JPH0541991A - 部分グリセライドリパーゼをコードする遺伝子および部分グリセライドリパーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】部分グリセライドリパーゼをコードする遺伝子
および該遺伝子を組み込んだ形質転換体を培養すること
による部分グリセライドリパーゼの製造法を提供する。 【構成】モノグリセライド、ジグリセライドに作用し、
トリグリセライドに全く作用しない部分グリセライドリ
パーゼをコードするＤＮＡを単離精製し、該遺伝子を酵
母或いは糸状菌に導入し、該組換え体を培養することに
よって部分グリセライドリパーゼを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、モノグリセライド（以
下、ＭＧという）、ジグリセライド（以下、ＤＧとい
う）に作用し、トリグリセライドに全く作用しない新規
リパーゼ（以下、部分グリセライドリパーゼという）を
コードする遺伝子および該遺伝子を組み込んだ形質転換
体を培養することによる部分グリセライドリパーゼの製
造法に関し、該リパーゼは、ＭＧ及び／又はＤＧ（以
下、部分グリセライドという）の製造、特にＭＧの製
造、油脂の精製等の油脂工業分野で利用され、あるいは
分析用酵素として利用され、産業上特に重要である。

【０００２】

【従来の技術】部分グリセライドリパーゼに関連する酵
素としては、ラット小腸、ブタ脂肪組織など動物臓器由
来のモノグリセライドリパーゼ、ジグリセライドリパー
ゼがよく知られている。又、微生物由来のものでは、ス
タフィロコッカス属に属する菌株由来のもの、バチルス
属に属する菌株由来のもの及びペニシリウム属に属する
菌株由来のものが知られている。しかしながら、動物組
織由来の酵素はＭＧばかりではなく、ＤＧ、ＴＧにも作
用し（特開昭63−245672）、微生物由来でスタフィロコ
ッカス属由来のものは、基質特異性としてＴＧにも作用
し（特開昭55−42532）、バチルス属由来のものは、Ｍ
Ｇにのみ作用し、ＴＧ，ＤＧには作用しないものである
（特開昭63−245672）。

【０００３】一方、ペニシリウム属に属する菌株とし
て、奥村らはペニシリウム・サイクロピウム（Penicill
ium cyclopium）の一菌株が、ＭＧ、ＤＧによく作用す
る酵素を生産することを報告している〔ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー（J.Biochem.），87巻，205-21
1ページ（1980）〕。しかしながら、この酵素はＭＧ、
ＤＧのみならずＴＧにも少なからず作用すると述べられ
ている。

【０００４】さらにペニシリウム・エスピー（Penicill
ium sp.）Ｕ−150から生産する部分グリセライドリパー
ゼについてはＭＧ、ＤＧには作用するがＴＧには全く作
用しない新規な酵素を生産することが報告されている
（特開平２−174676）。しかし、現在ではこれらの部分
グリセライドリパーゼ遺伝子についての解析は全くなさ
れていないのである。また、組換え体部分グリセライド
リパーゼの製造に関する研究も従来全くなされていない
のが現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来、部分グリセライ
ドリパーゼは動物、菌類等から製造されているため、供
給量、供給費用などの点で改善すべき点が多くあった。

【０００６】本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意
研究の結果、部分グリセライドリパーゼをコードするＤ
ＮＡを精製・単離し、その塩基配列を決定することに成
功した。更に該遺伝子を組み込んだ形質転換体を得、該
形質転換体を培養することによって部分グリセライドリ
パーゼを製造する方法を完成した。

【０００７】かかる成果に基づいて部分グリセライドリ
パーゼの効率的な大量生産への途を開き、さらには、蛋
白質工学によるリパーゼの特異性の改変への途をも開い
た。

【０００８】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、部分
グリセライドリパーゼ遺伝子をコードするＤＮＡに関す
るものであり、更に該遺伝子を組み込んだ形質転換体を
培養することによる部分グリセライドリパーゼの製造方
法に関する。

【０００９】即ち、配列番号：１に示すアミノ酸配列を
コードする塩基配列を含むＤＮＡを提供するものであ
る。

【００１０】かかるＤＮＡは、遺伝コドンの縮重を考慮
すると、種々の塩基配列を包含し得るものである。

【００１１】これらの塩基配列は、遺伝子発現系の諸要
素、例えば宿主細胞の種類等に応じた優先コドン等によ
って当業者が容易に選択し得るものである。その一例を
配列番号：２に示す。

【００１２】配列番号：１に示したＤＮＡの取得方法も
化学的合成法も含めて種々のものが考えられる。例え
ば、ＰＣＲ（Polymerase ChainReaction）法により得ら
れたＤＮＡ断片をプローブとして用い、糸状菌のゲノム
ＤＮＡ等からイントロンを含む遺伝子をクローニングし
た後、イントロンを含まないｃＤＮＡを、例えばＰＣＲ
法により得ることができる。このようにして得られた部
分グリセライドリパーゼの遺伝子及びプレプロ領域を含
むＤＮＡのアミノ酸配列を配列番号：３に示す。

【００１３】上記と同様に、かかるＤＮＡは遺伝コドン
の縮重を考慮すると、種々の塩基配列を包含し得るもの
である。

【００１４】これらの塩基配列は、遺伝子発現系の諸要
素、例えば宿主細胞の種類等に応じた優先コドン等によ
って当業者が容易に選択し得るものである。その一例を
配列番号：４に示す。

【００１５】これらの遺伝子は部分グリセライドリパー
ゼを生産する微生物より以下の実施例に述べる方法によ
り単離できる。微生物としては、部分グリセライドリパ
ーゼを産生するものであればいずれでも良いが、例えば
ペニシリウム属菌が使用できる。好ましくはペニシリウ
ム・サイクロピウムＭ１、あるいはペニシリウム・エス
ピーＵ−150が挙げられ、より好ましくは、ペニシリウ
ム・エスピーＵ−150が使用できる。

