CN102203231A - 用于共配制的酶和底物的输送系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供包括酶和底物共输送系统的方法、组合物、系统和试剂盒。该液体输送系统包括至少一种封装于水溶性聚合物基质中的酶和在载液中的该酶的底物，所述聚合物基质不溶于所述载液。当加入水时，该聚合物基质溶解，从基质释放酶，使其可以对底物进行催化反应。

Description

用于共配制的酶和底物的输送系统

优先权

本申请要求2008年11月3日提交的序列号为61/110,832的美国临时专利申请的优先权，其通过合并于本文作为参考。

发明领域

本发明涉及用于共输送酶和底物的液体剂型，其中至少一种酶封装于聚合物基质中。

发明背景

在酶/底物系统的输送中，一般会引起两个问题。第一个问题是最佳效力依赖于保持合适的酶：底物比例。第二个问题是酶必须与其底物物理分离，直至需要反应的时刻。克服这些问题的一个方式是将酶与底物分开包装，在使用的时间点再将它们组合。但是，这一方法不方便、复杂，而且会导致使用时的混合误差。而且还是昂贵的，因为酶经常必需与稳定物质一起配制。克服这些问题的另一个方法是提高干燥的酶和干燥的底物的共混物，从而在保持合适的酶与底物的比例的同时达到物理分离。但是，经常需要或是必需提供液体配方用于那些不是设立为处理粉末、颗粒或其他固体产品的过程中。需要一种备选的方法。

在相同的容器中组合酶和底物的共配制的方法将是需要的。这使得生产者能够控制酶底物比例，在配方成分上节约成本，而且会提供给消费者简单、方便而且“即用型”的产品。在某些情况下，在相同的液体剂型中组合酶和底物能够减轻毒性相关的情况(例如如果能够将漆酶中介物与漆酶本身在相同的容器中处理和传送，能够实质上降低漆酶形成的环境风险)。

Ounichi(美国专利No.4,898,781)和Aronson(美国专利No.5,281,355)公开了用于洗衣和家庭护理应用的酶的封装，得到的产品仅仅包含酶，不包含反应性底物。理想的将是生产其中酶与反应性底物相分离的包含酶和底物的液体剂型。其中可使用这种共配制的应用包括但不限于，酶漂白系统，例如与酯底物一起使用过水解酶(perhydrolase)；和酶染色系统，例如使用漆酶和染料前体底物。

发明概要

本发明一方面提供了用于共配制的酶和底物的液体输送系统，其中所述输送系统是包含酶和该酶底物的组合物，其中所述酶封装于水溶性的聚合物基质中。该底物在与包含该酶的所述聚合物基质接触的基本上非水性的液相(即，小于约5％，小于约1％或小于约0.5％的水)中，其中所述聚合物不溶于所述液相中。所述酶在所述聚合物基质中保持催化潜力，但是在25℃下至少10天内，基本上不与组合物中的底物反应。在向该组合物中加入水之后，该聚合物基质溶解，释放该酶，允许发生与该底物的催化反应。

在一些实施方式中，组合物包含选自蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、过水解酶、过氧化物酶、碳水化合物氧化酶、酚氧化酶、角质酶(cutinases)、脂肪酶、半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、过氧化氢酶和漆酶及其混合物中的一种或多种酶。在一些实施方式中，组合物包含在相同的聚合物基质中封装的两种或多种酶。在一些实施方式中，组合物包含在不同的聚合物基质中封装的两种或多种酶。在一些实施方式中，组合物包含在相同的聚合物基质中封装的两种或多种酶，和封装于不同的聚合物基质中的至少一种酶。

在一些实施方式中，组合物包含至少一种表面活性剂。

在一些实施方式中，聚合物基质选自聚乙烯醇、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶及其衍生物或共聚物。用于此处提供的组合物中的适宜聚合物是酶可以封装在其中而且不会溶于水的聚合物。

在一些实施方式中，含酶的聚合物基质为悬浮于包含底物的基本上非水性的液体中的颗粒形式。在一个实施方式中，这些颗粒通过悬浮助剂保持悬浮。在一些实施方式中，液体悬浮液在容器中，其包含足以用于和/或预期用于在使用酶/底物反应的应用中单独使用(即单次量)的量的酶和底物，其中该容器可以打开来分发该液体，例如通过打开帽或盖子。在一些实施方式中，液体悬浮物在可重封的容器中，该容器包含足以用于和/或预期用于多次(即，多次剂量)量的酶和底物，这使得可以通过打开和关闭容器帽、打开和关闭阀或分发端口等来重复分发该悬浮液。在一些实施方式中，含酶的聚合物基质为密闭的(即密封的)容器形式，例如小袋或囊，而且底物在聚合物容器内的基本上非水性的液体中。

底物溶于或分散于基本上非水性的液相中，该液相可包括非水性液体(载液)。载液的实例包括但不限于，二醇类、非离子表面活性剂、乙醇、聚乙二醇、乙酸酯或其混合物。液体或固体底物可与一种或多种载液组合，而且可以与载液混溶或悬浮于载液中。在一些实施方式中，载液包含加入其中以形成适于提高底物溶解度和/或降低封装聚合物溶解性条件的盐或pH缓冲剂。在一些实施方式中，载液是酶的底物，例如丙二醇二乙酸酯载液可以作为封装于聚合物基质中的过水解酶的底物，所述聚合物基质不溶于丙二醇二乙酸酯，所述聚合物基质例如聚乙烯醇、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮。在许多实施方式中，该输送呈现出比缺乏该聚合物的相当的输送系统更高的稳定性。

在一个实施方式，该酶为过水解酶，底物为酯底物，诸如，例如，乙酸酯，例如丙二醇二乙酸酯。在一些实施方式中，该酯底物为丙二醇二乙酸酯，包含过水解酶的聚合物为悬浮于该丙二醇二乙酸酯中的颗粒形式，或为围绕丙二醇二乙酸酯的封闭容器的形式，即，丙二醇二乙酸酯封闭于该聚合物容器中。

在一些实施方式中，该酶为过水解酶，底物为酯底物，该组合物进一步包括产生过氧化氢的化合物，例如选自过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化脲(urea hydrogen peroxide)的化合物，而且在向该组合物中加入水之后产生过酸。在一些实施方式中，过酸选自过乙酸、过壬酸、过丙酸、过丁酸、过戊酸和过己酸。在一个实施方式中，酯底物为丙二醇二乙酸酯，而且该产生过氧化氢的化合物悬浮在该丙二醇二乙酸酯中。

在一些实施方式中，该酶为过水解酶，该组合物包含用于生产单甘油酯和甘油二酯(例如酰基供体和醇受体)或山梨聚糖酯(例如酰基供体和山梨聚糖)的底物。在一些实施方式中，该酶为过水解酶，该组合物包含产生芳香酯的底物，例如苄基酯(例如酰基供体和挥发性醇，例如苄醇)。

在一些实施方式中，该酶为酚氧化酶，例如漆酶，底物为漆酶中介物，例如选自2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)、丁香酰胺和丁香腈(syringonitrile)。

本发明的各方面提供了用于其中使用酶活性的应用中的组合物，例如去污剂组合物、织物加工组合物或个人护理组合物，其中该组合物包含酶和该酶的底物，其中该酶封装于水溶性的聚合物基质中，而且其中含酶的聚合物基质与包含该底物的基本上非水性的液体溶液或悬浮液接触而且与之不相溶，如本文所述。

