DE69925635T2

DE69925635T2 - Phenol oxidierende enzyme von pilzen

Info

Publication number: DE69925635T2
Application number: DE69925635T
Authority: DE
Inventors: Huaming Wang; A. Elizabeth BODIE
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2019-12-21
Also published as: EP1141321A2; MXPA01006388A; AU2391200A; US6399329B1; BR9916527A; CA2357577A1; DE69925635D1; WO2000039306A2; ATE296889T1; BR9916836A; CA2355131A1; EP1141322A2; WO2000037654A2; US6509307B1; ID29971A; WO2000037654A3; AU2433700A; WO2000039306A3; CA2357577C; TR200101963T2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue, phenoloxidierende Enzyme, insbesondere neue phenoloxidierende Enzyme, die aus einem Pilz erhältlich sind. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Wirtszellen zur Expression des phenoloxidierenden Enzyms sowie Verfahren zur Herstellung von Expressionssystemen, die phenoloxidierende Enzyme umfassen, bereit.
Hintergrund der Erfindung
Phenoloxidierende Enzyme funktionieren durch Katalysieren von Redoxreaktionen, d.h. den Transfer von Elektronen von einem Elektronendonor (üblicherweise einer Phenolverbindung) zu molekularem Sauerstoff (der als ein Elektronenakzeptor wirkt), der zu H20 reduziert wird. Während sie in der Lage sind, zahlreiche verschiedene Phenolverbindung als Elektronendonoren zu verwenden, sind phenoloxidierende Enzyme sehr spezifisch für molekularen Sauerstoff als Elektronenakzeptor.
Phenoloxidierende Enzyme können für zahlreiche verschiedene Anwendungsbereiche verwendet werden, einschließlich der Waschmittelindustrie, der Papier- und Zellstoffindustrie, der Textilindustrie und der Nahrungsmittelindustrie. In der Waschmittelindustrie wurden phenoloxidierende Enzyme bisher zum Unterbinden der Übertragung von Farbstoffen in Lösung von einer Textilie zur nächsten während des Waschens mit dem Waschmittel verwendet, eine Anwendung, die üblicherweise aus Farbstoffübertragungshemmung bezeichnet wird.
Die meisten phenoloxidierenden Enzyme weisen pH-Optima im sauren Bereich auf, während sie im neutralen oder basischen pH-Bereich inaktiv sind.
Phenoloxidierende Enzyme sind bekannt dafür, dass sie von einer breiten Palette an Pilzen, einschließlich Spezies der Genera Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botytis, Pleurotus, Fomes, Phlebia, Trametes, Polyporus, Rhizoctonia und Lentinus, produziert werden. Es bleibt jedoch Bedarf daran bestehen, phenoloxidierende Enzyme und Organismen, die in der Lage sind, phenoloxidierende Enzyme natürlich zu produzieren, zur Verwendung in Textil, Reinigungs- und Waschmittelwaschverfahren und -zusammensetzungen zu identifizieren und zu isolieren.
Koikeda et al., J. Biol. Chem. 268(25), 18801 (1993), offenbaren eine Bilirubinoxidase aus Myrothecium verrucaria. Die EP 0852260 A offenbart eine Polyphenoloxidase aus Myrothecium spp. Die WO 99/49020 (relevant nur unter Art. 54(3)(4) EPC) offenbart Phenoloxidaseenzyme aus Stachybotris.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue phenoloxidierende Enzyme wie in den Ansprüchen definiert, die in der Lage sind, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. In veranschaulichenden Ausführungsformen, die hierin offenbart sind, sind die phenoloxidierenden Enzyme aus Pilzen erhältlich. Die phenoloxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung können beispielsweise zum Zellstoff- und Papierbleichen, zum Bleichen der Farbe von Flecken auf Textilien und zur Anti-Farbstoffübertragung in Waschmittel- und Textilanwendungen verwendet werden. Die phenoloxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung können in der Lage sein, die Farbe in Abwesenheit eines Enhancers oder in Gegenwart eines Enhancers zu modifizieren.
In einer Ausführungsform ist das phenoloxidierende Enzym aus Bakterien, Hefe oder Nicht-Stachybotrys-Spezies von Pilzen erhältlich. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das phenoloxidierende Enzym aus Pilzen einschließlich Myrothecium-Spezies, Curvularia-Spezies, Chaetomium-Spezies, Bipolaris-Spezies, Humicola-Spezies, Pleurotus-Spezies, Trichoderma-Spezies, Mycellophthora-Spezies und Amerosporium-Spezies erhältlich. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Pilz Myrothecium verrucaria, Curvularia pallescens, Chaetomium sp., Bipolaris spicifera, Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei, Mycellophthora thermophila und Amerosporium atrium.
In einer hierin offenbarten, veranschaulichenden Ausführungsform ist das phenoloxidierende Enzym aus Bipolaris spicifera erhältlich und weist die in 2 gezeigte genomische Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3) und die in 3 gezeigte abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 4) auf. In einer anderen, hierin offenbarten, veranschaulichenden Ausführungsform ist das phenoloxidierende Enzym aus Curvularia pallescens erhältlich und weist die in 9 gezeigte genomische Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 6) und die in 10 gezeigte abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 7) auf. In einer anderen, hierin offenbarten, veranschaulichenden Ausführungsform ist das phenoloxidierende Enzym aus Amerosporium atrum erhältlich und umfasst die in 13 gezeigte Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 8) und die in 13 gezeigte abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 9).
Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung phenoloxidierende Enzyme, für die Polynucleotidsequenzen kodieren, die unter hochstringenten Bedingungen an die Nucleinsäure mit der in Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 6 oder Seq.-ID Nr. 8 gezeigten Sequenz hybridisieren und in der Lage sind, die mit einem Farbstoff oder einer farbigen Verbindung assoziierte Farbe zu modifizieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polynucleotide, die für die in Seq.-ID Nr.4 gezeigte Aminosäuresequenz kodieren, sowie Polynucleotide, die für die in Seq.-ID Nr. 7 gezeigte Aminosäuresequenz kodieren, und Polynucleotide, die für die in Seq.-ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz kodieren. Die vorliegende Erfindung stellt Expressionsvektoren und Wirtszellen bereit, die Polynucleotide umfassen, die für phenoloxidierende Enzyme der vorliegenden Erfindung kodieren, sowie Verfahren zur Herstellung der Enzyme.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines phenoloxidierenden Enzyms bereit, das folgende Schritte umfasst: das Erhalten einer Wirtszelle, die ein Polynucleotid umfasst, das in der Lage ist, unter hochstringenten Bedingungen an Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 6 oder Seq.-ID Nr. 8 zu hybridisieren, worin dieses Polynucleotid für ein phenoloxidierendes Enzym kodiert, das in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren; das Züchten dieser Wirtszelle unter für die Produktion dieses phenoloxidierenden Enzyms geeigneten Bedingungen; und gegebenenfalls die Gewinnung dieses produzierten phenoloxidierenden Enzyms. In einer Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 3 gezeigte Sequenz; in einer anderen Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 6 gezeigte Sequenz; und in einer anderen Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 8 gezeigte Sequenz. In einer anderen Ausführungsform umfasst das phenoloxidierende Enzym die in Seq.-ID Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz; in einer weiteren Ausführungsform umfasst das phenoloxidierende Enzym die in Seq.-ID Nr. 7 gezeigte Aminosäuresequenz; und in wiederum einer anderen Ausführungsform umfasst das phenoloxidierende Enzym die in Seq.-ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle bereit, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein phenoloxidierendes Enzym kodiert, umfassend die Schritte des Erhaltens eines Polynucleotids, das in der Lage ist, unter hochstringenten Bedingungen an Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 6 oder Seq.-ID Nr. 8 zu hybridisieren, worin dieses Polynucleotid für ein phenoloxidierendes Enzym kodiert, das in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren; des Einführens dieses Polynucleotids in die Wirtszelle; und des Züchtens der Wirtszelle unter für die Produktion des phenoloxidierenden Enzyms geeigneten Bedingungen. In einer Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 3 gezeigte Sequenz. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 6 gezeigte Sequenz. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 8 gezeigte Sequenz.
In der vorliegenden Erfindung umfasst die Wirtszelle, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein phenoloxidierendes Enzym kodiert, Fadenpilze, Hefe und Bakterien. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Fadenpilz, einschließlich Aspergillus-Spezies, Trichoderma-Spezies und Mucor-Spezies. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Fadenpilz-Wirtszelle Aspergillus niger var. awamori oder Trichoderma reesei.
In wiederum einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle eine Hefe, die Saccharomyces-, Pichia-, Hansenula-, Schizosaccharomyces-, Kluyveromyces- und Yarrowia-Spezies umfasst. In einer zusätzlichen Ausführungsform ist die Saccharmoyces-Spezies Saccharomyces cerevisiae. In wiederum einer anderen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine grampositive Bakterie, wie beispielsweise eine Bacillus-Spezies, oder eine gramnegative Bakteria, wie beispielsweise eine Escherichia-Spezies.
Auch hierin bereitgestellt sind Waschmittelzusammensetzungen, umfassend ein phenoloxidierendes Enzym der Erfindung. In einer Ausführungsform der Waschmittelzusammensetzung umfasst die Aminosäure die in Seq.-ID Nr. 4 gezeigte Sequenz. In einer anderen Ausführungsform der Waschmittelzusammensetzung umfasst die Aminosäure die in Seq.-ID Nr. 7 gezeigte Sequenz. In einer weiteren Ausführungsform der Waschmittelzusammensetzung umfasst die Aminosäure die in Seq.-ID Nr. 9 gezeigte Sequenz.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zur Modifikation der mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen, die in Flecken in einer Probe auftreten, assoziierten Farbe, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einer Zusammensetzung, die ein phenoloxidierendes Enzym der Erfindung umfasst. In einer Ausführungsform des Verfahrens umfasst die Aminosäure die in Seq.-ID Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Aminosäure die in Seq.-ID Nr. 7 gezeigte Aminosäuresequenz. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Aminosäure die in Seq.-ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die genomische Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 1), die für ein aus Stachybotrys chartarum erhältliches, phenoloxidierendes Enzym kodiert.
2 zeigt die genomische Sequenz (Seq.-ID Nr. 3), die für ein aus Bipolaris spicifera erhältliches, phenoloxidierendes Enzym kodiert.
3 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 4) für ein aus Bipolaris spicifera erhältliches, phenoloxidierendes Enzym.
