JP2810002B2 - 分子内空隙を埋めることにより安定化された大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ - Google Patents
分子内空隙を埋めることにより安定化された大腸菌リボヌクレアーゼｈｉInfo
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- JP2810002B2 JP2810002B2 JP7214457A JP21445795A JP2810002B2 JP 2810002 B2 JP2810002 B2 JP 2810002B2 JP 7214457 A JP7214457 A JP 7214457A JP 21445795 A JP21445795 A JP 21445795A JP 2810002 B2 JP2810002 B2 JP 2810002B2
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- escherichia coli
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、安定性が改良され
た変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ、該変異型大腸菌
リボヌクレアーゼＨＩをコードしている遺伝子、該遺伝
子を含有し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発
現ベクターを含有している形質転換体、および該形質転
換体を用いて変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを製造
する方法に関する。
た変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ、該変異型大腸菌
リボヌクレアーゼＨＩをコードしている遺伝子、該遺伝
子を含有し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発
現ベクターを含有している形質転換体、および該形質転
換体を用いて変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩを製造
する方法に関する。
【０００２】本発明が対象としているリボヌクレアーゼ
ＨＩは従来リボヌクレアーゼＨと認識されていた物質で
ある。最近になって、従来のリボヌクレアーゼＨとは異
なる物質であるが、それと類似の酵素活性を有する物質
の存在が判明した［板谷、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス，ＵＳＡ，８
７，８５８７−８５９１(１９９０)］。従って、従来の
リボヌクレアーゼＨとその新たに見いだされた物質とを
峻別するため、従来のリボヌクレアーゼＨはリボヌクレ
アーゼＨＩと、そして新しく見いだされた物質はリボヌ
クレアーゼＨIIと命名された。このように、本明細書に
て使用しているリボヌクレアーゼＨＩなる用語は従来の
リボヌクレアーゼＨを表すために使用される用語であ
る。
ＨＩは従来リボヌクレアーゼＨと認識されていた物質で
ある。最近になって、従来のリボヌクレアーゼＨとは異
なる物質であるが、それと類似の酵素活性を有する物質
の存在が判明した［板谷、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス，ＵＳＡ，８
７，８５８７−８５９１(１９９０)］。従って、従来の
リボヌクレアーゼＨとその新たに見いだされた物質とを
峻別するため、従来のリボヌクレアーゼＨはリボヌクレ
アーゼＨＩと、そして新しく見いだされた物質はリボヌ
クレアーゼＨIIと命名された。このように、本明細書に
て使用しているリボヌクレアーゼＨＩなる用語は従来の
リボヌクレアーゼＨを表すために使用される用語であ
る。
【０００３】大腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨＩ(本
明細書に於いては、単にリボヌクレアーゼＨＩ、または
ＲＮaseＨＩと称する場合は、天然型の大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩを意味するものとする)は１５５アミノ酸
からなる分子量約１８Ｋdの加水分解酵素であって、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエ
ンド作用で切断するという基質特異性を有する。この酵
素は、その基質特異性に基づき、下記の如き様々な用途
を有し、極めて利用価値の高い酵素として注目されてい
る。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの編集（エディッティング）。 かかる利用価値を有するリボヌクレアーゼＨＩの重要性
は遺伝子工学の発展に伴ってますます増大すると思われ
る。
明細書に於いては、単にリボヌクレアーゼＨＩ、または
ＲＮaseＨＩと称する場合は、天然型の大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩを意味するものとする)は１５５アミノ酸
からなる分子量約１８Ｋdの加水分解酵素であって、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエ
ンド作用で切断するという基質特異性を有する。この酵
素は、その基質特異性に基づき、下記の如き様々な用途
を有し、極めて利用価値の高い酵素として注目されてい
る。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの編集（エディッティング）。 かかる利用価値を有するリボヌクレアーゼＨＩの重要性
