FR2786500A1 - Gene codant pour une alpha-agarase et son utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des agars - Google Patents

Abstract

L'invention concerne le gène agaA codant pour une alpha-agarase et ayant la SEQ ID Ndegre 1, ledit gène codant pour une alpha-agarase de " Alteromonas agarilytica " DSM 12513, ainsi que la protéine AgaA de " A. agarilytica " DSM 12513 ayant la SEQ ID Ndegre 2. Application : biodégradation des agars.

Description

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La présente invention concerne un nouveau gène, codant pour une a-agarase, et son utilisation pour la production d'enzymes de biodégradation des agars.

Les galactanes sulfatés des Rhodophycées, tels que les agars et les carraghénanes, représentent les polysaccharides majeurs des Rhodophycées et sont très largement utilisés en tant qu'agents gélifiants ou épaississants dans diverses branches d'activité, notamment l'agro-alimentaire. Environ 6000 tonnes d'agars et 22 000 tonnes de carraghénanes sont extraits annuellement des algues rouges marines à cet effet. Les agars sont produits industriellement à partir des algues rouges des genres Gelidium et Gracilaria. Les carraghénanes sont quant à eux largement extraits des genres Chondrus, Gigartina et Eucheuma.

Les agaro-colloïdes sont des complexes polysaccharidiques composés des agars et des agaroïdes. Seuls les agars ont la propriété de former des gels thermoréversibles. Ces polysaccharides sont constitués de chaînes où alternent régulièrement des molécules de D-galactose et de 3,6-anhydro-L-galactose. Ces deux sucres sont liés entre eux par une liaison osidique -1,4. Ce dimère, ainsi constitué, est lui-même lié à un autre dimère identique par une liaison osidique a-1,3.

On appelle agar un mélange de ces polysaccharides présentant une proportion plus ou moins importante (selon la source) de radicaux sulfate, pyruvate, méthyle ou autres, ce qui en font des polymères électriquement chargés. Le terme agarose est réservé à un polymère totalement exempt de ces radicaux, ce qui en fait un polymère électriquement neutre. Le gel d'agar se forme lorsque, à basse température, les chaînes s'organisent en doubles hélices maintenues par des liaisons hydrogène.

Il existe deux types d'enzymes capables de dégrader les agars : lesa-agarases et les p-agarases. Les (3-agarases agissent sur la liaison P-1,4 et les a-agarases sur la liaison [alpha]-1,3.

Des micro-organismes produisant des enzymes capables d'hydrolyser les agars ont déjà été isolés. Cette capacité à digérer l'agar a été attribuée aux genres Pseudomonas, (MORRICE et al., Eur. J. Biochem. 137,149-154, (1983)), Streptomyces (HODGSON et CHATER, J. Gen. Microbiol. 124,339-348, (1981)), Cytophaga (VAN DER MEULEN et HARDER, J. Microbiol. 41,431-447, (1975)) et Vibrio (SUGANO et al., Appl. Environ. Microbiol. 59,1549-1554, (1993)).

Plusieurs gènes de P-agarase ont déjà été isolés. Ainsi, BELAS et al. ont isolé le gène d'une P-agarase chez Pseudomonas atlantica (Appl. Environ. Microbiol. 54,30-37, (1988)). BUTTNER et al. ont isolé une P-agarase chez Streptomyces coelicolor et séquence le gène correspondant (Mol. Gen. Genet. 209,101-109, (1987)). SUGANO et al. ont cloné et séquence deux gènes différents de p-agarase chez Vibrio sp.

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JT0107, qu'ils ont appelé agaA (Appl. Environ. Microbiol. 59,3750-3756, (1993)) et agaB (Biochimica et Biophysica Acta 1 218, 105-108, (1994)). A cejour, aucun gène d'a-agarase n'est décrit dans la littérature.

La demanderesse a maintenant isolé un gène codant pour une a-agarase à partir de la bactérie "Alteromonas agarilytica" souche GJ1B déposée à la Collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 5/11/1998 sous le numéro DSM 12513.

Cette souche GJ1B a été décrite dans la thèse de P. Potin ("Recherche, production, purification et caractérisation de galactane-hydrolases pour la préparation d'oligosaccharides des parois d'algues rouges", février 1992) où il est indiqué qu'elle a une activité a-agarase. Toutefois, aucune mention n'est faite sur le ou les gènes responsables de cette activité.

Ainsi, la présente invention a pour objet le nouveau gène agaA ayant la séquence d'ADN SEQ ID N 1 qui code pour une a-agarase dénommée protéine AgaA, ayant la séquence SEQ ID N 2.

La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques, à savoir les séquences d'ADN génomique, les séquences d'ADN ou d'ARNm qui comprennent ou sont constituées par un enchaînement de nucléotides codant pour la protéine AgaA ou pour l'un quelconque de ses fragments peptidiques tels que définis ci-après.

L'invention concerne toutes les séquences d'acides nucléiques codant pour la protéine AgaA dans son entier, ou pour un ou plusieurs de ses fragments peptidiques.

Ces séquences sont représentées de préférence par : a) la séquence d'ADN SEQ ID N 1 codant pour la protéine AgaA et les fragments d'ADN codant pour les fragments peptidiques de ladite protéine ; b) les séquences d'ADN hybridant en conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments ; c) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour la protéine AgaA ou les fragments de celle-ci ; et d) les séquences d'ARNm correspondantes.

Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans SAMBROOK et al. ("Molecular Cloning : a Laboratory Manual" Ed. Cold Spring Harbor Press, N. Y., 1989).

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Par exemple, la synthèse des séquences d'ADN selon l'invention peut être effectuée par amplification des gènes de "Alteromonas agarilytica" GJ1B à l'aide de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit par exemple par GOBLET et al. (Nucleic Acid Research, 17,2144, (1989)) en utilisant des oligonucléotides synthétiques comme amorces, définis à partir de la séquence d'ADN SEQ ID N 1.

Le fragment d'acides nucléiques ainsi amplifié peut ensuite être cloné dans un vecteur d'expression selon les techniques décrites dans MANIATIS et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, NEW YORK (1982)).

L'invention a également pour objet les cellules procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être par exemple sous la forme d'un plasmide, doit comporter, outre la séquence d'acides nucléiques de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des cellules procaryotes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier qui pourra aisément déterminer, en fonction du micro-organisme à transformer, les moyens nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention.

Les micro-organismes procaryotes préférés aux fins de l'invention sont Escherichia coli et Bacillus subtilis.

A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer notamment les cellules de Aspergillus niger, Trichoderma viridae ou Pichiapastoris.

La présente invention a également pour objet la nouvelle protéine AgaA de "A. agarilytica"qui comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID N 2.

La nouvelle protéine AgaA est composée de 1429 acides aminés et a une masse moléculaire théorique de 154,67 kDa. Après élimination du peptide signal, cette protéine a une masse moléculaire calculée de 151,91 kDa.

La présente invention concerne également les fragments peptidiques de la protéine AgaA résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité a-agarase.

Les protéines et fragments peptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par les techniques de génie génétique qui comprend les étapes de :

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- culture de cellules procaryotes ou de cellules eucaryotes transformées par un vecteur d'expression possédant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention et - récupération de la protéine ou du fragment peptidique produit par lesdites cellules.

Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Pour plus de détails les concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai ; Annals of the New-York Academy ofSciences, volume 646,1991.

Les fragments peptidiques peuvent également être préparés par synthèse peptidique chimique classique bien connue de l'homme du métier.

L'invention va maintenant être décrite en détail à l'aide de l'exposé expérimental ci-après.

Une grande partie des techniques bien connues de l'homme du métier, décrite dans ces exemples, est exposée en détail dans l'ouvrage de SAMBROOK et al.

(supra) ou dans l'ouvrage de MANIATIS et al. (supra).

La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 à 4 sur lesquelles : - la figure 1 est la photographie d'un gel d'électrophorèse SDS-PAGE des fractions a-agarase positives de "A. agarilytica" issue des chromatographies d'affinité et d'échange d'ion.

