JP2790583B2 - 変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ - Google Patents
変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈｉInfo
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- JP2790583B2 JP2790583B2 JP32947292A JP32947292A JP2790583B2 JP 2790583 B2 JP2790583 B2 JP 2790583B2 JP 32947292 A JP32947292 A JP 32947292A JP 32947292 A JP32947292 A JP 32947292A JP 2790583 B2 JP2790583 B2 JP 2790583B2
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- Japan
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、安定性が改良された変
異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ、該変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨＩをコードしている遺伝子、該遺伝子を
含有し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発現ベ
クターを含有している形質転換体、および該形質転換体
を用いて変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを製造する
方法に関する。
異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ、該変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨＩをコードしている遺伝子、該遺伝子を
含有し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発現ベ
クターを含有している形質転換体、および該形質転換体
を用いて変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを製造する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術、および発明が解決しようとする課題】大
腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨＩ(本明細書に於いて
は、単にリボヌクレアーゼＨＩ、またはＲＮaseＨＩと
称する場合は、天然型の大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを
意味するものとする)は１５５アミノ酸からなる分子量
約１９Ｋdの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切断
するという基質特異性を有する。この酵素は、その基質
特異性に基づき、下記の如き様々な用途を有し、極めて
利用価値の高い酵素として注目されている。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。 かかる利用価値を有するリボヌクレアーゼＨＩの重要性
は遺伝子工学の発展に伴ってますます増大すると思われ
る。
腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨＩ(本明細書に於いて
は、単にリボヌクレアーゼＨＩ、またはＲＮaseＨＩと
称する場合は、天然型の大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを
意味するものとする)は１５５アミノ酸からなる分子量
約１９Ｋdの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切断
するという基質特異性を有する。この酵素は、その基質
特異性に基づき、下記の如き様々な用途を有し、極めて
利用価値の高い酵素として注目されている。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。 かかる利用価値を有するリボヌクレアーゼＨＩの重要性
は遺伝子工学の発展に伴ってますます増大すると思われ
る。
【０００３】本発明が対象としているリボヌクレアーゼ
ＨＩは従来リボヌクレアーゼＨと認識されていた物質で
ある。最近になって、従来のリボヌクレアーゼＨとは異
なる物質であるが、それと類似の酵素活性を有する物質
の存在が判明した［板谷、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス，ＵＳＡ，８
７，８５８７−８５９１(１９９０)］。従って、従来の
リボヌクレアーゼＨとその新たに見いだされた物質とを
峻別するため、従来のリボヌクレアーゼＨはリボヌクレ
アーゼＨＩと、そして新しく見いだされた物質はリボヌ
クレアーゼＨIIと命名された。このように、本明細書に
て使用しているリボヌクレアーゼＨＩなる用語は従来の
リボヌクレアーゼＨを表すために使用される用語であ
る。従来のリボヌクレアーゼＨ酵素は、大腸菌内での産
生量が極めて低いことから、組換えＤＮＡ技術による生
産が試みられており、既にＢＲＬ、ファルマシアおよび
宝酒造等から、組換えＤＮＡ技術により生産されたリボ
ヌクレアーゼＨが供給されている。これらの市販の組換
