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Pullulanase, microorganismes la produisant, procédés de préparation de cette pullulanase, utilisations et compositions comprenant celle-ci
L'invention concerne une nouvelle pullulanase. L'invention concerne également des souches de microorganismes produisant cette pullulanase et les procédés de préparation de cette pullulanase. L'invention concerne également les utilisations et les compositions comprenant celle-ci.
L'amidon, dont les constituants essentiels sont l'amylose et l'amylopectine, peut être converti en sucres simples par un procédé enzymatique réalisé en deux étapes : une étape de liquéfaction de l'amidon et une étape de saccharification de l'amidon liquéfié. Lors de l'étape de liquéfaction, l'amidon est dégradé en maltodextrines par un traitement de courte durée à haute température à pH neutre en présence d'une a-amylase thermostable.
L'oc-amylase n'hydrolyse pratiquement pas les liaisons glucosidiques K-1, 6, les liaisons de ce type présentes dans l'amylopectine restent intactes au cours de l'étape de liquéfaction de l'amidon. Lors de l'étape de saccharification l'amidon liquéfié est dégradé par un traitement à une température d'environ 60 C et à un pH compris entre environ 4 et 5 en présence d'une glucoamylase. Cette étape de saccharification dure en général de 40 à 60 heures.
La glucoamylase dégrade les polysaccharides composant les maltodextrines produites à l'étape précédente, principalement en catalysant l'enlèvement séquentiel des unités monomériques de glucose à partir de l'extrémité non-réductrice, essentiellement par hydrolyse des liaisons glucosidiques < x-l, 4 ; elle est également capable d'hydrolyser les liaisons glucosidiques oc-1, 6 mais à une vitesse nettement plus faible. De plus, lorsque des concentrations élevées de dextrose sont atteintes dans le milieu de saccharification, la glucoamylase catalyse la réaction inverse, c'est-à-dire la synthèse, à partir de glucose, d'oligosaccharides contenant des liaisons ci-1, 6. Tous ces faits limitent le taux de conversion de l'amidon.
En vue de remédier à ces inconvénients
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et d'atteindre un taux de conversion élevé de l'amidon, il a déjà été proposé d'ajouter lors de la saccharification de l'amidon liquéfié une enzyme hydrolysant les liaisons glucosidiques a-1, 6, comme par exemple une pullulanase.
Dans le brevet européen 0 063 909, on décrit une enzyme dite débranchante, c'est-à-dire capable d'hydrolyser les liaisons glucosidiques < x-l, 6 dans l'amylopectine, qui présente une activité pullulanase et possède un optimum d'activité à un pH de 4-5 à 60 C. Cette enzyme qui dérive d'une souche de Bacillus acidopullulyticus est mise sur le marché par la société NOVO NORDISK sous la marque PROMOZYME.
Par ailleurs, dans le brevet Etats-Unis 5,055, 403, on a proposé une pullulanase présentant une activité enzymatique en milieu acide et dérivée d'une souche de Bacillus naganoensis.
Cette enzyme présente un maximum d'activité à un pH d'environ 5
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mesurée à 60 C et un maximum d'activité à une température d'environ 62, 5 OC mesurée à un pH de 4, 5.
Quoiqu'actives à pH acide et à une température d'environ 60 C et dès lors utilisables lors de la saccharification de l'amidon liquéfié, les pullulanases de l'art antérieur présentent l'inconvénient d'être très peu stables dans de telles conditions de température et de pH, leur durée de demi-vie à une température de 60 C et à un pH d'environ 4,5 en l'absence de substrat ne dépassant pas quelques dizaines de minutes.
La présente invention a pour but de fournir une nouvelle pullulanase, active à pH acide, présentant une thermostabilité à pH acide très largement supérieure à celle des pullulanases de l'art antérieur et une durée de demi-vie de plusieurs heures sous ces conditions précitées.
A cet effet l'invention concerne une pullulanase, thermostable et active à pH acide, capable d'hydrolyser les liaisons glucosidiques de type a-1, 6 dans l'amylopectine, ayant un point isoélectrique d'environ 4,5 et une durée de demi-vie d'environ 55 heures mesurée à une température d'environ 60 C dans une solution tamponnée à un pH d'environ 4,5 et en l'absence de substrat.
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Cela signifie que la pullulanase de l'invention montre une activité enzymatique relative d'au moins 50 % mesurée après une incubation de 55 heures à une température d'environ 60 C dans une solution tamponnée à un pH d'environ 4,5 et en l'absence de substrat.
Par activité enzymatique relative, on entend le rapport entre l'activité enzymatique, mesurée au cours d'un essai réalisé dans des conditions données de pH, température, substrat et durée, et l'activité enzymatique maximale mesurée au cours de ce même essai, l'activité enzymatique étant mesurée à partir de l'hydrolyse du pullulane et l'activité enzymatique maximale étant fixée arbitrairement à la valeur de 100.
La pullulanase selon l'invention est thermostable à pH acide, comme il apparaît à la figure 1 qui représente l'évolution de l'activité enzymatique relative de la pullulanase en fonction du temps d'incubation, l'incubation étant réalisée à une température de 60 OC et à un pH de 4,5, l'activité enzymatique maximale étant l'activité initiale dans ce cas. En effet, la pullulanase selon l'invention montre une activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 40 heures à une température de 60 OC dans une solution tamponnée à un pH d'environ 4,5 et en l'absence de substrat. Elle montre une activité enzymatique relative d'au moins 70 X mesurée après une incubation de 24 heures sous ces mêmes conditions.
La pullulanase selon l'invention est par ailleurs stable dans une large gamme de pH acides, comme il apparaît à la figure 2 qui représente l'évolution de l'activité enzymatique relative de la pullulanase en fonction du pH d'incubation, l'incubation étant réalisée à une température de 60 C durant 60 minutes, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à un pH de 4,5. En effet, la pullulanase selon l'invention montre une activité enzymatique relative d'au moins 85 % mesurée après une incubation de 60 minutes à une température d'environ 60 C en l'absence de substrat et dans une gamme de pH compris entre environ 3,5 et environ 5,8.