【００１６】あるいは、部分グリセライドリパーゼでは
ないリパーゼをコードするＤＮＡを蛋白質工学の手法に
より改変することによって得ることもできる。

【００１７】また、ペニシリウム・エスピーＵ−150の
染色体中の部分グリセライドリパーゼ遺伝子とその上
流、下流の隣接部を明らかにした。この中には酵母や糸
状菌をはじめとする下等真核生物におけるプロモータ
ー、ターミネーターが含まれており、これによりこれら
の微生物を宿主とした、部分グリセライドリパーゼの効
率的な大量生産が可能である。

【００１８】即ち、本発明により部分グリセライドリパ
ーゼをコードする遺伝子と該遺伝子の発現を促進する機
能をコードするＤＮＡ配列を含んでなる組換え体ＤＮＡ
を有する微生物を培養することにより培養物より部分グ
リセライドリパーゼを採取することが可能となった。こ
こで、該遺伝子の発現を促進する機能をコードするＤＮ
Ａ配列は、使用する宿主微生物内で機能するものであれ
ば如何なるものでも使用できる。

【００１９】以下、実施例を参照しながら本発明を詳細
に説明するが、実施例に使用したプラスミドなどは一例
として挙げたものであり、本発明に使用できるものであ
ればこれらに限定されるものではない。

【００２０】

【実施例】

(1) 菌体の取得 ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）Ｕ−150
（FERM P-10452）を以下の培養条件で培養した。

【００２１】米糠２％及びコーンスティープリカー1.5
％よりなる培地（pH6.0）に本菌株を接種し、26℃にお
いて２日間通気攪拌培養し、菌体をろ過して得た。

【００２２】得られた湿菌体４ｇを液体窒素中で凍結
し、そのまま、液体窒素及び海砂を入れた乳鉢に移し、
乳棒で微細な粉末とした。

【００２３】(2) 染色体ＤＮＡの調製 得られた粉末（半分量）を、７mlの溶解液〔150mM EDT
A、50mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）〕（以下、ＴＥ
という）に１％ザルコシン、300g/mlプロテイナーゼＫ
を含有させた液に懸濁後、遠心分離により上清を得た。

【００２４】これに50mlのRNase A（１mg/ml）を加え、
37℃、20分処理してＲＮＡを分解した後、当量のフェノ
ール、当量のフェノール：CHCl₃（１：１）及び当量のC
HCl₃：イソアミルアルコール（24：１）でそれぞれ１回
ずつ抽出した後、エタノール沈降により得た沈殿を1.6m
lの精製水に溶解し、さらに、1.1mlの20％ポリエチレン
グリコール8000、2.5M−NaClを加え、混合後、生じた沈
殿物を遠心により集め、2mgの染色体ＤＮＡを得、ＴＥ
に溶解した。

【００２５】(3) ｍＲＮＡの調製 シグイン（Chigwin）等の方法〔バイオケミストリー（B
iochemistry）、18巻、5294頁（1979）〕に従って全Ｒ
ＮＡを得た。即ち(1)で得た粉末の半分量を20mlのＧＴ
Ｃ液（６Ｍ グアニジン、チオイソシアネイト、５mM
クエン酸ナトリウム、8.5％ ザルコシン、0.1Ｍ β−
メルカプトエタノールを含有）に懸濁し、10,000×ｇ、
15分の遠心分離により、菌体破片及び海砂を除いた。

【００２６】得られた上清を、超遠心分離用チューブ
中、5.7Ｍの塩化セシウム溶液上に重層し、33,000rpm、
25℃、18時間の条件で超遠心分離して、沈澱物を得た。
この沈澱物を水に溶解し、0.025容の１Ｎ−酢酸及び0.5
容の冷エタノールを加え、混合後に生じた沈澱物を遠心
により集め、水に溶解し、不純物を遠心により除去して
全ＲＮＡを得た（約10mg）。この内の４mgをｍＲＮＡを
選択するために、オリゴ（dT）セルロース・スパン・カ
ラムキット（ファルマシア社製）に供し、ｍＲＮＡ画分
（80μｇ）を得た。

【００２７】(4) 遺伝子ライブラリーの作成 (1)で得られた全ＤＮＡをBam HIで部分分解する。部分
分解されたＤＮＡを子牛の腸由来のアルカリフォスファ
ターゼ（ベーリンガー社製）を用いて脱リン酸し、Fric
shaufらの方法〔J. Mol. Biol.170巻、827-842頁（198
7）〕に従って、EMBL3のBamHIサイトにライゲートし
た。

【００２８】ライゲーション混合物はインビトロでパッ
ケージし、E. Coli Q 359にトランスフェクションし
た。その結果、１×10⁵のインデペンデントクローンよ
りなるライブラリーが作成できた。

【００２９】(5) 部分グリセライドリパーゼの精製 (1)の培養液（20ｌ）から菌体をろ別した後、そのろ液
を限外ろ過により濃縮した。この濃縮液（250ml）に硫
安を0.75飽和になるように添加し、生じた沈殿物を遠心
により集めた。得られた沈殿分を10mMのリン酸緩衝液
（pH6.0）（以下、ＰＢという）に溶解させ、10mMのＰ
Ｂに対して充分に透析を行った。

【００３０】この透析液を10mMのＰＢで平衡化させたDE
AE−セファロースCL-6Bカラムに負荷し、０〜500mMのNa
Clの直線濃度勾配により吸着したタンパク質を溶出させ
た。

【００３１】溶出された部分グリセライドリパーゼ画分
を集め、10mMのＰＢに対して充分に透析を行った。

【００３２】この透析液を10mMのＰＢで平衡化したハイ
ドロキシアパタイトゲルのカラムに負荷し、10〜500mM
のＰＢの直線濃度勾配により吸着したタンパク質を溶出
させた。次に部分グリセライドリパーゼ画分を集め、限
外ろ過膜により脱塩、濃縮を行った。