えリボヌクレアーゼＨは、大腸菌を宿主として生産され
るものである(金谷ら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、２６４、１１５４６−１１５４９
(１９８９))。
ＨＩは従来リボヌクレアーゼＨと認識されていた物質で
ある。最近になって、従来のリボヌクレアーゼＨとは異
なる物質であるが、それと類似の酵素活性を有する物質
の存在が判明した［板谷、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス，ＵＳＡ，８
７，８５８７−８５９１(１９９０)］。従って、従来の
リボヌクレアーゼＨとその新たに見いだされた物質とを
峻別するため、従来のリボヌクレアーゼＨはリボヌクレ
アーゼＨＩと、そして新しく見いだされた物質はリボヌ
クレアーゼＨIIと命名された。このように、本明細書に
て使用しているリボヌクレアーゼＨＩなる用語は従来の
リボヌクレアーゼＨを表すために使用される用語であ
る。従来のリボヌクレアーゼＨ酵素は、大腸菌内での産
生量が極めて低いことから、組換えＤＮＡ技術による生
産が試みられており、既にＢＲＬ、ファルマシアおよび
宝酒造等から、組換えＤＮＡ技術により生産されたリボ
ヌクレアーゼＨが供給されている。これらの市販の組換
えリボヌクレアーゼＨは、大腸菌を宿主として生産され
るものである(金谷ら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、２６４、１１５４６−１１５４９
(１９８９))。
【０００４】上記のような高い利用価値を有するリボヌ
クレアーゼＨＩの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐
性を高めることができれば、従来の組換えリボヌクレア
ーゼＨＩでは利用できなかった条件下での利用が可能と
なる。これまでに、天然型リボヌクレアーゼＨＩよりも
高い安定性を有する変異型リボヌクレアーゼＨＩを製造
するための組換えＤＮＡ技術を用いた方法が幾つか開発
されている（特願平０１−２８４４５４、特願平０３−
１９７７０３、特願平０３−１５８３３２、特願平０３
−１９７７０７、特願平０３−２４７４４１）。ごく最
近になって、これらの方法を組み合わせれば、リボヌク
レアーゼＨＩの安定性がさらに高まることが示されたの
で［木村ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、２６７、２１５３５−２１５４２(１９９
２)；特願平０３−２４７４４０］、リボヌクレアーゼ
ＨＩの安定性を高める別の方法を開発することは、組み
合わせる手段の選択の幅を広げる意味から重要である。
そして、これにより、さらに高い安定性を有するリボヌ
クレアーゼＨＩが得られる可能性も高められる。
クレアーゼＨＩの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐
性を高めることができれば、従来の組換えリボヌクレア
ーゼＨＩでは利用できなかった条件下での利用が可能と
なる。これまでに、天然型リボヌクレアーゼＨＩよりも
高い安定性を有する変異型リボヌクレアーゼＨＩを製造
するための組換えＤＮＡ技術を用いた方法が幾つか開発
されている（特願平０１−２８４４５４、特願平０３−
１９７７０３、特願平０３−１５８３３２、特願平０３
−１９７７０７、特願平０３−２４７４４１）。ごく最
近になって、これらの方法を組み合わせれば、リボヌク
レアーゼＨＩの安定性がさらに高まることが示されたの
で［木村ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、２６７、２１５３５−２１５４２(１９９
２)；特願平０３−２４７４４０］、リボヌクレアーゼ
ＨＩの安定性を高める別の方法を開発することは、組み
合わせる手段の選択の幅を広げる意味から重要である。
そして、これにより、さらに高い安定性を有するリボヌ
クレアーゼＨＩが得られる可能性も高められる。
【０００５】大腸菌リボヌクレアーゼＨＩよりも遥かに
高い安定性を有する好熱菌リボヌクレアーゼＨが知られ
ており、この好熱菌リボヌクレアーゼＨを大腸菌におい
て製造する方法が報告されている（金谷ら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６７、１０
１８４−１０１９２(１９９２)；特願平０２−１１１０
６５）。しかし、大腸菌を用いて産生された好熱菌リボ
ヌクレアーゼＨの酵素活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨ
Ｉのそれよりも低いものであった。また、大腸菌から産
生される好熱菌リボヌクレアーゼＨの場合、その精製に
は尿素を用いて可溶化するという操作が必要であり、大
腸菌リボヌクレアーゼＨＩの場合に較べてその製造方法
が複雑であるという欠点もあった。従って、より酵素活
性、安定性にすぐれた酵素であって、その製造および精
製も好熱菌リボヌクレアーゼＨよりも容易である変異型
リボヌクレアーゼＨＩを造ることができれば、産業上の
利用価値がより高くなると考えられる。
高い安定性を有する好熱菌リボヌクレアーゼＨが知られ
ており、この好熱菌リボヌクレアーゼＨを大腸菌におい
て製造する方法が報告されている（金谷ら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６７、１０
１８４−１０１９２(１９９２)；特願平０２−１１１０
６５）。しかし、大腸菌を用いて産生された好熱菌リボ
ヌクレアーゼＨの酵素活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨ
Ｉのそれよりも低いものであった。また、大腸菌から産
