DE69937395T2 - Phenol oxydierende enzyme und deren verwendung - Google Patents

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oxidizing enzyme
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    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
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    • C11D3/38654—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing oxidase or reductase
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft neue Phenol oxidierende Enzyme, insbesondere neue Phenol oxidierende Enzyme, die von Stämmen von Stachybotrys abgeleitet sind. Die Erfindung stellt Verfahren und Wirtszellen zum Exprimieren von Phenol oxidierenden Enzymen aus Stachybotrys sowie Verfahren zum Herstellen von Expressionssystemen bereit. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Modifizieren einer gefärbten Verbindung und zur Farbstofftransferverhütung während des Waschens von Stoffen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine enzymatische Detergenszusammensetzung zum Bleichen von Flecken oder Antifarbstofftransfer.
  • Hintergrund der Erfndung
  • Phenol oxidierende Enzyme entfalten ihre Wirksamkeit, indem sie Redoxreaktionen katalysieren, d. h. den Transfer von Elektronen von einem Elektronendonor (üblicherweise einer phenolischen Verbindung) zu molekularem Sauerstoff (welcher als ein Elektronenakzeptor wirkt), der zu H2O reduziert wird. Obwohl sie in der Lage sind, ein breites Spektrum von verschiedenen phenolischen Verbindungen als Elektronendonoren zu verwenden, sind Phenol oxidierende Enzyme sehr spezifisch für molekularen Sauerstoff als Elektronenakzeptor.
  • Phenol oxidierende Enzyme können für ein breites Spektrum von Anwendungen verwendet werden, einschließlich der Detergens- oder Waschmittelindustrie, der Papier- und Zellstoffindustrie, der Textilindustrie und der Nahrungsmittelindustrie. In der Detergens- oder Waschmittelindustrie sind Phenol oxidierende Enzyme für das Verhüten des Transfers von Farbstoffen in Lösung von einem Textil zu einem anderen während des Waschens mit Waschmittel verwendet worden, eine Anwendung, die üblicherweise als Farbstofftransferhemmung oder -inhibition bezeichnet wird.
  • Die meisten Phenol oxidierenden Enzyme zeigen pH-Optima im sauren pH-Bereich, während sie bei neutralen oder alkalischen pH-Werten inaktiv sind.
  • Phenol oxidierende Enzyme werden bekanntermaßen durch ein breites Spektrum von Pilzen, einschließlich Spezies der Gattungen Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botytis, Pleurotus, Fomes, Phlebia, Trametes, Polyporus, Rhizoctonia und Lentinus, produziert. Es besteht jedoch weiterhin eine Notwendigkeit, Phenol oxidierende Enzyme und Organismen, die in der Lage sind, Phenol oxidierende Enzyme, die pH-Optima im alkalischen Bereich aufweisen, von Natur aus zu produzieren, für eine Verwendung in Detergens- oder Waschmittelwaschverfahren und -zusammensetzungen zu identifizieren und zu isolieren.
  • WO 95/01426 offenbart Laccasen und Mittel, die in der Lage sind, die Aktivitäten von Laccasen zu verstärken. JP 05 199882 A offenbart eine Bilirubinoxidase.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft neue Phenol oxidierende Enzyme, wie in den Ansprüchen definiert, die in der Lage sind, die mit Farbstoffen und gefärbten Verbindungen, welche unterschiedliche chemische Strukturen aufweisen, assoziierte Farbe insbesondere bei neutralem oder alkalischem pH zu modifizieren. Basierend auf ihrer Farbmodifizierungsfähigkeit können Phenol oxidierende Enzyme der Erfindung beispielsweise für das Zellstoff- und Papierbleichen, zum Bleichen der Farbe von Flecken auf Stoffen und zum Antifarbstofftransfer in Detergens- bzw. Waschmittel- und Textilanwendungen verwendet werden. Unter einem Aspekt der Erfindung ist das Phenol oxidierende Enzym in der Lage, die Farbe in Abwesenheit eines Verstärkers zu modifizieren. Unter einem anderen Aspekt der Erfindung ist das Phenol oxidierende Enzym in der Lage, die Farbe in Gegenwart eines Verstärkers zu modifizieren.
  • Die Erfindung stellt ein Phenol oxidierendes Enzym, welches aus Stachybotrys erhältlich ist und mindestens 65% Identität mit dem Phenol oxidierenden Enzym mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 offenbart, aufweist, bereit.
  • Die Phenol oxidierenden Enzyme, wie sie in den Ansprüchen offenbart werden, sind aus Stachybotrys erhältlich. In einer anderen Ausführungsform werden die Stachybotrys-Enzyme ausgewählt aus Stämmen der Gruppe bestehend aus S. parvispora, einschließlich insbesondere S. parvispora var. hughes MUCL 38996; Stämmen der Spezies S. chartarum einschließlich insbesondere S. chartarum MUCL 38898; S. parvispora MUCL 9485; S. chartarum MUCL 30782; S. kampalensis MUCL 39090; S. theobromae MUCL 39293; und Stämmen der Spezies S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes und S. nilagerica. Unter einem Aspekt stellt die Erfindung ein Phenol oxidierendes Enzym bereit, das ein Molekulargewicht von etwa 38 kD hat, wie durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gemessen. Unter einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Phenol oxidierendes Enzym bereit, das ein Molekulargewicht von etwa 30,9 kD hat, wie durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemessen.
  • Wenn ein partiell gereinigtes Phenol oxidierendes Enzym, das von einem Stamm von S. parvispora oder S. chartarum erhalten worden ist, gekocht und einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen wurde, wurden drei Molekulargewichtsspezies beobachtet. Für das Phenol oxidierende Enzym, das von S. parvispora MUCL 38996 erhalten worden ist, waren die drei Molekulargewichtsspezies etwa 70 kD, 45 kD und 22,1 kD. Für das Phenol oxidierende Enzym, das von S. chartarum MUCL 38898 erhalten worden ist, waren die drei Molekulargewichtsspezies etwa 58,4 kD, 46,1 kD und 19,7 kD. Die Erfindung umfasst eine jegliche Phenol oxidierendes Enzym-Aktivität, die einer jeglichen von diesen Molekulargewichtsspezies allein oder in Kombination mit wenigstens einer anderen der Molekulargewichtsspezies innewohnt. Das Phenol oxidierende Enzym, wie in den Ansprüchen definiert, zeigt nach dem Kochen eine Zunahme des apparenten oder scheinbaren Molekulargewichts, wobei das Molekulargewicht durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt wird.
  • Die Phenol oxidierenden Enzyme der Erfindung sind in der Lage, die mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren und weisen wenigstens eine antigene Gruppe auf, die sie mit dem Phenol oxidierenden Enzym, das von Natur aus durch S. parvispora MUCL 38996 produziert wird, und/oder dem Phenol oxidierenden Enzym, das von Natur aus durch S. chartarum MUCL 38898 produziert wird, wie durch die Ouchterlony-Technik, in welcher ein positives Enzym eine Immunpräzipitationslinie zeigt, gemessen, gemein haben. In einer Ausführungsform ist die Immunpräzipitationslinie eine Linie vom Typ 1. In einer Ausführungsform ist das Phenol oxidierende Enzym, welches wenigstens eine antigene Gruppe aufweist, die es mit dem Phenol oxidierenden Enzym, das von Natur aus durch S. parvispora MUCL 38996 produziert wird, gemein hat, erhältlich aus Stachybotrys Die Erfindung umfasst auch Mutanten des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys, solange die Mutante in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren.
  • In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Polynucleotid, welches ein Phenol oxidierendes Enzym, welches aus Stachybotrys erhältlich ist, codiert, bereit, wobei das Polynucleotid eine Nucleinsäuresequenz mit mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% und mindestens 95% Identität mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 umfasst, solange das Polynucleotid ein Phenol oxidierendes Enzym codiert, welches in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. Die Erfindung umfasst auch Polynucleotidsequenzen, die in der Lage sind, unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz an das in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigte Polynucleotid zu hybridisieren, oder jene, die dazu komplementär sind. Die Erfindung stellt auch Polynucleotide bereit, die die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, codieren. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Polynucleotid die Nucleinsäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigt, auf. Die Erfindung stellt auch Expressionsvektoren und Wirtszellen, die Polynucleotide der Erfindung umfassen, bereit.
  • Die Erfindung betrifft zusätzlich Verfahren zum Herstellen eines Phenol oxidierenden Enzyms, welches aus Stachybotrys erhältlich ist. Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des Enzyms bereit, welches die Schritte umfasst, eine Wirtszelle, umfassend ein Polynucleotid, welches das Phenol oxidierende Enzym, welches aus Stachybotrys erhältlich ist, codiert, zu erhalten, wobei das Enzym mindestens 65% Identität mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz aufweist; die Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Produktion des Phenol oxidierenden Enzyms geeignet sind, zu kultivieren; und gegebenenfalls das produzierte Phenol oxidierende Enzym zu gewinnen. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen eines Phenol oxidierenden Enzyms bereit, welches den Schritt umfasst, eine rekombinante Wirtszelle, welche durch die Expression eines Polynucleotids, welches ein Phenol oxidierendes Enzym, welches aus Stachybotrys erhältlich ist, codiert, gekennzeichnet ist, wobei das Enzym mindestens 65% Identität mit der Aminosäure mit der Sequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, aufweist, zu kultivieren; und gegebenenfalls das Phenol oxidierende Enzym zu gewinnen. In einer Ausführungsform liegt das Polynucleotid auf einem replizierenden Plasmid vor und in einer anderen Ausführungsform ist es in das Wirtsgenom integriert.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die Sequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die Sequenz, wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polynucleotid in der Lage, unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz an SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 zu hybridisieren, oder ist komplementär zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Wirtszelle bereit, welche ein Polynucleotid, welches ein Phenol oxidierendes Enzym der Erfindung codiert, umfasst, welches den Schritt umfasst, ein Polynucleotid, welches das Phenol oxidierende Enzym, welches aus Stachybotrys erhältlich ist und wenigstens 65% Identität mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz aufweist, codiert, in eine Wirtszelle einzuführen; und gegebenenfalls die Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Produktion des Phenol oxidierenden Enzyms geeignet sind, zu kultivieren. In einer Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die Sequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die Sequenz, wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polynucleotid in der Lage, unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz an SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 zu hybridisieren, oder ist komplementär zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3.
  • Unter einem Aspekt der Erfindung umfasst die rekombinante Wirtszelle, welche ein Polynucleotid umfasst, welches ein Phenol oxidierendes Enzym codiert, Fadenpilze (filamentöse Pilze), Hefen und Bakterien. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Fadenpilz (filamentöser Pilz), einschließlich der Aspergillus-Spezies, Trichoderma-Spezies und Mucor-Spezies. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die aus einem Fadenpilz (filamentösen Pilz) bestehende Wirtszelle A. niger var. awamori und T. reseei.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle eine Hefe, welche Saccharomyces-, Pichia-, Hansenula-, Schizosacharomyces-, Kluyveromyces- und Yarrowia-Spezies umfasst. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Saccharomyces-Spezies S. cerevisiae. In einer zusätzlichen Ausführungsform ist die Wirtszelle ein grampositives Bakterium, wie eine Bacillus-Spezies, oder ein gramnegatives Bakterium, wie eine Escherichia-Spezies. Die Erfindung umfasst auch Verfahren zum Reinigen des Phenol oxidierenden Enzyms aus solchen Wirtszellen.
  • Es werden hier auch Detergens- oder Waschmittelzusammensetzungen bereitgestellt, welche die Aminosäure mit einer Sequenz mit mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Identität mit dem Phenol oxidierenden Enzym mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz umfassen, solange das Enzym in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Aminosäure die Sequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Phenol oxidierende Enzym durch ein Polynucleotid, welches die Sequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, umfasst, codiert. In einer anderen Ausführungsform wird das Phenol oxidierende Enzym durch ein Polynucleotid, welches die Sequenz, wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt, umfasst, codiert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polynucleotid in der Lage, unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz yon SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 zu hybridisieren, oder ist komplementär zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3.
  • Die Erfindung umfasst auch Verfahren zum Modifizieren der mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen, die in Flecken auf Stoffen vorkommen, assoziierten Farbe, umfassend die Schritte, den Stoff mit einer Zusammensetzung, umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Identität mit dem Phenol oxidierenden Enzym mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz, solange das Enzym in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren, in Kontakt zu bringen. In einer Ausführungsform des Verfahrens weist die Aminosäure die Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt auf. Unter einem Aspekt des Verfahrens liegt das pH-Optimum zwischen 5,0 und 11,0, unter einem anderen Aspekt liegt das pH-Optimum zwischen 7 und 10,5 und unter einem noch anderen Aspekt liegt das pH-Optimum zwischen 8,0 und 10. Unter einem weiteren Aspekt des Verfahrens liegt die optimale Temperatur zwischen 20 und 60°C und unter einem anderen Aspekt zwischen 20 und 40°C. Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Verhindern eines Farbstofftransfers in Detergens- bzw. Waschmittel- und Textilanwendungen bereit.
  • Hier auch bereitgestellt werden Detergens- oder Waschmittelzusammensetzungen, umfassend ein Phenol oxidierendes Enzym von Stachybotrys der Erfindung allein oder in Kombination mit einem Verstärker und anderen Detergens- bzw. Waschmittelinhaltsstoffen, einschließlich Proteasen, Amylasen und/oder Cellulasen
  • Verstärker, die in Detergens- oder Waschmittelzusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Phenothiazin-10-propionsäure (PPT), 10-Methylphenothiazin (MPT), Phenoxazin-10-propionsäure (PPO), 10-Methylphenoxazin (MPO), 10-Ethylphenothiazin-4-carbonsäure (EPC), Acetosyringon, Syringaldehyd, Methylsyringat, 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat (ABTS) und 4-Hydroxy-4-biphenylcarbonsäure oder Derivate davon.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 veranschaulicht das pH-Profil der Oxidation von verschiedenen Chromophoren durch das Phenol oxidierende Enzym aus Stachybotrys parvispora.
  • 2 veranschaulicht das pH-Profil eines Bleichens von Direct Blue 1 als Vergleich zwischen dem Phenol oxidierenden Enzym aus Stachybotrys parvispora und der Bilirubinoxidase aus Myrothecium verrucaria.
  • 3 veranschaulicht das Molekulargewicht des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys chartarum, wie durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Bahn 1 repräsentiert eine ungekochte Probe und Bahn 2 repräsentiert eine gekochte Probe.
  • Die 4A–4B sind eine auf Homologie basierende Aminosäure-Ausrichtung (Aminosäure-Alignment) von Fragmenten des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys chartarum (bezeichnet als St. ch.) gegenüber der Bilirubinoxidase aus Myrothecium verracaria (bezeichnet als biliru oxidas) und dem Mangan-oxidierenden Protein aus LEPTOTHRIX DISCOPHORA (bezeichnet als mpf-A).
  • Die 5A–5B veranschaulichen die Nucleinsäure-(SEQ ID NO: 1) und Aminosäure-(SEQ ID NO: 2)-Sequenz für ein Phenol oxidierendes Enzym, welches aus Stachybotrys chartarum erhältlich ist.
  • Die 6A–6B veranschaulichen die genomische Sequenz (SEQ ID NO: 3) für ein Phenol oxidierendes Enzym, das aus Stachybotrys chartarum erhältlich ist.