Elle montre une activité enzymatique relative supérieure à 90 % mesurée dans une gamme de pH compris entre environ
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3,8 et environ 5 sous ces mêmes conditions. Sous ces mêmes conditions, elle n'est totalement inactivée qu'à un pH inférieur ou égal à 3 ou supérieur ou égal à 7.
La pullulanase selon l'invention est active dans une large gamme de température et de pH comme il apparaît à la figure 3 qui représente l'évolution de l'activité enzymatique relative de la pullulanase en fonction du pH et de la température, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à un pH de 4,3 et à une température de 60 C.
La pullulanase selon l'invention présente une activité enzymatique optimale mesurée à une température d'environ 60 OC dans une gamme de pH comprise entre 4,0 et 4,8.
La pullulanase selon l'invention présente par ailleurs une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH d'environ 4,3, dans une gamme de température comprise entre 55 et 65 C.
La pullulanase selon l'invention développe une activité enzymatique de plus de 80 % de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 3,8 et environ 4,9 pour une température d'environ 60 C, l'activité enzymatique maximale étant mesurée à une température de 60 C et à un pH de 4,3.
Le poids moléculaire de la pullulanase selon l'invention est d'environ 100 ( 10) kDa.
La pullulanase selon l'invention est constituée d'un seul type de polypeptide.
La pullulanase selon l'invention est capable de catalyser l'hydrolyse des liaisons glucosidiques a-1, 6 présentes aussi bien dans l'amylopectine que dans le pullulane. C'est donc une enzyme dite déramifiante ou débranchante. La pullulanase selon l'invention dégrade le pullulane en maltotriose et l'amylopectine en amylose. La pullulanase selon l'invention possède par ailleurs toutes les propriétés adéquates compatibles avec les conditions industrielles réelles de saccharification de l'amidon. Ces propriétés sont un optimum de pH inférieur à 5, un optimum de température aux alentours de 60 OC et une bonne stabilité de l'enzyme dans ces conditions de pH acide et de température
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élevée. Le milieu acide est imposé par l'utilisation simultanée de la glucoamylase et de la pullulanase lors de la saccharification industrielle de l'amidon.
En effet la glucoamylase utilisée pour la saccharification de l'amidon est généralement produite par un champignon et notamment par une souche d'Aspergillus, tel que Aspergillus niger, Aspergillus awamori ou Aspergillus foetidus. Les conditions idéales adaptées à la saccharification d'amidon liquéfié en présence d'une glucoamylase sont une température d'environ 60 C et un pH d'environ 4,0 à 4,5.
Ceci est notamment le cas pour la glucoamylase vendue sous les marques DIAZYKE L-200 et OPTIDEX par SOLVAY ENZYMES. Par ailleurs l'étape de saccharification dure plusieurs heures, en général de 40 à 60 heures, il est essentiel que les enzymes utilisées soient stables, actives et efficaces tout au long de cette étape, ces enzymes doivent donc présenter une thermostabilité élevée en milieu acide et une durée de demi-vie la plus longue possible. C'est pourquoi la pullulanase de la présente invention est plus efficace que les pullulanases connues.
La présente invention concerne également les bactéries aérobies produisant la pullulanase selon l'invention. Généralement elles appartiennent à la famille des Bacillaceae. De préférence elles appartiennent au genre Bacillus. De bons résultats ont été obtenus avec la souche de Bacillus deramificans LMG P-13056 ou un dérivé de cette souche.
La souche de Bacillus deramificans LMG P-13056 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS 0F MICROORGANISMS (LMG culture collection, Université de Gand, Belgique) conformément au Traité de Budapest.
La souche de la présente invention a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques : bactérie Gram positif, aérobe qui se présente sous le forme de bâtonnet, elle forme une endo-spore.
Par dérivé de cette souche, on entend toute bactérie modifiée naturellement ou artificiellement. Les dérivés de cette souche peuvent être obtenus par les techniques connues de modification telles que rayonnement ultra-violet, rayons X, agents mutagènes ou génie génétique.
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La présente invention concerne également des souches recombinantes dans lesquelles le gène codant pour la pullulanase selon l'invention est introduit par les techniques de génie génétique.
Le gène peut être introduit sur un plasmide ou intégré dans le chromosome de l'hôte en une ou plusieurs copies, le promoteur peut être modifié ou remplacé par un autre promoteur mieux adapté à l'hôte récepteur, le gène lui-même peut être modifié de façon à produire une pullulanase mutante.
L'invention concerne également les souches de microorganismes différentes de l'organisme producteur de départ, dans lesquelles le gène codant pour la pullulanase est introduit par transformation, soit sous forme intégrée dans l'ADN chromosomique, soit sous forme autoréplicative (plasmide).
La présente invention concerne également un procédé pour la production d'une pullulanase comprenant la culture d'une bactérie aérobie capable de produire la pullulanase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose et la récolte de la pullulanase ainsi obtenue.
La présente invention concerne également un procédé pour la production d'une pullulanase comprenant la culture de la souche de Bacillus deramificans LMG P-13056 ou un dérivé de cette souche capable de produire la pullulanase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose et la récolte de la pullulanase ainsi obtenue.
Les conditions de culture de ces bactéries telles que composants du milieu de culture, paramètres de culture, température, pH, aération, agitation, sont bien connues de l'homme du métier.
Les sources de carbone du milieu de culture sont habituellement choisies parmi l'amidon, l'amidon partiellement hydrolysé, l'amidon soluble, des oligosaccharides, le glucose, l'amylose, l'amylopectine ou un mélange de deux ou plusieurs de ceux-ci.
Les sources d'azote du milieu de culture sont habituellement choisies parmi l'extrait de levure, la farine de soja, la farine
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de graines de cotton, la farine de poisson, la gélatine, la farine de pomme de terre ou un mélange de deux ou plusieurs de ceux-ci. Les sels minéraux du milieu de culture sont généralement choisis pour les anions parmi chlorure, carbonate, phosphate, sulfate et pour les cations parmi potassium, sodium, ammonium, magnésium, calcium ou un mélange de deux ou plusieurs de ceux-ci.
