FR2778412A1 - Procede pour preparer une enzyme alpha-amylase thermophile et enzyme ainsi obtenue - Google Patents

Abstract

Procédé pour préparer une enzyme a-amylase à partir d'une souche archaebactérienne Thermococcus hydrothermalis (CNCM 1-1319), selon lequel on isole le gène codant pour cette a-amylase et on l'introduit dans une souche de bactérie de l'espèce E. coli.L'enzyme a-amylase produit par cette souche modifiée est thermophile.Application à l'industrie de l'amidon.

Description

La présente invention concerne un procédé pour préparer une enzyme a-

amylase thermophile a partir de la souche archaebactérienne thermophile

Thermococcus hydrothermalis (CNCM 1-1319) et 1' enzyme ainsi obtenue.

Les enzymes a-amylases sont utilisées pour la production de métabolites qui présentent de nombreuses applications industrielles aussi bien dans le domaine agro-alimentaire tel que par exemple en boulangerie pâtisserie, en alimentation diététique, en boissons, en confiserie, que hors de ce domaine tel que par exemple dans les colles et adhésifs, les détergents, la chimie, la pharmacie, la fonderie, etc... Mais une des utilisations les plus courantes des ca-amylases est leur emploi dans la dégradation de l'amidon en dextrines, cyclodextrines, maltodextrines, ou encore en maltose. Ces produits de dégradation peuvent ensuite entrer dans de nombreux procédés industriels comme par exemple dans la fabrication de nutriments, d'épaississants ou de stabilisants. Les produits issus de l'hydrolyse de I'amidon obtenus par l'action d'une ca-amylase peuvent être, à leur tour, transformés en d'autres molécules d'intérêt: par exemple le glucose peut être transformé en

fructose ou en sorbitol.

Certes, I'hydrolyse de l'amidon peut se faire chimiquement, mais actuellement celle-ci est réalisée par des procédés enzymatiques. La technique enzymatique a notamment pour avantage la production en moindre quantité de

produits indésirables que l'hydrolyse chimique.

Il doit être rappelé que l'amidon étant faiblement soluble à la température ambiante, il est difficilement attaquable par les a-amylases. Pour permettre une hydrolyse, ou liquéfaction, il est donc nécessaire de le solubiliser pour rendre les molécules d'amidon accessibles aux enzymes. Cette étape de solubilisation de

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l'amidon, aussi appelée gélatinisation, est réalisée a des températures d'au moins C et pouvant atteindre 100 C. Ce traitement thermique empêche aussi la contamination bactérienne. La liquéfaction de l'amidon par une a-amylase est donc réalisée à haute température et nécessite l'emploi d'enzymes actives aux températures élevées utilisées dans l'industrie de l'amidon. En outre, cette étape de liquéfaction est réalisée à un pH acide pour limiter la formation de produits indésirables tels que ceux obtenus si le pH est trop basique, notamment si cette étape est suivie d'une étape de saccharification pour

obtenir du glucose.

Du fait des conditions d'hydrolyse enzymatique de l'amidon, telles que décrites ci-dessus, on cherche à utiliser des a-amylases thermophiles et actives à

un pH acide pour réaliser la liquéfaction de l'amidon.

Actuellement les a-amylases utilisées proviennent de bactéries mésophiles dont un petit nombre possède une activité thermophile. On citera l'a-amylase de Bacillus liqueniformis (Termamyl, Novo Nordisk), I'a-amylase de Bacillus subtilis (Speedase, Nagase & CO Ltd). Celles-ci sont généralement actives à un pH

compris entre 6,0 et 6,5 c'est-à-dire trop peu acide.

On connaît également des micro-organismes thermophiles appartenant à la classe des archaebactéries qui sont doués d'activité amylolytique thermophile:

Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei, Thermococcus profundus.

L'utilisation de l'un ou l'autre des micro-organismes cités ci-dessus peut être une solution pour les industriels. Cependant leur culture est délicate (températures et pressions élevées, anaérobie, production de produits soufrés comme H2S,...) et, de plus, les quantités d'enzymes produites par ces micro-organismes sont

relativement faibles.

