JP2790970B2 - ５重置換による大腸菌リボヌクレアーゼｈｉの安定化 - Google Patents
５重置換による大腸菌リボヌクレアーゼｈｉの安定化Info
- Publication number
- JP2790970B2 JP2790970B2 JP5314750A JP31475093A JP2790970B2 JP 2790970 B2 JP2790970 B2 JP 2790970B2 JP 5314750 A JP5314750 A JP 5314750A JP 31475093 A JP31475093 A JP 31475093A JP 2790970 B2 JP2790970 B2 JP 2790970B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ribonuclease
- escherichia coli
- mutant
- primer
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】本発明は、安定性が改良された変異型大腸
菌リボヌクレアーゼＨＩ、該変異型大腸菌リボヌクレア
ーゼＨＩをコードしている遺伝子、該遺伝子を含有し大
腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発現ベクターを含
有している形質転換体、および該形質転換体を用いて変
異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを製造する方法に関す
る。
菌リボヌクレアーゼＨＩ、該変異型大腸菌リボヌクレア
ーゼＨＩをコードしている遺伝子、該遺伝子を含有し大
腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発現ベクターを含
有している形質転換体、および該形質転換体を用いて変
異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを製造する方法に関す
る。
【０００２】大腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨＩ(本
明細書に於いては、単にリボヌクレアーゼＨＩ、または
ＲＮaseＨＩと称する場合は、天然型の大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩを意味するものとする)は１５５アミノ酸
からなる分子量約１９Ｋdの加水分解酵素であって、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエ
ンド作用で切断するという基質特異性を有する。この酵
素は、その基質特異性に基づき、下記の如き様々な用途
を有し、極めて利用価値の高い酵素として注目されてい
る。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。
明細書に於いては、単にリボヌクレアーゼＨＩ、または
ＲＮaseＨＩと称する場合は、天然型の大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩを意味するものとする)は１５５アミノ酸
からなる分子量約１９Ｋdの加水分解酵素であって、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエ
ンド作用で切断するという基質特異性を有する。この酵
素は、その基質特異性に基づき、下記の如き様々な用途
を有し、極めて利用価値の高い酵素として注目されてい
る。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。
【０００３】リボヌクレアーゼＨＩの重要性は遺伝子工
学の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この
酵素は、大腸菌内での産生量が極めて低いことから、組
換えＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、
既にＰromega, ＢＲＬ、ファルマシア、東洋紡および宝
酒造等から、組換えＤＮＡ技術により生産されたリボヌ
クレアーゼＨＩが供給されている。これらの市販の組換
えリボヌクレアーゼＨＩは、大腸菌を宿主として生産さ
れるものである(金谷ら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、２６４、１１５４６−１１５４
９(１９８９））。
学の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この
酵素は、大腸菌内での産生量が極めて低いことから、組
換えＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、
既にＰromega, ＢＲＬ、ファルマシア、東洋紡および宝
酒造等から、組換えＤＮＡ技術により生産されたリボヌ
クレアーゼＨＩが供給されている。これらの市販の組換
えリボヌクレアーゼＨＩは、大腸菌を宿主として生産さ
れるものである(金谷ら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、２６４、１１５４６−１１５４
９(１９８９））。
【０００４】このように利用価値の高いリボヌクレアー
ゼＨＩの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐性を高め
ることができれば、従来の組換えリボヌクレアーゼＨＩ
では利用できなかった条件下での利用が可能となる。
ゼＨＩの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐性を高め
ることができれば、従来の組換えリボヌクレアーゼＨＩ
では利用できなかった条件下での利用が可能となる。
【０００５】これまでに本発明者らは組換えＤＮＡ技術
を用いて、変性剤に対して天然型リボヌクレアーゼＨＩ