は遺伝子工学の発展に伴ってますます増大すると思われ
る。
【０００４】
【従来の技術】上記のような高い利用価値を有するリボ
ヌクレアーゼＨＩの安定性、例えば変性剤や熱に対する
耐性を高めることができれば、従来の組換えリボヌクレ
アーゼＨＩでは利用できなかった条件下での利用が可能
となる。これまでに、天然型リボヌクレアーゼＨＩより
も高い安定性を有する、ある種の変異を有する変異型リ
ボヌクレアーゼＨＩは幾つか開発されている（特開平０
３−１４７７８５、特開平０５−０３８２８６、特開平
０５−００３７８７、特開平０５−０６４５８５、特開
平０５−０７６３５９）。ごく最近になって、これらの
変異を組み合わせれば、リボヌクレアーゼＨＩの安定性
がさらに高まることが示されたので［木村ら、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６７、２
１５３５−２１５４２(１９９２)；特開平０５−０７６
３５８、特願平５−３１４７５０］、リボヌクレアーゼ
ＨＩの安定性を高める別の変異を開発することは、組み
合わせる手段の選択の幅を広げる意味から重要である。
そして、これにより、より高い安定性を有するリボヌク
レアーゼＨＩが得られる可能性も増す。
ヌクレアーゼＨＩの安定性、例えば変性剤や熱に対する
耐性を高めることができれば、従来の組換えリボヌクレ
アーゼＨＩでは利用できなかった条件下での利用が可能
となる。これまでに、天然型リボヌクレアーゼＨＩより
も高い安定性を有する、ある種の変異を有する変異型リ
ボヌクレアーゼＨＩは幾つか開発されている（特開平０
３−１４７７８５、特開平０５−０３８２８６、特開平
０５−００３７８７、特開平０５−０６４５８５、特開
平０５−０７６３５９）。ごく最近になって、これらの
変異を組み合わせれば、リボヌクレアーゼＨＩの安定性
がさらに高まることが示されたので［木村ら、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６７、２
１５３５−２１５４２(１９９２)；特開平０５−０７６
３５８、特願平５−３１４７５０］、リボヌクレアーゼ
ＨＩの安定性を高める別の変異を開発することは、組み
合わせる手段の選択の幅を広げる意味から重要である。
そして、これにより、より高い安定性を有するリボヌク
レアーゼＨＩが得られる可能性も増す。
【０００５】大腸菌リボヌクレアーゼＨＩよりも遥かに
高い安定性を有する好熱菌由来のリボヌクレアーゼＨが
知られており、この好熱菌リボヌクレアーゼＨを大腸菌
において組換え的に製造する方法が報告されている（金
谷ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２６７、１０１８４−１０１９２(１９９２)；特開
平０４−００８２９４）。しかし、大腸菌を用いて産生
された好熱菌リボヌクレアーゼＨの３７℃における酵素
活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨＩのそれよりもかなり
低いものであった（約５％）。また、大腸菌から産生さ
れる好熱菌リボヌクレアーゼＨの場合、その精製には尿
素を用いて可溶化するという操作が必要であり、大腸菌
リボヌクレアーゼＨＩの場合に較べてその製造方法が複
雑であるという欠点もあった。従って、より酵素活性、
安定性にすぐれた酵素であって、その製造および精製も
好熱菌リボヌクレアーゼＨよりも容易である変異型リボ
ヌクレアーゼＨＩを造ることができれば、産業上の利用
価値がより高くなると考えられる。
高い安定性を有する好熱菌由来のリボヌクレアーゼＨが
知られており、この好熱菌リボヌクレアーゼＨを大腸菌
において組換え的に製造する方法が報告されている（金
谷ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２６７、１０１８４−１０１９２(１９９２)；特開
平０４−００８２９４）。しかし、大腸菌を用いて産生
された好熱菌リボヌクレアーゼＨの３７℃における酵素
活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨＩのそれよりもかなり
低いものであった（約５％）。また、大腸菌から産生さ
れる好熱菌リボヌクレアーゼＨの場合、その精製には尿
素を用いて可溶化するという操作が必要であり、大腸菌
リボヌクレアーゼＨＩの場合に較べてその製造方法が複
雑であるという欠点もあった。従って、より酵素活性、
安定性にすぐれた酵素であって、その製造および精製も
好熱菌リボヌクレアーゼＨよりも容易である変異型リボ
ヌクレアーゼＨＩを造ることができれば、産業上の利用
価値がより高くなると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】大腸菌リボヌクレアー
ゼＨＩ酵素は、分子レベルでみればαI−ヘリックス、
αIII−ヘリックス、αIV−ヘリックス、βＤ−鎖及び
βＥ−鎖に囲まれた疎水性コアー部分に大きな分子内空
隙（キャビティー）を有しているが（片柳ら、Ｎature
Ｖol. ３４７，p.３０６−３０９（１９９０））、本発
明者らは、この分子内空隙に面している第７４番目のＶ
al（バリン）をＬeu（ロイシン）に置換することにより
本酵素の安定性が上昇することを見いだしている（特願
平０４−３２９４７０）。次いで、この安定性の上昇し
た変異体の立体構造をＸ線を用いて解析することによ
り、第７４番目のＶalをＬeuに置換することにより本酵
素の安定性が上昇した理由は、本酵素の疎水性コアーに
存在する分子内空隙が部分的に埋められたためであるこ
とを明らかにした（石川ら、バイオケミストリー、３
２、６１７１−６１７８（１９９３））。しかしなが
ら、分子内空隙の充填は、選択する疎水性コアー内のア