4 ist ein Aminosäureabgleich von phenoloxidierendem Enzym, erhältlich aus Stachybotrys chartarum (Seq.-ID Nr. 2) (obere Linie), und Bipolaris spicifera (Seq.-ID Nr. 4).
5 ist eine cDNA- (Seq.-ID Nr. 5) und Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), erhältlich aus Stachybotrys chartarum.
6 ist eine Darstellung des Southern-Hybridisierungsverfahrens, das in Beispiel IV beschrieben wird. Die genomische DNA wurde aus den folgenden Stämmen isoliert: Stachybotrys chartarum (Spur 1 und 2), Myrothecium verruvaria (Spur 3 und 4), Curvalaria pallescens (Spur 5 und 6), Myrothecium cinctum (Spur 7 und 8), Pleurotus eryngii (Spur 9 und 10), Humicola insulas (Spur 11 und 12). Die genomische DNA wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI (Spur 1, 3, 5, 7, 9, 11) oder HindIII (Spur 2, 4, 6, 8, 10 und 12) verdaut. Die zur Southern-Analyse verwendete DNA-Sonde wurde aus einem genomischen Fragment von Stachybotrys chartarum isoliert, das durch PCR gebildet wurde und den inneren Teil der Gene mit einer Größe von mehr als 1 kb abdeckt. Dieselbe DNA-Sonde wurde in den Southern-Hybridisierungsverfahren verwendet, die in den 7, 8 und 9 veranschaulicht sind.
7 ist eine Darstellung des Southern-Hybridisierungsverfahrens, das in Beispiel IV beschrieben wird. Die genomische DNA wurde aus den folgenden Stämmen isoliert: Stachybotrys chartarum (Spur 1 und 2), Aspergillus niger (Spur 3 und 4), Corpinus cineras (Spur 5 und 6), Mycellophthora thermophila (Spur 7 und 8), Pleurotus abalonus (Spur 9 und 10), Trichoderma reesei (Spur 11 und 12). Die genomische DNA wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI (Spur 1, 3, 5, 7, 9, 11) oder HindIII (Spur 2, 4, 6, 8, 10 und 12) verdaut.
8 ist eine Darstellung des Southern-Hybridisierungsverfahrens, das in Beispiel IV beschrieben wird. Die genomische DNA wurde aus den folgenden Stämmen isoliert: Stachybotrys chartarum (Spur 1); Trametes vesicolor (Spur 2 und 3); Amerosporium atrum (Spur 6 und 7); Bipolaris spicifera (Spur 8 und 9); Chaetomium sp (Spur 10 und 11). Die genomische DNA wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI (Spur 1, 2, 8 und 10) oder HindIII (Spur 3, 9 und 11) verdaut.
9 zeigt die genomische Nucleinsäuresequenz eines phenoloxidierenden Enzyms, das aus Curvularia pallescens erhältlich ist, von der Translationsstartstelle bis zur Translationsstoppstelle.
10 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz des phenoloxidierenden Enzyms, das aus Curvularia pallescens erhältlich ist.
11 zeigt einen Aminosäureabgleich zwischen der in Seq.-ID Nr. 4 gezeigten, aus Bipolaris spicifera erhältlichen Aminosäuresequenz (untere Linie) und der in Seq.-ID Nr. 7 gezeigten, aus Curvularia pallescens erhältlichen Aminosäuresequenz (obere Linie).
12 zeigt das pH-Profil von Bipolaris spicifera, gemessen bei 470 nm unter Verwendung von Guajacol als Substrat.
13 zeigt die Amerosporium-atrum-Aminosäure- (Seq.-ID Nr. 8) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 9).
14 zeigt einen Aminosäureabgleich zwischen der aus Amerosporium atrum erhältlichen Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 9) (untere Linie) und der aus Stachybotrys chartarum erhältlichen Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) (obere Linie).
Detaillierte Beschreibung
Definitionen
Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "phenoloxidierendes Enzym" auf jene Enzyme, die Redoxreaktionen katalysieren und für molekularen Sauerstoff und/oder Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor spezifisch sind. Für die hierin beschriebenen phenoloxidierenden Enzyme kodiert Nucleinsäure, die in der Lage ist, unter mäßig- bis hochstringenten Bedingungen an Seq.-ID Nr. 1 (die für ein phenoloxidierendes Enzym kodiert, das aus Stachybotrys chartarum ATCC-Nummer 38898 erhältlich ist) oder ein Fragment davon zu hybridisieren, und in der Lage sind, die mit einem Farbstoff oder einer farbigen Verbindung assoziierte Farbe zu modifizieren. Solche phenoloxidierenden Enzyme haben zumindest 60% Identität, zumindest 65% Identität, zumindest 70% Identität, zumindest 75% Identität, zumindest 80% Identität, zumindest 85% Identität, zumindest 90% Identität und zumindest 95% Identität mit dem phenoloxidierenden Enzym, das die in Seq.-ID Nr. 2 offenbarte Aminosäuresequenz, bestimmt durch MegAlign Program von DNAstar (DNASTAR, Inc., Madison, WI 53715) mittels Jotun-Hein-Methode (Method in Enzymology 183, 626–645 (1990)), aufweist.
Wie hierin verwendet bezieht sich Stachybotrys auf jede beliebige Stachybotrys-Spezies, die ein phenoloxidierendes Enzym produziert, das in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. Die vorliegende Erfindung umfasst Derivate von natürlichen Isolaten von Stachybotrys, einschließlich Nachkommenschaft und Mutanten, solange das Derivat die Fähigkeit besitzt, ein phenoloxidierendes Enzym zu produzieren, das in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren.
Wie hierin in Bezug auf phenoloxidierende Enzyme verwendet, bezeichnet "erhältlich aus" phenoloxidierende Enzyme, die äquivalent zu jenen sind, die aus dem bestimmten erwähnten mikrobiellen Stamm abstammen oder durch diesen natürlich produziert werden. Beispielsweise beziehen sich phenoloxidierende Enzyme, die aus Bipolaris erhältlich sind, auf jene phenoloxidierenden Enzyme, die von Bipolaris natürlich produziert werden. Die vorliegende Erfindung umfasst phenoloxidierende Enzyme, die in Wirtsorganismen durch Gentechnik-Verfahren rekombinant produziert werden. Beispielsweise kann ein phenoloxidierendes Enzym, das aus Bipolaris erhältlich ist, durch Gentechnik-Verfahren in einer Aspergillus-Spezies produziert werden.
Wie hierin verwendet bezieht sich "farbige Verbindung" auf eine Substanz, die zu Textilien zusetzt, oder auf Substanzen, die zu sichtbaren Flecken führen. Wie im Dictionary of Fiber and Textile Technology (Hoechst Celanese Corporation, PO Box 32414, Charlotte, NC 28232 (1990)) definiert ist, ist ein Farbstoff eine farbige Verbindung, die durch chemische Reaktion, Absorption oder Dispersion in die Faser aufgenommen wird. Beispiele für Farbstoffe umfassen Direct-Blue-Farbstoffe, Säureblau-Farbstoffe, Direct-Red-Farbstoffe, reaktive Blau- und reaktive Schwarz-Farbstoffe. Eine Liste von üblicherweise verwendeten Textilfarbstoffen ist im Colour Index, 3. Auflage, Bd. 1–8, zu finden. Beispiele von Substanzen, die zu sichtbaren Flecken führen, sind Polyphenole, Carotenoide, Anthocyanine, Tannine, Maillard-Reaktionsprodukte usw.
Wie hierin verwendet bedeutet die Phrase "die mit einem Farbstoff oder einer farbigen Verbindung assoziierte Farbe modifizieren" oder "Modifikation der farbigen Verbindung", dass der Farbstoff oder die Verbindung durch Oxidation so verändert wird, dass entweder die Farbe modifiziert erscheint, d.h. die Farbe in ihrer Erscheinung abgeschwächt, blasser, farbloser, gebleicht oder entfernt ist, oder dass nicht die Farbe verändert wird, sondern die Verbindung so modifiziert wird, dass Farbstoffanlagerung unterbunden wird. Die vorliegende Erfindung umfasst die Modifikation der Farbe durch jedes beliebige Mittel, einschließlich beispielsweise des vollständigen Entfernens der farbigen Verbindung vom Fleck an einer Probe, wie z.B. einem Stoffstück, durch jedes beliebige Mittel sowie der Reduktion der Farbintensität oder einer Änderung der Farbe der Verbindung. Bei Zellstoff- und Papieranwendungen beispielsweise resultiert Delignifizierung im Zellstoff zu größerer Helligkeit des aus dem Zellstoff hergestellten Papiers.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Bezeichnungen "Mutanten und Varianten", sofern diese im Zusammenhang mit phenoloxidierenden Enzymen genannt werden, auf phenoloxidierende Enzyme, die durch Änderung der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz und/oder der Struktur davon, wie beispielsweise durch Änderung der Nucleinsäuresequenz des strukturellen Gens und/oder durch direkte Substitution und/oder Änderung der Aminosäuresequenz und/oder Struktur des phenoloxidierenden Enzyms, erhalten werden. Die Bezeichnung "Derivat" eines phenoloxidierenden Enzyms wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Abschnitt oder ein Fragment der in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenz voller Länge des phenoloxidierenden Enzyms oder einer Variante davon, der oder das zumindest eine Aktivität des natürlich vorkommenden, phenoloxidierenden Enzyms beibehält. Wie hierin verwendet beziehen sich die Bezeichnungen "Mutanten und Varianten", sofern diese im Zusammenhang mit mikrobiellen Stämmen genannt werden, auf Zellen, die aus einem natürlichen Isolat in bestimmter Weise verändert wurden, beispielsweise veränderte DNA-Nucleotidsequenz von z.B. dem strukturellen Gen, das für das phenoloxidierende Enzym kodiert; Änderungen an einem natürlichen Isolat zur Steigerung der Produktion von phenoloxidierendem Enzym; oder andere Änderungen, die Expression von phenoloxidierendem Enzym bewirken, aufweisen.
Die Bezeichnung "Enhancer" oder "Mediator" bezieht sich auf jede beliebige Verbindung, die in der Lage ist, die mit einem Farbstoff oder einer farbigen Verbindung assoziierte Farbe in Verbindung mit einem phenoloxidierenden Enzym oder einer Verbindung, die die oxidative Aktivität des phenoloxidierenden Enzyms steigert, zu modifizieren. Dieses fördernde Mittel ist typischerweise eine organische Verbindung.