生される好熱菌リボヌクレアーゼＨの場合、その精製に
は尿素を用いて可溶化するという操作が必要であり、大
腸菌リボヌクレアーゼＨＩの場合に較べてその製造方法
が複雑であるという欠点もあった。従って、より酵素活
性、安定性にすぐれた酵素であって、その製造および精
製も好熱菌リボヌクレアーゼＨよりも容易である変異型
リボヌクレアーゼＨＩを造ることができれば、産業上の
利用価値がより高くなると考えられる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の観点
から、大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ酵素の酵素活性を保
持しながら、その安定性を高めることを目的として、好
熱菌リボヌクレアーゼＨのアミノ酸配列を参考にして種
々の改変を試みた。その結果、該酵素の遺伝子に部位特
異的変異を導入することにより該酵素の第１３４番目の
Ａsp（アスパラギン酸）をＨis（ヒスチジン）に置換し
た変異体が、天然型のリボヌクレアーゼＨＩよりも熱に
対する安定性が高められていることを見い出し、かつ、
その酵素活性は天然型リボヌクレアーゼＨＩとほぼ同等
であることを確認し、本発明を完成するに至った。即
ち、本発明は、天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩの第
１３４番目のＡspがＨisで置換されたアミノ酸配列から
なる変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを提供するもの
である。
から、大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ酵素の酵素活性を保
持しながら、その安定性を高めることを目的として、好
熱菌リボヌクレアーゼＨのアミノ酸配列を参考にして種
々の改変を試みた。その結果、該酵素の遺伝子に部位特
異的変異を導入することにより該酵素の第１３４番目の
Ａsp（アスパラギン酸）をＨis（ヒスチジン）に置換し
た変異体が、天然型のリボヌクレアーゼＨＩよりも熱に
対する安定性が高められていることを見い出し、かつ、
その酵素活性は天然型リボヌクレアーゼＨＩとほぼ同等
であることを確認し、本発明を完成するに至った。即
ち、本発明は、天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩの第
１３４番目のＡspがＨisで置換されたアミノ酸配列から
なる変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを提供するもの
である。
【０００７】また、本発明は、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨＩの第１３４番目のＡspをコードしているコド
ン、ＧＡＴがＨisをコードするコドン、ＣＡＴに変換さ
れている変異型リボヌクレアーゼＨＩの構造遺伝子を提
供するものである。また、本発明は上記変異型リボヌク
レアーゼＨＩを大腸菌で発現させるための発現ベクター
を提供するものである。また、本発明は、上記の発現ベ
クターで形質転換された変異型リボヌクレアーゼＨＩ産
生性の形質転換体を提供するものである。さらに本発明
は、該形質転換体を培養することにより、高い安定性を
有する変異型リボヌクレアーゼＨＩを製造する方法を提
供するものである。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成
書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９８２):Ａ
Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓpring ＨarborＬaborato
y)に詳述されており、上記変異型リボヌクレアーゼＨＩ
構造遺伝子、発現ベクター、形質転換体は、この成書に
記載の一般的手法に従って、例えば後記実施例に示した
様に常法通り作製することができる。尚、本発明の発現
ベクターは、大腸菌内で機能するものであれば特に制限
はないが、バクテリオファージλのＰLおよびＰRプロモ
ーターの支配下に上記変異型リボヌクレアーゼＨＩ遺伝
子を含有しているものが好ましい。
アーゼＨＩの第１３４番目のＡspをコードしているコド
ン、ＧＡＴがＨisをコードするコドン、ＣＡＴに変換さ
れている変異型リボヌクレアーゼＨＩの構造遺伝子を提
供するものである。また、本発明は上記変異型リボヌク
レアーゼＨＩを大腸菌で発現させるための発現ベクター
を提供するものである。また、本発明は、上記の発現ベ
クターで形質転換された変異型リボヌクレアーゼＨＩ産
生性の形質転換体を提供するものである。さらに本発明
は、該形質転換体を培養することにより、高い安定性を
有する変異型リボヌクレアーゼＨＩを製造する方法を提
供するものである。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成
書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９８２):Ａ
Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓpring ＨarborＬaborato
y)に詳述されており、上記変異型リボヌクレアーゼＨＩ
構造遺伝子、発現ベクター、形質転換体は、この成書に
記載の一般的手法に従って、例えば後記実施例に示した
様に常法通り作製することができる。尚、本発明の発現
ベクターは、大腸菌内で機能するものであれば特に制限
はないが、バクテリオファージλのＰLおよびＰRプロモ
ーターの支配下に上記変異型リボヌクレアーゼＨＩ遺伝