  • 7 ist eine auf Homologie basierende Aminosäure-Ausrichtung (Aminosäure-Alignment) des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys, SEQ ID NO: 2 (untere Zeile) und der Bilirubinoxidase (SEQ ID NO: 4).
  • 8 stellt eine Veranschaulichung des Vektors pGAPT bereit, der für die Expression des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys in Aspergillus verwendet worden ist. Die Basen 1 bis 1134 enthalten den Glucoamylasegenpromotor aus Aspergillus niger. Die Basen 1227 bis 1485 und 3079 bis 3100 enthalten den Glucoamylase-Terminator aus Aspergillus niger. Das pyrG-Gen aus Aspergillus nidulans war von 1486 bis 3078 als ein Marker für die Pilz-Transformation inseriert. Der Rest des Plasmids enthält pUC18-Sequenzen für eine Propagierung in E. coli. Nucleinsäure, welche das Phenol oxidierende Enzym aus Stachybotrys von SEQ ID NO: 1 codierte, wurde in die BglII- und XbaI-Restriktionsstellen kloniert.
  • 9A–9B zeigt die Nucleinsäuresequenz des durch PCR erzeugten, in Beispiel 17 beschriebenen Fragments von Stachybotrys, das in Aspergillus exprimiert worden war.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Definitionen
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff Phenol oxidierendes Enzym auf jene Enzyme, die Redoxreaktionen katalysieren und für molekularen Sauerstoff und Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor spezifisch sind. Wenn Phenol oxidierende Enzyme aus Stachybotrys der Erfindung gekocht und einer SDS-Gelelektrophorese unterworfen werden, werden drei Molekulargewichtsspezies beobachtet. Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „Enzym" eine jegliche Molekulargewichtsspezies, die allein oder in Kombination mit mindestens einer anderen Molekulargewichtsspezies in der Lage ist, die mit einem Farbstoff oder einer gefärbten Verbindung assoziierte Farbe zu modifizieren.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich Stachybotrys auf eine jegliche Stachybotrys-Spezies, die ein Phenol oxidierendes Enzym, wie in den Ansprüchen definiert, welches in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren, produziert. Die Erfindung umfasst Derivate von natürlichen Isolaten von Stachybotrys, einschließlich Nachkommenschaft und Mutanten, solange das Derivat in der Lage ist, ein Phenol oxidierendes Enzym zu produzieren, welches in der Lage ist, die mit Farbstoff oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Phenol oxidierende Enzym aus Stachybotrys erhältlich und wird durch das in den Beispielen 4 und 5 offenbarte Verfahren gereinigt.
  • Wie hier bei der Bezugnahme auf Phenol oxidierende Enzyme verwendet, bedeutet der Begriff „erhältlich aus" Phenol oxidierende Enzyme, die äquivalent sind zu jenen, die von dem bestimmten erwähnten mikrobiellen Stamm herstammen oder von Natur aus produziert werden. Um dies zu exemplifizieren, beziehen sich Phenol oxidierende Enzyme, welche aus Stachybotrys erhältlich sind, auf jene Phenol oxidierenden Enzyme, die von Natur aus durch Stachybotrys produziert werden. Die Erfindung umfasst Phenol oxidierende Enzyme, die identisch sind mit jenen, die durch Stachybotrys-Spezies produziert werden, welche aber durch die Verwendung von Techniken der Gentechnologie durch Nicht-Stachybotrys-Organismen, die mit einer Nucleinsäure, welche das Phenol oxidierende Enzym codiert, transformiert sind, produziert werden. Dass sie äquivalent sind, bedeutet, dass das Phenol oxidierende Enzym mindestens eine antigene Gruppe mit dem Phenol oxidierenden Enzym, welches aus S. parvispora MUCL 38996 und/oder S. chartarum MUCL 38898 erhältlich ist, gemein hat, wie durch die Ouchterlony-Technik, in welcher ein positives Enzym eine Immunpräzipitationslinie zeigt, gemessen. Alternativ bedeutet, dass sie äquivalent sind, dass das Phenol oxidierende Enzym durch ein Polynucleotid codiert wird, welches in der Lage ist, unter Bedingungen von mittlerer bis maximaler Stringenz an das Polynucleotid mit der Sequenz, wie in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigt, zu hybridisieren. Dass sie äquivalent sind, bedeutet, dass das Phenol oxidierende Enzym mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Identität mit dem Phenol oxidierenden Enzym mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz aufweist. Prozent Identität auf der Nucleinsäure-Ebene wird bestimmt unter Verwendung des FastA-Programms und Prozent Identität auf der Aminosäure-Ebene wird bestimmt unter Verwendung von TFastA, welche beide das Verfahren von Pearson und Lipman (PNAS USA, 1988, 85: 2444–2448) verwenden. Alternativ wird Identität bestimmt durch das MegAlign Program von DNAstar (DNASTAR, Inc., Maidson, WI 53715), durch die Jotun Hein Method (1990, Method in Enzymology, 183: 626–645) mit einer „gap penalty" = 11, einer „gap length penalty" = 3 und von „Pairwise Alignment Parameters Ktuple" = 2. Die Erfindung umfasst auch Mutanten, Varianten und Derivate der Phenol oxidierenden Enzyme der Erfindung, solange das mutierte, variierte oder abgeleitete Phenol oxidierende Enzym in der Lage ist, mindestens eine charakteristische Aktivität des in der Natur vorkommenden Phenol oxidierenden Enzyms zu bewahren.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „gefärbte Verbindung" auf eine Substanz, die Textilien Farbe zuführt, oder auf Substanzen, welche zu dem sichtbaren Auftreten von Flecken führen. Wie im Dictionary of Fiber and Textile Technology (Hoechst Celanese Corporation (1990) PO Box 32414, Charlotte, NC 28232) definiert, ist ein Farbstoff eine gefärbte Verbindung, die in die Faser durch eine chemische Reaktion, Absorption oder Dispersion inkorporiert wird. Beispiele von Farbstoffen umfassen Direct Blue-Farbstoffe, Acid Blue-Farbstoffe, Direct red-Farbstoffe, Reactive Blue- und Reactive Black-Farbstoffe. Ein Katalog von üblicherweise verwendeten Textilfarbstoffen wird im Colour Index, 3. Aufl., Bände 1–8, gefunden. Beispiele von Substanzen, die zum sichtbaren Auftreten von Flecken führen, sind Polyphenole, Carotinoide, Anthocyanine, Tannine, Maillard-Reaktionsprodukte u. s. w.
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „die mit einem Farbstoff oder einer gefärbten Verbindung assoziierte Farbe modifizieren" oder „Modifizierung der gefärbten Verbindung", dass der Farbstoff oder die Verbindung durch Oxidation derart verändert wird, dass entweder die Farbe modifiziert erscheint, d. h. die Farbe visuell als verringert, abgeschwächt, entfärbt, gebleicht oder entfernt erscheint, oder die Farbe nicht beeinflusst wird, aber die Verbindung derart modifiziert wird, dass die Wiederablagerung des Farbstoffs gehemmt wird. Die Erfindung umfasst die Modifizierung der Farbe durch ein jegliches Mittel oder eine jegliche Maßnahme, einschließlich beispielsweise der vollständigen Entfernung der gefärbten Verbindung aus einem Fleck auf einem Stoff durch ein jegliches Mittel oder eine jegliche Maßnahme, wie auch die Verringerung der Farbintensität oder eine Veränderung der Farbe der Verbindung.
  • Die „Anti-Farbstofftransfer"- oder „Anti-Farbstoff-Wiederablagerungs"-Wirkung kann von der Farbmodifizierungsaktivität einer Phenol oxidierenden Verbindung abhängig sein, d. h. lösliche Farbstoffe oder gefärbte Komponenten werden oxidiert oder gebleicht und sind nicht in der Lage, als eine Farbe auf dem Stoff erneut abgelagert zu werden, oder abhängig von einer Substratmodifizierung in Abwesenheit einer Farbmodifizierung, so dass ein Farbstoff oder eine gefärbte Komponente wasserlöslich wird und fortgespült wird. Die Fähigkeit einer Phenol oxidierenden Verbindung, die allein oder zusammen mit einem Verstärker verwendet wird, eine(n) lösliche(n) oder dispergierte(n) Farbstoff oder gefärbte Verbindung zu einer farblosen Spezies in einer Waschlösung zu oxidieren, verhindert die Farb-Wiederablagerungswirkung.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Mutanten und Varianten", wenn er sich auf Phenol oxidierende Enzyme bezieht, auf Phenol oxidierende Enzyme, die durch Veränderung der in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenz und/oder Struktur davon, wie durch Veränderung der DNA-Nucleotidsequenz des Strukturgens und/oder durch direkte Substitution und/oder Veränderung der Aminosäuresequenz und/oder der Struktur des Phenol oxidierenden Enzyms, erhalten werden. Der Ausdruck „Derivat" eines Phenol oxidierenden Enzyms, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Abschnitt oder ein Fragment der in der Natur vorkommenden, volle Länge aufweisenden oder variierten Aminosäuresequenz des Phenol oxidierenden Enzyms, der bzw. das mindestens eine Aktivität des in der Natur vorkommenden Phenol oxidierenden Enzyms bewahrt. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Mutanten und Varianten", wenn er sich auf mikrobielle Stämme bezieht, auf Zellen, die gegenüber einem natürlichen Isolat in irgendeiner Form verändert sind, beispielsweise indem sie eine veränderte DNA-Nucleotidsequenz von beispielsweise dem Strukturgen, welches das Phenol oxidierende Enzym codiert; Veränderungen an einem natürlichen Isolat, um die Produktion von Phenol oxidierendem Enzym zu verstärken; oder andere Veränderungen, die die Expression von Phenol oxidierendem Enzym beeinflussen, aufweisen.
  • Der Begriff „Verstärker" („Enhancer") oder „Vermittlersubstanz" („Mediator") bezieht sich auf eine jegliche Verbindung, die in Assoziation mit einem Phenol oxidierenden Enzym in der Lage ist, die mit einem Farbstoff oder einer gefärbten Verbindung assoziierte Farbe zu modifizieren, oder eine Verbindung, die die oxidative Aktivität des Phenol oxidierenden Enzyms erhöht. Das Verstärkungsmittel ist typischerweise eine organische Verbindung.
  • Phenol oxidierende Enzyme
  • Die Phenol oxidierenden Enzyme der Erfindung entfalten ihre Wirkung, indem sie Redoxreaktionen katalysieren, d. h. den Transfer von Elektronen von einem Elektronendonor (üblicherweise einer phenolischen Verbindung) zu molekularem Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid (welcher bzw. welches als ein Elektronenakzeptor wirkt), welcher bzw. welches zu Wasser reduziert wird. Beispiele von solchen Enzymen sind Laccasen (EC 1.10.3.2), Bilirubinoxidasen (EC 1.3.3.5), Phenoloxidasen (EC 1.14.18.1), Catecholoxidasen (EC 1.10.3.1).
  • Die Erfindung umfasst Phenol oxidierende Enzyme aus Stachybotrys, wie in den Ansprüchen definiert, die in der Lage sind, die mit einem Farbstoff oder einer gefärbten Verbindung assoziierte Farbe zu modifizieren und die mindestens eine antigene Gruppe mit dem Phenol oxidierenden Enzym, das von Natur aus durch S. parvispora MUCL 38996 produziert wird, und/oder dem Phenol oxidierenden Enzym, welches von Natur aus durch S. chartarum MUCL 38898 produziert wird, gemein haben. Ein Verfahren zum Messen des Vorhandenseins von gemeinsamen antigenen Determinanten erfolgt mittels der doppelten Immundiffusionstests (Ouchterlony-Technik), welche dem in Clausen, J. (1988) Immunochemical Technique for the Identification and Estimation of Macromolecules (3. durchgesehene Auflage), Burdon, R. H., und P. H. van Knippenberg, Hrsg., auf Seite 281 (Anhang 11, „Micro technique") erläuterten Protokoll folgen und unter den dort spezifizierten Bedingungen ausgeführt werden, und wie interpretiert gemäß dem Protokoll, das in Clausen, a. a. O., in Kapitel 6, S. 143–146 beschrieben worden ist und unter den ebenda spezifizierten Bedingungen. Ein anderes Verfahren zum Messen des Vorhandenseins von gemeinsamen antigenen Determinanten erfolgt durch Western-Blot (Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, John Wiley & Sons, Inc., Abschnitt 10.8: Immunoblotting and Immunodetection).
  • Ein Phenol oxidierendes Enzym, das aus S. parvispora MUCL 38996 erhältlich ist und gemäß den Beispielen 4 und 5 hergestellt worden ist, weist ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 38 Kilodalton (kD) auf, wie durch eine SDS-PAGE-Analysenmethode bestimmt, und einen scheinbaren isoelektrischen Punkt unter 2,8, wie in Beispiel 6 definiert. Ein Phenol oxidierendes Enzym, das aus S. chartarum MUCL 38898 erhältlich ist und durch das Verfahren der Beispiele 4 und 5 hergestellt worden ist, weist ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30,9 Kilodalton auf, wie durch eine SDS-PAGE-Analysenmethode bestimmt.
  • Die Erfindung umfasst Phenol oxidierende Enzyme von Stachybotrys, welche mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Identität mit dem Phenol oxidierenden Enzym mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz umfassen.
  • Nucleinsäure, welche Phenol oxidierende Enzyme codiert
  • Die Erfindung umfasst Polynucleotide, die Phenol oxidierende Enzyme, welche aus Stachybotrys-Spezies erhältlich sind, codieren, welche Polynucleotide mindestens 65% Identität, mindestens 70% Identität, mindestens 75% Identität, mindestens 80% Identität, mindestens 85% Identität, mindestens 90% Identität oder mindestens 95% Identität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 offenbarten Polynucleotidsequenz umfassen, solange das durch das Polynucleotid codierte Enzym in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Phenol oxidierende Enzym die Polynucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt oder wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt, auf oder ist in der Lage, an SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 zu hybridisieren, oder ist komplementär dazu. Wie sich für den Fachmann auf diesem Gebiet versteht, können aufgrund der Degeneration des genetischen Codes verschiedene Polynucleotide das in SEQ ID NO: 2 offenbarte Phenol oxidierende Enzym codieren. Die Erfindung umfasst alle derartigen Polynucleotide.
  • Die Nucleinsäure, welche ein Phenol oxidierendes Enzym codiert, kann erhalten werden durch Standardverfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, ausgehend von beispielsweise klonierter DNA (z. B. einer DNA-„Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonierung, durch PCR oder durch Klonieren von genomischer DNA oder von Fragmenten davon, aus einer gewünschten Zelle, wie einer Stachybotrys-Spezies, gereinigt werden (Siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd. Oxford, Vereinigtes Königreich, Band I, II). Von genomischer DNA abgeleitete Nucleinsäuresequenzen können zusätzlich zu codierenden Regionen regulatorische Regionen enthalten. Was auch immer die Quelle ist, sollte die isolierte Nucleinsäure, welche ein Phenol oxidierendes Enzym der Erfindung codiert, in einen geeigneten Vektor für eine Propagierung des Gens molekular kloniert werden.