- la figure 2 représente la carte physique de la sonde nucléotidique ayant servi à identifier les clones a-agarases positifs dans la banque génomique d'"A. agarilytica et celle d'un clone génomique d"'A. agarilytica présentant une activité agarase ; - la figure 3 donne la séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés déduite du gène de l'a-agarase provenant de "A. agarilytica "; - la figure 4 représente le profil d'élution des produits d'hydrolyse de l'agarose par l'a-agarase provenant de la souche "A. agarilytica"selon l'invention.

Exemple 1 : isolement, culture de la souche "Alteromonas aQarilytica" DSM 12513 et extraction de son ADN
La souche GJ 1 B DSM 12513 a été isolée à partir d'eau de mer de Great BayLittle Bay estuarine complex du New Hampshire aux USA (YOUNG et al., Carbohydr. Res. 66,207-212, (1978)).

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La recherche taxonomique de la souche GJ1B, réalisée par des techniques bien connues de l'homme du métier, a montré qu'elle appartient au genre Alteromonas. Elle pousse en faisant des cratères dans l'agar, sous forme de colonies non pigmentées présentes sur les bords de ces cratères, alors que le fond du cratère se retrouve dépourvu d' agar ; l'agar du reste de la boîte est ensuite liquéfié. La bactérie est à Gram-négatif, aérobie et a une forme de bâtonnet mobile par un flagelle polaire. Elle possède un métabolisme oxydatif. Elle est capable d'assimiler diverses sources carbonées telles que le glucose, l'arabinose, la N-acétylglucosamine, le mannitol, le galactose, le maltose, le gluconate, le saccharose et le fructose. Elle possède les activités nitrate réductase, catalase, -glucosidase et P-galactosidase. Elle est capable de dégrader plusieurs types de macromolécules, telles que l'agar, l'amidon. Les valeurs en pourcentage de la composition en guanine et cytosine de l'ADN de la souche ont été établies entre 39 et 45%.

La souche GJ1B présente des caractéristiques morphologiques, biochimiques et physiologiques similaires à celles de la souche Vibrio agarlyticus (CATALDI, Rev.

Inst. Bacteriolôgico 9,366-377, (1940)). Elle a donc été appelée "Alteromonas agarilytica" (Cataldi) comb. nov.

La culture de la souche a été réalisée à 22 C sur le milieu BSM modifié (milieu Basal Salt Medium) (POTIN et al., Eur. J. Biochem. 214,599-607, (1993)).

Le protocole employé pour extraire l'ADN de la souche "Alteromonas agarilytica" DSM 12513 est dérivé de celui de Marmur (MARMUR, J. Mol. Biol. 3, 208-218, (1961) ; BARBEYRON, Thèse d'université Pierre et Marie Curie-Paris VI, (1993)) et est décrit en détail ci-après.

Après culture, les bactéries ont été centrifugées à 3000 g durant 15 minutes, puis lavées dans de l'eau de mer stérile. Les cellules ont subi une dernière centrifugation, identique à la précédente, et ont été traitées immédiatement ou congelées à -20 C.

5 à 10 g de cellules selon la concentration cellulaire (poids humide après centrifugation) ont été repris dans 25 ml de tampon Sph (Tris-HCl, pH 8,50 mM ; saccharose 25%), puis par 5 ml de tampon TES (Tris-HCI, pH 8,50 mM ; acide éthylènediaminetétraacétique 5 mM ; chlorure de sodium 50 mM), et 50 mg de lysosyme ont été ajoutés. Des sphéroplastes sont apparus après une incubation de 15 minutes à température ambiante.

L'ADN a été aussitôt protégé par l'ajout de 100 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (concentration finale) et l'incubation a été poursuivie dans la glace pendant encore 10 minutes.

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La lyse a été totalement achevée par l'addition de 2% de dodécylsulfate de sodium (concentration finale) et de 25 ml de solution de lyse (Tris-HCl, pH 8, 50 mM ; acide éthylènediaminetétraacétique 100 mM ; chlorure de sodium 100 mM).

Les protéines ont été pleinement dénaturées par une incubation de 1 heure à 50 C en présence de 40 mg de protéinase K. A la fin de cette incubation, 1 M (concentration finale) de perchlorate de sodium a été ajouté pour que les liaisons ADN-protéines soient rompues.

La solution a été déprotéinisée en l'agitant en présence de 0,5 volume de phénol saturé pendant 5 minutes. L'agitation a été faite manuellement et a dû être suffisamment énergique, sans l'être trop pour ne pas déchirer l'ADN, pour former une émulsion (sans laquelle il ne pourrait y avoir d'extraction). La déprotéinisation a été poursuivie pendant encore 5 minutes après ajout de 0,5 volume de chloroforme/alcool isoamylique (24/1). Les protéines ont été concentrées à l'interface entre la phase aqueuse et la phase organique, par une centrifugation de 15 minutes à 10000 g à température ambiante.

La phase aqueuse contenant les acides nucléiques a été transvasée dans un tube propre avec une pipette dont l'embout a été agrandi pour ne pas déchirer l'ADN. La déprotéinisation a été poursuivie et les traces de phénol ont été extraites de la phase aqueuse, par agitation de la solution pendant 5 minutes en présence de 1 volume de chloroforme/alcool isoamylique (24/1).

Après une centrifugation de 5 minutes à 10000 g à température ambiante, la phase aqueuse a été prélevée avec les mêmes précautions que précédemment, et les acides nucléiques ont été précipités en versant délicatement 0,6 volume d'isopropanol (de façon à former deux phases). L'ADN de haut poids moléculaire a été récupéré avec une baguette de verre, lavé dans de l'éthanol à 70%, déshydraté dans de l'éthanol absolu et séché à l'air.

Après séchage, l'ADN a été dissous dans 20 ml de tampon TE (Tris-HCl, pH 8, 10 mM, acide éthylènediaminetétraacétique 1 mM). La dissolution a nécessité environ 12 heures et elle a pu être facilitée par un chauffage à 50 C. La solution obtenue est opalescente, signe d'une contamination importante en protéines. Ces dernières sont efficacement éliminées en passant une fraction de l'ADN sur un gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthydium. Après ce passage sur gradient et élimination du bromure d'éthydium, l'ADN ainsi obtenu est quantifié.

Il a pu être conservé à 4 C ou congelé à -20 C.

La composition d'ADN, exprimée en pourcentage molaire de guanine + cytosine (mol% G+C), a été déterminée par la méthode spectroscopique de

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ULITZUR (Biochem. Biophys. Acta 272, 1-11, (1972)) et le procédé de gradient en chlorure de césium en présence de 2'-[4-hydroxyphényl]-5-[4-méthyl-1-pipérazinyl]- 2,5'-bi-lH-benzimidazole (Hoechst 33258/Sigma) (KARLOVSKY et DE COCK, Anal. Biochem. 194,192-197, (1991)). Dans le premier cas, il est de 47% 2 (moyenne de 2 manipulations) et dans le deuxième cas de 37,5% 1,5. Ce pourcentage molaire G+C a été calculé en utilisant l'ADN d'E. coli comme référence standard.

Exemple 2 : mise en évidence et purification de l'activité agarase dans la souche

"Alteromonas aarilvtica" DSM 12513
L'activité agarase de la souche a été induite dans un milieu BSM modifié supplémenté par 2,5 g/1 d'agar. On considère qu'une souche présente une activité agarase lorsqu'elle digère l'agar sur lequel elle se développe.

On a cultivé la souche à activité agarase dans 2,5 1 du milieu ci-dessus à 22 C.