在另一方面，本发明提供了包含用于此处描述的共配制酶和底物的输送系统或包含该输送系统的组合物，和包装的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括使用方法说明书，例如去污方法、清洁方法、织物加工方法或个人护理方法。在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括将该输送系统合并到配制的组合物中，以用于其中使用该酶对该底物的催化活性的方法中，例如去污剂组合物、织物加工组合物或个人护理组合物。

本发明另一方面提供了一种去污的方法，包括：(a)在过氧化氢源的存在下将本文所述含过水解酶的组合物加入到水中并混合，从而产生含水过酸溶液；和(b)将包含污染物的物品与该溶液接触，从而降低该污染物的浓度。在一些实施方式中，该污染物包括选自肉毒杆菌毒素、炭疽毒素、蓖麻毒素、鲭鱼毒素、雪卡毒素、河豚毒素、霉菌毒素或其组合的毒素。在一些实施方式中，该污染物包括选自细菌、病毒、真菌、寄生虫、阮病毒或其组合的病原体。在一些实施方式中，该物品选自硬表面、纺织品、食物、饲料、服饰品、小地毯、地毯、织物、医疗器械和兽医器械。在一些实施方式中，水是已灭菌的。在一些实施方式中，在高温下进行对要去污的物品的接触。

本发明另一方面提供了一种漂白织物的方法，包括：(a)在过氧化氢源的存在下将本文所述含过水解酶的组合物加入到水中并混合，从而产生含水过酸溶液；和(b)将织物与该溶液在适于使得该织物能可测增白的条件下接触一定时间长度，从而产生漂白的织物。

本发明另一方面提供了一种清洁的方法，包括在加入水的情况下，将包含污渍的物品与本文所述的去污剂组合物接触，其中该污渍至少一部分被去除。

在另一方面，本发明提供了一种漂白织物的方法，包括在加入水的情况下将织物与本文所述含酚氧化酶(例如漆酶)的组合物在适于使得该织物能可测增白的条件下接触一定时间长度，其中所述组合物包含影响织物增白的中介物，从而产生漂白的织物。

在另一方面，本发明提供了一种改变织物颜色的方法，包括在加入水的情况下将织物与本文所述含酚氧化酶(例如漆酶)的组合物在适于使得该织物能可测颜色改变的条件下接触一定时间长度，其中所述组合物包含在使用的条件下影响织物颜色改变的中介物，从而产生改变颜色的织物。

在另一方面，本发明提供了一种染发的方法，包括在加入水的情况下将头发与本文所述含酚氧化酶(例如漆酶)的组合物在适于使得头发能可测颜色改变的条件下接触一定时间长度，其中所述组合物包含在使用的条件下影响头发颜色改变的中介物，从而产生改变颜色的头发。

在另一方面，本发明提供了一种纸浆或纸漂白和/或去木质化的方法，包括在加入水的情况下将纸浆或纸与本文所述含酚氧化酶(例如漆酶)的组合物在适于使得纸浆或纸能可测颜色改变和/或木质素含量改变的条件下接触一定时间长度，其中所述组合物包含影响颜色和/或木质素含量改变的中介物，从而产生改变颜色和/或木质素含量的纸浆或纸。

在另一方面，本发明提供了一种酶活化木材纤维以生产木材复合物的方法，包括在加入水的情况下将木材与本文所述含酚氧化酶(例如漆酶)的组合物在适于使得木材复合物产量能可测改变的条件下接触一定时间长度，其中所述组合物包含影响木材复合物产量改变的中介物，从而产生具有木材纤维结合改变的木材。

在另一方面，本发明提供了一种处理废水的方法，包括在加入水的情况下将废水流与本文所述含酚氧化酶(例如漆酶)的组合物在适于使得废水中苯酚浓度能可测降低的条件下接触一定时间长度，其中所述组合物包含影响苯酚浓度降低的中介物，从而产生具有降低苯酚含量的废水流。

附图说明

图1原理性描述了过水解酶催化的反应。

图2展示了如实施例3所述的用PVA漆酶盘和ABTS漆酶中介物的酶沥滤实验结果。

图3展示了如实施例3所述的用PVA漆酶盘和SA漆酶中介物的酶沥滤实验结果。

图4展示了如实施例3所述的用PVA漆酶盘和SN漆酶中介物的酶沥滤实验结果。

图5展示了在如实施例3所述的12孔微滴定板实验中的牛仔布漂白结果。

图6展示了在如实施例3所述的耐洗牢度试验仪实验中的牛仔布漂白和染色结果。

具体实施方式

本发明提供一种用于共配制的酶和底物的输送系统。此处记载的组合物包含封装于包含水溶性聚合物的聚合物基质中的酶。该组合物还包含该酶的底物。该封装的酶可悬浮于一种基本上非水性的液体组合物中或以封闭的容器形式围绕该基本上非水性的液体组合物，该基本上非水性的液体组合物包括底物，或由底物组成、或基本上由底物组成，底物诸如，举例而言，液体底物、底物溶液、或固体底物颗粒或包含底物的胶囊的液体悬浮液。从封装酶的聚合物释放酶通过在水中稀释而触发。

定义

除非另外定义，此处只有的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第二版，JohnWiley and Sons，NY(1994)；和Hale和Marham，The Harper CollinsDictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)为本领域技术人员提供了许多用于本发明的术语的一般性字典。与此处记载的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实施中。因此，通过整体参考说明书而更加完全地描述下面定义的术语。并且，此处使用的单数术语“一个”和“所述”包括其复数指代，除非上下文另外清楚指明。除非另外说明，核酸以5′至3′的方向从左向右书写，氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。应理解本发明不限于所描述的特定方法学、实验方案和试剂，因为本领域技术人员可以根据使用它们的背景而对其进行改变。

通篇说明书中给定的每个上限值意欲包括每个更小的数值限制，相当于这样的更小数值限制明确记载于本文中。通篇说明书中给定的每个下限值包括每个更大的数值限制，相当于这样的更大数值限制明确记载于本文中。整个说明书中每个数值范围包括落入该较宽数值范围的每个较窄数值范围，相当于这样的较窄数值范围全部明确记载于本文中。

此处使用的术语“酶”是指催化化学反应的任何蛋白质。酶的催化功能构成其“活性”或“酶活性”。通常根据酶进行的催化反应的类型对酶分类，例如肽键的水解。

此处使用的术语“底物”是指酶对其执行其催化活性产生产物的底物(例如化学化合物)。

此处使用的术语“纯化的”和“分离的”是指污染物从样品的移除和/或物质(例如蛋白质、核酸、细胞等)，即，从其天然相关的至少一种成分中移除的物质。例如，这些术语可指实质上或基本上无在天然状态下(例如完整的生物系统)通常与之伴随的成分的物质。

此处使用的术语“多核苷酸”是指任何长度、任何三维结构的、单链或多链(例如单链、双链、三股螺旋等)的核苷酸的聚合物形式，所述核苷酸包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物或修饰形式，包括修饰的核苷酸或碱基或其类似物。由于遗传密码是简并的，多于一个密码子可用于编码一个具体的氨基酸，本发明涵盖编码具体氨基酸序列的多核苷酸。可以使用任何类型的修饰核苷酸或核苷酸类似物，只要该多核苷酸在使用条件下保持所需的功能性，包括提高核酸酶抗性的修饰(例如脱氧、2′-O-Me、硫代磷酸酯等)。为了检测或捕获还可以加入标记物，例如放射性或非放射性标记，或锚定物，例如生物素。术语多核苷酸还包括肽核酸(PNA)。多核苷酸可以天然反生或非天然发生。术语“多核苷酸”和“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。本发明的多核苷酸可包含RNA、DNA或二者，和/或其修饰形式和/或其类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。一个或多个磷酸二酯键可以被备选的连接基团取代。备选的连接基团包括但不限于如下实施例，其中磷酸被P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR₂(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂(“formacetal”)取代，其中各个R或R’独立地为H，或可选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)取代或未取代的烷基(1-20个碳)。多核苷酸的所有键不需要都相同。多核苷酸可以是线性的或环状的，或包括线性和环状部分的组合。