よりも高い安定性を有する変異型リボヌクレアーゼＨＩ
を製造したが、その安定化や残存活性の程度は必ずしも
十分満足し得るものではなかった（特開平３−１４７７
８５(特願平１−２８４４５４)、特開平５−３７８７
(特願平３−１５８３３２)、特開平５−３８２８６(特
願平３−１９７７０３)、特開平５−６４５８５(特願平
３−１９７７０７)、特開平５−７６３５８(特願平３−
２４７４４０、特願平４−３２９４７０、特願平４−３
２９４７２)。また、大腸菌リボヌクレアーゼＨＩより
も極めて高い安定性を有する好熱菌リボヌクレアーゼＨ
の大腸菌による製造法も報告されているが(金谷及び板
谷、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
２６７、１０１８４−１０１９２(１９９２);特開平４
−８２９４(特願平２−１１１０６５))、大腸菌を用い
て産生された好熱菌リボヌクレアーゼＨの酵素活性は、
大腸菌リボヌクレアーゼＨＩよりも低いものであった。
尚、後者の場合、精製には尿素を用いて可溶化するとい
う操作が必要であり、大腸菌リボヌクレアーゼＨＩの場
合に比べてその製造方法が複雑であるという欠点もあっ
た。従ってより酵素活性安定性にすぐれた酵素であっ
て、その製造及び精製も好熱菌リボヌクレアーゼＨより
も容易である変異型リボヌクレアーゼＨＩをつくること
ができれば、産業上より利用価値が高いと考えられる。
を用いて、変性剤に対して天然型リボヌクレアーゼＨＩ
よりも高い安定性を有する変異型リボヌクレアーゼＨＩ
を製造したが、その安定化や残存活性の程度は必ずしも
十分満足し得るものではなかった（特開平３−１４７７
８５(特願平１−２８４４５４)、特開平５−３７８７
(特願平３−１５８３３２)、特開平５−３８２８６(特
願平３−１９７７０３)、特開平５−６４５８５(特願平
３−１９７７０７)、特開平５−７６３５８(特願平３−
２４７４４０、特願平４−３２９４７０、特願平４−３
２９４７２)。また、大腸菌リボヌクレアーゼＨＩより
も極めて高い安定性を有する好熱菌リボヌクレアーゼＨ
の大腸菌による製造法も報告されているが(金谷及び板
谷、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
２６７、１０１８４−１０１９２(１９９２);特開平４
−８２９４(特願平２−１１１０６５))、大腸菌を用い
て産生された好熱菌リボヌクレアーゼＨの酵素活性は、
大腸菌リボヌクレアーゼＨＩよりも低いものであった。
尚、後者の場合、精製には尿素を用いて可溶化するとい
う操作が必要であり、大腸菌リボヌクレアーゼＨＩの場
合に比べてその製造方法が複雑であるという欠点もあっ
た。従ってより酵素活性安定性にすぐれた酵素であっ
て、その製造及び精製も好熱菌リボヌクレアーゼＨより
も容易である変異型リボヌクレアーゼＨＩをつくること
ができれば、産業上より利用価値が高いと考えられる。
【０００６】本発明者らは、上記の観点から、大腸菌リ
ボヌクレアーゼＨＩの酵素活性を保持しながら、その安
定性を高めることを目的として、これまでに大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨＩの酵素活性を損なうことなしに安定性
をそれぞれ２〜７℃高めることのわかっている変異をい
くつか同時に導入してみた結果、酵素活性をそれほど損
なうことなしに安定性の著しく増大した２種の変異型リ
ボヌクレアーゼＨＩ５重置換体を得た。導入した変異
は、Ｇly２３→Ａla(未発表データ)、Ｈis６２→Ｐro
(特開平５−３７８７)、Ｖal７４→Ｌeu(特願平４−３
２９４７０)、Ｌys９５→Ｇly(特開平５−７６３５９
(特願平３−２４７４４１))、及びＡsp１３４→Ｈis(特
願平４−３２９４７２)又はＡsp１３４→Ａsn(特願平４
−３２９４７２)である。これら２種の５重置換変異体
(以下、５Ｈ−リボヌクレアーゼＨＩ及び５Ｎ−リボヌ
クレアーゼＨＩという)はいずれも従来の安定性が改良
された変異体より熱に対する安定性においても酵素活性
においても優れていることを見いだし、本発明を完成す
るに至った。
ボヌクレアーゼＨＩの酵素活性を保持しながら、その安
定性を高めることを目的として、これまでに大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨＩの酵素活性を損なうことなしに安定性
をそれぞれ２〜７℃高めることのわかっている変異をい
くつか同時に導入してみた結果、酵素活性をそれほど損
なうことなしに安定性の著しく増大した２種の変異型リ
ボヌクレアーゼＨＩ５重置換体を得た。導入した変異
は、Ｇly２３→Ａla(未発表データ)、Ｈis６２→Ｐro
(特開平５−３７８７)、Ｖal７４→Ｌeu(特願平４−３
２９４７０)、Ｌys９５→Ｇly(特開平５−７６３５９
(特願平３−２４７４４１))、及びＡsp１３４→Ｈis(特
願平４−３２９４７２)又はＡsp１３４→Ａsn(特願平４
−３２９４７２)である。これら２種の５重置換変異体
(以下、５Ｈ−リボヌクレアーゼＨＩ及び５Ｎ−リボヌ
クレアーゼＨＩという)はいずれも従来の安定性が改良
された変異体より熱に対する安定性においても酵素活性
においても優れていることを見いだし、本発明を完成す
るに至った。
【０００７】即ち、本発明は、Ｇly２３がＡlaに、Ｈis
６２がＰroに、Ｖal７４がＬeuに、Ｌys９５がＧlyに、
Ａsp１３４がＨisに置換された５Ｈ−リボヌクレアーゼ
ＨＩである変異大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ及び、Ｇly
２３がＡlaに、Ｈis６２がＰroに、Ｖal７４がＬeuに、
Ｌys９５がＧlyに、Ａsp１３４がＡsnに置換された５Ｎ
−リボヌクレアーゼＨＩである変異大腸菌リボヌクレア
ーゼＨＩを提供するものである。
６２がＰroに、Ｖal７４がＬeuに、Ｌys９５がＧlyに、
Ａsp１３４がＨisに置換された５Ｈ−リボヌクレアーゼ