La culture est généralement conduite à une température comprise entre 20 et 45 C et de préférence entre 25 et 40 OC.
La culture est généralement conduite à un pH compris entre 3,5 et 6 et de préférence entre 4 et 6.
La culture est conduite sous condition d'aérobiose en présence d'air ou d'oxygène et sous agitation.
Les techniques de récolte de la pullulanase produite sont bien connues de l'homme du métier. Habituellement, on emploie la centrifugation, l'ultrafiltration, l'évaporation, la précipitation, la filtration, la microfiltration,. la cristallisation ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques telle qu'une centrifugation suivie d'une ultrafiltration.
La pullulanase peut ensuite être purifiée, si nécessaire, des techniques de purification d'enzymes sont connues de l'homme du métier.
La pullulanase peut également être séchée par atomisation ou lyophilisation.
L'invention concerne également une pullulanase mutée obtenue par modification de la séquence de nucléotides du gène qui code pour la pullulanase définie ci-dessus.
L'invention concerne également un procédé pour la préparation d'une pullulanase recombinante, le procédé comprenant l'isolement d'un fragment d'ADN codant pour la pullulanase, l'insertion de ce fragment d'ADN dans un vecteur approprié, l'introduction de ce vecteur dans un hôte approprié ou l'introduction de ce fragment d'ADN dans le chromosome d'un hôte approprié, la culture de cet hôte, l'expression de la pullulanase et la récolte de la pullulanase. L'hôte approprié est choisi généralement parmi le groupe constitué des microorganismes
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Escherichia coli, Bacillus ou Aspergillus. Habituellement l'hôte est choisi parmi les Bacillus.
De préférence l'hôte est choisi parmi les microorganismes Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus alcalophilus, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens ou Bacillus deramificans LMG P-13056.
La pullulanase selon l'invention a des débouchés multiples dans diverses industries, telles que, par exemples, les industries alimentaires, les industries pharmaceutiques ou les industries chimiques.
La pullulanase peut notamment être utilisée en boulangerie comme "anti-staling", c'est-à-dire comme additif pour éviter au pain de rassir au cours de sa conservation ou en brasserie au cours de la fabrication de bières à faible teneur en calories.
La pullulanase peut également être utilisée lors de la préparation d'aliments à faible teneur en calories dans lesquels l'amylose est utilisé comme substitut des matières grasses.
Pour les applications alimentaires, la pullulanase peut être immobilisée sur un support. Les techniques d'immobilisation d'enzymes sont bien connues de l'homme du métier.
La pullulanase selon l'invention convient particulièrement bien pour le traitement de l'amidon et du pullulane.
L'invention concerne l'utilisation de la pullulanase pour la saccharification de l'amidon liquéfié.
La présente invention concerne également l'utilisation de la pullulanase lors d'un procédé de dégradation d'amidon ou d'amidon partiellement hydrolysé comprenant une étape de saccharification de l'amidon ou de l'amidon partiellement hydrolysé en présence d'une pullulanase. Généralement ce procédé est effectué en présence d'une ou de plusieurs autres enzymes telles que glucoamylase, a-amylase, P-amylase, a-glucosidase ou d'autres enzymes saccharifiantes.
Etant donné ses propriétés biochimiques, la pullulanase de la présente invention permet d'effectuer l'étape de saccharification dans des conditions fortement acides, c'est-à-dire jusqu'à au moins un pH de 3,9. Ce pH est plus acide que celui acceptable par les pullulanases connues.
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La présente invention concerne également des compositions enzymatiques comprenant la pullulanase selon l'invention.
Les compositions comprenant la pullulanase de la présente invention peuvent être utilisées sous forme solide ou liquide.
La pullulanase est formulée selon les utilisations prévues.
Des stabilisants ou des agents de conservation peuvent également être ajoutés aux compositions enzymatiques comprenant la pullulanase selon l'invention. Par exemple on peut stabiliser la pullulanase par l'addition de propylène glycol, d'éthylène glycol, de glycérol, d'amidon, de pullulane, d'un sucre tel que du glucose, d'un sel tel que le chlorure de sodium ou d'un mélange de deux ou plusieurs de ces produits.
Les compositions enzymatiques, selon l'invention, peuvent également comprendre, en plus de la pullulanase, une ou plusieurs autres enzymes. De telles enzymes sont notamment des hydrolases d'hydrates de carbone, comme, par exemples, les glucoamylase, a-amylase, 0-amylase, < x-glucosidase, isoamylase, cyclomaltodextrin-glucotransférase, p-glucanase, a-glucosidase, glucoseisomérase, des enzymes saccharifiantes, des enzymes qui coupent les liens glucosidiques ou un mélange de deux ou plusieurs de celles-ci.
La présente invention concerne de préférence une composition enzymatique comprenant une glucoamylase et une pullulanase.
La figure 1 représente l'activité enzymatique relative de la pullulanase en fonction du temps d'incubation, pour une incubation réalisée à une température de 60 C et à un pH de 4,5.
La figure 2 représente l'activité enzymatique relative de la pullulanase en fonction du pH d'incubation, pour une incubation réalisée à une température de 60 C durant 60 minutes.
La figure 3 représente l'évolution de l'activité enzymatique relative de la pullulanase en fonction du pH et de la température.
La figure 4 représente la carte de restriction du plasmide pBRDEBRA 3.
La figure 5 représente la carte de restriction du plasmide pUBC131.
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La figure 6 représente la carte de restriction du plasmide pUBCDEBRA1.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
Exemple 1
La souche de Bacillus deramificans LMG P-13056 a été isolée du sol sur un milieu nutritif gélosé et selectionnée pour sa capacité de dégrader un dérivé coloré du pullulane connu sous le nom de l'AZCL-pullulane et vendu sous la marque MEGAZYME.
