PT2350250E - Sistema de entrega para enzima e substrato coformulados - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "SISTEMA DE ENTREGA PARA ENZIMA E SUBSTRATO COFORMULADOS"

Prioridade 0 presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos E.U.A. com o N° de Série 61/110 832, apresentado em 3 de novembro de 2008.

Campo da Invenção A invenção diz respeito a formulações líquidas para a coentrega de enzimas e substratos, em que pelo menos uma enzima está encapsulada numa matriz polimérica.

Antecedentes da Invenção

Na entrega de sistemas de enzima/substrato, surgem geralmente dois problemas. O primeiro problema é que a eficácia ótima depende da manutenção da proporção adequada enzima:substrato. O segundo problema é que a enzima deve estar fisicamente isolada do seu substrato até a reação ser desejada. Uma maneira de ultrapassar estes problemas consiste em embalar a enzima separadamente do substrato e combiná-los no momento da utilização. No entanto, esta abordagem é inconveniente, complicada e pode resultar em erros de mistura no momento da utilização. Ele também pode 2 ΡΕ2350250 ser dispendiosa uma vez que a enzima muitas vezes tem de ser formulada com substâncias estabilizantes. Uma outra maneira de ultrapassar estes problemas é proporcionar uma mistura de enzima seca e substrato seco, conseguindo-se assim o isolamento físico, enquanto se mantém a proporção adequada de enzima para substrato. Contudo, é frequentemente desejável ou necessário proporcionar uma formulação líquida para utilização em processos que não estão configurados para manipular pós, grânulos ou outros produtos sólidos. É necessária uma abordagem alternativa.

Seria desejável uma abordagem de coformulação, com a enzima e o substrato combinados no mesmo recipiente. Isto iria permitir a um fabricante controlar a proporção enzima:substrato, resultando em economia de custos nos ingredientes da formulação, e iria proporcionar um produto simples, conveniente e "pronto a usar" para o consumidor. Em alguns casos, a combinação de enzima e substrato na mesma formulação líquida pode atenuar as preocupações de toxicidade (por exemplo, os riscos ambientais colocados por mediadores de lacase poderiam ser substancialmente reduzidos se eles pudessem ser manuseados e transportados no mesmo recipiente como a própria enzima lacase).

Ounichi (Patente dos E.U.A. N° 4 898 781) e Aron-son (Patente dos E.U.A. N° 5 281 355) ensinam o encapsulamento de enzimas para aplicações de lavandaria e de assistência domiciliar, onde o produto resultante contém apenas uma enzima e não contém um substrato reativo. Seria desejá- 3 ΡΕ2350250 vel produzir uma formulação liquida contendo não só a enzima mas também o substrato, com a enzima isolada do substrato reativo. As aplicações nas quais uma tal coformulação poderia ser útil incluem, mas sem constituir limitação, sistemas enzimáticos de branqueamento, por exemplo, utilizando uma enzima per-hidrolase com um substrato éster, e sistemas enzimáticos de tingimento, por exemplo, utilizando uma enzima lacase e um substrato precursor de corante.

Breve Sumário da Invenção

Num aspeto, a invenção proporciona um sistema de entrega liquido para enzima e substrato coformulados, em que o sistema de entrega é uma composição contendo uma enzima e um substrato para a enzima, em que a enzima está encapsulada numa matriz polimérica solúvel em água. 0 substrato está numa fase liquida substancialmente não aquosa (isto é, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 1%, ou menos do que cerca de 0,5% de água) em contacto com a matriz polimérica que contém a enzima, em que o polímero não é solúvel na fase líquida. A enzima retém o potencial catalítico na matriz polimérica, mas substancialmente não reage com o substrato na composição durante pelo menos 10 dias a 25 °C. Após a adição de água à composição, a matriz polimérica é solubilizada, libertando a enzima, permitindo que ocorra a reação catalítica com o substrato.

Em algumas formas de realização, a composição contém um ou mais enzimas selecionadas a partir de protea- 4 ΡΕ2350250 ses, celulases, amilases, pectinases, per-hidrolases, pero-xidases, oxidases de hidratos de carbono, enzimas oxidantes de fenol, cutinases, lipases, hemicelulases, xilanases, mananases, catalases e lacases, e suas misturas. Em algumas formas de realização, a composição contém duas ou mais enzimas encapsuladas na mesma matriz polimérica. Em algumas formas de realização, a composição contém duas ou mais enzimas encapsulados em matrizes poliméricas separadas. Em algumas formas de realização, a composição contém duas ou mais enzimas encapsuladas na mesma matriz polimérica e pelo menos uma enzima encapsulada numa matriz polimérica separada.

Em algumas formas de realização, a composição contém pelo menos um agente tensioativo.

Em algumas formas de realização, a matriz polimérica é selecionada a partir de álcool polivinílico, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirro-lidona, goma guar e seus derivados ou copolimeros. Um polímero apropriado para utilização nas composições aqui proporcionadas é aguele em gue uma enzima pode ser encapsulada e que não é solúvel em água.

Em algumas formas de realização, a matriz polimérica contendo enzima está na forma de partículas suspensas num líquido substancialmente não aquoso contendo o substrato. Numa forma de realização, as partículas são mantidas em suspensão por meio dum auxiliar de suspensão. 5 ΡΕ2350250

Em algumas forma de realização, a suspensão em líquido está num recipiente que contém uma quantidade de enzima e substrato suficiente e/ou pretendida para uma única utilização (ou seja, uma dose única) numa aplicação na qual a reação enzima/substrato é útil, em que o recipiente pode ser aberto para dispensar o líquido, por exemplo, através da abertura de um tampão ou tampa. Em algumas formas de realização, a suspensão em líquido está num recipiente resselável, que contém uma quantidade de enzima e substrato suficiente e/ou pretendida para utilizar várias vezes (ou seja, doses múltiplas), o que permite a dispensa repetida da suspensão através da abertura e fecho de um tampão de recipiente, abertura e fecho de uma válvula de porto dispensador, ou semelhantes. Em algumas formas de realização, a matriz polimérica contendo a enzima está na forma de um recipiente fechado, isto é, selado, tal como uma bolsa ou saqueta, e o substrato está num líquido substancialmente não aquoso no interior do recipiente polimérico. 0 substrato é solubilizado ou disperso numa fase líquida substancialmente não aquosa, a qual pode incluir um líquido não aquoso (fluido de transporte). Exemplos de fluidos transportadores incluem, mas sem constituir limitação, glicóis, agentes tensioativos não iónicos, álcoois, poliglicóis, ésteres acetatos ou uma sua mistura. Um substrato líquido ou sólido pode ser combinado com um ou mais fluidos agente de suporte e pode ser ou miscível com ou suspenso no ou nos fluidos agentes de suporte. Em algumas formas de realização, o fluido agente de suporte 6 ΡΕ2350250 contém sal ou um tampão de pH adicionado para criar condições adequadas para aumentar a solubilização do substrato e/ou reduzir a solubilização do polimero encapsulante. Em algumas formas de realização, o fluido agente de suporte é um substrato para a enzima, por exemplo, um fluido agente de suporte de diacetato de propilenoglicol pode servir como substrato para uma enzima per-hidrolase encapsulada numa matriz polimérica, a qual é insolúvel em diacetato de propilenoglicol, por exemplo, álcool polivinilico, metilcelu-lose, hidroxipropil-metilcelulose, polivinilpirrolidona). Em muitas formas de realização, a entrega exibe uma maior estabilidade em comparação com um sistema de entrega comparável sem o polimero.

Numa forma de realização, a enzima é uma per-hidrolase e o substrato é um substrato de éster, tal como, por exemplo, um éster de acetato, por exemplo, diacetato de propilenoglicol. Em algumas formas de realização, o substrato éster é diacetato de propilenoglicol, e o polimero compreendendo a enzima per-hidrolase está na forma de partículas suspensas no diacetato de propilenoglicol, ou sob a forma de um recipiente fechado que rodeia o diacetato de propilenoglicol, isto é, o diacetato de propilenoglicol está encerrado no interior do recipiente polimérico.

Em algumas formas de realização, a enzima é uma per-hidrolase, o substrato é um substrato de éster, a composição compreende ainda um composto gerador de peróxido de hidrogénio, por exemplo, selecionado de entre percarbonato 7 ΡΕ2350250 de sódio, perborato de sódio e peróxido de hidrogénio--ureia, e um perácido é produzido depois da água ser adicionada à composição. Em algumas formas de realização, o perácido é selecionado de entre ácido peracético, ácido pernonanoico, ácido perpropiónico, ácido perbutanoico, ácido perpentanoico e ácido per-hexanoico. Em algumas formas de realização, o substrato de éster é diacetato de propilenoglicol e o composto gerador de peróxido de hidrogénio está suspenso no diacetato de propilenoglicol.

Em algumas formas de realização, a enzima é uma enzima per-hidrolase e a composição contém substratos para a produção de mono e diglicéridos (por exemplo, um dador de acilo e aceitador de álcool) ou um éster de sorbitano (por exemplo, um dador de acilo e sorbitano). Em algumas formas de realização, a enzima é uma enzima per-hidrolase e a composição contém substratos para a produção de um éster fragrante, por exemplo, um éster de benzilo (por exemplo, um dador de acilo e um álcool volátil, por exemplo, álcool benzilico).

Em algumas formas de realização, a enzima é uma enzima oxidante de fenol, tal como uma enzima lacase, e o substrato é um mediador da lacase, por exemplo, selecionado de entre 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), siringamida e siringonitrilo.

Em vários aspetos, a invenção proporciona uma composição para utilização numa aplicação em que uma ΡΕ2350250 atividade enzimática é útil, por exemplo, uma composição detergente, uma composição de processamento têxtil, ou uma composição para cuidados pessoais, em que a composição contém uma enzima e um substrato para a enzima, em que a enzima está encapsulada numa matriz polimérica solúvel em água e em que a matriz polimérica contendo a enzima está em contacto com e é insolúvel numa solução ou suspensão em liquido substancialmente não-aquosa contendo o substrato, conforme aqui descrito.

Em outro aspeto, a invenção proporciona um kit contendo um sistema de entrega para enzima e substrato coformulados conforme aqui descrito ou uma composição contendo o sistema de entrega, e embalagem. Em algumas formas de realização, o kit compreende ainda instruções para utilização num método, por exemplo, um método de descontaminação, um método de limpeza, um método de processamento de têxteis, ou um método de cuidados pessoais. Em algumas formas de realização, o kit compreende ainda instruções para a incorporação do sistema de entrega numa composição formulada para utilização num método no qual a atividade catalítica da enzima sobre o substrato é útil, por exemplo, uma composição detergente, uma composição de processamento de têxteis ou um composição de cuidados pessoais.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um método para descontaminação compreendendo: (a) adição de uma composição contendo per-hidrolase conforme aqui 9 ΡΕ2350250 descrito para a água na presença de uma fonte de peróxido de hidrogénio e mistura, gerando assim uma solução aquosa de perácido; e (b) contacto de um item compreendendo um contaminante com a solução, reduzindo assim a concentração do contaminante. Em algumas formas de realização, o contaminante compreende uma toxina selecionada de entre toxina botulinica, toxina de antraz, ricina, toxina escombroide, ciguatoxina, tetradotoxina, micotoxinas ou uma sua combinação. Em algumas formas de realização, o contaminante compreende um agente patogénico selecionado a partir de uma bactéria, um virus, um fungo, um parasita, um prião ou uma sua combinação. Em algumas formas de realização, o item é selecionado a partir de uma superfície dura, um tecido, um alimento, uma ração, uma peça de vestuário, um tapete, um tapete, um tecido, um instrumento médico e um instrumento veterinário. Em algumas formas de realização, a água é esterilizada. Em algumas formas de realização, o contacto do item a ser descontaminado é realizado a alta temperatura.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um método para o branqueamento de um produto têxtil, compreendendo: (a) adição a água de uma composição contendo per-hi-drolase conforme aqui descrita, na presença de uma fonte de peróxido de hidrogénio, e mistura, gerando-se assim uma solução aquosa de perácido; e (b) contacto de um produto têxtil com a solução durante um período de tempo e sob condições adequadas para permitir um branqueamento mensurável do produto têxtil, produzindo-se assim um produto têxtil branqueado. 10 ΡΕ2350250

Num outro aspeto, a invenção proporciona um método para limpeza, compreendendo o contacto de um artigo compreendendo uma mancha com uma composição detergente, conforme aqui descrita, na presença de água adicionada, em que pelo menos uma porção da mancha é removida.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um método para o branqueamento de um produto têxtil, compreendendo o contacto de um produto têxtil com uma composição contendo uma enzima oxidante de fenol (por exemplo, lacase) conforme aqui descrito, na presença de água adicionada durante um período de tempo e sob condições que permitam o branqueamento mensurável do produto têxtil, em que a composição compreende um mediador que efetua o branqueamento do produto têxtil, produzindo-se assim um produto têxtil branqueado.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um método para modificar a cor de um produto têxtil, compreendendo o contacto de um produto têxtil com uma composição contendo uma enzima oxidante de fenol (por exemplo, lacase) conforme aqui descrito, na presença de água adicionada durante um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma mudança de cor mensurável no produto têxtil, em que a composição compreende um mediador que efetua a mudança de cor no produto têxtil sob as condições usadas, produzindo-se assim um produto têxtil com uma mudança de cor.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um méto- 11 ΡΕ2350250 do para a coloração dos cabelos, que compreende o contacto do cabelo com uma composição contendo uma enzima oxidante de fenol (por exemplo, lacase), conforme aqui descrito, na presença de áqua adicionada durante um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma mudança de cor mensurável no cabelo, em que a composição compreende um mediador que efetua a mudança de cor no cabelo sob as condições usadas, produzindo-se desse modo cabelo com uma mudança de cor.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um método para o branqueamento de polpa ou de papel e/ou desligninificação, compreendendo o contacto da polpa ou do papel com uma composição contendo enzima oxidante de fenol (por exemplo, lacase) conforme aqui descrita, na presença de água adicionada durante um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma mudança mensurável de cor e/ou conteúdo de lignina da polpa ou do papel, em que a composição compreende um mediador que efetua a mudança de cor e/ou conteúdo de lignina, produzindo-se assim polpa ou papel com uma mudança de cor e/ou conteúdo de lignina.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um método para a ativação enzimática de fibras de madeira para a produção de compósitos de madeira, compreendendo o contacto da madeira com uma composição contendo enzima oxidante de fenol (por exemplo, lacase), conforme aqui descrita, na presença de água adicionada durante um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma alteração 12 ΡΕ2350250 mensurável de rendimento do compósito de madeira, em que a composição compreende um mediador que efetua a mudança de rendimento do compósito de madeira, produzindo-se assim madeira com uma alteração na ligação de fibras de madeira.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um método para o tratamento de águas residuais, compreendendo o contacto dos efluentes de águas residuais com uma composição contendo uma enzima oxidante de fenol (por exemplo, lacase), conforme aqui descrito, na presença de água adicionada durante um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma diminuição mensurável na concentração de fenol nas águas residuais, em que a composição compreende um mediador que efetua a diminuição da concentração de fenol, produzindo-se assim efluentes de águas residuais com uma diminuição no conteúdo de fenol.

