JPH0670768A - ブラストサイジンｓデアミナーゼ遺伝子 - Google Patents
ブラストサイジンｓデアミナーゼ遺伝子Info
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ブラストサイジンＳをマーカーとして用いる
ことができる発現用ベクターの構築。 【構成】 ブラストサイジンＳデアミナーゼをコードす
る遺伝子、当該遺伝子を組み込んだベクター、及び当該
ベクターで形質転換体及び形質導入体。
ことができる発現用ベクターの構築。 【構成】 ブラストサイジンＳデアミナーゼをコードす
る遺伝子、当該遺伝子を組み込んだベクター、及び当該
ベクターで形質転換体及び形質導入体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なブラストサイジ
ンＳデアミナーゼ、当該ブラストサイジンＳデアミナー
ゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を組み込んだ発現ベ
クター、及び当該発現ベクターを用いて形質転換した形
質転換体に関する。
ンＳデアミナーゼ、当該ブラストサイジンＳデアミナー
ゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を組み込んだ発現ベ
クター、及び当該発現ベクターを用いて形質転換した形
質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
バイオテクノロジー技術の発達によって、動物のみなら
ず、植物においても遺伝子操作が盛んに行なわれるよう
になっている。かかる遺伝子操作を行なう際には、その
生物の種類に応じたベクターを用いるのが通例である。
このようなベクターにおいては、目的とする遺伝子がホ
スト細胞において確かに組み込まれたか否かを判断する
マーカーが通常組み込まれている。例えばカナマイシン
耐性、クロラムフェニコール耐性等が代表的なマーカー
として用いられている。
バイオテクノロジー技術の発達によって、動物のみなら
ず、植物においても遺伝子操作が盛んに行なわれるよう
になっている。かかる遺伝子操作を行なう際には、その
生物の種類に応じたベクターを用いるのが通例である。
このようなベクターにおいては、目的とする遺伝子がホ
スト細胞において確かに組み込まれたか否かを判断する
マーカーが通常組み込まれている。例えばカナマイシン
耐性、クロラムフェニコール耐性等が代表的なマーカー
として用いられている。
【０００３】しかしながら、これらの薬剤耐性マーカー
に対応する抗生物質は、医学上及び環境中の安全性の観
点から、取り扱い上格別の注意を必要とするのが常であ
る。そこで、比較的安全な薬剤耐性マーカーを用いた、
発現用ベクターの確立が望まれている。さらに、特定の
農薬に対して耐性を有する有用植物を作出し、より、効
率的な農業生産を企図することが望まれている。
に対応する抗生物質は、医学上及び環境中の安全性の観
点から、取り扱い上格別の注意を必要とするのが常であ
る。そこで、比較的安全な薬剤耐性マーカーを用いた、
発現用ベクターの確立が望まれている。さらに、特定の
農薬に対して耐性を有する有用植物を作出し、より、効
率的な農業生産を企図することが望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、広範な生物種に対
して蛋白合成阻害活性を有し、農業用抗生物質として汎
用されているアミノヌクレオシド系抗生物質であるブラ
ストサイジン (Blasticidin)Ｓ (以下、BcS と略記す
る) に着目して本発明を完成するに至った。
解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、広範な生物種に対
して蛋白合成阻害活性を有し、農業用抗生物質として汎
用されているアミノヌクレオシド系抗生物質であるブラ
ストサイジン (Blasticidin)Ｓ (以下、BcS と略記す
る) に着目して本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本願は、以下の発明を提供する
ものである。 (１) 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するブラ
ストサイジンＳデアミナーゼ。 (２) 配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする
ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。
ものである。 (１) 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するブラ
ストサイジンＳデアミナーゼ。 (２) 配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする
ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。
【０００６】(３) 配列番号２に示されるアミノ酸配列
をコードするブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。 (４) 配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする
ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。 (５) ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子として、
少なくとも配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝
子を組み込んだベクター。
をコードするブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。 (４) 配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする
ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。 (５) ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子として、
少なくとも配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝
子を組み込んだベクター。
【０００７】(６) (５) 記載のベクターで形質転換又
は形質導入した形質転換体又は形質導入体。 ブラストサイジンＳデアミナーゼ( 以下、BcS デアミナ
ーゼと略記する) は、すでに記載した、現在主に抗イネ
いもち病薬剤等として汎用されているBcS の不活性化酵
素である。
は形質導入した形質転換体又は形質導入体。 ブラストサイジンＳデアミナーゼ( 以下、BcS デアミナ
ーゼと略記する) は、すでに記載した、現在主に抗イネ
いもち病薬剤等として汎用されているBcS の不活性化酵
素である。
【０００８】すでに、本発明者らは、かかる酵素をコー
ドする遺伝子bsr を BcS耐性を有すBacillus cereus K5
5-S1由来のプラスミドから単離した (Kamakura et al.,
Agric.Biol.Chem.,51(11),3165-3168(1987))が、かかる
bsrをイネいもち病菌 (Pyricularia oryzae) に導入
しても、Bcs デアミナーゼ活性は発現されなかった。本
発明に係るブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子は、
上記の bsrとは全く異なる構造の遺伝子 (以下、bsrAと
記載する) である。 Ａ. bsrAの単離bsrA の単離は、ブラストサイジンＳデアミナーゼ産生菌
として知られている糸状菌 Aspergillus terreus S-7
12菌 (ATCC 28865) の cＤＮＡを用いて通常のクローニ
ング法により行なわれる。
ドする遺伝子bsr を BcS耐性を有すBacillus cereus K5
5-S1由来のプラスミドから単離した (Kamakura et al.,
Agric.Biol.Chem.,51(11),3165-3168(1987))が、かかる
bsrをイネいもち病菌 (Pyricularia oryzae) に導入
しても、Bcs デアミナーゼ活性は発現されなかった。本
発明に係るブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子は、
上記の bsrとは全く異なる構造の遺伝子 (以下、bsrAと
記載する) である。 Ａ. bsrAの単離bsrA の単離は、ブラストサイジンＳデアミナーゼ産生菌
として知られている糸状菌 Aspergillus terreus S-7
12菌 (ATCC 28865) の cＤＮＡを用いて通常のクローニ
ング法により行なわれる。
【０００９】すなわち、 Aspergillus terreus S-712
を BcS存在下で培養した菌糸よりｍＲＮＡ抽出し、オリ
ゴdTプライマーを用いて cＤＮＡを合成する。次いで、
かかる cＤＮＡをクローニング用ベクターに組み込ん
で、これを宿主に導入して cＤＮＡライブラリーを調製
し、当該形質転換体を BcSプレートにレプリカして、こ
の BcSプレートで生産可能なコロニーを選択・増殖させ
ることによって所望のbsrAを単離することができる。
を BcS存在下で培養した菌糸よりｍＲＮＡ抽出し、オリ
ゴdTプライマーを用いて cＤＮＡを合成する。次いで、
かかる cＤＮＡをクローニング用ベクターに組み込ん
で、これを宿主に導入して cＤＮＡライブラリーを調製
し、当該形質転換体を BcSプレートにレプリカして、こ
の BcSプレートで生産可能なコロニーを選択・増殖させ
ることによって所望のbsrAを単離することができる。
【００１０】なお、後述する手法により、bsrAの塩基配
列が判明した場合には、bsrAの塩基配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR 法 (Saiki et a
l.,Science,239,487-491(1988)) により、上記クローニ
ングを行なうことができる。また、スクリーニング法も
上記の他、免疫スクリーニング法、ハイブリッド分子形
成法等を用いて行なうこともできる。 Ｂ. bsrAの塩基配列の決定は、常法、例えば、マキサム
−ギルバートの化学修飾法 (Maxam-Gilbert, Meth. En
zym., 65, 499-560 (1980)) 、サンガーらの方法(F. Sa
nger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74：54
63-5467 (1977))等を用いて行なうことができる。 Ｃ. 次に、BcS デアミナーゼ遺伝子として、少なくとも
配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子を組み込
んだベクターを構築する。
列が判明した場合には、bsrAの塩基配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR 法 (Saiki et a
l.,Science,239,487-491(1988)) により、上記クローニ
ングを行なうことができる。また、スクリーニング法も
上記の他、免疫スクリーニング法、ハイブリッド分子形
成法等を用いて行なうこともできる。 Ｂ. bsrAの塩基配列の決定は、常法、例えば、マキサム
−ギルバートの化学修飾法 (Maxam-Gilbert, Meth. En
zym., 65, 499-560 (1980)) 、サンガーらの方法(F. Sa
nger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74：54
63-5467 (1977))等を用いて行なうことができる。 Ｃ. 次に、BcS デアミナーゼ遺伝子として、少なくとも
配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子を組み込
んだベクターを構築する。
【００１１】当該ベクター構築の基本となるベクター
は、bsrAの導入を企図する宿主の種類に応じて適宜選択
することができる。例えば、宿主として大腸菌を用いる
場合には、pBR322、pUC18 等を；枯草菌を用いる場合に
は、pHY300PLK(Ishiwa et al.,Jpn.Ｊ.Genet,61 ,515-5
28(1986))等を；酵母を用いる場合には、pYEUra3(東洋
紡績社製) 、pAU9(K.Okazaki et al.,Nuc.Acids.Res.,1
8 ,6485(1990))等を；動物細胞を用いる場合には、pMAM
-neo(F.Lee et al.,Nature,294,228(1981)) 等を；植物
細胞を用いる場合には、pBin19(M.Bevan.,Nuc.Acids.Re
s.,12,8711(1984)) 、pLGV1103(R.Hain et al.,Mol Gen
Genet,199,161(1985)) 等を用いることができる。さら
に、上記プラスミドの他、λZAPII等のファージベクタ
ー、pWE15(Stratagene社製) 等のコスミド等を用いるこ
ともできる。
は、bsrAの導入を企図する宿主の種類に応じて適宜選択
することができる。例えば、宿主として大腸菌を用いる
場合には、pBR322、pUC18 等を；枯草菌を用いる場合に
は、pHY300PLK(Ishiwa et al.,Jpn.Ｊ.Genet,61 ,515-5
28(1986))等を；酵母を用いる場合には、pYEUra3(東洋