此处使用的“多肽”是指包含氨基酸而且被本领域技术人员鉴别为蛋白质的任何组合物。此处使用常规单字母或三字母氨基酸编码。术语“多肽”和“蛋白质”在此可以互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性的或分枝的，其可以包含修饰的氨基酸，而且其可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物，例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如用标记成分缀合。该定义还包括例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如此处使用的，功能性和/或结构性相似的蛋白质被认为是“相关蛋白质”。在一些实施方式中，这些蛋白质来自不同的属和/或种，包括生物的纲间差异(例如细菌蛋白和真菌蛋白)。在另外的实施方式中，相关的蛋白质来自相同的种。实际上，本发明并不是意图限制此处记载的这些过程、方法和/或组合物为来自任何具体来源的相关蛋白。此外，术语“相关蛋白质”涵盖三级结构同源物和一级序列同源物。在进一步的实施方式中，该术语涵盖有免疫性交叉反应的蛋白质。

“过水解酶”是指能够催化导致足够高量过酸产生的过水解反应(perhydrolysis reaction)，所述过酸适用于诸如清洁、漂白、灭菌或消毒用途。一般而言，用于此处所述方法中的过水解酶呈现高的过水解与水解的比例。在一些实施方式中，过水解酶包括、由下列物质组成、或主要由下列物质组成：SEQ ID NO：1中显示的耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)过水解酶氨基酸序列，或其变体或同源物。在一些实施方式中，过水解酶包括酰基转移酶活性，并催化含水酰基转移反应。

此处使用的术语“过水解”(“perhydrolyzation”或“perhydrolyze”或“perhydrolysis”)是指其中从酯和过氧化氢底物产生过酸的反应。在一个实施方式中，过水解反应用过水解酶催化，例如酰基转移酶或芳基酯化酶。在一些实施方式中，过酸通过在过氧化氢(H₂O₂)存在下的通式为R₁C(＝O)OR₂的酯底物过水解产生，其中R₁和R₂为相同或不同的有机部分。在一个实施方式中，-OR₂为-OH。在一个实施方式中，-OR₂被-NH₂取代。在一些实施方式中，过酸通过羧酸或酰胺底物的过水解产生。

此处使用的术语“过酸”是指衍生自羧酸酯的分子，其已经与过氧化氢反应以形成能够转移其氧原子之一的高反应性产物，例如通式RC(＝O)OOH的有机酸。正是转移氧原子的能力允许过酸例如过乙酸作为漂白剂发挥作用。

术语“过氧化氢源”包括过氧化氢以及能够自发或酶促产生过氧化氢作为反应产物的系统成分。

术语“过水解与水解的比例”是指在限定的条件下和限定的时间内，过水解酶从酯底物酶促产生的过酸的量与酶促产生的酸的量之比例。

此处使用的术语“酰基”是指具有通式RCO-的有机基团，衍生自去除-OH基团的有机酸。通常，酰基用后缀“-oyl”命名，例如甲酰基氯CH₃CO-Cl，为从甲酸CH₃CO-OH形成的酰基氯。

此处使用的术语“酰基化”是指其中分子的取代基之一用酰基取代的化学转化，或向分子中引入酰基的过程。

此处使用的术语“转移酶”是指催化官能团从一个底物向另一个底物转移的酶。

此处使用的术语“酶促转化”是指通过将底物或中介物接触酶，使底物或中介物修饰为产物。在一些实施方式中，接触通过将底物或中介物直接暴露至适当的酶来进行。在另一些实施方式中，接触包括将底物或中介物暴露给表达和/或分泌该酶的有机体，和/或分别代谢所需底物和/或中介物为所需中介物和/或终产物的有机体。

此处使用的“有效量的酶”是指达到在具体应用(例如用于去污的通过酰基转移酶产生的过乙酸)中所需活性必须的酶量。本领域技术人员易于确定这种有效量，而且这种确定基于许多因素，例如使用的特殊酶变体、具体组合物、去污的方法、要去污的物品等。

此处使用的涉及物质(例如酶)或组合物时的术语“稳定性”是指在确定环境条件下保持一定水平的功能活性一定时间阶段的能力。另外，术语“稳定性”在许多更加具体的涉及目的具体环境条件的上下文中使用。例如，此处使用的“热稳定性”是指物质或组合物在升高的温度下保持其功能(即不降解)的能力。稳定性的实质改变显示为与不存在选定环境条件下存在的活性相比，要检测的功能活性半衰期至少约5％或更多的升高或降低(在大部分实施方式中，其优选升高)。

涉及酶时此处使用的术语“化学稳定性”是指在对其活性有副作用的化学品存在下酶的稳定性。在一些实施方式中，这样的化学品包括但不限于，过氧化氢、过酸、阴离子去污剂、阳离子去污剂、非离子去污剂、螯合剂等。但是，这并不意味着本发明限于任何具体化学稳定性水平，也不限于化学稳定性范围。

此处使用的“pH稳定性”是指物质(例如酶)或组合物在具体pH下行使功能的能力。多种pH下的稳定性可以通过本领域已知的标准方法测量或通过此处记载的方法测量。pH稳定性的实质改变显示为与最优pH下的活性相比，功能活性半衰期至少约5％或更多的升高或降低(在大部分实施方式中，其优选升高)。这并不意味着本发明限于任何pH稳定性水平或pH范围。

此处使用的“氧化稳定性”是指物质(例如酶)或组合物在氧化条件下(例如存在氧化化学品的情况下)行使功能的能力。

此处使用的“热稳定性”是指蛋白质在具体温度下行使功能的能力。一般而言，大部分酶具有有限范围的发挥功能的温度。除了在温和温度范围(如室温)工作的酶，还有能够在非常高或非常低的温度下工作的酶。可以用已知方法测定热稳定性。热稳定性的实质改变显示为当暴露于不同温度(即较高或较低)时比酶活性最优温度下的酶活性，突变体的催化活性半衰期至少约5％或更多的升高或降低。然而，本发明并不是意图限制此处记载的这些过程、方法和/或组合物为任何温度稳定性水平或温度范围。

此处使用的“氧化化学品”是指具有漂白能力的化学品。氧化化学品以适于漂白的量、pH和温度存在。该术语包括但不限于过氧化氢和过酸。

此处使用的术语“污染物”是指通过与其他物质、材料或物品接触或相关联而使其不理想、不纯和/或不适合使用的任何物质。

此处使用的术语“污染的物品”或“需要去污的物品”是接触或关联污染物和/或需要去污的任何物品或事物。这并不意味着该物品被限定为任何具体事物或类型的物品。例如，在一些实施方式中，该物品为硬表面，而在另一些实施方式中，该物品为衣物制品。在又一些实施方式中，该物品为织物。在又一些实施方式中，该物品用于医药和/或兽医领域。在一些实施方式中，该物品是外科器械。在另一些实施方式中，该物品用于运输(例如公路、跑道、轨道、火车、汽车、飞机、轮船等)。在另一些实施方式中，该术语涉及食物和/或食品，包括但不限于肉、肉副产品、鱼、海产品、蔬菜、水果、奶制品、谷物、烘烤产品、青贮饲料、干草、草料等。实际上，该术语意图涵盖适于用本发明提供的方法和组合物去污的任何物品。