Breve Descrição dos Desenhos

Fig. 1 esquematicamente delineia reações catalisadas por uma enzima per-hidrolase

Fig. 2 mostra os resultados da experiência de lixiviação de enzima com discos de lacase em PVA e ABTS mediador de lacase, conforme descrito no Exemplo 3 Fig. 3 mostra os resultados da experiência de lixiviação de enzima com discos de lacase em PVA e SA mediador de lacase, conforme descrito no Exemplo 3 Fig. 4 mostra os resultados da experiência de lixiviação de enzima com discos de lacase em PVA e SN mediador de lacase, conforme descrito no Exemplo 3 13 ΡΕ2350250

Fig. 5 mostra os resultados do branqueamento de ganga nas experiências da placa de microtitulação de 12 poços descritas no Exemplo 3

Fig. 6 mostra os resultados do branqueamento de ganga e tingimento nas experiências de Launder-O-Meter descritas no Exemplo 3

Descrição Detalhada A invenção proporciona um sistema de entrega para enzima e substrato coformulados. As composições aqui descritas contêm uma enzima encapsulada numa matriz polimérica contendo um polímero solúvel em água. As composições também contêm um substrato para a enzima. A enzima encapsulada pode ser suspensa em ou na forma de um recipiente vedado em torno de uma composição líquida substancialmente não-aquosa compreendendo, consistindo do, ou consistindo essencialmente do substrato, tal como, por exemplo, um substrato líquido, solução de substrato, ou uma suspensão líquida de partículas de substrato sólido ou cápsulas contendo o substrato. A libertação da enzima a partir do polímero no qual está encapsulada é desencadeada por diluição em água.

Definições A menos que aqui definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o comummente entendido por um perito vulgar na técnica à qual esta invenção pertence. Por exemplo, Singleton e Sainsbury, Dictionary of Microbiology and 14 ΡΕ2350250

Molecular Biology, 2a Ed., John Wiley and Sons, NY (1994), e Hale e Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991), equipam os peritos na técnica com dicionários gerais de muitos dos termos usados na invenção. Quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos encontram utilização na prática da presente invenção. De acordo com isto, os termos definidos imediatamente abaixo são descritos mais completamente com referência à especificação como um todo. Também, conforme aqui usado, os termos no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem a referência plural a menos que o contexto indique claramente o contrário. A menos que indicado de outro modo, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carboxi, respetivamente.

Pretende-se que toda a limitação numérica máxima dada ao longo desta especificação inclui toda a limitação numérica mais baixa, como se tais limitações numéricas mais baixas fossem expressamente aqui escritas. Toda a limitação numérica mínima dada ao longo desta especificação irá incluir toda a limitação numérica mais alta, como se tais limitações numéricas mais altas fossem expressamente aqui escritas. Todo o intervalo numérico dado ao longo desta especificação irá incluir todo o intervalo numérico mais estreito que cai dentro desse intervalo numérico mais largo, como se tais intervalos numéricos mais estreitos fossem todos aqui expressamente escritos. 15 ΡΕ2350250

Conforme aqui utilizado, o termo "enzima" diz respeito a qualquer proteína que catalisa uma reação química. A função catalítica de uma enzima constitui a sua "atividade" ou "atividade enzimática." Uma enzima é tipicamente classificada de acordo com o tipo de função catalítica que carrega, por exemplo, hidrólise de ligações peptídicas.

Conforme aqui utilizado, o termo " substrato" diz respeito a uma substância (por exemplo, um composto químico) sobre a qual uma enzima exerce a sua atividade catalítica para gerar um produto.

Conforme aqui utilizado, os termos "purificado" e "isolado" dizem respeito à remoção de contaminantes de uma amostra e/ou a um material (por exemplo, uma proteína, ácido nucleico, célula, etc.), isto é, um material que é removido de pelo menos um componente com o qual está naturalmente associado. Por exemplo, esses termos podem referir-se a um material que está substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham conforme encontrado no seu estado nativo, tal como, por exemplo, um sistema biológico intacto.

Conforme aqui utilizado, o termo "polinucleótido" diz respeito a uma forma polimérica de nucleótidos de qualquer comprimento e qualquer estrutura tridimensional e de cadeia única ou múltipla (por exemplo, de cadeia única, de cadeia dupla, helicoidal tripla, etc.), que contém deso-xirribonucleótidos, ribonucleótidos e/ou análogos ou formas 16 ΡΕ2350250 modificadas de desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos, incluindo nucleótidos modificados ou bases ou os seus análogos. Devido ao código genético ser degenerado, pode ser usado mais de um codão para codificar um aminoácido particular e a presente invenção abrange polinucleótidos que codificam uma sequência de aminoácido particular. Qualquer tipo de nucleótido ou análogo de nucleótido modificado pode ser utilizado, desde que o polinucleótido retenha a funcionalidade desejada sob condições de utilização, incluindo as modificações que aumentam a resistência à nuclease (por exemplo, desoxi, 2'-0-Me, fosforotioatos, etc.). Também podem ser incorporadas marcadores para propósitos de deteção ou de captura, por exemplo, marcadores ou âncoras radioativos ou não radioativos, por exemplo, biotina. 0 termo polinucleótido inclui ácidos nucleicos peptidicos (PNA). Os polinucleótidos podem ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Os termos "polinucleótido" e "ácido nucleico" e "oligonucleótido" são aqui utilizados intermutavelmente. Os polinucleótidos da invenção podem conter de RNA, DNA ou ambos, e/ou formas modificadas e/ou seus análogos. Uma sequência de nucleótidos pode ser interrompida por componentes não nucleótidos. Um ou mais encadeamentos de fosfodiéster pode ser substituído por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas sem constituir limitação, formas de realização em que fosfato é trocado por P (0) S ("tioato"), P(S)S ("ditioato") , (0)NR2 ("amidato") , P(0)R, P(0)0R', CO ou CH2 ("formacetal") , em que cada R ou R' é independentemente H ou alquilo Ci-C2o substituído ou não 17 ΡΕ2350250 substituído contendo facultativamente um encadeamento éter (-0-), arilo, alcenilo, cicloalquilo, cicloalcenilo ou araldilo. Nem todos os encadeamentos num polinucleótido necessitam de ser idênticos. Os polinucleótidos podem ser lineares ou circulares, ou compreender uma combinação de porções lineares e circulares.

Conforme aqui usado, "polipéptido" diz respeito a qualquer composição constituída por aminoácidos e reconhecida como uma proteína pelos peritos na técnica. 0 código de uma letra ou de três letras convencional para codificar os resíduos de aminoácidos é aqui utilizado. Os termos "polipéptido" e "proteína" são utilizados aqui intermuta-velmente para referir polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácidos que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligações dissul-fureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, polipéptidos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

Conforme aqui usado, proteínas funcionalmente e/ou estruturalmente semelhantes são consideradas como sen- ΡΕ2350250 do "proteínas relacionadas." Em algumas formas de realização, estas proteínas são derivadas de um diferentes géneros e/ou espécie, incluindo as diferenças entre classes de organismos (por exemplo, uma proteína bacteriana e uma proteína fúngica). Em formas de realização adicionais, as proteínas relacionadas são fornecidos a partir da mesma espécie. Com efeito, não se pretende que os processos, métodos e/ou composições aqui descritos estejam limitados a proteínas relacionadas provenientes de uma qualquer fonte particular. Além disso, o termo "proteínas relacionadas" engloba homólogos estruturais terciárias e homólogos de sequência primária. Noutras formas de realização, o termo abrange proteínas que são imunologicamente reativas de forma cruzada.

Uma "per-hidrolase" refere-se a uma enzima que é capaz de catalisar uma reação de per-hidrólise que resulta na produção de uma quantidade suficientemente elevada de perácido adequada para utilização numa aplicação, tal como limpeza, branqueamento, desinfeção ou esterilização. Geralmente, uma enzima per-hidrolase utilizada em métodos aqui descritos apresenta uma alta razão per-hidrólise para hidrólise. Em algumas formas de realização, a per-hidrolase compreende, consiste ou consiste essencialmente da sequência de aminoácidos de per-hidrolase de Mycobacterium smegmatis estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou homólogo. Em algumas formas de realização, a enzima per-hidrolase compreende a atividade de acil-transferase e catalisa uma reação de transferência de acilo aquosa. 19 ΡΕ2350250

Os termos "per-hidrolisação" ou "per-hidrólise" conforme aqui utilizado referem-se a uma reação em que um perácido é gerado a partir de substratos de ésteres e peróxido de hidrogénio. Numa forma de realização, a reação de per-hidrolisação é catalisada com uma enzima per-hidrolase, por exemplo, acil-transferase ou aril-esterase. Em algumas formas de realização, um perácido é produzido por per-hidrólise de um substrato éster da fórmula RiC (=0) OR2, Em que Ri e R2 são porções orgânicas iguais ou diferentes, na presença de peróxido de hidrogénio (H2O2) · Numa forma de realização, -OR2 é -OH. Numa forma de realização, -OR2 é substituído por-NH2. Em algumas formas de realização, um perácido é produzido por per-hidrólise de um substrato ácido carboxílico ou amida. 0 termo "perácido," conforme é aqui utilizado, refere-se a uma molécula derivada de um éster de ácido carboxílico que se fez reagir com peróxido de hidrogénio para formar um produto altamente reativo que é capaz de transferir um dos seus átomos de oxigénio, por exemplo, um ácido orgânico da fórmula RC(=0)00H. É esta capacidade de transferência de átomos de oxigénio que permite a um perácido, por exemplo ácido peracético, funcionar como um agente de branqueamento. A frase "fonte de peróxido de hidrogénio" inclui peróxido de hidrogénio, bem como os componentes de um sistema que pode espontaneamente ou enzimaticamente produzir peróxido de hidrogénio como um produto de reação. 20 ΡΕ2350250 A frase "razão per-hidrólise para hidrólise" diz respeito à razão entre a quantidade de perácido enzimatica-mente produzida e a quantidade de ácido enzimaticamente produzida por uma enzima per-hidrolase a partir de um substrato éster sob condições definidas e dentro de um tempo definido.

Conforme aqui utilizado, o termo "acilo" diz respeito a um qrupo orgânico com a fórmula geral RCO-, derivado de um ácido orgânico por remoção do grupo -OH. Tipicamente, os nomes dos grupos acilos terminam com o sufixo "-oílo", por exemplo, cloreto metanoilo, CH3C0-C1, é o cloreto de acilo formado a partir de ácido metanoico, CH3CO-OH) .

Conforme aqui utilizado, o termo "acilação" diz respeito a uma transformação química na qual um dos substi-tuintes de uma molécula é substituído por um grupo acilo, ou ao processo de introdução de um grupo acilo numa molécula.

Conforme aqui utilizado, o termo "transferase" diz respeito a uma enzima que catalisa a transferência de um grupo funcional a partir de um substrato para um outro substrato.

Conforme aqui utilizado, o termo "conversão enzimática" diz respeito à modificação de um substrato ou ΡΕ2350250 intermediário para um produto, por contacto do substrato ou intermediário com uma enzima. Em algumas formas de realização, o contacto é feito por exposição direta do substrato ou intermediário à enzima apropriada. Em outras formas de realização, o contacto compreende a exposição do substrato ou intermediário a um organismo que expressa e/ou excreta a enzima, e/ou metaboliza o substrato e/ou intermediário para o intermediário e/ou produto final desejado, respetivamente.

Conforme aqui utilizado, "quantidade eficaz de enzima" diz respeito à quantidade de enzima necessária para conseguir a atividade requerida na aplicação específica (por exemplo, a produção de ácido peracético por aciltrans-ferase para utilização em descontaminação). Tais quantidades eficazes são prontamente determinadas por um perito vulgar na técnica e são baseadas em muitos fatores, tais como a variante particular da enzima utilizada, a composição específica, o método de descontaminação, o item a ser descontaminado e semelhantes.

Conforme aqui utilizado, o termo "estabilidade" em referência a uma substância (por exemplo, uma enzima) ou composição diz respeito à sua capacidade de manter um determinado nivel de atividade funcional durante um período de tempo sob certas condições ambientais. Além disso, o termo "estabilidade" pode ser usado em numerosos contextos mais específicos referentes à condição ambiental particular de interesse. Por exemplo, "estabilidade térmica", conforme 22 ΡΕ2350250 aqui usado, diz respeito à capacidade de uma substância ou composição manter a sua função (isto é, não se degradar) a temperatura elevada. Uma mudança substancial na estabilidade é evidenciada por aumento ou diminuição de pelo menos cerca de 5% ou mais (na maior parte das formas de realização, é preferivelmente um aumento) na semivida da atividade funcional a ser ensaiada, em comparação com a atividade presente na ausência das condições ambientais selecionadas.

Conforme aqui utilizado, o termo "estabilidade química", conforme usado em referência a uma enzima, diz respeito à estabilidade da enzima na presença de produtos químicos que afetam adversamente a sua atividade. Em algumas formas de realização, tais produtos químicos incluem, mas sem constituir limitação, peróxido de hidrogénio, perácidos, detergentes aniónicos, detergentes catiónicos, detergentes não iónicos, agentes quelantes, etc. No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limitada a um qualquer nível de estabilidade química particular nem intervalo de estabilidade química.

Conforme aqui utilizado, "estabilidade do pH" diz respeito à capacidade de uma substância (por exemplo, uma enzima) ou composição funcionar num pH particular. A estabilidade em vários pH pode ser medida quer por procedimentos padrão conhecidos pelos peritos na técnica e/ou pelos métodos aqui descritos. Uma mudança substancial na estabilidade do pH é evidenciada por pelo menos cerca de 5% ou mais de aumento ou diminuição (na maior parte das 23 ΡΕ2350250 formas de realização é de preferência um aumento) na semivida da atividade funcional, quando em comparação com a atividade no pH ótimo. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer nivel de pH de estabilidade ou intervalo de pH.

Conforme aqui utilizado, "estabilidade oxidativa" diz respeito à capacidade de uma substância (por exemplo, uma enzima) ou composição funcionar sob condições oxidan-tes, por exemplo, na presença de um produto químico oxidante.

Conforme aqui utilizado, "estabilidade térmica" diz respeito à capacidade de uma proteína funcionar a uma temperatura particular. Em geral, a maioria das enzimas tem um intervalo finito de temperaturas às elas funcionam. Além de enzimas que trabalham em temperaturas intermédias (por exemplo, temperatura ambiente), existem enzimas que são capazes de trabalhar a temperaturas muito elevadas ou muito baixas. A estabilidade térmica pode ser medida por procedimentos conhecidos. Uma mudança substancial na estabilidade térmica é evidenciada por pelo menos cerca de 5% ou mais de aumento ou diminuição na semivida da atividade catalítica de um mutante quando exposto a uma temperatura diferente (isto é, mais alta ou mais baixa) da temperatura ótima para a atividade enzimática. No entanto, não se pretende que os processos, métodos e/ou composições aqui descritos sejam limitados a qualquer nível de estabilidade à temperatura nem intervalo de temperaturas. 24 ΡΕ2350250

Conforme aqui utilizado, "produto químico oxidante" diz respeito a um produto químico que tem a capacidade de branqueamento. 0 produto químico oxidante está presente numa quantidade, pH e temperatura adequados para o branqueamento. 0 termo inclui, mas sem constituir limitação, peróxido de hidrogénio e perácidos.