子を含有しているものが好ましい。
【０００８】
【発明の効果】本発明により安定性が高められた変異型
大腸菌リボヌクレアーゼＨＩは、従来のリボヌクレアー
ゼＨＩでは変性してしまう高い温度下でさえも変性する
ことがない（実施例３参照）ので、このような条件下で
の取扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌
リボヌクレアーゼＨＩは、耐久性等も向上していると期
待されるので、従来のリボヌクレアーゼＨＩよりも失活
しにくく、安定に保存でき、従って取り扱いが容易にな
ることは理解されよう。また、本発明の変異型大腸菌リ
ボヌクレアーゼＨＩは天然型リボヌクレアーゼＨＩと同
等の酵素活性を有しているので、天然型リボヌクレアー
ゼＨＩの場合と同量の使用によってほぼ同等の酵素活性
を得ることができる。
大腸菌リボヌクレアーゼＨＩは、従来のリボヌクレアー
ゼＨＩでは変性してしまう高い温度下でさえも変性する
ことがない（実施例３参照）ので、このような条件下で
の取扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌
リボヌクレアーゼＨＩは、耐久性等も向上していると期
待されるので、従来のリボヌクレアーゼＨＩよりも失活
しにくく、安定に保存でき、従って取り扱いが容易にな
ることは理解されよう。また、本発明の変異型大腸菌リ
ボヌクレアーゼＨＩは天然型リボヌクレアーゼＨＩと同
等の酵素活性を有しているので、天然型リボヌクレアー
ゼＨＩの場合と同量の使用によってほぼ同等の酵素活性
を得ることができる。
【０００９】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９
８２): Ａ Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓping Ｈarbor
Ｌaboratoy)および試薬の仕様書に従った。
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９
８２): Ａ Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓping Ｈarbor
Ｌaboratoy)および試薬の仕様書に従った。
【００１０】実施例１ プラスミドpＪＡＬ１３４Ｈの
作製 プラスミドpＪＡＬ１３４Ｈの作製の概略を図１に示
す。まず、天然型リボヌクレアーゼＨＩの大腸菌での発
現プラスミドpＡＫ６００（特開平０３−０６５１８８
参照）のrnh遺伝子を鋳型とし、プライマーを用いてＰ
ＣＲ法によりrnh遺伝子への点突然変異の導入を行っ
た。
作製 プラスミドpＪＡＬ１３４Ｈの作製の概略を図１に示
す。まず、天然型リボヌクレアーゼＨＩの大腸菌での発
現プラスミドpＡＫ６００（特開平０３−０６５１８８
参照）のrnh遺伝子を鋳型とし、プライマーを用いてＰ
ＣＲ法によりrnh遺伝子への点突然変異の導入を行っ
た。
【００１１】プライマーとしては、図２に示す化学合成
したオリゴヌクレオチドを用いた。図１および図２に示
すように、まず、pＡＫ６００を鋳型ＤＮＡとし、Ｓph
Ｉの制限酵素部位を含む５'−プライマー(１)と変異導
入用３'−プライマー(４)により約４００bpのＤＮＡ断
片を、また、ＸhoＩ部位を含む５'−プライマー(３)と
ＳalＩ部位を含む３'−プライマー(２)により約１００b
pのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、遺
伝子断片２種を得た。ＰＣＲ反応は市販のＧeneＡmp Ｋ
it(Ｔakara)の説明書に従って行った。得られた約４０
０bpの遺伝子断片を制限酵素ＳphＩおよびＸhoＩで、ま
た約１００bpのＤＮＡ断片を制限酵素ＸhoＩおよびＳal
Ｉで消化した後、得られた消化物を１.５％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、それぞれ約４００bp、約１００bp
のＤＮＡ断片を得た。このうち、約４００bp断片には変
異導入部位が含まれる。
したオリゴヌクレオチドを用いた。図１および図２に示
すように、まず、pＡＫ６００を鋳型ＤＮＡとし、Ｓph
Ｉの制限酵素部位を含む５'−プライマー(１)と変異導
入用３'−プライマー(４)により約４００bpのＤＮＡ断
片を、また、ＸhoＩ部位を含む５'−プライマー(３)と
ＳalＩ部位を含む３'−プライマー(２)により約１００b
pのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、遺
伝子断片２種を得た。ＰＣＲ反応は市販のＧeneＡmp Ｋ
it(Ｔakara)の説明書に従って行った。得られた約４０
０bpの遺伝子断片を制限酵素ＳphＩおよびＸhoＩで、ま
た約１００bpのＤＮＡ断片を制限酵素ＸhoＩおよびＳal
Ｉで消化した後、得られた消化物を１.５％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、それぞれ約４００bp、約１００bp
のＤＮＡ断片を得た。このうち、約４００bp断片には変
異導入部位が含まれる。
【００１２】次に、このようにして得られた変異遺伝子
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニング
し、発現ベクターを作製した。プラスミドpＪＬＡ５０
４(ドイツ：Ｍedac社より購入)をＳphＩおよびＳalＩで
消化し、約４.９kbの断片を０.７％アガロース電気泳動
により精製した後、上記約４００bp、約１００bpの変異
rnh遺伝子断片(それぞれＳphＩ−ＸhoＩおよびＸhoＩ−
ＳalＩ断片)とライゲーションすることにより環化し
た。ライゲーションは市販のライゲーションキット(Ｔa
