトリス−塩
酸緩衝液（pH 7.5) を用いて溶出させ、活性画分を分取
した。次に、これを適当に濃縮してからゲル濾過剤スー
パーデックス 200ＨＲを用いてゲル濾過を行った。溶出
には50mM同緩衝液を用いた。このようにして得られた酵
素は、ＳＤＳ−電気泳動法により単一タンパクに精製さ
れていることが確認された。

【００１８】(2) 耐熱性アミラーゼのＮ末端側の一部の
アミノ酸配列の分析 上記(1) で得られた精製酵素について、電気泳動法によ
り均一な標品であることを確認した後、これをニトロセ
ルロース膜に転写し、アミノ酸配列自動分析装置（ＡＢ
Ｉプロテインシーケンサー４７７Ａ、エドマン法）を用
いてＮ末端側からアミノ酸配列を決定した。その結果、
配列番号３に示される20アミノ酸の配列を決定すること
ができた。

【００１９】(3) ＤＮＡプローブの合成 上記(2) で決定されたＮ末端側20アミノ酸中12番目のイ
ソロイシンから19番目のアスパラギン酸までの８アミノ
酸に対応する塩基配列（配列番号４）を有するＤＮＡプ
ローブをＤＮＡ自動合成装置（ＡＢＩ ＤＮＡシンセサ
イザー ３８０Ｂ）を用いて合成した。

【００２０】(4) 染色体ＤＮＡの調製 テルモコッカス プロファンダス DT5432 株を上記(1)
と同様の方法で培養し、培養液から菌体を採取した。そ
の菌体を50mlの50mMトリス−塩酸（pH 7.5) ／0.5Ｍ塩
化ナトリウム緩衝液にて洗浄した。次いで洗浄菌体を50
mlの50mMトリス塩酸（pH 7.5) ／0.1mM エチレンジアミ
ンテトラアセテート緩衝液（ＴＥ）に懸濁して細胞を破
裂させ、ＤＮＡを溶出させた。これに50mlのフェノール
飽和ＴＥを加え、遠心分離（6,500×ｇ，15分）により
ＤＮＡ層を分離した。ＤＮＡ層に70％エタノールを加え
てＤＮＡを沈澱させ、そのＤＮＡ沈澱をガラス棒で巻取
った。このようにしてテルモコッカス プロファンダス
DT5432 株の染色体ＤＮＡが得られた。

【００２１】(5) 耐熱性アミラーゼ遺伝子の単離 上記(4) で得られた染色体ＤＮＡ10μｇを下記の組成の
緩衝液50μｌに溶かし、制限酵素Sac I 10単位を加えて
37℃にて１時間作用させて分解した。緩衝液の組成 10 mM トリス−塩酸（pH 7.4) 7 mM 塩化マグネシウム 50 mM 塩化カリウム 0.1mM エチレンジアミンテトラアセテート 1 mM ジチオスレイトール 得られたSac I 切断ＤＮＡ断片混合物を電気泳動により
分離させ、ナイロン膜に転写した。

【００２２】一方、市販のラベリングキット（ベーリン
ガー・マイハイム（株）製品）を用いて、上記(3) で製
造したＤＮＡプローブの３′−末端に、ジゴキシゲニン
標識デオキシウリジン三リン酸（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）を
標識した。即ち、この標識は下記の組成の反応混合液を
37℃にて15分間反応させることにより行った。反応混合液の組成 ５倍濃度緩衝液 ４μｌ（１M カ
コジレートカリウム，0.125Mトリス，1.25mg/ml 牛血清
アルブミン，pH 6.5) 25mM 塩化コバルト溶液 ４μｌ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ １μｌ ターミナルトランスフェラーゼ 50単位 蒸溜水 20μｌ ＤＮＡプローブ 約 100 pmol

【００２３】反応開始15分後に２％グリコーゲン液１μ
ｌ及び 0.2ＭのＥＤＴＡ溶液１μｌを加えて反応を停止
した。次いで、４M 塩化リチウム 2.5μｌ及び冷却エタ
ノール75μｌを加えて標識されたＤＮＡ断片を沈澱さ
せ、遠心分離した。回収されたＤＩＧ−ｄＵＴＰ標識Ｄ
ＮＡプローブを滅菌蒸溜水20μｌに溶解した。