On a centrifugé la culture à 1000 g pendant 20 minutes. On a récupéré le surnageant de culture et on l'a concentré jusqu'à 100 ml par ultrafiltration tangentielle (seuil de coupure : 10 kDa), opération suivie d'une précipitation au sulfate d'ammonium (70 % de saturation). Le culot de protéines a été remis en suspension dans 10 ml de tampon A (Tris-HCl, pH 7,2,10 mM, CaC12 25 mM). Après retrait du matériel insoluble, on a ajouté 1 ml de Sépharose CL6B équilibré dans le tampon A afin de réaliser une chromatographie par affinité. L'activité a-agarase s'est fixée au Sépharose pendant 30 minutes à 4 C sous agitation douce. On a ensuite centrifugé les billes de Sépharose à 200 g pendant 5 minutes, on les a reprises dans 5 ml de tampon A et coulées dans une colonne de verre. Après plusieurs lavages en tampon A, on a élué l'activité a-agarase de la colonne en faisant passer au travers de celle-ci une solution d'oligoagars à pH 7,2 obtenue en digérant une solution d'agar à 5 g/1 par de l'aagarase non purifiée de "A. agarilytica" (le culot obtenu en 70% sulfate d'ammonium). On a soumis les fractions a-agarase positives (24 ml) à une chromatographie d'échange d'ions (Mono Q) en tampon B(Tris-HCI, pH 7,2,10 mM, CaCl2 5 mM). Après lavages, on a élue l'activité par un gradient de chlorure de sodium (0 à 500 mM NaCl) en tampon B (1 ml/ mn). L'activité a-agarase a été éluée à une concentration en NaCl de 350 mM.

On a testé l'activité agarase des différentes fractions issues des deux chromatographies en déposant des quantité aliquotes de ces fractions sur un gel d'agarose et par un dosage des sucres réducteurs selon la technique de KIDBY & DAVIDSON (Annal. Biochem., Vol. 55,321-325 (1973)). Cependant ce test s'est

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avéré le plus souvent négatif après la dernière étape de chromatographie d'échange d'ions et a été avantageusement remplacé par un test viscosimétrique.

On a mis en oeuvre une électrophorèse sur SDS-PAGE avec la fraction éluée de la seconde colonne. Celle-ci a présenté une bande principale avec une masse d'environ 180 kDa (figure 1). Cette protéine a été microséquencée. La séquence obtenue du peptide NH2-terminal est ETLELQAESFANSGG et celle du peptide interne est QPRVYNPNEHIVAEIQGPAT.

Exemple 3 : produits de dégradation de l'a-agarase
Les spécificités de substrat de l'a-agarase de l'invention ont été étudiées en analysant les produits de dégradation de l'agarose par l'a-agarase partiellement purifiée (après colonne d'échange d'ions).

On a mis l'agarose en présence de l'a-agarase à raison de 0,2U/mg de polysaccharide durant 15 heures (1 unité enzymatique U est la quantité d'enzyme qui produit une augmentation d'absorbance de 0,1 unité de densité optique à 237 nm au cours du test des sucres réducteurs). On a refroidi l'hydrolysat dans la glace et on l'a centrifugé à 15000 g pendant 20 minutes. On a concentré le surnageant et on l'a fractionné par chromatographie d'exclusion sur une colonne de Bio-Gel P2. On a utilisé de l'eau distillée en tant que phase mobile et on a réalisé la détection par un enregistrement de l'indice de réfraction.

Le chromatogramme des produits finaux d'hydrolyse de l'agarose par l'a-agarase purifiée est représenté sur la figure 4. Le pic majeur n 1 a été identifié comme étant de l'agarotétraose sur la base des résultats obtenus par RMN du 13C (Résonance Magnétique Nucléaire du carbone 13). Les pics mineurs n 2 et 3 ont été identifiés comme étant de l'agarotétraose méthylé en C6 et de l'agarohexaose respectivement. La présence de l'oligosaccharide méthylé provient de la source d'agarose employée qui est un agarose anormalement contaminé par de l'agar méthylé. Ces résultats confirment que l'a-agarase de la souche GJ1B d'"A. agarilytica"est spécifique de la liaison a-1,3 dans l'agarose et dans certains agars.

Des expériences ont montré que l'a-agarase d"'A. agarilytica"était incapable de dégrader l'agarotétraose, l'agarohexaose, le K-carraghénane, le t-carraghénane, le -carraghénane ou l'agar extrait de l'algue rouge Gracilaria eucheumoides (agar méthylé en C2 du résidu 3,6-anhydro-L-galactose et sulfaté en C4 du résidu Dgalactose).

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Exemple 4 : clonage du gène de l'[alpha]-agarase
On a préparé une banque d'ADN génomique de la souche de "A. agarilytica".

Des fragments de 4 à 12 kb, provenant de la digestion partielle par Sau3AI de l'ADN chromosomique, ont été fractionnés sur un gradient de saccharose. Ces fragments ont été insérés dans le site BamHI du plasmide pAT153 (TWIGG et SHERRATT, Nature, 283, 216, (1980)).

Les clones recombinants (environ 6000) de la souche DH5a d'E. coli (SAMBROOK et al., supra) ont été inoculés indépendamment sur des plaques de microtitration dans le milieu LBA (milieu Luria-Bertani (MANIATIS et al., supra) supplémenté en ampicilline à une concentration de 50 pg/ml). Après incubation, toute la nuit à 37 C, ces clones ont été repiqués sur des membranes de Nylon N+ déposées sur milieu LB (milieu Luria-Bertani) en présence de 50 ug/ml, puis remis à 37 C la nuit. Les membranes ont été récupérées et les colonies apparues sur leur surface ont été lysées. Enfin, les membranes ont été hybridées avec une sonde radioactive spécifique du gène de l'a-agarase. Cette sonde a été obtenue par PCR avec des oligonucléotides synthétiques dégénérés dont les séquences ont été déterminées à partir du microséquençage du fragment NH2-terminal et d'un fragment interne de la protéine AgaA purifiée (cf exemple 2); ce fragment de PCR a été cloné.

Deux clones positifs ont été identifiés. Ces clones ont été repiqués à 22 C sur du milieu Zd (5 mg/1 de bactotryptone, 1 mg/1 d'extrait de levure, 10 mg/1 de NaCl, pH 7,2) supplémenté à 50 ug/ml d'ampicilline pour observer la production d'agarase (trou dans la gélose lorsqu'il y a production d'agarase).

En moins de huit jours de culture à 22 C, les deux colonies indépendantes, appelées pAA 1à pAA2, ont creusé le substrat.

Les cartes de la sonde et du plasmide pAA1 correspondant à une des deux colonies sont représentées sur la figure 2, sur lesquelles : - les lignes fines représentent les régions de l'ADN vecteur, le segment en gras représente l'insert de "A. agarilytica" et les rectangles blancs représentent tout ou partie du gène d'a-agarase; - les différentes abréviations sont les sites de reconnaissance des endonucléases de restriction et ont les significations ci-après :
B/S : site de clonage BamHI-Sau3A
A : Accl
E : EcoRI
P : Pstl

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La cartographie de ces ADN montre la présence d'un fragment ayant un profil de restriction commun entre la sonde et le plasmide pAAl (délimité par les lignes en pointillés sur la figure 2), ce qui permet de situer, sur l'insert d'ADN génomique, cette sonde et donc de localiser le début du gène sur le plasmide pAAl.

Exemple 5 : analyse de la séquence nucléotidique du gène d'[alpha]-agarase
Le plasmide pAA 1a été utilisé pour déterminer. sur les deux brins, la séquence nucléotidique du gène de structure de l'a-agarase.

Ce séquençage a été réalisé par une technique bien connue de l'homme du métier, à savoir la méthode de Sanger (SANGER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467, (1977)) également appelée méthode aux didéoxynucléotides.

L'insert pAA 1a été séquence sur 4651 pb (figure 3). Il contient un unique cadre ouvert de lecture (ORF) de 4287 pb. Ce gène appelé agaA a la SEQ ID N 1.