kara)を用い、添付の説明書に正確に従って行った。こ
のようにして得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株
を形質転換し、形質転換体より変異型リボヌクレアーゼ
ＨＩ発現用プラスミドベクターpＪＡＬ１３４Ｈを得
た。上記のようにして得られた形質転換菌エシエリシア
・コリ(Ｅ.coli)ＨＢ１０１／pＪＡＬ１３４Ｈは工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研菌
寄第１３３２１号、受託日：平成４年１２月３日）。
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニング
し、発現ベクターを作製した。プラスミドpＪＬＡ５０
４(ドイツ：Ｍedac社より購入)をＳphＩおよびＳalＩで
消化し、約４.９kbの断片を０.７％アガロース電気泳動
により精製した後、上記約４００bp、約１００bpの変異
rnh遺伝子断片(それぞれＳphＩ−ＸhoＩおよびＸhoＩ−
ＳalＩ断片)とライゲーションすることにより環化し
た。ライゲーションは市販のライゲーションキット(Ｔa
kara)を用い、添付の説明書に正確に従って行った。こ
のようにして得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株
を形質転換し、形質転換体より変異型リボヌクレアーゼ
ＨＩ発現用プラスミドベクターpＪＡＬ１３４Ｈを得
た。上記のようにして得られた形質転換菌エシエリシア
・コリ(Ｅ.coli)ＨＢ１０１／pＪＡＬ１３４Ｈは工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研菌
寄第１３３２１号、受託日：平成４年１２月３日）。
【００１３】実施例２ 変異型リボヌクレアーゼＨＩ
（Ｋ９５Ｇ）の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＡＬ１３４Ｈを１０
０mｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２００ml中、
３０℃で振盪培養した。培養液の濁度がクレット値で約
１００まで生育した時点で、培養温度を４２℃に上げ、
更に３.５時間振盪を続け、次いで遠心して集菌した。
この時のクレット値は約２５０であった。
（Ｋ９５Ｇ）の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＡＬ１３４Ｈを１０
０mｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２００ml中、
３０℃で振盪培養した。培養液の濁度がクレット値で約
１００まで生育した時点で、培養温度を４２℃に上げ、
更に３.５時間振盪を続け、次いで遠心して集菌した。
この時のクレット値は約２５０であった。
【００１４】得られた菌体を１mＭ ＥＤＴＡを含む１０
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.5)１５mlに懸濁した
後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,０
００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗抽
出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５lに対して４℃で一夜透析し
た。透析後の粗抽出液を、同緩衝液で平衡化したＰ−１
１カラム(２ml)に通した。この条件下、変異型リボヌク
レアーゼＨＩ(Ｄ１３４Ｈ)は、Ｐ−１１カラムに吸着す
る。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、ＮaＣl濃度を０.
５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ−１１カラム
から変異型リボヌクレアーゼＨＩ(Ｄ１３４Ｈ)を溶出さ
せた。変異型リボヌクレアーゼＨＩ(Ｄ１３４Ｈ)を含む
Ｐ−１１溶出画分をまとめ、精製標品とした。精製標品
は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相Ｈ
ＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量は７mg／l培
養液であった。精製標品の同定は、アクロモバクタープ
ロテアーゼＩにより消化して得られるペプチドフラグメ
ントを逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメントピ
ークの溶出位置を確認するとともに、１３４位のアミノ
酸を含むペプチドを分取後アミノ酸配列分析により行っ
た。
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.5)１５mlに懸濁した
後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,０
００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗抽
出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５lに対して４℃で一夜透析し
た。透析後の粗抽出液を、同緩衝液で平衡化したＰ−１
１カラム(２ml)に通した。この条件下、変異型リボヌク
レアーゼＨＩ(Ｄ１３４Ｈ)は、Ｐ−１１カラムに吸着す
る。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、ＮaＣl濃度を０.