ミノ酸部位と選択する置換アミノ酸の数の組合せが数多
くあることから容易でなく、また、本酵素の酵素活性が
保持されるべき点にも配慮しなければならない。
ゼＨＩ酵素は、分子レベルでみればαI−ヘリックス、
αIII−ヘリックス、αIV−ヘリックス、βＤ−鎖及び
βＥ−鎖に囲まれた疎水性コアー部分に大きな分子内空
隙（キャビティー）を有しているが（片柳ら、Ｎature
Ｖol. ３４７，p.３０６−３０９（１９９０））、本発
明者らは、この分子内空隙に面している第７４番目のＶ
al（バリン）をＬeu（ロイシン）に置換することにより
本酵素の安定性が上昇することを見いだしている（特願
平０４−３２９４７０）。次いで、この安定性の上昇し
た変異体の立体構造をＸ線を用いて解析することによ
り、第７４番目のＶalをＬeuに置換することにより本酵
素の安定性が上昇した理由は、本酵素の疎水性コアーに
存在する分子内空隙が部分的に埋められたためであるこ
とを明らかにした（石川ら、バイオケミストリー、３
２、６１７１−６１７８（１９９３））。しかしなが
ら、分子内空隙の充填は、選択する疎水性コアー内のア
ミノ酸部位と選択する置換アミノ酸の数の組合せが数多
くあることから容易でなく、また、本酵素の酵素活性が
保持されるべき点にも配慮しなければならない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上
記の観点から、大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ酵素の酵素
活性を保持しながら、その安定性を高めることを目的と
して、種々の改変を試みた。その結果、分子内空隙を構
成する別のアミノ酸である第５２番目のＡla（アラニ
ン、Ａ）をかさ高いアミノ酸、例えばＶal（バリン、
Ｖ）、Ｌeu（ロイシン、Ｌ）、またはＩle（イソロイシ
ン、Ｉ）に置換した変異体が、天然型のリボヌクレアー
ゼＨＩよりも熱に対する安定性が高められていることを
見い出し、かつ、その酵素活性が損なわれていないこと
を確認した。更に、この変異体の７４位のＶalをＬeuに
置換することで、５２位または７４位の単変異体よりも
安定なリボヌクレアーゼＨＩを得ることができた。即
ち、本発明は大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ酵素の第５２
番目のＡlaの他のアミノ酸による置換、および第５２番
目のＡlaと第７４番目のＶalの他のアミノ酸による同時
置換、により分子内空隙を埋めることによる該酵素の安
定化法、およびかかる方法により得られる安定化された
変異型リボヌクレアーゼＨＩを提供するものである。
記の観点から、大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ酵素の酵素
活性を保持しながら、その安定性を高めることを目的と
して、種々の改変を試みた。その結果、分子内空隙を構
成する別のアミノ酸である第５２番目のＡla（アラニ
ン、Ａ）をかさ高いアミノ酸、例えばＶal（バリン、
Ｖ）、Ｌeu（ロイシン、Ｌ）、またはＩle（イソロイシ
ン、Ｉ）に置換した変異体が、天然型のリボヌクレアー
ゼＨＩよりも熱に対する安定性が高められていることを
見い出し、かつ、その酵素活性が損なわれていないこと
を確認した。更に、この変異体の７４位のＶalをＬeuに
置換することで、５２位または７４位の単変異体よりも
安定なリボヌクレアーゼＨＩを得ることができた。即
ち、本発明は大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ酵素の第５２
番目のＡlaの他のアミノ酸による置換、および第５２番
目のＡlaと第７４番目のＶalの他のアミノ酸による同時
置換、により分子内空隙を埋めることによる該酵素の安
定化法、およびかかる方法により得られる安定化された
変異型リボヌクレアーゼＨＩを提供するものである。
【０００８】さらに本発明は、上記変異型リボヌクレア
ーゼＨＩをコードする構造遺伝子、該構造遺伝子を含有
する発現ベクター、該発現ベクターを導入された形質転
換体、および該形質転換体を培養することによる、高い
安定性を有する変異型リボヌクレアーゼＨＩの製造方法
を提供するものである。大腸菌を用いての遺伝子操作法
は成書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９８２):
Ａ Ｌaboratory Ｍanual, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌab
oratory)に詳述されており、上記変異型リボヌクレアー
ゼＨＩ構造遺伝子、発現ベクター、形質転換体は、この
成書に記載の一般的手法に従って、例えば後記実施例に
示した様に常法通り作製することができる。尚、本発明
の発現ベクターは、大腸菌内で機能するものであれば特
に制限はないが、バクテリオファージλのＰLおよびＰR
プロモーターの支配下に上記変異型リボヌクレアーゼＨ
Ｉ遺伝子を含有しているものが好ましい。
ーゼＨＩをコードする構造遺伝子、該構造遺伝子を含有
する発現ベクター、該発現ベクターを導入された形質転
換体、および該形質転換体を培養することによる、高い
安定性を有する変異型リボヌクレアーゼＨＩの製造方法
を提供するものである。大腸菌を用いての遺伝子操作法
は成書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９８２):
Ａ Ｌaboratory Ｍanual, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌab
oratory)に詳述されており、上記変異型リボヌクレアー
ゼＨＩ構造遺伝子、発現ベクター、形質転換体は、この
成書に記載の一般的手法に従って、例えば後記実施例に