La séquence d'acides nucléiques obtenue est illustrée sur la figure 3. Deux hexamères, appelés ici TTGAtc et TAcAca, compatibles avec les promoteurs consensus "-35" et "-10" de E. coli, les majuscules correspondant au promoteur consensus de E. coli (ROSENBERG & COURT, Ann. Rev. 13, 319-353, (1979)), et séparés par 16 nucléotides, sont trouvés à 25 nucléotides en amont du codon initiateur putatif de la traduction du gène agaA. Six pb avant ce codon initiateur se trouve une séquence de Shine-Dalgarno putative (SHINE & DALGARNO, Proc. Nat.

Acad. Sci. USA 71,1342-1346, (1974)) qui est le site de fixation des ribosomes (notée S. D. sur la figure 3). Dans la région 3' non traduite, une boucle d'arrêt de transcription est trouvée en aval du codon stop TAA, suivi de trois résidus thymidine.

Le coefficient de Chargaff (GC%) du gène de l'a-agarase est de 42%, ce qui est en accord avec celui du genre Alteromonas.

Exemple 6 : de la séquence d'acides aminés déduite du gène d'[alpha]-agarase
Le produit de traduction du gène agaA est une protéine de 1429 acides aminés présentant une masse moléculaire théorique de 154,67 kDa. La séquence d'acides aminés déduite, SEQ ID N 2, comprend le peptide NH2-terminal et le peptide interne déterminés à partir du microséquençage de l'a-agarase purifiée (soulignés sur la figure 3). Comme indiqué par l'analyse du profil d'hydropathie (KYTE et DOOLITLE, J. Mol. Biol., 157,105-132, (1982)) la partie N-terminale de la protéine correspond à un domaine très hydrophobe, ce qui suggère que ce domaine est le peptide signal (VON HEIJNE, Eur. J. Biochem. 133,17-21, (1983) ; J. Mol. Biol.

184, 99-105, (1985)). Selon la règle "(-3,-1)" de Von Heijne, le site de coupure le

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plus probable du peptide signal par la signal-peptidase est attribué entre Ala26 et Glu27.

La masse moléculaire de la protéine AgaA calculée après élimination du peptide signal, est de 151,91 kDa. ce qui correspond approximativement à la masse moléculaire déterminée initialement par électrophorèse sur SDS-PAGE, qui est de 180 kDa (voir figure 1).

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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM : GOEMAR (B) RUE : Madeleine B. P. 55 (C) VILLE : (E) PAYS : (F) CODE POSTAL : cedex (ii) TITRE DE L' INVENTION: gène codant pour une a-agarase et son utilisation pour la production d'enzymes de biodégradation des agars (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT: 190..4477 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GGATCGACAG AACAGGGGTG ATATTTGTTT TTTTTAATAT CTCCCTGTTT TTTTTGTTTT 60 ATTGAGTATT GTCATCAATT AACAAAAAGT CTTTGTTGTG CGATTGTTTA CAAGCAGCTG 120 TTTGTTCGAA ACAAGGTTGA TCGCGCGTAA GAAAAACTTA CACAACATAA TAAAAAATTG 180 GAGAATAAA ATG TTT AAA ACT AAA CGT TCT CTG CTG AAC TCA AGC ATT 228
Met Phe Lys Thr Lys Arg Ser Leu Leu Asn Ser Ser Ile
1 5 10 GCA ATC TCA TTT GCT GTA CTT GGC GTG CAA GCG CAA GCA GAG ACA CTA 276 Ala Ile Ser Phe Ala Val Leu Gly Val Gin Ala Gin Ala Glu Thr Leu
15 20 25 GAA TTA CAA GCA GAA TCG TTT GCC AAC TCT GGC GGC ACA TAT AGT GAT 324 Glu Leu Gin Ala Glu Ser Phe Ala Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Asp
30 35 40 45 GGG CAG CCA AAT CCA GTT ACT ATT TAC AAT GTA AAC GGA CAA GGC GCG 372 Gly Gin Pro Asn Pro Val Thr Ile Tyr Asn Val Asn Gly Gin Gly Ala
50 55 60 ATT AAT TTC GTT AAT GCA GGT GAC TAT GTT GAT TAC AAT ATC AAT GCC 420 Ile Asn Phe Val Asn Ala Gly Asp Tyr Val Asp Tyr Asn Ile Asn Ala
65 70 75

<Desc/Clms Page number 13>

CTG GGG GGG GAA TAC GAT ATT GAA TAT TTT GTT GGC ACC GGT GTT ACA 468 Leu Gly Gly Glu Tyr Asp Ile Glu Tyr Phe Val Gly Thr Gly Val Thr
80 85 90 TCT GGA CCC AAT ATA GAA GTA CTT GTG GAC GTT AAT GGT ACA TGG CAA 516 Ser Gly Pro Asn Ile Glu Val Leu Val Asp Val Asn Gly Thr Trp Gln
95 100 105 AGT CAA GGC TCG GTT GCT GTT CCT TAT GGT AGT TGG GAT GAC TTC CAA 564 Ser Gin Gly Ser Val Ala Val Pro Tyr Gly Ser Trp Asp Asp Phe Gin 110 115 120 125 TCG CTC ACG CCA TCT CAT ACA GTA ACA TTA CCT GTT GGT ACT TCG ACT 612 Ser Leu Thr Pro Ser His Thr Val Thr Leu Pro Val Gly Thr Ser Thr
130 135 140 GTT CGC TTG TTG GCG GTA GGC TCA ACT TGG CAA TGG AAT TTA GAA TCA 660 Val Arg Leu Leu Ala Val Gly Ser Thr Trp Gin Trp Asn Leu Glu Ser
145 150 155 TTT AGA TTA ACT CAA GTT TCA CCT GTT GAA CCA GTA GGT GAT GCT GAT 708 Phe Arg Leu Thr Gin Val Ser Pro Val Glu Pro Val Gly Asp Ala Asp
160 165 170 AAT GAC GGC GTT AAT GAT AAT CAA GAT TTA TGT CCT AAT AGC CCA TCA 756 Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gin Asp Leu Cys Pro Asn Ser Pro Ser
175 180 185 GGT GTC ACA GTT GAT AAT AAT GGT TGC CAA ATT ACT GGT GGT ACA GAT 804 Gly Val Thr Val Asp Asn Asn Gly Cys Gin Ile Thr Gly Gly Thr Asp 190 195 200 205 CCG GGT GGA GAA TCC TTT GTA ATC CAG ATG GAG GCT TTT GAT TCA ACT 852 Pro Gly Gly Glu Ser Phe Val Ile Gin Met Glu Ala Phe Asp Ser Thr
210 215 220 GGA AGT GAT GAT TCA AGA GCA AAA GGT GTG ATT ATT GGT GAA CGT GGT 900 Gly Ser Asp Asp Ser Arg Ala Lys Gly Val Ile Ile Gly Glu Arg Gly
225 230 235 TAC CCG CAA GAT AAG CAT ACG GTT GTT GAT AGT GTA CAA ACT ACT GAT 948 Tyr Pro Gin Asp Lys His Thr Val Val Asp Ser Val Gin Thr Thr Asp
240 245 250 TGG GTG GAT TAC AGT ATT AAT TTC CCA TCT TCA GCC AAT TAT AGT GTC 996 Trp Val Asp Tyr Ser Ile Asn Phe Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Ser Val
255 260 265 TCA ATG TTA GCG TCT GGG CAG ACA GAC CAC GCC ACG GCT GTA TTA TAT 1044 Ser Met Leu Ala Ser Gly Gin Thr Asp His Ala Thr Ala Val Leu Tyr 270 275 280 285 CTT GAT GGC ACT GAA ATT AAT GAA GTG CCT GTG CAT ACA GGT AGC CAA 1092 Leu Asp Gly Thr Glu Ile Asn Glu Val Pro Val His Thr Gly Ser Gin
290 295 300 GCC GAT TTT GCA AAC TTT CAA CTA GCA GGC TCG GTT TAT ATT GCG TCT 1140 Ala Asp Phe Ala Asn Phe Gin Leu Ala Gly Ser Val Tyr Ile Ala Ser
305 310 315 GGT ACG CAT ACC ATT CGA GTT CAA GCA CAA AGC TCT ACT GGT GAG TTT 1188 Gly Thr His Thr Ile Arg Val Gin Ala Gin Ser Ser Thr Gly Glu Phe
320 325 330