Conforme aqui utilizado, o termo "contaminantes" diz respeito a qualquer substância que pelo seu contacto ou associação com uma outra substância, material ou item o torne indesejável, impuro e/ou impróprio para utilização.

Conforme aqui utilizado, o termo "um item contaminado" ou "item com necessidade de descontaminação" diz respeito a qualquer item ou coisa em contacto ou associado com um contaminante e/ou que necessita de ser descontaminado. Não se pretende que o item esteja limitado a qualquer coisa ou tipo de item particular. Por exemplo, em algumas formas de realização, o item é uma superfície dura, enquanto noutras formas de realização, o item é um artigo de vestuário. Ainda em formas de realização adicionais, o item é um têxtil. Em ainda outras formas de realização, o produto é utilizado nos campos médico e/ou veterinário. Em algumas formas de realização, o item é um instrumento cirúrgico. Noutras formas de realização, o item é usado na área dos transportes (por exemplo, estradas, pistas de aviação, ferrovias, comboios, autocarros, aviões, navios, etc.). Noutras formas de realização, o termo é 25 ΡΕ2350250 usado com referência a alimentos e/ou material para alimentos, incluindo, mas sem constituir limitação, carne, subprodutos de carne, peixe, marisco, vegetais, frutas, produtos lácteos, cereais, produtos de panificação, silagem, fenos, forragens , etc. Com efeito, pretende-se que o termo abranja qualquer item que seja adequado para a descontaminação usando os métodos e composições aqui proporcionados.

Conforme aqui utilizado, o termo "descontaminação" diz respeito à remoção de substancialmente todos ou todos os contaminantes de um produto contaminado. Em algumas formas de realização, a descontaminação abrange desinfeção, enquanto noutras formas de realização, o termo abrange esterilização. No entanto, não se pretende que o termo esteja limitado a estas formas de realização, na medida em que o termo tem a intenção de abranger a remoção de contaminantes inanimadas, bem como a contaminação microbiana (por exemplo, bacteriana, fúngica, virai, por priões, etc.).

Conforme aqui utilizado, o termo "desinfeção" diz respeito à remoção de contaminantes das superfícies, bem como à inibição ou morte de micróbios nas superfícies dos itens. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a uma qualquer superfície, item ou contaminante(s) ou micróbios em particular a serem removidos.

Conforme aqui utilizado, o termo "esterilização 26 ΡΕ2350250 diz respeito à morte de todos os organismos microbianos sobre uma superfície.

Conforme aqui utilizado, o termo "esporicida" diz respeito à morte de esporos microbianos incluindo, mas sem constituir limitação, esporos fúngicos e bacterianos. 0 termo engloba composições que são eficazes na prevenção da germinação de esporos, bem como às composições que tornam os esporos totalmente não viáveis.

Conforme aqui utilizado, os termos "bactericida", "fungicida" e "viricida" referem-se a composições que matam bactérias, fungos e vírus, respetivamente. 0 termo "micro-bicida" diz respeito a composições que inibem o crescimento e/ou a replicação de quaisquer micro-organismos incluindo, mas sem constituir limitação, bactérias, fungos, vírus, protozoários, riquétsias, etc.

Conforme aqui utilizado, os termos "bacteriostá-tico", "fungistático" e "virostático" referem-se a composições que inibem o crescimento e/ou a replicação de bactérias, fungos e vírus, respetivamente. 0 termo "microbiostáti-co" diz respeito a composições que inibem o crescimento e/ou a replicação de quaisquer micro-organismos incluindo, mas sem constituir limitação, bactérias, fungos, vírus, protozoários, riquétsias, etc.

Conforme aqui utilizado, o termo "composição de limpeza" diz respeito a composições que encontram utili- 27 ΡΕ2350250 zação na remoção de compostos indesejados de itens a serem limpos, tais como tecidos, pratos, lentes de contacto, outros substratos sólidos, cabelos (champôs), pele (sabonetes e cremes), dentes (líquidos para lavagens bucais, pastas dentífricas), etc. 0 termo diz ainda respeito a qualquer composição que é adequada para a limpeza, branqueamento, desinfeção e/ou esterilização de qualquer objeto e/ou de superfície. Pretende-se que os termos incluam, mas sem constituir limitação, composições detergentes (por exemplo, detergentes de lavandaria líquidos e/ou sólidos e detergentes de tecidos finos; formulações de limpeza de superfícies duras, tais como balcões de vidro, madeira, cerâmica e metal e janelas; limpadores de carpetes; limpadores de fornos; refrescantes de tecidos; amaciadores de tecidos; e pré-observadores de têxtil e lavandaria, bem como detergentes de louça). 0 termo engloba ainda quaisquer materiais/compostos selecionados para o tipo particular de composição de limpeza desejada e a forma do produto (por exemplo, composição de líquido, gel, grânulo ou spray), desde que a composição seja compatível com a aciltransferase, a fonte de peróxido de hidrogénio, PGDA e qualquer outra enzima(s) ou substância utilizada na composição. A seleção específica dos materiais de composição de limpeza é prontamente feita considerando a superfície, item ou tecido a ser limpo, e a forma desejada da composição para as condições de limpeza durante a utilização. Na verdade, o termo "composição de limpeza" conforme aqui utilizado inclui, a menos que indicado em contrário, agentes de lavagem granulados ou em forma de pó 28 ΡΕ2350250 para todos os fins ou resistentes ao desgaste, especialmente detergentes de limpeza; agentes de lavagem para todos os fins em forma de liquido, gel ou pasta, especialmente os assim chamados tipos de liquido para serviço pesado (HDL); detergentes líquidos para tecidos delicados; agentes de lavagem manual de louça ou agentes de lavagem de louça de serviço leve, especialmente os do tipo de alta formação de espuma; agentes de máquinas de lavar louça, incluindo os vários tipos de pastilhas, granulados, líquidos e auxiliares de enxaguamento (abrilhantadores) para uso doméstico e institucional; agentes de limpeza e desinfeção líquidos, incluindo do tipo lavagem manual e antibacteriana, barras de limpeza, líquidos para lavagens bucais, limpadores de dentaduras, champôs de carros ou carpetes, limpadores de casas de banho; champôs para cabelo e enxaguamentos para cabelo; géis de banho e banhos de espuma e limpadores de metal; bem como auxiliares de limpeza tais como aditivos de branqueamento e "stick tira-nódoas" ou tipos para pré-tratar.

Conforme aqui utilizado, os termos "composição detergente" e "formulação de detergente" são usados em referência a misturas que são pretendidas para utilização num meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em algumas formas de realização, o termo é usado em referência a tecidos e/ou peças de vestuário de lavagem (por exemplo, "detergentes para lavandaria"). Em formas de realização alternativas, o termo diz respeito a outros detergentes, tais como aqueles usados para limpar pratos, talheres, etc. 29 ΡΕ2350250 (por exemplo, "detergentes para lavar louça"). Não se pretende que a presente invenção seja limitado a qualquer formulação ou composição de detergente em particular. Com efeito, pretende-se que para além de uma enzima per-hidrolase, por exemplo, uma acil-transferase, o termo abrange detergentes que contêm agentes tensioativos, trans-ferase(s), enzimas hidroliticas, oxidorredutases, estrutu-radores, agentes de branqueamento, ativadores de branqueamento, agentes de anil e corantes fluorescentes, inibidores de aglutinação, agentes de mascaramento, ativadores de enzimas, antioxidantes e agentes de solubilização.

Conforme aqui utilizado, o termo "compatível com enzima", quando usado no contexto de materiais de composição de limpeza, significa que os materiais não reduzem a atividade enzimática de tal forma que a enzima relevante não é eficaz conforme desejado durante situações normais de utilização.

Conforme aqui utilizado, o termo "derivado" diz respeito a uma proteína que é derivada de uma proteína progenitora por adição de um ou mais aminoácidos a qualquer um ou ambas as extremidades C- e N-terminal, substituição de um ou mais aminoácidos em um ou em numerosos sítios diferentes na sequência de aminoácidos, e/ou deleção de um ou mais aminoácidos em qualquer uma ou em ambas as extremidades C- e N-terminal e/ou num ou mais sítios na sequência de aminoácidos, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na sequência de amino- 30 ΡΕ2350250 ácidos. A preparação de um derivado de proteína é muitas vezes conseguida através da modificação de uma sequência de DNA que codifica uma proteína nativa, da transformação da sequência de DNA modificado num hospedeiro adequado, e da expressão da sequência de DNA modificado para produzir a proteína derivada.

Proteínas relacionados (e derivadas) abrangem proteínas "variantes". Proteínas variantes diferem de uma proteína progenitora e/ou de uma outra por um pequeno número de resíduos de aminoácidos. Em algumas formas de realização, o número de resíduos de aminoácidos diferentes é qualquer de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50. Em algumas formas de realização, as variantes diferem por cerca de 1 até cerca de 10 aminoácidos.

Em algumas formas de realização, as proteínas relacionadas, tais como as proteínas variantes, compreendem qualquer de pelo menos cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência de aminoácidos.

Conforme aqui utilizado, o termo "sequência análoga" diz respeito a uma sequência polipeptídica no interior de uma proteína que proporciona uma função semelhante, estrutura terciária e/ou resíduos conservados, com respeito a uma proteína de referência. Por exemplo, nas regiões de epitopos que contêm uma hélice alfa ou uma estrutura em folha beta, a substituição de aminoácido(s) 31 ΡΕ2350250 numa sequência análoga mantém o mesmo elemento estrutural. Em algumas formas de realização, são proporcionadas sequências análogas que resultam numa enzima variante apresentando uma função semelhante ou melhorada em relação à proteína progenitora a partir da qual a variante é derivada.

Conforme aqui utilizado, "proteína homóloga" diz respeito a uma proteína (por exemplo, uma enzima per-hidrolase) que tem função semelhante (por exemplo, atividade enzimática) e/ou estrutura como uma proteína de referência (por exemplo, uma enzima per-hidrolase a partir duma fonte diferente). Os homólogos pode ser de espécies evolucionariamente relacionadas ou não relacionadas. Em algumas formas de realização, um homólogo possui uma estrutura quaternária, terciária e/ou primária semelhante à de uma proteína de referência, permitindo assim potencialmente a substituição de um segmento ou fragmento na proteína de referência por um segmento ou fragmento análogo proveniente do homólogo, com reduzida desorganização da estrutura e/ou função da proteína de referência, em comparação com a substituição do segmento ou fragmento por uma sequência proveniente de uma proteína não homóloga.

Conforme aqui utilizado, proteínas "de tipo selvagem", "nativa" e "que ocorrem naturalmente" são as encontradas na natureza. Os termos "sequência de tipo selvagem" dizem respeito a um aminoácido ou sequência de ácido nucleico que se encontra na natureza ou que ocorre naturalmente. Em algumas formas de realização, uma sequência de 32 ΡΕ2350250 tipo selvagem é o ponto de partida de um projeto de engenharia de proteínas, por exemplo, a produção de proteínas variantes. 0 termo "branqueamento", conforme aqui usado, significa o processo de tratamento de um material têxtil, tal como uma fibra, fio, tecido, roupa ou material não tecido para produzir uma cor mais clara em que a referida fibra, fio, tecido, roupa ou material não tecido. Por exemplo branqueamento, conforme aqui usado, significa o branqueamento do têxtil por remoção, modificação ou mascaramento de compostos causadores de cor em materiais têxteis celulósicos ou outros. Assim, "branqueamento" diz respeito ao tratamento de um têxtil durante um período de tempo suficientemente longo e sob condições de pH e temperatura adequadas para efetuar um branqueamento do têxtil. 0 branqueamento pode ser realizado utilizando agente ou agentes de branqueamento químico e/ou agente ou agentes de branqueamento gerados enzimaticamente. Exemplos de agentes de branqueamento adequados incluem, mas sem constituir limitação, CIO2, H2O2, perácidos, NO2, etc. 0 termo "agente de branqueamento", como aqui usado, engloba qualquer porção que é capaz de branqueamento de um têxtil. Um ativador de branqueamento pode ser necessária. Exemplos de agentes de branqueamento químicos adequados úteis nos processos, métodos e composições aqui descritos são o peróxido de sódio, perborato de sódio, permanganato de potássio e perácidos. Em alguns aspetos, 33 ΡΕ2350250 Η2Ο2 pode ser considerado um agente de branqueamento químico quando tiver sido gerado enzimaticamente in situ. A "composição de branqueamento químico" contém um ou mais agentes de branqueamento químico. A frase "sistema de branqueamento enzimático" ou "composição de branqueamento enzimático" contém um ou mais enzimas e substratos capazes de gerar enzimaticamente um agente de branqueamento. Por exemplo, um agente de branqueamento enzimático pode conter uma enzima per-hidrolase, um substrato éster e uma fonte de peróxido de hidrogénio, para a produção de um agente de branqueamento de perácido.

Um "substrato éster", em referência a um sistema de branqueamento enzimático que contém uma enzima per-hidrolase, diz respeito a um substrato per-hidrolase que contém um encadeamento éster. Ésteres compreendendo ácidos carboxílicos alifáticos e/ou aromáticos e álcoois podem ser utilizados como substratos com enzimas per-hidrolase. Em algumas formas de realização, a fonte de éster é um éster acetato. Em algumas formas de realização, a fonte de éster é selecionada de entre um ou mais de diacetato de propilenoglicol, diacetato de etilenoglicol, triacetina, acetato de etilo e tributirina. Em algumas formas de realização, a fonte de éster é selecionada de entre os ésteres de um ou mais dos seguintes ácidos: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido monoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico , ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido oleico. 34 ΡΕ2350250 0 termo "fonte de peróxido de hidrogénio" significa peróxido de hidrogénio que é adicionado a um banho de tratamento de têxtil de uma fonte quer exógena (isto é, uma fonte externa ou de fora) quer gerada in situ pela ação de uma oxidase que origina peróxido de hidrogénio sobre um substrato. "Fonte de peróxido de hidrogénio" inclui peróxido de hidrogénio bem como os componentes de um sistema que pode espontaneamente ou enzimaticamente produzir peróxido de hidrogénio como produto de reação. 0 termo "oxidase geradora de peróxido de hidrogénio" significa uma enzima que catalisa uma reação de oxidação/redução que envolve oxigénio molecular (O2) como aceitador de eletrões. Numa tal reação, o oxigénio é reduzido a água (H2O) ou peróxido de hidrogénio (H2O2) . Uma oxidase adequada para utilização na presente invenção é uma oxidase que gera peróxido de hidrogénio (ao contrário de água) sobre o seu substrato. Um exemplo de um oxidase geradora de peróxido de hidrogénio e o seu substrato adequado para utilização na presente invenção é a glucose-oxidase e glucose. Outras enzimas oxidases que podem ser utilizadas para a geração de peróxido de hidrogénio incluem álcool-oxidase, etilenoglicol-oxidase, glicerol-oxidase, aminoácido-oxidase, etc. Em algumas formas de realização, a oxidase geradora de peróxido de hidrogénio é uma oxidase de hidrato de carbono.