示した様に常法通り作製することができる。尚、本発明
の発現ベクターは、大腸菌内で機能するものであれば特
に制限はないが、バクテリオファージλのＰLおよびＰR
プロモーターの支配下に上記変異型リボヌクレアーゼＨ
Ｉ遺伝子を含有しているものが好ましい。
【０００９】
【発明の効果】本発明により安定性が高められた変異型
大腸菌リボヌクレアーゼＨＩは、従来のリボヌクレアー
ゼＨＩでは変性してしまう高い温度下でさえも変性する
ことがない（試験例１参照）ので、このような条件下で
の取扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌
リボヌクレアーゼＨＩは、耐久性等も向上していると期
待されるので、従来のリボヌクレアーゼＨＩよりも失活
しにくく、安定に保存でき、従って取り扱いが容易にな
ることは理解されよう。
大腸菌リボヌクレアーゼＨＩは、従来のリボヌクレアー
ゼＨＩでは変性してしまう高い温度下でさえも変性する
ことがない（試験例１参照）ので、このような条件下で
の取扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌
リボヌクレアーゼＨＩは、耐久性等も向上していると期
待されるので、従来のリボヌクレアーゼＨＩよりも失活
しにくく、安定に保存でき、従って取り扱いが容易にな
ることは理解されよう。
【００１０】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９
８２): Ａ Ｌaboratory Ｍanual, Ｃold Ｓping Ｈarbo
r Ｌaboratory)および試薬の仕様書に従った。
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９
８２): Ａ Ｌaboratory Ｍanual, Ｃold Ｓping Ｈarbo
r Ｌaboratory)および試薬の仕様書に従った。
【００１１】実施例１ 変異型リボヌクレアーゼＨＩ（Ａ５２Ｉ）の調製 Ａ．プラスミドpＪＡＬ５２Ｉの作製 プラスミドpＪＡＬ５２Ｉの作製の概略を図１に示す。
まず、天然型リボヌクレアーゼＨＩの大腸菌での発現プ
ラスミドpＪＡＬ６００のrnh遺伝子を鋳型とし、プライ
マーを用いてＰＣＲ法によりrnh遺伝子への点突然変異
の導入を行った。尚、出発プラスミドpＪＡＬ６００の
調製は、プラスミドpＪＡＬ１３５Ｃ（特開平０５−０
０３７８６）中の変異型rnh遺伝子部分を天然型rnh遺伝
子部分（特開平０１−２０２２８６に記載されるプラス
ミドpＤＲ６００由来）と置き換えることによって行っ
た。
まず、天然型リボヌクレアーゼＨＩの大腸菌での発現プ
ラスミドpＪＡＬ６００のrnh遺伝子を鋳型とし、プライ
マーを用いてＰＣＲ法によりrnh遺伝子への点突然変異
の導入を行った。尚、出発プラスミドpＪＡＬ６００の
調製は、プラスミドpＪＡＬ１３５Ｃ（特開平０５−０
０３７８６）中の変異型rnh遺伝子部分を天然型rnh遺伝
子部分（特開平０１−２０２２８６に記載されるプラス
ミドpＤＲ６００由来）と置き換えることによって行っ
た。
【００１２】プライマーとしては、図２に示す化学合成
したオリゴヌクレオチドを用いた。図１および図２に示
すように、まず、pＪＡＬ６００を鋳型ＤＮＡとし、Ｂg
lIIの制限酵素部位を含む５'−プライマー(１)とＳstＩ
部位を含む３'−プライマー(２)により約１５０bpのＤ
ＮＡ断片を、また、変異導入用５'−プライマー(３)と
ＳalＩ部位を含む３'−プライマー(４)により約３５０b
pのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、遺
伝子断片２種を得た。この２種の遺伝子断片を、前者の
３'末端と後者の５'末端との間で部分的にアニーリング
させる。次いで、部分的にアニーリングした断片を鋳型
ＤＮＡとし、５'−プライマー(１)と３'−プライマー
(４)により約５００bpのＤＮＡ断片をＰＣＲ反応により
増幅した。ＰＣＲ反応は市販のＧene Ａmp Ｋit(Ｔakar
a)の説明書に従って行った。得られた約５００bpの遺伝
子断片を制限酵素ＢglIIおよびＳalＩで消化した後、得
られた消化物を１.５％アガロースゲル電気泳動にか
け、約５００bpのＤＮＡ断片を得た。
したオリゴヌクレオチドを用いた。図１および図２に示
すように、まず、pＪＡＬ６００を鋳型ＤＮＡとし、Ｂg
lIIの制限酵素部位を含む５'−プライマー(１)とＳstＩ
部位を含む３'−プライマー(２)により約１５０bpのＤ
ＮＡ断片を、また、変異導入用５'−プライマー(３)と
ＳalＩ部位を含む３'−プライマー(４)により約３５０b
pのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、遺
伝子断片２種を得た。この２種の遺伝子断片を、前者の
３'末端と後者の５'末端との間で部分的にアニーリング
させる。次いで、部分的にアニーリングした断片を鋳型
ＤＮＡとし、５'−プライマー(１)と３'−プライマー
(４)により約５００bpのＤＮＡ断片をＰＣＲ反応により
増幅した。ＰＣＲ反応は市販のＧene Ａmp Ｋit(Ｔakar
a)の説明書に従って行った。得られた約５００bpの遺伝
子断片を制限酵素ＢglIIおよびＳalＩで消化した後、得
られた消化物を１.５％アガロースゲル電気泳動にか
け、約５００bpのＤＮＡ断片を得た。
【００１３】次に、このようにして得られた変異遺伝子
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニング
し、発現ベクターを作製した。プラスミドpＪＡＬ６０
０をＢglIIおよびＳalＩで消化し、約４.９kbの断片を
０.７％アガロース電気泳動により精製した後、上記約
５００bpの変異rnh遺伝子断片とライゲーションするこ