ＨＩである変異大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ及び、Ｇly
２３がＡlaに、Ｈis６２がＰroに、Ｖal７４がＬeuに、
Ｌys９５がＧlyに、Ａsp１３４がＡsnに置換された５Ｎ
−リボヌクレアーゼＨＩである変異大腸菌リボヌクレア
ーゼＨＩを提供するものである。
【０００８】また、本発明は、上に述べた変異型大腸菌
リボヌクレアーゼＨＩ、即ち５Ｈ−および５Ｎ−リボヌ
クレアーゼＨＩの構造遺伝子を提供するものである。ま
た、本発明は上記変異型リボヌクレアーゼＨＩを大腸菌
で発現させるための発現ベクターを提供するものであ
る。
リボヌクレアーゼＨＩ、即ち５Ｈ−および５Ｎ−リボヌ
クレアーゼＨＩの構造遺伝子を提供するものである。ま
た、本発明は上記変異型リボヌクレアーゼＨＩを大腸菌
で発現させるための発現ベクターを提供するものであ
る。
【０００９】また本発明は、上記の発現ベクターで形質
転換された変異型リボヌクレアーゼＨＩ産生性の形質転
換体を提供するものである。さらに本発明は、該形質転
換体を培養することにより、高い安定性を有する変異型
リボヌクレアーゼＨＩを製造する方法を提供するもので
ある。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成書(Ｍaniatis
ら、Ｍoleculer Ｃloning(１９８２);Ａ Ｌaboratoy
Ｍanual, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｙ）に詳述されており、上記変異型リボヌクレアーゼ
ＨＩ構造遺伝子、発現ベクター、形質転換体は、この成
書に記載の一般的手法に従って、例えば後記実施例に示
した様に常法通り作製することができる。尚、本発明の
発現ベクターは、大腸菌内で機能するものであれば特に
制限はないが、バクテリオファージλのＰＬおよびＰR
プロモーターの支配下に上記変異型リボヌクレアーゼＨ
Ｉ遺伝子を含有しているものが好ましい。
転換された変異型リボヌクレアーゼＨＩ産生性の形質転
換体を提供するものである。さらに本発明は、該形質転
換体を培養することにより、高い安定性を有する変異型
リボヌクレアーゼＨＩを製造する方法を提供するもので
ある。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成書(Ｍaniatis
ら、Ｍoleculer Ｃloning(１９８２);Ａ Ｌaboratoy
Ｍanual, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｙ）に詳述されており、上記変異型リボヌクレアーゼ
ＨＩ構造遺伝子、発現ベクター、形質転換体は、この成
書に記載の一般的手法に従って、例えば後記実施例に示
した様に常法通り作製することができる。尚、本発明の
発現ベクターは、大腸菌内で機能するものであれば特に
制限はないが、バクテリオファージλのＰＬおよびＰR
プロモーターの支配下に上記変異型リボヌクレアーゼＨ
Ｉ遺伝子を含有しているものが好ましい。
【００１０】本発明により安定性が高められた変異型大
腸菌リボヌクレアーゼＨＩは、従来のリボヌクレアーゼ
ＨＩでは変性してしまう高い温度下でさえも変性するこ
とがない(実施例３参照)ので、このような条件下での取
扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨＩは、耐久性等も向上していると期待さ
れ、従来のリボヌクレアーゼＨＩよりも失活しにくく、
安定に保存することができるので、取り扱いが容易にな
ることは理解されるであろう。
腸菌リボヌクレアーゼＨＩは、従来のリボヌクレアーゼ
ＨＩでは変性してしまう高い温度下でさえも変性するこ
とがない(実施例３参照)ので、このような条件下での取
扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨＩは、耐久性等も向上していると期待さ
れ、従来のリボヌクレアーゼＨＩよりも失活しにくく、
安定に保存することができるので、取り扱いが容易にな
ることは理解されるであろう。
【００１１】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１
９８２); Ａ Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓpring
Ｈarbor Ｌaboratoy)および試薬の仕様書に従った。
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１
９８２); Ａ Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓpring
Ｈarbor Ｌaboratoy)および試薬の仕様書に従った。
【００１２】実施例１ プラスミドpＪＡＬ ５Ｈ及びp
ＪＡＬ ５Ｎの作製 プラスミドpＪＡＬ ５Ｈ及びpＪＡＬ ５ＮはＰＣＲ法で
作製した。ＰＣＲ反応は、Ｖal74のコドンをＬeuのコド
ンに置換した変異rnhＡ遺伝子を鋳型とし、プライマー
を用いて以下に述べる方法でrnh遺伝子への点突然変異
の導入を行った。尚、この変異rnhＡ遺伝子は、プラス
ミドpＪＡＬ７４Ｌに組み込まれており、このプラスミ
ドは工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る、Ｅscherichia coli ＨＢ１０１／pＪＡＬ７４Ｌ
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３２０：寄託日平成４年１２月３
日）から得ることができる。
ＪＡＬ ５Ｎの作製 プラスミドpＪＡＬ ５Ｈ及びpＪＡＬ ５ＮはＰＣＲ法で
作製した。ＰＣＲ反応は、Ｖal74のコドンをＬeuのコド
ンに置換した変異rnhＡ遺伝子を鋳型とし、プライマー
を用いて以下に述べる方法でrnh遺伝子への点突然変異
の導入を行った。尚、この変異rnhＡ遺伝子は、プラス
ミドpＪＡＬ７４Ｌに組み込まれており、このプラスミ