５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ−１１カラム
から変異型リボヌクレアーゼＨＩ(Ｄ１３４Ｈ)を溶出さ
せた。変異型リボヌクレアーゼＨＩ(Ｄ１３４Ｈ)を含む
Ｐ−１１溶出画分をまとめ、精製標品とした。精製標品
は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相Ｈ
ＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量は７mg／l培
養液であった。精製標品の同定は、アクロモバクタープ
ロテアーゼＩにより消化して得られるペプチドフラグメ
ントを逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメントピ
ークの溶出位置を確認するとともに、１３４位のアミノ
酸を含むペプチドを分取後アミノ酸配列分析により行っ
た。
【００１５】得られた精製標品の０.１Ｍ ＮaＣlを含む
１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.５)中における２
００〜２５０nmでのＣＤスペクトルは天然型と同一であ
り、ＣＤスペクトルで検出できるような２次構造の変化
は見られなかった。また、以下の方法により酵素活性を
測定し、比活性を測定したところ、得られた変異型酵素
は１２Ｕ／mgの比活性を有しており、天然型酵素の約６
０％の酵素活性を保持していた。得られた比較結果を以
下の表１に示す。活性は、[3Ｈ]−Ｍ１３ＤＮＡ／ＲＮ
Ａを基質として用い、３０℃、１分間に１μmolの酸可
溶性物質を遊離する酵素活性を１ユニット(Ｕ)と定義し
た。タンパク量は変異型リボヌクレアーゼＨＩと天然型
リボヌクレアーゼＨＩとが同じ吸光係数を持つという仮
定のもとにε280＝１５７６Ｍ-1・cm-1を用いて２８０n
mにおける吸光度を測定することにより求めた。
１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.５)中における２
００〜２５０nmでのＣＤスペクトルは天然型と同一であ
り、ＣＤスペクトルで検出できるような２次構造の変化
は見られなかった。また、以下の方法により酵素活性を
測定し、比活性を測定したところ、得られた変異型酵素
は１２Ｕ／mgの比活性を有しており、天然型酵素の約６
０％の酵素活性を保持していた。得られた比較結果を以
下の表１に示す。活性は、[3Ｈ]−Ｍ１３ＤＮＡ／ＲＮ
Ａを基質として用い、３０℃、１分間に１μmolの酸可
溶性物質を遊離する酵素活性を１ユニット(Ｕ)と定義し
た。タンパク量は変異型リボヌクレアーゼＨＩと天然型
リボヌクレアーゼＨＩとが同じ吸光係数を持つという仮
定のもとにε280＝１５７６Ｍ-1・cm-1を用いて２８０n
mにおける吸光度を測定することにより求めた。
【表１】 天然型と変異型リボヌクレアーゼＨＩの酵素活性の比較 酵素名 比活性(Ｕ／mg) 天然型リボヌクレアーゼＨＩ ２０ 変異型リボヌクレアーゼＨＩ(Ｄ１３４Ｈ) １２
【００１６】実施例３ 変異型リボヌクレアーゼＨＩ
(Ｄ１３４Ｈ)の安定性の評価 天然型リボヌクレアーゼＨＩと変異型リボヌクレアーゼ
ＨＩ（Ｄ１３４Ｈ）の熱安定性について測定し、比較し
た。測定はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおける
ＣＤ値で熱変性曲線を測定することにより行った。熱変
性実験は光路長２mmのセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジン
を含む２０mＭ酢酸ナトリウム（pＨ５.５）中で行っ
た。変異型リボヌクレアーゼＨＩ（Ｄ１３４Ｈ）の熱変
性曲線は天然型の熱変性曲線よりも高温側へシフトして
おり、明らかに熱安定性が増加していた。全体の５０％
が変性するときの温度を比較すると変異型リボヌクレア
ーゼＨＩ（Ｄ１３４Ｈ）は天然型よりも７．０℃安定化
していた。得られた結果を以下の表２に示す。
(Ｄ１３４Ｈ)の安定性の評価 天然型リボヌクレアーゼＨＩと変異型リボヌクレアーゼ
ＨＩ（Ｄ１３４Ｈ）の熱安定性について測定し、比較し
た。測定はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおける
ＣＤ値で熱変性曲線を測定することにより行った。熱変
性実験は光路長２mmのセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジン
を含む２０mＭ酢酸ナトリウム（pＨ５.５）中で行っ
た。変異型リボヌクレアーゼＨＩ（Ｄ１３４Ｈ）の熱変
性曲線は天然型の熱変性曲線よりも高温側へシフトして
おり、明らかに熱安定性が増加していた。全体の５０％
が変性するときの温度を比較すると変異型リボヌクレア
ーゼＨＩ（Ｄ１３４Ｈ）は天然型よりも７．０℃安定化
していた。得られた結果を以下の表２に示す。
【表２】 天然型および変異型リボヌクレアーゼＨＩの熱安定性の比較 酵 素 名 ５０％変性するときの温度（℃） 天然型リボヌクレアーゼＨＩ ５３.１ 変異型リボヌクレアーゼ(Ｄ１３４Ｈ) ６０.１
【００１７】以上の結果から、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨＩの第１３４番目のＡspをＨisに変換すること