Phenoloxidierende Enzyme
Die phenoloxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung funktionieren durch Katalysieren von Redoxreaktionen, d.h. den Transfer von Elektronen von einem Elektronendonor (üblicherweise eine Phenolverbindung) zu molekularem Sauerstoff und/oder Wasserstoffperoxid (der oder das als Elektronenakzeptor wirkt), der oder das zu Wasser reduziert wird. Beispiele für solche Enzyme sind Laccasen (EC 1.10.3.2), Bilirubinoxidasen (EC 1.3.3.5), Phenoloxidasen (EC 1.14.18.1) oder Catechinoxidasen (EC 1.10.3.1).
Die vorliegende Erfindung umfasst phenoloxidierende Enzyme, die aus Bakterien, Hefe oder Pilzspezies, die nicht Stachybotrys sind, erhältlich sind, wobei für diese Enzyme Nucleinsäure kodiert, die in der Lage ist, unter hochstringenten Bedingungen an die in Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 6 oder Seq.-ID Nr. 8 gezeigte Nucleinsäure zu hybridisieren, solange das Enzym in der Lage ist, die mit einem Farbstoff oder einer farbigen Verbindung assoziierte Farbe zu modifizieren.
Phenoloxidierende Enzyme, für die Nucleinsäure kodiert, die in der Lage ist, an Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 6 oder Seq.-ID Nr. 8 zu hybridisieren, sind aus Bakterien, Hefe und Pilzspezies, die nicht Stachybotrys sind, einschließlich Myrothecium verrucaria, Curvalaria pallescens, Chaetomium sp, Bipolaris spicifera, Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei, Mycellophthora thermophila und Amerosporium atrum, jedoch nicht darauf beschränkt, erhältlich. Veranschaulichende Beispiele von isolierten und charakterisierten phenoloxidierenden Enzymen, für die Nucleinsäure kodiert, die in der Lag ist, an Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 6 oder Seq.-ID Nr. 8 zu hybridisieren, werden hierin bereitgestellt und umfassen phenoloxidierende Enzyme, die aus Stämmen von Bipolaris spicifera, Curvularia pallescens und Amerosporium atrum erhältlich sind, und umfassen die phenoloxidierenden Enzyme, die die in Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 7 bzw. Seq.-ID Nr. 9 gezeigten Aminosäuresequenzen umfassen. Die in Seq.-ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz stellt eine partielle Aminosäuresequenz dar.
Stämme von Bipolaris spicifera sind beim Centraalbureau Voor Schimmelcultures Baarn (CBS)-Delft (Niederlande), Institut der Königlichen Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften erhältlich und weisen die CBS-Zugriffsnummern CBS 197.31; CBS 198.31; CBS 199.31; CBS 211.34; CBS 274.52; CBS 246.62; CBS 314.64; CBS 315.64; CBS 418.67; CBS 364.70 und CBS 586.80 auf.
Stämme von Curvularia pallescens sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich und umfassen die ATCC-Zugriffsnummern ATCC 12018; ATCC 22920; ATCC 32910; ATCC 34307; ATCC 38779; ATCC 44765; ATCC 60938; ATCC 60939; und ATCC 60941.
Stämme von Amerosporium atrum sind beim CBS erhältlich und umfassen die CBS-Zugriffsnummern CBS 142.59; CBS 166.65; CBS 151.69 und CBS 548.86.
Fachleuten wird bekannt sein, dass unter den zahlreichen hinterlegten Stämmen eines bestimmten Organismus leichte Aminosäurevariationen des phenoloxidierenden Enzyms gefunden werden können. Beispielsweise können unter den zahlreichen verschiedenen Bipolaris-spicifera-Stämmen, die beim CBS hinterlegt sind, Aminosäuresequenzen mit 95% oder mehr Identität zur in Seq.-ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz vorkommen, und demähnlich können auch unter den zahlreichen verschiedenen Curvularia-pallescens-Stämmen, die bei der ATCC hinterlegt sind, Aminosäuresequenzen mit 95% oder mehr Identität mit der in Seq.-ID Nr. 7 gezeigten Aminosäuresequenz vorkommen. Darüber hinaus kann unter den zahlreichen verschiedenen Amerosporium-atrum-Stämmen, die beim CBS hinterlegt sind, Aminosäuresequenzen mit 95% oder mehr Identität zur in Seq.-ID Nr. 9 gezeigten Aminosäuresequenz vorkommen. Daher umfasst die vorliegende Erfindung phenoloxidierende Enzyme, die aus Stämmen von Bipolaris spicifera erhältlich sind und zumindest 95% Identität zur in Seq.-ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenso phenoloxidierende Enzyme, die aus den Stämmen von Curvularia pallescens erhältlich sind und zumindest 95% Identität zur in Seq.-ID Nr. 7 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch phenoloxidierende Enzyme, die aus den Stämmen von Amerosporium atrum erhältlich sind und zumindest 95% Identität zur in Seq.-ID Nr. 9 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen.
Nucleinsäure, die für phenoloxidierende Enzyme kodiert
Fachleuten wird bekannt sein, dass aufgrund der Degeneration des genetischen Codes zahlreiche verschiedene Polynucleotide für das in Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 7 und Seq.-ID Nr. 9 offenbarte, phenoloxidierende Enzym kodieren können. Die vorliegende Erfindung umfasst alle diese Polynucleotide.
Die für ein phenoloxidierendes Enzym kodierende Nucleinsäure kann mittels Standardverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, gewonnen werden, beispielsweise aus klonierter DNA (z.B. einer DNA-"Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonieren, durch PCR oder durch das Klonieren von genomischer DNA, oder Fragmente davon, gereinigt aus einer erwünschten Zelle wie z.B. einer Biopolaris-Spezies, Curvularia-Spezies oder Amerosporium-Spezies (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover (Hrsg.), DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K., Bd. I, II (1985)). Nucleinsäuresequenzen, die aus genomischer DNA stammen, können Regulationsregionen zusätzlich zu Kodierregionen enthalten. Unabhängig von ihrer Quelle sollte die isolierte Nucleinsäure, die für ein phenoloxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung kodiert, molekular in einen geeigneten Vektor zur Vermehrung des Gens kloniert werden.
Beim molekularen Klonieren des Gens aus genomischer DNA werden DNA-Fragmente gebildet, von denen manche für das erwünschte Gen kodieren. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gespaltet werden. Alternativ dazu kann DNAse in Gegenwart von Mangan verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, beispielsweise durch Beschallung. Die linearen DNA-Fragmente können dann nach Größe mittels Standardverfahren, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese, PCR und Säulenchromatographie, getrennt werden.
Nachdem Nucleinsäurefragmente gebildet wurden, kann die Identifikation des spezifischen DNA-Fragments, das für ein phenoloxidierendes Enzym kodiert, auf zahlreiche verschiedene Arten erfolgen. Beispielsweise kann ein für das phenoloxidierende Enzym kodierendes Gen der vorliegenden Erfindung oder seine spezifische RNA oder ein Fragment davon, wie beispielsweise eine Sonde oder ein Primer, isoliert und markiert werden und in weiterer Folge in Hybridisierungstests verwendet werden, um ein gebildetes Gen nachzuweisen (W. Benton & R. Davis, Science 196, 180 (1977); M. Grunstein & D. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975)). Diese DNA-Fragmente, die zur Sonde wesentliche Sequenzähnlichkeit aufweisen, hybridisieren unter stringenten Bedingungen.
Hybridisierungsbedingungen basieren auf Schmelztemperatur (T_m) des Nucleinsäure-Bindungskomplexes, wie von Bergen & Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, San Diego, CA (1987)) gelehrt, und verleihen eine definierte "Stringenz" wie nachstehend erläutert.
"Maximale Stringenz" tritt typischerweise bei etwa T_m – 5°C (5°C unter der T_m der Sonde) auf; "hohe Stringenz" bei etwa 5°C bis 10°C unter T_m; "mäßige Stringenz" bei etwa 10°C bis 20°C unter T_m; und "geringe Stringenz" bei etwa 20°C bis 25°C unter T_m. In der vorliegenden Erfindung beispielsweise sind die folgenden Bedingungen die Bedingungen hoher Stringenz: Hybridisierung erfolgte bei 37°C in Puffer, der 50% Formamid, 5 × SSPE, 0,5% SDS und 50 μg/ml gescherte Hering-DNA enthielt. Das Waschen erfolgte bei 65°C 30 Minuten lang in Gegenwart von 1 × SSC und 0,1% SDS einmal, bei 65°C 30 Minuten lang in Gegenwart von 0,5 × SSC und 0,1% SDS einmal und bei 65°C 30 Minuten lang in Gegenwart von 0,1 × SSC und 0,1% SDS einmal; folgend werden die Bedingungen mäßiger Stringenz beschrieben: Hybridisierung erfolgte bei 37°C in Puffer, der 25% Formamid, 5 × SSPE, 0,5% SDS und 50 μg/ml gescherte Hering-DNA enthielt. Das Waschen erfolgte bei 50°C 30 Minuten lang in Gegenwart von 1 × SSC und 0,1% SDS einmal, bei 50°C 30 Minuten lang in Gegenwart von 0,5 × SSC und 0,1% SDS einmal; folgend werden die Bedingungen niedriger Stringenz beschrieben: Hybridisierung erfolgte bei 37°C in Puffer, der 25% Formamid, 5 × SSPE, 0,5% SDS und 50 μg/ml gescherte Hering-DNA enthielt. Das Waschen erfolgte bei 37°C 30 Minuten lang in Gegenwart von 1 × SSC und 0,1% SDS einmal, bei 37°C 30 Minuten lang in Gegenwarf von 0,5 × SSC und 0,1% SDS einmal. Eine Nucleinsäure, die in der Lage ist, unter Bedingungen hoher Stringenz an eine Nucleinsäurensonde zu hybridisieren, weist etwa 80% bis 100% Identität zur Sonde auf; eine Nucleinsäure, die in der Lage ist, unter Bedingungen mäßiger Stringenz an eine Nucleinsäurensonde zu hybridisieren, weist etwa 50% bis 80% Identität zur Sonde auf.
Die Bezeichnung "Hybridisierung" wie hierin verwendet umfasst "den Prozess, durch den sich ein Nucleinsäurestrang an einen komplementären Strang durch Basenpaarung bindet" (J. Coombs, Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY (1994)).