ドは工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る、Ｅscherichia coli ＨＢ１０１／pＪＡＬ７４Ｌ
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３２０：寄託日平成４年１２月３
日）から得ることができる。
【００１３】プライマーとして、図１に示す化学合成し
たオリゴヌクレオチドを用いた。Ｖal74のコドンをＬeu
のコドンに置換した変異rnhＡ遺伝子を有するプラスミ
ドpＪＡＬ ７４Ｌを鋳型ＤＮＡとし、ＢglＩＩの制限酵
素部位を含む５'−プライマーと変異導入用３'−プライ
マー(６)により約２８０bpのＤＮＡ断片を、また変異導
入用５'−プライマー(５)とＳalＩ部位を含む３'−プラ
イマーにより約２２０bpのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ
反応により増幅し、Ｌys95をＧly95に変換した変異rnh
遺伝子断片２種を得た。ＰＣＲ反応は市販のＧnen Ａm
p Ｋit(Ｔakara)の説明書に従って行った。上記rnh遺
伝子断片をアガロース電気泳動により精製した後、両者
を混合し、５'−プライマーと３'−プライマーを添加し
て再度ＰＣＲ反応を行うことにより、ＢglＩＩ,ＳalＩ
制限酵素部位を両端にもつ変異rnh遺伝子断片を得た。
この得られた約５００bpの変異rnh遺伝子断片を鋳型Ｄ
ＮＡとし、５'−プライマーと変異導入用３'−プライマ
ー(４)により約１７０bpのＤＮＡ断片を、また変異導入
用５'−プライマー(３)と３'−プライマーにより約３１
０bpのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、
Ｈis62をＰro62に変換した変異rnh遺伝子断片２種を得
た。これらをアガロース電気泳動により精製した後、両
者を混合し、５'−プライマーと３'−プライマーを添加
して再度ＰＣＲ反応を行い、約５００bpの変異rnh遺伝
子断片を得た。同様にして５'−プライマーと変異導入
用３'−プライマー(２)のＰＣＲ反応で約６５bp、変異
導入用５'−プライマー(１)と３'−プライマーのＰＣＲ
反応で４１５bpのＤＮＡ断片を増幅してＧly23をＡla23
に変換した。最後に５'−プライマーと変異導入用３'−
プライマー(８)で約４００bp、変異導入用５'−プライ
マー(７)と３'−プライマーで約１００bpのＤＮＡ断片
を増幅してＡsp134をＨis134に、又は５'−プライマー
と変異導入用３'−プライマー(９)で約４００bp、変異
導入用５'−プライマー(７)と３'−プライマーで約１０
０bpのＤＮＡ断片を増幅してＡsp134をＡsn134に変換
し、２種のＤＮＡ断片を精製, 混合し、５'−プライマ
ーと３'−プライマーを添加して再度ＰＣＲ反応してＢg
lＩＩ, ＳalＩ制限酵素部位を両端にもつ変異rnh遺伝子
断片を得た。以上のようにして２３番をＡlaに、６２番
をＰroに、７４番をＬeuに、９５番をＧlyに、１３４番
をＨis又はＡsnに変換した約５００bpの変異rnh断片を
制限酵素ＢglＩＩおよびＳalＩで切断した後、消化物を
１.５％アガロース電気泳動にかけ、約５００bpの変異r
nh ＢglＩＩ−ＳalＩ遺伝子断片を切りだし、抽出して
精製した。この様にして得た、５Ｈおよび５Ｎ ＲＮase
ＨＩをコードする遺伝子のＤＮＡ配列およびそれによっ
てコードされるアミノ酸配列を図２および図３に示し
た。
たオリゴヌクレオチドを用いた。Ｖal74のコドンをＬeu
のコドンに置換した変異rnhＡ遺伝子を有するプラスミ
ドpＪＡＬ ７４Ｌを鋳型ＤＮＡとし、ＢglＩＩの制限酵
素部位を含む５'−プライマーと変異導入用３'−プライ
マー(６)により約２８０bpのＤＮＡ断片を、また変異導
入用５'−プライマー(５)とＳalＩ部位を含む３'−プラ
イマーにより約２２０bpのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ
反応により増幅し、Ｌys95をＧly95に変換した変異rnh
遺伝子断片２種を得た。ＰＣＲ反応は市販のＧnen Ａm
p Ｋit(Ｔakara)の説明書に従って行った。上記rnh遺
伝子断片をアガロース電気泳動により精製した後、両者
を混合し、５'−プライマーと３'−プライマーを添加し
て再度ＰＣＲ反応を行うことにより、ＢglＩＩ,ＳalＩ
制限酵素部位を両端にもつ変異rnh遺伝子断片を得た。
この得られた約５００bpの変異rnh遺伝子断片を鋳型Ｄ
ＮＡとし、５'−プライマーと変異導入用３'−プライマ
ー(４)により約１７０bpのＤＮＡ断片を、また変異導入
用５'−プライマー(３)と３'−プライマーにより約３１
０bpのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、
Ｈis62をＰro62に変換した変異rnh遺伝子断片２種を得
た。これらをアガロース電気泳動により精製した後、両
者を混合し、５'−プライマーと３'−プライマーを添加
して再度ＰＣＲ反応を行い、約５００bpの変異rnh遺伝
子断片を得た。同様にして５'−プライマーと変異導入
用３'−プライマー(２)のＰＣＲ反応で約６５bp、変異
導入用５'−プライマー(１)と３'−プライマーのＰＣＲ
反応で４１５bpのＤＮＡ断片を増幅してＧly23をＡla23
に変換した。最後に５'−プライマーと変異導入用３'−
プライマー(８)で約４００bp、変異導入用５'−プライ
マー(７)と３'−プライマーで約１００bpのＤＮＡ断片
を増幅してＡsp134をＨis134に、又は５'−プライマー
と変異導入用３'−プライマー(９)で約４００bp、変異
導入用５'−プライマー(７)と３'−プライマーで約１０
０bpのＤＮＡ断片を増幅してＡsp134をＡsn134に変換
し、２種のＤＮＡ断片を精製, 混合し、５'−プライマ
ーと３'−プライマーを添加して再度ＰＣＲ反応してＢg