により、熱に対する安定性が向上することが確認され
た。
アーゼＨＩの第１３４番目のＡspをＨisに変換すること
により、熱に対する安定性が向上することが確認され
た。
【図１】 プラスミドpＪＡＬ１３４Ｈの構築を示す模
式図である。
式図である。
【図２】 部位特異的突然変異を導入するための合成オ
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中、下線は制
限酵素部位を、●印は変異アミノ酸に対応する塩基（Ａ
sp134に対応する塩基）をそれぞれ示すものである。
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中、下線は制
限酵素部位を、●印は変異アミノ酸に対応する塩基（Ａ
sp134に対応する塩基）をそれぞれ示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．267（30) Ｐ．21535−51542（1992．10．25) Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．267（31) Ｐ．22014−22017（1992．11．５) Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．258（２) Ｐ．1276−1281（1983) ＮＡＴＵＲＥ 347 Ｐ．306−309 （1990) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/22 C12N 15/55 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩのア
ミノ酸配列において、第１３４番目のアスパラギン酸が
ヒスチジンで置換されたアミノ酸配列を有する変異型大
腸菌リボヌクレアーゼＨＩ。 - 【請求項２】 請求項１に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩを暗号化している変異型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨＩ構造遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩ構造遺伝子を大腸菌の遺伝子発現系制御下
に含有している組換え体プラスミド。 - 【請求項４】 pＪＡＬ１３４Ｈである請求項３に記載
の組換え体プラスミド。 - 【請求項５】 請求項３または４のいずれかに記載の組
換え体プラスミドで形質転換された大腸菌株。 - 【請求項６】 ＨＢ１０１／pＪＡＬ１３４Ｈである請
求項５に記載の大腸菌株。 - 【請求項７】 請求項５または６のいずれかに記載の大
腸菌株を培養し、得られた培養液から変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨＩを回収することを特徴とする変異型大
腸菌リボヌクレアーゼＨＩの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32947292A JP2790583B2 (ja) | 1992-12-09 | 1992-12-09 | 変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32947292A JP2790583B2 (ja) | 1992-12-09 | 1992-12-09 | 変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06169768A JPH06169768A (ja) | 1994-06-21 |
| JP2790583B2 true JP2790583B2 (ja) | 1998-08-27 |
Family
ID=18221763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32947292A Expired - Lifetime JP2790583B2 (ja) | 1992-12-09 | 1992-12-09 | 変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2790583B2 (ja) |
-
1992
- 1992-12-09 JP JP32947292A patent/JP2790583B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２５８（２）Ｐ．１２７６−１２８１（１９８３） |
| Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２６７（３０）Ｐ．２１５３５−５１５４２（１９９２．１０．２５） |
| Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２６７（３１）Ｐ．２２０１４−２２０１７（１９９２．１１．５） |
| ＮＡＴＵＲＥ ３４７ Ｐ．３０６−３０９（１９９０） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06169768A (ja) | 1994-06-21 |
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