紡績社製) 、pAU9(K.Okazaki et al.,Nuc.Acids.Res.,1
8 ,6485(1990))等を；動物細胞を用いる場合には、pMAM
-neo(F.Lee et al.,Nature,294,228(1981)) 等を；植物
細胞を用いる場合には、pBin19(M.Bevan.,Nuc.Acids.Re
s.,12,8711(1984)) 、pLGV1103(R.Hain et al.,Mol Gen
Genet,199,161(1985)) 等を用いることができる。さら
に、上記プラスミドの他、λZAPII等のファージベクタ
ー、pWE15(Stratagene社製) 等のコスミド等を用いるこ
ともできる。
【００１２】ベクターの構築に際して、原核生物用のベ
クターを基本ベクターとして採用する場合には、bsrAの
構造遺伝子の上流にプロモーター配列、SD配列等が位置
するように、ベクターを設計する必要がある。真核生物
用のベクターを基本ベクターとして採用する場合には、
上記と同様に、プロモーター、ＲＮＡのスプライス部
位、ポリアデニル化部位等が含まれるようにベクターを
設計する必要がある。
クターを基本ベクターとして採用する場合には、bsrAの
構造遺伝子の上流にプロモーター配列、SD配列等が位置
するように、ベクターを設計する必要がある。真核生物
用のベクターを基本ベクターとして採用する場合には、
上記と同様に、プロモーター、ＲＮＡのスプライス部
位、ポリアデニル化部位等が含まれるようにベクターを
設計する必要がある。
【００１３】さらに、bsrAの発現は、直接発現系に必ず
しも限定されるものではなく、例えばβ−ガラクトシダ
ーゼやβ−ラクタマーゼ等をコードする塩基配列を利用
して、融合蛋白発現系とすることができる。 Ｄ. かくして得られた発現ベクターの宿主細胞への導
入、及びこれによる形質転換の方法は、一般に用いられ
る方法を採ることができる。例えば、対数増殖期にある
細胞を集め、CaCl2 処理して自然にＤＮＡを取り込みや
すい状態にして、かかる処理細胞に、上記ベクターを取
り込ませる方法等を採用することができる。なお、かか
る方法において、形質転換効率の向上のため、MgCl2 や
RbClを更に共存させて、形質導入を行なうこともでき
る。
しも限定されるものではなく、例えばβ−ガラクトシダ
ーゼやβ−ラクタマーゼ等をコードする塩基配列を利用
して、融合蛋白発現系とすることができる。 Ｄ. かくして得られた発現ベクターの宿主細胞への導
入、及びこれによる形質転換の方法は、一般に用いられ
る方法を採ることができる。例えば、対数増殖期にある
細胞を集め、CaCl2 処理して自然にＤＮＡを取り込みや
すい状態にして、かかる処理細胞に、上記ベクターを取
り込ませる方法等を採用することができる。なお、かか
る方法において、形質転換効率の向上のため、MgCl2 や
RbClを更に共存させて、形質導入を行なうこともでき
る。
【００１４】上記で得られる所望の形質転換株を、常法
に従い培養することにより、所望のBcS デアミナーゼが
生産・蓄積される。当該培養に用いられる培地は、通常
の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれをも用いる
ことができる。例えば、L 培地、E 培地、M9培地等、又
は当該培地に通常知られている各種の炭素源、窒素源、
無機塩、ビタミン類等を添加した培地等を例示できる。
なお、上記トリプトファン・プロモーターを用いる場合
は、一般に当該プロモーターの働きを向上させるために
カザミノ酸を添加した上記の培地、例えばM9最小培地等
を用いて培養するのが好ましい。また、当該培地には培
養における適切な時期に、インドールアクリル酸等のト
リプトプァン・プロモーターの働きを強めるための薬剤
を添加することもできる。
に従い培養することにより、所望のBcS デアミナーゼが
生産・蓄積される。当該培養に用いられる培地は、通常
の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれをも用いる
ことができる。例えば、L 培地、E 培地、M9培地等、又
は当該培地に通常知られている各種の炭素源、窒素源、
無機塩、ビタミン類等を添加した培地等を例示できる。
なお、上記トリプトファン・プロモーターを用いる場合
は、一般に当該プロモーターの働きを向上させるために
カザミノ酸を添加した上記の培地、例えばM9最小培地等
を用いて培養するのが好ましい。また、当該培地には培
養における適切な時期に、インドールアクリル酸等のト
リプトプァン・プロモーターの働きを強めるための薬剤
を添加することもできる。
【００１５】上記培養により得られる培養物からのBcS
デアミナーゼの単離・精製は常法に従い実行可能であ
る。特に、BcS デアミナーゼを宿主から抽出する場合
は、例えば浸透圧ショック法等の温和な条件を採用する
のが、その高次構造保持の面からより好ましい。上記単
離・精製は、例えば当該ポリペプチドの物理・化学的性
質を利用した各種の処理操作に従い実施できる（例えば
「生化学データーブックII」pp1175〜1259、第１版・第
１刷、1980年6 月23日、株式会社東京化学同人発行参
照）。当該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋
白沈澱剤による処理、限外ろ過、分子篩クロマトグラフ
ィー (ゲルろ過) 、液体クロマトグラフィー、遠心分
離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、透析
法、又はこれらの組合せ等を採用できる。なお、上記操
作の好ましい一実施態様は次の通りである。
デアミナーゼの単離・精製は常法に従い実行可能であ
る。特に、BcS デアミナーゼを宿主から抽出する場合
は、例えば浸透圧ショック法等の温和な条件を採用する
のが、その高次構造保持の面からより好ましい。上記単
離・精製は、例えば当該ポリペプチドの物理・化学的性
質を利用した各種の処理操作に従い実施できる（例えば
「生化学データーブックII」pp1175〜1259、第１版・第
１刷、1980年6 月23日、株式会社東京化学同人発行参
照）。当該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋
白沈澱剤による処理、限外ろ過、分子篩クロマトグラフ
ィー (ゲルろ過) 、液体クロマトグラフィー、遠心分
離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、透析
法、又はこれらの組合せ等を採用できる。なお、上記操
作の好ましい一実施態様は次の通りである。
【００１６】まず培養上清より、BcS デアミナーゼを部
分精製する。この部分精製は、例えばアセトン、メタノ
ール、エタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミ
ド (DMF)等の有機溶媒や硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理、及び
／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外ろ過
処理等により行なわれる。これらの各処理の操作及び条
件は、通常、上記の方法において採用される条件等と同
様の方法を採用することができる。
分精製する。この部分精製は、例えばアセトン、メタノ
ール、エタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミ
ド (DMF)等の有機溶媒や硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理、及び
／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外ろ過
処理等により行なわれる。これらの各処理の操作及び条
件は、通常、上記の方法において採用される条件等と同
様の方法を採用することができる。
【００１７】次いで上記で得られた粗精製物を、ゲルろ
過に付すことにより、BcS デアミナーゼの活性が認めら
れる画分を収得する。ここで用いられるゲルろ過剤とし
ては特に限定はなく、例えばデキストランゲル、ポリア
クリルアミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミ
ド−アガロースゲル、セルロース等を素材とするものを
いずれも利用できる。これらの具体例としては、セファ
デックスG タイプ、同LHタイプ、セファロースタイプ、
セファクリルタイプ (以上、ファルマシア社製) 、セル
ロファイン (チッソ (株) 社製) 、バイオゲルP タイ
プ、同A タイプ (バイオ−ラド社製) 、ウルトロゲル
(LKB 社製) 、TSK-G タイプ (東ソー (株)社製) 等を例
示できる。
過に付すことにより、BcS デアミナーゼの活性が認めら
れる画分を収得する。ここで用いられるゲルろ過剤とし
ては特に限定はなく、例えばデキストランゲル、ポリア
クリルアミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミ
ド−アガロースゲル、セルロース等を素材とするものを
いずれも利用できる。これらの具体例としては、セファ
デックスG タイプ、同LHタイプ、セファロースタイプ、
セファクリルタイプ (以上、ファルマシア社製) 、セル
ロファイン (チッソ (株) 社製) 、バイオゲルP タイ
プ、同A タイプ (バイオ−ラド社製) 、ウルトロゲル
(LKB 社製) 、TSK-G タイプ (東ソー (株)社製) 等を例
示できる。
【００１８】目的ポリペプチドは、上記ゲルろ過により
得られるBcS デアミナーゼの活性画分を、例えばハイド
ロキシアパタイトカラムを用いたアフィニティークロマ
トグラフィー、DEAE法、CM法、SP法等によるイオン交換
カラムクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、
逆相高速液体クロマトグラフィー等に付すことにより、
又は上記各操作の組合せにより更に精製可能であり、均
質なBcS デアミナーゼとして単離できる。
得られるBcS デアミナーゼの活性画分を、例えばハイド
ロキシアパタイトカラムを用いたアフィニティークロマ
トグラフィー、DEAE法、CM法、SP法等によるイオン交換
カラムクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、
逆相高速液体クロマトグラフィー等に付すことにより、
又は上記各操作の組合せにより更に精製可能であり、均
質なBcS デアミナーゼとして単離できる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。
る。
【００２０】
【実施例１】bsrAの単離Aspergillus terreus S-712 株（ATCC 28865) を、Bc
S を250 μｇ／mlを含むYG培地で、28℃下、静置培養を
行った。次に、菌糸をスパチュラを用いて培養液から分
離した。かかる菌糸からQuick prep mRNA purification
KIT（ファルマシア社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、
ポリdTカラムを用いてｍＲＮＡを分離した。このｍＲＮ
Ａに、オリゴdT（ファルマシア社製）をプライマ−とし
て、リバ−ストランスクリプタ−ゼ（ファルマシア社
製）によりｃＤＮＡを調製した。かかるｃＤＮＡの両端
をT4ＤＮＡポリメラ−ゼにより平滑化させた後、T4ＤＮ
Ａリガ−ゼを用いてEco RI−Not I アダプタ―（ファル
マシア社製）を付加し、これを大腸菌用ファ−ジベクタ
−λＺＡＰII（Stratagene社製）のEco RI制限サイトに
挿入した。
S を250 μｇ／mlを含むYG培地で、28℃下、静置培養を
行った。次に、菌糸をスパチュラを用いて培養液から分
離した。かかる菌糸からQuick prep mRNA purification
KIT（ファルマシア社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、
ポリdTカラムを用いてｍＲＮＡを分離した。このｍＲＮ
Ａに、オリゴdT（ファルマシア社製）をプライマ−とし
て、リバ−ストランスクリプタ−ゼ（ファルマシア社
製）によりｃＤＮＡを調製した。かかるｃＤＮＡの両端
をT4ＤＮＡポリメラ−ゼにより平滑化させた後、T4ＤＮ
Ａリガ−ゼを用いてEco RI−Not I アダプタ―（ファル
マシア社製）を付加し、これを大腸菌用ファ−ジベクタ
−λＺＡＰII（Stratagene社製）のEco RI制限サイトに
挿入した。
【００２１】こうして得られた組換えファージＤＮＡを
GigapackII（Stratagene社製）を用いて挿入した後、大
腸菌に感染させてλファージ粒子として回収した。次
に、OD 600 ＝1 のXL-1Blue 200μｌ、線状ヘルパーファ
ージＲ408(Stratagene社製）（１×106 pfu/ml）１μｌ
を混合し、37℃で15分間インキュベートした後、さらに
５mlの２×YT培地を加え、37℃で3 時間培養して重感染
させた。さらに、かかる培養物を70℃で20分間熱処理
し、当該熱処理の後、遠心分離（4000xg）を5 分間行っ
てその上清を採取した。
GigapackII（Stratagene社製）を用いて挿入した後、大
腸菌に感染させてλファージ粒子として回収した。次
に、OD 600 ＝1 のXL-1Blue 200μｌ、線状ヘルパーファ
ージＲ408(Stratagene社製）（１×106 pfu/ml）１μｌ
を混合し、37℃で15分間インキュベートした後、さらに
５mlの２×YT培地を加え、37℃で3 時間培養して重感染
させた。さらに、かかる培養物を70℃で20分間熱処理