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Aussi un des buts de la présente invention est-il de fournir un procédé pour préparer une enzyme c-amylase thermophile qui est active à un pH relativement acide. Un autre but de l'invention est de fournir un tel procédé qui permet une production en quantité notable d'a-amylase. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par un procédé pour préparer une enzyme a-amylase thermophile à partir d'une souche archaebactérienne Thermococcus hydrothermalis (CNCM 1-1319), dont le gène a

été introduit par génie génétique dans le génome d'un micro-organisme mésophile.

o10 Il comprend les étapes suivantes: a) on prépare une sonde nucleotidique caractéristique du gène de l'ca-amylase de ladite souche Thermococcus hydrothermalis et nommée SA221-Dig., b) on digère l'ADN chromosomique de ladite souche Thermococcus hydrothermalis par une enzyme de restriction Eco RI, c) on détecte le gène codant pour ladite c-amylase par hybridation avec ladite sonde nucléotidique SA221- Dig., d) on récupère des fragments d'ADN par une électrophorèse et on les ligue dans le plasmide pKS-, e) on transforme une souche E. coli DH5cx par le milieu réactionnel de la ligation à I'aide de la méthode au CaCI2, f) on extrait les plasmides des bactéries et on récupère un plasmide renfermant le

gène codant pour l'cc-amylase dénommé pEAMY 101.

Avantageusement, on sous-clone un fragment Eco RI-Xba I contenu dans le plasmide pEAMY 101 et on le met sous la dépendance du promoteur lac du vecteur

pKS-, le nouveau plasmide ainsi obtenu étant dénommé p662EL100.

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De préférence, on utilise de manière usuelle une bactérie et on récupère à

partir du surnageant de la culture l'cz-amylase produite.

La présente invention est également relative à une enzyme ca-amylase

produite selon le procédé décrit ci-dessus.

Avantageusement, I'a-amylase est récupérée par expression des plasmides

pEAMY101 ou p662EL100 contenus dans la bactérie E. coli.

De préférence, cette enzyme présente une activité maximale pour un pH

compris entre 5,0 et 5,5 et une température comprise entre 75 C et 85 C.

Ne disposant d'aucun renseignement sur l'ca-amylase de la souche archaebactérienne Thermococcus hydrothermalis, cette enzyme n'étant pas purifiée à ce jour, en se basant sur les séquences des a-amylases disponibles et sur le fait que ces enzymes possèdent 4 régions consensus, il a fallu réaliser dans un premier temps une sonde nucléotidique spécifique du gène de l'a-amylase de la souche Thermococcus hydrothermalis. Cette sonde nucléotidique a été fabriquée en

utilisant la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) décrite ci-

dessous. Parmi les séquences consensus retrouvées chez les enzymes amylolytiques et plus particulièrement parmi les régions Il et IV, deux séquences en acides aminés ont été choisies: * la première SEQ.ID. N 1 présente les caractéristiques suivantes: Longueur: 6 Type: acides aminés Nombre de brins: simple Configuration linéaire

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Type de molécule: peptide et peut être représentée par la formule DG(L/W)R(I/F)D * la seconde SEQ.ID.N 2 présente les caractéristiques suivantes: Longueur: 6 Type: acides aminés Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Type de molécule: peptide et peut être représentée par la formule FY(Q/A)NHD Des oligonucléotides dégénérés ont été déduits à partir de ces séquences en acides aminés et synthétisés: * la première SEQ.ID.N 3 présente les caractéristiques suivantes: Longueur: 17 Type: acide nucléique Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Type de molécule: ADN synthétique et peut être représentée par la formule GAYGGNYKNM GNWTNGA * la seconde SEQ.ID.N 4 présente les caractéristiques suivantes: Longueur: 18 Type: acide nucléique Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Type de molécule: ADN synthétique et peut être représentée par la formule RTCRTGRTTN KSNACRAA