  • Bei der molekularen Klonierung des Gens ausgehend von genomischer DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen codieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physisch geschert werden, wie beispielsweise durch Beschallen. Die linearen DNA-Fragmente können dann entsprechend der Größe aufgetrennt werden durch Standardtechniken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese, PCR und Säulenchromatographie.
  • Sind Nucleinsäurefragmente einmal erzeugt, kann die Identifizierung des speziellen DNA-Fragments, welches ein Phenol oxidierendes Enzym codiert, auf verschiedene Weisen bewerkstelligt werden. Beispielsweise kann ein ein Phenol oxidierendes Enzym codierendes Gen der Erfindung oder dessen spezifische RNA oder ein Fragment davon, wie eine Sonde oder ein Primer, isoliert und markiert und dann in Hybridisierungsassays verwendet werden, um ein erzeugtes Gen nachzuweisen (Benton, W., und Davis, R., 1977, Science 196: 180; Grunstein, M., und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961). Jene DNA-Fragmente, welche gleichermaßen substantielle Sequenzähnlichkeit zu der Sonde aufweisen, werden unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
  • Die Erfindung umfasst Phenol oxidierende Enzyme, die aus Stachybotrys-Spezies erhältlich sind, die durch Nucleinsäurehybridisierungstechniken unter Verwendung von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 als Sonde oder Primer und Screenen von Nucleinsäure von entweder genomischem oder cDNA-Ursprung identifiziert werden. Nucleinsäure, welche Phenol oxidierende Enzyme, welche aus Stachybotrys-Spezies erhältlich sind, codiert und mindestens 65% Identität mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist, kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder -Amplifizierung unter Verwendung von Sonden, Abschnitten oder Fragmenten von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 nachgewiesen werden. Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäure, welche ein Phenol oxidierendes Enzym, welches durch die Erfindung umfasst wird, codiert, bereit, welches umfasst, einen Teil oder die Gesamtheit einer Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 mit Stachybotrys-Nucleinsäure von entweder genomischem oder cDNA-Ursprung zu hybridisieren.
  • Innerhalb des Umfangs der Erfindung sind auch Polynucleotidsequenzen enthalten, die in der Lage sind, an die in SEQ ID NO: 1 offenbarte Nucleotidsequenz unter Bedingungen von mittlerer bis maximaler Stringenz zu hybridisieren. Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nucleinsäure-Bindungskomplexes, wie in Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego, CA) gelehrt wird, und verleihen eine definierte „Stringenz", wie nachfolgend erläutert wird.
  • „Maximale Stringenz” tritt typischerweise bei etwa Tm – 5°C (5°C unterhalb der Tm der Sonde) auf; „hohe Stringenz" bei etwa 5°C bis 10°C unterhalb der Tm; „mittlere Stringenz" bei etwa 10°C bis 20°C unterhalb der Tm; und „niedrige Stringenz" bei etwa 20°C bis 25°C unterhalb der Tm. Wie sich für die Fachleute auf diesem Gebiet versteht, kann eine Hybridisierung bei maximaler Stringenz verwendet werden, um identische Polynucleotidsequenzen zu identifizieren oder nachzuweisen, während eine Hybridisation bei mittlerer oder niedriger Stringenz verwendet werden kann, um Polynucleotidsequenz-Homologe zu identifizieren oder nachzuweisen.
  • Der Begriff „Hybridisation", wie er hier verwendet wird, soll „den Prozess, durch welchen ein Strang von Nucleinsäure sich mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung verbindet" („the process by which a strand of nucleic acid joins with a complementary strand through base pairing") (Coombs, J. (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY), umfassen.
  • Das Amplifizierungsverfahren, wie es bei Polymerasekettenreaktions (PCR)-Techniken ausgeführt wird, wird in Dieffenbach, CW, und GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) beschrieben. Eine Nucleinsäuresequenz von mindestens etwa 10 Nucleotiden und mit bis zu etwa 60 Nucleotiden aus SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, vorzugsweise etwa 12 bis 30 Nucleotiden und mehr bevorzugt etwa 25 Nucleotiden kann als Sonde oder PCR-Primer verwendet werden.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Isolieren eines Nucleinsäurekonstrukts der Erfindung aus einer cDNA- oder genomischen Bibliothek erfolgt durch die Verwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von degenerierten Oligonucleotid-Sonden, die auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des Proteins mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, hergestellt worden sind. Beispielsweise kann die PCR ausgeführt werden unter Verwendung der Techniken, die in dem U.S.-Patent Nr. 4,683,202 beschrieben werden.
  • Expressionssysteme
  • Die Erfindung stellt Wirtszellen, Expressionsverfahren und -systeme für die Herstellung von Phenol oxidierenden Enzymen gemäß der Erfindung, die aus Stachybotrys-Spezies erhältlich sind, in Wirtsmikroorganismen, wie Pilzen, Hefen und Bakterien, bereit. Ist eine Nucleinsäure, welche ein Phenol oxidierendes Enzym der Erfindung codiert, einmal erhalten, können rekombinante Wirtszellen, welche die Nucleinsäure enthalten, konstruiert werden unter Verwendung von Techniken, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind. Techniken der Molekularbiologie werden in Sambrook et al., Molecular Biology Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) offenbart. Nucleinsäure, welche Phenol oxidierende Enzyme, welche aus Stachybotrys-Spezies erhältlich sind, codiert und mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% und mindestens 95% Identität mit der Nucleinsäure von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 aufweist oder die in der Lage ist, unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz an SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 zu hybridisieren oder zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 komplementär ist, wird erhalten und damit wird eine Wirtszelle unter Verwendung von geeigneten Vektoren transformiert. Den Fachleuten auf diesem Gebiet sind verschiedene Vektoren und Transformations- und Expressionskassetten, die für die Klonierung, Transformation und Expression in Pilzen, Hefen und Bakterien geeignet sind, bekannt.
  • Typischerweise enthält der Vektor oder die Kassette Sequenzen, welche die Transkription und Translation der Nucleinsäure dirigieren, einen selektierbaren Marker und Sequenzen, welche eine autonome Replikation oder chromosomale Integration erlauben. Geeignete Vektoren umfassen eine Region 5' von dem Gen, welche Transkriptionsstart-Kontrollregionen beherbergt, und eine Region 3' von dem DNA-Fragment, welche die Transkriptionstermination steuert. Diese Kontrollregionen können abgeleitet sein von Genen, die zu dem Wirt homolog oder heterolog sind, solange die ausgewählte Kontrollregion in der Lage ist, in der Wirtszelle ihre Funktion zu entfalten.
  • Initiationskontrollregionen oder Promotoren, die nützlich sind, um die Expression der Phenol oxidierenden Enzyme in einer Wirtszelle zu steuern, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Für die Erfindung ist praktisch ein jeglicher Promotor, der in der Lage ist, diese Phenol oxidierenden Enzyme zu steuern, geeignet. Nucleinsäure, welche das Phenol oxidierende Enzym codiert, wird funktionsfähig (operativ) durch Initiationscodons mit ausgewählten Expressionskontrollregionen für eine effektive Expression der oxidativen oder reduzierenden Enzyme verknüpft. Sind geeignete Kassetten einmal konstruiert, werden sie verwendet, um die Wirtszelle zu transformieren.
  • Allgemeine Transformationsverfahren werden in Current Protocols in Molecular Biology (Band 1, herausgegeben von Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 1987, Kapitel 9) gelehrt und umfassen Calciumphosphat-Methoden, eine Transformation unter Verwendung von PEG und Elektroporation. Für Aspergilluns und Trichoderma kann eine PEG- und Calciumphosphat-vermittelte Protoplasten-Transformation verwendet werden (Finkelstein, DB, 1992, Transformation. In Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Products (hrsg. von Finkelstein & Bill) 113–156. Die Elektroporation von Protoplasten wird in Finkelstein, DB 1992, Transformation. In Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Products (hrsg. von Finkelstein & Bill) 113–156, offenbart. Mikroprojektions-Bombardement an Conidien wird in Fungaro et al. (1995) Transformation of Aspergillus nidulans by microprojection bombardment an intact conidia. FEMS Microbiology Letters 125 293–298, beschrieben. Eine Agrobacterium-vermittelte Transformation wird in Groot et al. (1998), Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology 16 839–842, offenbart. Für eine Transformation von Saccharomyces sind den Fachleuten eine Lithiumacetat-vermittelte Transformation und eine PEG- und Calcium-vermittelte Protoplasten-Transformation wie auch Elektroporationstechniken bekannt.
  • Wirtszellen, die die codierende Sequenz für ein Phenol oxidierendes Enzym der Erfindung enthalten und das Protein exprimieren, können durch verschiedene Vorgehensweisen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, identifiziert werden. Diese Vorgehensweisen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisations- und Protein-Bioassay- oder Immunassay-Techniken, die auf Membranen basierende, auf Lösungen basierende oder auf Chips basierende Techniken für den Nachweis und/oder die Quantifizierung der Nucleinsäure oder des Proteins umfassen.
  • Wie hier beschrieben, wurde die genomische Sequenz (SEQ ID NO: 3), welche ein Phenol oxidierendes Enzym, welches aus Stachybotrys chartarum (MUCL 38898) erhältlich ist, codiert, isoliert und in Aspergillus niger var. awamori und Trichoderma reesei exprimiert. Die cDNA (SEQ ID NO: 1), welche aus Stachybotrys chartarum (MUCL 38898) erhältlich ist, wurde isoliert und in Saccharomyces cerevisiae exprimiert.
  • Aktivitäten von Phenol oxidierenden Enzymen
  • Die Phenol oxidierenden Enzyme der Erfindung sind in der Lage, ein breites Spektrum von unterschiedlichen phenolischen Verbindungen als Elektronendonoren zu verwenden, während sie sehr spezifisch für molekularen Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor sind.
  • Abhängig von dem speziellen Substrat und den Reaktionsbedingungen, z. B. Temperatur, Vorhandensein oder Abwesenheit von Verstärkern u. s. w., wird jede Oxidationsreaktion eines Phenol oxidierenden Enzyms einen optimalen pH haben. Beispielsweise weist das Phenol oxidierende Enzym von Stachybotrys parvispora, das wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt worden ist, ein pH-Optimum von etwa 5,0 bis etwa 7,0, wie durch Inkubation für 2 min bei 20°C mit ABTS als Substrat bestimmt; ein pH-Optimum von etwa 6,0 bis etwa 7,5, wie durch Inkubation für 2 min bei 20°C mit Syringaldizin als Substrat bestimmt; und ein pH-Optimum von etwa 7,0 bis etwa 9,0, wie durch Inkubation für 2 min bei 20°C mit 2,6-Dimethoxyphenol als Substrat bestimmt, auf und dieses ist in der Lage, Guiacol zu oxidieren.
  • Das aus Stachybotrys chartarum MUCL 38898 erhaltene Phenol oxidierende Enzym, welches wie in den Beispielen 4 und 5 beschrieben hergestellt worden ist und die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, aufweist, hat ein pH-Optimum von etwa 8,0 bei sowohl 20 als auch 40°C, wie durch Inkubation mit DMP als Substrat und in Gegenwart von insgesamt 17,2 μg Enzym bestimmt, und ein pH-Optimum von etwa 5,0 bis 7,0, wie durch Inkubation mit ABTS als Substrat und in Gegenwart von insgesamt 1,7 μg Enzym bestimmt.
  • Anwendungen von Polyphenol oxidierenden Enzymen
  • Wie weiter unten beschrieben, sind die Phenol oxidierenden Enzyme, die aus Stachybotrys erhältlich sind, in der Lage, ein breites Spektrum von Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen mit unterschiedlichen chemischen Strukturen unter Verwendung von Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor zu oxidieren. Dementsprechend werden Phenol oxidierende Enzyme der Erfindung in Anwendungen verwendet, wo es wünschenswert ist, die mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren, wie beim Reinigen, zum Entfernen der Nahrungsmittelflecken auf Stoffen und bei der Anti-Farbstoffwiederablagerung; Textilien; und Papier- und Zellstoff-Anwendungen. Ein besonders wichtiges Merkmal der Phenol oxidierenden Enzyme ist ihre Expression von hohen Ausmaßen an enzymatischer Aktivität bei etwa 20–40°C in einem breiten Bereich von pH-Werten, einschließlich eines breiten Bereichs von neutralen bis alkalischen pHs. Ganz besonders ist ihre Fähigkeit, hohe Ausmaße an enzymatischer Aktivität in dem pH-Bereich von etwa 7,0 bis etwa 10,5 bei Temperaturen von etwa 20–35°C zu exprimieren.
  • Gefärbte Verbindungen
  • Im Rahmen der Erfindung könnten verschiedene gefärbte Verbindungen Ziele für eine Oxidation durch Phenol oxidierende Enzyme der Erfindung sein. Beispielsweise können bei Detergens- oder Waschmittelanwendungen gefärbte Substanzen, die als Flecken auf Stoffen auftreten, ein Ziel sein. Nachfolgend werden mehrere Arten oder Klassen von gefärbten Substanzen, die in Flecken vorkommen können, beschrieben.
  • Sich von Porphyrin ableitende Strukturen
  • Porphyrin-Strukturen, die oftmals an ein Metall koordiniert sind, bilden eine Klasse von gefärbten Substanzen, die in Flecken vorkommen. Beispiele sind Häm oder Hämatin in Blutflecken, Chlorophyll als grüne Substanz in Pflanzen, z. B. Gras oder Spinat. Ein anderes Beispiel einer metallfreien Substanz ist Bilirubin, ein gelbes Abbauprodukt von Häm.
  • Tannine, Polyphenole
  • Tannine sind polymerisierte Formen von bestimmten Klassen von Polyphenolen. Solche Polyphenole sind Catechine, Leuanthocyanine u. s. w. (P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Hrsg. Oliver & Boyd, Edinburgh, 1972, S. 169–198). Diese Substanzen können mit einfachen Phenolen, wie z. B. Gallensäuren, konjugiert werden. Diese polyphenolischen Substanzen kommen in Teeflecken, Weinflecken, Bananenflecken, Pfirsichflecken u. s. w. vor und sind notorisch schwierig zu entfernen.
  • Carotinoide
  • Carotinoide sind die gefärbten Substanzen, die in Tomate (Lycopin, rot), Mango (Carotin, orange-gelb) vorkommen (G. E. Bartley et al., The Plant Cell (1995), Band 7, 1027–1038). Sie kommen in Nahrungsmittelflecken (Tomate) vor, die ebenfalls notorisch schwierig zu entfernen sind, insbesondere auf gefärbten Stoffen, wo die Verwendung von chemischen Bleichmitteln nicht angezeigt ist.
  • Anthocyanine
  • Diese Substanzen sind die hochgradig gefärbten Moleküle, die in vielen Früchten und Blüten vorkommen (P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Hrsg. Oliver & Boyd, Edinburgh, 1972, 135–169). Typische Beispiele, die für Flecken relevant sind, sind Beeren, aber auch Wein. Anthocyanine weisen eine große Diversität hinsichtlich Glycosidierungsmustern auf.
  • Maillard-Reaktionsprodukte
  • Beim Erwärmen von Mischungen von Kohlenhydratmolekülen in Gegenwart von Protein/Peptid-Strukturen tritt eine typische gelb/braun gefärbte Substanz auf. Diese Substanzen treten beispielsweise in siedendem Öl auf und sind aus Stoffen schwierig zu entfernen.