Conforme aqui utilizado, "têxtil" refere-se a 35 ΡΕ2350250 fibras, fios, tecidos, artigos de vestuário e não-tecidos. 0 termo engloba tecidos feitos a partir de materiais naturais, sintéticas (por exemplo, fabricados), e várias misturas naturais e sintéticas. Assim, o termo "têxtil" (ou "têxteis") diz respeito às fibras, fios, texturas tricotadas ou tecidas, não-tecidos e peças de vestuário não processados e processados. Em algumas formas de realização, um têxtil contém celulose. 0 termo "têxtil (ou têxteis) com necessidade de processamento" diz respeito a tecidos que necessitam de ser desencolados, lavados com água corrente, branqueados e/ou tingidos ou pode estar com necessidade de outros tratamentos tais como biopolimento, «biostonewashing» e/ou de amaciamento. 0 termo "têxtil (ou têxteis) com necessidade de branqueamento" diz respeito a têxteis que necessitam de ser branqueados sem referência a outros tratamentos possíveis. Estes tecidos podem ou não já ter sido submetidos a outros tratamentos. De modo semelhante, estes têxteis podem ou não necessitar de tratamentos posteriores. "Tecido" diz respeito a uma montagem fabricada de fibras e/ou fios que tem uma área de superfície substancial em relação à sua espessura e coesão suficiente para dar à montagem resistência mecânica útil.

Conforme aqui usados, os termos "purificado" e 36 ΡΕ2350250 "isolado" referem-se à remoção de contaminantes a partir de uma amostra e/ou a um material (por exemplo, uma proteína, ácido nucleico, célula, etc.) que é removido a partir de pelo menos um componente com o qual está naturalmente associado. Por exemplo, esses termos podem referir-se a um material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham conforme encontrado no seu estado nativo, tal como, por

Os termos "cola" ou "encolagem" referem-se a compostos utilizados na indústria têxtil para melhorar o desempenho de tecelagem, aumentando a resistência à abrasão e a resistência do fio. A cola é geralmente feita de, por exemplo, amido ou compostos semelhantes a amido.

Os termos "desencolar" ou "desencolagem", conforme aqui usados, referem-se ao processo de eliminação da cola, geralmente amido, a partir de tecidos normalmente antes da aplicação de acabamentos, corantes ou branqueadores especiais. "Enzima(s) de desencolagem" conforme aqui utilizados refere-se a enzimas que são usadas para remover enzimaticamente a cola. Exemplos de enzimas são amilases, celulases e mananases. 0 termo "lavagem" ou "limpeza", conforme aqui usado, significa a remoção de impurezas, por exemplo, muitos dos compostos não celulósicos (por exemplo, pecti- 37 ΡΕ2350250 nas, proteínas, cera, pintas, etc.), encontradas naturalmente em algodão ou outros produtos têxteis. Além das impurezas não celulósicas naturais, a lavagem pode remover, em algumas formas de realização, materiais residuais introduzidos pelos processos de fabrico, tais como fiação, ou lubrificantes de corte ou cones. Em algumas formas de realização, o branqueamento pode ser utilizado para remover impurezas de têxteis. 0 termo "enzima(s) de biolavagem" diz respeito a uma enzima(s) capaz de remover pelo menos uma parte das impurezas encontradas em algodão ou outros têxteis. 0 termo "pintas" diz respeito a impurezas indesejáveis, tais como fragmentos de sementes de algodão, folhas, caules e outras partes da planta, os quais se agarram à fibra, mesmo depois do processo de descaroçamento mecânico do algodão. 0 termo têxteis "não tingidos («greige») , conforme aqui usado, refere-se a tecidos que não tenham recebido qualquer branqueamento, tingimento ou tratamento de acabamento depois de serem produzidos. Por exemplo, qualquer tecido ou malha fora do tear que ainda não foi acabado (desencolado, limpo, etc.), branqueado ou tingido é considerado um têxtil não tingido (cru). 0 termo "tingimento" conforme aqui usado, diz respeito à aplicação de uma cor, em especial por imersão numa solução de coloração, por exemplo a têxteis. 38 ΡΕ2350250 0 termo fibra, fio ou tecido "celulósico não algodão" significa fibras, fios ou tecidos que são compostos principalmente por uma composição à base de celulose que não de algodão. Exemplos de tais composições incluem linho, rami, juta, linho, rayon, lyocell, acetato de celulose e outras composições semelhantes que são derivados a partir de materiais celulósicos não algodão. 0 termo "pectato-liase" conforme é aqui utilizado, diz respeito a um tipo de pectinase. "Pectinase" indica uma enzima pectinase definida de acordo com a técnica que as pectinases são um grupo de enzimas que clivam encadeamentos glicosidicos de substâncias pécticas principalmente poli(1,4-alfa-D-galacturonida) e seus derivados (ver Sakai et al., Advances in Applied Microbiology, 39 (1993) 213-294). Preferivelmente, uma pectinase útil aqui é uma enzima pectinase que catalisa a clivagem aleatória de encadeamentos alfa-1,4-glicosídicos em ácido péctico também chamado ácido poligalacturónico por transeliminação, tal como a classe de enzimas poligalacturonato-liase (EC 4.2.2.2) (PGL), também conhecida como poli(1,4-alfa-D-galacturoni-da)-liase, também conhecido como pectato-liase. 0 termo "pectina" indica pectato, ácido poligalacturónico e pectina, que podem ser esterifiçados com um grau maior ou menor. 0 termo "cutinases", conforme aqui utilizado, diz 39 ΡΕ2350250 respeito a uma planta, enzima derivada de bactérias ou fungos usada no processamento têxtil. As cutinases são enzimas lipolíticas capazes de hidrolisar o substrato cutina. As cutinases podem desagregar ésteres de ácidos gordos e outras composições à base de óleo com necessidade de serem removidos no processamento (por exemplo, a lavagem) de têxteis. "Cutinase" significa uma enzima que tem atividade de hidrólise de cutina de planta significativa. Especificamente, uma cutinase terá atividade hidrolíti-ca sobre a cutina de polímero biopoliéster encontrado nas folhas das plantas. As cutinases adequadas podem ser isoladas a partir de muitas plantas diferentes, fontes fúngicas e bacterianas. 0 termo "α-amilase," conforme aqui utilizado, diz respeito a uma enzima que cliva os encadeamentos a-l,4-gli-cosídicos de amilose para produzir moléculas de maltose (dissacáridos de α-glucose). As amilases são enzimas digestivas encontradas na saliva e também são produzidas por muitas plantas. As amilases desagregam os hidratos de carbono de cadeia longa (tal como amido) em unidades mais pequenas. Uma α-amilase "estável à oxidação" é uma a-amila-se que é resistente à degradação por meios oxidantes, quando em comparação com a α-amilase estável não oxidante, especialmente quando comparada com a α-amilase estável não oxidante da qual a α-amilase estável não oxidante foi derivada. 0 termo "protease significa um domínio de 40 ΡΕ2350250 proteína ou polipéptido de uma proteína ou polipéptido derivado de um microrganismo, por exemplo, um fungo, bactéria ou de uma planta ou animal, e que tem a capacidade de catalisar a clivagem de ligações peptídicas numa ou mais de várias posições de um esqueleto de hidrato de carbono de proteína.

Conforme aqui usado, "produtos de higiene pessoal" indica produtos utilizados na limpeza, branqueamento e/ou desinfeção de cabelo, pele, couro cabeludo e dentes, incluindo, mas sem constituir limitação, champôs, loções corporais, géis de banho, hidratantes tópicos, pasta de dentes e/ou outros produtos de limpeza tópicos. Em algumas formas de realização, estes produtos são utilizados em seres humanos, enquanto que em outras formas de realização estes produtos encontram utilização em animais não humanos (por exemplo, em aplicações veterinárias).

Uma "suspensão" ou "dispersão", conforme aqui usado, diz respeito a um sistema de duas fases em que uma fase sólida descontínua é dispersa no interior de uma fase líquida contínua.

Um "auxiliar de suspensão" conforme aqui utilizado diz respeito a um material adicionado a uma composição líquida para prevenir ou reduzir a sedimentação ou flutuação de partículas em suspensão. Os auxiliares de suspensão tipicamente trabalham aumentando quer a viscosidade quer a tensão de escoamento de um líquido agente de suporte. Os 41 ΡΕ2350250 fluidos com uma tensão de cedência significativa fluirão apenas quando é aplicada uma tensão, a qual é maior do que a tensão de cedência, e assim exibem comportamento pseudo-plástico ou tixotrópico. Agentes de suspensão eficazes atuam tipicamente através da formação de uma rede reversível de partículas ou fibras em ponte por forças fracas. Exemplos de agentes de suspensão incluem, mas sem constituir limitação, goma xantana e celulose microfibrosa, por exemplo, CELLULON® (CP Kelco, San Diego, CA). "Encapsulado", conforme aqui usado, diz respeito a uma substância que está contida no interior de um material envolvente. Isto pode incluir o núcleo/invólucro ou morfologias da matriz, conforme descrito na técnica (ver, por exemplo, "Microencapsulation" in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2005) . "Miscível", conforme aqui usado, diz respeito a um líquido que é capaz de se misturar com um outro líquido, numa razão especificada dos dois líquidos, sem separação em fases. "Matriz", conforme aqui usado, diz respeito a um material no qual uma substância é encerrada ou embebida.

Conforme aqui utilizado, um "biofilme" é uma coleção de microrganismos embebidos numa matriz de substâncias poliméricas extracelulares e vários compostos orgânicos e inorgânicos. Embora alguns biofilmes possam 42 ΡΕ2350250 conter uma única espécie de microrganismos, tipicamente os biofilmes compreendem não só espécies diferentes de microrganismos, mas diferentes tipos de microrganismos, por exemplo, algas, protozoários, bactérias e outros.

Sistemas de coentrega de enzima/substrato A invenção proporciona um sistema de entrega liquido para enzima e substrato coformulados em que pelo menos uma enzima está encapsulada numa matriz polimérica e está formulado com um substrato para a enzima. 0 substrato está numa fase líquida substancialmente não aquosa em contacto com a matriz polimérica e na qual a matriz polimérica não é solúvel. A matriz polimérica contendo a enzima pode ser suspensa ou rodear a fase líquida contendo o substrato. A enzima e o substrato não estão em contacto no sistema de entrega numa configuração na qual a catálise enzimática pode ocorrer. Quando em contacto com a água, na qual a matriz polimérica é solúvel e na qual a enzima é cataliticamente ativo para o substrato, ocorre a atividade catalítica. Uma ou múltiplas enzimas podem ser incluídas na composição, com pelo menos uma enzima encapsulada numa matriz polimérica. Em algumas formas de realização, o sistema de entrega contém duas ou mais enzimas, encapsuladas na mesma matriz polimérica ou em matrizes poliméricas separadas, e o sistema de entrega contém um substrato para pelo menos uma das enzimas. 0 substrato é solubilizado ou suspenso num agente ΡΕ2350250 de suporte líquido que é substancialmente não aquoso e no qual a matriz polimérica não é solúvel. 0 agente de suporte líquido e o polímero são escolhidos de tal modo que a matriz polimérica se mantém numa forma sólida e sem incha-mento durante o armazenamento. Isto pode ser conseguido, por exemplo, com um baixo teor de água, reticulação reversível e/ou temperatura de armazenamento baixa. Em algumas formas de realização, a fase líquida contém menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 1%, ou menos do que cerca de 0,5% de água, por exemplo, cerca de 4%, 3%, 2%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% ou 0,1% de água. A enzima encapsulada substancialmente não reage com o substrato na fase líquida durante o armazenamento do sistema de entrega. Em algumas formas de realização, menos do que cerca de 20%, 10%, 5%, 1% ou 0,5% do substrato na fase líquida são convertidos no produto durante o armazenamento durante pelo menos cerca de 10 dias, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses ou mais a cerca de 25 °C. Em algumas formas de realização, menos do que cerca de 20%, 10%, 5%, 1% ou 0,5% do substrato na fase líquida são convertidos no produto durante o armazenamento durante pelo menos cerca de 1,0 dias, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses ou mais a cerca de 37 °C. Em algumas formas de realização, menos do que cerca de 20%, 10%, 5%, 1% ou 0,5% do substrato na fase líquida são convertidos no produto durante o armazenamento durante pelo menos cerca de 10 dias, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses ou mais a cerca de 50 °C. 44 ΡΕ2350250

Num sistema de entrega conforme aqui descrito, uma enzima encapsulada retém pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou essencialmente todo o potencial catalítico inicial na matriz polimérica, libertável quando em contacto com a água, mas substancialmente não reage com o substrato na composição durante pelo menos cerca de 10 dias, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, ou mais, a 25 °C, 37 °C ou 50 °C.

Matriz polimérica A matriz polimérica compreende, consiste de ou consiste essencialmente de um polímero que é insolúvel num fluido agente de suporte contendo o substrato e solúvel em água. Em algumas formas de realização, a matriz polimérica compreende, consiste de ou consiste essencialmente de álcool polivinílico, metilcelulose, hidroxipropil-metil-celulose, polivinilpirrolidona, goma de guar ou um seu derivado ou copolímero, ou uma sua mistura. Em algumas formas de realização, a matriz polimérica contém um ou mais agentes de enchimento ou estendedores (por exemplo, amido, açúcar, argila, talco, carbonato de cálcio, dióxido de titânio, fibras de celulose), plastificante (por exemplo, glicerol, sorbitol, propilenoglicol), cossolvente, ligante, agente de inchamento (por exemplo, poliacrilato, croscarme-lose sódica, glicolato de amido e sódio, hidroxipropilcelu-lose de baixa substituição, galactomanano, Water-Lok, ZapLoc) ou agente de libertação. 45 ΡΕ2350250

Em algumas formas de realização, os polímeros são polímeros carregados negativamente, tais como heteropolis-sacáridos incluindo resíduos de glucuronida e/ou de galacturonida. Tais polissacáridos podem incluir por exemplo material produzido pelos organismos a partir do qual as próprias enzimas tenham sido produzidas, e podem permanecer como contaminantes nas preparações de enzima parcialmente purificadas ainda que eles não tenham eles próprios têm atividade enzimática útil. Em alternativa ou adicionalmente, tais polissacáridos podem ser adicionados separadamente, em quantidades até cerca de 1 a 5% numa base ponderai ou mais da pasta. Tais quantidades podem ser comparáveis com as das próprias enzimas. Em algumas formas de realização, os polissacáridos estão presentes (ou adicionados) antes da secagem por pulverização. Outros polímeros exemplares são arabinogalactanos, xilogalactanos e, geralmente, polissacáridos ácidos.