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Ces oligonucléotides dégénérés sont nommés AMYR2 et AMYR4 respectivement et servent d'amorces pour les expériences de PCR. Les conditions PCR sont les suivantes: ADN génomique de Thermococcus hydrothermalis 25 ng; amorces AMYR2 et AMYR4 100 pmoles chacune; MgCI2 250 pM; dNTPs 200 pM; Taq DNA polymérase (Proméga, France) 2U; volume réactionnel 100 pl. Le tampon d'amplification utilisé a été fourni par la société Proméga (France) avec l'enzyme Taq DNA polymérase. L'ADN archaebactérien est, dans un premier temps, dénaturé par incubation à 94 C pendant 10 minutes. L'enzyme Taq DNA polymérase est alors ajoutée au mélange réactionnel, puis l'ensemble est soumis à 30 cycles d'amplification en utilisant le DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Cetus). Un cycle d'amplification est composé d'une incubation de 1 minute à 94 C (étape de dénaturation), suivie d'une incubation de 1 minute à 54 C (étape

d'hybridation) et d'une incubation de 2 minutes à 72 C (étape de polymérisation).

Par cette méthode une partie de l'ADN chromosomique de la souche Thermococcus hydrothermalis a pu être amplifiée. La visualisation des résultats des expériences de PCR et la détermination de la taille des éventuelles amplifications sont réalisées en soumettant le milieu réactionnel à une électrophorése en gel d'agarose à 2 % [agarose 2 %; tampon TBE: Tris-borate 0,090 M; acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) 0,002 M (pH 8,2); Bromure d'éthidium 1 pg/I; 75 V; 1 h]. Un amplifiât ayant une taille de 221 paires de bases (pb) a ainsi été obtenu. Cet amplifiât a ensuite été récupéré du gel d'agarose par électroélution à l'aide de l'appareil HBS-Elutor (Biometra). Le morceau de gel d'agarose contenant l'ADN est placé dans une des cupules prévues à cet effet; puis la cupule est soumise à une électrophorèse pendant une heure sous une tension de 100 V.

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Sous l'effet du courant électrique, I'ADN sort de l'agarose et s'accumule dans le

fond de la cupule o on le récupère.

Pour pouvoir étudier cet amplifiât, il a fallu auparavant modifier cet ADN pour pouvoir le cloner. Les extrémités de ce fragment sont dans un premier temps rendues franches à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase d' E. col, puis ses extrémités 5'-OH sont phosphorylées à l'aide de l'enzyme T4 polynucléotide kinase. La ligation du fragment est réalisée en utilisant l'enzyme T4 DNA ligase. Toutes ces enzymes ont été fournies par la société Proméga (France)

et les manipulations ont été réalisées selon le protocole décrit par cette société.

Le fragment d'ADN ainsi modifié est clone dans le vecteur pBluescript Il KS-

(pKS-) (La Jolla, CA, USA) au niveau de son site Sma I. Le plasmide ainsi obtenu

est nommé pB2201.

L'insert du plasmide pB2201 (amplifiât obtenu par PCR) a été nommé SA221 et a été séquencé. Le séquençage a été réalisé avec un séquenceur automatique ABI model 377 (ABI-Perkin Elmer) en utilisant les primers universels du phage M13 marqués à la fluorescence. La DNA polymérase Ampli + Taq FS (ABI-Perkin Elmer) et la Thermosequenase (Amersham) ont été utilisées pour les cycles de

sequençages. Les produits PCR ont été purifiés sur colonne Quiawell 8 (Quiagen).

La séquence nucléotidique complète a été étudiée avec le Sequencer Package

(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml, ODA).

La séquence nucléotidique de l'amplifiât SA221, SEQ.ID.N 5, a pour caractéristiques Longueur: 221 Type: acide nucléique Nombre de brins: double

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Configuration: linéaire Type de molécule: amplifiât de PCR

et est représentée à la figure 1.

Pour vérifier que cette séquence nucléotidique a bien un rapport avec le gène recherché, il a été effectué des comparaisons avec les séquences déjà existantes dans la banque de données du National Center of Biotechnology

Information (NCBI, USA).