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Cette souche a été mise en culture à 37 C dans le milieu de croissance MYE dont la composition est la suivante : MYE : H2P04 33 mM KHPOHO 6 mM (NH4) 2SO4 45 mM MgCl2. 6H20 1 mM CaCl2. 2H20 1 mM Extrait de levure 0, 5 %
Glucose 0,5 %
Le pH du milieu est ajusté à pH 4,5 avec H3P04
Le milieu gélosé (MYE/agar) contient 2 % agar en plus.
La souche de la présente invention a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques : bactérie Gram positif, aérobe qui se présente sous le forme de bâtonnet, elle forme une endo-spore.
Elle appartient donc au genre Bacillus.
Les cellules végétatives de cette souche en culture sur le
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milieu MYE à 37 Oc ont une forme de bacille de taille 0, 7 x 3, 0-3, 5 um. La mobilité des cellules végétatives est faible.
Après une croissance de trois jours à 37 oc sur le milieu MYE, l'observation microscopique révèle la présence de sporanges (sub) terminales légèrement déformées et en forme d'ellipse.
Le test de la catalase est faiblement positif en présence de 10 X de peroxyde d'hydrogène. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 % de tétraméthyl-1, 4-phénylènediammoniumdichlorure.
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Cette souche ne se développe pas en anaérobiose, c'est-àdire sous une atmosphère de 84 % N2'8 % C02'8 % H2 à 37 C, par contre elle se développe en microanaérobiose, c'est-à-dire sous une atmosphère de 82. 5 % N2'6 % 02, 7. 5 % H2'4 % C02 à 37 OC.
Cette souche présente un développement normal après incu- bation en milieu MYE à 20 C, 30 C, 37 C et 45 C, par contre elle ne se développe pas à 50 C et 55 C. Elle présente un développement normal après incubation en milieu MYE tamponné avec le tampon phosphate aux pH suivants pH 4,0, pH 4,5, pH 5,0 et pH 5,5, par contre elle ne se développe pas à pH 7,0. Elle présente un développement normal après incubation en milieu MYE en présence de NaCl aux concentrations de 2,0 % et 3,5 X, présente
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un développement faible en présence de 5, 0 % de NaCl et ne se développe pas en présence de 7, 0 % de NaCl.
Cette souche n'hydrolyse pas la caséine : en effet aucune zone de lyse n'a pu être observée après plus de 2 semaines d'incubation à 37 C. Elle décompose la tyrosine faiblement, ne produit pas d'acétoine à partir de pyruvate et ne réduit pas le nitrate en nitrite ou en N2.
La souche de Bacillus deramificans LMG P-13056 selon l'invention est taxonomiquement différente de la souche de Bacillus acidopullulyticus décrite dans le brevet européen 0 063 909 et de la souche de Bacillus naganoensis décrite dans le brevet U. S. 5,055, 403. Certaines caractéristiques biochimiques décrites dans ces brevets sont rassemblées dans le tableau 1 à titre de comparaison.
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TABLEAU 1
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<tb>
<tb> Test <SEP> B. <SEP> acidopul-B. <SEP> naganoensis <SEP> B.
<SEP> deralulyticus <SEP> mificans
<tb> Croissance <SEP> à <SEP> pH <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 4,7-5, <SEP> 5
<tb> Croissance <SEP> à <SEP> pH <SEP> nd <SEP> nd
<tb> 7,0
<tb> Croissance <SEP> dans-nd <SEP> +
<tb> 3,5 <SEP> % <SEP> NaCl
<tb> Décomposition <SEP> de <SEP> - <SEP> - <SEP> +
<tb> tyrosine
<tb> Réduction <SEP> du
<tb> nitrate <SEP> en <SEP> nitrite <SEP> +--
<tb>
+ représente une réponse positive au test,-représente une réponse négative au test, nd signifie que le test n'a pas été décrit dans le brevet sous référence.
Exemple 2
La souche de Bacillus deramificans LMG P-13056 est mise en culture dans un milieu (MYA) liquide dont la composition est la suivante :
KH2PO4 33 mM K2HP04. 3H20 6 mM (NH4) 2SO4 45 mM
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MgCl2. 6H20 1 mM CaCl2. 2H20 1 mM Extrait de levure 2, 5 % Amidon de pomme de terre 2, 5 % Le pH du milieu est ajusté à pH 4,5 avec H3P04. La culture est réalisée sous agitation, avec une aération
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efficace, à une température de 37 C.
Après 68 heures de culture, on sépare la pullulanase et la biomasse cellulaire par centrifugation, la pullulanase produite par la souche de Bacillus deramificans LMG P-13056 est extracellulaire.
Puis on concentre la pullulanase par ultrafiltration, en vue d'obtenir une solution aqueuse concentrée de pullulanase.
On mesure l'activité enzymatique de la solution obtenue.
Une unité enzymatique de la pullulanase (PUN) est définie comme la quantité d'enzyme qui, à un pH de 4,5, à une température
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de 60 OC et en présence de pullulane, catalyse la libération de sucres réducteurs à raison de 1 uM d'équivalent glucose par minute.
La mesure de l'activité enzymatique pullulanase est réalisée selon le protocole suivant. 1 ml d'une solution de pullulane à 1 X dans un tampon acétate 50 mM à pH 4,5 est incubée à 60 C pendant 10 minutes. 0,1 ml d'une solution de pullulanase correspondant à une activité comprise entre 0,2 et 1 PUN/ml y est ajoutée. La réaction est stoppée après 15 minutes par addition de 0,4 ml de Na0H 0,5 M. Le dosage des sucres réducteurs libérés se fait par la méthode de SOMOGYI-NELSON (J. Biol. Chem. 153 (1944) 375-380 ; J. Biol. Chem. 160 (1945) 61-68).
Une deuxième méthode est utilisée pour effectuer les dosages de la pullulanase. La réaction enzymatique en présence de pullulane est effectuée selon les conditions de l'essai, puis est arrêtée par l'addition d'acide sulfurique (0,1 N). Les produits d'hydrolyse du pullulane sont ensuite soumis à une chromatographie HPLC (colonne HPX-87H de BIO-RAD ; la phase mobile est constituée de H2S04 10 mM) afin de séparer les différents constituants. La quantité de maltotriose formé est estimée par mesure de la surface du pic obtenu.