Em algumas formas de realização, a matriz polimérica inclui proteínas, péptidos ou seus derivados. Algumas ou todas as proteínas ou péptidos podem estar presentes num caldo de fermentação, meios celulares ou preparações de proteína parcialmente purificadas, e podem permanecer como contaminantes nas preparações de enzima parcialmente purificadas ainda que eles não tenham, eles próprios têm atividade enzimática útil. Em alternativa ou adicionalmente, tais polissacáridos podem ser adicionados separadamente, em quantidades até cerca de 1 a 5% numa base 46 ΡΕ2350250 ponderai ou mais da pasta. Tais quantidades podem ser comparáveis com as das próprias enzimas.

Em várias formas de realização, enzimas (e facultativamente substratos) são encapsuladas em polímeros utilizando técnicas que incluem, mas sem constituir limitação, moldagem com solvente, secagem por pulverização, liofilização/secagem por congelação, revestimento por pulverização em leito fluidizado, aglomeração em leito fluidizado, refrigeração por pulverização, granulação a húmido, granulação por tambores, granulação de alto cisa-lhamento, extrusão, revestimento em panela, coacervação, gelificação e atomização. Em formas de realização particulares, é usado a secagem por pulverização.

Geralmente, a quantidade de enzima encapsulada na matriz polimérica seja inferior a 50% em peso. Em várias formas de realização, a quantidade de enzima encapsulada na matriz polimérica é de cerca de 0,01% a cerca de 50%, cerca de 0,1% a cerca de 25%, cerca de 1% a cerca de 10%, ou cerca de 2% a cerca de 5% em peso.

Em algumas formas de realização, a matriz polimérica contendo a enzima está na forma de partículas que estão suspensas numa fase líquida que contém o substrato. Em várias formas de realização, as partículas têm cerca de 0,1 a cerca de 1000, cerca de 50 a cerca de 250, cerca de 100 a cerca de 300, cerca de 200 a cerca de 500, cerca de 400 a cerca de 800 ou cerca de 600 a cerca de 1000 micrómetros de diâmetro. 47 ΡΕ2350250

Em algumas formas de realização, a matriz polimérica está sob a forma de um filme que tem cerca de 5 a cerca de 1000, cerca de 50 a cerca de 100, cerca de 100 a cerca de 200, cerca de 200 a cerca de 500 ou cerca de 500 a cerca de 1000 micrómetros de espessura.

Em algumas forma de realização, a matriz polimérica contendo a enzima está na forma de um filme que forma um recipiente selado (por exemplo, uma bolsa, saqueta ou cápsula) que envolve uma fase liquida que contém o substrato.

Enzimas

Em várias formas de realização, o sistema de entrega contém uma ou mais proteases, esterases, serina-hidrolases, lipases, per-hidrolases, oxidases, enzimas oxi-dantes de fenol, lacases, acil-transferases, aril-estera-ses, per-hidrolases, amilases, pectinases, xilanases, celulases, hemicelulases, catalases, peroxidases, oxidases de hidratos de carbono, mananases, fitases, pectinases, peroxidases, oxidases de hidratos de carbono, cutinases, catalases ou uma sua mistura.

Numa forma de realização, o sistema de entrega contém uma lacase (uma multioxidase de cobre, EC 1.10.3.2, por exemplo, de Cerrena unicolor) e um mediador (substrato) para a lacase, tal como sal de diamónio do ácido 2,2'-azi-no-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), siringoni-trilo (SN), siringamida (SA), siringato de metilo (MS) ou 48 ΡΕ2350250 10-carboxipropil-fenotiazina (PTP) , ou de um mediador conforme descrito na Patente Europeia N° 1 064 359 1 141 321 ou 0 805 465, Patente dos E.U.A. N° 6 329 332

Pedido PCT N ° 00/05349 ou Publicação E.U.A. N° 2008/- 0196173.

Numa forma de realização, a enzima lacase compreende, consiste ou consiste essencialmente da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, abaixo, ou uma sua variante ou seu homólogo, tendo pelo menos 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou mesmo 9 9% ou mais de identidade de sequência, ou uma sequência de aminoácidos conforme descrita em Pedido PCT N° W02008/076322, ou uma sua variante ou seu homólogo possuindo pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, ou mesmo 99,5% ou mais de identidade de sequência.

AlGPVA!:h,HÍVNKBlv\PIXiVQRFm,AGGT!WnJ'FGQKGBNFQIJ^VIDDL'1'DDRMLT

FI^IHWHGFFQKGTAWAl>GFAFVTQ|G^AÍMl|^^YD)R0V|t)QAO1tWyttSBBláTQyC IXtLROÂFVVYDPNWHKBLYDVDDGGTVrnADWYMViJiQrVVGAATPDSTLíPíGtX#

VGGPAQSPIJííBADLRi^LVPAFVKjjaAVPGGADINHRIJSLTI^ríGLFSINNÀSFn^PSVPA

LLQII.SOÀQNAQDLLFFGSYlOF.JíLGK.V^/ELVIPPLAVtKsFHFFfliJíGHNFW^ATfcSAGS AAANFIFQAWDELCPKVNG14ASQKVKPKKCTAÍ (SEQ 1D NOí l).

Em algumas formas de realização, o sistema de entrega contém uma enzima per-hidrolase (por exemplo, acil-transferase; aril-esterase) e substrato(s) para a produção 49 ΡΕ2350250 de um perácido, por exemplo, um dador de acilo tal como um substrato éster, por exemplo, diacetato de propilenoglicol (PGDA), e uma fonte de peróxido de hidrogénio, por exemplo, percarbonato de sódio, perborato de sódio, peróxido de hidrogénio-ureia, ou um sistema que gera peróxido de hidrogénio enzimático, por exemplo, um oxidase geradora de peróxido de hidrogénio e o seu substrato, por exemplo, glucose-oxidase e glucose.

Em algumas formas de realização, a enzima per-hidrolase é uma enzima per-hidrolase que ocorre naturalmente M. smegmatis. Em algumas formas de realização, a enzima per-hidrolase compreende, consiste ou consiste essencialmente da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante ou seu homólogo. Em algumas formas de realização, a enzima per-hidrolase compreende, consiste ou consiste essencialmente de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mesmo 99,5%, ou mais, idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácidos da per-hidrolase de M. smegmatis é mostrada abaixo: MAKIíILCmMÚ^OWVF%íEDÒAri^;RFAFD¥RWTO¥I.^QQ:LGAJMWIKBO.i..SARTr ^IIWmFRLNaASYLPSCl^i:Hl.FLDLVIiMLGTNm¥AYmTHi3lALlMSVLVT( LTSAaGvoTT¥PAPKytTO?m.Ai>MPíBPWPQyi^GO^mmjatvYSAí^miicv 1WBAOSVL¥F|]^VP<3ííMFTEA.HNRDLO¥àLABQ:VRSLL (SBQ ID NCk 2} 50 ΡΕ2350250 A correspondente sequência de polinucleótidos que codifica a per-hidrolase de M. smegmatis é (5'-3'):

ATGGCCAAGOQAATTCKíTtmTCCHjTCiATOCOIjACCTCKíGacreGaTCíXCOTC CMAOACCsCKRlOACXXlAfXílUGCOGTl^OCCCeCGACCyrOCGCrCÍCiACCGCírrfltiCrr

CCiCX'CAGCACin€OOACCGGACTTCGAO<3TGATmAGÔAGGGACT£íAOCOOGCGC ACCAC^âACATCOACÔAaiXXACCGATCCGCGCM^imACOGCGCGAGCTACCrtKX:

Gm?r<K^m^XÍA«K;ACOTÇ<rCKTrOGACCTGOTGATCAT€ATCCTÒCK3CAOC^AA CGACAfXAAtX^CTACTTOGGCBCAC^a^CTaiACATCCCGatK^Altrrç-GCí

TCCTOGTX:AÍX^AGGTÕCirACÇAGCXXXM}GO[K5CGTCGGCACCA€GTAÇC€GGCA CCCAAGGTGaGGlGGTCTCGCÇCXCACtXKrrGOCXXCCATCXKXíaACCXClGGm:

CACirraAltrrrcGAGGCKXKiCGAGCAGAAGACCACTGAGCTCGCCCaCGTaTAaAG

CGCGCTCCK^GlXXjTItATGAAGGTGCCG-TlfCnt^GACGCGGGTTCGGlGATCAGCAC

CGACCCCGTCGAGGGAAmmCTTCACCGAGGCCAACAATCCXmTCTCGGGGTGG ODCTCGC-CKjAACAGGrGCGGAGCCrGCrGrAA«3’ (SEQIDNO: 3).

Em algumas formas de realização, a enzima per-hidrolase compreende uma ou mais substituições numa ou mais posições de aminoácidos equivalentes a posições na sequência de aminoácidos da per-hidrolase de M. smegmatis estabelecida em SEQ ID NO: 2. Em algumas formas de realização, a enzima per-hidrolase compreende qualquer uma ou qualquer combinação de substituições de aminoácidos selecionadas de entre Ml, K3 , R4 LO H L6, Cl, Dl 0, Sll, L12, T13, Wl 4 , Wl 6, G15, V17, Pl 8, Vl 9, D21, G22, A23, P24, T25, E26, R2 7 , F28, A2 9, P30, D31, V32, R33, W34, T35, G36, L38, Q40, Q41 , D45, L42, G43, A4 4, F46, E47, V48, 149, E50, E51, G52, L53 , S54, A55, R5 6, T57, T58, N59, 160, D61, D62, P63, T 64, D65 , P 6 6, R67, L68, N69, G70, A71, S72, Y73, S76, C77, L78, A7 9 , T80, L82, P83, L84, D85, L86, V87, N94, D95, T96, K97, Y99F100, R101, RI 02, P104, Ll0 5, D106, 1107, Al 0 8 , LIOS ), G110, Ml 11, S112, V113 , Ll 14 :, V115, T116, Q117, 51 ΡΕ2350250 VI18, Ll19, T12 Ο, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P146, P148, W149, F150, 1153, F154, 1194 e F196.

Em algumas formas de realização, a enzima per-hi-drolase compreende uma ou mais das seguintes substituições numa ou mais posições de aminoácidos equivalentes a posições na sequência de aminoácidos da per-hidrolase de M. smegmatis apresentada em SEQ ID NO: 2: L12C, Q ou G; T25S, G ou P ; L53H, Q, G ou S; S54V, LA, P, T ou R; A55G ou T; R67T, Q, N, G, E, L ou F; K97R, V125S, G, R, A ou P; F154Y; F196G.

Em algumas formas de realização, a enzima per-hidrolase compreende uma combinação de substituições de aminoácidos em posições de aminoácidos equivalentes a posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da per--hidrolase de M. smegmatis apresentada em SEQ ID NO: 2: L12I+S54V; L12M+S54T; L12T+S54V; L12Q+T25S+S54V; L53H+S54V; S54P+V125R; S54V+V125G; S54V+F196G; S54V+K97R+V125G; ou A55G+R67T+K97R+V125G.

Em algumas formas de realização, a suspensão liquida contém uma enzima per-hidrolase e substratos para a produção de mono e diglicéridos (por exemplo, um dador de acilo e aceitador de álcool) ou um éster de sorbitano (por exemplo, um dador de acilo e sorbitano). Em algumas formas de realização, a suspensão liquida contém uma enzima per-hidrolase e substratos para a produção de um éster fragrante, por exemplo, um éster de benzilo (por exemplo, um 52 ΡΕ2350250 dador de acilo e um álcool volátil, por exemplo, álcool benzílico).

Em algumas formas de realização, a enzima é uma per-hidrolase e o sistema de entrega contém um substrato de éster ou mistura de substrato de éster, por exemplo, um éster de acetato, por exemplo, diacetato de propilenoglicol (PGDA), acetato de etilo, acetato de butilo, acetato de hexilo, acetato de octilo, propionato de etilo, propionato de butilo, propionato de hexilo, acetato de isoamilo, acetato de citronelilo, propionato de citronelilo, acetato de dodecilo, acetato de Neodol 23-3, acetato de Neodol 23-9, diacetato de etileno glicol, triacetina, tributirina, metoxiacetato de etilo, acetato de linalilo, butirato de etilo, isobutirato de etilo, butirato de etil-2-metilo, isovalerato de etilo, isovalerato de dietilo, maleato de dietilo, glicolato de etilo ou uma sua mistura.

Em algumas formas de realização, o sistema de entrega contém uma protease e pelo menos uma outra enzima sensível a protease, isto é, uma enzima gue é hidrolisável pela protease, encapsulados na mesma ou em diferentes matrizes poliméricas, ou em gue uma de protease ou enzima sensível a protease está encapsulada numa matriz polimérica e a outra enzima está numa fase líquida no sistema de entrega, e a protease é substancialmente não cataliticamen-te ativa em relação à enzima sensível a protease até ser adicionada água ao sistema de entrega. 53 ΡΕ2350250 Líquidos Agentes de Suporte 0 sistema de entrega inclui um substrato para uma enzima encapsulada num liquido agente de suporte (ou transportador) no qual a matriz polimérica (na qual a enzima está encapsulada) é substancialmente insolúvel.

Exemplos não limitativos de liquidos agentes de suporte incluem glicóis, agentes tensioativos não iónicos, álcoois, poliglicóis e ésteres de acetato. Em algumas formas de realização, o agente de suporte liquido é, ele próprio, um substrato para a enzima.

Ingredientes adjuntos facultativos

Em algumas formas de realização, o sistema de entrega inclui um ou mais agentes tensioativos, ou seja, um agentes tensioativo não iónico, aniónico, catiónico, anfo-lítico, zwitteriónico ou semipolar não iónico, ou uma sua mistura. Em algumas formas de realização, o sistema de entrega inclui um ou mais dos seguintes: um auxiliar de suspensão, um agente quelante, um agente estabilizador, um emulsionante, um agente de tamponamento e/ou uma sua mistura.

Composições A invenção proporciona composições que contêm sistemas de coentrega de enzima/substrato, conforme aqui descritos. As composições exemplares incluem: uma composição de limpeza, uma composição de desinfeção, uma composição de descontaminação, uma composição de processamento têxtil, uma composição de branqueamento, uma composição de 54 ΡΕ2350250 tingimento têxtil, uma composição para cuidados pessoais, uma composição para tingimento de cabelo, uma composição de processamento de polpa ou papel, uma composição para a produção de compósito de madeira, uma composição de tratamento de águas residuais, uma composição de cozimento, uma composição de fabrico de cerveja, uma composição de ração para animais, uma composição de processamento de amido e/ou uma composição de fermentação de etanol. 0 sistema de entrega pode ser armazenado na composição ou podem ser misturados na composição no momento da utilização.