此处适于的术语“去污”是指从污染的物品去除基本上全部或全部的污染物。在一些实施方式中，去污涵盖消毒，而在其他实施方式中，该术语涵盖灭菌。但是，这并不意味着该术语限定于这些实施方式，因为该术语意在涵盖无生命污染物以及微生物(例如细菌、真菌、病毒、阮病毒等)污染物的去除。

此处使用的术语“消毒”是指从表面上去除污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。不应理解为本发明限于任何具体的表面、物品或要除去的污染物或微生物。

此处使用的使用“灭菌”是指杀死表面上的所有微生物有机体。

此处使用的术语“杀孢子(sporicidal)”是指杀死微生物孢子，包括但不限于真菌和细菌的孢子。该术语涵盖有效防止孢子萌芽的组合物，以及使得孢子完全不能存活的组合物。

此处使用的术语“杀细菌的”、“杀真菌的”和“杀病毒的”分别是指杀死细菌、真菌和病毒的组合物。术语“微生物杀灭剂”是指抑制任何微生物生长和/或复制的组合物，包括但不限于细菌、真菌、病毒、原生动物、立克次氏体等。

此处使用的术语“制细菌的”、“制真菌的”和“制病毒的”分别是指抑制细菌、真菌和病毒生长和/或复制的组合物。术语“制微生物的”是指抑制任何微生物生长和/或复制的组合物，包括但不限于细菌、真菌、病毒、原生动物、立克次氏体等。

此处使用的术语“清洁组合物”是指用于从待清洁的物品(例如纺织品、餐具、隐形眼镜、其他固体物质、头发(香波)、皮肤(肥皂和洗面奶)、牙齿(漱口水、牙膏)等)去除不想要的化合物的组合物。该术语还涉及适用于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体和/或表面的任何组合物。该术语意在包括但不限于去污剂组合物(例如液体和/或固体衣物去污剂和精细织物去污剂；硬表面清洁配方，例如用于玻璃、木、陶瓷和金属柜台上面和窗口的清洁配方；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物增鲜剂；织物柔顺剂；和纺织品和衣物预洗剂(pre-spotters)，以及餐具去污剂)。该术语进一步涵盖用于选定的具体类型的所需清洁组合物和产品形式(例如液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)的任何材料/化合物，只要该组合物与酰基转移酶、过氧化氢源、PGDA和用于该组合物的任何其他酶或底物相容。清洁组合物材料的具体选择易于通过考虑要清洁的表面、物品或织物，以及使用过程中的清洁条件所需的组合物形式来进行。实际上，除非另外指明，此处使用的术语清洁组合物包括：粒状或粉末形式的通用的或强效洗涤剂，特别是清洁去污剂；液体、凝胶或糊形式的通用洗涤剂，特别是所谓的强效液体型(HDL)；液体精细织物去污剂；餐具手洗洗涤剂或轻效型餐具洗涤剂，特别是那些高泡沫型的；机用餐具洗涤剂，包括家用和公共机构用的各种片剂、粒状、液体和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手型、清洁棒、漱口药、假牙清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发水和洗发剂；沐浴凝胶和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“污渍棒”(stain-stick)或预处理型助剂。

此处使用的术语“去污剂组合物”和“去污剂配方”是指要用于用来清洁弄脏的物品的洗涤介质中的混合物。在一些实施方式中，该术语涉及纺织品和/或衣物洗涤(例如衣物去污剂)。在备选的实施方式中，该术语涉及其他去污剂，例如那些用于清洁盘碟、餐具等等的去污剂(例如餐具去污剂)。这并不意味着本发明限于任何具体的去污剂配方或组合物。实际上，除了过水解酶，例如酰基转移酶，该术语意在涵盖包含表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂的去污剂。

此处使用的术语“酶相容的”，当用于清洁组合物材料的上下文中时，是指不会降低酶活性至该相关酶不能如正常使用条件下所预期那般有效的材料。

此处使用的“衍生物”是指来自亲本蛋白质的蛋白质，通过加入一个或多个氨基酸至C末端或N末端或两端都加、在氨基酸序列的一个或多个不同位点处一个或多个氨基酸的取代、和/或在氨基酸序列的C端和N端的某一端或两端和/或者在氨基酸序列的一个或多个位点删除一个或多个氨基酸，和/或在氨基酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸。蛋白质衍生物的制备经常通过修饰编码天然蛋白的DNA序列、该修饰的DNA序列向适宜宿主中的转化和该修饰的DNA序列的表达以形成该衍生的蛋白质来达成。

相关的(和衍生的)蛋白质涵盖“变体”蛋白质。变体蛋白质会有少数几个氨基酸残基不同于亲本蛋白质，和/或变体蛋白质之间也会有少数几个氨基酸残基相互不同。在一些实施方式中，不同的氨基酸残基的数量是约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50中的任一种。在一些实施方式中，变体有约1至约10个氨基酸不同。

在一些实施方式中，相关蛋白质，例如变体蛋白质，包括至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％氨基酸序列同一性中的任一种。

此处使用的术语“类似序列”是指提供与参照蛋白质相似功能、三级结构和/或保守残基的蛋白质中的多肽序列。例如，在包含α-螺旋或β-折叠结构的表位区域中，在类似序列中取代的氨基酸保持了相同的结构元件。在一些实施方式中，提供类似的序列，其导致变体酶呈现与该变体所来源于的亲本蛋白质相似或提高的功能。

此处使用的“同源蛋白质”是指具有与参照蛋白质(例如不同来源的过水解酶)相似功能(例如酶活性)和/或结构的蛋白质(例如过水解酶)。同源物可来自进化相关或不相关的物种。在一些实施方式中，同源物具有与参照蛋白相似的四级、三级和/或一级结构，从而潜在地允许用同源物的类似区段或片段取代参照蛋白的区段或片段，而与用来自非同源蛋白的序列取代该区段或片段相比，具有对参照蛋白结构和/或功能降低的破坏。

此处使用的“野生型”、“天然的”和“天然发生的”蛋白质是那些在大自然中发现的蛋白质。术语“野生型序列”是指在大自然中发现或天然发生的氨基酸或核酸序列。在一些实施方式中，野生型序列是蛋白质工程方案(例如变体蛋白质的生产)的起始点。

此处使用的术语“漂白”是指处理诸如纤维、纱线、纺织品、衣服或无纺布材料等织物材料以产生颜色更浅的所述纤维、纱线、纺织品、衣服或无纺布材料的方法。例如，此处使用的漂白是指通过去除、修饰或掩蔽纤维或其他织物材料中的生色化合物来对织物增白。所以，“漂白”是指在适宜的pH和温度条件下处理织物足够长的时间，以有效增亮(即增白)织物。可以用化学漂白剂和/或酶促产生的漂白剂进行漂白。适宜漂白剂的例子包括但不限于ClO₂、H₂O₂、过酸、NO₂等。

此处使用的术语“漂白剂”涵盖能够漂白织物的任何部分。可能需要漂白激活剂。用于此处记载的过程、方法和组合物适宜化学漂白剂的实例为过氧化钠、过硼酸钠、高锰酸钾和过酸。在一些方面，H₂O₂当在原位已由酶促生成时，可以认为是化学漂白剂。“化学漂白剂组合物”包含一种或多种化学漂白剂。