<Desc/Clms Page number 14>

AGC TGG TTA TGG TTT GGT GAT GCA TTA ACT TTC ACT AAC TTA GAC AGT 1236 Ser Trp Leu Trp Phe Gly Asp Ala Leu Thr Phe Thr Asn Leu Asp Ser
335 340 345 GAT GGG GGT AAT GGC GGC GAG GCT ACA CAA GAT GCT GAT AAC GAT GGA 1284 Asp Gly Gly Asn Gly Gly Glu Ala Thr Gln Asp Ala Asp Asn Asp Gly 350 355 360 365 GTG TTA GAT AGC TCA GAT TCT TGT CCA AAT ACG CCT ACG GGT GAG CCT 1332 Val Leu Asp Ser Ser Asp Ser Cys Pro Asn Thr Pro Thr Gly Glu Pro
370 375 380 GCA GAT GTG ACT GGC TGT AGT GCA TCG CAA TTA GAT GAT GAC AAT GAT 1380 Ala Asp Val Thr Gly Cys Ser Ala Ser Gin Leu Asp Asp Asp Asn Asp
385 390 395 GGT GTT TCA AAT AAT GTT GAT CAA TGT CCG AAT ACA GTT GCA GGT ACA 1428 Gly Val Ser Asn Asn Val Asp Gin Cys Pro Asn Thr Val Ala Gly Thr
400 405 410 GAG GTA GAT GCT GAT GGC TGT GAA GTA ATA TTT GCA GAT GCA GAT AAC 1476 Glu Val Asp Ala Asp Gly Cys Glu Val Ile Phe Ala Asp Ala Asp Asn
415 420 425 GAC GGC ATA GAA GAT TCG CAA GAT TTT TGC CCG AAC ACA CCA GCA GGT 1524 Asp Gly Ile Glu Asp Ser Gln Asp Phe Cys Pro Asn Thr Pro Ala Gly 430 435 440 445 GAA GCG GTC AAT AAT TCA GGT TGT GGT GCG TCA CAA TTG GAT GCC GAT 1572 Glu Ala Val Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Ser Gin Leu Asp Ala Asp
450 455 460 AAT GAT GGC GTT ACA AAC AAT ATA GAT CAA TGT CCA AAT ACA CCA GCG 1620 Asn Asp Gly Val Thr Asn Asn Ile Asp Gin Cys Pro Asn Thr Pro Ala
465 470 475 GGC ACA CAA GTT GAT GCG TCA GGT TGT GAG ACC GAC AAT GGT GGT GAG 1668 Gly Thr Gin Val Asp Ala Ser Gly Cys Glu Thr Asp Asn Gly Gly Glu
480 485 490 CCA GGT GAT AGC TAT TAT CAC AAT GGT CAA GGT TTA TTG TTT GGC CGT 1716 Pro Gly Asp Ser Tyr Tyr His Asn Gly Gin Gly Leu Leu Phe Gly Arg
495 500 505 GTA GAT GGC GCA ACT AAC TTT TTA GGT GAA GAA GGC TAT GTT GCC AAC 1764 Val Asp Gly Ala Thr Asn Phe Leu Gly Glu Glu Gly Tyr Val Ala Asn 510 515 520 525 CCT GAT AAC TAT GAT GTG ACA ACC GAT TTA CTC GAA ACT GAT GAT GCA 1812 Pro Asp Asn Tyr Asp Val Thr Thr Asp Leu Leu Glu Thr Asp Asp Ala
530 535 540 ATT CGC GCT AAT TCA ACC GAA GTG TTT CGT GGT GAG ATT TAT GAC GCA 1860 Ile Arg Ala Asn Ser Thr Glu Val Phe Arg Gly Glu Ile Tyr Asp Ala
545 550 555 GAT GGC CAT ATT GCT TTC TAT GAA CAT ATA GAT GAT AGC GTG CGT TTG 1908 Asp Gly His Ile Ala Phe Tyr Glu His Ile Asp Asp Ser Val Arg Leu
560 565 570 TAT ATA GAC GGT CAA CTC GTG CTT TCA AAT GAT AGC TGG GAA AAC TCG 1956 Tyr Ile Asp Gly Gin Leu Val Leu Ser Asn Asp Ser Trp Glu Asn Ser
575 580 585

<Desc/Clms Page number 15>

TCT CAA ACC ACA GAT TTA AAC TTA ACA CCT GGT TGG CAT AAT TTT GAG 2004 Ser Gln Thr Thr Asp Leu Asn Leu Thr Pro Gly Trp His Asn Phe Glu 590 595 600 605 TTA AGA CTT GGT AAC GCA GAT GGT GGC AGT GGT GCT GTG AGT GGT ATA 2052 Leu Arg Leu Gly Asn Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Val Ser Gly Ile
610 615 620 GGT TTT GGT ATA GAT GTG GAC GGT GGG ACA AAC TTT GTT CAC CCA AGC 2100 Gly Phe Gly Ile Asp Val Asp Gly Gly Thr Asn Phe Val His Pro Ser
625 630 635 AAT TTA AGC CCG AGT ATG TTT AGA GCG AGC GGC CAA GTT GTG GTT GAT 2148 Asn Leu Ser Pro Ser Met Phe Arg Ala Ser Gly Gin Val Val Val Asp
640 645 650 CCA ATT TTA CCA CCT TCA GGC GGA ATT TAT ATT CAG CTA GAA GAC TTT 2196 Pro Ile Leu Pro Pro Ser Gly Gly Ile Tyr Ile Gin Leu Glu Asp Phe
655 660 665 GAC GAA ACC GGC ACT GTT GGC CGA GTC GCG AGC GAT CCA AAT GAC GGC 2244 Asp Glu Thr Gly Thr Val Gly Arg Val Ala Ser Asp Pro Asn Asp Gly 670 675 680 685 TTT GTA AAA GGT GAT TCA AAC GTT GGT TGG GTT ACC AAT GGC GAT TGG 2292 Phe Val Lys Gly Asp Ser Asn Val Gly Trp Val Thr Asn Gly Asp Trp
690 695 700 GGT AAA TAC CAC AAT GTA TTT TTA GAA GCT GGT ACA TAT AGA GCA TTC 2340 Gly Lys Tyr His Asn Val Phe Leu Glu Ala Gly Thr Tyr Arg Ala Phe
705 710 715 ATA ACT GTA TCA ACA CCT GCG GGC GGT AGT TAT GGT GCA CGT GTT GAT 2388 Ile Thr Val Ser Thr Pro Ala Gly Gly Ser Tyr Gly Ala Arg Val Asp
720 725 730 ATA GAC GGC GAA CCT TTT GCT TGG GGA TAT TTT GAC AGC ACA GGT GGC 2436 Ile Asp Gly Glu Pro Phe Ala Trp Gly Tyr Phe Asp Ser Thr Gly Gly
735 740 745 TGG GAT ATC GCA GCA GAA TAT GAG TTG TAT GGT GGT CAT TTA GTC GTA 2484 Trp Asp Ile Ala Ala Glu Tyr Glu Leu Tyr Gly Gly His Leu Val Val 750 755 760 765 GAA AGT ACA GGT AAC CAT ACA CTA CAT GTT GAA GCT GTT GGT GGG TCT 2532 Glu Ser Thr Gly Asn His Thr Leu His Val Glu Ala Val Gly Gly Ser
770 775 780 GAT TGG CAA TGG AGT GGC GAC TTA GTT CGT TTA GCT AAA GTG AGC GAT 2580 Asp Trp Gin Trp Ser Gly Asp Leu Val Arg Leu Ala Lys Val Ser Asp
785 790 795 AGT GCA GTC AAA CAA CCG CGT GTA TAC AAT CCG AAC GAG CAT ATT GTC 2628 Ser Ala Val Lys Gin Pro Arg Val Tyr Asn Pro Asn Glu His Ile Val
800 805 810 GCT GAA ATT CAA GGA CCA GCA ACG GGT TTA CAA TAT TTA AAA ACA CCA 2676 Ala Glu Ile Gin Gly Pro Ala Thr Gly Leu Gin Tyr Leu Lys Thr Pro
815 820 825 GTG GAA ATT CCA TTA GCC AAC AAG GTA TTA AAA TCA GAC GTT TGG TAT 2724 Val Glu Ile Pro Leu Ala Asn Lys Val Leu Lys Ser Asp Val Trp Tyr