Numa forma de realização, uma composição de detergente é proporcionada para utilização numa aplicação de limpeza. Além do sistema de coentrega de enzima/-substrato aqui descrito, uma composição detergente pode conter um ou mais ingredientes detergentes selecionados de entre agentes tensioativos, estruturadores, agentes de branqueamento, precursores de branqueamento, estabilizadores de enzimas, agentes de complexação, agentes quelantes, reguladores de espuma, inibidores de corrosão, agentes antieletrostáticos, corantes, perfumes, bactericidas, fungicidas e ativadores. 0 sistema de entrega pode ser armazenado na composição detergente ou pode ser misturado na composição no instante da utilização. Método de uso Métodos de limpeza

Os sistemas de coentrega de enzima/substrato aqui descritos podem ser usados em métodos de limpeza. Em 55 ΡΕ2350250 algumas formas de realização, a invenção proporciona um método para limpeza, compreendendo o contacto de um artigo contendo uma mancha com uma composição detergente que compreende um sistema de coentrega de enzima/substrato, conforme aqui descrito, na presença de água, em que pelo menos uma porção da mancha é removida. As enzimas adequadas para uso em métodos de limpeza na presente invenção incluem, mas sem constituir limitação, proteases, amilases, per-hidrolases, oxidases, lipases, celulases, xilanases, mananases, esterases, cutinases, pectinases, enzimas oxi-dantes de fenol, catalases, lisozimas e hemicelulases.

Numa forma de realização, a invenção proporciona um método para a inibição da transferência de corante de um tecido tingido para um outro tecido durante a lavagem, compreendendo um sistema de coentrega de enzima/substrato, conforme aqui descrito, na presença de água, em que o sistema de libertação contém uma enzima capaz de branqueamento, por exemplo, uma enzima oxidante de fenol, tal como uma lacase, ou uma peroxidase, em que pelo menos uma porção de substâncias coloridas lixiviadas do tecido tingido e/ou sujo é branqueada, impedindo assim a redeposição das substâncias coloridas para o outro tecido na lavagem. Métodos de processamento de têxteis

Os sistemas de coentrega de enzima/substrato aqui descritos podem ser usados em métodos para processamento de têxteis. Em algumas formas de realização, a invenção 56 ΡΕ2350250 proporciona um método para o branqueamento de um produto têxtil, compreendendo o contacto de um produto têxtil com um sistema de coentrega de enzima/substrato contendo pelo menos uma enzima e substrato capaz de branqueamento de um têxtil, por exemplo, um per-hidrolase e substratos para a produção de um perácido ou uma enzima oxidante de fenol, por exemplo, uma lacase, e um mediador capaz de produzir um efeito de branqueamento, na presença de água, durante um período de tempo e sob condições adequadas para permitir o branqueamento mensurável do têxtil, produzindo assim um têxtil branqueado. Em algumas formas de realização, a invenção proporciona um método para modificar a cor de um produto têxtil (por exemplo, tingimento do têxtil), compreendendo o contacto de um produto têxtil com um sistema de coentrega de enzima/substrato contendo uma enzima e substrato capaz de mudar a cor de um produto têxtil, por exemplo uma enzima oxidante de fenol, por exemplo uma lacase, e um mediador capaz de efetuar uma mudança de cor, na presença de água, durante um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma alteração mensurável da cor no produto têxtil, produzindo assim um têxtil com uma mudança de cor.

Em algumas formas de realização, a invenção proporciona métodos para o pré-tratamento combinado de produtor têxteis num único processo, em que o sistema de coentrega de enzima/substrato compreende pelo menos duas enzimas de processamento de têxteis. Por exemplo, um processo combinado para a desencolagem, lavagem e branquea- 57 ΡΕ2350250 mento inclui uma enzima per-hidrolase e substrato(s) (por exemplo, substrato éster e fonte de peróxido de hidrogénio) conforme aqui descrito e enzimas amilase e pectinase. Um processo de lavagem e branqueamento combinada inclui uma enzima per-hidrolase e substrato(s) conforme aqui descrito e um enzima pectinase. Um processo de desencolagem e branqueamento combinados inclui uma enzima per-hidrolase e substrato(s) conforme aqui descrito e uma enzima amilase. Uma enzima pectinase nos métodos de pré-tratamento de têxteis combinados aqui descritos pode ser usada por si própria ou em combinação com uma ou mais outras enzimas tais como protease, lipase, celulase, cutinase e/ou hemicelulase. Métodos de sanitização, de desinfeção e/ou de descontaminação utilizando uma enzima per-hidrolase

Os sistemas de coentrega de enzima/substrato da presente invenção (e sistemas e kits relacionados que incorporam essas composições) podem ser usados numa variedade de métodos para a descontaminação, desinfeção e/ou saneamento de itens.

Em algumas formas de realização, o método para a descontaminação compreende: (a) o fornecimento de um sistema de coentrega de enzima/substrato, conforme aqui descrito, compreendendo uma enzima com atividade de per-hidrolase encapsulada num polimero solúvel em água, em que 58 ΡΕ2350250 a referida atividade compreende uma razão de per-hidrólise para hidrólise de pelo menos 2:1; uma fonte de peróxido de hidrogénio; e um substrato de éster; e (b) a adição da composição a água e mistura sob condições e durante um período de tempo suficiente para solubilizar a matriz polimérica e para gerar uma solução aquosa de pelo menos cerca de 0,16% de ácido peracético, numa base ponderai, por exemplo pelo menos cerca de 20 minutos, e um pH inferior a cerca de 9,0; e (c) a exposição de um item que compreende um contaminante à solução.

Numa forma de realização, o método para a descon-taminação compreende: (a) proporcionar um sistema de coentrega de enzima/substrato compreendendo uma enzima aciltransferase encapsulada num polímero solúvel em água, uma fonte de peróxido de hidrogénio e diacetato de propile-noglicol; (b) a adição da composição a água e mistura sob condições e durante um período de tempo suficiente para solubilizar a matriz polimérica e para gerar uma solução aquosa de pelo menos cerca de 0,16% de ácido peracético, numa base ponderai, por exemplo, pelo menos cerca de 20 minutos; e (c) a exposição de um item que compreende um contaminante à referida solução.

Em algumas formas de realização, a fonte de peróxido de hidrogénio é um composto gerador de peróxido de hidrogénio, por exemplo selecionado de entre percarbonato de sódio, perborato de sódio e peróxido de hidrogénio-ureia. Em algumas formas de realização, a fonte de peróxido 59 ΡΕ2350250 de hidrogénio é um sistema enzimático, tal como uma oxidase geradora de peróxido de hidrogénio e o seu substrato, por exemplo, glucose-oxidase e glucose. A oxidase geradora de peróxido de hidrogénio pode ser encapsulada numa matriz polimérica (o mesma ou em separado da matriz polimérica na qual a enzima per-hidrolase está encapsulada) ou solubili-zada ou suspensa na fase liquida no sistema de entrega. 0 substrato para a oxidase geradora de peróxido de hidrogénio pode ser encapsulado numa matriz polimérica (o mesmo ou em separado da matriz polimérica na qual a enzima per-hidrolase está encapsulada) ou solubilizado ou suspenso na fase liquida no sistema de entrega.

Dependendo do tipo específico de contaminante a ser removido, o passo de exposição do item à solução de perácido pode ser efetuado ao longo de uma ampla gama de escalas de tempo. Por exemplo, em certos procedimentos de saneamento tempos de exposição tão curtos como cerca de 30 segundos, 1 minuto, 5 minutos ou 10 minutos podem ser suficientes. Contudo, noutras aplicações (por exemplo, remoção de biofilmes), pode ser necessário expor o item durante períodos de tempo consideravelmente mais longos, tais como cerca de 30 minutos, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas ou mesmo mais longos, a fim de alcançar um nível de descontaminação adequado.

De modo semelhante, a temperatura da solução de perácido durante o passo de exposição pode ser ajustada dependendo do tipo particular de contaminante. Numa forma 60 ΡΕ2350250 de realização, a temperatura de exposição é a temperatura ambiente à qual a solução é preparada, isto é, tipicamente cerca de 18-25 °C. Noutras formas de realização, temperaturas mais elevadas podem ser usadas para facilitar o processo de descontaminação. Geralmente, temperaturas mais elevadas vão acelerar a reatividade da solução de perácido, acelerando assim o processo de descontaminação. Por conseguinte, em algumas formas de realização, o passo de exposição pode ser realizado com a solução de perácido a cerca de 30 °C, 37 °C, 45 °C, 50 °C, 60 °C, 75 °C, 90 °C, ou até mesmo superior.

Numa forma de realização dos métodos, a matriz polimérica contendo a enzima está na forma de um contentor solúvel em água no qual os substratos são encerrados numa fase liquida e o contentor é adicionado à água.

Os métodos de descontaminação são úteis contra uma larga gama de contaminantes, incluindo toxinas selecionadas do grupo constituído por toxina botulínica, toxina de antraz, ricina, toxina escombroide, ciguatoxina, tetradotoxina, micotoxinas ou uma qualquer sua combinação; e agentes patogénicos selecionados do grupo constituído por bactérias, vírus, fungos, parasitas, priões e qualquer sua combinação. Por exemplo, os métodos aqui revelados podem ser utilizados para a descontaminação de materiais contaminados com materiais incluindo, mas sem constituir limitação, produtos químicos tóxicos, mostarda, VX, esporos de B. anthracis, Y. pestis, F. tularensis, fungos e toxinas 61 ΡΕ2350250 (por exemplo, botulina, ricina, micotoxinas, etc.), bem como células infetadas com viriões infeciosos (por exemplo, flavivírus, ortomixovírus, paramixovírus, arenavirus, rabdovirus, arbovírus, enterovirus, buniavírus, etc.). Em algumas formas de realização, o pelo menos um agente patogénico é selecionado a partir de Bacillus sp., B. anthracis, Clostridium sp., C. botulinum, C. perfringens, Listeria sp., Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., Strepto-coccus sp., Salmonella sp., Shigella sp., E. coli, Yersinia sp., Y. pestis, Francisella sp., F. tularensis, Camplyo-bacter sp., Vibrio sp., Brucella sp., Cryptosporidium sp., Giardia sp., Cyclospora sp. e Trichinella sp.

As soluções de perácidos geradas usando os sistemas de entrega aqui descritos e os métodos para a sua utilização são eficazes para a descontaminação de biofilmes. Um dos aspetos caraterísticos do biofilme é que os microrganismos aqui atuam cooperativamente ou sinergicamente. Empiricamente tem-se verificado que os microrganismos que vivem num biofilme estão melhor protegidos dos biocidas do que os microrganismos que vivem fora de um biofilme. Por conseguinte, a remoção de biofilmes patogénicos representa um problema particularmente difícil na descontaminação e/ou higienização do equipamento.

Em algumas formas de realização, as composições estáveis feitas para serem usadas para gerar uma solução de perácido são úteis para remover os biofilmes, incluindo aqueles que são formados por uma ou mais bactérias patogé- 62 ΡΕ2350250 nicas selecionados a partir do grupo constituído por: Bacillus sp., B. anthracis, Clostridium sp. , Clostridium sp., C. botulinum, C. perfringens, Listeria sp., Pseudomo-nas sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Salmonella sp., Shigella sp., E. coli, Yersinia sp., Y. pestis, Francisella sp., F. tularensis, Camplyobacter sp., Vibrio sp., Brucella sp., Cryptosporidium sp., Giardia sp., Cyclospora sp., Trichinella sp. e qualquer sua combinação. Numa forma de realização, uma solução de perácido feita pelos métodos da presente invenção pode ser usada para descontaminar biofilmes selecionados a partir do grupo constituído por: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (SRWC-10943), Listeria monocytogenes (ATCC 19112) e qualquer sua combinação.

Numa forma de realização, biofilmes patogénicos compreendendo culturas bacterianas de Pseudomonas sp., Staphylococcus sp. e/ou Listeria sp. contaminando equipamento de aço inoxidável podem ser substancialmente removidos (isto é, redução de ~500-1000 vezes) por exposição a uma solução de 0,16% numa base ponderai de PAA (gerada a partir do sistema de coentrega de enzima/substrato contendo per-hidrolase) a 45 °C durante 45 minutos.

Em várias formas de realização, os métodos de descontaminação usando os sistemas de entrega contendo per-hidrolase aqui descritos são úteis para o sanitização/-descontaminação de uma larga gama de itens contaminados incluindo superfícies duras, tecidos, alimentos, rações, 63 ΡΕ2350250 vestuário, tapetes, carpetes, tecidos, instrumentos médicos, instrumentos veterinários, por exemplo, itens e equipamentos de aço inoxidável, incluindo grandes reatores, usados em processos farmacêuticos e de biotecnologia.

As soluções de perácido gerado enzimaticamente usando os sistemas de entrega aqui descritos são particularmente bem adequados para a limpeza de itens e equipamento de aço inoxidável porque a proporção de perácido para o correspondente ácido gerado em solução aquosa é muito mais elevada do que a encontrada em soluções comerciais. Por exemplo, uma solução de ácido peracético (PAA) gerada utilizando a composição estável da variante S54V de MsAcT, percarbonato e diacetato de propilenoglicol (PGDA) terá uma proporção de PAA para ácido acético de aproximadamente 10:1. As soluções de PAA comerciais têm tipicamente mais ácido acético do que PAA e podem mesmo ter a proporção inversa (1:10). A proporção aumentada de PAA para ácido acético reduz, ou elimina completamente, a necessidade de realizar tratamentos de passivação adicionais do item ou equipamento de aço inoxidável após o tratamento de PAA. Assim, em algumas formas de realização, as soluções de perácido geradas usando as composições estáveis da presente invenção podem ser usadas para esterilizar itens e equipamentos de aço inoxidável, incluindo reatores grandes, utilizados em processos farmacêuticos e de biotecnologia. Em algumas formas de realização, as soluções de perácido podem ser usadas para sanitização de itens e equipamento de aço inoxidável num 64 ΡΕ2350250 único passo, sem a necessidade de qualquer tratamento posterior do aço com um agente de passivação.

Em ainda outras formas de realização, os sistemas de entrega aqui descritos podem ser utilizados na descontaminação de alimentos e/ou rações, incluindo, mas sem constituir limitação, vegetais, frutos e outros itens alimentares e/ou de rações. De facto, está contemplado que a presente invenção encontrará utilização na limpeza da superfície de frutos, vegetais, ovos, carnes, etc. Com efeito, pretende-se que a presente invenção encontrará utilização nas indústrias alimentares e/ou de rações para remover contaminantes de vários itens alimentares e/ou de rações. Em algumas formas de realização, os métodos para a descontaminação de alimentos e/ou rações estabelecidos pela Food and Drug Administration e/ou outras entidades de segurança alimentar, conforme conhecido dos peritos na técnica encontrarão utilização com a presente invenção.

Em ainda outras formas de realização, o item com necessidade de descontaminação é selecionado de entre superfícies duras, tecidos, alimentos, rações, vestuário, tapetes, carpetes, têxteis, instrumentos médicos e instrumentos veterinários. Em algumas formas de realização, os alimentos são selecionados de entre fruta, vegetais, peixe, marisco e carne. Em algumas ainda outras formas de realização, as superfícies duras são selecionadas de entre superfícies domésticas e superfícies industriais. Em algumas formas de realização, as superfícies domésticas são 65 ΡΕ2350250 selecionadas de entre bancadas de cozinha, lava-louças, armários, tábuas de corte, mesas, prateleiras, áreas de armazenamento e preparação de alimentos, acessórios de casa de banho, pisos, tetos, paredes e áreas de quartos. Em algumas formas de realização alternativas, as superfícies industriais são selecionadas a partir de áreas de processamento de alimentos, áreas de processamento de rações, mesas, prateleiras, pisos, tetos, paredes, lava-louças, tábuas de corte, aviões, automóveis, comboios e barcos.

Kits A invenção também proporciona conjuntos de partes ou "kits". Numa forma de realização, um kit proporciona um sistema de coentrega de enzima/substrato, conforme aqui descrito, com instruções para utilização numa aplicação, incluindo qualquer um dos métodos aqui descritos (por exemplo, um método de limpeza ou um método de processamento de têxteis) , em que a atividade da enzima na diluição em água é útil. É fornecida embalagem adequada. Conforme aqui utilizado, "embalagem" refere-se a uma matriz sólida ou material habitualmente utilizado num sistema e capaz de manter dentro de limites fixos componentes de um kit, conforme aqui descrito, por exemplo um sistema de coentrega de enzima/substrato.

Podem ser fornecidas instruções em forma impressa ou sob a forma de um meio eletrónico, tal como uma disquete, CD ou DVD, ou na forma de um endereço de sitio na Internet, onde tais instruções podem ser obtidas. 66 ΡΕ2350250

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar, mas sem constituir limitação, o invenção. EXEMPLOS Exemplo 1

Matrizes de álcool polivinilico (PVA) contendo uma enzima foram preparadas utilizando um método de tratamento de solvente. Uma parte do concentrado de enzima liquida (cerca de 35 mg/mL de enzima) foi adicionada a nove partes de uma solução de polímero a 10% e misturou-se profundamente. Esta solução foi espalhada sobre uma folha de vidro e deixada a secar à temperatura ambiente. Os filmes de polímero secos continham aproximadamente 3,5% numa base ponderai de enzima, e tinham uma espessura de cerca de 50-100 μΜ. Estes filmes foram cortados em discos circulares de 4 mm de diâmetro para testes posteriores.

Os polímeros de PVA utilizados nesta experiência foram de dois graus comerciais DuPont diferentes: Elvanol 51-05 (88% de hidrólise, grau nominal de polimerização 500) e Elvanol 71-30 (98% de hidrólise, grau nominal de polimerização 1500).

Lixiviação da Enzima

Para avaliar a lixiviação da enzima, os discos foram incubados em diacetato de propilenoglicol (PGDA) durante cerca de 46 horas em frascos de vidro a 37 °C. Após a incubação, os discos foram removidos dos frascos de vidro 67 ΡΕ2350250 e o excesso de PGDA foi removido por absorção com toalhetes de tecido. Os discos foram colocados em 4 mL de H20 para solubilizar o PVA. A atividade da enzima em cada disco pré-incubado foi medida e comparada com a atividade em discos cortados recentemente que não tinham sido incubados em PGDA, usando o ensaio de razão de pNB. 0 ensaio de razão de pNB foi realizado como segue:

Esquema de reação:

Tampão de Ensaio (Tris 100 mM pH 8,0 + Triton X- 100 0,1%)

Para preparar 1000 mL, diluir 100 mL de Tris 1 M (pH 8,0) e 1,0 mL de Triton X-100 em água Milli-Q.

Stock de Substrato (butirato de p-nitrofenil 100 mM em DMSO)

Para preparar 10 mL, adicionar 174,3 yL de pNB a 10 mL de DMSO.

Dividir em aliquotas de 1 mL e armazenar a -20 °C. Uma solução de trabalho pode ser mantida à temperatura ambiente e desprezada quando a cor amarela de fundo se inaceitavelmente elevada. 68 ΡΕ2350250

Protocolo de Cuvete Única 1. Configurar o espectrofotómetro com o programa de ensaio AAPF padrão; temperatura 25 °C. 2. Diluir 10 pL de Stock de Substrato em 1 mL de Tampão de Ensaio numa cuvete de 1 mL descartável. Equilibrar a 25 °C. 3. Iniciar a reação com 10 pL de solução de enzima. 4. Iniciar o espectrofotómetro. 5. Determinar a velocidade (AA.4i0/min) .

Os resultados são apresentados na Tabela 1. Branqueamento de Têxteis

Três amostras de tecido 100% de algodão cada um 3 in x 4 in (Testfabrics, estilo #428U, cetim de algodão desencolado) e três amostras de algodão «interlock» ou entretecido cada um de 3 in x 4 in foram lavadas em um Launder-O-Meter, com e sem discos de per-hidrolase em PVA, sob as seguintes condições:

Razão do banho: 50:1 pH 7 (tampão de fosfato de sódio 100 M)

Temperatura: 60 °C

PGDA: 4 mL/L

H202 (50%) : 4 mL/L

Tempo de incubação: 60 min

Enzima per-hidrolase: sete discos de per-hidrolase em PVA de 5/32 in 69 ΡΕ2350250 0 desempenho do branqueamento no que diz respeito às amostras de cetim de algodão 100% foi quantificado medindo valores CIE L* usando um Minolta CR-200 Chromameter. Maiores valores CIE L* indicam efeitos de branqueamento mais altos. Os resultados são apresentados na Tabela 1. O interlock de algodão foi incluído como lastro e o branqueamento do interlock não foi avaliado.

Um controle "sem enzima" incluiu todos os componentes acima exceto os discos de per-hidrolase em PVA.

Tabela 1

Massa do Wlociidade (dissolvida em Atividade enzima Branqueamento Tipo de Disco 4 niL de H*0) total/mg disno (CIE L*) Filme (mg) 1 2 Méd Stdev Méd Stdev Méd Stdev Disco Recente 1 2,0 0,79 0,75 0,77 0,03 1537 1513 35 93,44 0,10 Disco Recente 2 2,0 0,73 0,76 0,74 0,02 1488 51-05 Disco Incubado 1 1,9 0,68 0,69 0,68 0,02 1441 1473 .......45...... l ' 1 : f ' l; . 2,0 0,73 0,78 0,75 0,03 1504 Disco Recente 1 2,5 0,75 0,76 0,75 0,00 1206 1189 24 93,30 0,10 Disco Recente 2 2,6 0,76 0,77 0,76 0,01 1172 71-30 Disco incubado 1 -, 0,72 0,73 0,73 0,01 1261 1220 57 1 > I:r l:.. i V" 0,76 0,78 0,77 0,01 1180 San Enz 89,33 0,15

Exemplo 2

Discos circulares de 5/32 in de diâmetro foram cortadas de filme de PVA (Elvanol 51-05) que tinha cerca de 50-100 ym de espessura e continha enzimas per-hidrolase e 70 ΡΕ2350250 α-amilase encapsuladas ("discos de per-hidrolase/a-amilase em PVA"). As enzimas foram encapsuladas na matriz polimérica, conforme acima descrito, mas com 9 partes de solução de polímero a 10% e 1 parte de cada de concentrado de per-hidrolase e concentrado de amilase. O filme de polímero resultante era aproximadamente de 2,5% em massa de cada uma das enzimas.

Lixiviação da Enzima

Para avaliar a lixiviação da enzima a partir dos discos, três discos foram incubadas em frascos de vidro selados com ou sem PGDA a 37 °C durante 60 horas. Após remoção dos frascos, cada disco foi dissolvido em 4 mL de água Milli-Q. A atividade de alfa-amilase foi medida usando o kit de ensaio de velocidade Ceralpha disponível em Mega-zyme International Ireland Limited. A atividade de alfa-amilase foi avaliada por hidrólise de malto-heptósido de p-nitrofenilo bloqueado na presença de níveis em excesso de uma α-glicosidase termostável, resultando na hidrólise quantitativa do fragmento de maltossacárido de p-nitro-fenilo em glucose e p-nitrofenol livre. A atividade de per-hidrolase foi medida usando o ensaio de velocidade de pNB conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na Tabela 2. A atividade de per-hidrolase (*) é a média de seis medições (duas por disco) e a atividade da amilase é a média de três medições (uma por disco) . A atividade é representada como AA4io/min para ambas as enzimas. 71 ΡΕ2350250

Tabela 2

Enzima Disco Atividade* Desv. Pad. Per-hidrolase Controlo 0,543 0,019 PGDA 0,544 0,023 Amilase Controlo 0,042 0,001 PGDA 0,040 0,002

Branqueamento e Desencolagem de Têxteis

Três amostras de tecido de cetim de algodão crus (por tingir) de 3 in x 4 in (Testfabrics, estilo #428R) e três amostras de interlock de algodão cru de 3 in x 4 in foram lavadas num Launder-O-Meter com e sem discos de per-hidrolase/amilase em PVA, sob as seguintes condições:

Razão do banho: 50:1 pH: 7 (tampão de fosfato de sódio 100 mM)

Temperatura: 60 °C

PGDA: 4 mL/L

H202 (50%) : 4 mL/L

Tempo de incubação: 60 min

Enzimas: quinze discos de per-hidrolase/amilase em PVA de 5/32 in

Para avaliar a desencolagem, discos de tecido de 5/8 in foram cortados a partir de cada amostra de cru tratado, e em seguida os discos foram tingidos com solução de iodo durante 1 min à temperatura ambiente. Os discos de tecido foram em seguida lavados com água fria, secos com toalhetes, e a cor dos discos foi em seguida medida usando 72 ΡΕ2350250 um Minolta CR-200 Chromameter. Valores de CIE L* foram calculados para quantificar a profundidade do fingimento com iodo. 0 desempenho do branqueamento foi avaliado para as amostras conforme descrito no Exemplo 1. A cor mais clara de um disco de tecido indica que existe menos amido presente, indicando uma eficácia de desencolagem mais elevada. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3

Tingdmento de Iodo (CIE L*) Branqueamento (CIE L*) Méd DesvPad Méd DesvPad Controlo de Tampão 26,10 2,25 87,33 0,20 (-) Enzimas 24,42 0,23 90,46 0,18 (+) Enzimas 33,93 1,25 93,54 0,23

Exemplo 3 A enzima lacase de Cerrena unicolor, conforme descrito no Pediso PCT N° WO 2008/076322, foi encapsulada em álcool polivinilico Elvanol 52-22 (88% de hidrólise, grau nominal de polimerização 1300), que se dissolve em água à temperatura ambiente. O filme de polímero continha 1,5% em massa de lacase, 8,5% em massa de fermentação proveniente de sólidos concentrados por ultrafiltração sem enzimas e 90% em massa de polímero. Discos circulares de 5/32 in de diâmetro foram cortadas a partir de filme de PVA contendo enzima lacase encapsulada ("discos de lacase em PVA"). A enzima foi encapsulada no polímero, conforme descrito no Exemplo 1. 73 ΡΕ2350250

Lixiviação da enzima A lixiviação da enzima proveniente dos discos de lacase em PVA foi avaliada utilizando três diferentes mediadores de lacase como substratos para a enzima.

1. ABTS

Dois discos de lacase em PVA foram inseridos num frasco de vidro com uma solução de 1 mL de PGDA contendo 1% numa base ponderai de ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotia-zolina-6-sulfonato de diamónio) e incubados durante 10 dias à temperatura ambiente (frasco "2" na Figura 2) . A mesma preparação de discos sem lacase em PVA foi preparada como um controle negativo (frasco "1" na Figura 2). Além disso, dois discos de lacase em PVA foram dissolvidos em 100 pL de água desionizada e em seguida adicionados a um frasco contendo 1 mL de PGDA com 1% de ABTS como um controlo positivo (frasco "3" na Figura 2) . As mudanças de cor destas soluções foram monitorizadas como uma indicação da lixiviação da enzima.

Após 10 dias de incubação à temperatura ambiente, não foram observadas mudanças de cor nos frascos 1 e 2. No entanto, a cor da solução no frasco 3 mudou para verde escuro logo que a lacase dissolvida foi adicionada ao frasco, indicando a reação da lacase e mediador.

2. SA

Dois discos de lacase em PVA foram inseridos num 74 ΡΕ2350250 frasco de vidro com uma solução de 1 mL de PGDA contendo 1% numa base ponderai de siringamida (3,5-dimetoxi-4-hidroxi-benzamida; "SA") e incubados durante 10 dias à temperatura ambiente ("4" na Figura 3). A mesma preparação sem discos de lacase em PVA foi preparada como um controle negativo ("5" na Figura 3). Além disso, dois discos de lacase em PVA foram dissolvidos em 100 yL de água desionizada e em seguida adicionados a um frasco contendo 1 mL de PGDA com 1% de SA como um controlo positivo ("6" na Figura 3). A cor da solução contendo lacase dissolvida ("6") mudou de amarelo claro para castanho, indicando que a lacase reagiu com o mediador. No entanto, a mesma preparação com discos de enzima encapsulada ("4") não muda de cor durante a incubação de 10 dias e estes resultados sugerem que a lacase encapsulada não reage com SA na solução de PGDA.

Após 10 dias de incubação à temperatura ambiente, as soluções incubadas foram centrifugadas e a absorvância foi medida a 420 nm num espectrofotómetro. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4

Absorvância (420 na) 1_2_Mád DsvPad

4 PGDA. + SA 5 PGDA + SA + 2 Discos Enz 6 PGDA + SA + 2 Discos Enz + Água 100 mL 0,1980 0,1993 0,1987 0,0009 0,2028 0,2048 0,2038 0,0014 1,0357 1,0433 1,0395 0,0054 75 ΡΕ2350250

3. SN

Dois discos de lacase em PVA foram inseridos num frasco de vidro com uma solução de 1 mL de PGDA contendo 5% em massa de siringonitrilo (3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzo-nitrilo; "SN") e incubados durante 10 dias à temperatura ambiente ("8" na Figura 4). A mesma preparação sem discos de lacase em PVA foi preparada como um controlo negativo ("7" na Figura 4). Além disso, dois discos de lacase em PVA foram dissolvidos em 100 pL de água desionizada e em seguida adicionados a um frasco contendo 1 mL de PGDA com 1% de SN como um controlo positivo ("9" na Figura 4).

Dentro de 1 hora, a cor do frasco 9 mudou para uma cor castanha esverdeada, indicando que a lacase reagiu com NS. A cor dos frascos 7 e 8 permaneceram inalteradas ao longo do período de incubação de 10 dias.

Testes de aplicação

Preparação da Ganga

Ganga tingida com fundo de enxofre/índigo desen-colada e ganga tingida com índigo 100% desencolada foram tratadas numa lavadora de tamboração UniMac (escala de laboratório 50 lb) com 1 g/L de celulase INDIAGE®44L a 55 °C e pH 4, 8 durante 60 minutos numa razão de banho de 10:1 seguido por duas lavagens e em seguida secagem.

Para as experiências de placa de microtitulação de 12 poços descritas abaixo, amostras de tecido redondas 76 ΡΕ2350250 de 5/8 polegada de diâmetro foram cortadas a partir do tecido de ganga pré-tratada com celulase. Para as experiências de Launder-O-Meter descritas abaixo, amostras de tecido de 3 in x 4 in foram cortadas a partir do tecido de ganga pré-tratada com celulase e em seguida as extremidades foram costuradas para evitar o desgaste durante o tratamento.