とにより環化した。ライゲーションは市販のライゲーシ
ョンキット(Ｔakara)を用い、添付の説明書に正確に従
って行った。このようにして得られたプラスミドで大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換体より変異型リ
ボヌクレアーゼＨＩ発現用プラスミドベクターpＪＡＬ
５２Ｉを得た。変異遺伝子中、目的の部位以外に変異の
導入されていないことは、変異遺伝子の全ＤＮＡ配列を
決定することにより確認した。上記のようにして得られ
た形質転換菌エシエリシア・コリ(Ｅ.coli)Ｋ１２／Ｈ
Ｂ１０１／pＪＡＬ５２Ｉは通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
６７４号、受託日：平成６年１１月２９日）。
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニング
し、発現ベクターを作製した。プラスミドpＪＡＬ６０
０をＢglIIおよびＳalＩで消化し、約４.９kbの断片を
０.７％アガロース電気泳動により精製した後、上記約
５００bpの変異rnh遺伝子断片とライゲーションするこ
とにより環化した。ライゲーションは市販のライゲーシ
ョンキット(Ｔakara)を用い、添付の説明書に正確に従
って行った。このようにして得られたプラスミドで大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換体より変異型リ
ボヌクレアーゼＨＩ発現用プラスミドベクターpＪＡＬ
５２Ｉを得た。変異遺伝子中、目的の部位以外に変異の
導入されていないことは、変異遺伝子の全ＤＮＡ配列を
決定することにより確認した。上記のようにして得られ
た形質転換菌エシエリシア・コリ(Ｅ.coli)Ｋ１２／Ｈ
Ｂ１０１／pＪＡＬ５２Ｉは通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
６７４号、受託日：平成６年１１月２９日）。
【００１４】Ｂ．変異型リボヌクレアーゼＨＩ（Ａ５２
Ｉ）の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＡＬ５２Ｉを１００m
ｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２００ml中、３０
℃で振盪培養した。培養液の濁度がクレット値で約１０
０まで生育した時点で、培養温度を４２℃に上げ、更に
３.５時間振盪を続け、次いで遠心して集菌した。この
時のクレット値は約２５０であった。
Ｉ）の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＡＬ５２Ｉを１００m
ｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２００ml中、３０
℃で振盪培養した。培養液の濁度がクレット値で約１０
０まで生育した時点で、培養温度を４２℃に上げ、更に
３.５時間振盪を続け、次いで遠心して集菌した。この
時のクレット値は約２５０であった。
【００１５】得られた菌体を１mＭ ＥＤＴＡを含む１０
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに懸濁し
た後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,
０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗
抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５lに対して４℃で一夜透析
した。透析後の粗抽出液を、同緩衝液で平衡化したＰ−
１１カラム(２ml)に通した。この条件下、変異型リボヌ
クレアーゼＨＩ(Ａ５２Ｉ)は、Ｐ−１１カラムに吸着す
る。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、ＮaＣl濃度を０.
５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ−１１カラム
から変異型リボヌクレアーゼＨＩ(Ａ５２Ｉ)を溶出させ
た。変異型リボヌクレアーゼＨＩ(Ａ５２Ｉ)を含むＰ−
１１溶出画分をまとめ、精製標品とした。精製標品は１
５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相ＨＰＬ
Ｃでも単一ピークを示した。精製収量は５２mg／l培養
液であった。精製標品の同定は、リジルエンドペプチダ
ーゼにより消化して得られるペプチドフラグメントを逆
相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメントピークの溶
出位置を確認するとともに、５２位のアミノ酸を含むペ
プチドを分取後アミノ酸配列分析により行った。
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに懸濁し
た後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,
０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗
抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５lに対して４℃で一夜透析
した。透析後の粗抽出液を、同緩衝液で平衡化したＰ−
１１カラム(２ml)に通した。この条件下、変異型リボヌ
クレアーゼＨＩ(Ａ５２Ｉ)は、Ｐ−１１カラムに吸着す
る。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、ＮaＣl濃度を０.