Les résultats de cette recherche d'homologie ont montré que le fragment d'ADN comportait des similitudes avec une partie du gène de l'ca-amylase de

Pyrococcus furiosus ainsi qu'avec une partie de deux gènes codant pour des a-

amylases d'orge. La séquence nucléotidique de l'amplifiât SA221 était cependant

différente des autres séquences déjà connues.

La déduction de la structure en acides aminés et la recherche d'homologie en acides animés, SEQ.ID.N 6, avec les séquences en acides aminés contenues dans la banque de données du NCBI ont également été réalisées. Cette séquence SEQ.ID.N 6, qui est représentée à la figure 2 a pour caractéristique: Longueur: 73 Type: acides animés Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Type de molécule: protéine On a ainsi obtenu une forte homologie entre cette séquence en acides

aminés déduite de l'amplifiât SA221 et différentes a-amylases archaebactériennes.

Ainsi, 94 % d'homologie ont été trouvés entre la séquence en acide aminé de SA221 et une partie de l'a-amylase de la souche Pyrococcus furiosus. Ce

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pourcentage d'homologie a atteint 96 % avec une partie de l'ca-amylase de la

souche Thermococcus profundus.

Les homologies obtenues au niveau des séquences en acides aminés ont permis de confirmer la manipulation précédente et leur hypothèse mais elles ont

s également permis de conclure que ce fragment d'ADN codait une partie d'une ca-

amylase d'origine archaebactérienne et que les résultats de PCR n'étaient pas dus

à une éventuelle contamination.

Les homologies précédemment obtenues permettent de conclure que le fragment SA221, fabriqué par amplification d'une partie de l'ADN chromosomal de

la souche Thermococcus hydrothermalis, est une partie d'un gène codant une a-

amylase. De ce fait le fragment SA221 est utilisé comme sonde pour rechercher le

gène codant l'oc-amylase de Thermococcus hydrothermalis.

Pour utiliser le fragment SA221 comme sonde, il faut, d'une part, I'obtenir en grande quantité et, d'autre part, le marquer, c'est-à-dire lui permettre de pouvoir être repéré, ces deux manipulations ayant pour but de rendre le repérage de la sonde SA221 plus sensible. Le marquage de la sonde est réalisé en greffant sur

celle-ci une molécule facilement détectable.

La production en grande quantité du fragment SA221 est réalisée à l'aide de nouvelles réaction de PCR, mais en utilisant le plasmide pB2201 comme ADN matrice en remplacement de l'ADN chromosomique de la souche Thermococcus hydrothermalis. Les amplifiâts ainsi obtenus sont ensuite marqués avec la digoxigenine-11-dUTP à l'aide du Kit Dig High Prime DNA Labeling (Boehringer Mannheim, France). Le marquage de ces amplifiâts et la quantification de ce marquage sont réalisés selon le protocole fourni par la Société Boehringer

Mannheim. La sonde marquée ainsi obtenue est nommée SA221-Dig.

l0 2778412 Selon le procédé de la présente invention, on digère l'ADN chromosomique de la souche Thermococcus hydrothermalis (CNCM 1-1319) par une enzyme de

restriction telle que Eco RI commercialisée par la société Boehringer Mannheim.

Les fragments d'ADN obtenus sont ensuite séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 0,8 % (poids/volume). Une partie du gel est conservée à 4 C pour récupérer ultérieurement des fragments d'intérêt, et l'autre partie de ce gel sert au transfert et à la fixation des fragments d'ADN sur une membrane de nylon telle que celle commercialisée par la société Amersham sous la marque Hybond-N+. Pour cela le gel d'agarose dans lequel sont séparés les fragments d'ADN, est immergé pendant 15 minutes dans une solution de dénaturation (NaCI 1,5 M et NaOH: 0,5

M) afin de dénaturer l'ADN.