Rln (Il R5 Rdn R4S

<Desc/Clms Page number 16>

ACC TAT CCG CAA AAC CGA AAC CTA GTC GTT GAT GGT GAC ACA CCA TAT 2772 Thr Tyr Pro Gin Asn Arg Asn Leu Val Val Asp Gly Asp Thr Pro Tyr
850 855 860 GCT GAT TTT GGT GCA ACG GGT GCC TTC TGG GGG CAT CCA CCT GAA CAC 2820 Ala Asp Phe Gly Ala Thr Gly Ala Phe Trp Gly His Pro Pro Glu His
865 870 875 GAT TTC TAC GAT GAT ACT GTG ATC ATG GAT TGG GCG GTT AAT GTT GTT 2868 Asp Phe Tyr Asp Asp Thr Val Ile Met Asp Trp Ala Val Asn Val Val
880 885 890 GAT GAT TTC CAA AGT GAA GGT TTT GAA TAT ACT GCG CGC GGT GAG TTT 2916 Asp Asp Phe Gin Ser Glu Gly Phe Glu Tyr Thr Ala Arg Gly Glu Phe
895 900 905 GAC TGG GGC TAT GGT TGG TTC ACT GAG TTT ACG ACT AAT CCG CAA CCG 2964 Asp Trp Gly Tyr Gly Trp Phe Thr Glu Phe Thr Thr Asn Pro Gin Pro 910 " 915 920 925 CAC TAT GTT CAA ACA TTG GAT GGC CGT AAT GTA CGT ATG ACA TTC ATG 3012 His Tyr Val Gin Thr Leu Asp Gly Arg Asn Val Arg Met Thr Phe Met
930 935 940 GGC TAT TTA AGT CAT GAT GGT TAT AAC AAC AAT TGG CTG AGT AAT CAT 3060 Gly Tyr Leu Ser His Asp Gly Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser Asn His
945 950 955 AGT CCA GCG TTT GTG CCT TTC ATG AAG TCA CAA GTT GAC CAA ATA TTG 3108 Ser Pro Ala Phe Val Pro Phe Met Lys Ser Gin Val Asp Gin Ile Leu
960 965 970 AAA GCA AAT CCT GAC AAG TTG ATG TTT GAT ACA CAA ACC AAT TCT ACA 3156 Lys Ala Asn Pro Asp Lys Leu Met Phe Asp Thr Gin Thr Asn Ser Thr
975 980 985 CGC TCA ACC GAT ATG CGC ACA TTT GGT GGA GAT TTC TCT CCT TAT GCA 3204 Arg Ser Thr Asp Met Arg Thr Phe Gly Gly Asp Phe Ser Pro Tyr Ala 99C 995 1000 1005 ATG GAA AAC TTC CGT GTT TGG TTG TTG AAA AAA TAT AGC AAT GCA CAG 3252 Met Glu Asn Phe Arg Val Trp Leu Leu Lys Lys Tyr Ser Asn Ala Gin
1010 1015 1020 TTA GTC TCT ATG GGT ATT AAT GAT ATT ACT AGC TTT GAT TAT GGC GCA 3300 Leu Val Ser Met Gly Ile Asn Asp Ile Thr Ser Phe Asp Tyr Gly Ala
1025 1030 1035 TAT TTG AGA GCA CAA GGC ATC ACC CAT ACT GAT TGG TCA AAT GCA GGG 3348 Tyr Leu Arg Ala Gin Gly Ile Thr His Thr Asp Trp Ser Asn Ala Gly
1040 1045 1050 GAT ACT ATT TCT GGC AAT ATT CCA ATG ATG GAA GAC TTC ATT TAT TTT 3396 Asp Thr Ile Ser Gly Asn Ile Pro Met Met Glu Asp Phe Ile Tyr Phe
1055 1060 1065 AAT CGT GAT GTC TGG AAC CAA AAG TTT GCA GAA GTA TTA GAA TAT ATT 3444 Asn Arg Asp Val Trp Asn Gin Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Tyr Ile 1070 1075 1080 1085 CGT CAG CAA CGT CCT AAT ATT GAA ATT GGT GCA AGT ACT CAC TTG TTT 3492 Arg Gin Gin Arg Pro Asn Ile Glu Ile Gly Ala Ser Thr His Leu Phe
1090 1095 lino

<Desc/Clms Page number 17>

GAA TCT CGT GGT TAT ATC TTT AAC GAG AAC ATT ACC TTC TTA TCG GGT 3540 Glu Ser Arg Gly Tyr Ile Phe Asn Glu Asn Ile Thr Phe Leu Ser Gly
1105 1110 1115 GAA TTG AAC TTA GGT GCA AGA ACT AGT ATT TCA GAG TTA CCC ACT AAT 3588 Glu Leu Asn Leu Gly Ala Arg Thr Ser Ile Ser Glu Leu Pro Thr Asn
1120 1125 1130 ATT CTT GTT CAC TTA AAG GGC GCG CAA GCA GTC GAT AAA ACC TTG GCT 3636 Ils Leu Val His Leu Lys Gly Ala Gin Ala Val Asp Lys Thr Leu Ala
1135 1140 1145 TAT TTc CCA TAC CCT TGG GAG TTT GAT GAA TTA CGT ATT CAA AAT GCA 3684 Tyr Phe Pro Tyr Pro Trp Glu Phe Asp Glu Leu Arg Ile Gin Asn Ala 1150 1155 1160 1165 CCA CGT TTT GGT CGA GGT TGG GTT GCT CAA GCT TAT GCT TAT GGT GGT 3732 Pro Arg Phe Gly Arg Gly Trp Val Ala Gin Ala Tyr Ala Tyr Gly Gly
1170 1175 1180 TTA TTC TCT ATC CCA GCT AAT GTG TGG GTC GGT GGA GAA GTA TTT ACT 3780 Leu Phe Ser Ile Pro Ala Asn Val Trp Val Gly Gly Glu Val Phe Thr
1185 1190 1195 TGG TCA CCG GGA GCG GAT AAC TAT CGT GAT ATC TAT CAA TTT GTG CGT 3828 Trp Ser Pro Gly Ala Asp Asn Tyr Arg Asp Ile Tyr Gin Phe Val Arg
1200 1205 1210 GCA CAA GCG AAC TTG TTA GAT GGT TAT ACG TCA TAT GCG AAA GCA GGT 3876 Ala Gin Ala Asn Leu Leu Asp Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Lys Ala Gly
1215 1220 1225 TAT GTT CAT GCC ATG TTC TCA TCA ATG AAA GCG GGT TTT ATT GAT GGT 3924 Tyr Val His Ala Met Phe Ser Ser Met Lys Ala Gly Phe Ile Asp Gly 1230 1235 1240 1245 GGT AAC CAA GTT CAA TCA AGC GTG AAA ATC TTA ACT GAA GAT AAT ATC 3972 Gly Asn Gln Val Gin Ser Ser Val Lys Ile Leu Thr Glu Asp Asn Ile
1250 1255 1260 AAC TTT GAT ATG TTA GTA TTT GGT GAT GCG GGT TAT CCT GTT GTA CCA 4020 Asn Phe Asp Met Leu Val Phe Gly Asp Ala Gly Tyr Pro Val Val Pro
1265 1270 1275 CGC CAA GCT GAC TTT GAT AAA TTT GAA TAT ATT TTC TAC GAC GGT GAC 4068 Arg Gin Ala Asp Phe Asp Lys Phe Glu Tyr Ile Phe Tyr Asp Gly Asp
1280 1285 1290 TTA AAC TAC TTA ACT GCT GAG CAA CAA GCT GTA TTG GAT GCT CAA GGC 4116 Leu Asn Tyr Leu Thr Ala Glu Gin Gin Ala Val Leu Asp Ala Gin Gly
1295 1300 1305 AGT AAG GTG AAG CAT ATT GGT CAA CGT GGC ACA ATT GCT GGT TTA CAA 4164 Ser Lys Val Lys His Ile Gly Gin Arg Gly Thr Ile Ala Gly Leu Gin 1310 1315 1320 1325 ATT AAT GTA AGC ATT AAT GGT AGT GTG TCT AAC GAA ACC GTG TCT GCT 4212 Ile Asn Val Ser Ile Asn Gly Ser Val Ser Asn Glu Thr Val Ser Ala
1330 1335 1340 GTA TCT CGT ATT CAC GAA ACA GAC TCA ACA GCG CCT TAC GTA GTA CAT 4260 Val Ser Arg Ile His Glu Thr Asp Ser Thr Ala Pro Tyr Val Val His
1345 1350 1355