术语“酶促漂白系统”或“酶促漂白组合物”包含能够酶促产生漂白剂的一种或多种酶和底物。例如，酶促漂白系统可包含过水解酶、酯底物和过氧化氢源，用于生成过酸漂白剂。

涉及含过水解酶的酶促漂白系统的“酯底物”是指包含酯键的过水解酶底物。包含脂肪族和/或芳香族羧酸和醇的酯可作为底物与过水解酶一起使用。在一些实施方式中，该酯源为乙酸酯。在一些实施方式中，该酯源选自一种或多种丙二醇二乙酸酯、乙二醇二乙酸酯、甘油三乙酸酯、乙酸乙酯和三丁酸甘油酯。在一些实施方式中，酯源选自一种或多种下列酸的酯：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十二烷酸、十四酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸。

术语“过氧化氢源”是指从外源性(即外部或外面)来源加入到织物处理浴中的过氧化氢，或通过生成过氧化氢的氧化酶对底物的作用而原位生成的过氧化氢。“过氧化氢源”包括过氧化氢以及能够自发或酶促产生过氧化氢作为反应产物的系统成分。

术语“产生过氧化氢的氧化酶”是指催化涉及分子氧(O₂)作为电子受体的氧化/还原反应的酶。在这样的反应中，氧被还原成水(H₂O)或过氧化氢(H₂O₂)。适用于此处的氧化酶为在其底物上产生过氧化氢(与水相对)的氧化酶。产生过氧化氢的氧化酶和适用于此处的其底物的例子为葡萄糖氧化酶和葡萄糖。其他可用于产生过氧化氢的氧化酶包括醇氧化酶、乙二醇氧化酶、甘油氧化酶、氨基酸氧化酶等。在一些实施方式中，该产生过氧化氢的氧化酶为碳水化合物氧化酶。

此处使用的“织物”是指纤维、纱线、纺织品、衣物和无纺布。该术语涵盖从天然、合成(例如制造的)和各种天然和合成混合物制备的织物。所以，术语“织物”涉及未加工和加工过的纤维、纱线、纺织过或编织的纺织品、无纺布和衣物。在一些实施方式中，织物包含纤维素。

术语“需要加工的织物”是指需要退浆、煮练、漂白和/或染色的织物，或可能需要其他处理例如生物抛光、生物石洗和/或软化的织物。

术语“需要漂白的织物”是指不参考其他可能的处理的条件下需要漂白的织物。这些织物可以已经进行过其他处理，也可以没有进行过其他处理。同样，这些织物可以需要或不需要后续处理。

“纺织品”是指纤维和/或纱线的经制造的装配品(manufacturedassembly)，其相对于其厚度具有实质表面积和足够的内聚力以产生可用于机械强度的装配品。

此处使用的术语“纯化的”和“分离的”是指污染物从样品的移除和/或从其天然相关的至少一种成分中移除的物质(例如蛋白质、核酸、细胞等)。例如，这些术语可指实质上或基本上无在天然状态下通常与之伴随的各成分的物质，例如，完整的生物系统。

术语“上浆”或“浆料”(size或sizing)是指用于织物工业中通过提高纱线抗磨损性和强度来改善织造性能的化合物。浆料通常由例如淀粉或淀粉样化合物制成。

此处使用的术语“退浆”是指从织物消除浆料(通常是淀粉)的过程，通常在进行具体的修整、染色或漂白之前进行。

此处使用的“退浆酶”是指用于酶促去除浆料的酶。示例性的酶为淀粉酶、纤维素酶和甘露聚糖酶。

此处使用的术语“煮练”是指去除杂质，例如棉织品或其他织物中天然发现的大部分非纤维素化合物(例如果胶、蛋白质、蜡质、籽屑等)。除了天然的非纤维素杂质，在一些实施方式中，煮练可以去除制造过程中引入的残余物质，例如纺纱、络筒或上浆润滑剂。在一些实施方式中，可以用漂白来从织物去除杂质。

术语“生物煮练酶(bioscouring enzyme)”是指能够去除至少一部分棉织品或其他织物中发现的杂质的酶。

术语“籽屑”是指即使在机械轧棉过程之后仍然存在于纤维上的诸如棉籽碎片、树叶、梗和其他植株部分等不需要的杂质。

此处使用的术语“本色的(英文发音同gray)”织物是指生产出来之后没有进行任何漂白、染色或修整处理的织物。例如，还没有修整(退浆、煮练等)、漂白或染色的从织布机上取下的任何机织或编织的织品都可以称为本色的织物。

此处使用的术语“染色”是指向例如织物施加颜色，尤其是通过浸入到染色溶液中进行的。

术语“非棉纤维素的”纤维、纱线或织品是指主要包括纤维素类成分而不是棉的纤维、纱线或织品。这类成分的实例包括亚麻、苧麻、黄麻、亚麻、人造纤维、莱赛尔(lyocell)、乙酸纤维素和源自非棉纤维素的其他相似成分。

此处使用的术语“果胶酸裂合酶”是指一种类型的果胶酶。“果胶酶”表示根据本领域技术限定的果胶酶，其中果胶酶是一组裂解果胶底物(主要是聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸酐)及其衍生物)糖苷键的酶(参见Sakai等人(1993)Advances in Applied Microbiology 39：213-294)。优选地，此处使用的果胶酶是通过反式消除催化果胶酸(也叫聚半乳糖醛酸)中的α-1，4-糖苷键的随机裂解的果胶酶，例如聚半乳糖醛酸酯裂解酶(EC4.2.2.2)(PGL)类，也叫做聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸酐)裂解酶，也叫果胶酸裂合酶。

术语“果胶”表示果胶酸酯、聚半乳糖醛酸和可以酯化至较高或较低程度的果胶。

此处使用的术语“角质酶”是指用于织物加工的植物、细菌或真菌来源的酶。角质酶是能够水解底物角质的脂解酶。角质酶能够分解在加工(例如煮练)织物中需要去除的脂肪酸酯和其他油类成分。“角质酶”表示具有显著的植物角质水解活性的酶。具体而言，角质酶对植物叶上发现的生物聚酯聚合物角质具有水解活性。适当的角质酶可以从许多不同的植物、真菌和细菌来源分离。

此处使用的术语“α-淀粉酶”是指裂解淀粉的α-(1-4)糖苷键以产生麦芽糖分子(α-葡萄糖的二糖)的酶。淀粉酶是发现于唾液中的消化酶，也由许多植物产生。淀粉酶分解长链碳水化合物(例如淀粉)为较小的单元。“氧化稳定的”α-淀粉酶与非氧化稳定的α-淀粉酶相比，特别是与该氧化稳定的α-淀粉酶所源自的非氧化稳定的α-淀粉酶相比，是抗氧化手段降解的α-淀粉酶。

术语“蛋白酶”表示源自微生物(例如，真菌、细菌)或源自植物或动物的蛋白质或多肽的蛋白质或多肽结构域，而且具有催化裂解蛋白质碳水化合物骨架一个或多个不同位点处肽键的能力。

此处使用的“个人护理产品”是指用于头发、皮肤、头皮和牙齿的清洁、漂白和/或消毒的产品，包括但不限于，香波、身体乳液、沐浴露、局部湿润剂、牙膏和/或其他局部清洁剂。在一些实施方式中，这些产品用在人身上，而在其他实施方式中，这些产品可用于非人的动物上，例如在兽医应用中。

此处使用的“悬浮液”或“分散液”是指其中不连续的固体相分散到连续的液相中的两相系统。

此处使用的“悬浮助剂”是指加入到液体组合物中来防止或减少悬浮颗粒的沉降或漂浮的物质。悬浮助剂通常通过增加载液的粘度或屈服应力来发挥作用。具有有效屈服应力的流体会仅仅当施加大于屈服应力的应力时才会流动，从而呈现剪切变稀和摇溶行为。有效的悬浮剂通常通过形成弱相互作用力桥接的颗粒或纤维的可逆网络来发挥作用。悬浮剂的实例包括但不限于黄原胶和微纤纤维素，例如