  • Für die Verhütung eines Farbstofftransfers von einem gefärbten Stoffteil auf andere Kleidungsstücke während des Waschens ist es wünschenswert, die Farbstoffmoleküle in der Waschlösung spezifisch zu bleichen. Verschiedene Arten von Stofffärbemitteln sind wünschenswerte Ziele für das Oxidationsverfahren: z. B. Schwefelfarbstoffe, Küpenfarbstoffe, direkte Farbstoffe, reaktive Farbstoffe und Azofarbstoffe.
  • Verstärker
  • Ein Phenol oxidierendes Enzym der Erfindung kann wirksam sein, um die mit Farbstoffen oder gefärbten Verbindungen assoziierte Farbe in Gegenwart oder Abwesenheit von Verstärkern abhängig von den Merkmalen der Verbindung zu modifizieren. Wenn eine Verbindung in der Lage ist, als ein direktes Substrat für das Phenol oxidierende Enzym zu wirken, kann das Phenol oxidierende Enzym die mit einem Farbstoff oder einer gefärbten Verbindung assoziierte Farbe in Abwesenheit eines Verstärkers modifizieren, obwohl ein Verstärker nach wie vor für eine optimale Aktivität des Phenol oxidierenden Enzyms bevorzugt sein kann. Für andere gefärbte Verbindungen, die nicht in der Lage sind, als ein direktes Substrat für das Phenol oxidierende Enzym zu wirken oder für das Phenol oxidierende Enzym nicht direkt zugänglich sind, wird ein Verstärker für eine optimale Aktivität des Phenol oxidierenden Enzyms und eine optimale Modifizierung der Farbe benötigt.
  • Verstärker werden beispielsweise in WO 95/01426 , veröffentlicht am 12. Januar 1995; WO 96/06930 , veröffentlicht am 07. März 1996; und WO 97/11217 , veröffentlicht am 27. März 1997, beschrieben. Verstärker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Phenothiazin-10-propionsäure (PPT), 10-Methylphenothiazin (MPT), Phenoxazin-10-propionsäure (PPO), 10-Methylphenoxazin (MPO), 10-Ethylphenothiazin-4-carbonsäure (EPC), Acetosyringon, Syringaldehyd, Methylsyringat, 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat (ABTS) und 4-Hydroxy-4-biphenylcarbonsäure oder Derivate davon.
  • Kulturen
  • Die Erfindung umfasst Stachybotrys-Stämme und natürliche Isolate und Derivate von solchen Stämmen und Isolaten, wie Stämme der Spezies S. parvispora, einschließlich insbesondere S. parvispora var. hughes MUCL 38996; Stämme der Spezies S. chartarum, einschließlich insbesondere Stachybotrys chartarum MUCL 38898; S. parvispora MUCL 9485; S. chartarum MUCL 30782; S. kampalensis MUCL 39090; S. theobromae MUCL 39293; und Stämme der Spezies S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes und S. nilagerica, die Phenol oxidierende Enzyme der Erfindung produzieren.
  • Die Erfindung stellt im Wesentlichen biologisch reine Kulturen von neuen Stämmen der Gattung Stachybotrys und insbesondere im Wesentlichen biologisch reine Kulturen der Stämme S. parvispora MUCL 38996 und S. chartarum MUCL 38898, aus welchen Phenol oxidierende Enzyme gereinigt werden können, bereit.
  • Reinigung
  • Die Phenol oxidierenden Enzyme der Erfindung können hergestellt werden durch Kultivierung von Phenol oxidierende Enzyme produzierenden Stachybotrys-Stämmen (wie S. parvispora MUCL 38996, S. chartarum MUCL 38898) unter aeroben Bedingungen in Nährmedium, enthaltend assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit einem oder mehreren anderen essentiellen Nährstoff(en). Das Medium kann gemäß Grundsätzen, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, zusammengestellt werden.
  • Während der Kultivierung sekretieren die Phenol oxidierende Enzyme produzierenden Stämme Phenol oxidierendes Enzym extrazellulär. Dies erlaubt, dass die Isolierung und Reinigung (Gewinnung) des Phenol oxidierenden Enzyms beispielsweise durch Abtrennung von Zellmasse von einer Kulturbrühe (z. B. durch Filtration oder Zentrifugation) erzielt werden kann. Die resultierende zellfreie Kulturbrühe kann als solche verwendet werden oder kann, sofern gewünscht, zuerst aufkonzentriert werden (z. B. durch Verdampfen oder Ultrafiltration). Sofern gewünscht, kann das Phenol oxidierende Enzym dann von der zellfreien Brühe abgetrennt und bis zu dem gewünschten Ausmaß durch herkömmliche Methoden, z. B. durch Säulenchromatographie, gereinigt oder sogar kristallisiert werden.
  • Die Phenol oxidierenden Enzyme der Erfindung können aus der Kulturbrühe, in welche sie extrazellulär sekretiert werden, durch Aufkonzentrierung des Überstands der Wirtskultur, gefolgt von einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Gelpermeationschromatographie, isoliert und gereinigt werden.
  • Die Phenol oxidierenden Enzyme der Erfindung können gemäß ihrer beabsichtigten Anwendung formuliert und eingesetzt werden. In dieser Hinsicht kann das Phenol oxidierende Enzym, wenn es in einer Detergens- oder Waschmittelzusammensetzung verwendet wird, direkt ausgehend von der Fermentationsbrühe als ein beschichteter Feststoff unter Verwendung der Vorgehensweise, die in dem United States Letters Patent Nr. 4,689,297 beschrieben worden ist, formuliert werden. Darüber hinaus kann, sofern gewünscht, das Phenol oxidierende Enzym in einer flüssigen Form mit einem geeigneten Träger formuliert werden. Das Phenol oxidierende Enzym kann auch immobilisiert werden, sofern gewünscht.
  • Die Erfindung umfasst auch Expressionsvektoren und rekombinante Wirtszellen, welche ein Phenol oxidierendes Enzym aus Stachybotrys der Erfindung umfassen, und die nachfolgende Reinigung des Phenol oxidierenden Enzyms aus der rekombinanten Wirtszelle.
  • Detergens- oder Waschmittelzusammensetzungen
  • Ein Phenol oxidierendes Enzym aus Stachybotrys der Erfindung kann in Detergens- bzw. Waschmittel- oder Reinigungszusammensetzungen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen können zusätzlich zu dem Phenol oxidierenden Enzym herkömmliche Detergens- oder Waschmittel-Inhaltsstoffe, wie grenzflächenaktive Mittel (Surfactants), Gerüststoffe (Builder) und weitere Enzyme, wie beispielsweise Proteasen, Amylasen, Lipasen, Cutinasen, Cellulasen oder Peroxidasen, umfassen. Andere Inhaltsstoffe umfassen Verstärker, Stabilisierungsmittel, Bakterizide, optische Aufheller und Parfümstoffe. Die Detergens- oder Waschmittelzusammensetzungen können eine jegliche geeignete physikalische Form, wie ein Pulver, eine wässrige oder nicht-wässrige Flüssigkeit, eine Paste oder ein Gel, annehmen. Beispiele von Detergens- oder Waschmittelzusammensetzungen werden in WO 95/01426 , veröffentlicht am 12. Januar 1995, und WO 96/06930 , veröffentlicht am 07. März 1996, aufgeführt.
  • Nachdem die Phenol oxidierenden Enzyme der Erfindung so beschrieben worden sind, werden jetzt die folgenden Beispiele zum Zweck der Veranschaulichung aufgeführt und weder sollen sie noch sollten sie als einschränkend gelesen werden. Verdünnungen, Mengen u. s. w., die hier als Prozentangaben ausgedrückt werden, sind, sofern nicht anders angegeben, Prozentangaben, die als Prozent Gewicht pro Volumen (Gew./Vol.) angegeben sind. Wie hier verwendet, beziehen sich Verdünnungen, Mengen u. s. w., die als% (Vol./Vol.) ausgedrückt werden, auf Prozentangaben bezogen auf Volumen pro Volumen. Temperaturen, auf die hier verwiesen wird, sind in Grad Celsius (C) angegeben.
  • Beispiel 1
  • Isolierung und Identifizierung des Stachybotrys parvispora var. hughes-Stamms
  • Ein neuer Stamm der Spezies Stachybotrys parvispora var. hughes war aus Bodenproben auf einem Agar-Agar-Nährmedium isoliert und aufgrund seiner Produktion eines Enzyms mit Oxidase-Aktivität selektiert worden.
  • Der neue Stamm wurde individuell auf Maismehl-Agar (DIFCO) bei 25°C für einen Zeitraum von drei Wochen kultiviert.
  • Der neue Stamm von S. parvispora wurde durch sein langsames Wachstum in Maismehl-Agar bei 25°C, welches weniger als 4 cm in drei Wochen betrug, seine Bildung von Conidien und die morphologischen Merkmale der gebildeten Conidien identifiziert.
  • Nach dem Wachstum für drei Tage auf Maismehl-Agar bei 25°C enthüllte eine mikroskopische Beobachtung, dass die Zellen des neuen Stammes von S. parvispora die Form von Conidien von 5,25 × 3,75–4,5 mm Größe aufweisen, die grob aufgerauht sind und in einem dunkeloliv-grauen schleimigen Tropfen versammelt sind, gebildet aus Phialiden von 9–11 × 3,5–4,5 mm, die sich in Quirlen zusammenballen. Conidiophoren weisen eine glatte Wand auf und sind bis zu 200 mm lang (siehe Jong, S. C., und E. E. Davis, Mycotaxon 3: 409–485).
  • Der so identifizierte neue Stamm von S. parvispora wurde unter den Regelungen des Budapester Vertrags bei den Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain (MUCL), Place Croix du Sud 3, Louvain-La-Neuve, Belgien, B-1348, am 05. Dezember 1995 hinterlegt und erhielt die Aufnahmenummer MUCL 38996.
  • Beispiel 2
  • Isolierung und Identifizierung eines Stachybotrys chartarum-Stammes
  • Ein neuer Stamm der Spezies Stachybotrys chartarum (zuvor als Stachybotrys atra var. corda bezeichnet) wurde aus Bodenproben auf einem Agar-Agar-Nährmedium isoliert und aufgrund seiner Produktion eines Enzyms mit Oxidase-Aktivität selektiert.
  • Der neue Stamm wurde individuell auf Maismehl-Agar (DIFCO) bei 25°C für einen Zeitraum von drei Wochen kultiviert.
  • Der neue Stamm von S. chartarum wurde durch sein schnelles Wachstum auf Maismehl-Agar bei 25°C, welches mehr als 4 cm in drei Wochen betrug, seine Bildung von Conidien und die morphologischen Merkmale der gebildeten Conidien identifiziert.
  • Nach dem Wachstum für drei Tage auf Maismehl-Agar bei 25°C enthüllte eine mikroskopische Beobachtung, dass die Zellen des neuen Stammes von S. chartarum die Form von Conidien von 8–11 × 5–10 mm Größe aufweisen, die grob aufgerauht sind und in einem dunkeloliv-grauen schleimigen Tropfen versammelt sind, gebildet aus Phialiden von 10–13 × 4–6 mm, die sich in Quirlen zusammenballen. Conidiophoren weisen eine glatte Wand auf und sind bis zu 1000 mm lang (siehe Jong, S. C., und E. E. Davis, Mycotaxon 3: 409–485).
  • Der so identifizierte neue Stamm von S. chartarum wurde unter den Regelungen des Budapester Vertrags bei den Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain (MUCL), Place Croix du Sud 3, Louvain-La-Neuve, Belgien, B-1348, am 05. Dezember 1995 hinterlegt und erhielt die Aufnahmenummer MUCL 38898.
  • Beispiel 3
  • Herstellung einer Conidien-Stammsuspension zur Inokulation
  • Stachybotrys parvispora MUCL 38996, das wie oben in Beispiel 1 beschrieben erhalten worden ist, wurde auf PDA(Kartoffel-Dextrose-Agar)-Platten (DIFCO) isoliert.
  • Eine Kolonie wurde in 5 ml 0,9% (Gew./Vol.) NaCl, enthaltend etwa 30 sterile Glaskügelchen (Durchmesser 5 mm), suspendiert. Die Suspension wurde sorgfältig in einem Vortex-Mischer (BENDER & HOBEIN AG) bewegt, bis eine vollständige Homogenisierung des Myzels erhalten worden war (höchste Geschwindigkeit für ungefähr 15–20 min). Dann wurden mehrere Verdünnungen (welche von 10–5 bis 10–7 reichten) von diesem Homogenisat auf jeweiligen sterilen PDA-Platten ausplattiert und bei 30°C etwa 5 Wochen inkubiert, um die Bildung von Conidien (von dunkelbräunlicher Farbe) zu ermöglichen.
  • Drei Platten, welche jeweils ungefähr 50 isolierte sporulierte Kolonien (wie anhand ihrer dunkelbräunlichen Farbe nachgewiesen) enthielten, wurden dann mit 5 ml 0,9% (Gew./Vol.) NaCl bedeckt und mit einem Glasstab abgeschabt, um die Conidien zu suspendieren. Die resultierenden Suspensionen wurden vereinigt und unter Verwendung einer Miracloth(CALBIOCHEM)-Membran filtriert, um das restliche Myzel zu entfernen. Das Ergebnis waren Conidien-Stammsuspensionen.
  • Der Titer (gemessen als Kolonie-bildende Einheiten (cfu; „colony forming units") pro ml) der resultierenden Suspension wurde dann bestimmt, indem Verdünnungen [in 0,9% (Gew./Vol.) NaCl] auf PDA-Platten ausplattiert wurden. Die Titer der resultierenden Conidien-Stammsuspensionen reichte von 106 bis 107 cfu/ml.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von Phenol oxidierendem Enzym
  • Herstellung von Enzym aus Stachybotrys parvispora
  • Ein 20 Liter-Fermenter, welcher Glucose und Kartoffelextrakt enthielt, wurde vorbereitet, indem 4,5 Kilogramm gekochte und in Stücke geschnittene Kartoffeln 30 min in 15 l Wasser (Milli-Q-Qualität) gekocht wurden, die resultierende Suspension durch hydrophile Baumwollgaze (STELLA) filtriert wurde, das resultierende Filtrat gesammelt wurde und dann das gesammelte Filtrat mit 300 g Glucose ergänzt wurde. Das mit Glucose ergänzte Filtrat wurde dann in den Fermenter gegeben und 30 min bei 120°C sterilisiert. Das sterilisierte ergänzte Filtrat hatte einen pH von 5,8.
  • Der 20 Liter-Fermenter wurde dann mit 15 ml der Conidien-Stammsuspension, erhalten wie oben in Beispiel 3 beschrieben, inokuliert und eine Fermentation wurde für 144 h bei 37°C ausgeführt.
  • Die Fermentation wurde unter einem konstanten Luftstrom von 4,5 Litern/min und einer konstanten Bewegung von 100 Upm (Umdrehungen pro Minute) (Durchmesser 13 cm) ohne pH-Kontrolle ausgeführt.
  • Eine etwa 50 ml-Probe der Kultur(Fermentations)-brühe wurde dann aus dem Fermenter entnommen und bei 12000 g 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dann von dem Pellet entfernt.