Puis on immerge le gel dans une solution de neutralisation dont la composition est Tris-HCI 0,5 M (pH 7,5) et NaCI 1,5 M, à deux reprises pendant 15 minutes, puis une dernière fois pendant 30 minutes pour permettre de rééquilibrer le pH. L'ADN est ensuite transféré sur la membrane de nylon par capillarité à l'aide d'un tampon de transfert (pH 7) tel que celui à base de NaCI 3M et de citrate sodique 0,3 M. Après une nuit de transfert a température ambiante, la membrane de nylon est placée quelques minutes sur du papier Whatmann 3MM imbibé d'un tampon SSC 2X (pH 7) comprenant du NaCI 0,15 M et du citrate sodique 0,015 M. La fixation de l'ADN à la membrane de nylon est réalisée par exposition de cette dernière pendant 3 minutes à un rayonnement ultra- violet, puis par contact avec NaOH 0,4 M pendant 20 minutes. Puis la membrane de nylon est séchée à une

température de 37 C.

Cette membrane de nylon est ensuite hybridee avec la sonde nucléotidique SA221-Dig. Pour cela la membrane de nylon est pré-incubée à 47 C pendant 30 l l 2778412 minutes dans un tampon d'hybridation pré-chauffé à 47 C, tel que celui composé du tampon SSC 5X de N-laurylsarcosine 0,1 %, de sodium dodécylsulfate (SDS) 0,02 %, de formamide 50 % et d'une solution de blocage (blocking solution) commercialisée par la société Boehringer Mannheim. La membrane est ensuite mise à hybrider pendant 18 heures à 47 C dans le tampon d'hybridation contenant la sonde nucléotidique SA221-Dig. La révélation des bandes ayant hybride la sonde SA221-Dig. a été réalisée comme décrit dans le kit de la société Boehringer Mannheim. On a ainsi révélé un fragment de 4 kpb qui s'est hybride sur la sonde

nucleotidique.

La récupération des fragments correspondants est réalisée à partir de la portion du gel d'agarose non-traitée et conservée à 4 C. Pour cela il est nécessaire d'effectuer une électroélution comme précédemment décrit. Ces fragments sont ensuite ligués dans le plasmide pKS- au niveau du site de restriction Eco RI. La ligation de ces fragments dans le vecteur pKS- est réalisée avec l'enzyme T4 DNA Ligase (Proméga, France) avec un rapport fragment/vecteur de 20. Le milieu réactionnel de la ligation a ensuite été utilisé pour transformer la souche E.coli DH5a (Bethesda Research Laboratories, Gaithesburg, MD) à l'aide de la méthode au CaCI2 (Cohen et al., 1972). La souche Ecoli DH5(x a été choisie comme

réceptrice car elle ne possede pas la capacité d'hydrolyser l'amidon.

Les cellules ont ensuite été cultivées en milieu Luria-Bertani (milieu LB) préalablement additionné d'ampicilline (50 pg/ml). Le milieu LB était composé de

tryptone (10 g/l), d'extrait de levure (5 g/l) et de NaCI (5 g/l).

Les plasmides contenus par les bactéries sont ensuite extraits avec la méthode décrite par Holmes et Quigley (1981). Pour cela, les bactéries sont

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récupérées à partir de 5 ml de milieu LB additionné d'ampicilline par centrifugation (5000 g; 2 minutes; 4 C) et reprises dans du tampon STET [saccharose 8 %;' Triton X100 5 %; EDTA 50 mM.; Tris-HCI 50 mM. (pH 8, 0)] puis 25 pl d'une solution de lysozyme à 10 mg/ml ont été ajoutés. Après 5 minutes d'incubation à température ambiante, la préparation est ensuite incubée pendant 1 minute à C puis centrifugée (15000 g; 15 minutes; 4 C). Le surnageant obtenu est débarrassé des protéines par ajout d'un volume de phénol. Après centrifugation (5000 g; 5 minutes), la phase aqueuse est récupérée et un volume de chloroforme

y est ajouté pour éliminer les traces de phénol pouvant être restées présentes.