L'activité dite débranchante, c'est-à-dire l'hydrolyse des liaisons glucosidiques oc-1, 6 présentes dans l'amylopectine, peut être quantifiée par l'augmentation de la coloration bleue provoquée, en présence d'iode, par la libération d'amylose à partir d'amylopectine.
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La mesure de l'activité enzymatique débranchante est réalisée selon le protocole suivant. 0,4 ml d'une solution
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d'amylopectine à 1 X contenant un tampon acétate 50 mM à pH 4, 5 est incubée à 60 OC pendant 10 minutes. La réaction est démarrée par l'addition de 0,2 ml de pullulanase et elle est arrêtée après 30 minutes par addition de 0,4 ml d'HCl 0,3 M. 0,8 ml d'une solution d'iode à 0,0025 X est ensuite ajoutée à 0,2 ml de ce mélange réactionnel et la densité optique est mesurée à 565 nm.
En vue de purifier la pullulanase, on diafiltre la solution aqueuse concentrée de pullulanase par 6 fois 500 ml d'une solution de NaCl à 9 g/l et on ajuste le pH de la solution aqueuse, ainsi obtenue, à pH 3,5 par addition d'HCl 25 % à température ambiante.
Le précipité obtenu est éliminé par centrifugation, on récupère le surnageant de centrifugation. Le pH de ce surnageant est ajusté à pH 6,0 par addition de NaOH 5 M. Le précipité obtenu est éliminé par centrifugation.
On récupère le surnageant de centrifugation, que l'on chauffe jusqu'à 55 OC pendant 15 minutes.
Le précipité formé est à nouveau éliminé par centrifugation.
On récupère le surnageant de centrifugation.
On ajoute à ce surnageant de l'acétone à une concentration finale de 60 Z, la suspension formée est mise à 4 C durant 2 heures. Le précipité formé à 4 OC est mis en solution dans un tampon MES (acide 2 (N-morpholino) éthanesulfonique) 20 mM, CaCl2 1mM (pH 6,0). Cette solution de pullulanase est nommée solution A.
On purifie de nouveau cette solution A par chromatographie d'échange ionique. Une colonne d'environ 20 ml de volume interne, vendue sous la marque S-SEPHAROSE HP HI LOAD 16/10 par la société PHARMACIA, est préalablement équilibrée par un tampon CHgCOONa 50 mM, NaCl 100 mM (pH 4,0) à un débit de 5 ml/minute.
La solution A est diluée 10 fois dans le tampon acétate et 15 ml de cette solution diluée sont déposés sur la colonne. Une phase isocratique est assurée par élution de 80 ml du tampon acétate (100 mM NaCl), suivie d'une élution par 200 ml du tampon acétate
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50 mM (pH = 6, 0) contenant un gradient linéaire en NaCl (100- 500 mM).
L'activité pullulanase est mesurée dans chaque fraction.
Les fractions les plus actives sont rassemblées en une solution nommée B.
A partir de cette solution B on effectue une précipitation par de l'acétone à une concentration finale de 80 %. Le précipité obtenu est mis en solution dans une volume de 0,6 ml du tampon MES 20 mM, CaCl2 1 mM (pH 6,0).
Cette solution de pullulanase est nommée solution C.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 2.
TABLEAU 2
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<tb>
<tb> Fractions <SEP> Volume <SEP> Protéines <SEP> Activité <SEP> pullulanase <SEP> Activité
<tb> spécifique
<tb> ml <SEP> mg/ml <SEP> Total <SEP> % <SEP> PUN/ml <SEP> Total <SEP> % <SEP> PUN/mg
<tb> Solution <SEP> A <SEP> 1,5 <SEP> 6,48 <SEP> 9,7 <SEP> 100 <SEP> 17,5 <SEP> 26,3 <SEP> 100 <SEP> 2,7
<tb> Solution <SEP> B <SEP> 0,025 <SEP> 0,3 <SEP> 3 <SEP> 0,7 <SEP> 8,4 <SEP> 32 <SEP> 28
<tb>
Le tableau 2 montre que cette étape de la purification a augmenté d'un facteur 10 l'activité spécifique pullulanase de la solution enzymatique.
L'activité débranchante, c'est-à-dire l'activité d'hydrolyse des liens alpha-1,6 dans l'amylopectine, de la pullulanase a également été mesurée comme décrit ci-dessus, par coloration à l'iode après hydrolyse de l'amylopectine. Les résultats montrent que l'activité débranchante a également été enrichie.
Exemple 3 a) Détermination du point isoélectrique
On effectue sur la solution C une électrophorèse IEF (iso electro focusing) dans un gradient de pH variant de 4,0 à 6,5.
On dépose un volume correspondant à 0,12 unités de pullulanase en triple sur gel. Après migration, un tiers du gel est coloré au bleu de Coomassie.
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Les deux autres parties du gel sont recouvertes par des gels d'agar (1 %) tamponnés par CH3COONa 100 mM, CaC12 1 mM, MgC12 1 mM (pH 4,5) contenant respectivement 0,1 % d'AZCL-pullulane vendue sous la marque MEGAZYME, ou 1 X d'amylopectine.
L'ensemble (gel d'acrylamide-gel d'agar) ainsi obtenu est ensuite incubé à 60 C en atmosphère saturée en humidité relative durant 16 heures. Le gel recouvert de la surcouche d'amylopectine est ensuite incubé à température ambiante dans une solution contenant de 3 mM I2, 50 mM KI afin de révéler l'activité débranchante par apparition de la coloration bleue.
La révélation à l'iode du gel amylopectine révèle un halo bleu foncé, signe d'une activité débranchante, à un point iso- électrique de 4,5 pour l'enzyme de la présente invention. La révélation de l'activité pullulanase indique le même résultat.
Ceci démontre que la pullulanase de la présente invention présente une activité pullulanase et une activité débranchante.