Der Amplifikationsvorgang, der im Rahmen von Polymerasekettenreaktion (PCR) stattfindet, wird von CW Dieffenbach und GS Dveksler (PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY (1995)) beschrieben. Eine Nucleinsäuresequenz mit zumindest etwa 10 Nucleotiden und maximal etwa 60 Nucleotiden aus Seq.-ID Nr. 1, vorzugsweise mit etwa 12 bis 30 Nucleotiden, und noch bevorzugter mit etwa 25 Nucleotiden, kann als eine Sonde oder ein PCR-Primer verwendet werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Isolieren eines Nucleinsäurekonstrukts der Erfindung aus einer cDNA- oder genomischen Bibliothek wird durch die Verwendung von Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die auf Grundlage der in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Polynucleotidsequenz hergestellt werden, durchgeführt. Die PCR kann beispielsweise unter Verwendung der im US-Patent Nr. 4.683.202 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung stellt Wirtszellen, Expressionsverfahren und -systeme zur Herstellung von phenoloxidierenden Enzymen, die aus Bakterien, Hefe oder Pilzspezies, die nicht Stachybotrys sind, erhältlich sind, in Wirts-Mikroorganismen bereit. Solche Wirtsmikroorganismen umfassen Pilze-, Hefe- und Bakterienspezies. Nachdem Nucleinsäure, die für ein phenoloxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung kodiert, erhalten wurde, können rekombinante Wirtszellen, die die Nucleinsäure enthalten, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren konstruiert werden. Molekularbiologische Verfahren sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), offenbart. Nucleinsäure, die für ein phenoloxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung kodiert, wird gewonnen und unter Verwendung geeigneter Vektoren zu einer Wirtszelle transformiert. Zahlreiche verschiedene Vektoren und Transformations- sowie Expressionskassetten, die für das Klonieren, die Transformation und Expression in Pilzen, Hefe und Bakterien geeignet sind, sind Fachleuten bekannt.
Typischerweise enthält der Vektor oder die Kassette Sequenzen, die Transkription und Translation der Nucleinsäure steuern, einen selektierbaren Marken und Sequenzen, die autonome Replikation oder chromosomale Integration ermöglichen. Geeignete Vektoren umfassen eine Region 5' des Gens, die Transkriptionsinitiationskontrollen enthält, und eine Region 3' des DNA-Fragments, die Transkriptionstermination steuert. Diese Kontrollregionen können aus Genen, die homolog oder heterolog zum Wirt sind, abgeleitet sein, solange die ausgewählte Kontrollregion in der Lage ist, in der Wirtszelle zu funktionieren.
Initiationskontrollregionen oder -promotoren, die nützlich sind, um Expression der phenoloxidierenden Enzyme in einer Wirtszelle zu steuern, sind Fachleuten bekannt. Im Grunde ist jeder Promotor, der in der Lage ist, diese phenoloxidierenden Enzyme zu steuern, für die vorliegende Erfindung geeignet. Nucleinsäure, die für das phenoloxidierende Enzym kodiert, ist über Initiationscodons operabel an ausgewählte Expressionskontrollregionen zur wirksamen Expression der Enzyme gebunden. Nachdem geeignete Kassetten konstruiert wurden, werden sie verwendet, um die Wirtszelle zu transformieren.
Allgemeine Transformationsverfahren werden in Current Protocols in Molecular Biology (Bd. 1, hrsg. von Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., Kapitel 9 (1987)) beschrieben und umfassen Calciumphosphatverfahren, Transformation unter Verwendung von PEG und Elektroporation. Für Aspergillus und Trichoderma kann PEG- und Calcium-vermittelte Protoplastentransformation verwendet werden (DB Finkelstein, Transformation. In: Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Products (hrsg. von Finkelstein & Bill), 113–156 (1992)). Elektroporation von Protoplasten ist in DB Finkelstein, Transformation. In: Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Products (hrsg. von Finkelstein & Bill), 113–156 (1992), offenbart. Mikroprojektionsbeschuss auf Conidien wird von Fungaro et al. in: Transformation of Aspergillus nidulans by microprojection bombardment on intact conidia. FEMS Microbiology Letters 125, 839–842 (1995), beschrieben. Agrobacterium-vermittelte Transformation wird in Groot et al., Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology 16, 839–842 (1998), offenbart. Zur Transformation von Saccharomyces sind Fachleuten Lithiumacetat-vermittelte Transformation und PEG- und Calcium-vermittelte Protoplastentransformation sowie Elektroporationsverfahren bekannt.
Wirtszellen, die die Kodiersequenz für ein phenoloxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung enthalten und das Protein exprimieren, können mittels zahlreicher verschiedener Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen, jedoch nicht ausschließlich, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und Protein-Biotest- oder Immuntest-Verfahren, die membranbasierte, lösungsbasierte oder chipbasierte Technologien zur Detektion und/oder Quantifizierung der Nucleinsäure oder des Proteins einbinden.
Aktivitäten phenoloxidierender Enzyme
Die phenoloxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, zahlreiche verschiedene Phenolverbindungen als Elektronendonoren zu verwenden, während sie sehr spezifisch für molekularen Sauerstoff als Elektronenakzeptor und/oder Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor sind.
Je nach dem spezifischen Substrat und den Reaktionsbedingungen, z.B. Temperatur, Gegenwart oder Abwesenheit von Enhancern usw., hat jede Oxidationsreaktion mit phenoloxidierendem Enzym einen optimalen pH.
Die phenoloxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, zahlreiche verschiedene Farbstoffe oder farbige Verbindungen mit verschiedenen chemischen Strukturen unter Verwendung von Sauerstoff und/oder Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor zu oxidieren. Demgemäß werden phenoloxidierende Enzyme der vorliegenden Erfindung in Anwendungen verwendet, in denen es wünschenswert ist, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren, wie beispielsweise bei Reinigungsvorgängen zur Entfernung von Nahrungsmittelflecken auf Stoffen und zur Vermeidung von neuerlicher Farbstoffablagerung; Textilien; und Papier- und Zellstoffanwendungen.
Farbige Verbindungen
In der vorliegenden Erfindung könnten zahlreiche verschiedene farbige Verbindungen Ziele für Oxidation durch phenoloxidierende Enzyme der vorliegenden Erfindung sein. Beispielsweise in Waschmittelanwendungen können farbige Substanzen, die als Flecken an Stoffen auftreten können, ein Ziel darstellen. Mehrere Typen oder Klassen von farbigen Substanzen können als Flecken auftreten, wie beispielsweise Porphyrin-abgeleitete Strukturen, wie z.B. Häm in Blutflecken oder Chlorophyll in Pflanzen; Tannine und Polyphenole (siehe P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Hrsg. Oliver & Boyd, Edinburgh, 169–198 (1972)), die in Teeflecken, Weinflecken, Bananenflecken oder Pfirsichflecken auftreten; Carotenoide, die farbigen Substanzen, die in Tomaten (Lycopen, rot), Mango (Carotin, orange-gelb) auftreten (G. E. Bartley et al., The Plant Cell, Bd. 7, 1027–1038 (1995)); Anthocyanine, die stark farbigen Moleküle, die in zahlreichen Früchten und Blumen auftreten (P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Hrsg. Oliver & Boyd, Edinburgh, 135–169 (1972)); und Maillard-Reaktionsprodukte, gelb-braun-farbige Substanzen, die beim Erhitzen von Gemischen aus Kohlenhydratmolekülen in Gegenwart von Protein/Peptid-Strukturen auftreten, wie beispielsweise in Speiseölen. Pigmente sind in Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Auflage, Bd. 17, 788–889, veröffentlicht von Wiley-Interscience, John Wiley & Sons, offenbart, und Farbstoffe sind in Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Auflage, Bd. 8, veröffentlicht von Wiley-Interscience, John Wiley & Sons, offenbart.
Enhancer
Ein phenoloxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung kann so wirken, dass es die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe in Gegenwart oder Abwesenheit von Enhancern je nach den Eigenschaften der Verbindung modifiziert. Ist eine Verbindung in der Lage, als ein direktes Substrat für das phenoloxidierende Enzym zu wirken, so kann das phenoloxidierende Enzym die mit einem Farbstoff oder einer farbigen Verbindung assoziierte Farbe in Abwesenheit eines Enhancers modifizieren, obwohl der Enhancer für optimale Aktivität des phenoloxidierenden Enzyms stets bevorzugt werden kann. Für andere farbige Verbindungen, die nicht in der Lage sind, als ein direktes Substrat für das phenoloxidierende Enzym zu wirken, oder die nicht direkt für das phenoloxidierende Enzym zugänglich sind, ist für optimale phenoloxidierende Enzymaktivität und zur Modifikation der Farbe ein Enhancer erforderlich.
Enhancer werden beispielsweise in der WO 95/01426, veröffentlicht am 12. Jänner 1995; der WO 96/06930, veröffentlicht am 7. März 1996; und der WO 97/11217, veröffentlicht am 27. März 1997, beschrieben. Enhancer umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Phenothiazin-10-propionsäure (PPT), 10-Methylphenothiazin (MPT), Phenoxazin-10-propionsäure (PPO), 10-Methylphenoxazin (MPO), 10- Ethylphenothiazin-4-carbonsäure (EPC), Acetosyringon, Syringaldehyd, Methylsyringat, 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat (ABTS) und 4-Hydroxy-4-biphenylcarbonsäure.
Kulturen
Die vorliegende Erfindung umfasst phenoloxidierende Enzyme, die aus Pilzen einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Myrothecium-Spezies, Curvalaria-Spezies, Chaetomium-Spezies, Bipolaris-Spezies, Humicola-Spezies, Pleurotus-Spezies, Trichoderma-Spezies, Mycellophthora-Spezies und Amerosporium-Spezies erhältlich sind. Insbesondere umfassen die Pilze Myrothecium verrucaria, Curvalaria pallescens, Chaetomium sp, Bipolaris spicifera, Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei, Mycellophthora thermophila und Amerosporium atrum, jedoch nicht ausschließlich. Zusätzlich zu den hierin bereitgestellten Beispielen umfassen andere Beispiele der obigen Spezies Myrothecium verrucaria mit der ATCC-Zugriffsnummer 36315; Pleurotus abalonus mit der ATCC-Zugriffsnummer 96053; Humicola insolens mit der ATCC-Zugriffsnummer 22082; Mycellophthora thermophila mit der ATCC-Zugriffsnummer 48104; und Trichoderma reesei mit der ATCC-Zugriffsnummer 56765.
Reinigung
Die phenoloxidierende Enzyme der vorliegenden Erfindung können durch Kultivierung von phenoloxidierende Enzyme produzierenden Stämmen unter aeroben Bedingungen in Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit wesentlichem/n Nährstoff(en) enthält, hergestellt werden. Das Medium kann gemäß den auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Prinzipien zusammengesetzt sein.