lＩＩ, ＳalＩ制限酵素部位を両端にもつ変異rnh遺伝子
断片を得た。以上のようにして２３番をＡlaに、６２番
をＰroに、７４番をＬeuに、９５番をＧlyに、１３４番
をＨis又はＡsnに変換した約５００bpの変異rnh断片を
制限酵素ＢglＩＩおよびＳalＩで切断した後、消化物を
１.５％アガロース電気泳動にかけ、約５００bpの変異r
nh ＢglＩＩ−ＳalＩ遺伝子断片を切りだし、抽出して
精製した。この様にして得た、５Ｈおよび５Ｎ ＲＮase
ＨＩをコードする遺伝子のＤＮＡ配列およびそれによっ
てコードされるアミノ酸配列を図２および図３に示し
た。
【００１４】次に、このようにして得られた変異遺伝子
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニング
し、発現ベクターを作製した。プラスミドpＪＡＬ７４
ＬをＢglＩＩおよびＳalＩで消化し、約４.９kbの断片
を０.７％アガロース電気泳動により精製した後、上記
約５００bpの変異rnh遺伝子ＢglＩＩ−ＳalＩ断片とラ
イゲーションすることにより環化した。ライゲーション
は市販のライゲーションキット(Ｔakara)を用い、添付
の説明書に正確に従って行った。このようにして得られ
たプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株(宝酒造)を形質転換
し、形質転換体より変異型リボヌクレアーゼＨＩ(５Ｈ,
５Ｎ)発現用プラスミドベクターpＪＡＬ ５ＨおよびpＪ
ＡＬ ５Ｎを得た。pＨＡＬ ５ＨおよびpＪＡＬ ５Ｎの
制限酵素切断地図を図４に示す。これらのプラスミドを
含有している大腸菌、Ｅscherichia coli ＨＢ１０１／
pＪＡＬ５Ｈ、およびＥscherichia coli ＨＢ１０１／p
ＪＡＬ５Ｎはそれぞれ寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３９８
８およびＦＥＲＭ Ｐ−１３９８９で工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている（寄託日はいずれも
平成５年１１月３０日）。
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニング
し、発現ベクターを作製した。プラスミドpＪＡＬ７４
ＬをＢglＩＩおよびＳalＩで消化し、約４.９kbの断片
を０.７％アガロース電気泳動により精製した後、上記
約５００bpの変異rnh遺伝子ＢglＩＩ−ＳalＩ断片とラ
イゲーションすることにより環化した。ライゲーション
は市販のライゲーションキット(Ｔakara)を用い、添付
の説明書に正確に従って行った。このようにして得られ
たプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株(宝酒造)を形質転換
し、形質転換体より変異型リボヌクレアーゼＨＩ(５Ｈ,
５Ｎ)発現用プラスミドベクターpＪＡＬ ５ＨおよびpＪ
ＡＬ ５Ｎを得た。pＨＡＬ ５ＨおよびpＪＡＬ ５Ｎの
制限酵素切断地図を図４に示す。これらのプラスミドを
含有している大腸菌、Ｅscherichia coli ＨＢ１０１／
pＪＡＬ５Ｈ、およびＥscherichia coli ＨＢ１０１／p
ＪＡＬ５Ｎはそれぞれ寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３９８
８およびＦＥＲＭ Ｐ−１３９８９で工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている（寄託日はいずれも
平成５年１１月３０日）。
【００１５】実施例２ 変異型リボヌクレアーゼＨＩ
(５Ｈ,５Ｎ)の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＡＬ ５Ｈ、ＨＢ１０
１／pＪＡＬ ５Ｎを１００μg／１のアンピシリンを含
むＬＢ培地２００ml中、３０℃で振盪培養した。培養液
の濁度がクレット値で約８０まで生育した時点で、培養
温度を４２℃に上げ、更に３.５時間振盪を続け、次い
で遠心して集菌した。この時のクレット値は約２００〜
２４０であった。
(５Ｈ,５Ｎ)の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＡＬ ５Ｈ、ＨＢ１０
１／pＪＡＬ ５Ｎを１００μg／１のアンピシリンを含
むＬＢ培地２００ml中、３０℃で振盪培養した。培養液
の濁度がクレット値で約８０まで生育した時点で、培養
温度を４２℃に上げ、更に３.５時間振盪を続け、次い
で遠心して集菌した。この時のクレット値は約２００〜
２４０であった。
【００１６】得られた菌体から、以下に示すような方法
により、変異型リボヌクレアーゼＨＩ(５Ｈ, ５Ｎ)をそ
れぞれ精製した。得られた菌体を１mＭ ＥＤＴＡを含
む１０mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに
懸濁した後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。
１５,０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上
清(粗抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５１に対して４℃で一
夜透析した。透析後の粗抽出液を同緩衝液で平衡化した
Ｐ−１１カラム(２ml)に通した。この条件下、変異型リ
ボヌクレアーゼＨＩはいずれもＰ−１１カラムに吸着す
る。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、ＮaＣl濃度を０.
５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ−１１カラム
から変異型リボヌクレアーゼＨＩを溶出させた。変異型
リボヌクレアーゼＨＩを含むＰ−１１溶出画分をまと