Ceci démontre que la pullulanase de la présente invention est capable d'hydrolyser les liens de type out-1, 6, aussi bien dans le pullulane que dans l'amylopectine. Ceci démontre une spécificité faible de la pullulanase de la présente invention vis-àvis de son substrat. b) pH et température d'activité enzymatique
On mesure l'activité enzymatique de la pullulanase à différentes températures (55,60 et 65 OC) et à différents pH (de 3,25 à 7) en tampon citrate-phosphate 50 mM par la mesure des sucres réducteurs libérés. On met en oeuvre la solution C de pullulanase, telle qu'obtenue à l'exemple 2, diluée à environ 1 PUN/ml.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 3.
Une représentation graphique des résultats obtenus est donnée à la figure 3. L'abscisse représente le pH de l'essai et l'ordonnée représente l'activité enzymatique relative en X. La courbe * représente l'essai réalisé à 60 oc, la courbe + représente l'essai réalisé à 55 oc et la courbe # représente l'essai réalisé à 65 C.
Au cours de cet essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon placé à un pH d'environ 4,3 et à une
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température d'environ 60 C. Par définition on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 %.
Cet exemple montre que la pullulanase selon l'invention présente une activité enzymatique optimale mesurée à une température d'environ 60 C dans une gamme de pH comprise entre 4,0 et 4,8.
Cet exemple montre également que la pullulanase selon l'invention présente une activité enzymatique optimale, mesurée à un pH d'environ 4,3, dans une gamme de température comprise entre 55 et 65 C.
De plus, cet exemple montre que la pullulanase selon l'invention développe une activité enzymatique de plus de 80 X de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 3,8 et environ 4,9.
TABLEAU 3
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<tb>
<tb> Activité <SEP> relative <SEP> de <SEP> l'enzyme <SEP> %
<tb> pH <SEP> Température <SEP> C
<tb> 55 <SEP> 60 <SEP> 65
<tb> 3,25 <SEP> 5,7 <SEP> 2,2 <SEP> 4,3
<tb> 3,75 <SEP> 80,8 <SEP> 83,7 <SEP> 11,5
<tb> 4,30 <SEP> 87,9 <SEP> 100 <SEP> 84,1
<tb> 4,90 <SEP> 82,4 <SEP> 87,1 <SEP> 68
<tb> 5,50 <SEP> 50,6 <SEP> 39,6 <SEP> 13,5
<tb> 6,00 <SEP> 7,5 <SEP> 2,9 <SEP> 0
<tb> 6,40 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
c) Détermination de la demi-vie de l'enzyme
On dilue la solution A de la pullulanase, telle qu'obtenue à l'exemple 2, de telle sorte qu'elle developpe une activité enzymatique d'environ 0,7 PUN/ml dans un tampon acétate de sodium 100 mM à un pH de 4,5. On incube la solution diluée contenant la pullulanase à 60 C et des échantillons sont prélevés à des temps
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différents.
Une mesure de l'activité enzymatique par la méthode des sucres réducteurs est ensuite réalisée. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4.
TABLEAU 4
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<tb>
<tb> Temps <SEP> Activité <SEP> relative
<tb> heures
<tb> 0 <SEP> 100
<tb> 16 <SEP> 76
<tb> 24 <SEP> 74
<tb> 40 <SEP> 57
<tb> 48 <SEP> 54
<tb> 64 <SEP> 47
<tb>
Une représentation graphique des résultats obtenus est donnée à la figure 1. L'abcisse représente le temps en heures et l'ordonnée représente l'activité enzymatique relative en X.
Cet exemple montre que la pullulanase est thermostable à pH acide.
Cet exemple montre que la demi-vie de la pullulanase est d'environ 55 heures dans ces conditions. En effet la pullulanase présente une activité enzymatique relative d'au moins 50 % mesurée après une incubation de 55 heures à une température d'environ 60 C dans une solution tamponnée à un pH d'environ 4,5 et en l'absence de substrat.
Cet exemple montre de plus que la pullulanase selon l'invention présente une activité enzymatique relative d'au moins 55 % mesurée après une incubation de 40 heures à une température d'environ 60 C dans une solution tamponnée à un pH d'environ 4,5 et en l'absence de substrat. Cet exemple montre également
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qu'elle présente une activité enzymatique relative d'au moins 70 % mesurée après une incubation de 24 heures sous ces mêmes conditions. d) Stabilité de la pullulanase vis-à-vis du pH
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On dilue la solution A de la pullulanase, telle qu'obtenue à l'exemple 2, de telle sorte qu'elle developpe une activité enzymatique d'environ 0,7 PUN/ml, dans différents tampons citratephosphate 100 mM à des pH variants entre pH 3,0 et 8,0.
On incube les différentes solutions diluées contenant la pullulanase pendant 60 minutes à 60 C.
Ensuite on mesure l'activité enzymatique de ces différentes
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solutions après incubation pendant 60 minutes à pH 4, 2 à 60 OC en présence de 1, 6 % de pullulane. La quantité de maltotriose formée est mesurée par chromatographie HPLC. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 5.
Une représentation graphique des résultats obtenus est donnée à la figure 2. L'abscisse représente le pH et l'ordonnée représente l'activité enzymatique relative en %.
Cet exemple montre que la pullulanase selon l'invention est stable dans une large gamme de pH acide, en effet elle présente
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une activité enzymatique relative d'au moins 85 X mesurée après une incubation de 60 minutes à une température d'environ 60 OC en l'absence de substrat et dans une gamme de pH compris entre environ 3,5 et environ 5,8. Cet exemple montre également qu'elle présente une activité enzymatique relative supérieure à 90 X mesurée dans une gamme de pH compris entre environ 3,8 et environ 5 sous ces mêmes conditions et qu'elle n'est inactivée qu'à un pH inférieur ou égale à 3 ou supérieur ou égale à 7.