し、当該熱処理の後、遠心分離（4000xg）を5 分間行っ
てその上清を採取した。
【００２２】その結果、in vivoで大腸菌用ファ−ジベ
クタ−λＺＡＰIIにより切り出され、かつ一本鎖ＤＮＡ
として線状ファージにパッケージングされたファージ粒
子を得た。当該ファージ粒子を、Eschericia coli XL-
1Blue に感染させて、c ＤＮＡがファージミドとして保
持されたEschericia coli XL-1Blue を得た。このEsch
ericia coli XL-1Blue を150 μｇ／mlのBcS を含むLB
培地のプレートにレプリカして、生育したコロニーを単
離する操作を20回繰り返した。これによって得られたコ
ロニー４個のうち、１個をbrsAを含むクローンとして単
離してこれをEschericia coli XL-1Blue ／pBSA712 と
命名した。
クタ−λＺＡＰIIにより切り出され、かつ一本鎖ＤＮＡ
として線状ファージにパッケージングされたファージ粒
子を得た。当該ファージ粒子を、Eschericia coli XL-
1Blue に感染させて、c ＤＮＡがファージミドとして保
持されたEschericia coli XL-1Blue を得た。このEsch
ericia coli XL-1Blue を150 μｇ／mlのBcS を含むLB
培地のプレートにレプリカして、生育したコロニーを単
離する操作を20回繰り返した。これによって得られたコ
ロニー４個のうち、１個をbrsAを含むクローンとして単
離してこれをEschericia coli XL-1Blue ／pBSA712 と
命名した。
【００２３】YG培地の組成: 0.5 ％イーストエキス、2
％グルコース 2 ×YT培地の組成: 16％トリプトン、10％イーストエキ
ス、5 ％ NaCl LB培地の組成: 10％トリプトン、5 ％イーストエキス、
10％NaCl
％グルコース 2 ×YT培地の組成: 16％トリプトン、10％イーストエキ
ス、5 ％ NaCl LB培地の組成: 10％トリプトン、5 ％イーストエキス、
10％NaCl
【００２４】
【実施例２】糸状菌で発現するBcS 耐性ベクターｐＢＦ
１０１の構築 pBS SK +（Stratagene社製）のユニークなSal I サイト
にAsperugillus nidulans由来のTrpC遺伝子のプロモー
ター及びターミネーターによってハイグロマイシンＢ耐
性遺伝子hph が発現するように設計されたベクター、pC
SN43(Staben etal.,Fungal Genet Neswsl,36,79-81(198
9)) を、37℃で１時間Cla I （TAKARA社製）で消化し、
hph 及びPolyA 付加シグナルを含む2Kb の断片を除い
た。次に残余の消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼによってセ
ルフライゲーションを行い、TrpCプロモーターのみをMC
S の上流に有するベクタpPtrpCを得た。
１０１の構築 pBS SK +（Stratagene社製）のユニークなSal I サイト
にAsperugillus nidulans由来のTrpC遺伝子のプロモー
ター及びターミネーターによってハイグロマイシンＢ耐
性遺伝子hph が発現するように設計されたベクター、pC
SN43(Staben etal.,Fungal Genet Neswsl,36,79-81(198
9)) を、37℃で１時間Cla I （TAKARA社製）で消化し、
hph 及びPolyA 付加シグナルを含む2Kb の断片を除い
た。次に残余の消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼによってセ
ルフライゲーションを行い、TrpCプロモーターのみをMC
S の上流に有するベクタpPtrpCを得た。
【００２５】次に、前記実施例１で得たpBSA712 にEco
RI（TAKARA社製）を31℃で１時間作用させて、これをゲ
ル電気泳動にかけることよって生成する559bp の断片を
単離した。さらにかかる559bp の断片を他方の断片にも
とと逆方向に挿入した。そして、この559bp の断片の下
流に存在するユニークなBam HIサイトに、前記pCSN43を
Bam HIで30℃下で１時間消化することによって得られた
約700bp のTrpCターミネーターを挿入した( pBTtrpC)。
RI（TAKARA社製）を31℃で１時間作用させて、これをゲ
ル電気泳動にかけることよって生成する559bp の断片を
単離した。さらにかかる559bp の断片を他方の断片にも
とと逆方向に挿入した。そして、この559bp の断片の下
流に存在するユニークなBam HIサイトに、前記pCSN43を
Bam HIで30℃下で１時間消化することによって得られた
約700bp のTrpCターミネーターを挿入した( pBTtrpC)。
【００２６】さらに、このpBTtrpC をSac I （TAKARA社
製）及びEco RV（TAKARA社製）で37℃下１時間処理し
て、これにより生ずるbsrA遺伝子とpolyA 付加シグナル
を含む約1.3kbp断片を、前記pPtrpCのSac I サイトとEc
o RVサイト間の断片と置換することにより、糸状菌用Bc
S 耐性ベクターであるｐBF101 を得た。以上述べたpBF1
01は、Eschericia coli JM109に導入され、当該菌株は
Eschericia coli JM109/pBF101 として、工業技術院微
生物工業研究所に寄託されている( 寄託番号 FERM P-13
083 ）。
製）及びEco RV（TAKARA社製）で37℃下１時間処理し
て、これにより生ずるbsrA遺伝子とpolyA 付加シグナル
を含む約1.3kbp断片を、前記pPtrpCのSac I サイトとEc
o RVサイト間の断片と置換することにより、糸状菌用Bc
S 耐性ベクターであるｐBF101 を得た。以上述べたpBF1
01は、Eschericia coli JM109に導入され、当該菌株は
Eschericia coli JM109/pBF101 として、工業技術院微
生物工業研究所に寄託されている( 寄託番号 FERM P-13
083 ）。
【００２７】なお、以上記載したプラスミドpBF101の構
築図を図１に示す。
築図を図１に示す。
【００２８】
【実施例３】大腸菌のpBSA712 による形質転換 下記のＬ培地で、一夜前に培養したEschericia coli J
M109をL 培地10mlに１％接種し、37℃で保温振盪培養し
た。濁度計で濁度（OD550 ）が0.3 に達した時点で、培
養液を遠心して集菌し、菌体を100ml 塩化カルシウム溶
液に懸濁した。得られた懸濁液を氷冷下で一晩放置した
後、当該懸濁液( コンピテント細胞含有) に、実施例１
で得たプラスミドＤＮＡを加え、さらに30分間氷冷保存
した後、37℃で30分間ヒートショックにかけた。BcS 耐
性マーカーで選択するため、ヒートショックをかけた懸
濁液を直ちにBcS 150 μg/mlを含む寒天L 培地プレート
に塗抹接種し、37℃で保存した。その結果、耐性コロニ
ーが出現し、形質転換したEschericia coli JM109／pB
SA712 を得た。かかる形質転換株は、工業技術院微生物
工業研究所に寄託されている( 寄託番号 FERM P-13082
）。
M109をL 培地10mlに１％接種し、37℃で保温振盪培養し
た。濁度計で濁度（OD550 ）が0.3 に達した時点で、培
養液を遠心して集菌し、菌体を100ml 塩化カルシウム溶
液に懸濁した。得られた懸濁液を氷冷下で一晩放置した
後、当該懸濁液( コンピテント細胞含有) に、実施例１
で得たプラスミドＤＮＡを加え、さらに30分間氷冷保存
した後、37℃で30分間ヒートショックにかけた。BcS 耐
性マーカーで選択するため、ヒートショックをかけた懸
濁液を直ちにBcS 150 μg/mlを含む寒天L 培地プレート
に塗抹接種し、37℃で保存した。その結果、耐性コロニ
ーが出現し、形質転換したEschericia coli JM109／pB
SA712 を得た。かかる形質転換株は、工業技術院微生物
工業研究所に寄託されている( 寄託番号 FERM P-13082
）。
【００２９】このEschericia coli JM109／pBSA712 か
ら、プラスミドＤＮＡpBSA712 を単離して、前述のサン
ガーらの方法に従って、その塩基配列を決定した。その
結果、プラスミドＤＮＡは、配列番号３に示した塩基配
列を有することが判明した。この559bp の塩基配列のう
ち、配列番号２に示した393bp の配列がオープンリーデ
イングフレームであることが推定された。そして、当該
オープンリーデイングフレームは配列番号１に示したア
ミノ酸をコードすることが推定された。
ら、プラスミドＤＮＡpBSA712 を単離して、前述のサン
ガーらの方法に従って、その塩基配列を決定した。その
結果、プラスミドＤＮＡは、配列番号３に示した塩基配
列を有することが判明した。この559bp の塩基配列のう
ち、配列番号２に示した393bp の配列がオープンリーデ
イングフレームであることが推定された。そして、当該
オープンリーデイングフレームは配列番号１に示したア
ミノ酸をコードすることが推定された。
【００３０】L 培地の組成：10％バクト−トリプトン、
5 ％イーストエキス、5 ％NaCl、1 ％グルコース(pH7.
2)
5 ％イーストエキス、5 ％NaCl、1 ％グルコース(pH7.
2)
【００３１】
【実施例４】プラスミドpBSA712 及びpBF101の単離・精
製 前記L 培地 (5 ml) で一晩前培養したEshericia coli J
M109／pBSA712 の菌体を遠心後集菌し、20mMトリス・HC
l 、10mM EDTA 及び50mMグルコースよりなる緩衝液 (pH
8.0)で懸濁した(200μl)。これに終濃度10mg/ml となる
ようリゾチームを加え、室温で５分間放置した後、更に
200μl の0.2 N NaOH、１％SDS ( ドデシルスルホン酸
ソーダ) 溶液を加え、これを穏やかに混合し、氷冷下で
5 分間放置した。これに150 μl の5 M 酢酸カリウム
(pH4.8)を加えて十分に混合し、氷冷下で10分間置いた
後、これを遠心して、菌体破片と水溶性画分とに分画し
た。次に、得られた水溶性画分に 600mlのイソプロピル
アルコールを加えて室温で10分間放置してＤＮＡを沈澱
させた。得られた沈澱を集めて400ml の10mMトリス・HC
l 、1mM EDTA(TE)を含む緩衝液で再度懸濁して、フェノ
ールで蛋白質を除去してから２倍容のエタノールでＤＮ
Ａを再沈澱させた。沈澱をもう一度TE緩衝液(150μl)に
溶かし、これをリボヌクレアーゼで処理してＲＮＡを分
割してから20％ポリエチレングリコール6000、2.5MNaCl
溶液の90μl を加えてプラスミドＤＮＡのみを沈澱さ
せ、回収した (収量5 μg)。
製 前記L 培地 (5 ml) で一晩前培養したEshericia coli J
M109／pBSA712 の菌体を遠心後集菌し、20mMトリス・HC
l 、10mM EDTA 及び50mMグルコースよりなる緩衝液 (pH
8.0)で懸濁した(200μl)。これに終濃度10mg/ml となる
ようリゾチームを加え、室温で５分間放置した後、更に
200μl の0.2 N NaOH、１％SDS ( ドデシルスルホン酸
ソーダ) 溶液を加え、これを穏やかに混合し、氷冷下で
5 分間放置した。これに150 μl の5 M 酢酸カリウム
(pH4.8)を加えて十分に混合し、氷冷下で10分間置いた
後、これを遠心して、菌体破片と水溶性画分とに分画し
た。次に、得られた水溶性画分に 600mlのイソプロピル
アルコールを加えて室温で10分間放置してＤＮＡを沈澱
させた。得られた沈澱を集めて400ml の10mMトリス・HC
l 、1mM EDTA(TE)を含む緩衝液で再度懸濁して、フェノ
ールで蛋白質を除去してから２倍容のエタノールでＤＮ
Ａを再沈澱させた。沈澱をもう一度TE緩衝液(150μl)に
溶かし、これをリボヌクレアーゼで処理してＲＮＡを分
割してから20％ポリエチレングリコール6000、2.5MNaCl
溶液の90μl を加えてプラスミドＤＮＡのみを沈澱さ
せ、回収した (収量5 μg)。
【００３２】回収したＤＮＡに蒸留水を加え、更に、こ
の1/10量の0.25％ブロムフェノールブルーと5 ％グリセ
ロールを加えた。得られたＤＮＡ溶液を、アガロースゲ
ル電気泳動( 0.8 ％アガロースゲル (60mm×4 mm) 、緩
衝液 : 40mM トリス・HCl 4.8g、2mM EDTA ・2Na 0.74g
、酢酸0.14ml (pH8.1)、蒸留水1 リットル中、電圧 10
0Ｖ) に付し、単一のプラスミドＤＮＡであることを確
認した。
の1/10量の0.25％ブロムフェノールブルーと5 ％グリセ
ロールを加えた。得られたＤＮＡ溶液を、アガロースゲ
ル電気泳動( 0.8 ％アガロースゲル (60mm×4 mm) 、緩
衝液 : 40mM トリス・HCl 4.8g、2mM EDTA ・2Na 0.74g
、酢酸0.14ml (pH8.1)、蒸留水1 リットル中、電圧 10
0Ｖ) に付し、単一のプラスミドＤＮＡであることを確
認した。
【００３３】また、Eshericia coli JM109／pBF101につ
いても上と同様の操作を行なったところ、単一のpBF101
が単離精製された。
いても上と同様の操作を行なったところ、単一のpBF101
が単離精製された。
【００３４】
【実施例５】 BcSデアミナーゼの抽出・単離・精製 実施例３で得たEschericia coli JM109／pBSA712 株を
Ｌ培地 (BcS 2 μg/mlを含む) １リットルで37℃で16時