【００２４】上記のSac I 切断ＤＮＡ断片を固定したナ
イロン膜について、非特異的結合をブロックするため、
まず、プレハイブリダイゼーションを行った。膜 100cm
² 当たり20mlのプレハイブリダイゼーション液（５倍濃
度ＳＳＣ溶液、Ｎ−ラウロイルサルコシン・ナトリウム
0.1％、ＳＤＳ 0.02％、ブロッキング試薬（0.１Mマレ
イン酸）１％）を加え、68℃にて60分間反応させた。次
に、プレハイブリダイゼーション液を、ＤＩＧ−ｄＵＴ
Ｐ標識ＤＮＡプローブ液５μｌを含むハイブリダイゼー
ション液（前記プレハイブリダイゼーション液と同組
成) に交換して68℃にて６時間反応させた。ハイブリダ
イゼーション液は膜面積 100cm² 当たり2.5mlの割合で
用いた。反応終了後に膜を洗浄液（２倍濃度ＳＳＣ，Ｓ
ＤＳ 0.1％）にて２回、希釈洗浄液（１/10 ＳＳＣ，Ｓ
ＤＳ 0.1％）にて２回洗浄して未反応のＤＮＡプローブ
を除去した。

【００２５】ナイロン膜上のＤＮＡ断片にハイブリダイ
ズさせたＤＩＧ−ｄＵＴＰ標識ＤＮＡプローブを検出す
るため、検出キット（ベーリンガー・マンハイム（株）
製品）を用いて以下の反応を行った。

【００２６】ハイブリダイズ膜を、アルカリホスファタ
ーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（0.9mU)溶液30mlにて30
分間反応させ、次に、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリルリン酸とニトロブルー・テトラゾリウム塩を加
えて発色させると、ハイブリダイズ部位に青色不溶性沈
澱が形成された。その位置からハイブリダイズしたＤＮ
Ａ断片の位置、およびそのサイズが 2.5kbであることが
判明した。このようにして、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ標識ＤＮ
Ａプローブと強い反応を示したSac I 切断ＤＮＡ断片
(2.5kb) を得た。

【００２７】次にテルモコッカス プロファンダス DT5
432 株の染色体ＤＮＡ５μｇを制限酵素Sac I にて切断
し、１％アガロースを用いて電気泳動した。泳動位置か
ら、2.5kb ＤＮＡ断片を含むと考えられる２−３kbに相
当する部分のSac I 切断ＤＮＡを抽出した。このSac I
切断ＤＮＡと、プラスミドベクターpUC119（例えば宝酒
造（株）より入手可能である。）を同制限酵素で切断し
たものとを緩衝液（20mMトリス−塩酸（pH7.5)、 10mM
塩化マグネシウム、 10mM ジチオスレイトール）に溶か
し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１単位を加えて18℃にて18時間
反応させ両者を連結した。65℃で５分間加熱して反応を
停止した。反応液の一部をとり、アガロース電気泳動に
より両者が連結していることを確認した。このようにし
て、組換えプラスミドベクターを得た。

【００２８】(6) 大腸菌の形質転換 エシェリキア・コリ MV1184 株（宝酒造（株))のコンピ
テント細胞（10⁵ −10⁶ 個）の懸濁液に、上記(5) で得
られた組換えプラスミドベクター（１μg)を加え、氷冷
下にて30分反応させ、引続き42℃で２分間の熱ショック
を加えて、プラスミドを細胞内にとり込ませた。このよ
うにして得られた細胞を、 100mg／Ｌのアンピシリンを
含むＬＢ寒天培地にまき、コロニーを形成させた。その
中から、コロニーハイブリダイゼーションにより目的と
する形質転換株５株を得た。

【００２９】上記により得られた形質転換株５株を、ア
ンピシリン及び１％デンプンを含むＬＢ寒天培地で培養
したところ、該培地上でコロニーの周囲にデンプン分解
を示す透明帯を形成した。この結果から、これらの形質
転換株はアンピシリン耐性及びアミラーゼ活性を有して
いることがわかる。５株の中でデンプン分解力がもっと
も強く発現していると認められる１株を選別した。