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TABLEAU 5
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<tb>
<tb> pH <SEP> Activité <SEP> relative <SEP> %
<tb> 3 <SEP> 0
<tb> 3,5 <SEP> 90
<tb> 4 <SEP> 98
<tb> 4,5 <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> 96
<tb> 5,5 <SEP> 92
<tb> 6 <SEP> 89
<tb> 6,5 <SEP> 75
<tb> 7 <SEP> 0
<tb>
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Exemple 4 et exemple 5R (de comparaison)
On prépare un milieu de saccharification en mettant en suspension de l'amidon de maïs à une concentration de 35 X en poids de matières sèches d'amidon et du chlorure de calcium à une concentration de 0,02 X.
On liquéfie cette suspension d'amidon de maïs en présence d'a-amylase, vendue sous la marque TAKATBERK L-340 par SOLVAY ENZYMES, à 105 OC pendant 5 minutes à pH 6,0.
On refroidit rapidement l'amidon liquéfié, ainsi obtenu, à une température de 95 C et on continue l'hydrolyse pendant 120 minutes à 95 C sous agitation. A ce stade le degré d'hydrolyse est compris entre 10 et 12 DE (DE représente l'unité de"Dextrose Equivalents", c'est-à-dire le nombre d'extrémités réductrices exprimées en équivalent glucose).
L'amidon liquéfié ainsi obtenu est dilué à une concentration finale de 32 g de poids sec par 100 g de milieu de saccharification.
On refroidit le milieu de saccharification obtenu à une température de 60 C.
On ajuste le pH de ce milieu de saccharification à différentes valeurs avec de l'acide acétique, depuis 3,9 jusqu'à 4,8 et on le maintient constant au cours de la saccharification.
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On ajoute au milieu de saccharification une quantité de glucoamylase correspondante à 0,176 DU/g. ds. (unité enzymatique glucoamylase par g de matières sèches de milieu de saccharification), la glucoamylase utilisée est vendue sous la marque DIAZYME L-200.
Pour l'exemple 4 selon l'invention, on ajoute également au milieu de saccharification une quantité de pullulanase, correspondante à 0, 075 PUN/g. ds., sous forme de solution aqueuse concentrée de pullulanase, telle que décrite à l'exemple 2.
L'exemple 5R de comparaison est réalisé sans addition de pullulanase.
Après 48 heures, on arrête la saccharification et on analyse les produits obtenus par chromatographie. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 6.
Cet exemple montre que la pullulanase de l'invention est efficace en saccharification. La pullulanase de l'invention possède donc toutes les propriétés adéquates compatibles avec les conditions industrielles réelles de saccharification de l'amidon.
Cet exemple montre que le taux de conversion de l'amidon est supérieur en présence de la pullulanase selon l'invention, à différents pH, et ceci jusqu'à un pH très acide, c'est-à-dire au moins 3,9.
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TABLEAU 6
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<tb>
<tb> pH <SEP> Exemples <SEP> Produits <SEP> obtenus <SEP> en <SEP> % <SEP> > DP3
<tb> Glucose <SEP> DP2 <SEP> DP3
<tb> 3,9 <SEP> 5R <SEP> 94,18 <SEP> 2,92 <SEP> 0,54 <SEP> 2,37
<tb> 4 <SEP> 95, <SEP> 63 <SEP> 2,90 <SEP> 0,73 <SEP> 0,73
<tb> 4,2 <SEP> 5R <SEP> 94,18 <SEP> 2,98 <SEP> 0,56 <SEP> 2,29
<tb> 4 <SEP> 94,79 <SEP> 4,30 <SEP> 0,56 <SEP> 0,38
<tb> 4,5 <SEP> 5R <SEP> 93,72 <SEP> 2,88 <SEP> 0,57 <SEP> 2,83
<tb> 4 <SEP> 95,49 <SEP> 3,00 <SEP> 0,75 <SEP> 0,76
<tb> 4,8 <SEP> 5R <SEP> 93,32 <SEP> 2,79 <SEP> 0,60 <SEP> 3,30
<tb> 4 <SEP> 95,25 <SEP> 2,70 <SEP> 0,87 <SEP> 1,
18
<tb>
DP2 représente les oligosaccharides contenant deux unités de glucose (dimère de glucose), DP3 les oligosaccharides contenant trois unités de glucose (trimère de glucose), > DP3 les oligosaccharides contenant plus de 3 unités de glucose.
Exemple 6 et exemple 7R (de comparaison)
On répète l'exemple 4, mais en fixant le pH de milieu de saccharification à un pH de 4,2.
On ajoute au milieu de saccharification une quantité de glucoamylase correspondante à 0,17 DU/g. ds. (unité enzymatique par g de matières sèches de milieu de saccharification), la glucoamylase utilisée est vendue sous la marque DIAZYME L-200.
Pour l'exemple 6 selon l'invention, on ajoute également au milieu de saccharification diverses quantités de pullulanase, correspondantes respectivement à 0,0325 PUN/g. ds., 0,050 PUN/g. ds., 0,075 PUN/g. ds. et 0,10 PUN/g. ds. (unité enzymatique pullulanase par gramme de matières sèches de milieu de saccharification), sous forme de solution aqueuse concentrée de pullulanase, telle que décrite à l'exemple 2.
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L'exemple 7R de comparaison est réalisé sans addition de pullulanase.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 7.
Cet exemple montre que la quantité de pullulanase qu'il faut mettre en oeuvre pour observer une augmentation du pourcentage de glucose produit est inférieure à 0,0325 PUN/g. ds.
TABLEAU 7
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<tb>
<tb> Exemples <SEP> Pullulanase <SEP> Produits <SEP> obtenus <SEP> en <SEP>
<tb> PUN/g. <SEP> ds.
<tb>
Glucose <SEP> DP2 <SEP> DP3 <SEP> > DP3
<tb> 7R <SEP> 0 <SEP> 94,78 <SEP> 3,55 <SEP> 0,73 <SEP> 0,94
<tb> 6 <SEP> 0, <SEP> 0325 <SEP> 95,16 <SEP> 3,45 <SEP> 0,78 <SEP> 0, <SEP> 61
<tb> 0,050 <SEP> 95,30 <SEP> 3,39 <SEP> 0,74 <SEP> 0,56
<tb> 0,075 <SEP> 95,25 <SEP> 3,47 <SEP> 0,74 <SEP> 0, <SEP> 55
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> 95,27 <SEP> 3,49 <SEP> 0,70 <SEP> 0,53
<tb>
Exemple 8
Cet exemple concerne le clonage du gène de la pullulanase.