Avaliação do Desempenho do Branqueamento

Para quantificar os efeitos de branqueamento, as leituras de refletómetro de cada amostra de tecido de ganga foram tomadas antes e após o tratamento usando um Chroma Meter CR-200 da Minolta. A diferença de cor total (ΔΕ) foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: cor * (onde AL, Aa, Ab, diferenças nos valores CIE L*, CIE a* e CIE b*, respetivamente, antes e depois do branqueamento com lacase).

Experiências em Placa de Microtitulação de 12 poços

Amostras de ganga pré-tratada com 5/8 polegadas de diâmetro foram incubadas numa placa de microtitulação de 12 poços sob as seguintes condições: 1. Só tampão

2. Tampão + 50 pL de solução de PGDA contendo 5% de SN 3. Tampão + 50 pL de solução de PGDA contendo 5% de SN + lacase encapsulada 77 ΡΕ2350250 ensaio de placa de microtitulação de 12 poços (2 mL de volume de reação) pH: 6 (tampão de acetato de sódio 50 mM em água) Temperatura: 60 °C Tempo de incubação: 60 minutos Enzima: 5 discos de 5/32 polegadas de filme de lacase encapsulada por teste Mediador: 50 yL de solução de PGDA contendo siringonitrilo a 5% por teste

Os resultados são mostrados na Figura 5. Um efeito de branqueamento dramático foi observado quando as amostras de ganga foram incubadas com discos de lacase em PVA. Os resultados indicaram claramente que a água desencadeou a libertação da lacase a partir do filme de polímero no qual foi encapsulada, permitindo o acesso do mediador e resultando na reação da enzima com o mediador para provocar o branqueamento.

Experiências em Launder-O-Meter amostras de ganga pré-tratada com celulase de 3 in x 4 in foram incubadas num Launder-O-Meter sob as seguintes condições:

(A) 1 mL de solução de PGDA contendo 5% de SN (B) 1 mL de solução de PGDA contendo 5% de SN e 0,15 g de lacase encapsulada

(C) 1 mL de solução de PGDA contendo 5% de ABTS (D) 1 mL de solução de PGDA contendo 5% de ABTS e 0,15 g de lacase encapsulada

Launder-O-Meter (250 mL de volume total de reação) pH: 6 (tampão de acetato de sódio 50 mM em água) 78 ΡΕ2350250

Temperatura: 60 °C

Tempo de incubação: 60 minutos

Enzima: 0,15 g de filme de lacase encapsulada cortado em pequenos pedaços aleatórios

Mediador: O Siringonitrilo (SN) O 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) de diamónio (ABTS)

Os resultados são apresentados na Tabela 5 e na Figura 6. As amostras de ganga tratadas com a preparação (B) (lacase + sistema de coentrega de SN) foram significativamente branqueadas. A cor das amostras de ganga tratadas com a preparação (D) (lacase + sistema de coentrega de ABTS) tingiram para uma cor púrpura clara.

Tabela 5

Diferença de cor entre antes e depois dos tratamentos Delta L Delta a Delta b Delta Ε Méd DsvPd Méd DsvPd Méd DsvPd Méd DsvPd Tanpão + PGDA + Mediador (SN) 0,38 0,62 -0,15 0,18 0,37 0,02 0,65 0,41 Tanpão + PGDA + Mediador Lacase Encapsulada (SN) + 16,35 1,49 -2,78 0,06 6,89 1,04 17,96 1,76 Tanpão + PGDA + Mediador (ABTS) 0,32 0,71 -0,07 0,15 0,29 0,11 0,64 0,32 Tanpão + PGDA Mediador (ABTS) + Lacase Encapsulada 17,41 0,28 1,45 0,25 7,31 0,06 18,94 0,26

Exemplo 4

Sistema de branqueamento com enzima estabilizada

Este exemplo demonstra como a encapsulação de enzimas dentro de uma matriz de polímero pode ser utilizada 79 ΡΕ2350250 para estabilizar um branqueamento enzimático em garrafa única ou sistema de desinfeção. 0 sistema de garrafa única é projetado para produzir ácido peracético na diluição com água. Os seus componentes são: perborato de sódio, diacetato de propilenoglicol (PGDA) e arilesterase (ArE) e um fluido de agente de suporte não aquoso. Nesta forma de realização, o fluido agente de suporte foi um agente tensioativo não iónico de álcool etoxilado (Novel 1012-6 de Sasol Co., Hamburgo, DE). 0 componente de enzima ArE foi adicionado ao sistema em duas formas: (1) diretamente , a partir de um concentrado de enzima líquida, e (2) encapsulado em polímero como um pó seco de pulverização. O polímero foi a hidroxipropil-metilcelulose (HPMC, Methocel E5 Premium LV de Dow Chemical Co., Midland, MI, EUA) . A secagem por pulverização foi conduzida de tal modo que o pó seco era HPMC a 75% (em massa).

Para ambos o concentrado de enzima e a enzima encapsulada, 12,5 yg de ArE ativa foram adicionados a cada um de seis tubos de ensaio contendo 1 g de fluido agente de suporte, 135 mg de perborato de sódio e 2 mg de PGDA. Para cada conjunto de seis tubos, três dos tubos foram iniciados (por diluição em 9 mL de tampão Tris, pH 9,0) e ensaiados para o ácido peracético conforme descrito abaixo. Os outros três tubos foram incubados a 37 °C durante cinco dias, em seguida desencadeados e ensaiados para o ácido peracético. 80 ΡΕ2350250

Ensaio para o ácido peracético

Materiais e Métodos: Ácido peracético: Sigma-Fluka P/N 77240, L/N 11244491, 38,8% (5,115 M, F.W. = 76,05 g/mol), ácido peracético como por C de A.

Sal de diamónio de 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotia-zolina-6-sulfónico) (ABTS): Fluka P/N WA10917, L/N 1135552 54804068, 99+% puro (HPLC), F.W. = 548,64 g/mol Ácido cítrico: Sigma P/N C1857, L/N 0054K0001, F.W. = 192,13

Iodeto de potássio (Kl) : P/N Sigma P4286, L/N 124K0151, F.W. = 166,0

Soluções de stock: Ácido cítrico 125 mM, pH até 5,0 com NaOH, filtro estéril de 0,22 pm, estável indefinidamente à temperatura ambiente até crescimento aparente (geralmente fungos neste pH) ABTS 100 mM em Milli Q (MQ) H20. Aliquotar em alíquotas de 500 pL e armazenar a -20 °C durante até seis meses.

Kl 25 mM em MQ H20. Estável indefinidamente à temperatura ambiente.

Substrato de trabalho: 1. Adicionar 50 mL de tampão de ácido cítrico 125 mM de stock a um recipiente à prova de luz (uma folha de alumínio envolvendo a garrafa de vidro é aceitável). 2. Descongelar uma alíquota de 500 pL de stock de ABTS e adicionar à solução de ácido cítrico. 81 ΡΕ2350250 3. Adicionar 100 yL de Kl 25 mM ao ácido cítrico. 4. Rodar suavemente para misturar e tapar. Solução boa durante até 54 horas quando armazenada no escuro à temperatura ambiente.

Preparação da Curva Padrão: 1. Obter stock de ácido peracético (normalmente -39%; -390 g/L; 390 (g/L)/76,05 (g/mol) -5,13 M. NOTA: esta concentração atual será determinada pelo atual número de ensaio reportado em CofA. 2. Fazer uma diluição de 1:100 de PAA de stock em ácido cítrico 125 mM. Tapar e turbilhonar durante 15 segundos. 3. Tomar a diluição de 1:100 do passo 2 e diluí-la 1:100 (isto irá fazer uma diluição do 1 : 10 000 de PAA de stock) em ácido cítrico 125 mM. Tapar e turbilhonar durante 15 segundos. Esta concentração de PAA é agora -5000 mM/10 000 = -0,5 mM = -500 μΜ 4. Tomar a solução do passo três e diluir 4 partes padrão (a -500 μΜ padrão de #3) para 1 parte de ácido cítrico para fazer um padrão à volta de 400 μΜ 5. Tomar a solução do passo três e diluir 3 partes padrão (a -500 μΜ padrão de #3) para 2 partes de ácido cítrico para fazer um padrão à volta de 300 μΜ 6. Tomar a solução do passo três e diluir 2 partes padrão (a -500 μΜ padrão de #3) para 3 partes de ácido cítrico para fazer um padrão à volta de 200 μΜ 7. Tomar a solução do passo três e diluir 1 parte padrão (a -500 μΜ padrão de #3) para 4 partes de ácido cítrico para fazer um padrão à volta de 100 μΜ 82 ΡΕ2350250

Ensaio: 1. Numa placa de microtitulação, colocar 20 yL de todos os padrões, em ordem decrescente de diluição em triplicado ou em formato de linha ou em formato de coluna (um padrão por poço). 2. No final da curva padrão, colocar 20 yL de ácido cítrico em poços em triplicado (estes são os brancos). 3. Em linhas ou colunas separadas colocar 20 yL de amostras diluídas em poços em triplicado. 4. Verter uma quantidade adequada de substrato de trabalho numa bacia de substrato (ou tampa ou base de caixa de Petri limpa, ou uma tampa de caixa de pipeta de ponta limpa) 5. Com uma pipeta multicanal, adicionar 200 yL de substrato a cada poço da placa de microtitulação que tem padrão, branco e amostra. 6. Com um cronómetro, deixar a reação prossequir durante 3 minutos (+/- 0,5 min) 7. Ler os poços num leitor de microplacas em 420 nm 8. Transferir os dados para o Excel ou utilizar o programa leitor de placas para gerar a curva padrão, calcular o declive e calcular a interseção por reqressão linear utilizando os dados padrão (calcular a média, DP, etc.). 9. Calcular as concentrações das amostras usando o declive e intercetar usando y=m*x+b e multiplicando pelo fator de diluição da amostra. 83 ΡΕ2350250

Resultados

Os resultados de ácido peracético para cada conjunto de três tubos foram calculados e tabulados. Os resultados são mostrados na Tabela 6. A amostra encapsulada demonstrou uma estabilidade significativamente aumentada após 5 dias a 37 °C.

Tabela 6 Ácido peracético produzido (pM)

Amostra Sem incubação Após 5 dias a 37 °C

Concentrado de enzima 410 153

Enzima encapsulada em polímero 417 275

Lisboa, 9 de maio de 2014

Claims (19)

1. ΡΕ2350250 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um sistema de entrega de líquido para enzima e substrato coformulados, em que o sistema de entrega é uma composição que compreende uma enzima e um substrato para a enzima, em que a enzima está encapsulada numa matriz polimérica solúvel em água e o substrato está presente numa fase líquida substancialmente não aquosa em contacto com a matriz polimérica na qual a enzima está encapsulada, em que o polímero não é solúvel na fase líquida e a fase líquida substancialmente não aquosa compreende menos do que cerca de 5% de água.
2. 2. 0 sistema de entrega de acordo com a reivindicação 1, em que a fase líquida substancialmente não aquosa compreende menos do que cerca de 1% de água.
3. 3. 0 sistema de entrega de acordo com a reivindicação 1, em que a fase líquida substancialmente não aquosa compreende menos do que cerca de 0,5% de água.
4. 4. O sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a enzima retém potencial catalítico na matriz polimérica, mas substancialmente não reage com o substrato na composição durante pelo menos 10 dias a 25 °C.
5. 5. O sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que após a adição de 2 ΡΕ2350250 água à composição, a matriz polimérica é solubilizada, libertando a enzima, permitindo que ocorra a reação catalítica com o substrato.
6. 6. 0 sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo constituído por proteases, celulases, amilases, pectinases, per-hidrolases, peroxidases, oxidases de hidratos de carbono, enzimas oxidantes de fenol, cutinases, lipases, hemicelulases, xilanases, mananases, catalases, lacases e suas misturas.
7. 7. 0 sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo: (a) duas ou mais enzimas encapsuladas na mesma matriz polimérica ou; (b) duas ou mais enzimas encapsuladas em matrizes poliméricas separadas.
8. 8. 0 sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo ainda pelo menos um agente tensioativo.
9. 9. 0 sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que: (a) a matriz polimérica é selecionada a partir do grupo constituído por álcool polivinílico, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirrolidona, goma de guar e seus derivados ou copolímeros; e/ou 3 ΡΕ2350250 (b) a enzima encapsulada numa matriz polimérica sob a forma de partículas suspensas num líquido substancialmente não aquoso contendo o substrato e, facultativamente, as partículas são mantidas em suspensão através de um auxiliar de suspensão; e/ou (c) o substrato é solubilizado ou disperso numa fase líquida substancialmente não aquosa, a qual pode facultativamente incluir um líquido não aquoso (fluido agente de suporte).
10. 10. O sistema de entrega de acordo com a reivindicação 9, em que: (a) o fluido agente de suporte é selecionado de entre o grupo constituído por glicóis, agentes tensioativos não iónicos, álcoois, poliglicóis, ésteres de acetato e uma sua mistura; ou (b) o fluido agente de suporte é um substrato para a enzima.
11. 11. O sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que: (a) a enzima é uma per-hidrolase e o substrato é um substrato de éster; ou (b) a enzima é uma per-hidrolase e o substrato diacetato de propilenoglicol.
12. 12. 0 sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, compreendendo ainda um 4 ΡΕ2350250 composto que origina peróxido de hidrogénio selecionado de entre percarbonato de sódio, perborato de sódio e peróxido de hidrogénio-ureia, em que um perácido é produzido após ser adicionada água à composição.
13. 13. 0 sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que: (a) a enzima é uma enzima lacase, e o substrato é um mediador de lacase; ou (b) a enzima é uma enzima oxidante de fenol, e o substrato é selecionado a partir do grupo constituído por 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), siringa-mida e siringonitrilo.
14. 14. 0 sistema de entrega de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a enzima é uma per--hidrolase e o substrato é um substrato de éster, e o sistema de entrega compreende ainda perborato de sódio.
15. 15. 0 sistema de entrega de acordo com a reivindicação 14, em que o sistema de entrega aumentou a estabilidade em armazenamento em comparação com um sistema de entrega comparável sem o polímero.
16. 16. Um estojo contendo o sistema de entrega para enzima e substrato coformulados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e instruções para utilização. 5 ΡΕ2350250
17. 17. Um método para o branqueamento de um produto têxtil, que compreende: (a) a adição do sistema de entrega de acordo com a reivindicação 14 ou reivindicação 15 a água, na presença de uma fonte de peróxido de hidrogénio, e mistura, gerando-se assim uma solução aquosa de perácido; e (b) fazer o contacto de um produto têxtil com a solução durante um período de tempo e sob condições adequadas para permitir o branqueamento mensurável do produto têxtil, produzindo-se assim um produto têxtil branqueado.
18. 18. Um método para descontaminação que compreende: (a) a adição do sistema de entrega de acordo com a reivindicação 14 ou reivindicação 15 a água, na presença de uma fonte de peróxido de hidrogénio, e mistura, gerando-se assim uma solução aquosa de perácido; e (b) fazer o contacto de um item que compreende um contaminante com a solução, reduzindo-se assim a concentração do contaminante.
19. 19. 0 método de acordo com a reivindicação 17 ou reivindicação 18, em que a fonte de peróxido de hidrogénio é o perborato de sódio. Lisboa, 9 de maio de 2014