間振盪培養し、次いで、これを遠心分離 (6000×ｇ、6
分) した。得られた菌体を生理食塩水 100mlで洗浄し
て、次いで遠心分離 (6000×ｇ、6 分) の操作を２回く
り返した。菌体を0.1 Ｍリン酸緩衝液 (pH8.2) 50 ％グ
リセリンに5 〜10ml懸濁し、超音波破砕した後、遠心分
離 (5000×ｇ、6 分) した。上清 (粗酵素液) に20％(w
/v)(NH4)2SO4 を加え、0 〜4 ℃で30分間放置した。次
いで遠心分離 (8500×ｇ、20分) し、上清に (NH4)2SO
4 を40％ (w/v)になるように加え、0 〜4 ℃で30分間放
置した。沈澱に0.1 Ｍリン酸緩衝液 10 ％グリセリンを
加え、次いで20％(w/v)(NH4)2SO4を加え、不純物を沈澱
させた後、更に (NH4)2SO4を40％(w/v) になるまで加え
て、酵素蛋白を沈澱させた。
Ｌ培地 (BcS 2 μg/mlを含む) １リットルで37℃で16時
間振盪培養し、次いで、これを遠心分離 (6000×ｇ、6
分) した。得られた菌体を生理食塩水 100mlで洗浄し
て、次いで遠心分離 (6000×ｇ、6 分) の操作を２回く
り返した。菌体を0.1 Ｍリン酸緩衝液 (pH8.2) 50 ％グ
リセリンに5 〜10ml懸濁し、超音波破砕した後、遠心分
離 (5000×ｇ、6 分) した。上清 (粗酵素液) に20％(w
/v)(NH4)2SO4 を加え、0 〜4 ℃で30分間放置した。次
いで遠心分離 (8500×ｇ、20分) し、上清に (NH4)2SO
4 を40％ (w/v)になるように加え、0 〜4 ℃で30分間放
置した。沈澱に0.1 Ｍリン酸緩衝液 10 ％グリセリンを
加え、次いで20％(w/v)(NH4)2SO4を加え、不純物を沈澱
させた後、更に (NH4)2SO4を40％(w/v) になるまで加え
て、酵素蛋白を沈澱させた。
【００３５】次いでセファデックス (Sephadex) G100で
ゲル濾過 (溶出液：0.01M トリス・HCl 緩衝液 (pH7.5)
−2mM DTT)を用い、濃縮した。これを2 日間透析した
後、ピリミジノブラストサイジンＳをリガンドした活性
化ＣＨ−セファロースアフィニティカラムを通過させ
(溶出液：0.01Ｍトリス・HCl 緩衝液 (pH7.5)) 、次い
でこれを濃縮し、酵素標品 (BcSデアミナーゼ) とし
た。
ゲル濾過 (溶出液：0.01M トリス・HCl 緩衝液 (pH7.5)
−2mM DTT)を用い、濃縮した。これを2 日間透析した
後、ピリミジノブラストサイジンＳをリガンドした活性
化ＣＨ−セファロースアフィニティカラムを通過させ
(溶出液：0.01Ｍトリス・HCl 緩衝液 (pH7.5)) 、次い
でこれを濃縮し、酵素標品 (BcSデアミナーゼ) とし
た。
【００３６】
【実施例６】 BcSデアミナーゼ発現の確認 次に、実施例３で得たEschericia coli JM109／pBSA71
2 の活性が BcSデアミナーゼの発現によるものであるこ
とを確認するために、酵素活性を検討した。 BcSは酸性
条件下で 274nmに最大吸収を持ち、デアミノBcS は258n
m に最大吸収を示す。そこで、 BcSを添加した緩衝液を
耐性および感受性菌とインキュベートして、反応液の上
清のＵＶスペクトルを測定することにより、吸収波長の
シフトとして、酵素活性を検定した。親株であるEscher
icia coli JM109と30℃下で１時間インキュベートした
BcS溶液は、274nm の吸収を示したままだった。これに
対して、pBSA712 で形質転換したEschericia coli JM1
09／pBSA712 では、258 nmへのシフトが起こっており、
BcSデアミナーゼの活性の存在が示された。
2 の活性が BcSデアミナーゼの発現によるものであるこ
とを確認するために、酵素活性を検討した。 BcSは酸性
条件下で 274nmに最大吸収を持ち、デアミノBcS は258n
m に最大吸収を示す。そこで、 BcSを添加した緩衝液を
耐性および感受性菌とインキュベートして、反応液の上
清のＵＶスペクトルを測定することにより、吸収波長の
シフトとして、酵素活性を検定した。親株であるEscher
icia coli JM109と30℃下で１時間インキュベートした
BcS溶液は、274nm の吸収を示したままだった。これに
対して、pBSA712 で形質転換したEschericia coli JM1
09／pBSA712 では、258 nmへのシフトが起こっており、
BcSデアミナーゼの活性の存在が示された。
【００３７】
【実施例７】糸状菌のpBF101による形質転換 イネいもち病菌(Pyricuraria oryzae P2) を、プレー
トより３デイスクコルクボーラーで打ち抜き、これを10
0ml のYG液体培地で28℃下で2 日間振盪培養した。さら
に5ml を新しい同培地 100mlに接種し一晩培養した。当
該培養液を遠心分離することによって得た菌体を、滅菌
水で2 回、OM緩衝液で2 回洗浄した後、ノボザイム234
を含む酵素溶液で28℃、2 時間処理してプロトプラスト
化した。得られたプロトプラスト溶液に、0.5 容のST緩
衝液を静かに重層し4000×ｇで10分間遠心し、プロトプ
ラストを界面に集めた。このプロトプラストを2 倍量の
STC 緩衝液で洗浄後、108〜109／mlの濃度になるよう
に、STC 緩衝液に懸濁した。100 μl のプロトプラスト
溶液に対し5 μl のＤＮＡ溶液を加え静かにかき混ぜた
後、室温で25分放置した。PEG 溶液を 200μl、200 μ
l、800 μl の順に合計1200μl 加え、室温で20分間イ
ンキュベートした。1000×ｇで、5 分間遠心後、上清の
PEG 溶液を捨て、2.5 mlのYGS 液体培地で2 時間振盪培
養した後、再度集菌し、STC 緩衝液に懸濁し、これを20
μg/mlの BcSを含有させた再生寒天培地にスプレッドし
た。さらに同濃度の BcS を含む１％ Sea Plaque (1.2
Ｍソルビトール入り) を約5 ml重層し、固化した後、パ
ラフィルムでふたをして28℃で培養した。約5 日後より
形質転換体が出現しはじめ、形質転換効率は約200colon
ies/μg ＤＮＡの割合であった。 YG培地:0.5％イーストエキス、2 ％グルコース OM緩衝液:1.2 M MgSO 4 、 10mM Sodium phosphate (pH
5.8) Novozyme234 酵素溶液：5 mg/ml ( OM緩衝液中) ST緩衝液:0.6M ソルビトール、100mM Tris-HCl(pH7.5) STC 緩衝液:0.2M ソルビトール、100mM Tris-HCl(pH7.
5) 、20mM CaCl2 PEG 溶液:60 ％ PEG 4000 、10mM CaCl 2, 10mM Tris-H
Cl (pH8.0) YGS 培地:0.5％イーストエキス、2 ％グルコース、1.2M
ソルビトール
トより３デイスクコルクボーラーで打ち抜き、これを10
0ml のYG液体培地で28℃下で2 日間振盪培養した。さら
に5ml を新しい同培地 100mlに接種し一晩培養した。当
該培養液を遠心分離することによって得た菌体を、滅菌
水で2 回、OM緩衝液で2 回洗浄した後、ノボザイム234
を含む酵素溶液で28℃、2 時間処理してプロトプラスト
化した。得られたプロトプラスト溶液に、0.5 容のST緩
衝液を静かに重層し4000×ｇで10分間遠心し、プロトプ
ラストを界面に集めた。このプロトプラストを2 倍量の
STC 緩衝液で洗浄後、108〜109／mlの濃度になるよう
に、STC 緩衝液に懸濁した。100 μl のプロトプラスト
溶液に対し5 μl のＤＮＡ溶液を加え静かにかき混ぜた
後、室温で25分放置した。PEG 溶液を 200μl、200 μ
l、800 μl の順に合計1200μl 加え、室温で20分間イ
ンキュベートした。1000×ｇで、5 分間遠心後、上清の
PEG 溶液を捨て、2.5 mlのYGS 液体培地で2 時間振盪培
養した後、再度集菌し、STC 緩衝液に懸濁し、これを20
μg/mlの BcSを含有させた再生寒天培地にスプレッドし
た。さらに同濃度の BcS を含む１％ Sea Plaque (1.2
Ｍソルビトール入り) を約5 ml重層し、固化した後、パ
ラフィルムでふたをして28℃で培養した。約5 日後より
形質転換体が出現しはじめ、形質転換効率は約200colon
ies/μg ＤＮＡの割合であった。 YG培地:0.5％イーストエキス、2 ％グルコース OM緩衝液:1.2 M MgSO 4 、 10mM Sodium phosphate (pH
5.8) Novozyme234 酵素溶液：5 mg/ml ( OM緩衝液中) ST緩衝液:0.6M ソルビトール、100mM Tris-HCl(pH7.5) STC 緩衝液:0.2M ソルビトール、100mM Tris-HCl(pH7.
5) 、20mM CaCl2 PEG 溶液:60 ％ PEG 4000 、10mM CaCl 2, 10mM Tris-H
Cl (pH8.0) YGS 培地:0.5％イーストエキス、2 ％グルコース、1.2M
ソルビトール
【００３８】
【発明の効果】本発明により、新規なブラストサイジン
Ｓデアミナーゼ、当該ブラストサイジンＳデアミナーゼ
をコードする遺伝子、当該遺伝子を組み込んだ発現ベク
ター、及び当該発現ベクターを用いて形質転換した形質
転換体が提供される。
Ｓデアミナーゼ、当該ブラストサイジンＳデアミナーゼ
をコードする遺伝子、当該遺伝子を組み込んだ発現ベク
ター、及び当該発現ベクターを用いて形質転換した形質
転換体が提供される。
【００３９】
配列番号：1 配列の長さ：130 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ポリペプチド 配列の起源：Aspergillus terreus S-712(ATCC 28865) 配列：Met Pro Leu Ser Gln Glu Glu Ser Thr Leu 10 Ile Glu Arg Ala Thr Ala Thr Ile Asn Ser 20 Ile Pro Ile Ser Glu Asp Tyr Ser Val Ala 30 Ser Ala Ala Leu Ser Ser Asp Gly Arg Ile 40 Phe Thr Gly Val Asn Val Tyr His Phe Thr 50 Gly Gly Pro Cys Ala Glu Leu Val Val Leu 60 Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asn 70 Leu Thr Cys Ile Val Ala Ile Gly Asn Glu 80 Asn Arg Gly Ile Leu Ser Pro Cys Gly Arg 90 Cys Arg Gln Val Leu Leu Asp Leu His Pro 100 Gly Ile Lys Ala Ile Val Lys Asp Ser Asp 110 Gly Gln Pro Thr Ala Val Gly Ile Arg Glu 120 Leu Leu Pro Ser Gly Tyr Val Trp Glu Gly 130 配列番号：2 配列の長さ：393 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の起源：Aspergillus terreus S-712(ATCC 28865) 配列：ATG CCT TTG TCT CAA GAA GAA TCC ACC CTC 30 ATT GAA AGA GCA ACG GCT ACA ATC AAC AGC 60 ATC CCC ATC TCT GAA GAC TAC AGC GTC GCC 90 AGC GCA GCT CTC TCT AGC GAC GGC CGC ATC 120 TTC ACT GGT GTC AAT GTA TAT CAT TTT ACT 150 GGG GGA CCT TGT GCA GAA CTC GTG GTG CTG 180 GGC ACT GCT GCT GCT GCG GCA GCT GGC AAC 210 CTG ACT TGT ATC GTC GCG ATC GGA AAT GAG 240 AAC AGG GGC ATC TTG AGC CCC TGC GGA CGG 270 TGT CGA CAG GTG CTT CTC GAT CTG CAT CCT 300 GGG ATC AAA GCG ATA GTG AAG GAC AGT GAT 330 GGA CAG CCG ACG GCA GTT GGG ATT CGT GAA 360 TTG CTG CCC TCT GGT TAT GTG TGG GAG GGC 390 TAA 393 配列番号：3 配列の長さ：559 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の起源：Aspergillus terreus S-712(ATCC 28865) 配列：-49 GAATTCGCGGCCGCCACAATTGCCCACCATCAGCCATCT -10 CATTGTCAAT ATG CCT TTG TCT CAA GAA GAA TCC ACC CTC 30 ATT GAA AGA GCA ACG GCT ACA ATC AAC AGC 60 ATC CCC ATC TCT GAA GAC TAC AGC GTC GCC 90 AGC GCA GCT CTC TCT AGC GAC GGC CGC ATC 120 TTC ACT GGT GTC AAT GTA TAT CAT TTT ACT 150 GGG GGA CCT TGT GCA GAA CTC GTG GTG CTG 180 GGC ACT GCT GCT GCT GCG GCA GCT GGC AAC 210 CTG ACT TGT ATC GTC GCG ATC GGA AAT GAG 240 AAC AGG GGC ATC TTG AGC CCC TGC GGA CGG 270 TGT CGA CAG GTG CTT CTC GAT CTG CAT CCT 300 GGG ATC AAA GCG ATA GTG AAG GAC AGT GAT 330 GGA CAG CCG ACG GCA GTT GGG ATT CGT GAA 360 TTG CTG CCC TCT GGT TAT GTG TGG GAG GGC 390 TAA 393 GCACCAGCCATTGATCTTGTACATTCAAGCTACTTTCTG 432 TTACTAGATGAACCGAGCATGAGTTGATGGTGAATGCAT 471 ACAGAGTACAATGGTGGAAAAAAAAGCGGCCGCGAATTC 510