【００３０】(7) 組換えプラスミドpTAMY830の抽出 上記(6) で選別した形質転換株エシェリキア・コリ MV1
184(pTAMY830) を、ＬＢ液体培地（ 100mg／Ｌアンピシ
リンを含む）を用いて、37℃にて20時間培養する。培養
物より菌体を遠心分離して集め、さらに洗浄する。この
ようにして得られる形質転換細胞より、常法のアルカリ
−ＳＤＳ法を用いてプラスミドの抽出・精製を行った。
培養上清については、後記のように酵素活性測定に供し
た。得られたプラスミドには上記Sac I 切断ＤＮＡ断片
(2.5kb) が挿入されており、さらにサブクローニング実
験によりこのＤＮＡ断片がアミラーゼ生成に必須である
ことがわかった。この組換えプラスミドをpTAMY830と命
名した。

【００３１】図１には、組換えプラスミドpTAMY830の制
限酵素地図を示す。図中、太線部分がアミラーゼ生成に
必須の2.5kb ＤＮＡ挿入断片であり、太線矢印(amyT)は
耐熱性アミラーゼ遺伝子部分を示す。また、断片中の制
限酵素切断部位も示した。

【００３２】(8) 耐熱性アミラーゼ遺伝子の塩基配列の
決定 組換えプラスミドpTAMY830に挿入されたSac I 切断ＤＮ
Ａ断片(2.5kb) から種々の長さ欠失させたデレーション
ミュータントを作製した。これら細分化ＤＮＡ断片をプ
ラスミドpBluescript II KS+にサブクローニングし、ダ
イプライマサイクルシークエンシング レディーリアク
ション キット（アプライドバイオシステム社製）を用
いたジデオキシリボヌクレオチド法により塩基配列を決
定した上、それらを結合・総合して挿入断片ＤＮＡの全
塩基配列を決定した。2.5kb ＤＮＡ断片のうち1206bpの
塩基配列は配列番号２に示すとおりである。

【００３３】配列番号２で示される塩基配列中、上記
(2) の配列番号３で示される20アミノ酸をコードする配
列は、79番目から認められること、及び1204番目から12
06番目の３塩基TGAが終止コドンになっていることが認
められた。従って、本酵素の全アミノ酸をコードするオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、１番目から
1206番目までの1206塩基からなる。尚、ＯＲＦの１〜３
番の３塩基ATG が開始コドンである。

【００３４】また、配列番号２に示される塩基配列か
ら、耐熱性アミラーゼのアミノ酸配列を決定した。その
アミノ酸配列を配列番号１に示す。上記(2) で決定した
Ｎ末端配列から、成熟型酵素はアミノ酸配列中27番目の
アラニンから 401番目のアスパラギン酸までの 375アミ
ノ酸からなり、その分子量は43,281ダルトンと計算され
た。配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目メチオ
ニンから26番目アラニンまでの26アミノ酸は、分泌の際
に切断されるシグナルペプチドである。また、このアミ
ノ酸配列中には、既知のアミラーゼで保存されている相
同性の高い４領域（ 132〜137 番目の６アミノ酸、 220
〜228 番目の９アミノ酸、 248〜251 番目の４アミノ
酸、 310〜315 番目の６アミノ酸）が存在していた。

【００３５】(9) 形質転換株による耐熱性アミラーゼ生
産 組換えプラスミドpTAMY830が導入されているエシェリキ
ア・コリ MV1184(pTAMY830) をＬＢ培地(100μg/mlアン
ピシリンを含む) にて37℃、24時間好気的に振盪培養し
た。次いで、遠心分離法により増殖菌体と培養上清液に
分画した。

【００３６】集めた菌体を氷冷 0.1Ｍトリス−塩酸緩衝
液に懸濁し、超音波発生器を用いて菌体を破砕した。破
砕液を遠心分離して細胞断片残滓を除去し、上清液を得
た。これを同緩衝液にて一夜透析して、細胞抽出液を得
た。このようにして得られた細胞抽出液、及び上記培養
上清液について、それぞれの耐熱性アミラーゼ活性を下
記のようにして測定した。