５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ−１１カラム
から変異型リボヌクレアーゼＨＩ(Ａ５２Ｉ)を溶出させ
た。変異型リボヌクレアーゼＨＩ(Ａ５２Ｉ)を含むＰ−
１１溶出画分をまとめ、精製標品とした。精製標品は１
５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相ＨＰＬ
Ｃでも単一ピークを示した。精製収量は５２mg／l培養
液であった。精製標品の同定は、リジルエンドペプチダ
ーゼにより消化して得られるペプチドフラグメントを逆
相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメントピークの溶
出位置を確認するとともに、５２位のアミノ酸を含むペ
プチドを分取後アミノ酸配列分析により行った。
【００１６】得られた精製標品の０.１Ｍ ＮaＣlを含む
１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.５)中における２
００〜２５０nmでのＣＤスペクトルは天然型と同一であ
り、ＣＤスペクトルで検出できるような２次構造の変化
は見られなかった。
１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.５)中における２
００〜２５０nmでのＣＤスペクトルは天然型と同一であ
り、ＣＤスペクトルで検出できるような２次構造の変化
は見られなかった。
【００１７】実施例２ 変異型リボヌクレアーゼＨＩ（Ａ５２ＬおよびＡ５２
Ｖ）の調製 実施例１に記載の操作に実質的に従い、天然型リボヌク
レアーゼＨＩの５２番目のＡlaがＬeuまたはＶalに置換
された変異型リボヌクレアーゼＨＩ、Ａ５２ＬおよびＡ
５２Ｖをそれぞれ調製した。用いた出発プラスミド、プ
ライマーは次の通りである。なお、プライマーは図２に
おける変異アミノ酸に対応する塩基のみを記す。
Ｖ）の調製 実施例１に記載の操作に実質的に従い、天然型リボヌク
レアーゼＨＩの５２番目のＡlaがＬeuまたはＶalに置換
された変異型リボヌクレアーゼＨＩ、Ａ５２ＬおよびＡ
５２Ｖをそれぞれ調製した。用いた出発プラスミド、プ
ライマーは次の通りである。なお、プライマーは図２に
おける変異アミノ酸に対応する塩基のみを記す。
【表１】 出発プラスミド プライマー Ａ５２Ｌ pＪＡＬ６００ ＣＴＧＡ５２Ｖ pＪＡＬ６００ ＧＴＴ
【００１８】実施例３ 変異型リボヌクレアーゼＨＩ（Ａ５２Ｉ／Ｖ７４Ｌ、Ａ
５２Ｌ／Ｖ７４Ｌ、Ａ５２Ｖ／Ｖ７４Ｌ）の調製 Ａ．プラスミドpＪＡＬ５２Ｉ７４Ｌ、pＪＡＬ５２Ｌ７
４Ｌ、pＪＡＬ５２Ｖ７４Ｌの作製 プラスミドpＪＡＬ５２Ｉ７４Ｌ、pＪＡＬ５２Ｌ７４
Ｌ、pＪＡＬ５２Ｖ７４Ｌの作製の概略を図３に示す。
５２Ｌ／Ｖ７４Ｌ、Ａ５２Ｖ／Ｖ７４Ｌ）の調製 Ａ．プラスミドpＪＡＬ５２Ｉ７４Ｌ、pＪＡＬ５２Ｌ７
４Ｌ、pＪＡＬ５２Ｖ７４Ｌの作製 プラスミドpＪＡＬ５２Ｉ７４Ｌ、pＪＡＬ５２Ｌ７４
Ｌ、pＪＡＬ５２Ｖ７４Ｌの作製の概略を図３に示す。
【００１９】まず、pＪＡＬ５２Ｉ、pＪＡＬ５２Ｌ、p
ＪＡＬ５２Ｖのrnh遺伝子を鋳型とし、図２で示すプラ
イマー(１)および(５)を用いてＰＣＲ法によりrnh遺伝
子の６６から６８位にＡfl IIの制限酵素部位を導入し
た。ＰＣＲ反応は市販のＧeneＡmp Ｋit（Ｔakara）の
説明書に従って行った。この増幅した約１９０bpの遺伝
子断片を制限酵素Ｂgl IIおよびＡfl IIで消化した後、
得られた消化物を１.５％アガロースゲル電気泳動にか
け、約１９０bpのＤＮＡ断片を得た。
ＪＡＬ５２Ｖのrnh遺伝子を鋳型とし、図２で示すプラ
イマー(１)および(５)を用いてＰＣＲ法によりrnh遺伝
子の６６から６８位にＡfl IIの制限酵素部位を導入し
た。ＰＣＲ反応は市販のＧeneＡmp Ｋit（Ｔakara）の
説明書に従って行った。この増幅した約１９０bpの遺伝
子断片を制限酵素Ｂgl IIおよびＡfl IIで消化した後、
得られた消化物を１.５％アガロースゲル電気泳動にか
け、約１９０bpのＤＮＡ断片を得た。
【００２０】次に、７４位のＶalがＬeuに置き換わった
変異型rnh遺伝子をもつプラスミドpＪＡＬ７４Ｌ（特開
平０６−１６９７６７）を制限酵素Ｂgl II及びＡfl II
で消化し、約５.２kbの断片を０.７％アガロース電気泳
動により精製した後、上記約１９０bpの変異rnh遺伝子
断片とライゲーションすることにより環化した。ライゲ
ーションは市販のライゲーションキット（Ｔakara）を
用い、添付の説明書に正確に従って行った。このように
して得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換し、形質転換体より変異型リボヌクレアーゼＨＩ発現
用プラスミドベクターpＪＡＬ５２Ｉ７４Ｌ、pＪＡＬ５
２Ｌ７４Ｌ、pＪＡＬ５２Ｖ７４Ｌを得た。変異遺伝子
中、目的の部位以外に変異の導入されていないことは、
変異遺伝子の全ＤＮＡ配列を決定することにより確認し
た。
変異型rnh遺伝子をもつプラスミドpＪＡＬ７４Ｌ（特開
平０６−１６９７６７）を制限酵素Ｂgl II及びＡfl II
で消化し、約５.２kbの断片を０.７％アガロース電気泳
動により精製した後、上記約１９０bpの変異rnh遺伝子
断片とライゲーションすることにより環化した。ライゲ