め、精製標品とした。精製標品は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅでいずれも単一バンドを与え、逆相ＨＰＬＣでも単一
ピークを示した。精製収量は表１に示したとおりであっ
た。
により、変異型リボヌクレアーゼＨＩ(５Ｈ, ５Ｎ)をそ
れぞれ精製した。得られた菌体を１mＭ ＥＤＴＡを含
む１０mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに
懸濁した後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。
１５,０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上
清(粗抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５１に対して４℃で一
夜透析した。透析後の粗抽出液を同緩衝液で平衡化した
Ｐ−１１カラム(２ml)に通した。この条件下、変異型リ
ボヌクレアーゼＨＩはいずれもＰ−１１カラムに吸着す
る。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、ＮaＣl濃度を０.
５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ−１１カラム
から変異型リボヌクレアーゼＨＩを溶出させた。変異型
リボヌクレアーゼＨＩを含むＰ−１１溶出画分をまと
め、精製標品とした。精製標品は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅでいずれも単一バンドを与え、逆相ＨＰＬＣでも単一
ピークを示した。精製収量は表１に示したとおりであっ
た。
【００１７】
【表１】 変異型リボヌクレアーゼＨＩの精製収量 変異型リボヌクレアーゼＨＩ 培養液１ lあたりの精製収量(mg) ５Ｈ ７０ ５Ｎ ９５ 精製標品の同定は、リジンエンドペプチターゼ及びキモ
トリプシンにより消化して得られるペプチドフラグメン
トを逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメントピー
クの溶出位置を確認するとともに、全てのペプチドを分
取後、アミノ酸配列分析により行った。このアミノ酸配
列分析の結果は図２および図３に示した通りであった。
トリプシンにより消化して得られるペプチドフラグメン
トを逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメントピー
クの溶出位置を確認するとともに、全てのペプチドを分
取後、アミノ酸配列分析により行った。このアミノ酸配
列分析の結果は図２および図３に示した通りであった。
【００１８】得られた精製標品について以下の方法で酵
素活性を測定した。活性は、[3Ｈ]−Ｍ１３ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡ（金谷ら、Ｊournal of ＢiologicalＣhemistry,
Ｖol 266，p6038-6044, 1991）を基質として用い、３７
℃、１分間に１μmolの酸可溶性物質を遊離する酵素活
性を１ユニット(Ｕ)と定義した。タンパク量は天然型リ
ボヌクレアーゼＨＩと同じ吸光係数を持つという仮定の
もとにε280＝３.５×１０4Ｍ-1・cm-1を用いて２８０n
mにおける吸光度を測定することにより求めた。得られ
た酵素活性を天然型酵素と比較した結果を表２に示す。
素活性を測定した。活性は、[3Ｈ]−Ｍ１３ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡ（金谷ら、Ｊournal of ＢiologicalＣhemistry,
Ｖol 266，p6038-6044, 1991）を基質として用い、３７
℃、１分間に１μmolの酸可溶性物質を遊離する酵素活
性を１ユニット(Ｕ)と定義した。タンパク量は天然型リ
ボヌクレアーゼＨＩと同じ吸光係数を持つという仮定の
もとにε280＝３.５×１０4Ｍ-1・cm-1を用いて２８０n
mにおける吸光度を測定することにより求めた。得られ
た酵素活性を天然型酵素と比較した結果を表２に示す。
【表２】 天然型と変異型リボヌクレアーゼＨＩの酵素活性の比較 酵素名 比活性(Ｕ／mg) 天然型リボヌクレアーゼＨＩ ８.８３ 変異型リボヌクレアーゼＨＩ(５Ｈ) ３.１３ (５Ｎ) ４.８３ 表２から明らかなように、いずれの変異酵素とも天然型
酵素の３５％以上の酵素活性を有していた。
酵素の３５％以上の酵素活性を有していた。
【００１９】実施例３ 変異型リボヌクレアーゼＨＩの安定性の評価 天然型リボヌクレアーゼＨＩと本発明に係る変異型リボ
ヌクレアーゼＨＩの熱安定性について測定し、比較し
た。測定はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおける
ＣＤ値で熱変性曲線を測定することにより行った。熱変
性実験は光路長２mmのセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジン
および０.１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０mＭ酢酸ナトリ
ウム(pＨ５.５)中で行った。測定により得られた変異型
リボヌクレアーゼＨＩの熱変性曲線はいずれも天然型の
熱変性曲線よりも高温側へシフトしており、明らかに熱
安定性が増加していた。全体の５０％が変性するときの
温度を比較した結果を表３に示す。
ヌクレアーゼＨＩの熱安定性について測定し、比較し
た。測定はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおける
ＣＤ値で熱変性曲線を測定することにより行った。熱変
性実験は光路長２mmのセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジン
および０.１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０mＭ酢酸ナトリ
ウム(pＨ５.５)中で行った。測定により得られた変異型
リボヌクレアーゼＨＩの熱変性曲線はいずれも天然型の
熱変性曲線よりも高温側へシフトしており、明らかに熱
安定性が増加していた。全体の５０％が変性するときの
温度を比較した結果を表３に示す。
【表３】 天然型および変異型リボヌクレアーゼＨＩの熱安定性の比較 酵素名 ５０％変性するときの温度(℃) 天然型リボヌクレアーゼＨＩ ５２.５ 天然型リボヌクレアーゼＨＩ(５Ｈ) ７２.７ (５Ｎ) ７０.１ 変異酵素５Ｈおよび５Ｎは天然型酵素よりもそれぞれ２
０.２℃、１７.６℃安定化していた。
０.２℃、１７.６℃安定化していた。
【００２０】以上の結果からＧ２３Ａ, Ｈ６２Ｐ, Ｖ７
４Ｌ, Ｋ９５Ｇ, Ｄ１３４Ｈ又はＤ１３４Ｎである変異
型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩにおけるアミノ酸配列の
変異を組み合わせることにより得られる変異型リボヌク
レアーゼＨＩの熱に対する安定性が向上することが確認
された。
４Ｌ, Ｋ９５Ｇ, Ｄ１３４Ｈ又はＤ１３４Ｎである変異
型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩにおけるアミノ酸配列の
変異を組み合わせることにより得られる変異型リボヌク
レアーゼＨＩの熱に対する安定性が向上することが確認
された。
【図１】 ＰＣＲ反応による５重変異導入法を示す模式
図である。部位特異的突然変異を導入するための合成オ
リゴヌクレオチドの配列中、下線は制限酵素部位を、黒
丸印は変異箇所を示す。
図である。部位特異的突然変異を導入するための合成オ
リゴヌクレオチドの配列中、下線は制限酵素部位を、黒
丸印は変異箇所を示す。
【図２】 ５Ｈ−ＲＮaseＨＩをコードする遺伝子断片
のＤＮＡ配列およびそれによってコードされるアミノ酸
配列を示す模式図。
のＤＮＡ配列およびそれによってコードされるアミノ酸
配列を示す模式図。
【図３】 ５Ｎ−ＲＮaseＨＩをコードする遺伝子断片
のＤＮＡ配列およびそれによってコードされるアミノ酸
配列を示す模式図。
のＤＮＡ配列およびそれによってコードされるアミノ酸
配列を示す模式図。
【図４】 プラスミドpＪＡＬ ５ＨおよびpＪＡＬ ５Ｎ
の制限酵素切断地図である。
の制限酵素切断地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/22 C12N 15/55 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩの
(１)第２３番目のＧly, 第６２番目のＨis, 第７４番目
のＶal, 第９５番目のＬys, 第１３４番目のＡspをそれ
ぞれＡla, Ｐro, Ｌeu, Ｇly, Ｈis に置換する変異、
(２)第２３番目のＧly, 第６２番目のＨis, 第７４番目
のＶal, 第９５番目のＬys, 第１３４番目のＡsp をそ
れぞれＡla, Ｐro, Ｌeu, Ｇly, Ａsn に置換する変異
を導入した変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ。 - 【請求項２】 請求項１に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩを暗号化している変異型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨＩ構造遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩ構造遺伝子を大腸菌の遺伝子発現系制御下
に含有している組換え体プラスミド。 - 【請求項４】 構造遺伝子が請求項１に記載の変異(１)
を導入した変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを暗号化
するものである請求項３に記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項５】 pＪＡＬ ５Ｈである請求項４に記載のプ
ラスミド。 - 【請求項６】 構造遺伝子が請求項１に記載の変異(２)
を導入した変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを暗号化
するものである請求項３に記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項７】 pＪＡＬ ５Ｎである請求項６に記載のプ
ラスミド。 - 【請求項８】 請求項３〜７のいずれかに記載の組換え
体プラスミドで形質転換された大腸菌株。 - 【請求項９】 ＨＢ１０１／pＪＡＬ ５Ｈである請求項
８に記載の大腸菌株。 - 【請求項１０】 ＨＢ１０１／pＪＡＬ ５Ｎである請求
項８に記載の大腸菌株。 - 【請求項１１】 請求項８〜１０のいずれかに記載の大
腸菌株を培養し、得られた培養液から変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨＩを回収することを特徴とする変異型大
腸菌リボヌクレアーゼＨＩの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5314750A JP2790970B2 (ja) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | ５重置換による大腸菌リボヌクレアーゼｈｉの安定化 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5314750A JP2790970B2 (ja) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | ５重置換による大腸菌リボヌクレアーゼｈｉの安定化 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163344A JPH07163344A (ja) | 1995-06-27 |