【図１】プラスミドpBF101の構築図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年５月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝
子
子
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なブラストサイジ
ンＳデアミナーゼ、当該ブラストサイジンＳデアミナー
ゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を組み込んだベクタ
ー、及び当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体
に関する。
ンＳデアミナーゼ、当該ブラストサイジンＳデアミナー
ゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を組み込んだベクタ
ー、及び当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体
に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
バイオテクノロジー技術の発達によって、動物のみなら
ず、植物においても遺伝子操作が盛んに行なわれるよう
になっている。かかる遺伝子操作を行なう際には、その
生物の種類に応じたベクターを用いるのが通例である。
このようなベクターにおいては、目的とする遺伝子がホ
スト細胞において確かに組み込まれたか否かを判断する
マーカーが通常組み込まれている。例えばカナマイシン
耐性、クロラムフェニコール耐性等が代表的なマーカー
として用いられている。
バイオテクノロジー技術の発達によって、動物のみなら
ず、植物においても遺伝子操作が盛んに行なわれるよう
になっている。かかる遺伝子操作を行なう際には、その
生物の種類に応じたベクターを用いるのが通例である。
このようなベクターにおいては、目的とする遺伝子がホ
スト細胞において確かに組み込まれたか否かを判断する
マーカーが通常組み込まれている。例えばカナマイシン
耐性、クロラムフェニコール耐性等が代表的なマーカー
として用いられている。
【０００３】しかしながら、これらの薬剤耐性マーカー
に対応する抗生物質は、医学上及び環境中の安全性の観
点から、取り扱い上格別の注意を必要とするのが常であ
る。そこで、比較的安全な薬剤耐性マーカーを用いた、
発現用ベクターの確立が望まれている。さらに、特定の
農薬に対して耐性を有する有用植物を作出し、より、効
率的な農業生産を企図することが望まれている。
に対応する抗生物質は、医学上及び環境中の安全性の観
点から、取り扱い上格別の注意を必要とするのが常であ
る。そこで、比較的安全な薬剤耐性マーカーを用いた、
発現用ベクターの確立が望まれている。さらに、特定の
農薬に対して耐性を有する有用植物を作出し、より、効
率的な農業生産を企図することが望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、広範な生物種に対
して蛋白合成阻害活性を有し、農業用抗生物質として汎
用されているアミノヌクレオシド系抗生物質であるブラ
ストサイジン (Blasticidin)Ｓ (以下、BcSと略記する)
に着目して本発明を完成するに至った。
解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、広範な生物種に対
して蛋白合成阻害活性を有し、農業用抗生物質として汎
用されているアミノヌクレオシド系抗生物質であるブラ
ストサイジン (Blasticidin)Ｓ (以下、BcSと略記する)
に着目して本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本願は、以下の発明を提供する
ものである。 (１) 配列番号１に示すアミノ酸配列を有するブラスト
サイジンＳデアミナーゼ。 (２) 配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするブラ
ストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。
ものである。 (１) 配列番号１に示すアミノ酸配列を有するブラスト
サイジンＳデアミナーゼ。 (２) 配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするブラ
ストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。
【０００６】(３) 配列番号２に示すブラストサイジン
Ｓデアミナーゼ遺伝子。 (４) 配列番号３に示すブラストサイジンＳデアミナー
ゼ遺伝子。 (５) ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子として、
少なくとも配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝
子を組み込んだベクター。 (６) (５) 記載のベクターで形質転換又は形質導入し
た形質転換体又は形質導入体。
Ｓデアミナーゼ遺伝子。 (４) 配列番号３に示すブラストサイジンＳデアミナー
ゼ遺伝子。 (５) ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子として、
少なくとも配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝
子を組み込んだベクター。 (６) (５) 記載のベクターで形質転換又は形質導入し
た形質転換体又は形質導入体。
【０００７】ブラストサイジンＳデアミナーゼ( 以下、
BcSデアミナーゼと略記する) は、すでに記載した、現
在主に抗イネいもち病薬剤等として汎用されているBcS
の不活性化酵素である。すでに、本発明者らは、かかる
酵素をコードする遺伝子bsrをBcS耐性を有すBacillus c
ereus K55-S1由来のプラスミドから単離した (Kamakura
et al.,Agric.Biol.Chem.,51(11),3165-3168(1987))
が、かかるbsrをイネいもち病菌 (Pyricularia oryzae)
に導入しても、BcSデアミナーゼ活性は発現されなかっ
た。
BcSデアミナーゼと略記する) は、すでに記載した、現
在主に抗イネいもち病薬剤等として汎用されているBcS
の不活性化酵素である。すでに、本発明者らは、かかる
酵素をコードする遺伝子bsrをBcS耐性を有すBacillus c
ereus K55-S1由来のプラスミドから単離した (Kamakura
et al.,Agric.Biol.Chem.,51(11),3165-3168(1987))
が、かかるbsrをイネいもち病菌 (Pyricularia oryzae)
に導入しても、BcSデアミナーゼ活性は発現されなかっ
た。
【０００８】本発明に係るブラストサイジンＳデアミナ
ーゼ遺伝子は、上記のbsrとは全く異なる構造の遺伝子
(以下、BSDと記載する) である。 Ａ. BSDの単離BSD の単離は、ブラストサイジンＳデアミナーゼ産生菌
として知られている糸状菌Aspergillus terreus S-712
菌 (ATCC 28865) のｃＤＮＡを用いて通常のクローニン
グ法により行なわれる。
ーゼ遺伝子は、上記のbsrとは全く異なる構造の遺伝子
(以下、BSDと記載する) である。 Ａ. BSDの単離BSD の単離は、ブラストサイジンＳデアミナーゼ産生菌
として知られている糸状菌Aspergillus terreus S-712
菌 (ATCC 28865) のｃＤＮＡを用いて通常のクローニン
グ法により行なわれる。
【０００９】すなわち、Aspergillus terreus S-712をB
cS存在下で培養した菌糸よりｍＲＮＡ抽出し、オリゴdT
プライマーを用いてｃＤＮＡを合成する。次いで、かか
るｃＤＮＡをクローニング用ベクターに組み込んで、こ
れを宿主に導入してｃＤＮＡライブラリーを調製し、当
該形質転換体をBcSプレートにレプリカして、このBcSプ
レートで生育可能なコロニーを選択・増殖させることに
よって所望のBSDを含むクローンを単離することができ
る。
cS存在下で培養した菌糸よりｍＲＮＡ抽出し、オリゴdT
プライマーを用いてｃＤＮＡを合成する。次いで、かか
るｃＤＮＡをクローニング用ベクターに組み込んで、こ
れを宿主に導入してｃＤＮＡライブラリーを調製し、当
該形質転換体をBcSプレートにレプリカして、このBcSプ
レートで生育可能なコロニーを選択・増殖させることに
よって所望のBSDを含むクローンを単離することができ
る。
【００１０】なお、後述する手法により、BSDの塩基配
列が判明した場合には、BSDの塩基配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法 (Saiki et a
l.,Science,239,487-491(1988)) により、上記クローニ
ングを行なうことができる。また、スクリーニング法も
上記の他、免疫スクリーニング法、ハイブリッド分子形
成法等を用いて行なうこともできる。 Ｂ. BSDの塩基配列の決定は、常法、例えば、マキサム
−ギルバートの化学修飾法 (Maxam-Gilbert, Meth. Enz
ym.,65, 499-560 (1980)) 、サンガーらの方法(F. Sang
er et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74：5463
-5467 (1977)) 等を用いて行なうことができる。 Ｃ. 次に、BcSデアミナーゼ遺伝子として、少なくとも
配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子を組み込
んだベクターを構築する。
列が判明した場合には、BSDの塩基配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法 (Saiki et a
l.,Science,239,487-491(1988)) により、上記クローニ
ングを行なうことができる。また、スクリーニング法も
上記の他、免疫スクリーニング法、ハイブリッド分子形
成法等を用いて行なうこともできる。 Ｂ. BSDの塩基配列の決定は、常法、例えば、マキサム
−ギルバートの化学修飾法 (Maxam-Gilbert, Meth. Enz
ym.,65, 499-560 (1980)) 、サンガーらの方法(F. Sang
er et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74：5463
-5467 (1977)) 等を用いて行なうことができる。 Ｃ. 次に、BcSデアミナーゼ遺伝子として、少なくとも
配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子を組み込
んだベクターを構築する。
【００１１】当該ベクター構築の基本となるベクター
は、BSDの導入を企図する宿主の種類に応じて適宜選択
することができる。例えば、宿主として大腸菌を用いる
場合には、pBR322、pUC18 等を；枯草菌を用いる場合に
は、pHY300PLK(Ishiwa et al.,Jpn.Ｊ.Genet,61 ,515-5
28(1986) )等を；酵母を用いる場合には、pYEUra3(東洋
紡績社製) 、pAU9(K.Okazaki et al.,Nuc.Acids.Res.,1
8 ,6485(1990)) 等を；動物細胞を用いる場合には、pMA
M-neo(F.Lee et al.,Nature, 294,228(1981)) 等を；植
物細胞を用いる場合には、pBin19(M.Bevan.,Nuc.Acids.
Res.,12,8711(1984))、pLGV1103(R.Hain et al.,MolGen
Genet,199,161(1985)) 等を用いることができる。さら
に、上記プラスミドの他、λZAP II等のファージベクタ
ー、pWE15(Stratagene社製) 等のコスミド等を用いるこ
ともできる。
は、BSDの導入を企図する宿主の種類に応じて適宜選択
することができる。例えば、宿主として大腸菌を用いる
場合には、pBR322、pUC18 等を；枯草菌を用いる場合に
は、pHY300PLK(Ishiwa et al.,Jpn.Ｊ.Genet,61 ,515-5
28(1986) )等を；酵母を用いる場合には、pYEUra3(東洋
紡績社製) 、pAU9(K.Okazaki et al.,Nuc.Acids.Res.,1
8 ,6485(1990)) 等を；動物細胞を用いる場合には、pMA
M-neo(F.Lee et al.,Nature, 294,228(1981)) 等を；植
物細胞を用いる場合には、pBin19(M.Bevan.,Nuc.Acids.