Après une nouvelle centrifugation réalisée dans les mêmes conditions que la précédente, la phase aqueuse obtenue est débarrassée des ARNs par un traitement à l'ARNase (ARNase 10 pg/ml; 60 minutes; 37 C). La fraction ainsi

obtenue contient les plasmides des bactéries étudiées.

Les plasmides renfermant le gène de l'a-amylase sont recherchés par hybridation avec la sonde SA221-Dig comme décrit auparavant après transfert et

fixation sur une membrane de nylon à l'aide de l'appareil Bio-Dot apparatus (Bio-

Rad, France).

Par cette technique on a isolé un plasmide qui s'est hydridé avec la sonde

SA221-Dig. Ce plasmide est nommé pEAMY101.

La souche E.coli DH5oc est de nouveau transformée par le plasmide pEAMY101 pour vérifier si la souche E.coli DH5a transformée est capable d'exprimer l'cc-amylase de la souche archaebactérienne Thermococcus hydrothermalis. Pour cela, on cultive la souche E.cofi DH5ca transformée par le plasmide pEAMY101 (E.coli(pEAMY101)) sur gélose à l'amidon [(tryptone 4g/l;

extrait de levure 2 g/I; NaCI 5 g/Il; amidon 1 %; ampicilline 50 pg/ml; isopropylthio-

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13-D-galactoside (IPTG) lmM.; agar-agar 10 g/lI]. Après 24 h d'incubation à 37 C pour permettre le développement des bactéries, les géloses sont incubées à 60 C pendant une nuit. A cette température les micro-organismes sont tués. Par contre les éventuelles enzymes amylolytiques thermophiles produites sont capables d'hydrolyser l'amidon contenu dans la gélose. Pour détecter l'hydrolyse de ce substrat, on a utilisé la technique basée sur l'utilisation de la solution de Lugol. Pour cela, une solution de Lugol [12 5 g/I; KI 10 g/l] a été déposée sur la gélose pour visualiser les zones d'hydrolyse de l'amidon. La souche E.coli DH5a a alors donné un faible halo de décoloration autour d'elle indiquant que cette souche Ecoli était capable d'exprimer le gène de l'cc-amylase de Thermococcus hydrothermalis, mais

à un faible niveau.

Pour augmenter la production de l'a-amylase thermophile, on a construit un autre plasmide, appelé p662EL100, dans lequel le fragment d'ADN archaebactérien codant l'ca-amylase a été mis sous la dépendance d'un promoteur fort, en lI'occurrence le promoteur de l'opéron lactose qui fait partie intégrante du vecteur pKS-. Pour cela, on a alors sous-cloné un fragment Eco RI-Xba I de 2,7 kpb contenu par l'insert du plasmide pEAMY101. Cette nouvelle construction a permis de retourner ce fragment d'ADN archaebactérien contenu dans le plasmide

pEAMY101 pour le mettre sous la dépendance du promoteur lac du vecteur pKS-.

Cette partie de l'insert du plasmide pEAMY101 est porteuse du gène de l'cc-amylase

de Thermococcus hydrothermalis.

La souche E. coli DH5ca a été transformée par le plasmide p662EL100 (E. coli (p662EL100)) et celle-ci a été testée sur gélose à l'amidon comme cela a été réalisé pour la souche E.coli (pEAMY101). La souche E.coli (p662EL100) a alors présenté un important halo de décoloration après révélation avec la solution de Lugol, ce qui indique que l'on a réussi a surexprimer l'a-amylase recombinante

issue de la souche Thermococcus hydrothermalis.

Le fragment contenu par le plasmide p662EL100 a alors été séquence par la Société Eurogentec (Seraing, Belgique). La séquence nucléotidique SEQ. ID.N 7 de son insert présente les caractéristiques suivantes: Longueur: 2705 Type: acide nucléique Nombre de brins: double Configuration: linéaire Type de molécule: ADN génomique

et est représentée à la figure 3.