<Desc/Clms Page number 18>

TTC ATT AAC CGT CCG TTT GCG GGT GGG GTA ACA CCA ATA CTG AAC AAT 4308 Leu !le Asn Arg Pro Phe Ala Gly Gly Val Thr Pro Ile Leu Asn Asn
1360 1365 1370 GTT GAA GTG GCA ATT CCA GCA AGT TAC TTC CCA CAA GGG GTA ACC TCA 4356 Val Glu Val Ala Ile Pro Ala Ser Tyr Phe Pro Gin Gly Val Thr Ser
1375 1380 1385 GCG AAA TTA CAC TTA CCA GAT GGC TCA AGT TCT ACA GTC GCG GTT TCT 4404 Ala Lys Leu His Leu Pro Asp Gly Ser Ser Ser Thr Val Ala Val Ser 1390 1395 1400 1405 ACT AAC GCC AAT GGT GAT ACA GTC GTG TCG GTT AGC AAT CTT GAA GTT 4452 Thr Asn Ala Asn Gly Asp Thr Val Val Ser Val Ser Asn Leu Glu Val
1410 1415 1420 TGG GGT ATT TTA GAG TTA GCT CAC T AATTTTTTGA TACGATTTTT 4497 Trp Gly Ile Leu Glu Leu Ala His
1425 CATGGATTTA AGGGGCTTCA GTGAAGCCCC TTTTATTTGG TACTTGTTGA CTAACGATTG 4557 AGGACATTTT TATGGCGAAT CAATAAACCT TATCTTAAAC AAGCGTGTAG TTAATGTGTT 4617 TTGATTACGG TTTGGTGACT GTCACTTTTA TTTA 4651 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 1429 acides amin s (3) TYPE: acide amin (D) CONFIGURATION : lin aire (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 : Me Phe Lys Thr Lys Arg Ser Leu Leu Asn Ser Ser Ile Ala Ile Ser
1 5 10 15 Phe Ala Val Leu Gly Val Gin Ala Gin Ala Glu Thr Leu Glu Leu Gin
20 25 30 Ala Glu Ser Phe Ala Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Gly Gin Pro
35 40 45 Asn Pro Val Thr Ile Tyr Asn Val Asn Gly Gin Gly Ala Ile Asn Phe
50 55 60 Val Asn Ala Gly Asp Tyr Val Asp Tyr Asn Ile Asn Ala Leu Gly Gly
65 70 75 80 Glu Tyr Asp Ile Glu Tyr Phe Val Gly Thr Gly Val Thr Ser Gly Pro
85 90 95 Asn Ile Glu Val Leu Val Asp Val Asn Gly Thr Trp Gin Ser Gin Gly
100 105 110 Ser Val Ala Val Pro Tyr Gly Ser Trp Asp Asp Phe Gin Ser Leu Thr
115 120 125 Pro Ser His Thr Val Thr Leu Pro Val Gly Thr Ser Thr Val Arg Leu
130 135 140

<Desc/Clms Page number 19>

Leu Ala Val Gly Ser Thr Trp Gin Trp Asn Leu Glu Ser Phe Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gin Val Ser Pro Val Glu Pro Val Gly Asp Ala Asp Asn Asp Gly
165 170 175 Val Asn Asp Asn Gin Asp Leu Cys Pro Asn Ser Pro Ser Gly Val Thr
180 185 190 Val Asp Asn Asn Gly Cys Gin Ile Thr Gly Gly Thr Asp Pro Gly Gly
195 200 205 Glu Ser Phe Val Ile Gln Met Glu Ala Phe Asp Ser Thr Gly Ser Asp 210 215 220 Asp Ser Arg Ala Lys Gly Val Ile !le Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gln 225 230 235 240 Asp Lys His Thr Val Val Asp Ser Val Gin Thr Thr Asp Trp Val Asp
245 250 255 Tyr Ser Ile Asn Phe Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Ser Val Ser Met Leu
260 265 270 Ala Ser Gly Gin Thr Asp His Ala Thr Ala Val Leu Tyr Leu Asp Gly
275 280 285 Thr Glu Ile Asn Glu Val Pro Val His Thr Gly Ser Gin Ala Asp Phe
290 295 300 Ala Asn Phe Gin Leu Ala Gly Ser Val Tyr Ile Ala Ser Gly Thr His 305 310 315 320 Thr Ile Arg Val Gin Ala Gin Ser Ser Thr Gly Glu Phe Ser Trp Leu
325 330 335 Trp Phe Gly Asp Ala Leu Thr Phe Thr Asn Leu Asp Ser Asp Gly Gly
340 345 350 Asn Gly Gly Glu Ala Thr Gin Asp Ala Asp Asn Asp Gly Val Leu Asp
355 360 365 Ser Ser Asp Ser Cys Pro Asn Thr Pro Thr Gly Glu Pro Ala Asp Val
370 375 380 Thr Gly Cys Ser Ala Ser Gin Leu Asp Asp Asp Asn Asp Gly Val Ser 385 390 395 400 Asn Asn Val Asp Gin Cys Pro Asn Thr Val Ala Gly Thr Glu Val Asp
405 410 415 Ala Asp Gly Cys Glu Val Ile Phe Ala Asp Ala Asp Asn Asp Gly Ile
420 425 430 Glu Asp Ser Gin Asp Phe Cys Pro Asn Thr Pro Ala Gly Glu Ala Val
435 440 445 Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Ser Gin Leu Asp Ala Asp Asn Asp Gly
450 455 460 Val Thr Asn Asn Ile Asp Gin Cys Pro Asn Thr Pro Ala Gly Thr Gin 465 470 475 480 Val Asp Ala Ser Gly Cys Glu Thr Asp Asn Gly Gly Glu Pro Gly Asp
485 490 495