Res.,12,8711(1984))、pLGV1103(R.Hain et al.,MolGen
Genet,199,161(1985)) 等を用いることができる。さら
に、上記プラスミドの他、λZAP II等のファージベクタ
ー、pWE15(Stratagene社製) 等のコスミド等を用いるこ
ともできる。
【００１２】ベクターの構築に際して、原核生物用のベ
クターを基本ベクターとして採用する場合には、BSDの
構造遺伝子の上流にプロモーター配列、SD配列等が位置
するように、ベクターを設計する必要がある。真核生物
用のベクターを基本ベクターとして採用する場合には、
上記と同様に、プロモーター、ＲＮＡのスプライス部
位、ポリアデニル化部位等が含まれるようにベクターを
設計する必要がある。
クターを基本ベクターとして採用する場合には、BSDの
構造遺伝子の上流にプロモーター配列、SD配列等が位置
するように、ベクターを設計する必要がある。真核生物
用のベクターを基本ベクターとして採用する場合には、
上記と同様に、プロモーター、ＲＮＡのスプライス部
位、ポリアデニル化部位等が含まれるようにベクターを
設計する必要がある。
【００１３】さらに、BSDの発現は、直接発現系に必ず
しも限定されるものではなく、例えばβ−ガラクトシダ
ーゼやβ−ラクタマーゼ等をコードする塩基配列を利用
して、融合蛋白発現系とすることができる。 Ｄ. かくして得られたベクターの宿主細胞への導入、及
びこれによる形質転換の方法は、一般に用いられる方法
を採ることができる。例えば、対数増殖期にある細胞を
集め、CaCl2処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状
態にして、かかる処理細胞に、上記ベクターを取り込ま
せる方法等を採用することができる。なお、かかる方法
において、形質転換効率の向上のため、MgCl2やRbClを
更に共存させて、形質導入を行なうこともできる。
しも限定されるものではなく、例えばβ−ガラクトシダ
ーゼやβ−ラクタマーゼ等をコードする塩基配列を利用
して、融合蛋白発現系とすることができる。 Ｄ. かくして得られたベクターの宿主細胞への導入、及
びこれによる形質転換の方法は、一般に用いられる方法
を採ることができる。例えば、対数増殖期にある細胞を
集め、CaCl2処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状
態にして、かかる処理細胞に、上記ベクターを取り込ま
せる方法等を採用することができる。なお、かかる方法
において、形質転換効率の向上のため、MgCl2やRbClを
更に共存させて、形質導入を行なうこともできる。
【００１４】上記で得られる所望の形質転換株を、常法
に従い培養することにより、所望のBcSデアミナーゼが
生産・蓄積される。当該培養に用いられる培地は、通常
の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれをも用いる
ことができる。例えば、Ｌ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等、
又は当該培地に通常知られている各種の炭素源、窒素
源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地等を例示でき
る。なお、トリプトファン・プロモーターを用いる場合
は、一般に当該プロモーターの働きを向上させるために
カザミノ酸を添加した上記の培地、例えばＭ９最小培地
等を用いて培養するのが好ましい。また、当該培地には
培養における適切な時期に、インドールアクリル酸等の
トリプトプァン・プロモーターの働きを強めるための薬
剤を添加することもできる。
に従い培養することにより、所望のBcSデアミナーゼが
生産・蓄積される。当該培養に用いられる培地は、通常
の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれをも用いる
ことができる。例えば、Ｌ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等、
又は当該培地に通常知られている各種の炭素源、窒素
源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地等を例示でき
る。なお、トリプトファン・プロモーターを用いる場合
は、一般に当該プロモーターの働きを向上させるために
カザミノ酸を添加した上記の培地、例えばＭ９最小培地
等を用いて培養するのが好ましい。また、当該培地には
培養における適切な時期に、インドールアクリル酸等の
トリプトプァン・プロモーターの働きを強めるための薬
剤を添加することもできる。
【００１５】上記培養により得られる培養物からのBcS
デアミナーゼの単離・精製は常法に従い実行可能であ
る。特に、BcSデアミナーゼを宿主から抽出する場合
は、例えば浸透圧ショック法等の温和な条件を採用する
のが、その高次構造保持の面からより好ましい。上記単
離・精製は、例えば当該ポリペプチドの物理・化学的性
質を利用した各種の処理操作に従い実施できる（例えば
「生化学データーブックII」pp1175〜1259、第１版・第
１刷、1980年６月23日、株式会社東京化学同人発行参
照）。当該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋
白沈澱剤による処理、限外ろ過、分子篩クロマトグラフ
ィー (ゲルろ過) 、液体クロマトグラフィー、遠心分
離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、透析
法、又はこれらの組合せ等を採用できる。なお、上記操
作の好ましい一実施態様は次の通りである。
デアミナーゼの単離・精製は常法に従い実行可能であ
る。特に、BcSデアミナーゼを宿主から抽出する場合
は、例えば浸透圧ショック法等の温和な条件を採用する
のが、その高次構造保持の面からより好ましい。上記単
離・精製は、例えば当該ポリペプチドの物理・化学的性
質を利用した各種の処理操作に従い実施できる（例えば
「生化学データーブックII」pp1175〜1259、第１版・第
１刷、1980年６月23日、株式会社東京化学同人発行参
照）。当該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋
白沈澱剤による処理、限外ろ過、分子篩クロマトグラフ
ィー (ゲルろ過) 、液体クロマトグラフィー、遠心分
離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、透析
法、又はこれらの組合せ等を採用できる。なお、上記操
作の好ましい一実施態様は次の通りである。
【００１６】まず培養菌体より、BcSデアミナーゼを部
分精製する。この部分精製は、例えばアセトン、メタノ
ール、エタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミ
ド (DMF)等の有機溶媒や硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理、及び
／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外ろ過
処理等により行なわれる。これらの各処理の操作及び条
件は、通常、上記の方法において採用される条件等と同
様の方法を採用することができる。
分精製する。この部分精製は、例えばアセトン、メタノ
ール、エタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミ
ド (DMF)等の有機溶媒や硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理、及び
／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外ろ過
処理等により行なわれる。これらの各処理の操作及び条
件は、通常、上記の方法において採用される条件等と同
様の方法を採用することができる。
【００１７】次いで上記で得られた粗精製物を、ゲルろ
過に付すことにより、BcSデアミナーゼの活性が認めら
れる画分を収得する。ここで用いられるゲルろ過剤とし
ては特に限定はなく、例えばデキストランゲル、ポリア
クリルアミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミ
ド−アガロースゲル、セルロース等を素材とするものを
いずれも利用できる。これらの具体例としては、セファ
デックスＧタイプ、同ＬＨタイプ、セファロースタイ
プ、セファクリルタイプ (以上、ファルマシア社製)、
セルロファイン (チッソ(株)社製)、バイオゲルＰタイ
プ、同Ａタイプ (バイオ−ラド社製)、ウルトロゲル(LK
B社製)、ＴＳＫ−Ｇタイプ(東ソー(株)社製)等を例示で
きる。
過に付すことにより、BcSデアミナーゼの活性が認めら
れる画分を収得する。ここで用いられるゲルろ過剤とし
ては特に限定はなく、例えばデキストランゲル、ポリア
クリルアミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミ
ド−アガロースゲル、セルロース等を素材とするものを
いずれも利用できる。これらの具体例としては、セファ
デックスＧタイプ、同ＬＨタイプ、セファロースタイ
プ、セファクリルタイプ (以上、ファルマシア社製)、
セルロファイン (チッソ(株)社製)、バイオゲルＰタイ
プ、同Ａタイプ (バイオ−ラド社製)、ウルトロゲル(LK
B社製)、ＴＳＫ−Ｇタイプ(東ソー(株)社製)等を例示で
きる。
【００１８】目的ポリペプチドは、上記ゲルろ過により
得られるBcSデアミナーゼの活性画分を、例えばアフィ
ニティークロマトグラフィー、DEAE法等によるイオン交
換カラムクロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ、逆相高速液体クロマトグラフィー等に付すことによ
り、又は上記各操作の組合せにより更に精製可能であ
り、均質なBcSデアミナーゼとして単離できる。
得られるBcSデアミナーゼの活性画分を、例えばアフィ
ニティークロマトグラフィー、DEAE法等によるイオン交
換カラムクロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ、逆相高速液体クロマトグラフィー等に付すことによ
り、又は上記各操作の組合せにより更に精製可能であ
り、均質なBcSデアミナーゼとして単離できる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 〔実施例１〕BSDの単離Aspergillus terreus S-712株（ATCC 28865) を、BcSを
250μｇ／mlを含むYG培地で、28℃下、静置培養を行っ
た。次に、菌糸をスパチュラを用いて培養液から分離し
た。かかる菌糸からQuick prep mRNA purification KIT
（ファルマシア社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ポリ
ｄＴカラムを用いてｍＲＮＡを分離した。このｍＲＮＡ
に、オリゴｄＴ（ファルマシア社製）をプライマーとし
て、リバーストランスクリプターゼ（ファルマシア社
製）により第１鎖を合成し、引き続いてＲＮａｓｅＨ、
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ｄＮＴＰを加えて第２鎖を合成
してｃＤＮＡを調製した。かかるｃＤＮＡの両端をクレ
ノウフラグメントにより平滑化させた後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いてEco RI−Not Iアダプター（ファルマシ
ア社製）を付加し、これを大腸菌用ファージベクターλ
ＺＡＰII（Stratagene社製）のEcoRI制限サイトに挿入
した。
る。 〔実施例１〕BSDの単離Aspergillus terreus S-712株（ATCC 28865) を、BcSを
250μｇ／mlを含むYG培地で、28℃下、静置培養を行っ
た。次に、菌糸をスパチュラを用いて培養液から分離し
た。かかる菌糸からQuick prep mRNA purification KIT
（ファルマシア社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ポリ
ｄＴカラムを用いてｍＲＮＡを分離した。このｍＲＮＡ
に、オリゴｄＴ（ファルマシア社製）をプライマーとし
て、リバーストランスクリプターゼ（ファルマシア社
製）により第１鎖を合成し、引き続いてＲＮａｓｅＨ、
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ｄＮＴＰを加えて第２鎖を合成
してｃＤＮＡを調製した。かかるｃＤＮＡの両端をクレ
ノウフラグメントにより平滑化させた後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いてEco RI−Not Iアダプター（ファルマシ
ア社製）を付加し、これを大腸菌用ファージベクターλ
ＺＡＰII（Stratagene社製）のEcoRI制限サイトに挿入
した。
【００２０】この組み換えファージをGigapackII（Stra
tagene社製）を用いてin vitroでパッケージングし、E.
coli XL-1 Blue（Stratagene社製）に感染させ、λファ
ージ粒子として回収した。次に、OD600＝１のXL-1Blue
200μl、１×105 個の組み換えλファージ粒子を含むス
トック液200μl 、線状ヘルパーファージＲ408（１×10
6 pfu／ml）(Stratagene 社製）１μlとを混合し、37℃
で15分間培養して重感染させた。しかる後さらに５mlの
２×YT培地を加え、37℃で３時間培養し、その培養液を
70℃で20分間熱処理して4000×g の遠心分離を５分間行
い、その上清を採取した。
tagene社製）を用いてin vitroでパッケージングし、E.
coli XL-1 Blue（Stratagene社製）に感染させ、λファ
ージ粒子として回収した。次に、OD600＝１のXL-1Blue
200μl、１×105 個の組み換えλファージ粒子を含むス
トック液200μl 、線状ヘルパーファージＲ408（１×10
6 pfu／ml）(Stratagene 社製）１μlとを混合し、37℃
で15分間培養して重感染させた。しかる後さらに５mlの
２×YT培地を加え、37℃で３時間培養し、その培養液を
70℃で20分間熱処理して4000×g の遠心分離を５分間行
い、その上清を採取した。
【００２１】その結果、in vivoで大腸菌用ファージベ
クターλＺＡＰIIから切り出され、かつ一本鎖ＤＮＡと
してパッケージングされた組み換え線状ファージ粒子を
得た。当該ファージ粒子を、Eschericia coli XL-1Blue
に感染させて、ｃＤＮＡがファージミドとして保持さ
れたEschericia coli XL-1Blue を得た。このEscherici
a coli XL-1Blue を150μｇ／mlのBcSを含むLB培地のプ
レートにレプリカして、生育したコロニーを単離する操
作を20回繰り返した。これによって得られたコロニー４
個のうち、１個をBSDを含むクローンとして単離してこ
れをEschericiacoli XL-1Blue／pBSA712 と命名した。
クターλＺＡＰIIから切り出され、かつ一本鎖ＤＮＡと
してパッケージングされた組み換え線状ファージ粒子を
得た。当該ファージ粒子を、Eschericia coli XL-1Blue
に感染させて、ｃＤＮＡがファージミドとして保持さ
れたEschericia coli XL-1Blue を得た。このEscherici
a coli XL-1Blue を150μｇ／mlのBcSを含むLB培地のプ