(CP Kelco，SanDiego，CA)。

此处使用的“封装的”是指包含在周围材料中的物质。这可以包括本领域已经记载的核/壳或基质形态(参见例如“Microencapsulation”Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，2005)。

此处使用的“可混溶的”是指一种液体能与另一种液体以两种液体的指定比例混合而不会分相。

此处使用的“基质”是指其中物质被包封或包埋的材料。

此处使用的“生物膜”是指包埋在细胞外聚合物基质和各种有机和无机化合物中的微生物的集合。虽然一些生物膜可能含有单个物种的微生物，通常生物膜不仅包括不同物种的微生物，还包括不同类型的微生物。例如藻类、原生动物、细菌及其他。

酶/底物共输送系统

本发明提供了一种用于共配制的酶和底物的液体输送系统，其中至少一种酶包封在聚合物基质中并与该酶的底物一起配制。该底物位于聚合物基质接触的基本上非水性的液相中，其中该聚合物基质不溶于该液相。包含酶的聚合物基质可悬浮在包含底物的液相中或围绕在包含底物的液相周围。在该输送系统中酶和底物不接触，其中酶催化反应不发生。当接触水时，聚合物基质溶于水而且在水中酶具有对底物的催化活性，催化反应发生。组合物中可包括一种或多种酶，其中至少一种酶包封在聚合物基质中。在一些实施方式中，该输送系统包含两种或多种酶，包封在相同的聚合物基质中或者不同的聚合物基质中，而且该输送系统包含这些酶中至少一种酶的底物。

底物可溶于基本上非水性载液或悬浮基本上非水性载液中，聚合物基质不溶于基本上非水性载液。选择载液和聚合物以便聚合物基质在储存过程中保持固体形式而且不会溶胀。这可以通过例如低水含量、可逆交联和/或低储存温度来达到。在一些实施方式中，该液相包含少于约5％、少于约1％或少于约0.5％的水，例如约4％，3％，2％，1％，0.9％，0.8％，0.7％，0.6％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％或0.1％的水。

输送系统储存过程中包封的酶基本上不与液相中的底物反应。在一些实施方式中，在约25℃储存至少约10天、2周、1月、2月、3月或更长期间内，液相中少于约20％，10％，5％，1％或0.5％的底物被转化成产物。在一些实施方式中，在约37℃储存至少约10天、2周、1月、2月、3月或更长期间内，液相中少于约20％，10％，5％，1％或0.5％的底物被转化成产物。在一些实施方式中，在约50℃储存至少约10天、2周、1月、2月、3月或更长期间内，液相中少于约20％，10％，5％，1％或0.5％的底物被转化成产物。

在本文所述的输送系统中，包封的酶在聚合物基质中保持至少约50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或基本上全部的初始催化潜力，可在接触水时释放，但是在25℃，37℃或50℃至少约10天、2周、1月、2月、3月或更长期间内基本上不与该底物反应。

聚合物基质

该聚合物基质包括、由下列物质组成或基本上由下列物质组成：不溶于包含底物的载液但是溶于水的聚合物。在一些实施方式中，该聚合物基质包括、由下列物质组成或基本上由下列物质组成：聚乙烯醇、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、或其衍生物或共聚物、或其混合物。在一些实施方式中，聚合物基质中包含一种或多种填料或增量剂(如淀粉，糖，陶土，滑石粉，碳酸钙，二氧化钛，纤维素纤维)，增塑剂(如甘油，山梨醇，丙二醇)，助溶剂，粘合剂，膨松剂(例如，聚丙烯酸酯，交联羧甲纤维素钠，甘醇酸淀粉钠，低取代羟丙基纤维素，半乳甘露聚糖，Water-Lok，ZapLoc)，或脱模剂。

在一些实施方式中，该聚合物为带负电荷的聚合物，如包括葡糖醛酸和/或半乳糖醛酸残基的杂多糖。这样的多糖例如可包括产生这些酶本身的有机体生产的材料，而且可以作为污染物保持在部分纯化的酶制品中，即使这些酶制品没有这些污染物，它们本身也有有用的酶活性。可选的或另外，这样的多糖可以以占该料浆至多约1-5WT％或更多的量单独加入。这样的量相当于那些酶本身的量。在一些实施方式中，这些多糖在喷雾干燥之前存在(或加入)。其他示例性聚合物为阿拉伯半乳聚糖、木糖半乳聚糖(xylogalalctans)，一般是酸性聚糖。

在一些实施方式中，该聚合物基质包括蛋白、肽或其衍生物。一些或全部蛋白或肽可存在于发酵液、细胞培养基或部分纯化的蛋白制品中，而且可以作为污染物保持在部分纯化的酶制品中，这些酶制品即使不含这些污染物但本身具有有用的酶活性。可选的或另外，这样的多糖可以以占该料浆至多约1-5WT％或更多的量单独加入。这样的量相当于那些酶本身的量。

在多种实施方式中，酶(和可选择底物)用包括但不限于溶剂流延(solvent casting method)，喷雾干燥，冷冻干燥/冻干，流化床喷涂，流化床结块(fluid-bed agglomeration)，喷雾冷却，湿法造粒，滚筒造粒，高剪切造粒，挤出，锅包衣法(pan coating)，凝聚，凝胶和雾化的技术包封于聚合物中在具体实施方式中，使用喷雾干燥。

通常，包封于聚合物基质中的酶小于50wt％。在多种实施方式中，包封于聚合物基质中的酶量为约0.01wt％至约50wt％、约0.1wt％至约25wt％，约1wt％至约10wt％，或约2wt％至约5wt％。

在一些实施方式中，含酶的聚合物基质为悬浮于包含底物的基本上非水性的液体中的颗粒形式。在多种实施方式中，颗粒直径约0.1至约1000，约50至约250，约100至约300，约200至约500，约400至约800，或约600至约1000微米。

在一些实施方式中，聚合物基质为厚度为约5至约1000，约50至约100，约100至约200，约200至约500，约500至约1000微米的膜形式。

在一些实施方式中，含酶的聚合物基质为膜形式，该膜形成围绕包含该底物的液相的封闭容器(例如袋子、小袋或胶囊)。

酶

在各种实施方式中，输送系统包含一种或多种蛋白酶、酯酶、丝氨酸水解酶、脂肪酶、过水解酶、氧化酶、酚氧化酶、漆酶、酰基转移酶、芳基酯酶、过水解酶、淀粉酶、果胶酶、木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、碳水化合物氧化酶、甘露聚糖酶、植酸酶、果胶酶、过氧化物酶、糖类氧化酶、角质酶、过氧化氢酶或其混合物。

在一个实施方式中，输送系统包含漆酶(多铜氧化酶，EC1.10.3.2例如来自Cerrena unicolor)和漆酶的中介物(底物)，如2，2′-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，丁香腈(SN)，丁香酰胺(SA)和甲基丁香酯(MS)或10-羧丙基吩噻嗪(PTP)或欧洲专利No.1064359，1141321或0805465、美国专利No.6,329,332，PCT申请No.00/05349，或美国公开No.2008/0196173中公开的中介物。

在一个实施方式中，漆酶包括、由下列物质组成或基本上由下列物质组成：如下SEQ ID NO：1所描述的氨基酸序列，或其变体或同源物，其具有至少70，75，80，85，86，87，88.89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，乃至99％或更多序列同一性，或PCT申请号WO2008/076322所描述的氨基酸序列，或其变体或同源物，其至少具有70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99，乃至99.5％或更多序列同一性。 AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDV P DQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRF RL VSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKTVGGPA QSP LNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPF HLHG HNFWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQ

在一些实施方式中，输送系统包含过水解酶(例如，酰基转移酶、芳基酯酶)和底物以产生过酸(例如酰基供体，如酯底物，例如丙二醇二乙酸酯(PGDA))，和过氧化氢源(如，过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化脲)，或酶催化的过氧化氢产生系统，例如，产生过氧化氢的氧化酶和其底物(如，葡萄糖氧化酶和葡萄糖)。

在一些实施方式中，其过水解酶是天然存在于耻垢分枝杆菌的过水解酶。在一些实施方式中，过水解酶包括、由下列物质组成或基本上由下列物质组成：SEQ ID NO：2所述氨基酸序列或其变体或同源物。在一些实施方式中，过水解酶包括、由下列物质组成或基本上由下列物质组成与SEQ ID NO：4所述氨基酸序列具有至少约80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，甚至99.5％或以上的同一性之氨基酸序列。

耻垢分枝杆菌过水解酶的氨基酸序列如下所示：

MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGLSARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVIIMLGTNDTKAYF RRTPLDIALGMSVLVTQVLTSAGGVGTTYPAPKVLVVSPPPLAPMPHPWFQLIFEGGEQKTTELARVYSALASFMKVPFFDAGSVISTDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL(SEQ ID NO：2)

相应编码耻垢分枝杆菌过水解酶多聚核苷酸序列(5′-3′)为：

ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGCTGGGTCCCCGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCGCTGGACCGGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGCACCACCAACATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCAACGGCGCGAGCTACCTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTCGACCTGGTGATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACCCCGCTCGACATCGCGCTGGGCATGTCGGTGCTCGTCACGCAGGTGCTCACCAGCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTGGTGGTCTCGCCGCCACCGCTGGCGCCCATGCCGCACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAGGGCGGCGAGCAGAAGACCACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCGTCGTTCATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCACCGACGGCGTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGGCCCTCGCGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTAA-3’(SEQ ID NO：3).

在一些实施方式中，过水解酶包括在一个或多个氨基酸位点的一个或多个取代，其位点相当于如SEQ ID NO：2所述耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列的位点。在一些实施方式中，过水解酶包括任何一项选自下述氨基酸的取代或其任何组合，M1，K3，R4，I5，L6，C7，D10，S11，L12，T13，W14，W16，G15，V17，P18，V19，D21，G22，A23，P24，T25，E26，R27，F28，A29，P30，D31，V32，R33，W34，T35，G36，L38，Q40，Q41，D45，L42，G43，A44，F46，E47，V48，I49，E50，E51，G52，L53，S54，A55，R56，T57，T58，N59，I60，D61，D62，P63，T64，D65，P66，R67，L68，N69，G70，A71，S72，Y73，S76，C77，L78，A79，T80，L82，P83，L84，D85，L86，V87，N94，D95，T96，K97，Y99F100，R101，R102，P104，L105，D106，I107，A108，L109，G110，M111，S112，V113，L114，V115，T116，Q117，V118，L119，T120，S121，A122，G124，V125，G126，T127，T128，Y129，P146，P148，W149，F150，I153，F154，I194，和F196。

在一些实施方式中，过水解酶包括在一个或多个氨基酸位点的一个或多个以下取代，其位点相当于如SEQ ID NO：2所述耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列的位点：L12C，Q或G；T25S，G或P；L53H，Q，G或S；S54V，L A，P，T或R；A55G或T；R67T，Q，N，G，E，L或F；K97R；V125S，G，R，A或P；F154Y；F196G。

在一些实施方式中，过水解酶包括在氨基酸位点的氨基酸取代的组合，其位点相当于如SEQ ID NO：2所述耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列的氨基酸位点：L12I+S54V；L12M+S54T；L12T+S54V；L12Q+T25S+S54V；L53H+S54V；S54P+V125R；S54V+V125G；S54V+F196G；S54V+K97R+V125G；或A55G+R67T+K97R+V125G。

在一些实施方式中，液体悬浮液包含过水解酶和底物以产生单甘油酯或甘油二脂(如，酰基供体和醇受体)或山梨聚糖酯(如，酰基供体和山梨聚糖)。在一些实施方式中，液体悬浮液含有过水解酶和底物以产生芳香酯，例如，苄酯(如，酰基供体和挥发性醇，例如，苄醇)

在一些实施方式中，酶是过水解酶且输送系统包含酯底物或酯底物的混合物，例如，醋酸酯，例如，丙二醇二乙酸酯(PGDA)，醋酸乙酯，醋酸丁酯，乙酸己酯，乙酸辛酯，丙酸乙酯，丙酸丁酯，丙酸己酯，醋酸异戊酯，香茅醇乙酸酯，香茅醇丙酸酯，醋酸十二烷基酯，Neodol 23-3醋酸酯，Neodol 23-9醋酸酯，乙二醇二乙酸酯，甘油三乙酸酯，三丁酸甘油酯，甲氧基乙酸乙酯，乙酸芳樟酯，丁酸乙酯，异丁酸乙酯，乙基-2-甲基丁酸酯，异戊酸乙酯，异戊酸二乙酯，马来酸二乙酯，乙醇酸乙酯，或其混合物。

在一些实施方式中，输送系统包含包封在相同或不同的聚合物基质中的蛋白酶和至少一种其他蛋白酶敏感的酶，即可由蛋白酶水解的酶，或蛋白酶和蛋白酶敏感的酶其一是包封在聚合物基质中且其他酶在输送系统的液相中，并且蛋白酶对蛋白酶敏感的酶实质上没有催化活性，直到向输送系统中加入水。

载体液体

输送系统在载体液体中包括包封酶的底物，其中聚合物基质(酶被包封在其中)基本上是不溶的。载体液体的非限制性实例包括乙二醇，非离子表面活性剂，乙醇，聚乙二醇，和醋酸酯。在一些实施方式中，载体液体本身，是酶的底物。

可选的辅助成分

在一些实施方式中，输送系统包括一种或多种表面活性剂，即，非离子，阴离子，阳离子，两性，兼性离子的，或半极性非离子表面活性剂，或其混合物。在一些实施方式中，传递系统包括一种或多种：悬浮助剂，螯合剂，稳定剂，乳化剂，缓冲剂，和/或其混合物。

组合物

本发明提供如本文所述的包含酶/底物共同输送系统的组合物。典型的组合物包括：清洁组合物，消毒组合物，去污组合物，纺织加工组合物，漂白组合物，纺织印染组合物，个人护理组合物，染发组合物，纸浆或纸张加工组合物，生产木材复合物的组合物，废水处理组合物，烘焙组合物，酿造组合物，动物饲料组合物，淀粉加工组合物，和/或乙醇发酵组合物。输送系统可以存储在组合物中或可在使用时混合到组合物中。

在一个实施方式中，洗涤剂组合物是供清洗应用使用。除了在此所述的酶/底物共同输送系统，洗涤剂组合物可能包含一种或多种洗涤剂成分，选自表面活性剂，助洗剂，漂白剂，漂白剂的前体，酶稳定剂，络合剂，螯合剂，发泡调节剂，防腐蚀剂，防静电剂，染料，香料，杀菌剂，杀真菌剂和活化剂。输送系统可以存储在洗涤剂组合物中或可在使用时混合到组合物中。