  • Das Vorhandensein von Phenol oxidierendes Enzym-Aktivität in dem Überstand wurde dann gemessen, indem das folgende Standardassayverfahren verwendet wurde, das auf der Oxidation von ABTS [2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat)] durch Sauerstoff basiert: es wurde ein endgültiges Reaktionsvolumen von 1 ml, enthaltend Tris[Tris(hydroxymethyl)aminomethan]/HCL 200 mM (pH 7,0), 0,9 mM ABTS (Diammoniumsalz von SIGMA) und eine geeignete Menge des zu testenden Präparats (welches in diesem Beispiel der mit Wasser verdünnte Überstand, wie nachfolgend beschrieben ist), hergestellt. Die Assayreaktion wurde gestartet durch die Zugabe des zu testenden Präparats (welches in diesem Beispiel die Überstand-Verdünnung ist), um das endgültige Reaktionsvolumen von 1 ml zu bilden. Die grünlich-blaue Farbe, die durch die Oxidation von ABTS produziert wird, wurde dann kontinuierlich gemessen, indem die optische Dichte (OD) bei 420 nm während zwei Minuten unter Verwendung eines Spektrophotometers (Ultraspec Plus von Pharmacia) aufgezeichnet wurde. Die Rate der Zunahme der optischen Dichte pro Minute (ΔOD/min) wurde dann aus dem linearen Abschnitt der Kurve während 1 min berechnet.
  • Die geeignete Menge des (Enzym)-präparats, die diesem Standardassay unterzogen wurde, wurde durch Verdünnung mit Wasser eingestellt, um eine ΔOD/min, welche während des Assays von 0,2 bis 1,0 reichte, zu erhalten.
  • Wie hier verwendet, ist eine Standard-ABTS-Enzymeinheit (im Folgenden als eine Enzymeinheit oder EU bezeichnet) als die Menge von Enzym definiert, welche eine Zunahme von einer OD420 pro Minute unter diesen spezifischen Bedingungen erzeugt.
  • Auf diese Weise wurde eine Enzymaktivität von 30 EU/ml Kulturüberstand gemessen.
  • Herstellung von Phenol oxidierendem Enzym aus Stachybotrys chartarum
  • Stachybotrys chartarum wurde auf PDA-Platten (Difco) etwa 5–10 Tage kultiviert. Ein Teil der Plattenkultur (etwa 3/4 × 3/4 Zoll) wurde verwendet, um 100 ml PDB (Kartoffel-Dextrose-Brühe) in 500 ml-Schüttelkolben zu inokulieren. Der Kolben wurde bei 26–28°C, 150 Upm, 3–5 Tage inkubiert, bis gutes Wachstum erhalten wurde.
  • Die Brühenkultur wurde dann als Inokulum zu 1 l PDB in einem 2,8 l-Schüttelkolben zugegeben. Der Kolben wurde bei 26–28°C, 150 Upm, 2–4 Tage inkubiert, bis gutes Wachstum erhalten wurde.
  • Ein 10 l-Fermenter, welcher ein Produktionsmedium enthielt, wurde vorbereitet (enthaltend in Gramm/Liter die folgenden Bestandteile: Glucose 15; Lecithin 1,51; t-Aconitsäure 1,73; KH2PO4 3; MgSO4·7H2O 0,8; CaCl2·2H2O 0,1; Ammoniumtartrat 1,2; Soja-Pepton 5, Staley 7359; Benzylalkohol 1; Tween 20 1; Nitrilotriessigsäure 0,15; MnSO4·7H2O 0,05; NaCl 0,1; FeSO4·7H2O 0,01; COSO4 0,01; CaCl2·2H2O 0,01; ZnSO4·7H2O 0,01; CuSO4 0,001; AlK(SO4)2·12H2O 0,001; H3BO3 0,001; NaMoO4·H2O 0,001). Der Fermenter wurde dann mit der 1 l-Brühenkultur inokuliert und eine Fermentation bei 28°C für 60 h unter einem konstanten Luftstrom von 5,0 Litern/Minute und einer konstanten Bewegung von 120 Upm ausgeführt. Der pH wurde bei 6,0 gehalten.
  • Das Vorhandensein von Phenol oxidierendes Enzym-Aktivität im Überstand wurde gemessen unter Verwendung des folgenden Assayverfahrens basierend auf der Oxidation von ABTS (2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat)) durch Sauerstoff. ABTS (SIGMA, 0,2 ml, 4,5 mM H2O) und NaOAc (1,5 ml, 120 mM in H2O, pH 5,0) wurden in einer Küvette gemischt. Die Reaktion wurde durch Zugabe einer geeigneten Menge des zu messenden Präparats (welches in diesem Falle die Überstandsverdünnung ist), um eine endgültige Lösung von 1,8 ml zu bilden, gestartet. Die durch die Oxidation von ABTS erzeugte Farbe wurde dann alle 2 Sekunden für einen Gesamtzeitraum von 14 s gemessen, indem die optische Dichte (CD) bei 420 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers aufgezeichnet wurde. Eine ABTS-Einheit (eine Enzymeinheit oder EACU) in diesem Beispiel ist definiert als die Veränderung der CD, gemessen bei 420 (nm) pro Minute/2 (wenn keine Verdünnung bei der Probe vorgenommen wurde). Auf diese Weise wurde eine Phenol oxidierendes Enzym-Aktivität von 3,5 EACU/ml Kulturüberstand gemessen.
  • Beispiel 5
  • Reinigung des Enzyms
  • Die restliche Stachybotrys parvispora-Kulturbrühe, die wie oben in Beispiel 4 beschrieben erhalten worden war, wurde dann aus dem Fermenter abgezogen und 15 min bei 4500 g zentrifugiert. Stachybotrys chartarum wird auf eine ähnliche Weise gereinigt.
  • Der resultierende Überstand wurde dann von dem Pellet entfernt und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer mit einer YMI0-Membran mit einem Rückhaltevermögen von 10 kD ausgestatteten Amicon-Ultrafiltrationseinheit auf 0,6 Liter aufkonzentriert.
  • Zu dem Konzentrat wurde ein Volumen von 1,4 Litern Aceton zugegeben und damit gemischt. Die resultierende Mischung wurde dann zwei Stunden bei 20–25°C inkubiert.
  • Nach der Inkubation wurde die Mischung 30 min bei 10000 g zentrifugiert und das resultierende Pellet wurde von dem Überstand entfernt. Das Pellet wurde dann in einem Endvolumen von 800 ml Wasser resuspendiert.
  • Die resultierende Suspension wurde dann einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung, wie folgt, unterworfen: kristallines Ammoniumsulfat (JANSSEN) wurde zu der Suspension bis zu 40%-iger Sättigung zugegeben und die Mischung bei 4°C 16 h unter sanftem magnetischem Rühren inkubiert. Die Mischung wurde dann bei 10.000 g 30 min zentrifugiert und der Überstand von dem Zentrifugationspellet für eine weitere Verwendung entfernt. Dann wurde Ammoniumsulfat (JANSSEN) zu dem Überstand hinzugegeben, um 80%-ige Sättigung zu erreichen, und die Mischung bei 4°C 16 h unter sanftem magnetischem Rühren inkubiert. Die Suspension wurde dann 30 min bei 10.000 g zentrifugiert und das resultierende Pellet wurde von dem Überstand entfernt. Das Pellet wurde dann in 15 ml Wasser resuspendiert und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer CENTRIPREP 3000 (AMICON) auf 6 ml aufkonzentriert.
  • Die Phenol oxidierendes Enzym-Aktivität der Suspension wurde dann gemessen unter Verwendung des Standard-Assayverfahrens basierend auf der Oxidation von ABTS durch Sauerstoff, wie oben in Beispiel 4 beschrieben worden ist (aber mit der Ausnahme, dass das getestete Präparat das resuspendierte Konzentrat und nicht die Überstandverdünnungen ist). Die so gemessene Phenol oxidierendes Enzym-Aktivität betrug 5200 EU/ml.
  • Das Enzym wurde dann weiter durch Gelpermeationschromatographie gereinigt. In dieser Hinsicht wurde eine Säule, welche 850 ml SEPHACRYL S400 HIGH RESOLUTION (PHARMACIA) enthielt, mit einem Puffer enthaltend 50 mM KH2PO4/K2HPO4 (pH = 7,0) äquilibriert und dann mit dem Rest der 6 ml Suspension, die oben beschrieben worden war, beladen und mit dem Puffer, welcher 50 mM KH2PO4/K2HPO4 (pH = 7,0) enthielt, mit einer Flussrate von 1 ml/min eluiert. Es wurden dann jeweilige Fraktionen erhalten.
  • Die jeweiligen Fraktionen, welche die höchsten Phenol oxidierendes Enzym-Aktivitäten enthielten, wurden vereinigt, wodurch eine 60 ml-Suspension, welche das gereinigte Phenol oxidierende Enzym enthielt, bereitgestellt wurde.
  • Die Phenol oxidierendes Enzym-Aktivität der Suspension wurde dann gemessen unter Verwendung des Standard-Assayverfahrens basierend auf der Oxidation von ABTS durch Sauerstoff, wie oben in Beispiel 4 beschrieben worden war. Die so gemessene Enzymaktivität betrug 390 EU/ml.
  • Dieses Präparat wurde dann zur weiteren Charakterisierung des Enzyms verwendet, wie nachfolgend ausführlich beschrieben wird.
  • Beispiel 6
  • Bestimmung des isoelektrischen Punkts des Phenol oxidierenden Enzyms von S. parvispora
  • Der isoelektrische Punkt (pI) des durch S. parvispora MUCL 38996 produzierten Enzyms wurde dann ausgehend von dem gereinigten Enzym, das wie oben in Beispiel 5 beschrieben erhalten worden war, bestimmt.
  • Diese Bestimmung erfolgte durch isoelektrische Fokussierung in Polyacrylamidgelen durch Einsatz von Pharmacia DryIEF-Gelen, die rehydratisiert worden waren mit 2 ml einer Ampholin-Lösung (1 Volumen 8–10,5% (Gew./Vol.) Ampholin von Pharmacia, zugegeben zu 15 Volumen entionisiertem Wasser), indem dem vom Lieferanten empfohlenen Protokoll gefolgt wurde.
  • Das gereinigte Enzym, das wie oben in Beispiel 5 beschrieben erhalten worden ist, wurde einem isoelektrische Fokussierungs-Gel (IEF 3–9 von PHARMACIA), wie in dem PHARMACIA Technical File IEF Nr. 100 beschrieben, unterworfen.
  • Die folgenden PHARMACIA-Referenzmarker wurden bei dieser isoelektrischen Fokussierung verwendet: Pepsinogen (2,8), Amyloglucosidase (3,5), Methylrot (3,75), Glucoseoxidase (4,15), Sojabohnen-Trypsininhibitor (4,55), b-Lactoglobulin (5,2), Rinder-Carboanhydrase B (5,85) und humane Carboanhydrase B (6,55).
  • Die der isoelektrischen Fokussierung zu unterwerfenden Proben wurden vorbereitet, wie in dem PHARMACIA Technical File IEF Nr. 100 beschrieben.
  • Nach der Fokussierung wurden die Gele mit Coomassie Blau gefärbt, indem dem Protokoll, welches detailliert in dem Separation Technique File Nr. 101 (Veröffentlichung 18-1018-20, Pharmacia LKB Biotechnology) dargelegt wird, gefolgt wurde.
  • Unter Verwendung dieser Technik wurde der scheinbare isoelektrische Punkt des aus S. parvispora MUCL 38996 sekretierten Phenol oxidierenden Enzyms auf unter 2,8 bestimmt.
  • Beispiel 7
  • Bestimmung des pH-Optimums für das Phenol oxidierende Enzym aus S. Darvispora und S. chartarum
  • Es wurden dreizehn 100 ml-Pufferproben, jeweils enthaltend 50 mM Tris, 50 mM Citronensäure und 50 mM Na2HPO4, hergestellt.
  • Die dreizehn Pufferproben wurde dann mit entweder HCl oder NaOH, wie anwendbar, auf die jeweiligen pH-Werte, die nachfolgend in der Tabelle 1A aufgeführt sind, eingestellt, so dass eine der Pufferproben jeden der nachfolgend in Tabelle 1A aufgeführten pH-Werte aufwies.
  • Drei 0,9 ml-Proben wurden aus jeder der dreizehn Pufferproben entnommen. Auf diese Weise wurden drei Gruppen (eine erste Gruppe, eine zweite Gruppe und eine dritte Gruppe) von jeweils dreizehn Proben bereitgestellt, so dass jede Gruppe eine jeweilige Probe von jeder der dreizehn pH-Pufferproben aufwies.
  • Dann wurden jeweilige Substrate zu jeweiligen Mischungen, wie folgt, zugesetzt: 0,9 mM ABTS wurde zu den dreizehn Mischungen der ersten Gruppe zugegeben; 50 μM DMP (2,6-Dimethoxyphenol) (FLUKA) wurde zu den dreizehn Mischungen der zweiten Gruppe zugegeben; und 1 mM Syringaldizin (SIGMA) wurde zu den dreizehn Mischungen der dritten Gruppe zugegeben.
  • Die jeweiligen Reaktionen wurden durch die Zugabe von 2 EU von gereinigtem Phenol oxidierendem Enzym aus S. parvispora MUCL 38996, das wie oben in Beispiel 5 beschrieben erhalten worden war, gestartet.
  • Das Endvolumen von jeder der getesteten Probe war 1 ml.
  • Die Assays an jeder der neununddreißig Proben (eingestellt auf die nachfolgend in der Tabelle 1A aufgeführten pH-Werte) wurden bei etwa 20°C mit einer Inkubationszeit von 2 min ausgeführt, indem dem oben in Beispiel 4 erläuterten Protokoll gefolgt wurde.
  • Die optische Dichte wurde während 2 min (Ultraspec Plus von Pharmacia) bei den folgenden Wellenlängen aufgezeichnet: 420 nm für die Proben der ersten Gruppe (welche ABTS aufwiesen), 468 nm für die Proben der zweiten Gruppe (welche DMP aufwiesen) und 526 nm (für die Proben der dritten Gruppe (welche Syringaldazin aufwiesen).
  • Die Rate der Zunahme der optischen Dichte (ΔOD/min) wurde aus dem linearen Abschnitt der Kurven während einer Minute berechnet, wie ausführlich oben in Beispiel 4 beschrieben.