L'ADN chromosomique est extrait à partir d'une culture de Bacillus deramificans LMG P-13056.
Pour ce faire, une culture de 200 ml de ce bacille en phase stationnaire est centrifugée. Le culot de centrifugation ainsi
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obtenu est repris dans 9 ml de tampon TRIS-HCI (tris (hydroxyméthyl) aminométhane acidifié avec HCl) 0, 1 M, à un pH de 8, EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) 0,1 M, NaCl 0,15 M contenant 18 mg de lysozyme, la suspension ainsi obtenue est incubée 15 minutes à 37 C.
Le lysat ainsi obtenu est ensuite traité par 200 pl d'une solution de RNAse à 10 mg/ml pendant 20 minutes à 50 C. 1 ml d'une solution de SDS (sodium dodécyl sulfate) à 10 % est alors ajoutée à ce lysat. Ensuite on incube ce lysat durant 30 minutes à 70 OC.
Puis le lysat est refroidi aux environ de 45 C, on y
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ajoute ensuite 0,5 ml d'une solution de protéinase K à 20 mg/ml (préparée extemporanément).
Le lysat est incubé à 45 C sous agitation jusqu'à l'obtention d'une solution transparente.
On effectue à partir de cette solution transparente plusieurs extractions au phénol jusqu'à l'obtention d'une interface propre.
L'ADN est alors précipité à l'aide d'isopropanol.
L'ADN ainsi obtenu est ensuite clivé partiellement par l'enzyme de restriction Sau3AI. Les conditions de restriction sont celles décrites dans Molecular Cloning-a laboratory manual - (SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989/ 9.24-9. 28). Le rapport entre la quantité d'ADN mise en oeuvre et la quantité d'enzyme est ajusté afin d'obtenir un maximum de fragments de taille comprise entre 5 et 10 kbp (kbp : 103 paires de bases).
L'ensemble des fragments ainsi obtenus est ensuite soumis à une électrophorèse en gel d'agarose (0,8 %), en tampon acétate de sodium comme décrit dans Molecular Cloning-a laboratory manual - (SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989/ 6.22-6. 35). Les fragments de taille comprise entre 5 et 10 kbp sont isolés et purifiés par électroélution. Ils sont ensuite ligaturés avec le plasmide pBR322 qui est vendu par la société BIOLABS, coupés au site BamHl et déphosphorylé comme décrit dans Molecular Cloning-a laboratory manual- (SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989/1.63-1. 73).
La ligation ainsi obtenue est transformée dans des cellules de E. coli MC1061 (CASADABAN et al., 1980, J. Mol. Biol.
138 : 179-207) par électroporation (Molecular Cloning-a laboratory manual-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989 /1.75) ; les souches transformées sont sélectionnées sur boîte de Pétri contenant le milieu LB (Luria-Bertani) gélosé et 100 pg/ml
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d'ampicilline, après croissance à 37 C pendant environ 18 heures. Le milieu LB contient 10 g/l de tryptone, 5 g/l d'extrait de levure et 10 g/l de chlorure de sodium.
Les colonies obtenues sur ces boîtes sont ensuite répliquées
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sur deux boites du même milieu.
Une des deux boites est recouverte d'un milieu gélosé contenant 1 % d'agar, 100 mM d'acétate de sodium (pH 4,5) et 0,1 % d'AZCL-pullulane. Après incubation à 60 C durant une nuit, les colonies montrant une zone d'hydrolyse de l'AZCLpullulane sont repérées, et la colonie correspondante est isolée sur l'autre boîte répliquée.
Le plasmide (pBRDEBRA 3) présent dans cette souche est isolé par la technique de lyse alcaline comme décrit dans Molecular Cloning-a laboratory manual- (SAMBROOK, FRITSCH, MANIAISsecond edition, 1989/1.25-1. 28), et sa carte de restriction est déterminée. L'analyse montre que le fragment inséré a une taille d'environ 9 kbp (figure 4).
Lorsque le plasmide pBRDEBRA3 est introduit dans la souche de E. coli MC1061 par transformation, toutes les souches transformées obtenues sont capables d'hydrolyser l'AZCL- pullulane. Elles sont également capables d'hydrolyser les liens oc-1, 6 de l'amylopectine. En effet, les colonies sont recouvertes d'un milieu gélosé contenant 1 % d'agar, 100 mM d'acétate de sodium (pH 4,5) et 1 % d'amylopectine, et incubées pendant 18 heures à 60 C. Une coloration bleue est visible autour des souches transformées, lorsque la gélose est imprégnée d'une solution d'I2-KI 3/50 mM.
Le fragment BamHI[375]-BamHI[8843] de 8,5 kb du plasmide pBRDEBRA3 a ensuite été purifié par électrophorèse en gel d'agarose et sous-cloné dans le site BamHI [5759] du vecteur navette (E. coli-B. subtilis) pUBC131 (figure 5), décrit dans la demande de brevet européen 0 415 296 (figure 8 de cette demande de brevet européen), par transformation dans la souche de E. coli MC1061. Le plasmide résultant (pUBCDEBRA1, figure 6), a ensuite été extrait de E. coli et introduit par transformation dans la souche de B. subtilis 1A510.
La souche de B. subtilis 1A510 peut être obtenue au BACILLUS GENETIC STOCK CENTER (The OHIO STATE UNIVERSITY, Department of Biochemistry, 484 West 12th Avenue, Columbus, Ohio 43210).
Les souches transformées obtenues sont recouvertes d'une
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surcouche d'agarose contenant l'AZCL-pullulane ou l'amylopectine. On isole les souches transformées, qui sont capables d'hydrolyser l'AZCL-pullulane ainsi que d'hydrolyser l'amylopectine en position alpha-1, 6.
Ceci indique clairement que le gène codant pour la pullulanase est exprimé chez B. subtilis.