レートにレプリカして、生育したコロニーを単離する操
作を20回繰り返した。これによって得られたコロニー４
個のうち、１個をBSDを含むクローンとして単離してこ
れをEschericiacoli XL-1Blue／pBSA712 と命名した。
【００２２】YG培地の組成：0.5％イーストエキス、２
％グルコース ２×YT培地の組成：16％トリプトン、10％イーストエキ
ス、５％ NaCl LB培地の組成：10％トリプトン、５％イーストエキス、
10％NaCl 〔実施例２〕糸状菌で発現するBcS耐性ベクターpBF101
の構築 pBS SK+（Stratagene社製）のユニークなSalI サイトに
Aspergillus nidulans由来のTrpC遺伝子のプロモーター
及びターミネーターによってハイグロマイシンＢ耐性遺
伝子hphが発現するように設計されたベクター、pCSN43
(Staben etal.,Fungal Genet Neswsl,36,79-81(1989))
を、37℃で１時間ClaI（TAKARA社製）で消化し、hph及
びPolyA 付加シグナルを含む2Kbの断片を除いた。次に
残余の消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼによってセルフライ
ゲーションを行い、TrpCプロモーターのみをマルチクロ
ーニングサイト(MCS)の上流に有するベクタpPtrpCを得
た。
％グルコース ２×YT培地の組成：16％トリプトン、10％イーストエキ
ス、５％ NaCl LB培地の組成：10％トリプトン、５％イーストエキス、
10％NaCl 〔実施例２〕糸状菌で発現するBcS耐性ベクターpBF101
の構築 pBS SK+（Stratagene社製）のユニークなSalI サイトに
Aspergillus nidulans由来のTrpC遺伝子のプロモーター
及びターミネーターによってハイグロマイシンＢ耐性遺
伝子hphが発現するように設計されたベクター、pCSN43
(Staben etal.,Fungal Genet Neswsl,36,79-81(1989))
を、37℃で１時間ClaI（TAKARA社製）で消化し、hph及
びPolyA 付加シグナルを含む2Kbの断片を除いた。次に
残余の消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼによってセルフライ
ゲーションを行い、TrpCプロモーターのみをマルチクロ
ーニングサイト(MCS)の上流に有するベクタpPtrpCを得
た。
【００２３】次に、前記実施例１で得たpBSA712にEcoRI
（TAKARA社製）を37℃で１時間作用させて、これをゲル
電気泳動にかけることよって生成する559bpの断片を単
離した。さらにかかる559bpの断片を他方の断片にもと
と逆方向に挿入した。そして、この559bpの断片の下流
に存在するユニークなBamHIサイトに、前記pCSN43をBam
HIで30℃下で１時間消化することによって得られた約70
0bpのTrpCターミネーターを挿入した(pBTtrpC)。
（TAKARA社製）を37℃で１時間作用させて、これをゲル
電気泳動にかけることよって生成する559bpの断片を単
離した。さらにかかる559bpの断片を他方の断片にもと
と逆方向に挿入した。そして、この559bpの断片の下流
に存在するユニークなBamHIサイトに、前記pCSN43をBam
HIで30℃下で１時間消化することによって得られた約70
0bpのTrpCターミネーターを挿入した(pBTtrpC)。
【００２４】さらに、このpBTtrpC をSacI（TAKARA社
製）及びEcoRV（TAKARA社製）で37℃下１時間処理し
て、これにより生ずるBSD遺伝子とpolyA 付加シグナル
を含む約1.3kbp断片を、前記pPtrpCのSacI サイトとEco
RVサイト間の断片と置換することにより、糸状菌用BcS
耐性ベクターであるｐBF101を得た。以上述べたpBF101
は、Eschericia coli JM109に導入され、当該菌株はEsc
hericia coli JM109／pBF101として、工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている（国際寄託番号 FER
M BP-4187）。
製）及びEcoRV（TAKARA社製）で37℃下１時間処理し
て、これにより生ずるBSD遺伝子とpolyA 付加シグナル
を含む約1.3kbp断片を、前記pPtrpCのSacI サイトとEco
RVサイト間の断片と置換することにより、糸状菌用BcS
耐性ベクターであるｐBF101を得た。以上述べたpBF101
は、Eschericia coli JM109に導入され、当該菌株はEsc
hericia coli JM109／pBF101として、工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている（国際寄託番号 FER
M BP-4187）。
【００２５】なお、以上記載したプラスミドpBF101の構
築図を図１に示す。 〔実施例３〕大腸菌のpBSA712 による形質転換 下記のＬ培地で、一夜前に培養したEschericia coli JM
109をL 培地10mlに１％接種し、37℃で保温振盪培養し
た。濁度計で濁度（OD550）が0.3に達した時点で、培養
液を遠心して集菌し、菌体を100ml塩化カルシウム溶液
に懸濁した。得られた懸濁液を氷冷下で一晩放置した
後、当該懸濁液（コンピテント細胞含有)に、実施例１
で得たプラスミドＤＮＡを加え、さらに30分間氷冷保存
した後、37℃で30分間ヒートショックにかけた。BcS耐
性マーカーで選択するため、ヒートショックをかけた懸
濁液を直ちにBcS 150μ／mlを含む寒天Ｌ培地プレート
に塗抹接種し、37℃で保存した。その結果、耐性コロニ
ーが出現し、形質転換したEschericia coli JM109／pBS
A712 を得た。かかる形質転換株は、工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている（国際寄託番号 FER
M BP-4186）。
築図を図１に示す。 〔実施例３〕大腸菌のpBSA712 による形質転換 下記のＬ培地で、一夜前に培養したEschericia coli JM
109をL 培地10mlに１％接種し、37℃で保温振盪培養し
た。濁度計で濁度（OD550）が0.3に達した時点で、培養
液を遠心して集菌し、菌体を100ml塩化カルシウム溶液
に懸濁した。得られた懸濁液を氷冷下で一晩放置した
後、当該懸濁液（コンピテント細胞含有)に、実施例１
で得たプラスミドＤＮＡを加え、さらに30分間氷冷保存
した後、37℃で30分間ヒートショックにかけた。BcS耐
性マーカーで選択するため、ヒートショックをかけた懸
濁液を直ちにBcS 150μ／mlを含む寒天Ｌ培地プレート
に塗抹接種し、37℃で保存した。その結果、耐性コロニ
ーが出現し、形質転換したEschericia coli JM109／pBS
A712 を得た。かかる形質転換株は、工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている（国際寄託番号 FER
M BP-4186）。
【００２６】このEschericia coli JM109／pBSA712 か
ら、プラスミドＤＮＡpBSA712を単離して、前述のサン
ガーらの方法に従って、その塩基配列を決定した。その
結果、プラスミドＤＮＡは、配列番号３に示した塩基配
列を有することが判明した。この559bpの塩基配列のう
ち、配列番号２に示した393bpの配列がオープンリーデ
イングフレームであることが推定された。そして、当該
オープンリーデイングフレームは配列番号１に示したア
ミノ酸をコードすることが推定された。
ら、プラスミドＤＮＡpBSA712を単離して、前述のサン
ガーらの方法に従って、その塩基配列を決定した。その
結果、プラスミドＤＮＡは、配列番号３に示した塩基配
列を有することが判明した。この559bpの塩基配列のう
ち、配列番号２に示した393bpの配列がオープンリーデ
イングフレームであることが推定された。そして、当該
オープンリーデイングフレームは配列番号１に示したア
ミノ酸をコードすることが推定された。
【００２７】Ｌ培地の組成：10％バクトートリプトン、
５％イーストエキス、５％NaCl、１％グルコース(pH7.
2) 〔実施例４〕プラスミドpBSA712 及びpBF101の単離・精
製 前記L 培地 (５ml) で一晩前培養したEshericia coli J
M109／pBSA712 の菌体を遠心後集菌し、20mMトリス・HC
l、10mM EDTA 及び50mMグルコースよりなる緩衝液 (pH
8.0)で懸濁した(200μl)。これに終濃度10mg／ml とな
るようリゾチームを加え、室温で５分間放置した後、更
に 200μlの0.2 N NaOH、１％SDS（ドデシルスルホン酸
ソーダ）溶液を加え、これを穏やかに混合し、氷冷下で
５分間放置した。これに150μlの5M酢酸カリウム(pH4.
8)を加えて十分に混合し、氷冷下で10分間置いた後、こ
れを遠心して、菌体破片と水溶性画分とに分画した。次
に、得られた水溶性画分に600μlのイソプロピルアルコ
ールを加えて室温で10分間放置してＤＮＡを沈澱させ
た。得られた沈澱を集めて400μlの10mMトリス・HCl、1
mM EDTA(TE)を含む緩衝液で再度懸濁して、フェノール
で蛋白質を除去してから２倍容のエタノールでＤＮＡを
再沈澱させた。沈澱をもう一度TE緩衝液(150μl)に溶か
し、これをリボヌクレアーゼで処理してＲＮＡを分割し
てから20％ポリエチレングリコール6000、2.5MNaCl溶液
の90μlを加えてプラスミドＤＮＡのみを沈澱させ、回
収した (収量５μg)。
５％イーストエキス、５％NaCl、１％グルコース(pH7.
2) 〔実施例４〕プラスミドpBSA712 及びpBF101の単離・精
製 前記L 培地 (５ml) で一晩前培養したEshericia coli J
M109／pBSA712 の菌体を遠心後集菌し、20mMトリス・HC
l、10mM EDTA 及び50mMグルコースよりなる緩衝液 (pH
8.0)で懸濁した(200μl)。これに終濃度10mg／ml とな
るようリゾチームを加え、室温で５分間放置した後、更
に 200μlの0.2 N NaOH、１％SDS（ドデシルスルホン酸
ソーダ）溶液を加え、これを穏やかに混合し、氷冷下で
５分間放置した。これに150μlの5M酢酸カリウム(pH4.
8)を加えて十分に混合し、氷冷下で10分間置いた後、こ
れを遠心して、菌体破片と水溶性画分とに分画した。次
に、得られた水溶性画分に600μlのイソプロピルアルコ
ールを加えて室温で10分間放置してＤＮＡを沈澱させ
た。得られた沈澱を集めて400μlの10mMトリス・HCl、1
mM EDTA(TE)を含む緩衝液で再度懸濁して、フェノール
で蛋白質を除去してから２倍容のエタノールでＤＮＡを
再沈澱させた。沈澱をもう一度TE緩衝液(150μl)に溶か
し、これをリボヌクレアーゼで処理してＲＮＡを分割し
てから20％ポリエチレングリコール6000、2.5MNaCl溶液
の90μlを加えてプラスミドＤＮＡのみを沈澱させ、回
収した (収量５μg)。
【００２８】回収したＤＮＡに蒸留水を加え、更に、こ
の1／10量の0.25％ブロムフェノールブルーと５％グリ
セロールを加えた。得られたＤＮＡ溶液を、アガロース
ゲル電気泳動（0.8％アガロースゲル (60mm×４mm)、緩
衝液：40mM トリス・HCl 4.8g、2mM EDTA・2Na 0.74g、
酢酸0.14ml(pH8.1)、蒸留水１リットル中、電圧100Ｖ)
に付し、単一のプラスミドＤＮＡであることを確認し
た。
の1／10量の0.25％ブロムフェノールブルーと５％グリ
セロールを加えた。得られたＤＮＡ溶液を、アガロース
ゲル電気泳動（0.8％アガロースゲル (60mm×４mm)、緩
衝液：40mM トリス・HCl 4.8g、2mM EDTA・2Na 0.74g、
酢酸0.14ml(pH8.1)、蒸留水１リットル中、電圧100Ｖ)
に付し、単一のプラスミドＤＮＡであることを確認し
た。
【００２９】また、Eschericia coli JM109／pBF101に
ついても上と同様の操作を行なったところ、単一のpBF1
01が単離精製された。 〔実施例５〕 BcSデアミナーゼの抽出・単離・精製 実施例３で得たEschericia coli JM109／pBSA712 株を
Ｌ培地１L において37℃で16時間振盪培養し、次いで、
これを遠心分離 (6000×ｇ、６分) した。得られた菌体
を生理食塩水100mlで洗浄して、次いで遠心分離 (6000
×ｇ、６分) の操作を２回くり返した。菌体を0.1 Ｍリ
ン酸緩衝液 (pH7.2)50％グリセリンに５〜10ml懸濁し、
超音波破砕した後、遠心分離 (5000×ｇ、６分) した。
上清 (粗酵素液) に20％(w／v)(NH4)2SO4を加え、０〜
４℃で30分間放置した。次いで遠心分離 (8500×ｇ、20
分) し、上清に (NH4)2SO4を40％ (w／v)になるように
加え、０〜４℃で30分間放置した。沈澱に0.1Ｍリン酸
緩衝液10％グリセリンを加え、次いで20％(w／v)(NH4)2
SO4を加え、不純物を沈澱させた後、更に(NH4)2SO4を40
％(w／v) になるまで加えて、酵素蛋白を沈澱させた。
ついても上と同様の操作を行なったところ、単一のpBF1
01が単離精製された。 〔実施例５〕 BcSデアミナーゼの抽出・単離・精製 実施例３で得たEschericia coli JM109／pBSA712 株を
Ｌ培地１L において37℃で16時間振盪培養し、次いで、
これを遠心分離 (6000×ｇ、６分) した。得られた菌体
を生理食塩水100mlで洗浄して、次いで遠心分離 (6000
×ｇ、６分) の操作を２回くり返した。菌体を0.1 Ｍリ
ン酸緩衝液 (pH7.2)50％グリセリンに５〜10ml懸濁し、
超音波破砕した後、遠心分離 (5000×ｇ、６分) した。
上清 (粗酵素液) に20％(w／v)(NH4)2SO4を加え、０〜
４℃で30分間放置した。次いで遠心分離 (8500×ｇ、20
分) し、上清に (NH4)2SO4を40％ (w／v)になるように
加え、０〜４℃で30分間放置した。沈澱に0.1Ｍリン酸
緩衝液10％グリセリンを加え、次いで20％(w／v)(NH4)2
SO4を加え、不純物を沈澱させた後、更に(NH4)2SO4を40
％(w／v) になるまで加えて、酵素蛋白を沈澱させた。
【００３０】次いでセファデックス (Sephadex) G100で
ゲル濾過 (溶出液：0.01M トリス・HCl緩衝液 (pH7.5)
−2mM DTT)を用い、濃縮した。これを２日間透析した
後、ピリミジノブラストサイジンＳをリガンドした活性
化ＣＨ−セファロースアフィニティカラムを通過させ
(溶出液：0.01Ｍトリス・HCl緩衝液 (pH7.5)) 、次いで
これを濃縮し、酵素標品 (BcSデアミナーゼ) とした。 〔実施例６〕 BcSデアミナーゼ発現の確認 次に、実施例３で得たEschericia coli JM109／pBSA712
の活性がBcSデアミナーゼの発現によるものであること
を確認するために、酵素活性を検討した。基質BcSは酸
性条件下で274nmに最大吸収を持ち、生産物であるデア
ミノBcSは258nmに最大吸収を示す。そこで、BcSを添加
した緩衝液を耐性および感受性菌とインキュベートし
て、反応液の上清のＵＶスペクトルを酸性条件下で測定
することにより、吸収波長のシフトとして、酵素活性を
検定した。親株であるEschericia coli JM109と30℃下
で１時間インキュベートしたBcS溶液は、274nmの吸収を
示したままだった。これに対して、pBSA712で形質転換
したEschericia coli JM109／pBSA712では、258nmへの