Dans ce fragment on trouve une seule phase de lecture (ORF pour Open Reading Frame) de 1374 nucléotides, SEQ.ID.N"8, présentant les caractéristiques suivantes: Longueur: 1374 Type: acide nucléique Nombre de brins: double Configuration: linéaire Type de molécule: ADN génomique et est représentée à la figure 4, qui code une protéine de 457 acides aminés dont la séquence, SEQ.ID.N 9, présente les caractéristiques suivantes: Longueur: 457 Type: acides aminés Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Type de molécule: protéine

et est représentée à la figure 5.

Cette protéine a un poids moléculaire de 51543 Da (valeur calculée). Elle est constituée d'un peptide signal de 22 acides aminés, SEQ.ID.N 10, qui présente les caractéristiques suivantes: Longueur: 22 Type: acides aminés Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Type de molécule: peptide signal et est représentée par la formule MARKVLVALL VFLWLSVSA VP, et d'une protéine mature de 435 acides aminés, SEQ.ID.N 11, qui présente les caractéristiques suivantes: Longueur: 435 Type: acides aminés Nombre de brins: simple Configuration: linéaire Type de molécule: protéine et est représentée à la figure 6, et dont le poids moléculaire (valeur calculée) est de

49236 Da.

La souche E.coli transformée par le plasmide p662EL100 a été cultivée en milieu LB additionné d'ampicilline (50 pg/ml) ainsi que d'IPTG (1 mM en final) qui est un inducteur du promoteur de l'opéron lactose, ce qui va favoriser l'expression de l'cL-amylase recombinante. Le surnageant de culture a été récupéré par centrifugation (8000 g; 10 minutes) et concentré 100 fois à l'aide d'une unité Amicon et d'une membrane de type YM ayant un seuil de coupure de 10 kDa (Amicon, France). Les bactéries ont été également récupérées par centrifugation (8000 g; 10 minutes; 4 C), reprises avec un centième du volume initial dans de l'eau distillée et soniquées. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation (10000 g; 30 minutes. 4 C) et le surnageant obtenu sert d'extrait cellulaire. Les deux préparations (surnageant et extrait cellulaire) sont utilisées pour tenter de localiser l'activité a- amylasique recombinante. Ceci a été réalisé par la technique du zymogramme. Cette technique est une électrophoprèse en gel d'acrylamide dans lequel le substrat de l'enzyme étudiée est inclus et qui est réalisée dans des conditions non-dénaturantes pour permettre le maintien de l'activité enzymatique recherchée. Le gel de séparation est constitué d'acrylamide (8 %), d'amidon (0,1 %) et de tampon Tris-HCI 1,5M. (pH 8, 8). Après électrophorèse à 4 C, le gel est ramené à pH 5,5 par bains successifs d'acide maléique 0,1% et de tampon phosphate 0,1M. (pH 5,5). Ces opérations ont pour but de ramener le pH du gel à une valeur compatible avec l'activité a-amylasique étudiée. Le gel est ensuite incubé pendant 2 heures à 80 C et une solution de Lugol est versée dessus par la suite pour identifier les zones d'activités amylolytiques thermophiles. Par cette technique on a pu montrer que si la majeure partie de l'activité cx-amylasique était retrouvée dans l'extrait cellulaire, cette activité était également retrouvée dans le surnageant de culture, ce qui indique que l'enzyme

recombinante est sécrétée par la colonie E.coli (p662EL100).

Le fait que l'enzyme soit sécrétée est important pour sa production à l'échelle industrielle. Ceci permet une récupération aisée de cette enzyme car elle est retrouvée dans le milieu de culture. D'autre part ceci permet d'avoir une préparation enzymatique plus facile à purifier que si elle était uniquement localisée dans le cytoplasme. Ceci est dû à la présence moindre de protéines et d'activités enzymatiques indésirables dans le surnageant de culture par comparaison avec le

milieu intracellulaire.