Während der Kultivierung sekretieren die phenoloxidierende Enzyme produzierenden Stämme phenoloxidierendes Enzym extrazellulär. Dies ermöglicht das Isolieren und Reinigen (Gewinnen) des phenoloxidierenden Enzyms beispielsweise durch Trennung von Zellmasse aus einem Kulturmedium (z.B. durch Filtration oder Zentrifugation). Die resultierende, zellfreie Kulturlösung kann als solches verwendet werden oder kann zuerst, sofern erwünscht, eingeengt werden (z.B. durch Eindampfen oder Ultrafiltration). Sofern erwünscht, kann das phenoloxidierende Enzym dann aus der zellfreien Kulturlösung getrennt und bis zum erwünschten Grad mittels herkömmlicher Verfahren, z.B. mittels Säulenchromatographie, gereinigt oder sogar kristallisiert werden.
Die phenoloxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung können aus der Kulturnährlösung isoliert und gereinigt werden, in die sie durch Einengung des Überstandes der Wirtskultur extrazellulär sekretiert werden, gefolgt von Ammoniumsulfatfraktionierung und Gelpermeationschromatographie. Wie hierin in Beispiel I für phenoloxidierendes Enzym von Stachybotrys charatrum beschrieben, können die phenoloxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung gereinigt und Standardverfahren zum Proteinsequenzieren unterzogen werden. Oligonucleotid-Primer können basierend auf der Proteinsequenz entworfen und in PCR verwendet werden, um die für das phenoloxidierende Enzym kodierende Nucleinsäure zu isolieren. Die isolierte Nucleinsäure kann charakterisiert und in Wirtszellen zur Expression eingeführt werden. Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren und rekombinante Wirtszellen, die ein phenoloxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung umfassen, sowie die darauf folgende Reinigung des phenoloxidierenden Enzyms aus der rekombinanten Wirtszelle.
Die phenoloxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung können formuliert und gemäß ihren beabsichtigten Anwendungsbereichen verwendet werden. In dieser Hinsicht kann das phenoloxidierende Enzym, sofern es in einer Waschmittelzusammensetzung verwendet wird, unter Verwendung des im US-Patent Nr. 4.689.297 beschriebenen Verfahrens direkt aus der Fermentationslösung als ein beschichteter Feststoff formuliert werden. Weiters kann das phenoloxidierende Enzym, sofern erwünscht, zu einer flüssigen Form mit einem geeigneten Träger formuliert werden. Das phenoloxidierende Enzym kann auch, sofern erwünscht, immobilisiert werden.
Tests auf phenoloxidierende Aktivität
Phenoloxidierende Enzyme können beispielsweise durch ABTS-Aktivität wie in Beispiel II beschrieben oder durch das Delignifizierungsverfahren, das in Beispiel III offenbart ist, oder in Waschmittelverfahren, die Fachleuten bekannt sind, getestet werden.
Waschmittelzusammensetzungen
Ein phenoloxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung kann in Waschmittel- oder Reinigungszusammensetzungen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen können zusätzlich zum phenoloxidierenden Enzym herkömmliche Waschmittelbestandteile wie beispielsweise Tenside, Builder und weitere Enzyme wie z.B. Proteasen, Amylasen, Lipasen, Cutinasen, Cellulasen oder Peroxidasen umfassen. Andere Bestandteile umfassen Enhancer, stabilisierende Mittel, Bakterizide, optische Aufheller und Duftstoffe. Die Waschmittelzusammensetzung kann in jeglicher geeigneten physikalischen Form vorliegen, wie beispielsweise in Form eines Pulvers, einer wässrigen oder nicht wässrigen Flüssigkeit, einer Paste oder eines Gels. Beispiele für Waschmittelzusammensetzungen sind in der WO 95/01426, veröffentlicht am 12. Januar 1995, und der WO 96/06930, veröffentlicht am 7. März 1996, angeführt.
Nach dieser Beschreibung der phenoloxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung werden nun die folgenden Beispiele zur Veranschaulichung bereitgestellt, die weder als Einschränkung gedacht noch als solche verstanden werden sollen. Verdünnungen, Mengen usw., die hierin in Prozentsätzen angegeben sind, sind, außer anders angeführt, Prozentsätze berechnet als Prozent Gewicht pro Volumen (Gew./Vol.). Wie hierin verwendet beziehen sich Verdünnungen, Mengen usw., die als Vol.-% dargestellt sind, auf Prozentsätze, die als Prozent Volumen pro Volumen berechnet sind. Temperaturen, auf die hierin Bezug genommen werden, sind in Celsiusgraden (°C) angegeben.
Beispiel I
Herstellung von phenoloxidierendem Enzym aus Stachybotrys chartarum
Stachybotrys chartarum ATCC-Zugriffsnummer 38898 wurde auf PDA-Platten (Difco) etwa 5–10 Tage lang gezüchtet. Ein Teil der Plattenkultur (etwa ¾ × ¾ Zoll) wurde verwendet, um 100 ml PDB (Kartoffel-Glucose-Kulturlösung in 500-ml-Schüttelkolben zu inokulieren. Der Kolben wurde bei 26–28°C, 150 U/min, 3–5 Tage lang inkubiert, bis gutes Wachstum erreicht war.
Das Kulturmedium wurde dann in 1 l PDB in einem 2,8-l-Schüttelkolben inokuliert. Der Kolben wurde bei 26–28°C, 150 U/min, 2–4 Tage lang inkubiert, bis gutes Wachstum erreicht war.
Ein 10-l-Fermenter, der ein Produktionsmedium enthielt, wurde hergestellt (und enthielt in g/l die folgenden Komponenten: Glucose 15; Lecithin 1,51; t-Aconitsäure 1,73; KH₂PO₄ 3; MgSO₄·7H₂O 0,8; CaCl₂·2H₂O 0,1; Ammoniumtartrat 1,2; Sojapepton 5; Staley 7359; Benzylalkohol 1; Tween 20 1; Nitrilotriessigsäure 0,15; MnSO₄·7H₂O 0,05; NaCl 0,1; FeSO₄·7H₂O 0,01; CoSO₄ 0,01; CaCl₂·2H₂O 0,01; ZnSO₄·7H₂O 0,01; CuSO₄ 0,001; ALK(SO₄)₂·12H₂O 0,001; H₃BO₃ 0,001; NaMoO₄·2H₂O 0,001). Der Fermenter wurde dann mit dem 1 l Nährmedium inokuliert, und Fermentation wurde bei 28°C 60 Stunden lang unter einem permanentem Luftstrom von 5,0 l/min und konstantem Rühren bei 120 U/min laufen gelassen. Der pH wurde bei 6,0 gehalten.
Die Gegenwart von phenoloxidierender Enzymaktivität im Überstand wurde unter Verwendung des folgenden Testverfahrens basierend auf der Oxidation von ABTS (2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat)) durch Sauerstoff gemessen. ABTS (SIGMA, 0,2 ml, 4,5 mM H₂O) und NaOAc (1,5 ml, 120 mM in H₂O, pH 5,0) wurden in einer Küvette vermischt. Die Reaktion wurde durch Zusatz einer geeigneten Menge des zu messenden Präparats (das in diesem Beispiel die Überstandsverdünnung ist), um eine Endlösung von 1,8 ml zu erhalten, gestartet. Die durch die Oxidation von ABTS produzierte Farbe wurde dann alle 2 Sekunden über eine Gesamtdauer von 14 Sekunden durch Aufzeichnung der optischen Dichte (OD) bei 420 nm unter Verwendung eines Spektralphotometers gemessen. Eine ABTS-Einheit (eine Enzymeinheit oder EACU) in diesem Beispiel ist als die Änderung der optischen Dichte definiert, gemessen bei 420 pro Minute/2 (wobei die Probe keine Verdünnung aufweist). Auf diese Weise wurde eine phenoloxidierende Enzymaktivität von 3,5 EACU/ml Kulturüberstand gemessen.
Der resultierende Überstand wurde dann aus dem Pellet entfernt und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit, ausgestattet mit einer YMIO-Membran mit einem Cut-off von 10 kD, auf 0,6 l eingeengt.
Ein Volumen von 1,4 l Aceton wurde dann zu dem Konzentrat zugesetzt und damit vermischt. Das resultierende Gemisch wurde dann zwei Stunden lang bei 20–25°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurde das Gemisch 30 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert, und das resultierende Pellet wurde aus dem Überstand entfernt. Das Pellet wurde dann in einem Endvolumen von 800 ml Wasser resuspendiert.
Die resultierende Suspension wurde dann Ammoniumsulfat-Fraktionierung wie folgend unterzogen: kristallines Ammoniumsulfat wurde zur Suspension zu 40%iger Sättigung zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 4°C 16 Stunden lang unter sanftem Rühren mit Magnetrührer inkubiert. Das Gemisch wurde dann bei 10.000 g 30 Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wurde vom Zentrifugationspellet zur weiteren Verwendung entfernt. Ammoniumsulfat wurde dann zum Überstand zugesetzt, um 80%ige Sättigung zu erreichen, und das Gemisch wurde bei 4°C 16 Stunden lang unter sanftem Rühren mit Magnetrührer inkubiert. Die Suspension wurde anschließend 30 Minuten lang bei 10.000 g neuerlich zentrifugiert, und das resultierende Pellet wurde aus dem Überstand entfernt. Das Pellet wurde dann in 15 ml Wasser resuspendiert und durch Ultrafiltration unter Verwendung eines CENTRIPREP 3000 (AMICON) auf 6 ml eingeengt.
Die Aktivität des phenoloxidierenden Enzyms der Suspension wurde dann unter Verwendung des Standardtestverfahrens basierend auf der Oxidation von ABTS durch Sauerstoff wie zuvor beschrieben gemessen (jedoch unter der Ausnahme, dass das zu testende Präparat das resuspendierte Konzentrat und nicht die Überstandsverdünnungen ist). Die so gemessene phenoloxidierende Enzymaktivität betrug 5.200 EU/ml.
Das Enzym wurde dann durch Gelpermeationschromatographie weiter gereinigt. Hierbei wurde eine Säule, die 850 ml von SEPHACRYL S400 HIGH RESOLUTION (PHARMACIA) enthielt, mit einem Puffer, der 50 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄ (pH = 7,0) enthielt, äquilibriert und dann mit der Restsubstanz der zuvor beschriebenen 6 ml Suspension geladen und mit dem Puffer, der 50 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄ (pH = 7,0) enthielt, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Jeweilige Fraktionen wurden dann enthalten.