シフトが起こっており、BcSデアミナーゼの活性の存在
が示された。 〔実施例７〕糸状菌のpBF101による形質転換 イネいもち病菌（Pyricuraria oryzae P2)を、プレート
より菌片（３デイスク）をコルクボーラーで打ち抜き、
これを100mlのYG液体培地で28℃下で２日間振盪培養し
た。さらに5mlを新しい同培地100mlに接種し一晩培養し
た。当該培養液を遠心分離することによって得た菌体
を、滅菌水で２回、OM緩衝液で２回洗浄した後、洗浄水
ノボザイム234を含む酵素溶液で28℃、２時間処理して
プロトプラスト化した。得られたプロトプラスト溶液
に、0.5容のST緩衝液を静かに重層し4000×ｇで10分間
遠心し、プロトプラストを界面に集めた。このプロトプ
ラストを２倍量のSTC緩衝液で洗浄後、108〜109／mlの
濃度になるように、STC緩衝液に懸濁した。100μlのプ
ロトプラスト溶液に対し５μlのＤＮＡ溶液（0.5μg／
μl)を加え静かにかき混ぜた後、室温で25分放置した。
PEG溶液を200μl、200μl、800μlの順に合計1200μl加
え、室温で20分間インキュベートした。1000×ｇで、５
分間遠心後、上清のPEG溶液を捨て、2.5mlのYGS液体培
地で２時間振盪培養した後、再度集菌し、STC緩衝液に
懸濁し、これを20μg／mlのBcSを含有させた再生寒天培
地にスプレッドした。さらに同濃度のBcSを含む１％ Se
a Plaque（低融点アガロース FMC社製、1.2Mソルビトー
ル入り) を約５ml重層し、固化した後、パラフィルムで
ふたをして28℃で培養した。約５日後より形質転換体が
出現しはじめ、形質転換効率は約200colonies／μg Ｄ
ＮＡの割合であった。
ゲル濾過 (溶出液：0.01M トリス・HCl緩衝液 (pH7.5)
−2mM DTT)を用い、濃縮した。これを２日間透析した
後、ピリミジノブラストサイジンＳをリガンドした活性
化ＣＨ−セファロースアフィニティカラムを通過させ
(溶出液：0.01Ｍトリス・HCl緩衝液 (pH7.5)) 、次いで
これを濃縮し、酵素標品 (BcSデアミナーゼ) とした。 〔実施例６〕 BcSデアミナーゼ発現の確認 次に、実施例３で得たEschericia coli JM109／pBSA712
の活性がBcSデアミナーゼの発現によるものであること
を確認するために、酵素活性を検討した。基質BcSは酸
性条件下で274nmに最大吸収を持ち、生産物であるデア
ミノBcSは258nmに最大吸収を示す。そこで、BcSを添加
した緩衝液を耐性および感受性菌とインキュベートし
て、反応液の上清のＵＶスペクトルを酸性条件下で測定
することにより、吸収波長のシフトとして、酵素活性を
検定した。親株であるEschericia coli JM109と30℃下
で１時間インキュベートしたBcS溶液は、274nmの吸収を
示したままだった。これに対して、pBSA712で形質転換
したEschericia coli JM109／pBSA712では、258nmへの
シフトが起こっており、BcSデアミナーゼの活性の存在
が示された。 〔実施例７〕糸状菌のpBF101による形質転換 イネいもち病菌（Pyricuraria oryzae P2)を、プレート
より菌片（３デイスク）をコルクボーラーで打ち抜き、
これを100mlのYG液体培地で28℃下で２日間振盪培養し
た。さらに5mlを新しい同培地100mlに接種し一晩培養し
た。当該培養液を遠心分離することによって得た菌体
を、滅菌水で２回、OM緩衝液で２回洗浄した後、洗浄水
ノボザイム234を含む酵素溶液で28℃、２時間処理して
プロトプラスト化した。得られたプロトプラスト溶液
に、0.5容のST緩衝液を静かに重層し4000×ｇで10分間
遠心し、プロトプラストを界面に集めた。このプロトプ
ラストを２倍量のSTC緩衝液で洗浄後、108〜109／mlの
濃度になるように、STC緩衝液に懸濁した。100μlのプ
ロトプラスト溶液に対し５μlのＤＮＡ溶液（0.5μg／
μl)を加え静かにかき混ぜた後、室温で25分放置した。
PEG溶液を200μl、200μl、800μlの順に合計1200μl加
え、室温で20分間インキュベートした。1000×ｇで、５
分間遠心後、上清のPEG溶液を捨て、2.5mlのYGS液体培
地で２時間振盪培養した後、再度集菌し、STC緩衝液に
懸濁し、これを20μg／mlのBcSを含有させた再生寒天培
地にスプレッドした。さらに同濃度のBcSを含む１％ Se
a Plaque（低融点アガロース FMC社製、1.2Mソルビトー
ル入り) を約５ml重層し、固化した後、パラフィルムで
ふたをして28℃で培養した。約５日後より形質転換体が
出現しはじめ、形質転換効率は約200colonies／μg Ｄ
ＮＡの割合であった。
【００３１】YG培地：0.5％イーストエキス、２％グル
コース OM緩衝液：1.2M MgSO4、10mM Sodium phosphate (pH5.
8) Novozyme234 酵素溶液：５mg／ml (OM緩衝液中) ST緩衝液：0.6Mソルビトール、100mM Tris-HCl(pH7.5) STC緩衝液：0.2Mソルビトール、100mM Tris-HCl(pH7.
5)、20mM CaCl2 PEG溶液：60％ PEG 4000、10mM CaCl2,10mM Tris-HCl(p
H8.0) YGS培地：0.5％イーストエキス、２％グルコース、1.2M
ソルビトール
コース OM緩衝液：1.2M MgSO4、10mM Sodium phosphate (pH5.
8) Novozyme234 酵素溶液：５mg／ml (OM緩衝液中) ST緩衝液：0.6Mソルビトール、100mM Tris-HCl(pH7.5) STC緩衝液：0.2Mソルビトール、100mM Tris-HCl(pH7.
5)、20mM CaCl2 PEG溶液：60％ PEG 4000、10mM CaCl2,10mM Tris-HCl(p
H8.0) YGS培地：0.5％イーストエキス、２％グルコース、1.2M
ソルビトール
【００３２】
【発明の効果】本発明により、新規なブラストサイジン
Ｓデアミナーゼ、当該ブラストサイジンＳデアミナーゼ
をコードする遺伝子、当該遺伝子を組み込んだベクタ
ー、及び当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体
が提供される。
Ｓデアミナーゼ、当該ブラストサイジンＳデアミナーゼ
をコードする遺伝子、当該遺伝子を組み込んだベクタ
ー、及び当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体
が提供される。
【００３３】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：130 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ポリペプチド 配列の起源：Aspergillus terreusS-712(ATCC 28865) 配列：Met Pro Leu Ser Gln Glu Glu Ser Thr Leu 10 Ile Glu Arg Ala Thr Ala Thr Ile Asn Ser 20 Ile Pro Ile Ser Glu Asp Tyr Ser Val Ala 30 Ser Ala Ala Leu Ser Ser Asp Gly Arg Ile 40 Phe Thr Gly Val Asn Val Tyr His Phe Thr 50 Gly Gly Pro Cys Ala Glu Leu Val Val Leu 60 Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asn 70 Leu Thr Cys Ile Val Ala Ile Gly Asn Glu 80 Asn Arg Gly Ile Leu Ser Pro Cys Gly Arg 90 Cys Arg Gln Val Leu Leu Asp Leu His Pro 100 Gly Ile Lys Ala Ile Val Lys Asp Ser Asp 110 Gly Gln Pro Thr Ala Val Gly Ile Arg Glu 120 Leu Leu Pro Ser Gly Tyr Val Trp Glu Gly 130 配列番号：２ 配列の長さ：393 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の起源：Aspergillus terreus S-712(ATCC 28865) 配列：ATG CCT TTG TCT CAA GAA GAA TCC ACC CTC 30 ATT GAA AGA GCA ACG GCT ACA ATC AAC AGC 60 ATC CCC ATC TCT GAA GAC TAC AGC GTC GCC 90 AGC GCA GCT CTC TCT AGC GAC GGC CGC ATC 120 TTC ACT GGT GTC AAT GTA TAT CAT TTT ACT 150 GGG GGA CCT TGT GCA GAA CTC GTG GTG CTG 180 GGC ACT GCT GCT GCT GCG GCA GCT GGC AAC 210 CTG ACT TGT ATC GTC GCG ATC GGA AAT GAG 240 AAC AGG GGC ATC TTG AGC CCC TGC GGA CGG 270 TGT CGA CAG GTG CTT CTC GAT CTG CAT CCT 300 GGG ATC AAA GCG ATA GTG AAG GAC AGT GAT 330 GGA CAG CCG ACG GCA GTT GGG ATT CGT GAA 360 TTG CTG CCC TCT GGT TAT GTG TGG GAG GGC 390 TAA 393 配列番号：３ 配列の長さ：559 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の起源：Aspergillus terreus S-712(ATCC 28865) 配列：-49 GAATTCGCGGCCGCCACAATTGCCCACCATCAGCCATCT -10 CATTGTCAAT ATG CCT TTG TCT CAA GAA GAA TCC ACC CTC 30 ATT GAA AGA GCA ACG GCT ACA ATC AAC AGC 60 ATC CCC ATC TCT GAA GAC TAC AGC GTC GCC 90 AGC GCA GCT CTC TCT AGC GAC GGC CGC ATC 120 TTC ACT GGT GTC AAT GTA TAT CAT TTT ACT 150 GGG GGA CCT TGT GCA GAA CTC GTG GTG CTG 180 GGC ACT GCT GCT GCT GCG GCA GCT GGC AAC 210 CTG ACT TGT ATC GTC GCG ATC GGA AAT GAG 240 AAC AGG GGC ATC TTG AGC CCC TGC GGA CGG 270 TGT CGA CAG GTG CTT CTC GAT CTG CAT CCT 300 GGG ATC AAA GCG ATA GTG AAG GAC AGT GAT 330 GGA CAG CCG ACG GCA GTT GGG ATT CGT GAA 360 TTG CTG CCC TCT GGT TAT GTG TGG GAG GGC 390 TAA 393 GCACCAGCCATTGATCTTGTACATTCAAGCTACTTTCTG 432 TTACTAGATGAACCGAGCATGAGTTGATGGTGAATGCAT 471 ACAGAGTACAATGGTGGAAAAAAAAGCGGCCGCGAATTC 510
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpBF101の構築図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有
するブラストサイジンＳデアミナーゼ。 - 【請求項２】 配列番号１に示されるアミノ酸配列をコ
ードするブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。 - 【請求項３】 配列番号２に示されるアミノ酸配列をコ
ードするブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。 - 【請求項４】 配列番号３に示されるアミノ酸配列をコ
ードするブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子。 - 【請求項５】 ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子
として、少なくとも配列番号２に示される塩基配列を有
する遺伝子を組み込んだベクター。 - 【請求項６】 請求項５記載のベクターで形質転換又は
形質導入した形質転換体又は形質導入体。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP4226284A JP2686025B2 (ja) | 1992-08-25 | 1992-08-25 | ブラストサイジンｓデアミナーゼ遺伝子 |
Publications (2)
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|---|---|
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| JP2686025B2 JP2686025B2 (ja) | 1997-12-08 |
Family
ID=16842805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4226284A Expired - Lifetime JP2686025B2 (ja) | 1992-08-25 | 1992-08-25 | ブラストサイジンｓデアミナーゼ遺伝子 |
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| JP (1) | JP2686025B2 (ja) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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| BRPI0517380A (pt) * | 2004-11-08 | 2008-10-07 | Chromagenics Bv | molécula de dna, cassete de expressão, célula hospedeira, e, métodos para gerar uma célula hospedeira que expressa um polipeptìdeo de interesse e para produzir um polipeptìdeo de interesse |
-
1992
- 1992-08-25 JP JP4226284A patent/JP2686025B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-04-27 US US08/053,006 patent/US5527701A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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| JP2686025B2 (ja) | 1997-12-08 |
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