【００３３】次いで、上記濃縮液を、pH３〜10のキャリ
アアンホラインを用いた等電点分画クロマトグラフィー
に供し、pH4.3〜4.5の範囲に濃縮された部分グリセライ
ドリパーゼ画分を得、10mMのＰＢに対して充分透析し、
精製した部分グリセライドリパーゼ（6250単位／O
D₂₈₀、７mg含有）を得た。

【００３４】尚、部分グリセライドリパーゼ活性は下記
の方法により測定した。 ラウリン酸ビニル 1.0 ｇ ５０ｍＭ酢酸緩衝液（pH5.6） 5.0 ml 酵素液 1.0 ml ガラスビーズ（直径約５mm） 30 個

【００３５】上記を入れた三角フラスコを30℃で反復振
盪反応（１分間に140往復、振幅３cm）を行う。１時間
後、20mlのアセトン：エタノール混液（１：１）を加え
て反応を停止し、遊離したラウリン酸を、フェノールフ
タレインを指示薬として、0.1N-KOH溶液で適定する。

【００３６】上記条件下で１分間に１マイクロ当量の脂
肪酸を遊離させる酵素量を１単位とする。

【００３７】(6) 部分グリセライドリパーゼの部分ア
ミノ酸配列の決定 (5)で得られた精製した部分グリセライドリパーゼ蛋白
のＮ末端からのアミノ酸配列はエドマン法によるアミノ
酸配列自動分析装置（アプライド バイオシステムズ社
製）を用いて決定した。その結果は配列番号：７に示す
とおりであった。

【００３８】次いで、精製した部分グリセライドリパー
ゼを公知の方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J. Bio. Chem.）、245巻、3868頁（197
0）〕に従って、ピリジルエチル化した。

【００３９】ピリジルエチル化された部分グリセライド
リパーゼ（10mg/ml-50mMトリス・塩酸緩衝液−pH8.0
2.0mMのCaCl₂含有）はトリプシンを37℃、18時間反応さ
せて分解する。トリプシンの添加量は部分グリセライド
リパーゼ100に対して１を添加する。

【００４０】100℃、５分間加熱した後、分解物をバイ
ダック（Vydac）214TP5415カラムを用いて、逆相−ＨＰ
ＬＣ法により精製した。

【００４１】ペプチドは流量1.0ml／分で60分間、0.1％
トリフルオロ酢酸中で０〜60％のアセトニトリルの直線
勾配により溶出した。

【００４２】約47分のリテンション時間に溶出する一つ
のペプチド（以下、ペプチドＡという）を分離し、上記
の方法に従って、Ｎ末端からのアミノ酸配列を決定し
た。その結果は配列番号：８に示すとおりであった。

【００４３】(7) ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の合成 部分グリセライドリパーゼを含む特定のＤＮＡ領域を、
最近開発されてきたＰＣＲ（Polymerase Chain Reactio
n）法によって、単離増幅した〔Saiki, R. F.et al.,サ
イエンス（Science）、230巻、1350−1354頁（198
5）〕、Mullia, K.B. 及びFaloona,F. A.,メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods inEnzymology）、155
巻、335−350頁（1987）〕。

【００４４】a) ＰＣＲ法に用いたプライマーＤＮＡの
合成 (6)で決定された部分グリセライドリパーゼ蛋白のＮ末
端部位のアミノ酸配列の９番目のグルタミンから16番目
のチロシンに対応する塩基配列を予想し、ＤＮＡを合成
した。このＤＮＡをＰＣＲのセンスプライマーとした。
センスプライマーの配列を以下に示す。

【００４５】

【００４６】同様にして、(6)で決定されたペプチドＡ
のＮ末端からのアミノ酸配列の27番目のトリプトファン
から32番目のアラニンに対応する塩基配列を予想し、同
様にＤＮＡを合成した。このＤＮＡをＰＣＲのアンチセ
ンスプライマーとした。アンチセンスプライマーの配列
を以下に示す。

【００４７】

【００４８】合成したＤＮＡはそれぞれ80μＭの濃度に
なるようにＴＥ（10mMトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．
０、１ｍＭ−ＥＤＴＡ含有）に溶解した。

【００４９】b) ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅 反応は、Gene Amp^TM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のＤＮＡ Thermal Cycler（ＤＮＡ増
幅装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りで
ある。

【００５０】 （終濃度） H₂O 55.5 μｌ [10×]Reaction buffer 10 μｌ ［１×］ dNTPs, Mix 1.25 mM 16 μｌ 200 μＭ センスプライマー ５ μｌ ４ μＭ アンチセンスプライマー ５ μｌ ４ μＭ ＊template(DNA 0.2μg) 10 μｌ AmpliTagTMDNAポリメラーゼ 0.5 μｌ 2.5ｕ／TEST 100 μｌ ＊(2)で得たＤＮＡを0.2μg／10μｌになるようにＴＥでとかしたもの。

【００５１】上記の反応液100μｌを混合し、ミネラル
オイル（Sigma社製）100μｌを加えた。次に反応液の入
ったチューブをＤＮＡ Thermal Cyclerにセットし、以
下の条件で反応を行った。

【００５２】 95℃ １ 分 37℃ ２ 分 72℃ ３ 分

【００５３】この条件下で反応を50サイクル行った後、
更に72℃で７分間インキュベートした。

【００５４】c) 増幅されたＤＮＡの回収 反応後、ミネラルオイルを除き、100μｌのクロロホル
ムを加え、混合し、15,000回転／分、２分間の遠心分離
（トミー精工社製）を行い、上清を100μｌ回収した。
このうち10μｌを用い、1.5％アガロース電気泳動で回
収されたＤＮＡのサイズと量を確認した。その結果約90
0bpのＤＮＡ断片が約２μｇ増幅されていることが判っ
た。

【００５５】残りの90μｌを1.5％低融点アガロース電
気泳動にかけ、約900bpに相当するバンドを切り出し、6
5℃で溶かした後、等量のフェノールを加え混合し、遠
心後、水層部分をさらにフェノール／クロロホルム及び
クロロホルムで順次処理した後、水層に３Ｍ酢酸ナトリ
ウムを８％になるように加え、エタノールを２倍量加
え、−80℃で15分間置いた。次に15,000回転／分、10分
間、４℃の遠心後、沈澱を20μｌの精製水に溶かした。
この操作で約１μｇのＤＮＡ断片が回収された。

【００５６】このＤＮＡ断片にT4ＤＮＡポリメラーゼを
作用させて、両末端を平滑化し、pUC19のSmaIサイトに
サブクローニングし、プラスミドpLGG26を得た。このプ
ラスミドを２本鎖のままポリエチレングリコールにより
精製し、アルカリで変性させた後、シーケナーゼシステ
ム（ＵＳＢ社製）を用いて、デオキシヌクレオチドチェ
ーンターミネーション法により5'-及び3'-部位のヌクレ
オチド配列を決定した。

【００５７】その結果、５’−及び３’−部位のヌクレ
オチド配列は部分グリセライドリパーゼのＮ末端の９位
〜34位のアミノ酸配列及びペプチドＡの１位〜33位のア
ミノ酸配列とそれぞれ完全に一致した。

【００５８】このフラグメントは全長のゲノムＤＮＡク
ローンを分離するための遺伝子ライブラリーのスクリー
ニングにおいてプローブとして使用する。

【００５９】(8) 部分グリセライドリパーゼ遺伝子を
含有するファージの分離 ペニシリウム・エスピーＵ−150からの1.0×10⁵のイン
デペンデントファージからなる遺伝子ライブラリーは
(7)で得られた0.9kbのＰＣＲによる生産物をマルチプラ
イムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム社製）を用
いて[α-³²P]dCTPでラベルし、プローブとしてスクリー
ニングした。

【００６０】プラークを、ナイロン膜Hybond N⁺（アマ
シャム社製）にリフティングし、アルカリ固定した。こ
のフィルターとこのラベルした0.9kbのＤＮＡ断片をハ
イブリダイズさせた。

【００６１】その結果、250個のプラークがプローブに
ハイブリダイズした。

【００６２】それらのプラークからランダムに選び、分
離した19個の組替え体ファージを制限酵素地図とサザン
ブロッティングによって分析した。

【００６３】これらのファージにはすべてに共通して、
0.9kbのＰＣＲ生成物と強くハイブリダイズする16kb B
amHI、2.5kb EcoRI及び2.0kb HindIIIの各フラグメン
トを有していた。その制限酵素地図を図１に示す。

【００６４】(9) リパーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断
片の塩基配列の決定 この16kb BamHI断片中の2.0kb HindIII断片をpUC19に
サブクローニングし、2.0kb HindIII断片が互いに逆方
向に挿入されたプラスミドpLGG100およびpLGG300を作成
した。

【００６５】この両プラスミドをエキソヌクレアーゼII
I、なた豆のヌクレアーゼを用いていくつかの欠失プラ
スミドを作成した。

【００６６】これらのプラスミドについて、(7)に記載
の方法で塩基配列（配列番号：５）を決定した。

【００６７】配列番号：５は、部分グリセライドリパー
ゼ遺伝子をコードする部位の1026個のヌクレオチドから
なる2.0kbのHindIII断片のヌクレオチド配列を含み、上
流部位として548塩基、下流部位として464塩基のヌクレ
オチドを示す。

【００６８】精製した部分グリセライドリパーゼのＮ末
端から決定した34個のアミノ酸配列とペプチドＡの36個
のアミノ酸配列は完全に含まれていた。

【００６９】アミノ酸配列によって決定された部分グリ
セライドリパーゼのＮ末端の上流には26個のアミノ酸配
列が存在している。これは、部分グリセライドリパーゼ
の分泌に必要なシグナル配列若しくはプレプロ領域と考
えられる。

【００７０】尚、この上流部位には、TATAAおよびCAAT
なる塩基配列を有しており、糸状菌をはじめとする下等
真核生物におけるプロモーターが含まれている。

【００７１】また、下流部位にはAATAAあるいはAATAAA
なる塩基配列を有しており、同じく糸状菌をはじめとす
る下等真核生物におけるターミネーターが含まれてい
る。

【００７２】従って、これらの上流下流配列を糸状菌を
はじめとする下等真核生物におけるプロモーター、ター
ミネーターとして使用可能である。

【００７３】(10) 部分グリセライドリパーゼ遺伝子を
含有するｃＤＮＡ断片の取得及び塩基配列の決定 (3)で得られたＲＮＡ（１μｇ）を下記の組成液20μｌ
中で逆転写する。

【００７４】 50mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.3） 3mM 塩化マグネシウム 75mM 塩化カリウム 10mM ジチオスレイトール 20mM ｄＮＴＰ混液 80pmole （dT）１５プライマー 2.5μｌ ＲＮａｓｉｎ 200単位 RNaseH^- 逆転写酵素 （商品名：Superscript、ＢＲＬ社製）

【００７５】37℃で60分間反応した後、氷上で冷却し
た。このようにして得られた反応液の５μｌを(7)で述
べたＰＣＲ法により増幅した。尚、センスプライマーと
して、

【００７６】5'-CAGCTTCAGC CATTGACCTC AAGCCA-3'

【００７７】アンチセンスプライマーとして、

【００７８】5'-CTGCTATTAT AGAGTCTATC AAACG-3'

【００７９】の各オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機を
使用して合成した。尚、プライマーの使用濃度は１μＭ
とした。

【００８０】ＰＣＲの結果、約１kbのＤＮＡ断片が得ら
れ、この断片をpUC19のSmaIサイトにサブクローニング
してpLGC8を得た。このｃＤＮＡの塩基配列を(7)と同様
にして塩基配列を決定した。その配列を配列番号：６に
示す。

【００８１】(11) 組み換えプラスミドpLGY81およびpL
GY82の構築 (9)で得たプラスミドpLGG300を制限酵素NcoIで分解し、
直鎖状にしたのち、制限酵素XhoIで部分分解し、部分グ
リセライドリパーゼのプロモーターとターミネーターを
含み、２ヶ所のイントロンを含むＤＮＡ断片を欠失した
約４kbのＤＮＡ断片を得た。

【００８２】該ＤＮＡ１μｇと、(10)で得た部分グリセ
ライドリパーゼのｃＤＮＡ断片を含むプラスミドpLGC8
を、NcoIおよびXhoIにより分解して得た約630bのＤＮＡ
断片１μｇをライゲーションし、プラスミドpLGR80を得
た。本プラスミド中には、部分グリセライドリパーゼ遺
伝子のプロモーターとターミネーターの間に、本酵素の
ｃＤＮＡが挿入された約1.9kbのＤＮＡ断片を含む。

【００８３】このpLGR80由来の約1.9kbのHindIII断片の
両末端を平滑化して得たＤＮＡ１μｇと、酵母内で複製
可能なプラスミドベクターYEp13（ATCC 37115）を、制
限酵素BamHIで切断し、両末端を平滑化して得たＤＮＡ
１μｇをライゲーションし、組換えプラスミドpLGY81お
よびpLGY82を得た。pLGY81およびpLGR82は、約1.9kbのH
indIII断片を互いに逆方向に保持している。

【００８４】(12) 組換えプラスミドpLGY81およびpLGY
82による酵母の形質転換 組換えプラスミドpLGY81およびpLGY82ＤＮＡを用い、サ
ッカロマイセス・セレビシエSHY2株（ATCC 44770）を、
伊藤らの方法〔ジャーナル オブ バクテリオロジー
（J. Bacteriol.），153巻、163-168頁（1983）〕によ
り形質転換し、形質転換株サッカロマイセス・セレビシ
エSHY2（pLGY81）およびサッカロマイセス・セレビシエ
SHY2（pLGY82）を得た。

【００８５】(13) 形質転換酵母による部分グリセライ
ドリパーゼの生産 組み換えプラスミドpLGY81またはpLGY82を有するサッカ
ロマイセス・セレビシエSHY2（pLGY81）またはサッカロ
マイセス・セレビシエSHY2（pLGY82）を20mg/mlのウラ
シル、20mg/mlのトリプトファン、20mg/mlのヒスチジン
を含む最小培地〔２％ グルコース、0.67％ Yeast Ni
trogen Base w/o amino acid（Difco）〕50mlに接種
し、温度30℃で24時間振とう培養した。

【００８６】得られた培養液１mlを、YPGal培地（２％
ガラクトース、２％ ポリペプトン、１％ 酵母エキ
ス）50mlに接種し、温度30℃で72時間振とう培養し、得
られた培養物を卓上遠心分離機を用いて、3500rpm、５
分間遠心分離を行った。

【００８７】得られた培養上清液について、(5)に記載
の方法で部分グリセライドリパーゼ活性を測定したとこ
ろ、部分グリセライドリパーゼ活性は、プラスミドpLGY
81を有する形質転換体の場合、プラスミドpLGY82を有す
る形質転換体の場合のいずれも4.2U/mlであった。対照
としてプラスミドベクターYEp13 DNAを有するサッカロ
マイセス・セレビシエSHY2株を用い、上記と同様にして
培養し、部分グリセライドリパーゼ活性の測定を行った
ところ、活性は存在しなかった。

【００８８】(14) 組換えプラスミドpLGG300によるア
スペルギルス・オリゼの形質転換 (9)で得た組換えプラスミドpLGG300を、アスペルギルス
・オルゼのniaD遺伝子を有するプラスミドpSTA14と、ア
スペルギルス・オリゼA01.1株（共にDr. Kinghornより
入手）を、Unklesらの方法〔モレキュラー アンド ジ
ェネラル ジェネチィクス（Mol. Gen. Genet.、218
巻、99-104頁（1989）〕に準じてco-transformationに
より形質転換し、得られた形質転換体の中で、１％のモ
ノオレインを含むプレート上で、大きなハローを形成し
た形質転換体を選択した。

【００８９】選択した形質転換体について、単胞子分離
を２回繰り返し、部分グリセライドリパーゼ生産形質転
換株として保存した。

【００９０】(15) 組換えプラスミドpLGR80によるアス
ベルギルス・オリゼの形質転換 (11)で得た組換えプラスミドpLGR80を用いて、(14)と同
様にしてco-transformationにより、アスペルギルス・
オリゼA01.1株を形質転換した。得られた形質転換体の
中から(14)と同様にして、部分グリセライドリパーゼ生
産形質転換株を選択し保存した。

【００９１】(16) アスペルギルス・オリゼー形質転換
株による部分グリセライドリパーゼの生産 (14)、(15)で得られた部分グリセライドリパーゼ生産形
質転換株の胞子を、それぞれ100mlの大豆油培地（２％
大豆油、0.5％ 酵母エキス、0.3％ NaNO₃、0.1％
K₂HPO₄、0.05％ KCl、0.05％ MgSO₄・7H₂O、0.001％
FeSO₄・12H₂O）に接種し、30℃で48時間振とう培養し、
得られた培養物をろ過し菌体を除去した。

【００９２】得られた培養液について、(5)に記載の方
法で部分グリセライドリパーゼ活性を測定したところ、
部分グリセライドリパーゼ活性はpLGG300による形質転
換株の場合342U/ml、pLGR80による形質転換株の場合637
U/mlであった。選択マーカーを有するプラスミドpSTA14
のみによる形質転換株を用い、上記と同様にして培養及
び部分グリセライドリパーゼ活性の測定を行ったとこ
ろ、活性は存在しなかった。

【００９３】

【発明の効果】本発明により、部分グリセライドリパー
ゼをコードする遺伝子が提供され、該遺伝子を組み込ん
だ形質転換体を培養することに部分グリセライドリパー
ゼを製造することができる。このようにして製造された
部分グリセライドリパーゼは、部分グリセライドの製
造、特にＭＧの製造、油脂の精製等の油脂工業分野で利
用でき、あるいは分析用酵素として利用され、産業上に
大きく貢献できる。

【００９４】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２７９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 Asp Val Ser Thr Ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp Val Gln 15 Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Gln Val 30 Gly Asp Lys Leu Ser Cys Ser Lys Gly Asn Cys Pro Glu Val Glu 45 Ala Thr Gly Ala Thr Val Ser Tyr Asp Phe Ser Asp Ser Thr Ile 60 Thr Asp Thr Ala Gly Tyr Ile Ala Val Asp His Thr Asn Ser Ala 75 Val Val Leu Ala Phe Arg Gly Ser Tyr Ser Val Arg Asn Trp Val 90 Ala Asp Ala Thr Phe Val His Thr Asn Pro Gly Leu Cys Asp Gly 105 Cys Leu Ala Glu Leu Gly Phe Trp Ser Ser Trp Lys Leu Val Arg 120 Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys Glu Val Val Ala Gln Asn Pro 135 Asn Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His Ser Leu Gly Ala Ala Val 150 Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arg Gly Lys Gly Tyr Pro Ser 165 Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val Gly Asn Ala Ala 180 Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe Arg Phe Thr 195 His Thr Asn Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser Met Gly 210 Tyr Val His Val Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn Asn 225 Ala Thr Val Ser Thr Ser Asp Ile Lys Val Ile Asp Gly Asp Val 240 Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp 255 Phe Glu Ala His Ile Trp Tyr Phe Val Gln Val Asp Ala Gly Lys 270 Gly Pro Gly Leu Pro Phe Lys Arg Val 279

【００９５】配列番号：２ 配列の長さ：８３７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列 GATGTTTCGA CCAGCGAACT GGACCAATTC GAATTCTGGG TCCAATATGC CGCCGCGTCA 60 TACTATGAAG CGGACTACAC AGCTCAAGTG GGCGACAAGC TCAGTTGTTC GAAGGGCAAC 120 TGCCCCGAAG TAGAGGCAAC TGGTGCGACT GTATCATATG ACTTCTCCGA CTCCACTATC 180 ACAGATACTG CCGGCTACAT TGCAGTCGAT CACACCAACT CAGCAGTTGT TCTTGCCTTC 240 CGCGGGTCCT ACTCTGTGCG CAACTGGGTC GCTGATGCCA CATTCGTCCA CACAAACCCT 300 GGTCTCTGTG ATGGTTGCCT CGCTGAACTC GGCTTCTGGA GCTCCTGGAA GCTCGTCCGT 360 GACGACATCA TCAAAGAACT CAAGGAAGTC GTCGCACAGA ACCCCAACTA CGAGCTGGTC 420 GTAGTGGGCC ACAGCCTGGG TGCTGCCGTC GCAACCCTTG CTGCCACCGA CCTCCGTGGC 480 AAGGGCTACC CATCGGCTAA GCTGTACGCG TACGCCTCTC CTCGCGTGGG TAACGCGGCT 540 TTGGCCAAGT ATATCACGGC TCAGGGCAAC AACTTCCGCT TCACCCACAC CAATGACCCC 600 GTCCCCAAGC TGCCCTTGTT GTCCATGGGT TATGTTCACG TTAGCCCTGA GTACTGGATC 660 ACCTCGCCTA ACAATGCCAC TGTTAGCACT TCTGATATCA AGGTTATTGA CGGAGATGTC 720 TCCTTTGATG GAAACACCGG AACTGGCCTG CCGTTGCTGA CGGACTTTGA GGCGCACATC 780 TGGTACTTTG TGCAGGTTGA TGCTGGCAAG GGCCCTGGGC TGCCATTCAA GAGGGTT 837

【００９６】配列番号：３ 配列の長さ：３０５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 Met Arg Leu Ser Phe Phe Thr Ala Leu Ser Ala Val Ala Ser Leu 15 Gly Tyr Ala Leu Pro Gly Lys Leu Gln Ser Arg Asp Val Ser Thr 30 Ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp Val Gln Tyr Ala Ala Ala 45 Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Gln Val Gly Asp Lys Leu 60 Ser Cys Ser Lys Gly Asn Cys Pro Glu Val Glu Ala Thr Gly Ala 75 Thr Val Ser Tyr Asp Phe Ser Asp Ser Thr Ile Thr Asp Thr Ala 90 Gly Tyr Ile Ala Val Asp His Thr Asn Ser Ala Val Val Leu Ala 105 Phe Arg Gly Ser Tyr Ser Val Arg Asn Trp Val Ala Asp Ala Thr 120 Phe Val His Thr Asn Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Leu Ala Glu 135 Leu Gly Phe Trp Ser Ser Trp Lys Leu Val Arg Asp Asp Ile Ile 150 Lys Glu Leu Lys Glu Val Val Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu 165 Val Val Val Gly His Ser Leu Gly Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala 180 Ala Thr Asp Leu Arg Gly Lys Gly Tyr Pro Ser Ala Lys Leu Tyr 195 Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr 210 Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe Arg Phe Thr His Thr Asn Asp 225 Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser Met Gly Tyr Val His Val 240 Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn Asn Ala Thr Val Ser 255 Thr Ser Asp Ile Lys Val Ile Asp Gly Asp Val Ser Phe Asp Gly 270 Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe Glu Ala His 285 Ile Trp Tyr Phe Val Gln Val Asp Ala Gly Lys Gly Pro Gly Leu 300 Pro Phe Lys Arg Val 305

【００９７】配列番号：４ 配列の長さ：９１５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列 ATGCGTCTCT CTTTCTTCAC AGCTCTATCC GCAGTGGCTT CGTTGGGCTA TGCCCTCCCC 60 GGCAAGCTGC AGTCTCGAGA TGTTTCGACC AGCGAACTGG ACCAATTCGA ATTCTGGGTC 120 CAATATGCCG CCGCGTCATA CTATGAAGCG GACTACACAG CTCAAGTGGG CGACAAGCTC 180 AGTTGTTCGA AGGGCAACTG CCCCGAAGTA GAGGCAACTG GTGCGACTGT ATCATATGAC 240 TTCTCCGACT CCACTATCAC AGATACTGCC GGCTACATTG CAGTCGATCA CACCAACTCA 300 GCAGTTGTTC TTGCCTTCCG CGGGTCCTAC TCTGTGCGCA ACTGGGTCGC TGATGCCACA 360 TTCGTCCACA CAAACCCTGG TCTCTGTGAT GGTTGCCTCG CTGAACTCGG CTTCTGGAGC 420 TCCTGGAAGC TCGTCCGTGA CGACATCATC AAAGAACTCA AGGAAGTCGT CGCACAGAAC 480 CCCAACTACG AGCTGGTCGT AGTGGGCCAC AGCCTGGGTG CTGCCGTCGC AACCCTTGCT 540 GCCACCGACC TCCGTGGCAA GGGCTACCCA TCGGCTAAGC TGTACGCGTA CGCCTCTCCT 600 CGCGTGGGTA ACGCGGCTTT GGCCAAGTAT ATCACGGCTC AGGGCAACAA CTTCCGCTTC 660 ACCCACACCA ATGACCCCGT CCCCAAGCTG CCCTTGTTGT CCATGGGTTA TGTTCACGTT 720 AGCCCTGAGT ACTGGATCAC CTCGCCTAAC AATGCCACTG TTAGCACTTC TGATATCAAG 780 GTTATTGACG GAGATGTCTC CTTTGATGGA AACACCGGAA CTGGCCTGCC GTTGCTGACG 840 GACTTTGAGG CGCACATCTG GTACTTTGTG CAGGTTGATG CTGGCAAGGG CCCTGGGCTG 900 CCATTCAAGA GGGTT 915

【００９８】配列番号：５ 配列の長さ：２０３８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CCGGGAGTAA ATTTTCATGT GATCGGGACA ACCTTGGAAA CCACATGGTG ATTACCAATA 60 TACGCCAGCC ACCATATCAT ATTCTCACGG CGTACTCCGT ACAATAAACT CCGTACTCGG 120 AGTCCACGCG ACCTCGGGTG CCGATATTGG CTAACTTCCA GGGTTCCCGG GCTGACCGAA 180 ATGAGACAAT AGCCCGGCTC CACCAATGCC CCGCGATTGA TAGCCAAGGC GATTGGAGAC 240 TTTTTCGTTT TTCGGTACCA CATCCCCGGA TGTGATCTAT ACCTTGACGA TGTTTATATG 300 AATCCGGAGT ATTCCCCGTG GGCTGAAGTG GGTCGATATC CCTCATCACA AGCAATATCG 360 GATTTTATTC TATGCCGTGG TTCCCCCGAC ACAAAAATGA GCTGGCGCAA TTGTGGAACT 420 AATCCAGGAA CCATACTTCG TACCTGAATG GAACTGTGAG GTGCAATTGA CCATATAAAG 480 CCGGGGGAAA CCCCCAGCTT TTGATTTCTC CAGTCTCCAT CAGCTTCAGC CATTGACCTC 540 AAGCCATCAT GCGTCTCTCT TTCTTCACAG CTCTATCCGC AGTGGCTTCG TTGGGCTATG 600 CCCTCCCCGG CAAGCTGCAG TCTCGAGGTA CATCCTACAA CCTTGCCCAG TGTAACCTGA 660 CCACATTACT GACACATGGT TAGATGTTTC GACCAGCGAA CTGGACCAAT TCGAATTCTG 720 GGTCCAATAT GCCGCCGCGT CATACTATGA AGCGGACTAC ACAGCTCAAG TGGGCGACAA 780 GCTCAGTTGT TCGAAGGGCA ACTGCCCCGA AGTAGAGGCA ACTGGTGCGA CTGTATCATA 840 TGACTTCTCC GAGTAAGTGA ATCCCACCGT GAAATAACCC AGACGATATA CTTACCCACG 900 CATAGCTCCA CTATCACAGA TACTGCCGGC TACATTGCAG TCGATCACAC CAACTCAGCA 960 GTTGTTCTTG CCTTCCGCGG GTCCTACTCT GTGCGCAACT GGGTCGCTGA TGCCACATTC 1020 GTCCACACAA ACCCTGGTCT CTGTGATGGT TGCCTCGCTG AACTCGGCTT CTGGAGCTCC 1080 TGGAAGCTCG TCCGTGACGA CATCATCAAA GAACTCAAGG AAGTCGTCGC ACAGAACCCC 1140 AACTACGAGC TGGTCGTAGT GGGCCACAGC CTGGGTGCTG CCGTCGCAAC CCTTGCTGCC 1200 ACCGACCTCC GTGGCAAGGG CTACCCATCG GCTAAGCTGT ACGCGTACGC CTCTCCTCGC 1260 GTGGGTAACG CGGCTTTGGC CAAGTATATC ACGGCTCAGG GCAACAACTT CCGCTTCACC 1320 CACACCAATG ACCCCGTCCC CAAGCTGCCC TTGTTGTCCA TGGGTTATGT TCACGTTAGC 1380 CCTGAGTACT GGATCACCTC GCCTAACAAT GCCACTGTTA GCACTTCTGA TATCAAGGTT 1440 ATTGACGGAG ATGTCTCCTT TGATGGAAAC ACCGGAACTG GCCTGCCGTT GCTGACGGAC 1500 TTTGAGGCGC ACATCTGGTA CTTTGTGCAG GTTGATGCTG GCAAGGGCCC TGGGCTGCCA 1560 TTCAAGAGGG TTTAAAATTT AGATCAAGCC CCCTCGATTT TCGTTTGATA GACTCTATAA 1620 TAGCTGAGCC GACGTTGATA TGTATAAAGA ATAATGACAC ATGCAGTTTC CGAATATGCA 1680 GAGGCAAGAT AGAAAGTAGA AATATACCGT AAGTCGATGC AAGGGGTTGG AAGAAAAAGT 1740 ACCAAGATTG CCCATATTAT CCTTCAATTC CCAATCTTGC ACTAATAAAG TTGGCTGATA 1800 AGCAATTCGG TCATTTCCGG CTCTCAGGAG ACATCCAGTC GGAGATCCGT CGGGGTTAGA 1860 CCGAAAAGAT CAAGTTGGGC GATCTTAGTA GTTTTTGGCC TTCTCGTTTG ATTCTAGCAA 1920 TATAAAGTGG ATATGGGGAG CCGGGCGGGG TTATCTGGAA TGAACGGTAT AAAGATATGA 1980 CTTGAACCTC GAGTTGAATT GGGGATCTCA ATTCAAAATG GTGCTGTATA CTAAGCTT 2038