ーションは市販のライゲーションキット（Ｔakara）を
用い、添付の説明書に正確に従って行った。このように
して得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換し、形質転換体より変異型リボヌクレアーゼＨＩ発現
用プラスミドベクターpＪＡＬ５２Ｉ７４Ｌ、pＪＡＬ５
２Ｌ７４Ｌ、pＪＡＬ５２Ｖ７４Ｌを得た。変異遺伝子
中、目的の部位以外に変異の導入されていないことは、
変異遺伝子の全ＤＮＡ配列を決定することにより確認し
た。
【００２１】Ｂ．変異型リボヌクレアーゼＨＩ（Ａ５２
Ｉ／Ｖ７４Ｌ、Ａ５２Ｌ／Ｖ７４Ｌ、Ａ５２Ｖ／Ｖ７４
Ｌ）の大腸菌における生産と精製 実施例１に記載の操作に実質的に従い、天然型リボヌク
レアーゼＨＩの５２番目のＡlaがＩle、Ｌeu又はＶal
に、７４番目のＶalがＬeuに置換された変異型リボヌク
レアーゼＨＩ、Ａ５２Ｉ／Ｖ７４Ｌ、Ａ５２Ｌ／Ｖ７４
Ｌ、およびＡ５２Ｖ／Ｖ７４Ｌをそれぞれ調製した。
Ｉ／Ｖ７４Ｌ、Ａ５２Ｌ／Ｖ７４Ｌ、Ａ５２Ｖ／Ｖ７４
Ｌ）の大腸菌における生産と精製 実施例１に記載の操作に実質的に従い、天然型リボヌク
レアーゼＨＩの５２番目のＡlaがＩle、Ｌeu又はＶal
に、７４番目のＶalがＬeuに置換された変異型リボヌク
レアーゼＨＩ、Ａ５２Ｉ／Ｖ７４Ｌ、Ａ５２Ｌ／Ｖ７４
Ｌ、およびＡ５２Ｖ／Ｖ７４Ｌをそれぞれ調製した。
【００２２】試験例１ 変異型リボヌクレアーゼＨＩの安定性の増加 天然型リボヌクレアーゼＨＩと実施例１〜３により調製
した変異型リボヌクレアーゼＨＩの熱安定性について測
定し、比較した。測定はpＨ３.０での変性の割合を２２
０nmにおけるＣＤ値で熱変性曲線を測定することにより
行った。得られた結果を以下の表２に示す。
した変異型リボヌクレアーゼＨＩの熱安定性について測
定し、比較した。測定はpＨ３.０での変性の割合を２２
０nmにおけるＣＤ値で熱変性曲線を測定することにより
行った。得られた結果を以下の表２に示す。
【表２】 酵 素 名 Ｔm(℃) △Ｔm(℃) ＷＴ ＲＮaseＨＩ 56.4 − Ａ５２Ｉ 62.6 6.2 Ａ５２Ｌ 60.7 4.3 Ａ５２Ｖ 61.9 5.5 Ｖ７４Ｌ 60.1 3.7 Ａ５２Ｉ／Ｖ７４Ｌ 60.3 3.9 Ａ５２Ｌ／Ｖ７４Ｌ 61.3 4.9 Ａ５２Ｖ／Ｖ７４Ｌ 64.4 8.0 変異型リボヌクレアーゼＨＩの熱変性曲線は天然型の熱
変性曲線よりも高温側へシフトしており、明らかに熱安
定性が増加していた。以上の結果から、天然型大腸菌リ
ボヌクレアーゼＨＩの分子内空隙を埋めるようなアミノ
酸変異を導入することで、熱に対する安定性が向上する
ことが確認された。又、５２位と７４位の単変異体中、
最も安定化したＡ５２ＩとＶ７４Ｌを組み合わせたＡ５
２Ｉ／Ｖ７４Ｌは各変異による安定化と同等もしくは低
く、その効果を打ち消し合っていた。しかし、Ａ５２Ｖ
／Ｖ７４Ｌの場合は相加的な効果を示し、２重置換体中
最も安定化していた。更に、分子内空隙の容量変化が同
じＡ５２ＩとＡ５２Ｖ／Ｖ７４Ｌを比較すると、後者の
方が安定であることがわかる。このことから、安定化す
る分子内空隙の埋め方として、一方からのみよりも、容
量変化の小さいアミノ酸置換を組み合わせることが有効
といえる。
変性曲線よりも高温側へシフトしており、明らかに熱安
定性が増加していた。以上の結果から、天然型大腸菌リ
ボヌクレアーゼＨＩの分子内空隙を埋めるようなアミノ
酸変異を導入することで、熱に対する安定性が向上する
ことが確認された。又、５２位と７４位の単変異体中、
最も安定化したＡ５２ＩとＶ７４Ｌを組み合わせたＡ５
２Ｉ／Ｖ７４Ｌは各変異による安定化と同等もしくは低
く、その効果を打ち消し合っていた。しかし、Ａ５２Ｖ
／Ｖ７４Ｌの場合は相加的な効果を示し、２重置換体中
最も安定化していた。更に、分子内空隙の容量変化が同
じＡ５２ＩとＡ５２Ｖ／Ｖ７４Ｌを比較すると、後者の
方が安定であることがわかる。このことから、安定化す
る分子内空隙の埋め方として、一方からのみよりも、容
量変化の小さいアミノ酸置換を組み合わせることが有効
といえる。
【００２３】参考例 酵素活性の測定 実施例１〜２により調製した変異型リボヌクレアーゼＨ
Ｉの酵素活性を以下の方法により測定し、比活性を測定
し、天然型酵素に対するパーセンテージを算定した。得
られた比較結果を以下の表３に示す。活性は、[3Ｈ]−
Ｍ１３ＤＮＡ／ＲＮＡを基質として用い、３０℃、１分
間に１μmolの酸可溶性物質を遊離する酵素活性を１ユ
ニット(Ｕ)と定義した。タンパク量は変異型リボヌクレ
アーゼＨＩと天然型リボヌクレアーゼＨＩとが同じ吸光
係数を持つという仮定のもとに、
Ｉの酵素活性を以下の方法により測定し、比活性を測定
し、天然型酵素に対するパーセンテージを算定した。得
られた比較結果を以下の表３に示す。活性は、[3Ｈ]−
Ｍ１３ＤＮＡ／ＲＮＡを基質として用い、３０℃、１分
間に１μmolの酸可溶性物質を遊離する酵素活性を１ユ
ニット(Ｕ)と定義した。タンパク量は変異型リボヌクレ
アーゼＨＩと天然型リボヌクレアーゼＨＩとが同じ吸光
係数を持つという仮定のもとに、
【数１】 を用いて２８０nmにおける吸光度を測定することにより
求めた。ここで、
求めた。ここで、
【数２】 とは、蛋白質濃度が１mg／mlの水溶液の２８０nmにおけ
る吸光度を示す。
る吸光度を示す。