  • Die Assayergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 1A zusammengefasst. Tabelle 1A Aktivität (ΔOD/min/ml) für das S. parvispora-Enzm
    pH ABTS Syringaldazin 2,6-Dimethoxyphenol
    4,0 0,76 0,00 0,21
    4,5 0,89 0,00 0,21
    5,0 2,04 0,00 0,32
    5,5 2,0 0,25 0,43
    6,0 2,11 1,27 0,61
    6,5 2,14 1,61 0,91
    7 2,04 1,75 1,59
    7,5 1,54 1,43 2,52
    8 0,93 0,92 3,52
    8,5 0,42 0,87 3,18
    9,0 0,11 0,68 1,41
    9,5 0,03 0,03 0,08
    10,0 0,00 0,00 0,08
  • Auf eine ähnliche Weise wurde das pH-Profil für das Phenol oxidierende Enzym aus S. chartarum erhalten. Anstelle von 50 μM DMP wurde 5 mM DMP verwendet. Die pro ABTS-Assay verwendete Menge an Enzym betrug 1,7 μg Enzym in insgesamt 0,9 ml Assaymischung. Die Menge von pro DMP-Assay verwendetem Enzym betrug 17,2 μg in insgesamt 0,9 ml Assaymischung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1B angegeben. Tabelle 1B Bestimmung des pH-Optimums des Stachybotrys chartarum-Enzyms Aktivität (ΔOD/min/ml)
    pH ABTS (20°C) ABTS (40°C) DMP (20°C) DMP (40°C)
    4 2,60 1,72 0,01 0,03
    4,5 3,26 1,73 0,01 0,03
    5 3,83 1,55 0,01 0,03
    5,5 4,37 1,57 0,02 0,04
    6 4,25 1,54 0,04 0,09
    6,5 4,45 1,50 0,08 0,18
    7 3,65 2,70 0,21 0,33
    7,5 3,01 3,31 0,47 0,63
    8 2,16 3,41 0,62 0,84
    8,5 1,15 2,85 0,46 0,81
    9 0,42 1,07 0,29 0,60
    9,5 0,19 0,45 0,20 0,58
    10 0,10 0,19 0,01 0,33
    10,5 0,04 0,02 0,04 0,06
    11 0,00 0,00 0,07 0,04
    11,5 0,00 0,00 0,00 0,01
    12 0,00 0,00 0,00 0,00
    • DMP
    = 2,6-Dimethoxyphenol
  • Der Assay wurde bei 20°C und 40°C ausgeführt.
  • Das obige Protokoll für Stachybotrys parvispora wurde wiederholt mit den Ausnahmen, dass alle Pufferproben auf einen pH von 7,0 eingestellt wurden und dass die eingesetzten Substrate 5 mM von entweder s-Dianizidin (SIGMA), 3,4-Dimethoxyphenol (FLUKA), 3,4-Dimethoxyanilin (FLUKA), 2-Methoxyphenol (FLUKA) und Veratrylalkohol (SIGMA) waren.
  • Mit der Ausnahme von Veratrylalkohol wurde eine Farbbildung qualitativ ausgehend von jedem dieser anderen Substrate beobachtet.
  • Beispiel 8
  • Vergleich mit Bilirubinoxidase
  • DH-Profil der DBI-Bleichung
  • Es wurden 14 Reaktionsmischungen (1 ml Endvolumen) hergestellt, welche 50 mM Tris, 50 mM Citronensäure und 50 mM Na2HPO4 enthielten, wobei zwei von jeder der Reaktionsmischungen mit entweder HCl oder NaOH auf jeden der jeweiligen pH-Werte, die nachfolgend in Tabelle 2 angegeben sind, eingestellt wurden, und das Substrat, Direct Blue Nr. 1 (hier als DBI bezeichnet, auch als Chicago Sky Blue 6B bekannt) von (SIGMA), wurde dazu in einer Menge, welche erforderlich ist, um eine anfängliche optische Dichte (CD) von 1,0 (620 nm) zu erhalten, zugegeben.
  • Die jeweiligen Reaktionen wurden durch die Zugabe von 4,5 EU Phenol oxidierendem Enzym aus entweder S. parvispora MUCL 38996, das wie oben in Beispiel 5 beschrieben erhalten worden war, oder der Bilirubinoxidase aus Myrothecium verrucaria (erworben von SIGMA) zu den jeweiligen Reaktionsmischungen gestartet.
  • Das Endvolumen von jeder der getesteten Proben betrug 1 ml.
  • Die Assays an jeder der Proben wurden bei etwa 20°C mit einer Inkubationszeit von 2 min ausgeführt, indem dem oben in Beispiel 4 erläuterten Protokoll gefolgt wurde.
  • Die optische Dichte wurde während 2 min (Ultraspec Plus von Pharmacia) bei einer Wellenlänge von 620 nm aufgezeichnet. Die Rate der Abnahme der optischen Dichte (–ΔOD/min) wurde aus dem linearen Abschnitt der Kurven berechnet.
  • Die Assayergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2
    Aktivität (–ΔO/DMinute/ml
    pH Stachybotrys Myrothecium
    4,0 2,65 4,10
    5,0 2,65 4,20
    6,0 3,85 4,50
    7,0 4,95 4,75
    8,0 6,95 3,60
    9,0 8,90 1,45
    10,0 5,85 1,10
  • Oxidation von Quiacol
  • Es wurden Reaktionsmischungen (1 ml Endvolumen) hergestellt, enthaltend 200 tmM Tris/HCl (pH 7,0) und 5 mM Quiacol (2-Methoxyphenol) (MERCK) als Substrat.
  • Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 5 EU von Phenol oxidierendem Enzym aus S. parvispora MUCL 38996, erhalten wie oben in Beispiel 5 beschrieben, oder durch die Zugabe von 5 EU der Bilirubinoxidase aus Myrothecium verrucaria (erworben von SIGMA) gestartet.
  • Das Endvolumen von jeder der getesteten Proben betrug 1 ml. Die Assays an jeder der Proben wurden ausgeführt bei etwa 20°C mit einer Inkubationszeit von 2 min, indem dem oben in Beispiel 4 erläuterten Protokoll gefolgt wurde.
  • Die optische Dichte wurde während 2 min (Ultraspec Plus von PHARMACIA) bei einer Wellenlänge von 440 nm aufgezeichnet. Die Rate der Zunahme der optischen Dichte (ΔOD/min) wurde aus dem linearen Abschnitt der Kurven berechnet.
  • Mit dem Phenol oxidierenden Enzym aus Stachybotrys parvispora MUCL 38996 wurde eine Zunahme der CD aufgezeichnet (0,05 ΔOD/min). Mit der Bilirubinoxidase aus Myrothecium verrucaria war jedoch keine Aktivität nachweisbar.
  • Beispiel 9
  • Gleichung von verschiedenen Farbstoffen
  • Die Substratspezifität des Phenol oxidierenden Enzyms aus S. parvispora MUCL 38996 wurde gegenüber einer Anzahl von Farbstoffen untersucht. Die Reaktionsmischungen (1 ml Endvolumen) enthielten 200 mM Tris/HCl (pH 7,0) und die jeweiligen Farbstoffe, die nachfolgend in Tabelle 3 aufgelistet sind; die Konzentration von diesen Farbstoffen wurde durch Verdünnung mit Wasser eingestellt, so dass eine optische Dichte von 1,0 (bei den nachfolgend in Tabelle 3 aufgelisteten Wellenlängen) dafür gemessen wurde. Die reaktive und Farbstoff-Nomenklatur ist in Übereinstimmung mit dem Color Index.
  • Die Bleichreaktionen wurden durch die Zugabe von Phenol oxidierendem Enzym von S. parvispora MUCL 38996, das wie oben in Beispiel 5 beschrieben erhalten worden war, gestartet. Die Menge von Phenol oxidierendem Enzym wurde durch Verdünnung mit Wasser eingestellt, um eine Abnahme der OD (bei den in Tabelle 3 aufgelisteten Wellenlängen) im Bereich von 0,05 bis 0,25 – ΔOD/min zu messen, um eine lineare Kurve zu erhalten.
  • Das Endvolumen von jeder der getesteten Proben betrug 1 ml.
  • Die Assays an jeder der Proben wurden bei etwa 20°C mit einer Inkubationszeit von 2 min ausgeführt, indem dem oben in Beispiel 4 erläuterten Protokoll gefolgt wurde.
  • Die optische Dichte wurde während 2 min bei der in Tabelle 3 angegebenen Wellenlänge aufgezeichnet (Ultraspec Plus von Pharmacia). Die Rate der Abnahme der optischen Dichte (–ΔOD/min) wurde aus dem linearen Abschnitt der Kurve berechnet und mit der Enzymverdünnung multipliziert, um die endgültige Bleichrate in –ΔOD/min/ml Enzymlösung, die wie oben in Beispiel 5 beschrieben erhalten worden war, auszudrücken.
  • Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 3 zusammengefasst.
  • In einem separaten Experiment wurde die Rate des Sauerstoffverbrauchs mit jedem der Farbstoffe in einer magnetisch gerührten Kammer, die mit einer Clark-Elektrode (Oxygraph K-IC von Gilson) ausgestattet war, gemessen. Die Oxygraph-Kammer enthielt in einem Endvolumen von 2 ml 200 mM Tris/HCl (pH 7,0), 5 mM von jedem der Farbstoffe und 100 ml (39 EU) von Phenol oxidierendem Enzym aus S. parvispora MUCL 38996, das wie oben in Beispiel 5 beschrieben erhalten worden war. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe des Enzyms gestartet und die Konzentration von gelöstem Sauerstoff wurde während 5 min aufgezeichnet. Die Steigung der Kurven wurde aus deren linearen Abschnitten bestimmt.
  • Die Ergebnisse von diesem Experiment sind ebenfalls nachfolgend in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3
    Farbstoff Wellenlänge (nm) Bleichrate ΔOD/min/ml Sauerstoffverbrauch ΔOD/min/ml
    Direct Blue 14 (SIGMA) 584 2,5 6,5
    Direct Blue 1 (SIGMA) 620 2,0 6,0
    Direct blue 53 (FLUKA) 590 4,2 4,6
    Direct Blue 98 (ZENECA) 580 0,4 N. D.
    Acid Blue 113 (ALDRICH) 539 0,6 N. D.
    Direct Red 28 (SIGMA) 480 0,2 0,6
    Direct Red 21 (FLUKA) 494 0,3 1,4
    Direct Red 79 (ZENECA) 509 0,2 N. D.
    Reactive Blue Cibacron GN_E (CIBA-GEIGY) 622 16,4 4,0
    Reactive Blue Cibacron C–R (CIBA-GEIGY) 610 7,8 4,3
    Reactive Blue 160 (ZENECA) 617 2,7 N. D.
    Direct Blue 71 (ZENECA) 507 0,0 1,3
    Reactive Black 5 (SANDOZ) 600 0,0 2,5
    Malvin (ROTH) 526 2,6 N. D.
    • N. D.
    bezieht sich auf „nicht bestimmt".
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass das Phenol oxidierende Enzym aus Stachybotrys in der Lage ist, verschiedene Farbstoffe, welche unterschiedliche chemische Strukturen aufweisen, unter Verwendung von Sauerstoff als Elektronenakzeptor und in Abwesenheit von Vermittlersubstanzen (Mediatoren) zu oxidieren und zu bleichen.
  • Zwei Farbstoffe (Reactive Black 5 und Direct Blue 71) werden durch das Phenol oxidierende Enzym aus Stachybotrys oxidiert, es kann aber keine Bleichreaktion beobachtet werden. Jedoch zeigen Anti-Farbstofftransfertests (siehe Beispiel 12 unten), dass der Transfer von Reactive Black 5 tatsächlich verhindert werden kann. Dementsprechend scheint, sogar obwohl der Farbstoff durch das Phenol oxidierende Enzym nicht direkt gebleicht wird, dieser auf eine solche Weise modifiziert worden zu sein, dass der Transfer gehemmt wird.
  • Die in Tabelle 3 zusammengefassten Ergebnisse zeigen auch, dass natürliche Farbstoffe des Anthocyanin-Typs, wie Malvin, durch das Phenol oxidierende Enzym effizient gebleicht werden können, was dessen Effizienz zum Entfernen von Flecken, welche eine solche Art von Farbstoffen enthalten (wie Frucht-Wein, u. s. w.), demonstriert.
  • Beispiel 10
  • Immunologische Eigenschaften
  • Gereinigtes Phenol oxidierendes Enzym aus S. parvispora MUCL 38996, das wie oben in Beispiel 5 beschrieben erhalten worden war, wurde zweifach mit Wasser verdünnt und 0,5 ml von dieser Lösung wurde mit 0,5 ml komplettem Freund'-Adjuvans gemischt und subkutan in ein Kaninchen injiziert, wie in Antibodies (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow und Lane (Hrsg.), auf Seite 105 beschrieben. Diese Immunisierungsprozedur wurde drei weitere Male wiederholt (was insgesamt vier Mal ergibt), wobei ein zweiwöchiges Zeitintervall zwischen jeder Injektion verstrich.
  • Zwei Wochen nach der vierten Injektion wurden die Antiseren gesammelt, wie in Antibodies (1988), a. a. O., auf Seite 119 beschrieben.
  • Dann wurden doppelte Immundiffusionstests (Ouchterlony-Technik) ausgeführt, indem dem in Clausen J. (1988) Immunochemical Technique for the Identification and Estimation of Macromolecules (3. durchgesehene Auflage), Burdon, R. H., und P. H. van Knippenberg, Hrsg., auf Seite 281 (Anhang 11, „micro technique" (Mikrotechnik)) erläuterten Protokoll gefolgt wurde, und unter den ebenda spezifizierten Bedingungen.
  • Vier jeweilige Mikroskopobjektträger (25 mm × 75 mm × 1 mm) wurden vorbereitet, die jeweils mit 2,5 ml geschmolzenem Diffusionsmedium bestehend aus 1,7% (Gew./Vol.) Agar (Agar granuliert von Difco Nr. 0145-17-0) und 0,9% (Gew./Vol.) NaCl bedeckt waren, indem der in Clausen, a. a. O. (in Anhang 10, § 10.1: „microtechnique" (Mikrotechnik)) beschriebenen Technik gefolgt wurde. Dann wurden fünf Vertiefungen in den Agar von jedem Objektträger unter Verwendung einer Matrize mit einer Saugvorrichtung (ebenfalls wie in Clausen, a. a. O., in Anhang 10, § 10.1.1.1 beschrieben) gemacht. Die fünf Vertiefungen (eine im Zentrum und vier in einem Kreis um die zentrale Vertiefung herum), die in den Objektträgern gemacht worden sind, hatten jeweilige Durchmesser von 3 mm, wobei ein Abstand zwischen den Vertiefungen (Mittelpunkt zu Mittelpunkt) von 8 mm vorgesehen wurde.
  • S. chartarum MUCL 38898 (erhalten wie in Beispiel 2 oben beschrieben) wurde auf Malt Extracted Plates (ME von DIFCO) isoliert. Eine Kolonie davon wurde dann in 5 ml 0,9% (Gew./Vol.) NaCl, enthaltend etwa 30 sterile Glaskügelchen (Durchmesser 5 mm), suspendiert. Die Suspension wurde sorgfältig mit einem Vortex-Mischer bewegt, bis eine vollständige Homogenisation des Myzels erzielt worden war. 30 g TSB (Trypticase Soy Broth von BECTONDICKINSON)-Pulver wurden in 1 Liter Wasser gelöst und es erfolgte eine Sterilisation durch Erwärmen für 30 min bei 120°C. Jeweilige 500 ml-Mengen des sterilisierten Kulturmediums wurden dann zu zwei Polypropylen-Schüttelkolben (Volumen 2 I) zugegeben. Die Kolben wurden dann mit jeweiligen 1 ml-Proben der Myzel-Suspension inokuliert und 96 h unter konstanter Bewegung (100 Upm mit 1 Zoll Exzentrizität) bei 37°C inkubiert.