<Desc/Clms Page number 20>

Ser Tyr Tyr His Asn Gly Gin Gly Leu Leu Phe Gly Arg Val Asp Gly
500 505 510 Ala Thr Asn Phe Leu Gly Glu Glu Gly Tyr Val Ala Asn Pro Asp Asn
515 520 525 Tyr Asp Val Thr Thr Asp Leu Leu Glu Thr Asp Asp Ala Ile Arg Ala
530 535 540 Asn Ser Thr Glu Val Phe Arg Gly Glu Ile Tyr Asp Ala Asp Gly His 545 550 555 ' 560 Ile Ala Phe Tyr Glu His Ile Asp Asp Ser Val Arg Leu Tyr Ile Asp
565 570 575 Gly Gln Leu Val Leu Ser Asn Asp Ser Trp Glu Asn Ser Ser Gin Thr
580 585 590 Thr Asp Leu Asn Leu Thr Pro Gly Trp His Asn Phe Glu Leu Arg Leu
595 600 605 Gly Asn Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Val Ser Gly Ile Gly Phe Gly
610 615 620 Ile Asp Val Asp Gly Gly Thr Asn Phe Val His Pro Ser Asn Leu Ser 625 630 635 640 Pro Ser Met Phe Arg Ala Ser Gly Gin Val Val Val Asp Pro Ile Leu
645 650 655 pro Pro Ser Gly Gly Ile Tyr Ile Gin Leu Glu Asp Phe Asp Glu Thr
660 665 670 Gly Thr Val Gly Arg Val Ala Ser Asp Pro Asn Asp Gly Phe Val Lys
675 680 685 Gly Asp Ser Asn Val Gly Trp Val Thr Asn Gly Asp Trp Gly Lys Tyr
690 695 700 His Asn Val Phe Leu Glu Ala Gly Thr Tyr Arg Ala Phe Ile Thr Val 705 710 715 720 Ser Thr Pro Ala Gly Gly Ser Tyr Gly Ala Arg Val Asp Ile Asp Gly
725 730 735 Glu Pro Phe Ala Trp Gly Tyr Phe Asp Ser Thr Gly Gly Trp Asp Ile
740 745 750 Ala Ala Glu Tyr Glu Leu Tyr Gly Gly His Leu Val Val Glu Ser Thr
755 760 765 Gly Asn His Thr Leu His Val Glu Ala Val Gly Gly Ser Asp Trp Gin
770 775 780 Trp Ser Gly Asp Leu Val Arg Leu Ala Lys Val Ser Asp Ser Ala Val 785 790 795 800 Lys Gin Pro Arg Val Tyr Asn Pro Asn Glu His Ile Val Ala Glu Ile
805 810 815 Gln Gly Pro Ala Thr Gly Leu Gin Tyr Leu Lys Thr Pro Val Glu Ile
820 825 830 Pro Leu Ala Asn Lys Val Leu Lys Ser Asp Val Trp Tyr Thr Tyr Pro
835 840 845

<Desc/Clms Page number 21>

Gln Asn Arg Asn Leu Val Val Asp Gly Asp Thr Pro Tyr Ala Asp Phe
850 855 860 Gly Ala Thr Gly Ala Phe Trp Gly His Pro Pro Glu His Asp Phe Tyr 365 870 875 880 Asp Asp Thr ValIle Met Asp Trp Ala Val Asn Val Val Asp Asp Phe
885 890 895 Gln Ser Glu Gly Phe Glu Tyr Thr Ala Arg Gly Glu Phe Asp Trp Gly
900 905 910 Tyr Gly Trp Phe Thr Glu Phe Thr Thr Asn Pro Gin Pro His Tyr Val
915 920 925 Gln Thr Leu Asp Gly Arg Asn Val Arg Met Thr Phe Met Gly Tyr Leu
93C 935 " 940 Ser His Asp Gly Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser Asn His Ser Pro Ala 945 950 955 960 Phe Val Pro Phe Met Lys Ser Gin Val Asp Gin Ile Leu Lys Ala Asn
965 970 975 Pro Asp Lys Leu Met Phe Asp Thr Gin Thr Asn Ser Thr Arg Ser Thr
980 985 990 Asp Met Arg Thr Phe Gly Gly Asp Phe Ser Pro Tyr Ala Met Glu Asn
995 1000 1005 PheArg Val Trp Leu Leu Lys Lys Tyr Ser Asn AlaGln Leu ValSer
1010 1015 ' 1020 Met Gly Ile Asn Asp Ile Thr Ser Phe Asp Tyr Gly Ala Tyr Leu Arg 1025 1030 1035 1040 Ala Gln Gly Ile Thr His Thr Asp Trp Ser Asn Ala Gly Asp Thr Ile
1045 1050 1055 Ser Gly Asn Ile Pro Met Met Glu Asp Phe Ile Tyr Phe Asn Arg Asp
1060 1065 1070 Val Trp Asn Gin Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Tyr Ile Arg Gin Gln
1075 1080 1085 Arg ?rc Asn Ile Glu !leGly Ala Ser Thr His Leu Phe Glu Ser Arg 1090 1095 1100 Gly Tyr !le Phe Asn Glu Asn Ile Thr Phe Leu Ser Gly Glu Leu Asn 1105 1110 1115 1120 Leu Gly Ala Arg Thr Ser Ile Ser Glu Leu Pro Thr Asn Ile Leu Val
1125 1130 1135 His Leu Lys Gly Ala Gin Ala Val Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Phe Pro
1140 1145 1150 Tyr Pro Trp Glu Phe Asp Glu Leu Arg Ile Gin Asn Ala Pro Arg Phe
1155 1160 1165 Gly Arg Gly Trp Val Ala Gin Ala Tyr Ala Tyr Gly Gly Leu Phe Ser
1170 1175 1180 Ile Pro Ala Asn Val Trp Val Gly Gly Glu Val Phe Thr Trp Ser Pro 1185 1190 1195 1200

<Desc/Clms Page number 22>

Gly Ala Asp Asn Tyr Arg Asp Ile Tyr Gln Phe Val Arg Ala Gin Ala
1205 1210 1215 Asn Leu Leu Asp Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Lys Ala Gly Tyr Val His
1220 1225 1230 Ala Met Phe Ser Ser Met Lys Ala Gly Phe Ile Asp Gly Gly Asn Gln
1235 1240 1245 Val Gin Ser Ser Val Lys Ile Leu Thr Glu Asp Asn Ile Asn Phe Asp
1250 1255 1260 Met Leu Val Phe Gly Asp Ala Gly Tyr Pro Val Val Pro Arg Gin Ala 1265 1270 1275 1280 Asp Phe Asp Lys Phe Glu Tyr Ile Phe Tyr Asp Gly Asp Leu Asn Tyr
1285 1290 1295 Leu Thr Ala Glu Gin Gin Ala Val Leu Asp Ala Gin Gly Ser Lys Val
1300 1305 1310 Lys His Ile Gly Gin Arg Gly Thr Ile Ala Gly Leu Gin Ile Asn Val 1315 1320 1325 Ser Ile Asn Gly Ser Val Ser Asn Glu Thr Val Ser Ala Val Ser Arg
1330 1335 1340 =le His Glu Thr Asp Ser Thr Ala Pro Tyr Val Val His Leu Ile Asn 1345 1350 1355 1360 Arg Pro Phe Ala Gly Gly Val Thr Pro Ile Leu Asn Asn Val Glu Val
1365 1370 1375 Ala Ile Pro Ala Ser Tyr Phe Pro Gln Gly Val Thr Ser Ala Lys Leu
1380 1385 1390 His Leu Pro Asp Gly Ser Ser Ser Thr Val Ala Val Ser Thr Asn Ala
1395 1400 1405 Asn Gly Asp Thr Val Val Ser Val Ser Asn Leu Glu Val Trp Gly Ile
1410 1415 1420 Leu Glu Leu Ala His

Claims (8)

1. REVENDICATIONS 1. Gène agaA codant pour une a-agarase, caractérisé en ce qu'il a la SEQ ID N 1.
2. 2. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour une a-agarase de "Alteromonas agarilytica"DSM 12513.
3. 3. Protéine AgaA de "Alteromonas agarilytica" DSM 12513, caractérisée en ce qu'elle a la SEQ ID N 2.
4. 4. Fragments peptidiques de la protéine selon la revendication 3 résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité a-agarase.
5. 5. Séquences d'acides nucléiques codant pour la protéine selon la revendication 3 et pour les fragments peptidiques selon la revendication 4.
6. 6. Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est constituée par : a) la séquence d'ADN SEQ ID N 1 codant pour la protéine AgaA et les fragments d'ADN codant pour les fragments peptidiques de ladite protéine ; b) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments ; c) les séquences d'ADN qui. en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour la protéine AgaA ou les fragments de celle-ci ; et d) les séquences d'ARNm correspondantes.
7. 7. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 5 ou 6 et les moyens nécessaires à son expression.
8. 8. Micro-organismes ou cellules hôtes transformés par un vecteur d'expression selon la revendication 7.