| JP2790970B2 true JP2790970B2 (ja) | 1998-08-27 |
Family
ID=18057138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5314750A Expired - Lifetime JP2790970B2 (ja) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | ５重置換による大腸菌リボヌクレアーゼｈｉの安定化 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2790970B2 (ja) |
-
1993
- 1993-12-15 JP JP5314750A patent/JP2790970B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２６７（３０）Ｐ．２１５３５−２１５４２（１９９２．１０．２５） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07163344A (ja) | 1995-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bülow | Characterization of an artificial bifunctional enzyme, β‐galactosidase/galactokinase, prepared by gene fusion | |
| JP4250716B2 (ja) | 酵素的に活性な組換えカルボキシペプチダーゼｂの製造 | |
| Pedersen-Lane et al. | High-level expression of human thymidylate synthase | |
| Cannio et al. | A few amino acid substitutions are responsible for the higher thermostability of a novel NAD+‐dependent bacillar alcohol dehydrogenase | |
| JPH0662869A (ja) | 超好熱性α−アミラーゼ遺伝子 | |
| JP4486009B2 (ja) | Ｄｎａリガーゼ変異体 | |
| Arredondo-Peter et al. | Molecular Cloning of the Cowpea Leghemoglobin II Gene and Expression of Its cDNA in Escherichia coli (Purification and Characterization of the Recombinant Protein) | |
| US5229286A (en) | Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus | |
| JP2790970B2 (ja) | ５重置換による大腸菌リボヌクレアーゼｈｉの安定化 | |
| Fusi et al. | Expression of a synthetic gene encoding P2 ribonuclease from the extreme thermoacidophilic archaebacterium Sulfolobus solfataricus in mesophylic hosts | |
| JPH08196281A (ja) | 水生成型ｎａｄｈオキシダーゼをコードするｄｎａ | |
| JP5004209B2 (ja) | 毒性を有するタンパク質の発現方法 | |
| JP4405324B2 (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法 | |
| JP2790583B2 (ja) | 変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ | |
| JP2747141B2 (ja) | 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ | |
| JP3463951B2 (ja) | 耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及びその遺伝子 | |
| JP2810002B2 (ja) | 分子内空隙を埋めることにより安定化された大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ | |
| JP2747128B2 (ja) | 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ | |
| JP3498808B2 (ja) | Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 | |
| JP3688367B2 (ja) | 変異型ｄｎａポリメラーゼ | |
| US5514587A (en) | DNA fragment encoding a hydrogen peroxide-generating NADH oxidase | |
| JPH0538286A (ja) | 変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ | |
| WO2023157936A1 (ja) | 改変型ｄ－アルロース－３－エピメラーゼ | |
| JP2902206B2 (ja) | タンパク質分子の安定化法 | |
| JPH0576358A (ja) | 変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ |