JP3181660B2 - ビリルビンオキシダーゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビリルビンオキシダー
ゼ（以下、BOという）をコードする遺伝子および該遺伝
子を組み込んだ組換えDNA、該組換えDNAを導入した形質
転換体及び該形質転換体を培養することによるBOの製造
法に関し、該BOは分析用酵素として利用され、産業上特
に重要である。

【０００２】

【従来の技術】BOは国際生化学連合（I.U.B）酵素委員
会により、酵素番号EC 1.3.3.5として分類される酵素で
ある。BOはミロセシウム（Myrothecium）属、トリコデ
ルマ（Trichoderma）属及びコプリナス（Coprinas）属
等の微生物が産生することが報告されている酵素であ
り、ビリルビンに作用してビリベルジンを経てほぼ無色
の生成物に変化せしめる反応を触媒する酵素である。そ
の結果、ビリルビンの特異吸収（460nm付近）が減少す
るとともに、その還元性が消失する。また、この酵素は
過酸化水素を生成しない特徴を有している。BOはその起
源にもよるが、約52,000〜約83,000の分子量を有してい
る。特にミロセシウム属菌由来のBOはその酵素化学的性
質も詳細に明らかにされている（特公昭60−12032
号）。

【０００３】このようにBOはビリルビンに作用してビリ
ルビンを分解する酵素であることから、特に体液中のビ
リルビン定量用診断薬として応用され、肝疾患等の診断
に利用されている。更に血清中ビリルビンによる測定干
渉作用を除去するためにビリルビンの消去用として各種
の生化学検査用試薬に利用されている。その他、BOは各
種の方面（例えば、医薬、洗剤など）にも応用が図られ
ている。

【０００４】BOは前記に述べたようにミロセシウム属、
トリコデルマ属及びコプリナス属等の微生物から生産さ
れているが、現在ではBO遺伝子についての解析は全くな
されていないのである。また、組換え体BOの製造に関す
る研究も従来では全くなされていないのが現状である。
よって、遺伝子操作によりこれらのBOを大量に、安価に
生産する方法の開発が求望されていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来、BOは前述したよ
うな微生物を培養することによって製造されているた
め、供給量、供給費用などの点で改善すべき点が多くあ
った。

【０００６】本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意
研究の結果、BOをコードするDNAを精製・単離し、その
塩基配列を決定することに成功した。更に該遺伝子を組
み込んだ形質転換体を得、該形質転換体を培養すること
によってBOを製造する方法を完成した。

【０００７】かかる成果に基づいてBOの効率的な大量生
産への途を開き、さらには、蛋白質工学によるBOの特異
性の改変への途をも開いた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、BO遺伝子をコ
ードするDNAに関するものであり、更に該遺伝子を組み
込んだ形質転換体を培養することによるBOの製造方法に
関する。

【０００９】即ち、配列番号：１に示すアミノ酸配列を
コードする塩基配列を含むDNAを提供するものである。
かかるDNAは、遺伝コドンの縮重を考慮すると、種々の
塩基配列を包含し得る。

【００１０】これらの塩基配列は、遺伝子発現系の諸要
素、例えば宿主細胞の種類等に応じた優先コドン等によ
って当業者が容易に選択し得るものである。

【００１１】配列番号：１に示したDNAの取得方法も化
学的合成法も含めて種々のものが考えられる。例えば、
PCR（Polymerase Chain Reaction）法により得られたDN
A断片をプローブとして用い、ゲノムDNA等からイントロ
ンを含む遺伝子をクローニングした後、イントロンを含
まないcDNAを、例えばPCR法により得ることができる。

【００１２】これらの遺伝子はBOを生産する微生物より
以下の実施例に述べる方法により単離できる。微生物と
しては、BOを産生するものであればいずれでも良いが、
例えばミロセシウム属、トリコデルマ属及びコプリナス
属等の微生物が使用できる。好ましくはミロセシウム属
が挙げられ、より好ましくは、ミロセシウム・ベルカリ
ア（Myrothecium verrucaria）ＭＴ−１（本菌株は工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されその寄託番号は
微工研条寄第653号である。）が使用できる。

【００１３】以下、本発明をミロセシウム・ベルカリア
ＭＴ−１由来のBOの場合を例にとり、実施例を参照しな
がら詳細に説明する。

【００１４】尚、トリコデルマ属及びコプリナス属等の
微生物から生産されているBOの場合についても、本発明
と同様の過程を踏み、プライマー等を適当にデザインす
ることによって容易に実施できる。よって、本発明は以
下に記載する実施例に限定されるものではない。

【００１５】

【実施例】実施例１ BOのcDNAクロ−ニング菌体の取得 まずBOを分泌発現する生産菌を以下の如く培養した。培
養の為の培地には以下に示すポテトグルコース培地を使
用した。

【００１６】ポテトグルコース培地の作製法 １ 馬鈴薯の皮及び芽をとり約１cmの角切りにしたの
ち、400ｇを上皿天秤で秤 量してステンレスバッ
トに入れる。 ２ 脱イオン水1000mlをメスシリンダーで量り、上記の
ステンレスバットに加え、アデカノールＬＧ−126（旭
電化工業製）を３滴添加する。 ３ ガスコンロではじめ強火で沸騰させ、その後は弱火
で２時間煮沸する。その後、流水中で冷却する。 ４ 冷却後、ガーゼ２枚でろ過する。 ５ ろ液を1000mlに脱イオン水でフィルアップし、グル
コースを10ｇ加えて溶解する。 ６ 121℃で、30分間オートクレーブする。

【００１７】上記の如く作製されたポテトグルコース培
地２mlに、胞子形成を行なっていないミロセシウム・ベ
ルカリアＭＴ−１（以下、BO生産菌という。）を接種し
て140rpmで30℃、３日間振盪培養した。次にこの培養液
２mlを同ポテトグルコース培地100mlに接種し、140rpm
で30℃、３日間振盪培養した。更に、この培養液２mlを
500mlの同ポテトグルコース培地の入った坂口フラスコ
に接種して、125rpm、25℃で振盪培養した。培養の間、
培養液を経時的にサンプリングして、その上清に含まれ
るBOの発現量の変動を、下記に示す測定法によりBO活性
を測定し、BO活性が高い培養液を回収した。

【００１８】BO活性測定法 エチレンジアミン四酢酸１mMを含む0.2Ｍ−トリス塩酸
緩衝液250mlに試薬ビリルビン（和光純薬工業製）５mg
を溶解し、この２mlと酵素液0.2mlを37℃で反応させ440
nmの吸光度の減少を測定する。

【００１９】この培養液から菌体を遠心分離（12000×
ｇ，15分）により菌体を回収し、−80℃に凍結保存して
以下の実験に供した。

【００２０】菌体から全RNAの調製法 全RNAは、グアニジュウム／塩化セシュウム法〔［バイ
オケミストリ（Biochemistry），13，2633（1974）］、
［サイエンス（Science），196，1313（1977）］、［モ
レキュラー クローニング（Molecular Cloning）（198
2）］〕に従って調製した。

【００２１】で得られた菌体10ｇと海砂（20〜35メッ
シュ、和光純薬製）５ｇを混合し、すり鉢の中で液体窒
素と共に菌体を粉砕した。得られた粉砕物を40mMの４Ｍ
グアニジンチオシアネ−ト（フルカ製）、200mM 酢
酸ナトリウム（和光純薬製）、5mM EDTA（ドウジン
製）を含む溶液に加え、室温で15分間振盪混合させた。

【００２２】得られた混合物を30mlのコ−ニングチュ−
ブに分配し、遠心分離（10,000rpm、15分）を行なっ
た。次に予め４mlの５Ｍ 塩化セシュウム（和光純薬
製）の入った遠心チュ−ブ６本に、得られた上清を６ml
づつ重層し、超遠心分離（37,000rpm、18時間）を行な
った。その結果、チュ−ブの底に透明な沈殿物を得た。

【００２３】この沈殿物を80％エタノ−ルで２回洗浄し
乾燥させ、１チュ−ブあたり80μｌの10mM トリス−塩
酸緩衝液（pH7.6）、10mM EDTA、0.5％ SDSを含む溶
液に溶かした。次に６本分を１本のチュ−ブに集め、10
mM トリス・塩酸緩衝液（pH8.0）（１mMのEDTA含有）
（以下、TEという）、飽和フェノ−ル及びクロロホルム
で２回づつ抽出し、最後に得られた水層に１/10容量の
３Ｍ 酢酸ナトリウム（pH5.2）溶液と２倍容量のエタ
ノ−ルを加え、−20℃に１時間おいた。その後、遠心分
離（12,000×ｇ，15分）により沈殿を回収し、沈殿を80
％エタノ−ルで洗浄し、乾燥させた。これを滅菌蒸留水
200μｌに溶かし以下の実験に使用した。尚、最終的に
得られた全RNA量は約２mgであった。

【００２４】全RNAからpoly(A) ⁺ RNAの調製法 で得られた全RNA１．２ｍｇからmRNA Purification
Kit（ファルマシア社製）を用いてpoly(A)⁺RNAを12μｇ
回収した。

【００２５】BO蛋白のアミノ末端部分の配列とBO蛋白
をプロテア−ゼで切断したペプチドのアミノ酸配列の決
定 （I）BO蛋白のアミノ末端部分のアミノ酸配列の決定 （i）BO蛋白の還元カルボキシメチル化 ミロセシウム・ベルカリアＭＴ−１由来の精製したBO蛋
白５mgを３mlの６Ｍグアニジン塩酸と２mM EDTAを含む
0.5Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、50℃で２
分間処理した後、室温で24時間放置した。放置しておい
た反応液に0.6mgのDTT（ジチオスレイト−ル）と1.5mg
のヨ−ド酢酸を加え暗所で30分反応させた後、透析チュ
−ブに移し、暗所でイオン交換水に透析した。得られた
透析内液を凍結乾燥し、以下の実験に用いた。

【００２６】（ii）アミノ酸配列の決定 （i）で得られた試料の適当量を液相法プロテインシ−
クエンサ−（アプライド・バイオシステム社製）あるい
は固相法プロテインシ−クエンサ−（ミリジェン・バイ
オサ−チ社製）にかけ、得られたデ−タからアミノ酸配
列（配列番号：２）を決定した。

【００２７】（II）BO蛋白をプロテア−ゼで切断したペ
プチドのアミノ酸配列の決定 （i）トリプシン分解断片の取得とアミノ酸配列の決定 （I）の（i）で示したようにBO蛋白を還元カルボキシメ
チル化した試料を５mMの炭酸水素アンモニウム（pH7.
9）に溶解し、TPCK−トリプシン（ベ−リンガ−・マン
ハイム製）をBO蛋白量の１/50モル量加え、37℃で６時
間処理し、さらに同量のTPCK−トリプシンを加え37℃で
24時間処理した反応液を塩酸でpH２に調整した。トリプ
シン分解断片は、得られたトリプシン分解反応液の適当
量をHPLC逆相クロマトグラフィ−（μBondasphere C18
−100Aカラム）を行なうことにより分画し取得した。
尚、HPLCの条件は下記の通りである。

【００２８】 Ａ液：0.5％トリフルオロ酢酸／水 Ｂ液：0.5％トリフルオロ酢酸／50％アセトニトリル／
水 グラジェント：０−100％Ｂ液のリニアグラジェント 流速：0.5ml／分

【００２９】分画し得られたトリプシン分解断片の内、
（I）の（ii）と同様のプロテインシ−クエンサ−を用
いて４種類の断片のアミノ酸配列（配列番号：３〜配列
番号：６）を決定した。

【００３０】（ii）V8プロテア−ゼ分解断片の取得とア
ミノ酸配列の決定 （I）の（i）で示したようにBO蛋白を還元カルボキシメ
チル化した試料を５mMの炭酸水素アンモニウム（pH7.
9）に溶解し、V8プロテア−ゼ（Staphylococcusaureus
由来：ベ−リンガ−・マンハイム製）をBO蛋白量の１/5
0モル量加え37℃で６時間処理し、さらに同量のV8プロ
テア−ゼを加え37℃で24時間処理した反応液を塩酸でpH
２に調整した。V8プロテア−ゼ分解断片は、得られた分
解反応液の適当量を、トリプシン分解の場合と同様にHP
LC逆相クロマトグラフィ−を行なうことにより分画し取
得した。尚、分画条件も同様である。

【００３１】分画し得られたV8プロテア−ゼ分解断片の
内、（I）の（ii）と同様のプロテインシ−クエンサ−
を用いて６種類の断片のアミノ酸配列（配列番号：７〜
配列番号：12）を決定した。

【００３２】PCR（Polymerase Chain Reaction）法に
よるDNA断片の取得 BOのcDNAを含む特定のDNA領域を、最近開発されてきたP
CR法〔［サイエンス（Science），230，1350（198
5）］、メソッド イン エンザイモロジー（Methodin
Enzymology），155，335（1987）］〕によって、単離増
幅した。

【００３３】（I）BO蛋白の一部分に対応するDNA断片の
取得 （i）PCR法に用いたプライマーDNAの合成 の（I）で決定されたBO蛋白のアミノ末端配列（配列
番号：２）の16番目のプロリンから22番目のグルタミン
に対応する塩基配列を予想し、DNAを合成した。尚、5'
側には、PCR産物であるDNA断片をサブクロ−ニングし易
くするために、制限酵素EcoRIの認識配列を加えてあ
る。以下に示す全てのDNA合成には、0.2μMスケ−ルで
サイクロンプラスDNA合成機（ミリジェン・バイオサ−
チ社製）を使用した。このDNAをPCR法のプライマー＃１
とした。プライマー＃１の配列を以下に示す。

【００３４】 A A プライマー＃１ 5' -GGGAATTCCNATTCCICCIGTIAA CA- 3' （N=A,G,C,T） C G （I:イノシン）

【００３５】次にの（II）で得られたBO蛋白をトリプ
シンで分解した断片のうち、１つの断片のアミノ酸配列
（配列番号：３）に対応する塩基配列を予想してDNAを
合成した。尚、5'側には、PCR産物のDNA断片をサブクロ
−ニングし易くするために制限酵素BamHIの認識配列を
加えてある。配列番号：３の６番目のグルタミン酸から
12番目のアラニンに対応するDNAの相補的配列をPCR法の
プライマー＃２とした。プライマー＃２の配列を以下に
示す。

【００３６】 A A A GA T プライマー＃２ 5' -CGGGATCC TC TCIGC TAIGGIC TA TC- 3' G G G TG C （I:イノシン）

【００３７】合成したDNAはそれぞれ200μｌのTEに溶解
し、PCR法のプライマーとして使用した。

【００３８】（ii）PCR法に用いた鋳型DNAの調製 で得られた全RNA10μｌ（0.5μｇ）と20μＭのOligom
er(dT)₁₅（ベ−リンガ−製）３μｌを500μｌ容量のチ
ュ−ブ内で混合し、70℃で10分間インキュベ−トした
後、すぐに氷中で冷やした。

【００３９】次に、この得られた混合物４μｌに対し以
下の試薬を混合し、37℃で45分間インキュベ−トした。
この反応物をPCR法の鋳型DNAとした。以下、この反応物
を1st DNA mixという。

【００４０】 [5×] reverse buffer（BRL製） ４μｌ 0.1Ｍ DTT （BRL製） ２μｌ RNasin（20units）（Promega製） 1.5μｌ 2.5mM NTPs （TOYOBO製） ８μｌ MMTV Reverse Transcriptase（200units）（BRL製） １μｌ

【００４１】（iii）PCR法によるDNA断片の増幅 反応は、Gene Amp^TM Kit（パ−キンエルマ−ジャパン社
製）を用い、同社のDNA Thermal Cycler（DNA増幅装
置）により行なった。反応溶液の組成は以下の通りであ
る。

【００４２】 Ｈ₂Ｏ 58.5μｌ [10x]Reaction Buffer 10μｌ dNTPs，mix 1.25mM 16μｌ プライマー＃１ ５μｌ プライマー＃２ ５μｌ 1st DNA mix ５μｌ AmpliTaq^TM DNA polymerase（５units/μｌ） 0.5μｌ

【００４３】上記の反応液100μｌを混合し、ミネラル
オイル（シグマ社製）100μｌを加えた。次に反応液の
入ったチュ−ブをDNA Thermal Cyclerにセットし、以下
の条件で反応を行なった。

【００４４】 95℃ 0.5分 37℃ 0.5分 72℃ ３分

【００４５】この条件下で反応を40サイクル行なった
後、更に72℃で７分間インキュベ−トした。

【００４６】（iv）増幅されたDNAの回収 反応後、ミネラルオイルを除き、100μｌのクロロホル
ムを加え混合し、遠心分離（15,000rpm、２分）を行な
い、上清を100μｌ回収した。このうち10μｌを用いて
１％アガロ−ス電気泳動で回収されたDNAのサイズと量
を確認した。その結果約1.5KbpのDNA断片が約２μｇ増
幅されていることがわかった。

【００４７】残りの90μｌを１％アガロ−ス電気泳動に
かけ、1.5Kbpに相当するバンドを切りだし、DNA精製キ
ット（BIO 101社製）、GENECLEAN IIでこのDNAを抽出し
た。この操作で約１μｇのDNA断片が回収された。以
下、このDNA断片をBO−Aという。

【００４８】（v）PCR法で増幅されたDNAの塩基配列の
決定 まず、（iv）で得られたBO−Aを制限酵素EcoRI、あるい
はBamHIで切断し、１％アガロ−ス電気泳動でサイズを
確認した。このBO−AはBamHIで切断されることがわかっ
た。したがって、制限酵素処理しないBO−Aと、適当量
をあらかじめ制限酵素SmaIで切断した市販のプラスミド
pUC19（TOYOBO製）［ジーン（Gene），33，103（198
5）］と混合し、ライゲ−ションキット（宝酒造製）を
用いて16℃、18時間連結反応を行なった。

【００４９】次にこの混合物で大腸菌DH5αを形質転換
した［ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー
（J. Mol. Biol.），166，577（1983）］。得られた形
質転換体より、プラスミドを調製し、pUC19にBO−Aが導
入されたプラスミドpUCBO-Aを得た。

【００５０】次に、塩基配列決定のための方向を調べる
ために、各種制限酵素でpUCBO-Aを切断し、BO−Aの制限
酵素地図を作製した。図１の上段のスケールはDNA断片
のサイズを示し、枠で仕切られたBO−Aの上部に、制限
酵素認識部位を示し（例えば BglII、BamHI等）、枠の
右端にBO−Aを含むプラスミド名としてpUCBO-Aを示し
た。

【００５１】次に、塩基配列決定のためのサブクロ−ニ
ングを、得られたBO−Aの制限酵素地図を基にして行な
った。塩基配列決定の鋳型DNAは、M13ファ−ジ（M13mp1
8、M13mp19）のRF DNAにDNA断片をクロ−ニングし、一
本鎖DNAとして回収したり［メソッド イン エンザイ
モロジー，101，20（1983）］、pUC18、pUC19やpHSG39
6、pHSG397（いずれも宝酒造製）のプラスミドにクロ−
ニングし、２本鎖DNAとして回収し、鋳型DNAとした。塩
基配列は、得られた鋳型DNAを[α-³²P]dCTPと7-Deaza-S
equencing Kit（USB社製）を用いる従来公知の方法や蛍
光物質利用したTaqDye Primer Cycle Sequencing Kit
（ABI社製）、DNA増幅装置（パ−キンエルマ−・シ−タ
ス社製）及びDNA Sequencer 373A（ABI社製）を用いる
方法で決定した。

【００５２】図１において枠で仕切られたBO−Aの下部
に塩基配列決定の方向と距離を示した。決定されたBO−
Aの塩基配列は、配列番号：13に示した219番目のＣから
1771番目のＣに相当する。この塩基配列から予想される
アミノ酸配列を配列番号：13の塩基配列の下に示した。

【００５３】このアミノ酸配列とBO蛋白のアミノ末端配
列（配列番号：２）の一部（16番目のプロリンから25番
目のロイシン）やプロテア−ゼで分解した断片のアミノ
酸配列（配列番号：３から配列番号：12）の一致が認め
られる。一致しているアミノ酸配列部分を配列番号：13
に下線で示した。従って、得られたBO−Aは、目的のBO
蛋白のcDNAの一部分である。

【００５４】（II）BO蛋白のカルボキシル末端部分に対
応する3'側のcDNA断片の取得 （i）PCR法に用いたプライマーDNAの合成 （I）の（v）で決定されたBO−Aの塩基配列のうち、特
異的配列（配列番号：13の1692番目のＣから1716番目の
Ｇまで）のDNAを合成した。このDNAをPCR法のプライマ
ー＃３とした。尚、（I）の（i）と同様に5'側には制限
酵素EcoRIの認識配列を付けてある。プライマー＃３の
配列を以下に示す。

【００５５】 プライマー＃３ 5' -TCGAATTCAGGCTCAGAGTGGCCAGTTCAGCG- 3'

【００５６】もう一方のプライマーは、poly(A)⁺RNAの
3'側のpoly(A)配列を利用したPCR法を行なうために、３
つの制限酵素認識部位（5'からClaI、HindIII、SalI）
のみを持つDNAを合成し、このDNAをPCR法のプライマー
＃４とした。プライマー＃４の配列を以下に示す。

【００５７】 プライマー＃４ 5' -GATCGATAAGCTTGTCGACT- 3'

【００５８】合成したDNAはそれぞれ200μｌのTEに溶解
し、PCR法のプライマーとして使用した。

【００５９】（ii）PCR法に用いた鋳型DNAの調製 まず、（I）の（ii）で使用したOligomer(dT)₁₅に代え
て、5'側にさらにプライマー＃４の配列をもつDNAを合
成し、得たDNAを1st strand cDNA合成に用いるプライマ
ー＃５とした。プライマー＃５の配列を以下に示す。

【００６０】 プライマー＃５ 5' -GATCGATAAGCTTGTCGAC(T)₁₇- 3'

【００６１】で得られた全RNA 10μｌ（0.5μｇ）と
20μＭのプライマー＃５、３μｌを500μｌ容量のチュ
−ブ内で混合し、70℃で10分間インキュベ−トした後、
すぐに氷中で冷やした。次に、この得られた混合物４μ
ｌに対し以下の試薬を混合し、37℃で45分間インキュベ
−トした。この反応物をPCR法の鋳型DNAとした。以下、
この反応物を1st DNA mix(c)とする。

【００６２】 [5×] reverse buffer（BRL製） ４μｌ 0.1M DTT （BRL製） ２μｌ RNasin（20units）（Promega製） 1.5μｌ 2.5mM dNTPs（N=A,G,C,T）（TOYOBO） ８μｌ MMTV Reverse Transcriptase（200units）（BRL製） １μｌ

【００６３】（iii）PCR法によるDNA断片の増幅 反応溶液の組成は以下の通りであり、DNA増幅キット、D
NA増幅装置、増幅反応条件は、（I）の（iii）と同様で
ある。

【００６４】 Ｈ₂Ｏ 58.5μｌ [10×]Reaction Buffer 10μｌ dNTPs，mix 1.25mM 16μｌ プライマー＃３（20μＭ） ５μｌ プライマー＃４（20μＭ） ５μｌ 1st DNA mix(c) ５μｌ AmpliTaq^TM DNA polymerase（５units/μｌ） 0.5μｌ

【００６５】（iv）PCR法で増幅されたDNAの回収と塩基
配列の決定 （I）の（iv）と同様に、回収した反応液10μｌを用い
て1.5％アガロ−ス電気泳動で増幅されたDNAのサイズと
量を確認した。その結果、約290bpのDNA断片が約２μｇ
増幅されていることがわかった。残りの90μｌを1.5％
アガロ−ス電気泳動にかけ、290bpに相当するバンドを
切りだし、DNA精製キット、MERMAID^TM Kit（BIO 101社
製）でこのDNAを抽出した。この操作で約0.5μｇのDNA
断片が回収された。以下、このDNA断片をBO−Bという。

【００６６】次に得られたBO−Bを制限酵素EcoRIとHind
IIIで切断し、あらかじめ同じ制限酵素で切断したプラ
スミドpUC19にサブクロ−ニングした。その結果得られ
たBO−Bを含むプラスミドpUCBO-Bの塩基配列を決定し
た。この場合の塩基配列決定は7-Deaza-Sequencing-Kit
（USB社製）を用いる従来公知の方法でおこなった。図
１において枠で仕切られたBO−Bの上部に制限酵素認識
部位、下部に塩基配列決定の方向と距離を示し、枠の右
端にBO−Bを含むプラスミド名としてpUCB0-Bを示した。

【００６７】決定されたBO−Bの塩基配列は、配列番
号：13に示した1692番目のＣから1959番目のＡに相当す
る。BO−AとBO−Bの塩基配列を比較すると1692番目のＣ
から1771番目のＣが完全に一致すること、この塩基配列
から予想されるアミノ酸配列とBO蛋白をV8プロテア−ゼ
で分解した断片の配列の内、配列番号：７の配列と一致
すること、その配列のすぐ後にストップコドン（配列番
号：13の塩基配列で1782番目から1784番目）が現われ、
3'末端にpoly(A)配列が存在することから、BO−Bは、目
的のBO蛋白のカルボキシル末端部分に対応する3'側のcD
NA断片である。

【００６８】（III）BO蛋白のアミノ末端部分に対応す
る5'側のcDNA断片の取得 （i）PCR法に用いたプライマーDNAの合成 （I）の（v）で決定されたB0−Aの塩基配列のうち、以
下に示す特異的配列（配列番号：13の322番目から348番
目）の相補的配列のDNAを合成した。このDNAをPCR法の
プライマー＃６とした。プライマー＃６の配列を以下に
示す。

【００６９】 プライマー＃６ 5' -CGGATCCAAGGTCAGGGTAAACCTGGT- 3'

【００７０】PCR法の鋳型DNAの合成をSuperScript^TM P
lasmid System（BRL社製）を用いて行なうと、２本鎖cD
NA混合物の5'末端にSalIアダプタ−が導入される。従っ
て、もう一方のプライマーは、この配列を利用すること
にした。以下に示す配列を合成し、PCR法のプライマー
＃７とした。プライマー＃７の配列を以下に示す。

【００７１】 プライマー＃７ 5' -TCGACCCACGCGTCCG- 3'

【００７２】合成したDNAはそれぞれ200μｌのTEに溶解
し、PCR法のプライマーとして用いた。

【００７３】（ii）PCR法に用いた鋳型DNAの調製とDNA
断片の増幅 で得られたpoly(A)⁺RNAを2.5μｇ使用して、SuperScr
ipt^TM Plasmid System（BRL社製）により２本鎖cDNA合
成し、SalIアダプタ−の付加及び制限酵素NotIで切断し
た反応液をフェノ−ル／クロロホルム抽出、エタノ−ル
沈殿、乾燥を行ない、最終的にTE 50μｌに溶解させた
サンプルを鋳型DNAとした。以下この鋳型DNAをcDNA mix
という。

【００７４】PCR法の反応溶液の組成は以下の通りであ
り、DNA増幅キット、DNA増幅装置、増幅反応条件は、
（I）の（iii）と同様である。

【００７５】 Ｈ₂Ｏ 60.5μｌ [10×] Reaction Buffer 10μｌ dNTPs，mix 1.25mM 16μｌ プライマー＃６（20μＭ） ５μｌ プライマー＃７（20μＭ） ５μｌ cDNA mix ３μｌ AmpliTaq^TM DNA polymerase（５units/μｌ） 0.5μｌ

【００７６】（iii）PCR法で増幅されたDNAの回収と塩
基配列の決定 （II）の（iv）と同様にDNAを回収し、その結果、約350
bpのDNA断片が、約0.5μｇ得られた。以下、このDNA断
片をBO−Cという。

【００７７】次に得られたBO−Cを制限酵素SalIとBamHI
で切断し、あらかじめ同じ制限酵素で切断したプラスミ
ドpUC19にサブクロ−ニングした。その結果得られたBO
−Cを含むプラスミドpUCBO-Cの塩基配列を決定した。こ
の場合の塩基配列決定は7-Deaza-Sequencing-Kit（USB
社製）を用いる従来公知の方法でおこなった。図１にお
いて枠で仕切られたBO−Cの上部に制限酵素認識部位、
下部に塩基配列決定の方向と距離を示し、枠の右端にBO
−Cを含むプラスミド名としてpUCBO-Cを示した。決定さ
れたBO−Cの塩基配列は、配列番号：13に示した１番目
のＡから348番目のＧに相当する。BO−AとBO−Cの塩基
配列を比較すると219番目のＣから348番目のＧまでの配
列が完全に一致すること、この塩基配列から予想される
アミノ酸配列（配列番号：13の塩基配列では180から254
番に相当する）とBO蛋白のアミノ末端配列が一致するこ
とから、BO−Cは、BO蛋白のアミノ末端部分に対応する
5'側のcDNA断片である。

【００７８】以上、得られたBO−A、BO−B及びBO−CのD
NA断片のオ−バ−ラップする塩基配列部分を考慮し、結
合させた全体の塩基配列を配列番号：13に示した。塩基
配列の下段には塩基配列から予想される、66番目から68
番目の開始コドンであるＡＴＧから始まり終止コドンで
ある1782番目から1785番目のＴＡＧで終了する最も長い
オ−プンリ−ディングフレ−ムを示してある。

【００７９】BO蛋白部分はこのフレ−ム内に存在する。
したがって、BO蛋白は、572個のアミノ酸から成る前駆
体として翻訳されると考えられる。配列番号：13に示し
たアミノ酸配列部分のうち１番目のメチオニンから約20
のアミノ酸は比較的疎水性に富んだアミノ酸が並んでい
ることから、分泌蛋白質に一般的に見られるシグナル配
列と考えられる。BO蛋白のアミノ末端アミノ酸はバリン
であり、その前には２つの塩基性アミノ酸（Lys-Arg）
が存在している。このアミノ酸配列は、BO前駆体から成
熟体（BO蛋白）へのプロセッシングに必要な配列と考え
られる。

【００８０】配列番号：13で示した最も長いオ−プンリ
−ディングフレ−ムを、配列番号：１にアミノ酸の３文
字表記で示した。BO蛋白のアミノ末端配列（配列番号：
２）やプロテア−ゼ分解断片の配列（配列番号：３〜配
列番号：12）を下線で示した。したがって、BO蛋白側か
らの得られた配列と、得られたcDNAから予想されるアミ
ノ酸配列とを総合して考えると、BO蛋白の一次構造は、
39番目のバリンから572番目のグルタミン酸まで534個の
アミノ酸より成ると考えられる。

【００８１】ノザンブロッティング法によるBOのmRNA
のサイズの同定 ノザンブロッティングは、ホルムアルデヒド法により行
なった。〔［バイオケミストリイ，16，4743（197
7）］、［プロシーディング オブ ザ ナショナルア
カデミイ オブ サイエンス オブ ザ ＵＳA，77，5
794（1980）］、［モレキュラー クローニング（198
2）］〕

【００８２】で得られたpoly(A)⁺RNAのうち2.5μｇを
変性条件下で1.2％アガロ−ス電気泳動し、ブロッティ
ングし、ベイキングしたニトロセルロ−スフィルタ−
と、の（I）の（iv）で得られたプラスミドpUCBO-Aを
制限酵素EcoRIとHindIIIで切断し、アガロ−ス電気泳動
にかけ切りだし抽出した、約1.5kbpのBO-AのDNA断片の
適当量を[α-³²P]dCTPでMuitiprime^TM DNA Labelling
system（アマシャム社製）により標識化したDNA断片と
をハイブリダイゼイションさせ、15mM 塩化ナトリウ
ム、1.5mM クエン酸ナトリウムと0.1％ SDSを含む溶
液で42℃で30分間洗浄し、風乾させたフィルタ−のオ−
トラジオグラフィ−を行なった。その結果を図２に示し
た。

【００８３】同時に電気泳動したRNAのサイズマ−カ−
から算定された約２kbの位置に１本バンドが出現した
（図２に矢印で示す）。従って、BOのmRNAのサイズは、
約２kbであり、の（I）〜（III）で得られたBO−A、B
O−B及びBO−Cを組合せて得られた配列番号：13のDNAの
サイズと一致する。このことは、BOのmRNAは一種類であ
り、配列番号：13に示されたDNA配列がBOのmRNA配列をD
NAに変換した配列と考えることができる。

【００８４】前駆体部分と成熟体のBO（BO蛋白）部分
の全体を含むDNA断片の取得 で得られた結果から、BO蛋白に対するmRNAは一種類で
あり、の（II）と（III）で得られたBO−BとBO−Cの
塩基配列を利用すれば、オ−プンリ−ディングフレ−ム
（配列番号：１）全体を含むひと繋がりのDNA断片とし
て取得できる。このDNA断片の取得はPCR法によって行な
った。

【００８５】（ｉ）PCR法によるオ−プンリ−ディング
フレ−ム全体を含むDNA断片の 増幅 の（III）で得られたBO−Cの塩基配列の内、配列番
号：13の第12番目のＴから第36番目のＴまでの配列と第
1878番目のＣから第1902番目のＧまでの配列の相補的配
列のDNAを合成した。それぞれの合成DNAをPCRのプライ
マー＃８、プライマー＃９として用いた。また、の
（III）で得たcDNA mixをPCRの鋳型DNAとした。

【００８６】PCRの反応溶液の組成は以下の通りであ
り、DNA増幅キット、DNA増幅装置、増幅反応条件は、
（I）の（iii）と同様である。

【００８７】 Ｈ₂Ｏ 60.5μｌ [10×] Reaction Buffer 10μｌ dNTPs，mix 1.25mM 16μｌ プライマー＃８（20μＭ） ５μｌ プライマー＃９（20μＭ） ５μｌ （III）の（ii）のcDNA ｍｉｘ ５μｌ AmpliTaq^TM DNA polymerase（5units/μｌ） 0.5μｌ

【００８８】（ii）PCRで増幅されたDNAの回収と塩基配
列の決定 （II）の（iv）と同様にDNAを回収し、その結果、約1.9
kbpのDNA断片が、約１μｇ得られた。以下、このDNA断
片をBO−fullという。

【００８９】次に得られたBO−fullを、あらかじめ制限
酵素SmaIで切断したプラスミドpUC19にサブクロ−ニン
グし、BO−fullを含むプラスミドを得た。以下、このプ
ラスミドをpUC-BOという。次にBO−fullの制限酵素地図
を作製し、その地図に基づき塩基配列決定のためのサブ
クロ−ニングを行なった。の（v）のように、塩基配
列決定の鋳型DNAは、M13ファ−ジ（M13mp18、M13mp19）
のRF DNAにDNA断片をクロ−ニングし、一本鎖DNAとし
て回収したり［メソッド イン エンザイモロジー，10
1，20（1983）］、pUC18、pUC19やpHSG396、pHSG397
（いずれも宝酒造製）のプラスミドにクロ−ニングし、
２本鎖DNAとして回収し鋳型DNAとした。この場合の塩基
配列決定は、蛍光物質利用したTaq Dye Primer Cycle S
equencingKit（ABI社製）、DNA増幅装置（パ−キンエル
マ−・シ−タス社製）及びDNA Sequencer 373A（ABI社
製）を用いる方法でおこなった。図１において枠で仕切
られたBO−fullの上部に制限酵素認識部位、下部に塩基
配列決定の方向と距離を示し、枠の右端にBO−fullを含
むプラスミド名としてpUC−BOを示した。決定されたBO
−fullの塩基配列は、配列番号：13に示した第12番目の
Ｔから第1902番目のＧまで、完全に一致した配列であっ
た。したがって、このPCRにより配列番号：１に示した
アミノ酸配列に相当する塩基配列を全て含むDNA断片を
得ることができた。図１において枠で仕切られたBO−fu
llには、BO蛋白に対応する領域を斜線で、シグナルペプ
チドに相当する部分を含む領域をPreProとして示した。
また、BO蛋白のアミノ末端に相当する部分をＮ、カルボ
キシル末端に相当する部分をＣと示した。このBO−full
と名付けたDNA断片を含むプラスミドpUC−BOを、実施例
２および実施例３に示す酵母での組み換えBOの発現に必
要なプラスミド構築の材料とした。

【００９０】実施例２ まず、プラスミドpUC−BOのうち成熟タンパク部分に相
当すると予想される塩基配列を、下記プライマ−＃10、
プライマ−＃11を用いてPCR法により増幅した。プライ
マ−＃10には後述するプラスミドへクロ−ニングが容易
なように、酵母α因子のシグナルペプチドの塩基配列の
一部（HindIIIサイトを含む）が含まれている。またプ
ライマ−＃11にはストップコドンとEcoRIサイトが含ま
れている。プライマー＃10、プライマー＃11の配列を以
下に示す。

【００９１】 プライマ−＃10 5'-GGTAAGCTTGGATAAAAGAGTTGCCCAGATCAGCCCACAG-3' プライマ−＃11 5'-CGGAATTCTTACTCGTCAGCTGCGGCG-3'

【００９２】PCR法の反応はGene AmpTM kit（パ−キン
エルマ−ジャパン社製）を用い、同社のDNA Thermal Cy
clerにより行なった。反応液の組成は同キットに添付さ
れている説明書に記載されている方法に従った。反応液
の入ったチューブをDNA Thermal Cyclerにセットし、以
下の条件で反応を行なった。

【００９３】 95℃ 0.5分 37℃ 0.5分 72℃ ３分

【００９４】この反応条件下で反応を35サイクル行なっ
た後、さらに72℃で７分間インキュベ−トした。反応
後、反応液を取り出しこれをクロロホルムにて抽出し
た。

【００９５】次いで、これを1.5％アガロースゲルにて
電気泳動し、増幅されたDNAのサイズと量を確認した。
その結果、約1.6kbpのDNA断片が約１μｇ増幅されてい
ることがわかった。この1.6kbpのバンドを含むゲルを切
りだして、Gene clean II Kit（BIO 101社製）を用い
て、キットに添付されている説明書に従ってDNAを抽出
し回収した。

【００９６】回収したDNAを次に制限酵素EcoRIとHindII
I（いずれも東洋紡製）にて消化し、アガロ−ス電気泳
動を行なって、約1.6kbpのDNA断片をGene clean II Kit
を用いて回収した。得られた1.6kbp DNA断片を発現させ
るために、酵母において分泌発現が可能なように、分泌
発現に必要なシグナルペプチドの塩基配列と転写の終結
に必要な塩基配列（ターミネーター）を1.6kbp DNA断片
に結合した。

【００９７】まず、α因子のシグナルペプチド部分の塩
基配列を前述のPCR法を用いて増幅し単離した。すなわ
ち、酵母のゲノムDNA（Clontec社より購入）を鋳型DNA
としプライマ−＃12、＃13を用いてα因子のシグナルペ
プチド部分の塩基配列を増幅した。増幅後、前述したよ
うに反応液をアガロース電気泳動して、増幅したDNA断
片を確認して、これをMERMAID kitを用いて抽出し回収
した。その結果、約0.5μｇの約300bpのDNA断片を得
た。

【００９８】 プライマ−＃12 5'-GCCTCGAGTTTCATACACAATATAAACGACCAAA-3' プライマ−＃13 5'-GGAAGCTTACCCCTTCTTCTTTAGCAGCAATGCT-3'

【００９９】ここで、プライマ−＃12は制限酵素XhoIの
サイトをプライマ−＃13は制限酵素HindIIIのサイトを
含んでいるので、得られたDNA断片をXhoIとHindIIIで消
化することにより、α因子のシグナルペプチドの塩基配
列を含んだDNA断片の両末端に、それぞれXhoIサイトとH
indIIIサイトを導入できる。

【０１００】得られたDNA断片をXhoIとHindIIIで消化し
て、これとブル−スクリプトks^-（Stratagene社製）をX
hoI、HindIIIで消化したラージフラグメントをライゲー
ションした。ライゲーション反応はライゲーションキッ
ト（宝酒造製）を用いてキットに添付されている説明書
に従って行なった。ライゲ−ション後、反応液で大腸菌
DH5を形質転換した。形質転換はコンピテントセルDH5
（東洋紡製）を用いて公知の方法［モレキュラー クロ
ーニング（1982）］により行なった。形質転換の結果、
得られたアンピシリン耐性の菌株よりプラスミドDNA
（以下、pBαとする）を公知の方法にて調製した。

【０１０１】次にこのpBαをHindIIIとEcoRIで切断して
得られたラージフラグメントと、前述したPCR法で増幅
された1.6kbp DNA断片をHindIIIとEcoRIで切断したフラ
グメントをライゲーションした。ライゲーション後、前
述したようにこれを用いて大腸菌DHαを形質転換した。
得られた形質転換体より前述と同様にプラスミドを調製
した。このプラスミドをpBOαとし、以下の実験に用い
た。

【０１０２】次にpBOαの挿入DNA断片の下流に、酵母PG
K遺伝子のターミネーター配列を組み込んだ。そのため
にPGK遺伝子のターミネーター配列をPCR法で増幅し単離
した。鋳型DNAとしては酵母ゲノムDNAを、プライマーと
しては下記に示したプライマ−＃14、＃15を用いた。

【０１０３】 プライマ−＃14 5'-CCGAATTCATTGAATTGAATTGAAATCGATAGA-3' プライマ−＃15 5'-CCGGATCCGCATGCGATATCGGTTTTTCGAAACGCCAGAATTTTCGA-3'

【０１０４】増幅後、反応液をアガロース電気泳動して
増幅したDNA断片を確認して、これをMERMAID kitを用い
て抽出し回収した。その結果、約0.5μｇの約300bpのDN
A断片を得た。プライマ−＃14はEcoRIサイトをプライマ
−＃15はSphI、BamHIサイトを含んでおり、得られた断
片をEcoRIとBamHI（いずれも東洋紡製）で消化すること
により、PGK遺伝子のターミネーター配列の両端に、そ
れぞれEcoRIサイトとBamHIサイトを導入することができ
る。得られたPGK遺伝子のターミネーター断片を、EcoRI
とBamHIで消化し、これと前述のpBSαをEcoRIとBamHIで
消化したラージフラグメントを同様にライゲ−ションし
形質転換を行なった。得られたアンピシリン耐性の菌株
よりプラスミドDNAを調製し、これをpBOGSαとし、以下
の実験に供した。

【０１０５】このようにして作製された融合遺伝子が、
α因子の開始コドンであるメチオニンから順次アミノ酸
に翻訳されると、グリシン−バリン−セリン−ロイシン
−アスパラギン酸−リシン−アルギニン−バリン−アラ
ニン−グルタミン−イソロイシン−セリン−プロリンと
いう配列になる。このうち最初のグリシンから７番めの
アルギニンまではα因子のアミノ酸配列であり、８番め
のバリンからはBO成熟体のＮ末端領域のアミノ酸を示し
ていた。この配列中のリシン−アルギニンの配列はα因
子のシグナルペプチドがプロセッシングを受ける部分で
あり、この部分でBOタンパクが切りだされ分泌されるも
のと予想される。

【０１０６】プラスミドpBOGαをXhoIとSphIで消化して
アガロ−ス電気泳動し、約2.2kbpのDNA断片を確認し、
この断片をGENE CLEAN II kitにより回収した。このDNA
断片を、酵母−大腸菌のシャトルベクタ−であるpYES2
をXhoIとSphIで消化したラージフラグメントと前述の如
くライゲーションし、その反応液で大腸菌DH5を前述の
如くトランスフォーメーションした。

【０１０７】得られた形質転換体より前述の如くプラス
ミドを回収しこれをpYES−BOとした。図３にpYES−BOの
おおよその構造を示す。pYES2はXhoI、SphIサイトの上
流に酵母のGAL1遺伝子のプロモーターを持つプラスミド
で、XhoIサイト側に遺伝子の上流、SphIサイト側に遺伝
子の下流がくるような方向に遺伝子を挿入することで、
遺伝子がGAL1プロモーターで転写されうるようになる。
すなわちここで取得されたプラスミドでは、挿入された
DNA断片がGAL1プロモーターで転写されうる構造を有し
ていることになる。従って、このDNA断片がBOをコード
していれば、プラスミドを酵母に導入することでBOが発
現することが期待できる。

【０１０８】実施例３ 実施例１記載のプラスミドpUC−BOにおいてはBO遺伝子
のオープンリーディングフレームの5'側と3'側にpUC−1
9由来のEcoRI認識部位とSphI認識部位が存在する。この
EcoRI認識部位に次の２本鎖合成オリゴDNAを挿入しEcoR
I認識部位をXhoI認識部位に変換したプラスミドpUC−BO
Xを作成した。

【０１０９】 5'-AATTGCTCGAGATCGATCTAGAC-3' 3'-CGAGCTCTAGCTAGATCTGTTAA-5'

【０１１０】次に、このpUC−BOXからBO遺伝子を含む約
1.9KbpのXhoI−SphI断片を回収し、XhoIとSphIで切断し
た前述のプラスミドpYESにサブクローニングしプラスミ
ドpYES−FBOを得た。

【０１１１】実施例４ 実施例２及び実施例３で得られたプラスミドpYES−BO及
びpYES−FBOを用いて酵母SHY2を形質転換した。形質転
換の方法はLaboratory Course Manual for Methods In
Yeast Genetics（Cold Spring Harbor Laboratory）に
記載されている方法にしたがって行なった。

【０１１２】以下、プラスミドpYES−BOを用いた場合に
ついて詳細に記載する。SHY2の性状は（α、ste−VC9、
ura3−52、trp1−289、leu2−３、leu2−112、his3−
１、can1−100）であり、この株はロイシンの存在しな
い培地では成育できない。この株がpYES2−BOを保持す
ればpYES−BOの持つロイシン合成遺伝子の働きによりロ
イシンが含まれていない培地でも成育できる、いわゆる
ロイシン非要求性の株となる。従って、pYES−BOによる
形質転換体の酵母はロイシン非要求性となる。

【０１１３】形質転換を行なった結果、５個の形質転換
体が得られ、そのうちBO2株とした形質転換体酵母を以
下の実験に供した。

【０１１４】BO2株の培養は次のようにして行なった。B
O2株を下記組成のSDG培地10mlに接種して一晩30℃で前
培養した。

【０１１５】 0.67 ％ bacto yeast nitrogen base（w/o amino acids） ２ ％ ガラクトース 0.002％ ウラシル 0.002％ ヒスチジン 0.002％ トリプトファン

【０１１６】前培養液0.5mlを100mlのSDG培地に接種し
て、30℃で一晩振とう培養しOD₆₁₀を経時的に測定し
た。

【０１１７】OD₆₁₀が4.0に達した時点で培養をやめ、遠
心分離（8000×ｇ、10分）により菌体を取り除き、培養
上清を回収して以下の実験に供した。またコントロール
としては、pYES2で形質転換されたSHY2（以下、コント
ロール株とする）に上記と同じ操作を行なって回収され
た培養上清を用いた。

【０１１８】培養上清中に発現したBOが含まれているか
を調べるために、まずBO2株とコントロール株の培養上
清をそれぞれCentrifugal Ultrafree−20（分子量10,00
0カット、ミリポア社製）による限外濃縮により約50倍
に濃縮した。また、回収した菌体は５mlの50mM トリス
−塩酸緩衝液（pH7.0）−１mM PMSFに懸濁し、ボール
ミル破砕機（ビーブラウンテック製）により破砕した。
破砕後懸濁液を遠心分離し上清を菌体内画分として使用
した。

【０１１９】次に、培養上清中のBO遺伝子の発現を調べ
るために、菌体内画分と培養上清画分のBO活性の測定を
行なった。BO活性の測定は以下のようにして行った。0.
1mg／mlのビリルビン（シグマ社製）を１mM EDTA−0.2
Ｍ Tris・HCl（pH8.0）に溶解した溶液１mlとサンプル
0.1mlを混合して、37℃で20分反応後、ブランクとの吸
光度の差の有無により活性の存在を判定する。尚、各サ
ンプルは、以下のようにして調製した。

【０１２０】 サンプルＡ：BO2株の培養上清を濃縮（50倍） サンプルＢ：BO2株の菌体を破砕後濃縮（20倍） サンプルＣ：コントロール株の培養上清を濃縮（50倍） サンプルＤ：コントロール株の菌体を破砕後濃縮（20倍）

【０１２１】BO活性があればビリルビンの吸光度のピー
クが減少するはずである。その結果を、図４及び図５に
示した。培養上清を用いた実験では、コントロール株の
培養上清を加えた場合、ビリルビンの吸光度のピークは
減少しなかった。このとき、この上清にミロセシウム属
由来のBO（天野製薬製）を加えると、ビリルビンのピー
クは著しく減少した。

【０１２２】以上のことから、コントロール株の培養上
清はBO活性を示すものを含んでいないし、カビBOの活性
を完全に阻害するものも含んでいないことが明らかとな
った。従って、SHY2に導入したDNA断片が発現して組み
換えBOが分泌されていれば、その活性を検出できること
になる。

【０１２３】BO２株の培養上清を加えた実験では、図５
から明らかなようにビリルビンの吸光度のピークが著し
く減少した。すなわち、導入したDNA断片の存在に依存
して培養上清にBO活性が検出できた。菌体内画分を用い
た実験においても同様に導入したcDNAの存在に依存して
BO活性が検出された。

【０１２４】次にこのビリルビン分解活性が発現したBO
によるものであることをウエスタンブロットを用いた解
析により更に確認した。前述の如く調製されたコントロ
ール株とBO2株の培養上清濃縮液をそれぞれSDS-PAGE電
気泳動した。SDS-PAGE電気泳動はMolecular Cloningに
記載されている方法に準じて行なった。電気泳動後、ゲ
ル上に分離されたタンパクバンドをPVDF膜（ミリポア社
製）にMultiphor II（LKB社製）を用いて電気的にトラ
ンスファーした。その後このPVDF膜と抗BOウサギ血清を
用いて、Amplified Alkaline Phosphatase Goat Anti-R
abbit Immun-Blot Assay Kit（バイオラッド社製）によ
りウエスタンブロットを行なった。ウエスタンブロット
の方法はキットに添付されている説明書にしたがって行
なった。その結果を図６に示した。

【０１２５】レーン２にはカビ由来BOがアプライされて
おり、約60kDaの位置にバンドが検出された。コントロ
ール株の培養上清濃縮液を流したレーン４では60kDaの
位置にはバンドは観察されなかった。この時BO２株の培
養上清濃縮液を流したレーン３では図６より明らかなよ
うに60kDaの位置にバンドが観察された。したがって、
遺伝子の存在に依存してBOと同じサイズのBOと同じ抗原
性を有するバンドが観察されたことになる。このバンド
は発現された組み換えBOに由来するものと考えられる。

【０１２６】以上のことから導入されたDNA断片がBOタ
ンパクをコードする遺伝子断片であると示唆され、得ら
れた遺伝子断片がBOをコードするBO遺伝子であることが
明らかとなった。

【０１２７】プラスミドpYES−FBOで酵母SHY2を形質転
換し、得られた形質転換酵母を上述したと同様にSDG培
地を用いて培養した。菌体内画分において上記と同様に
成熟BO蛋白の発現が確認された。

【０１２８】

【発明の効果】本発明により、BOをコードする遺伝子が
提供され、該遺伝子を組み込んだ形質転換体を培養する
ことにBOを製造することができる。このようにして製造
されたBOは、分析用酵素として利用され、産業上に大き
く貢献できる。

【０１２９】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：５３４ 配列の型：アミノ酸 配列 Val Ala Gln Ile Ser Pro Gln Tyr Pro Met Phe Thr Val Pro Leu 15 Pro Ile Pro Pro Val Lys Gln Pro Arg Leu Thr Val Thr Asn Pro 30 Val Asn Gly Gln Glu Ile Trp Tyr Tyr Glu Val Glu Ile Lys Pro 45 Phe Thr His Gln Val Tyr Pro Asp Leu Gly Ser Ala Asp Leu Val 60 Gly Tyr Asp Gly Met Ser Pro Gly Pro Thr Phe Gln Val Pro Arg 75 Gly Val Glu Thr Val Val Arg Phe Ile Asn Asn Ala Glu Ala Pro 90 Asn Ser Val His Leu His Gly Ser Phe Ser Arg Ala Ala Phe Asp 105 Gly Trp Ala Glu Asp Ile Thr Glu Pro Gly Ser Phe Lys Asp Tyr 120 Tyr Tyr Pro Asn Arg Gln Ser Ala Arg Thr Leu Trp Tyr His Asp 135 His Ala Met His Ile Thr Ala Glu Asn Ala Tyr Arg Gly Gln Ala 150 Gly Leu Tyr Met Leu Thr Asp Pro Ala Glu Asp Ala Leu Asn Leu 165 Pro Ser Gly Tyr Gly Glu Phe Asp Ile Pro Met Ile Leu Thr Ser 180 Lys Gln Tyr Thr Ala Asn Gly Asn Leu Val Thr Thr Asn Gly Glu 195 Leu Asn Ser Phe Trp Gly Asp Val Ile His Val Asn Gly Gln Pro 210 Trp Pro Phe Lys Asn Val Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Phe 225 Leu Asp Ala Ala Val Ser Arg Ser Phe Gly Leu Tyr Phe Ala Asp 240 Thr Asp Ala Ile Asp Thr Arg Leu Pro Phe Lys Val Ile Ala Ser 255 Asp Ser Gly Leu Leu Glu His Pro Ala Asp Thr Ser Leu Leu Tyr 270 Ile Ser Met Ala Glu Arg Tyr Glu Val Val Phe Asp Phe Ser Asp 285 Tyr Ala Gly Lys Thr Ile Glu Leu Arg Asn Leu Gly Gly Ser Ile 300 Gly Gly Ile Gly Thr Asp Thr Asp Tyr Asp Asn Thr Asp Lys Val 315 Met Arg Phe Val Val Ala Asp Asp Thr Thr Gln Pro Asp Thr Ser 330 Val Val Pro Ala Asn Leu Arg Asp Val Pro Phe Pro Ser Pro Thr 345 Thr Asn Thr Pro Arg Gln Phe Arg Phe Gly Arg Thr Gly Pro Thr 360 Trp Thr Ile Asn Gly Val Ala Phe Ala Asp Val Gln Asn Arg Leu 375 Leu Ala Asn Val Pro Val Gly Thr Val Glu Arg Trp Glu Leu Ile 390 Asn Ala Gly Asn Gly Trp Thr His Pro Ile His Ile His Leu Val 405 Asp Phe Lys Val Ile Ser Arg Thr Ser Gly Asn Asn Ala Arg Thr 420 Val Met Pro Tyr Glu Ser Gly Leu Lys Asp Val Val Trp Leu Gly 435 Arg Arg Glu Thr Val Val Val Glu Ala His Tyr Ala Pro Phe Pro 450 Gly Val Tyr Met Phe His Cys His Asn Leu Ile His Glu Asp His 465 Asp Met Met Ala Ala Phe Asn Ala Thr Val Leu Pro Asp Tyr Gly 480 Tyr Asn Ala Thr Val Phe Val Asp Pro Met Glu Glu Leu Trp Gln 495 Ala Arg Pro Tyr Glu Leu Gly Glu Phe Gln Ala Gln Ser Gly Gln 510 Phe Ser Val Gln Ala Val Thr Glu Arg Ile Gln Thr Met Ala Glu 525 Tyr Arg Pro Tyr Ala Ala Ala Asp Glu 534

【０１３０】 配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 配列 Val Ala Gln Ile Ser Pro Gln Tyr Pro Met Phe Thr Val Pro Leu 15 Pro Ile Pro Pro Val Lys Gln Pro Arg Leu 25

【０１３１】 配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 配列 Ile Gln Thr Met Ala Glu Tyr Arg Pro Tyr Ala Ala 12

【０１３２】 配列番号：４ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Asp Tyr Tyr Tyr Pro Asn Arg 7

【０１３３】 配列番号：５ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 配列 Val Pro Phe Pro Ser Pro Thr Thr 8

【０１３４】 配列番号：６ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 配列 Leu Thr Val Thr Asn Pro Val Asn Gly Gln Glu Ile Trp Tyr Tyr 15 Glu Val 17

【０１３５】 配列番号：７ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 配列 Tyr Arg Pro Tyr Ala Ala Ala Asp Glu 9

【０１３６】 配列番号：８ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 配列 Phe Ser Asp Tyr Ala Gly Lys Thr Ile Glu 10

【０１３７】 配列番号：９ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 配列 Leu Trp Gln Ala Arg Pro Tyr Glu 8

【０１３８】 配列番号：１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 配列 Phe Gln Ala Gln Ser Gly Gln Phe Ser Val Gln Ala Val Thr Glu 15

【０１３９】 配列番号：１１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 配列 Thr Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met His 10

【０１４０】 配列番号：１２ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 配列 Asn Ala Tyr Arg Gly Gln Ala Gly Leu Tyr Met Leu Thr Asp Pro 15 Ala Glu Asp Ala Leu Asn Leu Pro Ser Gly Tyr Gly Glu 28