【００９９】配列番号：６ 配列の長さ：９９７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列 CAGCTTCAGC CATTGACCTC AAGCCATCAT GCGTCTCTCT TTCTTCACAG CTCTATCCGC 60 AGTGGCTTCG TTGGGCTATG CCCTCCCCGG CAAGCTGCAG TCTCGAGATG TTTCGACCAG 120 CGAACTGGAC CAATTCGAAT TCTGGGTCCA ATATGCCGCC GCGTCATACT ATGAAGCGGA 180 CTACACAGCT CAAGTGGGCG ACAAGCTCAG TTGTTCGAAG GGCAACTGCC CCGAAGTAGA 240 GGCAACTGGT GCGACTGTAT CATATGACTT CTCCGACTCC ACTATCACAG ATACTGCCGG 300 CTACATTGCA GTCGATCACA CCAACTCAGC AGTTGTTCTT GCCTTCCGCG GGTCCTACTC 360 TGTGCGCAAC TGGGTCGCTG ATGCCACATT CGTCCACACA AACCCTGGTC TCTGTGATGG 420 TTGCCTCGCT GAACTCGGCT TCTGGAGCTC CTGGAAGCTC GTCCGTGACG ACATCATCAA 480 AGAACTCAAG GAAGTCGTCG CACAGAACCC CAACTACGAG CTGGTCGTAG TGGGCCACAG 540 CCTGGGTGCT GCCGTCGCAA CCCTTGCTGC CACCGACCTC CGTGGCAAGG GCTACCCATC 600 GGCTAAGCTG TACGCGTACG CCTCTCCTCG CGTGGGTAAC GCGGCTTTGG CCAAGTATAT 660 CACGGCTCAG GGCAACAACT TCCGCTTCAC CCACACCAAT GACCCCGTCC CCAAGCTGCC 720 CTTGTTGTCC ATGGGTTATG TTCACGTTAG CCCTGAGTAC TGGATCACCT CGCCTAACAA 780 TGCCACTGTT AGCACTTCTG ATATCAAGGT TATTGACGGA GATGTCTCCT TTGATGGAAA 840 CACCGGAACT GGCCTGCCGT TGCTGACGGA CTTTGAGGCG CACATCTGGT ACTTTGTGCA 900 GGTTGATGCT GGCAAGGGCC CTGGGCTGCC ATTCAAGAGG GTTTAAAATT TAGATCAAGC 960 CCCCTCGATT TTCGTTTGAT AGACTCTATA ATAGCTG 997

【０１００】配列番号：７ 配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：フラグメント 配列 Asp Val Ser Thr Ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp Val Gln 15 Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Gln Val 30 Gly Asp Lys Leu 34 配列番号：８ 配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：フラグメント 配列 Val Ile Asp Gly Asp Val Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly 15 Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe Glu Ala His Ile Trp Tyr Phe Val 30 Gln Val Asp Ala Gly Lys 36

【図面の簡単な説明】

【図１】部分グリセライドリパーゼ遺伝子を含有する組
換え体ファージの制限酵素地図を示す。

【図２】組換えプラスミドpLGG300を示す。

【図３】組換えプラスミドpLGC8を示す。

【図４】組換えプラスミドpLGR80を示す。

【図５】組換えプラスミドpLGY81を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:69）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１に示すアミノ酸配列をコード
   する塩基配列を含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】配列番号：２に示す塩基配列を有する請求
   項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】配列番号：３に示すアミノ酸配列をコード
   する塩基配列を含むＤＮＡ。
4. 【請求項４】配列番号：４に示す塩基配列を有する請求
   項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】部分グリセライドリパーゼをコードする遺
   伝子と、該遺伝子の発現を促進する機能をコードするＤ
   ＮＡ配列を含んでなる組換え体ＤＮＡを有する微生物を
   培養し、培養物より部分グリセライドリパーゼを採取す
   ることを特徴とする部分グリセライドリパーゼの製造
   法。
6. 【請求項６】微生物がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａ
   ｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である請求項５記載
   の部分グリセライドリパーゼの製造法。
7. 【請求項７】微生物がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ
   ｌｌｕｓ）属に属する微生物である請求項５記載の部分
   グリセライドリパーゼの製造法。
8. 【請求項８】遺伝子発現を促進する機能をコードするＤ
   ＮＡ配列が、配列番号：５の塩基配列において、１番目
   から５４８番目までの塩基配列および／または１５７３
   番目から２０３８番目までの塩基配列である、請求項
   ５、請求項６或いは請求項７記載の製造法。