Die jeweiligen Fraktionen, die die stärksten phenoloxidierenden Enzymaktivitäten aufwiesen, wurden gesammelt und ergaben 60 ml Suspension, die gereinigtes, phenoloxidierendes Enzym enthielt.
Die phenoloxidierende Enzymaktivität der Suspension wurde dann basierend auf der Oxidation von ABTS durch Sauerstoff gemessen. Die so gemessene Enzymaktivität betrug 390 EU/ml. Phenoloxidierendes Enzym aus Stachybotrys chartarum, hergestellt wie zuvor offenbart, wurde SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und isoliert. Die isolierte Fraktion wurde mit Harnstoff und lodacetamid behandelt und durch das Enzym endoLysC verdaut. Die aus dem endoLysC-Verdau resultierenden Fragmente wurden mittels HPLC (Monobore-C18-Umkehrphasen-Säule, CH₃CN-Gradient) getrennt und in einer Multititerplatte gesammelt. Die Fraktionen wurden durch MALDI zur Massenbestimmung analysiert und über Edman-Abbau sequenziert. Die folgenden Aminosäuresequenzen wurden bestimmt und sind im Amino-Terminus-zu-Carboxy-Terminus-Ausrichtung dargestellt:
N' DYYFPNYQSARLLXYHDHA C'
N' RGQVMPYESAGLK C'
Zwei degenerierte Primer wurden basierend auf der Peptidsequenz entworfen. Primer 1 enthält die folgende Sequenz: TATTACTTTCCNAAYTAYCA, worin N für ein Gemisch aller vier Nucleotide (A, T, C und G) steht und Y für ein Gemisch aus nur T und C steht Primer 2 enthält die folgende Sequenz: TCGTATGGCATNACCTGNCC.
Zum Isolieren von genomischer DNA, die für phenoloxidierendes Enzym kodiert, wurde DNA, isoliert aus Stachybotrys chartarum (MUCL Nr. 38898), als eine Matrize für PCR verwendet. Die DNA wurde 100fach mit Tris-EDTA-Puffer zu einer Endkonzentration von 88 ng/μl verdünnt. 10 μl von verdünnter DNA wurden zum Reaktionsgemisch zugesetzt, das 0,2 mM von jedem Nucleotid (A, G, C und T), 1 × Reaktionspuffer, 0,296 μg von Primer 1 und 0,311 μg von Primer 2 in einem Gesamtvolumen von 100 μl Reaktionsgemisch enthielt. Nach Erhitzen des Gemisches bei 100°C 5 Minuten lang wurden 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Die PCR-Reaktion wurde bei 95°C 1 Minute lang durchgeführt, die Primer wurden 1 Minute lang an die Matrize bei 45°C anelliert, und Verlängerung erfolgte 1 Minute lang bei 68°C. Dieser Zyklus wurde 30mal wiederholt, um ein auf Gel sichtbares PCR-Fragment zu erhalten. Das durch Agarosegel detektierte PCR-Fragment enthielt ein Fragment von etwa 1 kb, das dann in den Plasmidvektor pCR-II (Invitrogen) kloniert wurde. Das 1-kb-Insert wurde dann Nucleinsäuresequenzierung unterzogen. Die Sequenzdaten zeigten, dass es das für Stachybotrys chartarum kodierende Gen war, da die abgeleitete Peptidsequenz mit den Peptidsequenzen, die mittels Edman-Abbau sequenziert und zuvor offenbart wurden, übereinstimmte. Die PCR-Fragmente, die das 5'-Gen und das 3'-Gen enthielten, wurden dann isoliert und sequenziert. 1 stellt die genomische Sequenz voller Länge (Seq.-ID Nr. 1) von Stachybotrys-Oxidase einschließlich des Promotors und der Terminationssequenzen bereit.
Beispiel II
Das folgende Beispiel beschreibt den ABTS-Test, der zur Bestimmung von phenoloxidierender Aktivität verwendet wird. Der ABTS-Test ist ein spektralphotometrischer Aktivitätstest, der die folgenden Reagenzien verwendet: Testpuffer = 50 Natriumacetat, pH 5,0; 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0; 50 mM Natriumcarbonat, pH 9,0. Die ABTS (2,2'-Azinobis[3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure]) ist eine 4,5-mM-Lösung in destilliertem Wasser.
0,75 ml Testpuffer und 0,1 ml ABTS-Substratlösung werden vereinigt, vermischt und zu einer Küvette zugesetzt. Eine Küvette, die Puffer-ABTS-Lösung enthält, wird als eine Blindprobe verwendet. 0,05 ml Enzymprobe wird zugesetzt, rasch vermischt und in die Küvette gegeben, die Puffer-ABTS-Lösung enthält. Die Geschwindigkeit der Veränderung von Absorptionsvermögen bei 420 nm wird, DOD 420/min, 15 Sekunden lang (oder länger bei Proben mit Aktivitätsraten < 0,1) bei 30°C gemessen. Enzymproben mit einer hohen Aktivitätsrate werden mit Testpuffer zu einem Niveau zwischen 0,1 und 1 verdünnt.
Beispiel III
Dieses Beispiel verwendet Arbeitsvorschriften zum Schüttelkolben-Zellstoffbleichen, die verwendet werden, um die Aktivität von phenoloxidierenden Enzymen zu bestimmen.
Der verwendete Puffer ist 50 mM Na-Acetat, pH 5, oder 50 mM Tris, pH 8,5. Weichholz-Zellstoff, delignifiziert durch Sauerstoff, mit einem κ von 17,3 wird verwendet. Das Enzym wird bei 10 ABTS-Einheiten pro g Zellstoff dosiert. Der Test kann mit oder ohne Mediatoren wie z.B. jenen, die zuvor beschrieben wurden, durchgeführt werden.
250 ml an vorgewärmtem Puffer werden in einen Messzylinder gegeben. 10 g feuchter Zellstoff (bei 72% Feuchtigkeit = 2,8 g trockener Zellstoff) werden in einen herkömmlichen Küchenmixer mit ~120 ml Puffer gegeben. Der Zellstoff wird auf der höchsten Einstellung etwa 30 Sekunden lang gemischt. Die resultierende Aufschlämmung wird in einen Schüttelkolben mit großer Öffnung gegeben (zurückbleibender Zellstoff wird mit verbleibendem Puffer und einer Spatel aus dem Mixer ausgespült), was zu etwa einer 1%igen Stoffdichte im Kolben (2,8 g/250 ml) führt.
Das Enzym +/– Mediator wird zugesetzt, und Kontrollen ohne Enzym werden in den Test eingebunden. Die Öffnung des Kolbens wird mit Gaze der Dicke 2 abgedeckt, die mit einem Gummiband fixiert wird. Die Kolben werden in einen Schüttler platziert und 2 Stunden lang bei ~55°C und 350 U/min inkubiert.
Am Ende der Inkubationsdauer werden 500 ml von 2%igem NaOH direkt in die Kolben zugesetzt, und die Temperatur im Schüttler wird auf 70°C eingestellt, und das Reaktionsgemisch wird 1,5 Stunden lang bei 250 U/min inkubieren gelassen. Die Kolbeninhalte werden durch Büchner-Trichter filtriert. Die Zellstoff-Aufschlämmungen werden direkt ohne Vakuum in die Trichter gegossen und langsam durchtropfen gelassen, was zur Anlagerung einer Filterschicht innerhalb des Trichters führt.
Nachdem sich der Großteil der Kolbeninhalte im Trichter befindet, wird ein leichtes Vakuum angesetzt, um das Material innerhalb des Trichters zusammenbacken zu lassen. Das Filtrat (flüssig) wird in den ursprünglichen Schüttelkolben zurückgeschüttet und herumgewirbelt, um restlichen Zellstoff von den Rändern zu waschen. Das Filtrat wird zurück zuoberst des Filterkuchens geschüttet. Das Endresultat ist ein äußerst klares, hellgolden-farbiges Filtrat, wobei der Großteil des Zellstoffs im Trichter eingefangen ist. Der Filterkuchen wird ohne Vakuum durch vorsichtiges Gießen von 1 l DI-Wasser über den Filterkuchen und selbständiges Durchtropfenlassen gewaschen. Ein Vakuum wird nur am Ende angelegt, um den Kuchen trockenzusaugen. Die Filterkuchen werden in den Trichtern über Nacht in einem Ofen bei 100°C getrocknet. Der getrocknete Zellstoff wird am nächsten Tag händisch von den abgekühlten Trichtern abgeschabt. Mikrokappa-Bestimmungen, basierend auf dem Verfahren des Scandinavian Pulp, Paper and Board Testing Committee Scan-c 1:77 (The Scandinavian Pulp, Paper and Board Testing committee Box 5604, S-114, 86 Stockholm, Schweden), werden durchgeführt, um % Delignifizierung zu bestimmen.
Beispiel IV
Beispiel IV beschreibt das Southern-Hybridisierungsverfahren, das zur Identifikation von homologen Genen aus anderen Organismen verwendet wird.