【００３７】（酵素活性の測定）酵素活性は、50mMリン
酸緩衝液(pH5.5) に溶かした 1.5％の可溶性デンプン液
を基質溶液とし、70℃で30分反応させた後、生成還元糖
量をソモギ−ネルソン法により求めることにより測定し
た。酵素活性１単位は１分間にグルコース１μmole生成
する酵素量とする。培養上清液と細胞抽出液それぞれの
酵素活性（単位）及び酵素活性の分布割合（％）を表１
に示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】表１に示された結果から、本発明の大腸菌
は、耐熱性アミラーゼを一部菌体外に分泌するので、酵
素の単離、精製の操作が容易であることがわかる。

【００４０】〔実施例２〕 (1) 酵素の精製 実施例１で得た細胞抽出液中のアミラーゼを実施例１と
同様の方法より精製し、電気泳動により単一標品である
ことを確認した。

【００４１】(2) 精製酵素のＮ末端アミノ酸配列の決定 上記の精製酵素標品について、Ｎ−末端側から20アミノ
酸のアミノ酸配列をエドマン分解法を用いるアミノ酸配
列自動分析装置ＡＢＩプロテイン シーケンサー 477A
により解析したところ、配列番号３で示されるアミノ酸
配列と一致していた。

【００４２】したがって、組換えプラスミドpTAMY830に
よって形質転換した大腸菌が生産する耐熱性アミラーゼ
はテルモコッカス プロファンダス DT5432 由来の耐熱
性アミラーゼと同一のものであることが明らかになっ
た。

【００４３】

【発明の効果】本発明によれば、極めて高い耐熱性を有
し、且つデンプンに作用してマルトース及びマルトトリ
オースを生成するアミラーゼをコードする遺伝子を提供
することができた。

【００４４】また、上記遺伝子を含む組換えベクターに
より形質転換された本発明の形質転換体は、簡単な組成
の培地中、37℃程度の低い温度で好気的に培養すること
ができ、しかも耐熱性アミラーゼの生産量が多く、かつ
その一部を菌体外に分泌するなど、耐熱性アミラーゼを
効率良く生産できるので、工業的なデンプン糖化等に利
用することができる。

【００４５】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：401 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：テルモコッカス プロファンダス 株名：DT5432 配列 Met Gly Ile Arg Lys Thr Ala Ala Val Leu Ile Val Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Leu Gly Ile Ser Ala Val Pro Ala Gly Ala Ala lys Tyr Ser Ser Leu 20 25 30 Glu Asp Gly Gly Val Ile Met Gln Ala Phe Tyr Trp Asp Val Pro Gly 35 40 45 Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr 50 55 60 Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met 65 70 75 80 Ser Gly Asn Ser Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu 85 90 95 Gly Glu Tyr Tyr Gln Lys Gly Thr Val Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys 100 105 110 Gln Glu Leu Val Asp Met Ile Asn Thr Ala His Ser Tyr Gly Ile Lys 115 120 125 Val Ile Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu 130 135 140 Trp Asn Pro Phe Val Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val 145 150 155 160 Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Glu Asp Phe His Pro Asn Glu 165 170 175 Val Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala 180 185 190 His Glu Lys Ser Trp Asp Gln Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser 195 200 205 Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Val Asp Ala Trp Arg Phe Asp 210 215 220 Tyr Val Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Val Val Lys Asp Trp Leu Ser Trp 225 230 235 240 Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Val Asp Ala 245 250 255 Leu Leu Ser Trp Ala Tyr Asp Ser Asn Ala Lys Val Phe Asp Phe Pro 260 265 270 Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala 275 280 285 Leu Val Ser Ala Leu Gln Asn Gly Gly Thr Val Val Ser Arg Asp Pro 290 295 300 Phe Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp 305 310 315 320 Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gln Pro 325 330 335 Val Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu 340 345 350 Asn Asn Leu Ile Trp Ile His Glu His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Lys 355 360 365 Ile Leu Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Leu Asp Ile Arg Lys Arg Gly Leu 370 375 380 Arg Arg Gln Thr Gly Pro His Asn Ile Tyr Gln Ser Trp Lys Arg Leu 385 390 395 400 Asp