【表３】 天然型と変異型リボヌクレアーゼＨＩの酵素活性の比較 酵 素 名 比活性(Ｕ/mg) 対天然型％ ＷＴ ＲＮaseＨＩ 9.45 − Ａ５２Ｉ 3.61 38％ Ａ５２Ｌ 0.28 3％ Ａ５２Ｖ 5.67 60％ Ｖ７４Ｌ 9.45 100％ Ａ５２Ｉ／Ｖ７４Ｌ 0.36 3.8％ Ａ５２Ｌ／Ｖ７４Ｌ 0.23 2.4％ Ａ５２Ｖ／Ｖ７４Ｌ 1.51 16％
【図１】 プラスミドｐＪＡＬ５２Ｉの構築を示す模式
図である。
図である。
【図２】 部位特異的突然変異を導入するための合成オ
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中、下線は制
限酵素部位を、●印は変異アミノ酸に対応する塩基（Ａ
la52に対応する塩基）をそれぞれ示すものである。
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中、下線は制
限酵素部位を、●印は変異アミノ酸に対応する塩基（Ａ
la52に対応する塩基）をそれぞれ示すものである。
【図３】 プラスミドpＪＡＬ５２Ｉ７４Ｌの構築を示
す模式図である。
す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/10 C12N 1/21 C12N 15/55 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩの５
２番目のアラニンがバリンまたはイソロイシンで置換さ
れているか、あるいは５２番目のアラニンがバリンで置
換されており、かつ７４番目のバリンがロイシンで置換
されており、それによって該リボヌクレアーゼＨＩのα
I−ヘリックス、αIII−ヘリックス、αIV−ヘリック
ス、βＤ−鎖及びβＥ−鎖に囲まれた疎水性コアーに存
在する分子内空隙が、該置換アミノ酸残基の側鎖によっ
て実質的に埋められ、それにより安定性が増大されてい
る変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩ。 - 【請求項２】 請求項１に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩをコードしている変異型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨＩ構造遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨＩ構造遺伝子を大腸菌の遺伝子発現系制御下
に含有している組換えプラスミド。 - 【請求項４】 pＪＡＬ５２Ｉである請求項３に記載の
組換えプラスミド。 - 【請求項５】 請求項３または４のいずれかに記載の組
換えプラスミドで形質転換された大腸菌株。 - 【請求項６】 大腸菌Ｋ１２／ＨＢ１０１／pＪＡＬ５
２Ｉである請求項５に記載の大腸菌株。 - 【請求項７】 請求項５または６のいずれかに記載の大
腸菌株を培養し、得られた培養液から変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨＩを回収することを特徴とする請求項１
に記載の変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨＩの製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7214457A JP2810002B2 (ja) | 1994-12-08 | 1995-08-23 | 分子内空隙を埋めることにより安定化された大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30472594 | 1994-12-08 | ||
| JP6-304725 | 1994-12-08 | ||
| JP7214457A JP2810002B2 (ja) | 1994-12-08 | 1995-08-23 | 分子内空隙を埋めることにより安定化された大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08205862A JPH08205862A (ja) | 1996-08-13 |
| JP2810002B2 true JP2810002B2 (ja) | 1998-10-15 |
Family
ID=26520332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7214457A Expired - Lifetime JP2810002B2 (ja) | 1994-12-08 | 1995-08-23 | 分子内空隙を埋めることにより安定化された大腸菌リボヌクレアーゼｈｉ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2810002B2 (ja) |
-
1995
- 1995-08-23 JP JP7214457A patent/JP2810002B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２５８（２）Ｐ．１２７６−１２８１（１９８３） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08205862A (ja) | 1996-08-13 |
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