Die genomische DNA aus mehreren Pilzstämmen einschließlich Stachybotrys chartarum, Myrothecium verruvaria, Myrothecium cinctum, Curvalaria pallescens, Humicola insulas, Pleurotus eryngii, Pleurotus abalous, Aspergillus niger, Corpinus cineras, Mycellophthora thermophila, Trichoderma reesei, Trametes vesicolor, Chaetomium sp und Bipolaris spicifera wurde isoliert. Alle Pilzspezies wurden entweder in CSL-Medium (beschrieben in Dunn-Coleman et al., Bio/Technology 9, 976–981 (1991)) oder in MB-Medium (Glucose 40 g/l, Sojabohnenmehl 10 g/l, MB-Spurenelemente 1 ml/l bei pH 5,0) 2 bis 4 Tage lang gezüchtet. Die Myzelien wurden durch Filtrieren durch Mirocloth (Calbiochem) geerntet. Die genomische DNA wurde aus Zellen durch wiederholte Phenol/Chloroform-Extraktion gemäß der Arbeitsvorschrift zu genomischer Pilz-DNA-Reinigung (M. J. Hynes, C. M. Corrick, J. A. King, Mol. Cell Biol. 31, 1430–1439 (1983)) extrahiert. 5 μg genomische DNA wurden mit Restriktionsenzym EcoRI oder HindIII über Nacht bei 37°C verdaut, und DNA-Fragmente wurden auf 1% Agarosegel durch Elektrophorese in TBE-Puffer getrennt. Die DNA-Fragmente wurden dann vom Agarosegel auf die Nitrocellulose-Membran in 20 × SSC-Puffer übertragen. Die für Southern-Analyse verwendete Sonde wurde aus Plasmiden isoliert, die entweder die gesamte Kodierregion des phenoloxidierenden Enzyms aus Stachybotrys (Seq.-ID Nr. 1) oder ein DNA-Fragment, das durch PCR-Reaktion gebildet wurde und den inneren Teil der Gene mit einer Größe von mehr als 1 kb abdeckte, enthielten. Die Primer, die verwendet wurden, um das PCR-Fragment zu bilden, waren Primer 1, der die folgende Sequenz enthielt: TATTACTTTCCNAAYTAYCA, worin N ein Gemisch aus allen vier Nucleotiden (A, T, C und G) und Y ein Gemisch aus nur T und C darstellt, und Primer 2, der die folgende Sequenz enthielt: TCGTATGGCATNACCTGNCC. Southern-Hybridisierung erfolgte 18 bis 20 Stunden lang bei 37°C in einem Hybridisierungspuffer mäßiger Stringenz, der 25% Formamid, 5 × SSPE, 0,5% SDS und 50 μg/ml gescherte Hering-DNA enthielt. Die Blots wurden einmal bei 50°C 30 Minuten lang in Gegenwart von 1 × SSC und 0,1% SDS gewaschen und neuerlich bei 50°C 30 Minuten lang in 0,5 × SSC und 0,1% SDS gewaschen. Mit den Southern-Blots wurde ein Röntgenfilm mehr als 20 Stunden lang und bis zu 3 Tage lang belichtet. Die 6, 7 und 8 zeigten, dass die genomischen DNAs mehrerer Pilzspezies Sequenzen enthielten, die in der Lage waren, unter den zuvor beschriebenen Bedingungen an die für das phenoloxidierende Stachybotrys-Enzym kodierende in Seq.-ID Nr. 1 gezeigte Nucleinsäure zu hybridisieren. Diese Pilzspezies, die das stärkste Signal abgeben (was auf eine höhere Identität zur Nucleinsäurensonde hinweisen kann als jene, die ein schwächeres Signal abgeben), sind Myrothecium verrucaria, Curvalaria pallescens, Chaetomium sp, Bipolaris spicifera und Amerosporium atrum. Pilzspezies, die auch an Nucleinsäure, die für das phenoloxidierende Stachybotrys-Enzym kodiert, hybridisieren, wurden in genomischer DNA von Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei und Mycellophthora thermophila nachgewiesen.
Beispiel V
Beispiel V beschreibt das Klonieren von Genen, die für Pilzenzyme kodieren, die in der Lage sind, an das phenoloxidierende Stachybotrys-Enzym aus Seq.-ID Nr. 1 zu hybridisieren.
A. Bipolaris spicifera
Basierend auf dem DNA- und Proteinsequenz-Vergleich des phenoloxidierenden Enzyms aus Seq.-ID Nr. 1 (aus Stachybotrys chartarum) und Bilirubin-Oxidase aus Myrothecium verruvaria (GenBank Nummer 14081) wurde eine Reihe von Oligonucleotid-Primern entworfen, um verwandte Sequenzen aus zahlreichen verschiedenen Organismen mittels Hybridisierungsverfahren zu isolieren. Die folgenden Oligonucleotid-Primer (Primer 1: 5' TGGTACCAYGAYCAYGCT 3' und Primer 2: 5' RGACTCGTAKGGCATGAC 3' (worin das Y ein ausgeglichenes Gemisch aus Nucleotiden T und C ist, R ein ausgeglichenes Gemisch aus Nucleotiden A und G ist und K für ein ausgeglichenes Gemisch aus Nucleotiden T und G steht) wurden verwendet, um ein phenoloxidierendes Enzym aus Bipolaris spicifera zu klonieren. Die aus Bipolaris spicifera isolierte genomische DNA wurde 10fach mit Tris-EDTA-Puffer zu einer Endkonzentration von 63 ng/μl verdünnt. 10 μl von verdünnter DNA wurden zu einem Reaktionsgemisch zugesetzt, das 0,2 mM von jedem Nucleotid (A, G, C und T), 1 × Reaktionspuffer (10 mM Tris, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl bei pH 8,3) in einem Gesamtvolumen von 100 μl Reaktionsgemisch in Gegenwart der Primer 1 und 2 enthielt. Nach Erhitzen des Gemischs bei 100°C 5 Minuten lang wurden 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Die PCR-Reaktion wurde bei 95°C 1 Minute lang durchgeführt, der Primer wurde an die Matrize bei 50°C 1 Minute lang anelliert, und Extension erfolgte bei 72°C 1 Minute lang. Dieser Zyklus wurde 30-mal wiederholt, um ein auf Gel sichtbares PCR-Fragment zu erhalten, und eine Extension bei 72°C wurde 7 Minuten lang nach den 30 Zyklen hinzugefügt. Das durch Agarosegel detektierte PCR-Fragment enthielt ein Fragment von etwa 1 kb, das dann in den Plasmidvektor pCR-II (Invitrogen) kloniert wurde. Das 1-kb-Insert wurde dann Nucleinsäuresequenzierung unterzogen. Das 3'-Ende des Gens wurde mittels RS-PCR-Verfahren (Sarkar et al., PCR Methods and Applications 2, 318–322 (1993)) aus der genomischen DNA von Bipolaris spicifera isoliert. Das PCR-Fragment wurde in den Plasmidvektor pCR-II (Invitrogen) kloniert und sequenziert. Das 5'-Ende des Gens wurde durch dasselbe RS-PCR-Verfahren (Sarkar et al., PCR Methods and Applications 2, 318–322 (1993)) aus der genomischen DNA von Bipolaris spicifera isoliert. Das PCR-Fragment wurde ebenfalls in den Plasmidvektor pCR-II (Invitrogen) kloniert und sequenziert. Die genomische DNA voller Länge (Seq.-ID Nr. 3) einschließlich der Regulationssequenz der Promotor- und Terminationsregionen ist in 2 gezeigt, und die aus genomischen DNA translatierte Aminosäuresequenz ist in 3 (Seq.-ID Nr. 4) gezeigt. Der in 4 gezeigte Sequenzdatenvergleich zeigte, dass sie für ein phenoloxidierendes Enzym, das etwa 60,8% Identität zu dem in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten phenoloxidierenden Stachybotrys-chartarum-Enzym aufweist (bestimmt durch MegAlign Program von DNAstar (DNASTAR, Inc., Maidson, WI 53175) durch Jotun-Hein-Methode (Method in Enzymology 183, 626–645 (1990)) mit einem gap penalty = 11, einer gap length penalty = 3 und Pairwise Alignment Parameters Ktuple = 2), kodiert.
B. Curvularia pallescens
Basierend auf dem Vergleich der Nucleinsäure- und der Proteinsequenzen des phenoloxidierenden Enzyms aus Seq.-ID Nr. 1 (erhältlich aus Stachybotrys chartarum) und Bilirubinoxidase, erhältlich aus Myrothecium verruvaria (GenBank-Zugriffsnummer 14081), wurde eine Reihe von Oligonucleotid-Primern entworfen, um verwandte Sequenzen aus zahlreichen verschiedenen Organismen mittels Hybridisierungsverfahren zu isolieren. Die folgenden Oligonucleotid-Primer (Primer 1: 5' TGGTACCAYGAYCAYGCT 3' und Primer 2: 5' TCGTGGATGARRTTGTGRCAR 3' (worin das Y ein ausgeglichenes Gemisch aus Nucleotiden T und C ist, R ein ausgeglichenes Gemisch aus Nucleotiden A und G ist)) wurden verwendet, um ein phenoloxidierendes Enzym aus Curvularia pallescens zu klonieren. Die aus Curvularia pallescens isolierte genomische DNA wurde mit Tris-EDTA-Puffer zu einer Endkonzentration von 200 ng/μl verdünnt. 10 μl von verdünnter DNA wurden zu einem Reaktionsgemisch zugesetzt, das 0,2 mM von jedem Nucleotid (A, G, C und T), 1 × Reaktionspuffer (10 mM Tris, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl bei pH 8,3) in einem Gesamtvolumen von 100 μl Reaktionsgemisch in Gegenwart der Primer 1 und 2 enthielt. Nach Erhitzen des Gemischs bei 100°C 5 Minuten lang wurden 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Die PCR-Reaktion wurde bei 95°C 1 Minute lang durchgeführt, der Primer wurde an die Matrize bei 50°C 1 Minute lang anelliert, und Extension erfolgte bei 72°C 1 Minute lang. Dieser Zyklus wurde 30-mal wiederholt, und eine Extension bei 72°C wurde 7 Minuten lang nach den 30 Zyklen hinzugefügt. Das durch Agarosegel detektierte PCR-Fragment enthielt ein Fragment von etwa 900 Basenpaaren. Das 900-bp-Fragment wurde dann Nucleinsäuresequenzierung unterzogen. Das 5'-Ende und ein Teil des 3'-Endes der genomischen DNA wurden mittels inverser PCR (T. Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186) aus der genomischen DNA von Curvularia pallescens unter Verwendung von zwei Oligonucleotidpaaren, basierend auf Sequenzdaten aus dem 900-bp-PCR-Fragment, isoliert. Die genomische DNA voller Länge (Seq.-ID Nr. 6) von der Translationsinitiationsstelle zur Translationsterminationsstelle ist in 9 gezeigt, und die mutmaßliche, aus genomischer DNA translatierte Aminosäuresequenz ist in 10 (Seq.-ID Nr. 7) gezeigt. Der in 11 gezeigte Sequenzdatenvergleich veranschaulicht, dass das aus Curvularia pallescens erhältliche phenoloxidierende Enzym mit der Seq.-ID Nr. 7 92,8% Identität zum phenoloxidierenden Enzym aufweist, das aus Bipolaris spicifera kloniert und in Seq.-ID Nr. 4 gezeigt ist (bestimmt durch MegAlign Program von DNAstar (DNASTAR, Inc., Maidson, WI 53175) durch Jotun-Hein-Methode (Method in Enzymology 183, 626–645 (1990)) mit einem gap penalty = 11, einer gap length penalty = 3 und Pairwise Alignment Parameters Ktuple = 2). Seq.-ID Nr. 7 weist 60,8% Identität zum phenoloxidierenden Stachybotrys-Enzym A auf, das in Seq.-ID Nr. 1 gezeigt ist.