【０１４１】 配列番号：１３ 配列の長さ：１９５９ 配列の型：核酸 配列 ACCAGACAAA CTTGAGCTTG CTTGACTCGG AGTCCTTTAG TTTTGCCTTT CATTTACAGT 60 CCAAG ATG TTC AAA CAC ACA CTT GGA GCT GCT GCC CTC AGC TTG CTT 107 Met Phe Lys His Thr Leu Gly Ala Ala Ala Leu Ser Leu Leu -38 -35 -30 -25 TTC AAC AGC AAT GCT GTC CAG GCA AGC CCC GTC CCC GAG ACC TCA CCG 155 Phe Asn Ser Asn Ala Val Gln Ala Ser Pro Val Pro Glu Thr Ser Pro -20 -15 -10 GCA ACT GGA CAT CTC TTC AAG CGA GTT GCC CAG ATC AGC CCA CAG TAT 203 Ala Thr Gly His Leu Phe Lys Arg Val Ala Gln Ile Ser Pro Gln Tyr -5 1 5 CCC ATG TTC ACA GTA CCA CTG CCA ATT CCT CCT GTT AAG CAG CCC CGC 251Pro Met Phe Thr Val Pro Leu Pro Ile Pro Pro Val Lys Gln Pro Arg 10 15 20 TTG ACT GTA ACC AAT CCT GTG AAT GGA CAA GAG ATC TGG TAC TAT GAG 299Leu Thr Val Thr Asn Pro Val Asn Gly Gln Glu Ile Trp Tyr Tyr Glu 25 30 35 40 GTC GAG ATC AAG CCC TTC ACT CAC CAG GTT TAC CCT GAC CTT GGA TCC 347 Val Glu Ile Lys Pro Phe Thr His Gln Val Tyr Pro Asp Leu Gly Ser 45 50 55 GCT GAT CTG GTC GGG TAT GAT GGA ATG TCT CCT GGC CCT ACT TTC CAG 395 Ala Asp Leu Val Gly Tyr Asp Gly Met Ser Pro Gly Pro Thr Phe Gln 60 65 70 GTT CCT CGT GGA GTT GAA ACA GTT GTC CGC TTC ATT AAC AAT GCT GAG 443 Val Pro Arg Gly Val Glu Thr Val Val Arg Phe Ile Asn Asn Ala Glu 75 80 85 GCT CCT AAC TCC GTT CAC CTG CAC GGA TCA TTC TCT CGT GCC GCC TTT 491 Ala Pro Asn Ser Val His Leu His Gly Ser Phe Ser Arg Ala Ala Phe 90 95 100 GAC GGA TGG GCA GAG GAC ATC ACC GAG CCT GGC AGC TTC AAA GAC TAT 539 Asp Gly Trp Ala Glu Asp Ile Thr Glu Pro Gly Ser Phe Lys Asp Tyr 105 110 115 120 TAC TAC CCA AAT AGA CAG TCT GCT CGT ACC CTA TGG TAC CAC GAT CAT 587Tyr Tyr Pro Asn Arg Gln Ser Ala Arg Thr Leu Trp Tyr His Asp His 125 130 135 GCT ATG CAT ATC ACT GCT GAG AAC GCC TAC CGT GGC CAG GCT GGT CTC 635Ala Met His Ile Thr Ala Glu Asn Ala Tyr Arg Gly Gln Ala Gly Leu 140 145 150 TAC ATG CTC ACT GAC CCA GCC GAA GAC GCT CTC AAC TTG CCA AGT GGA 683Tyr Met Leu Thr Asp Pro Ala Glu Asp Ala Leu Asn Leu Pro Ser Gly 155 160 165 TAT GGC GAG TTC GAT ATT CCA ATG ATC CTC ACG TCC AAG CAA TAT ACC 731Tyr Gly Glu Phe Asp Ile Pro Met Ile Leu Thr Ser Lys Gln Tyr Thr 170 175 180 GCA AAC GGC AAC TTG GTC ACC ACT AAT GGA GAG CTG AAC TCA TTC TGG 779 Ala Asn Gly Asn Leu Val Thr Thr Asn Gly Glu Leu Asn Ser Phe Trp 185 190 195 200 GGT GAT GTA ATT CAC GTG AAC GGT CAA CCC TGG CCT TTC AAG AAC GTT 827 Gly Asp Val Ile His Val Asn Gly Gln Pro Trp Pro Phe Lys Asn Val 205 210 215 GAG CCT CGC AAA TAT CGA TTC CGC TTC CTC GAT GCC GCA GTT TCT CGC 875 Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Phe Leu Asp Ala Ala Val Ser Arg 220 225 230 TCT TTC GGC CTT TAC TTT GCT GAT ACT GAT GCT ATC GAC ACT CGC TTG 923 Ser Phe Gly Leu Tyr Phe Ala Asp Thr Asp Ala Ile Asp Thr Arg Leu 235 240 245 CCT TTC AAG GTT ATT GCC TCC GAT TCT GGT CTT CTT GAA CAC CCT GCC 971 Pro Phe Lys Val Ile Ala Ser Asp Ser Gly Leu Leu Glu His Pro Ala 250 255 260 GAT ACC AGC TTG CTG TAC ATT TCC ATG GCC GAG CGT TAC GAA GTT GTG 1019 Asp Thr Ser Leu Leu Tyr Ile Ser Met Ala Glu Arg Tyr Glu Val Val 265 270 275 280 TTT GAC TTC TCC GAC TAT GCT GGC AAG ACT ATT GAA CTC CGC AAC CTG 1067 Phe Asp Phe Ser Asp Tyr Ala Gly Lys Thr Ile Glu Leu Arg Asn Leu 285 290 295 GGC GGT AGC ATT GGC GGC ATC GGA ACA GAT ACC GAC TAT GAC AAC ACC 1115 Gly Gly Ser Ile Gly Gly Ile Gly Thr Asp Thr Asp Tyr Asp Asn Thr 300 305 310 GAC AAG GTC ATG CGT TTC GTG GTA GCA GAC GAC ACA ACT CAG CCA GAT 1163 Asp Lys Val Met Arg Phe Val Val Ala Asp Asp Thr Thr Gln Pro Asp 315 320 325 ACC TCA GTT GTT CCT GCT AAC CTT CGT GAT GTT CCC TTC CCC TCT CCC 1211 Thr Ser Val Val Pro Ala Asn Leu Arg Asp Val Pro Phe Pro Ser Pro 330 335 340 ACC ACA AAC ACC CCC CGA CAG TTC CGC TTT GGT CGC ACC GGT CCT ACC 1259Thr Thr Asn Thr Pro Arg Gln Phe Arg Phe Gly Arg Thr Gly Pro Thr 345 350 355 360 TGG ACT ATT AAT GGT GTT GCT TTT GCT GAT GTT CAA AAC CGT CTG CTT 1307 Trp Thr Ile Asn Gly Val Ala Phe Ala Asp Val Gln Asn Arg Leu Leu 365 370 375 GCA AAC GTA CCC GTT GGT ACT GTC GAG CGT TGG GAG CTC ATC AAC GCC 1355 Ala Asn Val Pro Val Gly Thr Val Glu Arg Trp Glu Leu Ile Asn Ala 380 385 390 GGT AAC GGT TGG ACG CAC CCT ATT CAC ATC CAT CTT GTC GAC TTC AAG 1403 Gly Asn Gly Trp Thr His Pro Ile His Ile His Leu Val Asp Phe Lys 395 400 405 GTG ATT TCT CGT ACT TCC GGC AAC AAC GCG CGC ACA GTC ATG CCA TAC 1451 Val Ile Ser Arg Thr Ser Gly Asn Asn Ala Arg Thr Val Met Pro Tyr 410 415 420 GAG TCC GGT CTC AAA GAC GTT GTC TGG CTT GGT CGC CGT GAA ACT GTG 1499 Glu Ser Gly Leu Lys Asp Val Val Trp Leu Gly Arg Arg Glu Thr Val 425 430 435 440 GTT GTT GAG GCT CAT TAC GCG CCT TTC CCT GGT GTA TAC ATG TTC CAT 1547 Val Val Glu Ala His Tyr Ala Pro Phe Pro Gly Val Tyr Met Phe His 445 450 455 TGC CAC AAT TTG ATT CAC GAG GAT CAC GAT ATG ATG GCT GCC TTT AAC 1595 Cys His Asn Leu Ile His Glu Asp His Asp Met Met Ala Ala Phe Asn 460 465 470 GCC ACC GTC CTG CCA GAT TAT GGC TAT AAT GCC ACT GTT TTC GTT GAC 1643 Ala Thr Val Leu Pro Asp Tyr Gly Tyr Asn Ala Thr Val Phe Val Asp 475 480 485 CCT ATG GAA GAG CTT TGG CAG GCT CGT CCT TAT GAA CTC GGC GAG TTC 1691 Pro Met Glu Glu Leu Trp Gln Ala Arg Pro Tyr Glu Leu Gly Glu Phe 490 495 500 CAG GCT CAG AGT GGC CAG TTC AGC GTT CAG GCT GTT ACT GAG CGT ATT 1739Gln Ala Gln Ser Gly Gln Phe Ser Val Gln Ala Val Thr Glu Arg Ile 505 510 515 520 CAG ACT ATG GCT GAA TAC AGA CCT TAC GCC GCA GCT GAC GAG 1781Gln Thr Met Ala Glu Tyr Arg Pro Tyr Ala Ala Ala Asp Glu 525 330 534 TAGAAACATA CCAGGTATGG TATTGATGAA GGAAGCCAGG AAATCTCATG AATAACTTGT 1841 ATCTATTCCA TTCGTGCTAC ACCATATAGG CCATGACCTG CAGCTAGACT GTTAGGCTGA 1901 GCATCACTTT TTACCGCTGA TATGGAGACT ACATTTGAAG GAAAAAAAAA AAAAAAAA 1959

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpUCBO-A、プラスミドpUCBO-B、プラ
スミドpUCBO-C及びプラスミドpUC-BOの制限酵素地図を
示す。

【図２】ノザンブロティングのパターンを示す。

【図３】プラスミドpYES-BOのおおよその構造を示す。

【図４】BO2株及びコントロール株の培養上清中のBO活
性の測定結果を示す。図中ではビリルビンを、はビ
リルビン＋サンプルＣをはビリルビン＋サンプルＣ＋
ビリルビンオキシダーゼを、はビリルビン＋サンプル
Ａの結果を示す。

【図５】BO2株及びコントロール株の菌体中のBO活性の
測定結果を示す。図中ではビリルビンを、はビリル
ビン＋サンプルＤをはビリルビン＋サンプルＤ＋ビリ
ルビンオキシダーゼを、はビリルビン＋サンプルＢの
結果を示す。

【図６】BO2株及びコントロール株の培養上清濃縮液に
よるウエスタンブロットの結果を示す。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/19 C12N 9/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１３に示すアミノ酸配列を有す
   るプレプロ領域を含むビリルビンオキシダーゼをコード
   する塩基配列を含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】配列番号：１に示すアミノ酸配列をコード
   する塩基配列を含むＤＮＡ。
3. 【請求項３】配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する
   ビリルビンオキシダーゼをコードする塩基配列を複製可
   能な発現ベクターに連結し、該塩基配列と複製可能な発
   現ベクターとを含有する複製可能な組換えＤＮＡ。
4. 【請求項４】配列番号：１３に示すアミノ酸配列を有す
   るプレプロ領域を含むビリルビンオキシダーゼをコード
   する塩基配列を複製可能な発現ベクターに連結し、該塩
   基配列と複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能
   な組換えＤＮＡ。
5. 【請求項５】配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する
   ビリルビンオキシダーゼをコードする塩基配列を複製可
   能な発現ベクターに連結し、該塩基配列と複製可能な発
   現ベクターとを含有する複製可能な組換えＤＮＡを得、
   該組換えＤＮＡで微生物を形質転換した形質転換体。
6. 【請求項６】配列番号：１３に示すアミノ酸配列を有す
   るプレプロ領域を含むビリルビンオキシダーゼをコード
   する塩基配列を複製可能な発現ベクターに連結し、該塩
   基配列と複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能
   な組換えＤＮＡを得、該組換えＤＮＡで微生物を形質転
   換した形質転換体。
7. 【請求項７】配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する
   ビリルビンオキシダーゼをコードする塩基配列を含むＤ
   ＮＡをベクターに組み込んだ組換えＤＮＡを微生物に導
   入し、該微生物を培養し、ビリルビンオキシダーゼを培
   養物中に産生せしめ、該培養物中よりビリルビンオキシ
   ダーゼを採取することを特徴とするビリルビンオキシダ
   ーゼの製造法。
8. 【請求項８】配列番号：１３に示すアミノ酸配列を有す
   るプレプロ領域を含むビリルビンオキシダーゼをコード
   する塩基配列を含むＤＮＡをベクターに組み込んだ組換
   えＤＮＡを微生物に導入し、該微生物を培養し、ビリル
   ビンオキシダーゼを培養物中に産生せしめ、該培養物中
   よりビリルビンオキシダーゼを採取することを特徴とす
   るビリルビンオキシダーゼの製造法。