  • Nach der Fermentation wurde das Kulturmedium aus den jeweiligen Schüttelkolben bei 10000 g 15 min zentrifugiert. Die resultierenden Überstände wurden dann entfernt und jeder wurde durch Aceton-Präzipitation (1 Volumen Überstand/3 Volumen Aceton) um das 20-fache aufkonzentriert. Die Mischungen wurden dann bei 4°C unter magnetischem Rühren 45 min inkubiert. Die resultierenden Suspensionen wurden dann erneut bei 10000 g 15 min zentrifugiert und die resultierenden Pellets daraus entfernt. Die entfernten Pellets wurden dann in 50 ml Wasser (Milli-Q-Qualität) resuspendiert. Eine Phenol oxidierendes Enzym-Aktivität von 0,5 U ABTS wurde an ABTS gemessen. Die resultierenden enzymatischen Lösungen wurden dann für die immunologischen Tests verwendet.
  • Jeweilige 2×-Verdünnungen (welche 1 Volumen Enzym und 1 Volumen Verdünnungsmittel aufweisen), 4×-Verdünnungen (welche 1 Volumen Enzymprobe und 3 Volumen Verdünnungsmittel aufweisen) und 8×-Verdünnungen (welche 1 Volumen Enzymprobe und 7 Volumen Verdünnungsmittel aufweisen) wurden hergestellt unter Verwendung von 0,9% (Gew./Vol.) NaCl als Verdünnungsmittel und von 0,6 EU Enzymproben des Phenol oxidierenden Enzyms aus S. parvispora MUCL 38996 (erhalten wie oben in Beispiel 5 beschrieben), des Phenol oxidierenden Enzyms aus S. chartarum MUCL 38898 (erhalten, wie nachfolgend beschrieben) und der Bilirubinoxidase von M. verrucaria (SIGMA).
  • Ein konstantes Volumen von 10 ml der jeweiligen Proben (Verdünnungen), die getestet werden sollten, wurden dann in die jeweiligen vier einen Kreis beschreibenden Vertiefungen (wie nachfolgend beschrieben) eingefüllt und das gegen die Phenol oxidierendes Enzym-Aktivität, die aus S. parvispora MUCL 38996 erhalten worden war, erzeugte Antiserum wurde in die zentrale Vertiefung eingefüllt (wie ebenfalls nachfolgend beschrieben wird). Die Objektträger wurden dann 18 h bei 37°C inkubiert, bevor sie auf einem schwarzen Hintergrund unter Verwendung einer Spaltlampe untersucht wurden. Die vier Objektträger, die so hergestellt worden waren, enthielten die folgenden Proben:
    Objektträger Vertiefung 1 Vertiefung 2 Vertiefung 3 Vertiefung 4 Zentrale Vertiefung
    A 1 2 3 4 Antiserum
    B 5 6 7 8 Antiserum
    C 9 10 11 12 Antiserum
    D 1 5 9 13 Antiserum
    • Probe 1 ist eine unverdünnte Probe des S. parvispora-Enzyms.
    • Probe 2 ist eine 2×-Verdünnung des S. parvispora-Enzyms.
    • Probe 3 ist eine 4×-Verdünnung des S. parvispora-Enzyms.
    • Probe 4 ist eine 8×-Verdünnung des S. parvispora-Enzyms.
    • Probe 5 ist eine unverdünnte Probe des S. chartarum-Enzyms.
    • Probe 6 ist eine 2×-Verdünnung des S. chartarum-Enzyms.
    • Probe 7 ist eine 4×-Verdünnung des S. chartarum-Enzyms.
    • Probe 8 ist eine 8×-Verdünnung des des S. chartarum-Enzyms.
    • Probe 9 ist eine unverdünnte Probe der Bilirubinoxidase von M. verrucaria.
    • Probe 10 ist eine 2×-Verdünnung der Bilirubinoxidase von M. verrucaria.
    • Probe 11 ist eine 4×-Verdünnung der Bilirubinoxidase von M. verrucaria.
    • Probe 12 ist eine 8×-Verdünnung der Bilirubinoxidase von M. verrucaria.
    • Probe 13 ist eine 1/1 (Vol./Vol.)-Mischung von unverdünnten Proben des Phenol oxidierenden Enzyms von S. parvispora und der Bilirubinoxidase von M. verrucaria.
  • Interpretationen der Präzipitationsreaktionen, die aus diesem Test resultierten, wurden dann ausgeführt, indem dem Protokoll gefolgt wurde, das in Clausen, a. a. O., in Kapitel 6, S. 143–146 beschrieben wurde, und unter den ebenda spezifizierten Bedingungen.
  • Die Ergebnisse von Objektträger A (der die verschiedenen Verdünnungen des Phenol oxidierenden Enzyms von S. parvispora enthielt) zeigten einen klaren Präzipitationsbogen (oder Immunpräzipitationslinie) des Typs, welcher als Typ I bezeichnet wird, der als typisch für vollständige Identität identifiziert worden ist (siehe Clausen, a. a. O., Seiten 144–146, § 6.1.2.1). Dies war erwartet worden, da das Antiserum gegen das Phenol oxidierende Enzym aus S. parvispora erzeugt worden war.
  • Die Ergebnisse von Objektträger B (welcher den gleichen Test umfasste, der unter Verwendung des gleichen Protokolls und unter den gleichen Bedingungen, wie sie ausführlich oben in diesem Beispiel beschrieben worden sind, mit äquivalenten Mengen (EU) des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys chartarum MUCL Nr. 38898 ausgeführt wurde) zeigten einen klaren Präzipitationsbogen des Typs, welcher als TYP 1 bezeichnet wird, welcher als typisch für vollständige Identität identifiziert worden ist (siehe Clausen, a. a. O., Seiten 144–146, § 6.1.2.1).
  • Die Ergebnisse von Objektträger C (welcher den gleichen Test umfasste, der unter Verwendung des gleichen Protokolls und unter den gleichen Bedingungen, wie sie ausführlich oben in diesem Beispiel beschrieben worden sind, mit äquivalenten Mengen (EU) der Bilirubinoxidase aus Myrothecium verrucaria ausgeführt wurde) zeigten, dass kein Präzipitationsbogen beobachtet wurde, was als typisch für ein Fehlen von Identität identifiziert worden ist (siehe Clausen, a. a. O., Seiten 144–146, § 6.1.2.1). Dementsprechend sind die Bilirubinoxidase von M. verrucaria und das Phenol oxidierende Enzym aus S. parvispora weder vollständig (noch teilweise) immunochemisch identisch.
  • Die Ergebnisse von Objektträger D (welcher den gleichen Test umfasste, der unter Verwendung des gleichen Protokolls und unter den gleichen Bedingungen, wie sie ausführlich oben in diesem Beispiel beschrieben worden sind, aber mit dem Phenol oxidierenden Enzym oder Bilirubinoxidase und mit den oben aufgeführten Mengen (EU) des Phenol oxidierenden Enzyms und von Bilirubinoxidase ausgeführt wurde) zeigten, dass ein Präzipitationsbogen in der Vertiefung (Vertiefung 4), die das Phenol oxidierende Enzym von S. parvispora und die M. verrucaria-Bilirubinoxidase (zusätzlich zu Vertiefung 1 und 2, aber nicht 3) enthielt, beobachtet wurde, wodurch bestätigt wurde, dass die Beobachtung eines Fehlens eines Präzipitationsbogens dazwischen in Objektträger 3 nicht das Ergebnis einer Inhibition aufgrund von irgendetwas anderem als dem Phenol oxidierenden Enzym war. Dementsprechend bestätigen dieser Objektträger und die Ergebnisse davon, dass die Bilirubinoxidase von M. verrucaria und das Phenol oxidierende Enzym aus S. parvispora weder vollständig (noch teilweise) immunchemisch identisch sind.
  • BEISPIEL 11
  • Farbstofftransfer-Verhütung
  • Das Potential des enzymatischen Systems, einen Farbstofftransfer zu verhüten, wurde untersucht, indem ein gefärbtes (Stoff)Muster in Gegenwart eines weißen Aufnahmemusters gewaschen wurde. Die Experimente wurden in 25 ml Carbonatpuffer, pH 9, enthaltend die beiden Muster von 5 × 5 cm, ausgeführt. Das Enzym wurde als ABTS (2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Einheiten quantifiziert. Eine ABTS-Einheit ist definiert als die Menge von Enzym, die eine Zunahme der optischen Dichte von 1 OD/min bei 418 nm in Gegenwart von 2 mM ABTS in 20 mM Tris-Puffer, pH 9. Die Experimente wurden in Gegenwart von 0 Einheiten (u), 0,5 u, 1 u und 2 u/ml Waschlösung ausgeführt. Phenothiazin-10-propionat wurde als ein Verstärker der Enzymaktivität zugegeben. Dieser Verstärker wurde in Konzentrationen von 0 μM, 50 μM, 100 μM und 250 μM zugegeben. Die Stoffe wurden in der Waschlösung 30 min bewegt. Danach wurden sie im Taumeltrockner getrocknet und die Remissionsspektren wurden unter Verwendung eines Minolta-Spektrometers gemessen. Die dadurch erhaltenen Daten wurden zu den CIELAB-L*a*b*-Farbraum-Parametern transferiert. In diesem Farbraum bezeichnet L* die Helligkeit und a* und b* sind die Farbartkoordinaten.
  • Die Farbunterschiede zwischen dem Kontrollmuster ohne Zugabe des enzymatischen Bleichsystems und dem Stoffmuster, das in Gegenwart des Enzyms und/oder Phenothiazin-10-propionat gewaschen worden war, wurden ausgedrückt als ΔE, welches aus der folgenden Gleichung berechnet wurde:
    Figure 00390001
  • Der Weißanteil (ΔL) und der Farbtonunterschied (ΔE), die durch das obige Verfahren erhalten werden, sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
    Reactive Black 5 Direct Green 26
    ΔL ΔE ΔL ΔE
    Enzym: 0 Einheiten PTP: 0 μM 0 0 0 0
    Enzym: 0,5 Einheit PTP: 0 μM 1,6 1,7 –0,4 0,7
    Enzym: 1 Einheit PTP: 0 μM 2,6 2,7 –0,1 0,5
    Enzym: 2 Einheiten PTP: 0 μM 3,0 3,1 0,1 0,3
    Enzym: 0 Einheiten PTP: 50 μM –0,4 0,4 0 0,3
    Enzym: 0,5 Einheit PTP: 50 μM 4,1 4,3 1,9 2,6
    Enzym: 1 Einheit PTP: 50 μM 5,1 5,2 1,9 3,0
    Enzym: 2 Einheiten PTP: 50 μM 5,2 5,3 3,0 3,9
    Enzym: 0 Einheiten PTP: 100 μM –1,4 1,5 0,1 0,4
    Enzym: 0,5 Einheit PTP: 100 μM 4,3 4,5 2,2 3,1
    Enzym: 1 Einheit PTP: 100 μM 5,2 5,2 2,5 3,5
    Enzym: 2 Einheiten PTP: 100 μM 4,8 4,9 2,7 3,7
    Enzym: 0 Einheiten PTP: 250 μM –1,2 1,3 0,5 0,5
    Enzym: 0,5 Einheit PTP: 250 μM 5,1 5,2 2,1 3,1
    Enzym: 1 Einheit PTP: 250 μM 5,5 5,6 2,3 3,7
    Enzym: 2 Einheiten PTP: 250 μM 5,3 5,4 2,4 3,9
  • BEISPIEL 12
  • Bleichen von Tomatenflecken
  • Die Fähigkeit eines Phenol oxidierenden Enzyms der Erfindung, Flecken zu bleichen, wurde untersucht, indem Baumwollmuster, die mit Tomatenmark beschmutzt sind, in Gegenwart des Phenol oxidierenden Enzyms von Stachybotrys chartarum (welches durch die in Beispiel 4 und 5 offenbarten Verfahren erhältlich ist) und eines Verstärkers gewaschen wurden. Die Experimente wurden in 15 ml Boratpuffer, pH 9, und Phosphatpuffer, pH 7, ausgeführt. Das Enzym wurde als ABTS(2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Einheiten quantifiziert. Eine ABTS-Einheit ist definiert als die Menge von Enzym, die eine Zunahme der optischen Dichte von 1 OD/min bei 418 nm in Gegenwart von 2 mM ABTS in 20 mM Tris-Puffer, pH 9. Die Experimente wurden in Gegenwart von 2,8 Einheiten/ml Waschlösung ausgeführt.
  • Phenothiazin-10-propionat wurde als ein Verstärker der Enzymaktivität zugesetzt. Dieser Verstärker wurde in Konzentrationen von 250 μM zugegeben. Die Muster wurden 30 min bei 30°C gewaschen. Nach dem Waschen wurde die restliche Farbe der Flecken wie in Beispiel 11 gemessen. In der nachfolgenden Tabelle ist der Unterschied bei der Farbmessung zwischen dem Fleck vor und nach dem Waschen angegeben.
    Waschbedingung ΔE
    kein Enzym, 250 μM PTP, pH 7 11,5
    2,8 u Enzym, 250 μM PTP, pH 7 16,7
    kein Enzym, 250 μM PTP, pH 9 11,4
    2,8 u Enzym, 250 μM PTP, pH 9 15,2
  • Wie aus den ΔE-Werten ersehen werden kann, ist das Bleichen des Tomatenflecks in Gegenwart des Enzympräparats verbessert.
  • Beispiel 13
  • Aminosäuresequenzanalyse des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys chartarum
  • Das wie in Beispiel 4 offenbart hergestellte Phenol oxidierende Enzym aus Stachybotrys chartarum wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und isoliert. Die isolierte Fraktion wurde mit Harnstoff und Iodacetamid behandelt und durch das Enzym endoLysC verdaut. Die aus dem endoLysC-Verdau resultierenden Fragmente wurden durch HPLC (Umkehrphasen-„monobore"-C18-Säule, CH3CN-Gradient) aufgetrennt und in einer Multititerplatte gesammelt. Die Fraktionen wurden durch MALDI für eine Massenbestimmung analysiert und über einen Edman-Abbau sequenziert. Die folgenden Aminosäuresequenzen wurden bestimmt und sind in der Orientierung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus gezeigt:
    Figure 00410001
  • Die 4A–4B sind eine auf Homologie basierende Aminosäure-Ausrichtung (Aminosäure-Alignment) der Fragmente des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys chartarum gegenüber der Bilirubinoxidase aus Myrothecium verrucaria und dem Mangan-oxidierenden Protein aus LEPTOTHRIX DISCOPHORA.
  • Beispiel 14
  • Klonieren von genomischer Nucleinsäure
  • Es wurden zwei degenerierte Primer basierend auf der Peptidsequenz gestaltet. Primer 1 enthält die folgende Sequenz: TATTACTTTCCNAAYTAYCA, worin N eine Mischung von allen vier Nucleotiden (A, T, C und G) darstellt und Y eine Mischung von nur T und C darstellt. Primer C enthält die folgende Sequenz: TCGTATGGCATNACCTGNCC.