C. Amerosporium atrum
Basierend auf dem DNA- und der Proteinsequenzen-Vergleich des phenoloxidierenden Enzyms aus Seq.-ID Nr. 1 (aus Stachybotrys chartarum) und Bilirubinoxidase, erhältlich aus Myrothecium verruvaria (GenBank-Zugriffsnummer 14081), wurde eine Reihe von Oligonucleotid-Primern entworfen, um verwandte Sequenzen aus zahlreichen verschiedenen Organismen mittels Hybridisierungsverfahren zu isolieren. Die folgenden Oligonucleotid-Primer (Primer 1: 5' TGGTACCAYGAYCAYGCT 3' und Primer 2: 5' CXAGACRACRTCYTTRAGACC 3' (worin Y ein ausgeglichenes Gemisch aus Nucleotiden T und C ist, R ein ausgeglichenes Gemisch aus Nucleotiden A und G ist und X ein ausgeglichenes Gemisch aus Nucleotiden G, A, T und C ist)) wurden verwendet, um ein phenoloxidierendes Enzym aus Amerosporium atrum zu klonieren. Ein Reaktionsgemisch, das 0,2 mM von jedem Nucleotid (A, G, C und T), 1 × Reaktionspuffer (10 mM Tris, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl bei pH 8,3), 1 μl von 50 pmol/μl Primer 1 und 2 in einem Gesamtvolumen von 50 μl Reaktionsgemisch enthielt, wurde zu einem heißen Start-Röhrchen (Molecular Bio-Products) zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 95°C 90 Sekunden lang erhitzt, und die Röhrchen wurden auf Eis 5 Minuten lang gekühlt. Die aus Amerosporium atrum isolierte genomische DNA wurde 10fach mit Tris-EDTA-Puffer zu einer Endkonzentration von 41 ng/μl verdünnt. Etwa 1 μl der verdünnten DNA wurde zum heißen Start-Röhrchen mit 1 × Reaktionspuffer (100 mM Tris, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl bei pH 8,3) und 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 50 μl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde fünf Minuten lang auf 95°C erhitzt. Die PCR-Reaktion erfolgte 1 Minute lang bei 95°C, der Primer wurde an die Matrize 1 Minute lang bei 51°C anelliert, und Extension erfolgte 1 Minute lang bei 72°C. Dieser Zyklus wurde 29-mal wiederholt, um ein auf Gel sichtbares PCR-Fragment zu erhalten, und eine Extension wurde nach 29 Zyklen bei 72°C 7 Minuten lang hinzugefügt. Das mittels Agarosegel nachgewiesene PCR-Fragment enthielt ein Fragment von etwa 1 kb. Das 1-kb-Insert wurde dann Nucleinsäuresequenzierung unterzogen. Die genomische Sequenz für Amerosporium atrum ist in 13 gezeigt. Ein Aminosäureabgleich der aus Amerosporium atrum erhältlichen Aminosäure aus Seq.-ID Nr. 2 ist in 14 gezeigt.
Beispiel VI
Beispiel VI veranschaulicht das Bipolaris-spicifera-pH-Profil, gemessen bei 470 nm unter Verwendung von Guajacol als Substrat.
Phenoloxidierendes Enzym, das aus Bipolaris spicifera erhältlich ist, wurde in Wasser verdünnt und bei einer Endkonzentration von 20 mM zu 96-Well-Platten zugesetzt, die das Briton-Robinson-Puffersystem enthielten. Guajacol (Sigma Katalog-Nr. 6-5502) wurde zu den Wells zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt. Die Reaktion wurde 15 Minuten lang bei einer Temperatur von 25°C laufen gelassen, und Ablesungen wurde alle 11 Minuten unter Verwendung eines Spektralphotometers bei einer λ von 470 nm vorgenommen. Die Resultate sind in 12 gezeigt.
Das Briton-Robinson-Puffersystem ist in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
Beispiel VII
Beispiel VII veranschaulicht das Bleichen von Tomatenflecken durch phenoloxidierendes Enzym, das aus Bipolaris spicifera erhältlich ist und die in Seq.-ID Nr. 4 gezeigte Sequenz umfasst. Das Vermögen, Flecken zu bleichen, wurde durch Waschen von Baumwollstoffmuster, die mit Tomatenflecken beschmutzt waren, bestimmt.
Die Versuche wurden in kleinen 250-ml-Behältern durchgeführt, zu denen 15 ml Waschlösung zugesetzt wurden (in den Tabellen angegeben). Der pH der Waschlösung wurde auf pH 9 eingestellt. Gereinigtes phenoloxidierendes Enzym, das aus Bipolaris spicifera erhältlich ist und eine in Seq.-ID Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, wurde zu der Waschlösung bei einer Endkonzentration von 100 mg/l zugesetzt. Phenothiazin-10-propionat (PTP) wurde als Enhancer in einer Dosierung von 250 μM verwendet. Die folgende Formulierung wurde als Waschlösung (2 g/l) verwendet: Waschmittelzusammensetzung:

LAS 24%

STP 14,5%

Wasserfreies Natriumcarbonat 17,5%

Silicat 8,0%

SCMC 0,37%

Blaupigment 0,02%

Feuchtigkeit/Salze 34,6%
Die Stoffmuster wurden 30 Minuten lang bei 30°C gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Stoffmuster im Traumeltrockner getrocknet, und die Reflexionsspektren wurden unter Verwendung eines Spektrometers von Minolta gemessen. Die Daten zu den Farbunterschieden zwischen den Stoffmustern vor und nach dem Waschen wurden im CIELAB L*a*b*-Farbraum angegeben. In diesem Farbraum steht L* für Helligkeit, und a* und b* sind Farbkoordinaten. Farbunterschiede zwischen zwei Stoffmustern sind als ΔE ausgedrückt, die aus der folgenden Gleichung berechnet wird: ΔE = √ΔL2 + Δa2 + Δb2
Die Resultate in Form von ΔE-Werten sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt:

Waschen ohne Bleichsystem Waschen mit Bleichsystem

ΔE = 4,8 ΔE = 6,9
Wie aus den ΔE-Werten ersichtlich ist, wird das Bleichen des Tomatenflecks in Gegenwart des Enzym/Enhancer-Systems verbessert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Phenoloxidierendes Enzym, für das eine Nucleinsäure kodiert, die in der Lage ist, an die Nucleinsäure mit der in 2, 9 oder 13 gezeigten Sequenz unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren.
Phenoloxidierendes Enzym nach Anspruch 1, umfassend die in 3, 10 oder 13 offenbarte Aminosäuresequenz.
Phenoloxidierendes Enzym nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das aus einer Bakterie, einer Hefe oder einem Pilz, der nicht Stachybotrys ist, erhältlich ist.
Phenoloxidierendes Enzym nach Anspruch 3, worin dieser Pilz Myrothecium-Spezies, Curvularia-Spezies, Chaetomium-Spezies, Bipolaris-Spezies, Humicola-Spezies, Pleurotus-Spezies, Trichoderma-Spezies, Mycellophthora-Spezies und Amerosporium-Spezies umfasst.
Phenoloxidierendes Enzym nach Anspruch 4, worin der Pilz Myrothecium verrucaria, Curvalaria pallescens, Chaetomium sp, Bipolaris spicifera, Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei, Mycellophthora thermophila und Amerosporium atrum umfasst.
Phenoloxidierendes Enzym nach Anspruch 4, worin der Pilz eine Bipolaris-Spezies, eine Curvularia-Spezies oder eine Amerosporium-Spezies ist.
Phenoloxidierendes Enzym nach Anspruch 6, worin der Pilz Bipolaris spicifera, Curvularia pallescens oder Amerosporium atrum ist.
Isoliertes Polynucleotid, das in der Lage ist, an das aus der in 2, 9 oder 13 gezeigten Sequenz bestehende Polynucleotid oder ein Fragment davon unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren, das für das Enzym nach Anspruch 1 kodiert.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 8, das für die Aminosäure kodiert, die die in 3, 10 oder 13 gezeigte Sequenz umfasst.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 9, das zumindest 60% Identität mit der in 2 offenbarten Nucleinsäuresequenz aufweist.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 10, umfassend die in 2, 9 oder 13 offenbarte Nucleinsäuresequenz.
Expressionsvektor, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 8 bis 11.
Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 12.
Verfahren zur Herstellung eines phenoloxidierenden Enzyms in einer Wirtszelle, die folgenden Schritte umfassend: a) Erhalten einer Wirtszelle, die ein Polynucleotid umfasst, das in der Lage ist, an die Nucleinsäure mit der in 2, 9 oder 13 gezeigten Sequenz oder ein Fragment davon unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren; b) Züchten dieser Wirtszelle unter für die Produktion des phenoloxidierenden Enzyms geeigneten Bedingungen; und c) gegebenenfalls Gewinnen des produzierten phenoloxidierenden Enzyms.
Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die ein phenoloxidierendes Enzym umfasst, die folgenden Schritte umfassend: a) Erhalten eines Polynucleotids, das in der Lage ist, an die Nucleinsäure mit der in 2, 9 oder 13 gezeigten Sequenz oder ein Fragment davon unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren; b) Einführen des Polynucleotids in die Wirtszelle; und c) Züchten der Wirtszelle unter für die Produktion des phenoloxidierenden Enzyms geeigneten Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, worin das phenoloxidierende Enzym nach einem der Ansprüche 2 bis 7 definiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 8 bis 11 definiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17 oder Wirtszelle nach Anspruch 13, worin die Wirtszelle ein Fadenpilz, eine Hefe oder ein Bakterium ist.
Verfahren oder Wirtszelle nach Anspruch 18, worin die Wirtszelle ein Fadenpilz ist.
Verfahren oder Wirtszelle nach Anspruch 19, worin der Fadenpilz eine Aspergillus-Spezies, eine Trichoderma-Spezies oder eine Mucor-Spezies ist.
Verfahren oder Wirtszelle nach Anspruch 20, worin die Aspergillus-Spezies Aspergillus niger var. awamori ist.
Verfahren oder Wirtszelle nach Anspruch 18, worin die Wirtszelle eine Hefe ist.
Verfahren oder Wirtszelle nach Anspruch 22, worin die Hefe eine Saccharomyces-, Pichia-, Schizosaccharomyces-, Hansenula-, Kluyveromyces- oder Yarrowia-Spezies ist.
Verfahren oder Wirtszelle nach Anspruch 18, worin die Wirtszelle ein Bakterium ist.
Verfahren oder Wirtszelle nach Anspruch 24, worin das Bakterium eine Bacillus- oder Escherichia-Spezies ist.