【００４６】配列番号２ 配列の長さ：1206 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 起源 生物名：テルモコッカス プロファンダス 株名：DT5432 配列 ATG GGA ATT AGG AAA ACT GCC GCG GTG CTG ATT GTG GTT CTG GTC GCG 48 CTG GGG ATC TCT GCG GTT CCT GCC GGC GCA GCC AAA TAC TCT AGC CTT 96 GAA GAC GGT GGC GTC ATA ATG CAG GCG TTC TAC TGG GAC GTC CCA GGT 144 GGC GCA ATA TGG TGG GAC ACC ATC AGG AGC AAG ATA CCC GAA TGG TAC 192 GAC GCA GGG ATA TCG GCG ATA TGG ATT CCC CCG GCC AGC AAG GGC ATG 240 AGC GGG AAT TCA TCA ATG GGC TAC GAT CCT TAC GAT TTC TTC GAT CTT 288 GGC GAA TAC TAC CAG AAG GGA ACC GTC GAG ACG CGC TTC GGC TCA AAA 336 CAG GAG CTT GTT GAC ATG ATA AAC ACC GCC CAC TCC TAC GGC ATA AAG 384 GTC ATA GCC GAC ATC GTC ATA AAC CAC CGC GCC GGC GGA GAC CTC GAG 432 TGG AAC CCC TTC GTC GGG GAC TAC ACC TGG ACG GAC TTC TCC AAA GTG 480 GCT TCA GGA AAG TAC ACT GCT AAC TAC GAG GAC TTC CAC CCC AAC GAG 528 GTC AAG TGC TGC GAC GAG GGC ACC TTC GGA GGC TTC CCC GAC ATA GCC 576 CAC GAG AAG AGC TGG GAC CAG TAC TGG CTC TGG GCG AGC GAC GAG AGC 624 TAC GCT GCC TAC CTC AGA AGC ATC GGC GTT GAC GCC TGG CGC TTC GAC 672 TAT GTC AAG GGC TAC GGA GCC TGG GTC GTC AAG GAC TGG CTG AGC TGG 720 TGG GGC GGC TGG GCC GTA GGT GAG TAC TGG GAC ACG AAC GTC GAT GCC 768 CTC CTC AGC TGG GCC TAC GAC AGC AAT GCC AAA GTC TTC GAC TTC CCG 816 CTC TAC TAC AAG ATG GAC GAG GCC TTC GAC AAC AAT AAC ATC CCC GCG 864 CTA GTC TCT GCA CTC CAG AAC GGG GGA ACC GTC GTC TCC CGC GAC CCA 912 TTT AAG GCG GTT ACC TTC GTC GCC AAT CAC GAC ACG GAC ATA ATC TGG 960 AAC AAG TAT CCG GCC TAC GCA TTC ATC CTC ACC TAC GAA GGC CAG CCG 1008 GTT ATA TTC TAC CGC GAT TAT GAA GAA TGG CTC AAC AAG GAC AGG CTC 1056 AAC AAC TTA ATC TGG ATA CAT GAA CAC CTC GCT GGG GGC AGT ACC AAG 1104 ATA CTC TAT TAC GAC AGC GAC GAG CTT GAT ATT CGA AAG AGA GGG CTA 1152 CGG CGA CAA ACC GGG CCT CAT AAC ATA TAT CAA TCT TGG AAG CGA CTG 1200 GAC TGA 1206

【００４７】配列番号３ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Lys Tyr Ser Ser Leu Glu Asp Gly Gly Val Ile Met Gln Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Trp Asp Val 20

【００４８】配列番号４ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 ATA ATG CAG GCG TTC TAC TGG GAC 24

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えプラスミドpTAMY830の制限酵素地図を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に配列番号１に示したアミノ酸配
   列を有するポリペプチドをコードする耐熱性アミラーゼ
   遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   請求項１記載の耐熱性アミラーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の耐熱性アミラー
   ゼ遺伝子を有する組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の組換えベクターにより
   形質転換された形質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地に培養
   し、培養物中に配列番号１に示したアミノ酸配列を有す
   るポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペ
   プチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの
   製造方法。