  • Für die Isolierung von genomischer DNA, welche Phenol oxidierendes Enzym kodiert, wurde aus Stachybotrys chartarum (MUCL Nr. 38898) isolierte DNA als Matrize für eine PCR verwendet. Die DNA wurde 100-fach mit Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 88 ng/μl verdünnt. Zehn Mikroliter verdünnte DNA wurden zu der Reaktionsmischung, die 0,2 mM von jedem Nucleotid (A, G, C und T), 1 × Reaktionspuffer, 0,296 Mikrogramm von Primer 1 und 0,311 Mikrogramm von Primer 2 in einer Gesamtmenge von 100 Mikrolitern Reaktionsmischung enthielt, zugegeben. Nach Erwärmen der Mischung bei 100°C für 5 min wurden 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase zu der Reaktionsmischung hinzugegeben. Die PCR-Reaktion wurde bei 95°C für 1 min ausgeführt, die Primer wurden an die Matrize bei 45°C 1 min anhybridisiert und die Verlängerung erfolgte bei 68°C für 1 min. Dieser Zyklus wurde dreißigmal wiederholt, um ein im Gel sichtbares PCR-Fragment zu erhalten. Das durch ein Agarosegel detektierte PCR-Fragment enthielt ein Fragment von etwa 1 Kilobase, welches dann in den Plasmidvektor pCR-II (Invitrogen) kloniert wurde. Das 1 kb-Insert wurde dann einer Nucleinsäuresequenzierung unterworfen. Die Sequenzdaten enthüllten, dass es sich um das Gen, welches Stachybotrys chartarum codierte, handelte, da die abgeleitete Peptidsequenz mit den oben offenbarten Peptidsequenzen, die über einen Edman-Abbau sequenziert worden waren, übereinstimmte. Die PCR-Fragmente, welche das 5'-Gen und das 3'-Gen enthielten, wurden dann isoliert und sequenziert. 6 gibt die genomische Sequenz in voller Länge (SEQ ID NO: 3) von Stachybotrys-Oxidase einschließlich der Promotor- und Terminatorsequenzen an.
  • Beispiel 15
  • Klonieren der cDNA, welche das Phenol oxidierende Enzym von Stachybotrys codiert.
  • Der Stachybotrys chartarum-Stamm (MUCL 38898) wurde in Laccase-Produktionsmedium kultiviert und RNA wurde aus dem Myzel extrahiert und als Matrize für eine cDNA-Isolierung verwendet. Die Gesamt-cDNA wurde durch reverse Transkriptase unter Verwendung von 4,3 Mikrogramm RNA in einer 20 Mikroliter-Reaktionsmischung, enthaltend 0,34 Mikrogramm oligo-dT18-Primer, 0,5 mM von jedem der vier Nucleotide (A, G, C und T), 20 Einheiten RNA-Inhibitor und 100 Einheiten reverse Transkriptase, synthetisiert. Die cDNA, welche das Phenol oxidierende Enzym aus Stachybotrys codierte, wurde dann durch PCR in zwei Schritten kloniert. Als erstes wurde die 5'-cDNA als ein 678 bp-Fragment unter Verwendung der folgenden zwei Primer kloniert: GTCAATATGCTGTTCAAG und CTCGCCATAGCCACTAGG. Als zweites wurde die 3'-cDNA als ein 1301 bp-Fragment unter Verwendung der folgenden zwei Primer kloniert: CTTTCGATGGTTGGGCTG und GTTCTAGACTACTCCTCGATTCCAAGATC. Die cDNA-Sequenz von 1791 bp ist in 5 gezeigt.
  • Beispiel 16
  • Vergleich der genomischen DNA und der cDNA des Phenol oxidierenden Enzyms von Stachybotrys chartarum
  • Ein Vergleich der cDNA mit genomischer DNA enthüllte, dass es fünf Introns in der genomischen DNA gab. Die Proteintranslationsstartstelle (ATG) befindet sich bei Nucleotid Nr. 1044 bis Nr. 1046 und die Translationsstopstelle befindet sich bei Nucleotid Nr. 3093 bis 3095. Die ausgehend von der cDNA und genomischen DNA translatierte Proteinsequenz enthält 594 Aminosäuren.
  • Vergleich des Phenol oxidierenden Enzyms von Stachybotrys chartarum mit anderen oxidierenden Enzymen
  • Die Proteinsequenz SEQ ID NO: 2 wurde als Abfrage verwendet, um GCG (Genetics Computer Group University Research Park, Madison Wisconsin)-DNA- und Proteindatenbanken zu durchsuchen. Es zeigte sich, dass Stachybotrys-Oxidase 60% Identität mit Bilirubinoxidase auf der Proteinsequenzebene gemein hatte. 7 zeigt die auf Homologie basierende Sequenzausrichtung (Sequenz-Alignment) der beiden Proteine.
  • Beispiel 17
  • Expression des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys in Aspergillus niger var. awamori
  • Das DNA-Fragment, welches Nucleinsäure, welche das Phenol oxidierende Enzym aus Stachybotrys codiert, flankiert durch zwei neu eingeführte Restriktionsenzymstellen (BlgII und XbaI) enthält, wurde durch PCR isoliert (9). Dieses PCR-Fragment wurde zuerst in den Plasmidvektor pCR-II kloniert und einer Nucleinsäuresequenzierung unterworfen, um die Gensequenz zu verifizieren. Dieses DNA-Fragment wurde dann in die BglII- bis XbaI-Stelle des Vektors (pGAPT, siehe 8) kloniert. Der für das Exprimieren des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys verwendete Vektor enthält den Aspergillus niger-Glucoamylase-Genpromotor (von Base 1 bis Base 1134) und -terminator (von Base 1227 bis Base 1485), eine Mehrfachklonierungsstelle (von Base 1135 bis Base 1227), das pyrG-Gen von Aspergillus nidulans (von Base 1486 bis Base 3078) als Selektionsmarker für eine pilzliche Transformation und ein puc18-Plasmid-Gerüst für eine Propagierung in E. coli. Mit dem als pGAPT-gDO104 bezeichneten Expressionsplasmid wurde dann Aspergillus (Stamm dgr246:p2, Appl. Micro. Biotechnol., 1993, 39: 738–743) durch Standard-PEG-Methoden transformiert. Transformanten wurden auf Platten ohne Uridin selektiert. Vierzig Transformanten wurden auf CSA-Platten kultiviert und dann in Schüttelkolben, welche CSL- Spezialmedium mit Maltose enthielten, transferiert. CSA-Platten enthalten: NaH2PH04·H2O: 1 g/l; MgSO4: 1 g/l; Maltose 50 g/l; Glucose: 2 g/l; Promosoy: 10 g/l, Mazu: 1 ml/l; und Bacto Agar: 15 g/l. Das CSL-Medium wird in Dunn-Coleman et al., 1991, Bio/Technology 9: 976–981 beschrieben. CSL-Spezialmedium ist CSL-Medium, bei welchem Glucose und Fructose eliminiert wurden. ABTS-Assays wurden an den Tagen 3, 6 und 10 ausgeführt. Die Transformanten wurden auch zuerst in CSL kultiviert und dann nach eintägiger Vermehrung in Clofine-Spezialmedium transferiert. Nach 6 Tagen Vermehrung wurden diese Proben hinsichtlich ABTS-Aktivitäten (> 0,2 Einheiten) getestet. Die fünf besten Transformanten wurden über Sporen gereinigt und erneut auf ABTS-Aktivität nach achttägiger Vermehrung in Clofine-Medium getestet (> 5 Einheiten/ml). 10 zeigt ein SDS-Protein-Polyacrylamidgel, wobei das Expressionsniveau der rekombinanten Stachybotrys-Oxidase in kultivierten Aspergillus niger var. awamori einer Tag 6-Kultur, kultiviert in CSL-Spezialmedium, angegeben wird.
  • Beispiel 18
  • Expression von Phenol oxidierendem Enzym in Trichoderma reesei:
  • Das Expressionsplasmid für eine Verwendung beim Transformieren von Trichoderma reesei wurde, wie folgt, konstruiert. Die Enden des in 9 gezeigten BglII- bis XbaI-Fragments, welches das das Phenol oxidierende Enzym von Stachybotrys codierende Gen enthält, wurden durch T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und in die PmeI-Restriktionsstelle des Trichoderma-Expressionsvektors pTrex inseriert, der eine modifizierte Version von pTEX ist, siehe PCT-Veröffentlichung Nr. WO 96/23928 für eine vollständige Beschreibung der Herstellung des pTEX-Vektors, welcher einen CBHI-Promotor und -Terminator für eine Genexpression und ein Trichoderma-pyr4-Gen als Selektionsmarker für Transformanten enthält. Das lineare DNA-Fragment, welches nur den CBH1-Promotor, das Phenol oxidierende Gen aus Stachybotrys, den CBH1-Terminator und den Selektionsmarker pyr4 enthält, wurde aus einem Gel isoliert und wurde verwendet, um einen Uridin-auxotrophen Stamm von Trichoderma reesei (siehe U.S.-Patent Nr. 5,472,864 ), in welchem die vier hauptsächlichen Cellulasegene deletiert sind, zu transformieren. Stabile Transformanten wurden auf Trichoderma-Minimalplatten ohne Uridin isoliert. Die Transformanten wurden auf 50 ml Proflo-Medium in Schüttelkolben 7 Tage bei 28°C bis 30°C kultiviert und die Expression des Phenol oxidierenden Enzyms wurde durch ABTS (> 0,2 Einheiten/ml) und ein SDS-PAGE-Proteingel bestimmt. Proflo-Medium besteht aus (g/l): Proflo 22,5; Lactose 30,0; (NH4)2SO4 6,5; KH2PO4 2,0; MgSO4·7H2O 0,3; CaCl2 0,2; CaCO3 0,72; Spurenmetall-Stammlösung 1,0 ml/l und 10% Tween 80, 2,0 ml/l. Die verwendete Spurenmetall-Stammlösung enthielt (g/l): FeSO4·7H2O 5,0; MnSO4·H2O 1,6; ZnSO4·7H20 1,4; CoCl2·6H2O) 2,8.
  • Beispiel 19
  • Expression des Phenol oxidierenden Enzyms aus Stachybotrys in Saccharomyces cerevisiae:
  • Das BglII- bis XbaI-Fragment der cDNA (SEQ ID NO: 1) des Phenol oxidierenden Gens wurde in den Hefe-Expressionsvektor yES2.0 (Invitrogen), welcher den Hefe-Gal 1-Promotor und Cyc 1-Terminator, um die Expression des Phenol oxidierenden Gens zu steuern, und das Hefe-URA3-Gen als Selektionsmarker enthält, kloniert. Mit dem Expressionsplasmid wurde ein Hefestamm (Sc2-Stamm von Invitrogen) transformiert. Die Transformanten wurden auf Hefe-Minimalplatten ohne Uridin selektiert. Vier zufällig gepickte Transformanten zeigten im Plattenassay Aktivität (Bildung von gefärbten Höfen in Hefe-Minimalplatte mit 1 mM ABTS), während der Kontroll-Plasmidvektor keinerlei Bildung von gefärbten Höfen zeigte.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001

Claims (25)

  1. Phenol oxidierendes Enzym, erhältlich aus Stachybotrys und mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 65% Identität mit dem Phenol oxidierenden Enzym mit der Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 2 offenbart ist.
  2. Phenol oxidierendes Enzym nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 2 offenbart ist.
  3. Phenol oxidierendes Enzym nach Anspruch 1, wobei die Stachybotrys S. parvispora, S. chartarum, S. kampalensis, S. theobromae, S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes und S. nilagerica einschließt.
  4. Isoliertes Polynucleotid, welches das Phenol oxidierende Enzym nach Anspruch 1 codiert.
  5. Isoliertes Polynucleotid, welches die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 2 offenbart ist.
  6. Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 4 mit einer Nucleinsäuresequenz, die mindestens 65% Identität mit der Nucleinsäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 offenbart ist, oder die in der Lage ist, mit der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz zu hybridisieren, oder die komplementär zu der Nucleinsäuresequenz ist, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 offenbart ist.
  7. Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 6 mit der Nucleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 offenbart ist.
  8. Expressionsvektor, umfassend das Polynucleotid nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 7.
  9. Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 8.
  10. Wirtszelle nach Anspruch 9, die ein Fadenpilz, eine Hefe oder ein Bakterium ist.
  11. Wirtszelle nach Anspruch 9, bei der der Fadenpilz die Art Aspergillus, die Art Trichoderma und die Art Mucor einschießt, die Hefe die Arten Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kluyveromyces und Yarrowia einschließt und das Bakterium die Arten Bacillus und Escherichia einschließt.
  12. Verfahren zur Produktion eines aus Stachybotrys erhältlichen Phenol oxidierenden Enzyms in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend die Schritte: (a) Erhalten einer rekombinanten Wirtszelle, die mit einem Polynucleotid transformiert ist, welche das aus Stachybotrys erhältliche Phenol oxidierenden Enzym codiert, wobei das Enzym eine Aminosäuresequenz mit mindestens 65% Identität mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz aufweist; (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Produktion des Phenol oxidierenden Enzyms geeignet sind; und (c) gegebenenfalls Gewinnen des produzierten Phenol oxidierenden Enzyms.
  13. Verfahren zur Produktion eines Phenol oxidierenden Enzyms, wobei das Verfahren den Schritt des Kultivierens einer rekombinanten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen umfasst, wobei die Wirtszelle durch die Expression eines Polynucleotids gekennzeichnet ist, das in die Wirtszelle transformiert worden ist und ein Phenol oxidierendes Enzym codiert, das aus Stachybotrys erhältlich ist, wobei das Enzym eine Aminosäuresequenz mit mindestens 65% Identität mit der Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 2 offenbart ist, und gegebenenfalls des Gewinnens des Phenol oxidierenden Enzyms.
  14. Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, bei dem das Phenol oxidierende Enzym aus Stachybotrys erhältlich ist, welche S. parvispora, S. chartarum, S. kampalensis, S. theobromae, S. bisbyi S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes und S. nilagerica einschließt.
  15. Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, bei dem das Polynucleotid wie in Anspruch 6 definiert ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, bei dem die Wirtszelle Fadenpilz, Hefe und Bakterien einschließt.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Hefe die Arten Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kluyveromyces und Yarrowia einschließt und der Fadenpilz die Art Aspergillus, die Art Trichoderma und die Art Mucor einschließt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, bei das Saccharomyces S. cerevisiae ist und bei dem der Fadenpilz Aspergillus niger var. awamori oder Trichoderma reseei ist.
  19. Verfahren zur Erzeugung einer Wirtszelle, die ein Polynucleotid umfasst, welches ein aus Stachybotrys erhältliches Phenol oxidierendes Enzym codiert, wobei das Enzym eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 65% Identität mit der Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 2 offenbart ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Einführen eines Polynucleotids, welches das Phenol oxidierende Enzym codiert, in eine Wirtszelle, (b) gegebenenfalls Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Produktion des Phenol oxidierenden Enzyms geeignet sind.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Wirtszelle Fadenpilz, Hefe und Bakterien einschließt.
  21. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Polynucleotid wie in Anspruch 6 definiert ist.
  22. Wirtszelle, transformiert mit einem Polynucleotid, wie es in irgendeinem der Ansprüche 4 bis 7 definiert ist, wobei die Wirtszelle keine Stachybotrys-Art ist.
  23. Wirtszelle nach Anspruch 22, bei der das Polynucleotid in das Wirtszellengenom integriert ist.
  24. Wirtszelle nach Anspruch 22, die Fadenpilz, Hefe und Bakterien einschließt.
  25. Detergenszusammensetzung, umfassend das Phenol oxidierende Enzym nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3.
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