Pour vérifier si l'c-amylase recombinante possède des propriétés physico-

chimiques intéressantes, on étudie son activité en fonction du pH et de la température. Pour réaliser ce travail, différents tampons sont utilisés et permettent une étude sur une large gamme de pH allant de 3,0 à 8,0. Les tampons utilisés sont le tampon citrate-phosphate [acide citrique 0,05 M; phosphate de sodium dibasique 0,1 M.] pour les pH de 3, 0 à 7,0 et le tampon phosphate [phosphate de sodium monobasique 0,1 M; phosphate de sodium dibasique 0,1 M] pour les pH de 5,5 à 8,0. Les réactions ont été réalisées à 800C (température optimale de croissance de la souche Thermococcus hydrothermalis). Le milieu réactionnel (500 pl) est constitué d'amidon à 1 %, de 125 pl de solution enzymatique brute (surnageant de culture en milieu LB additionné d'ampicilline (50 pg/ml) et d'IPTG (1 mM) concentré fois) et de tampon au pH étudié. Les incubations ont duré 15 minutes, puis après refroidissement dans de la glace fondante, les sucres réducteurs formés sont dosés par la méthode à l'acide parahydroxybenzoate d'hydrazide (Lever, 1972). Le calcul des sucres réducteurs produits par l'action de l'enzyme recombinante selon la présente invention sur l'amidonest réalisé en retranchant a l'essai d'hydrolyse réalisé les valeurs de deux essais témoins: un témoin enzyme (réaction réalisée

sans amidon) et un témoin substrat (réaction réalisée sans solution enzymatique).

Les résultats ont montré que l'optimum de pH est compris entre 5,0 et 5, 5

(figure 7).

Pour déterminer la température à laquelle une activité optimale est obtenue,

on utilise des milieux réactionnels de 500 pl comme cela est décrit précédemment.

Le pH d'étude choisi découle des résultats précédents et est pH 5,0. Ces milieux sont incubés à des températures variant de 40 C à 120 C. La durée des incubations est de 15 minutes et les sucres réducteurs formés sont calculés comme

précédemment décrit.

Cette expérience a montré que l'activité maximale est obtenue pour des

températures comprises entre 75 C et 85 C (figure 8).

De même, les expériences de culture en milieu liquide de la colonie E. coli

(p662EL100) montrent que cette activité peut avoir lieu à 37 C.

Claims (6)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour préparer une enzyme ca-amylase thermophile à partir d'une souche archaebactérienne Thermococcus hydrothermalis (CNCM 1-1319), dont le gène a été introduit par génie génétique dans le génome d'un micro-organisme s mésophile, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes: a) on prépare une sonde nucléotidique caractéristique du gène de l'ca-amylase de ladite souche Thermococcus hydrothermalis et nommée SA221-Dig., b) on digère l'ADN chromosomique de ladite souche Thermococcus hydrothermalis par une enzyme de restriction Eco RI, c) on détecte le gène codant pour ladite cL-amylase par hybridation avec ladite souche nucléotidique SA221-Dig., d) on effectue une électrophorèse afin de récupérer des fragments d'ADN et on la ligue dans le plasmide pKS-, e) on transforme une souche E. Coli DH5a( par le milieu réactionnel de la ligation à I'aide de la méthode au CaCI2, f) on extrait les plasmides des bactéries et on récupère un plasmide renfermant le

gène codant pour l'ca-amylase dénommé pEAMY101.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on sous-

clone un fragment Eco RI-Xbal contenu par l'extrait du plasmide pEAMY 101 et on le met sous la dépendance du promoteur lac du vecteur pKS-, le nouveau plasmide

ainsi obtenu étant dénommé p662EL100.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que

l'on utilise de manière usuelle une bactérie et en ce que l'on récupère à partir du

surnageant de la culture l'a.-amylase produite.

4. Enzyme a-amylase, caractérisée par le fait qu'elle est obtenue par le

procédé selon l'une des revendications 1 à 3.

5. Enzyme c-amylase selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle est récupérée par expression des plasmides pEAMY101 et p662EL100 contenus

dans la bactérie E. coli.

6. Enzyme cc-amylase selon les revendications 4 et 5, caractérisée par le fait

que son activité est maximale pour un pH compris entre 5,0 et 5,5 et une

température comprise entre 75 C et 85 C.