使用方法

清洁方法

在此所述酶/底物共同输送系统可用于清洁方法。在一些实施方式中，本发明提供清洁方法，包括水存在下使用清洁剂组合物接触带有污渍的物品，该组合物包含在此所述的酶/底物共同输送系统，其中至少去除一部分污渍。在此所述清洗方法所适合使用的酶包括但不限于，蛋白酶，淀粉酶，过水解酶，氧化酶，脂肪酶，纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，酯酶，角质酶，聚酯酶，果胶酶，酚氧化酶，过氧化氢酶，溶菌酶和半纤维素。

在一个实施方式中，本发明提供了在洗涤过程中抑制染料从染色织物转移到其他织物的方法，包括水存在下的在此所述的酶/底物共同输送系统，其中输送系统包含具漂白能力的酶，例如，酚氧化酶，如漆酶，或过氧化物酶，其至少有一部份沥滤自染色的和/或脏的织物的有色物质被漂白，从而防止有色物质在洗涤时再沉积在其他织物上。

纺织品加工方法

所述酶/底物共同输送系统可用于纺织品加工方法。在一些实施方式中，本发明提供漂白织物的方法，包括在水存在时，并且在适宜衡量纺织品漂白作用的条件下，用含有至少一种具有漂白能力的酶和底物的酶/底物共同输送系统接触织物一段时间，例如，过水解酶和产生过酸的底物或酚氧化酶(例如，漆酶)和产生漂白效果能力的中介物，从而产生漂白纺织品。在一些实施方式中，本发明提供了改变纺织品颜色(例如，染色的纺织)的方法，其中包括在水存在时，并且在适宜衡量纺织品颜色变化的条件下，将纺织品接触含有能够改变纺织品颜色的酶和底物的酶/底物共同输送系统，例如，酚氧化酶(例如，漆酶)，和能够影响颜色变化的中介物，在水存在下，一段时间长度和在适合条件下，以能够衡量纺织，从而产生颜色变化的纺织品。

在一些实施方式中，本发明提供单一过程中联合预处理纺织品的方法，其中的酶/底物共同输送系统包括至少两中纺织品加工酶。例如，用于退浆，煮练和漂白的联合方法，包括在此所述的过水解酶和底物(例如，酯底物和过氧化氢源)，和淀粉酶和果胶酶。联合煮练和漂白过程，包括在此所述的过水解酶和底物和果胶酶。联合退浆和漂白过程，包括在此所述的过水解酶和底物和淀粉酶。在此所述的联合纺织品预处理方法中的果胶酶可单独使用或与一种或更多种酶联合使用，如蛋白酶，脂肪酶，纤维素酶，角质酶，和/或半纤维素酶。

用过水解酶消毒、灭菌和/或去污的方法

本发明的酶/底物共输送系统(和含有这些组合物的相关系统和试剂盒)可用在去污、杀菌和/或消毒物品的一系列方法中。

在一些实施方式中，去污的方法包括：(a)提供此处所述的酶/底物共输送系统，所述共输送系统包括：包封于水溶性聚合物中的具有过水解酶活性的酶，其中所述活性包括至少2∶1的过水解与水解的比例；过氧化氢源；和酯底物；和(b)将该组合物加入到水中，在足以溶解该聚合物基质的条件和时间长度和小于约9.0的pH下混合，以产生以重量计至少约0.16％过乙酸的水溶液，例如至少约20分钟；和(c)将包含污染物的物品暴露至该溶液。

在一些实施方式中，去污的方法包括：(a)提供酶/底物共输送系统，所述共输送系统包括包封于水溶性聚合物中的酰基转移酶、过氧化氢源和丙二醇二乙酸酯；(b)将该组合物加入到水中，在足以溶解该聚合物基质的条件和时间长度下混合，以产生以重量计至少约0.16％过乙酸的水溶液，例如至少约20分钟；和(c)将包含污染物的物品暴露至该溶液。

在一些实施方式中，过氧化氢源为产生过氧化氢的化合物，例如选自过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化脲。在一些实施方式中，过氧化氢源为酶促系统，例如产生过氧化氢的氧化酶及其底物，例如葡萄糖氧化酶和葡萄糖。产生过氧化氢的氧化酶可以包封于聚合物基质(与过水解酶包封的聚合物基质相同或与之分离)中或溶于或悬浮于该输送系统的液相中。产生过氧化氢的氧化酶的底物可以包封于聚合物基质(与过水解酶包封的聚合物基质相同或与之分离)中或溶于或悬浮于该输送系统的液相中。

取决于要去除的污染物的具体类型，暴露物品至过酸溶液的步骤可以在宽范围的时间阶段内进行。例如，在某些消毒过程中，短至约30秒、1分钟、5分钟或10分钟的暴露时间可能就足够了。然而，在其他应用中(例如去除生物膜)，可能需要暴露该物品相当长的时间阶段，例如约30分钟、1小时、6小时、12小时、24小时或更长，以达到足够的去污水平。

同样，可根据污染物的具体类型来调节暴露步骤中过酸溶液的温度。在一个实施方式中，暴露温度为溶液制备的环境温度，例如通常为约18-25℃。在其他实施方式中，可用更高的温度来促进去污过程。通常，较高温度会加速过酸溶液的反应性，从而加速去污过程。所以，在一些实施方式中，暴露步骤可以用约30℃，37℃，45℃，50℃，60℃，75℃，90℃或更高温度的过酸溶液进行。

在该方法的一个实施方式中，含酶的聚合物基质为水溶性容器的形式，其中底物封闭于液相中，该容器被加入到水中。

去污方法可用于广泛的污染物，包括：选自由肉毒杆菌毒素、炭疽毒素、蓖麻毒素、鲭鱼毒素、雪卡毒素、河豚毒素、真菌毒素及其任意组合组成的组中的毒素；和选自由细菌、病毒、真菌、寄生虫、朊病毒及其任意组合组成的组中的病原体。例如此处公开的方法可用于下述物质污染的材料的去污，包括但不限于有毒化学品、芥子气、VX毒剂、炭疽杆菌(B.anthracis)孢子、鼠疫杆菌(Y.pestis)、F.tularensis、真菌和毒素(如肉毒杆菌、蓖麻毒素、真菌毒素等)，以及感染性病毒颗粒感染的细胞(如，黄病毒、正粘病毒、副粘病毒、沙拉病毒、棒状病毒、虫媒病毒、肠道病毒、布尼亚病毒等)的。在一些实施方式中，所述至少一种病原体选自芽孢杆菌属物种、炭疽杆菌、梭状芽孢杆菌属物种、肉毒梭菌(C.botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、李斯特菌属物种、假单胞菌属物种、葡萄球菌属物种、链球菌属物种、沙门氏菌属物种、志贺菌属物种、大肠杆菌、耶尔森菌属物种、鼠疫菌(Y.pestis)、弗朗西斯菌属物种、F.tularensis、弯曲杆菌属(Camplyobacter)物种、弧菌属物种、布鲁氏杆菌属物种、隐孢子虫属物种、贾第虫属物种、环孢子虫属物种和毛线虫属物种。

用此处所述的输送系统产生的过酸溶液及其使用方法对于生物膜去污有效。生物膜的一个特征是其中的微生物合作或协同作用。经验上发现生物膜中存活的微生物比在生物膜之外的微生物能够更好地抗微生物剂。所以，病原性生物膜的去除代表在去污和/或消毒器械中的一个特别困难的问题。

在一些实施方式中，用来产生过酸溶液的稳定的组合物用于去除生物膜，包括选自下组的一种或多种病原性细菌所形成的生物膜：芽孢杆菌属物种、炭疽杆菌、梭状芽孢杆菌属物种、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、李斯特菌属物种、假单胞菌属物种、葡萄球菌属物种、链球菌属物种、沙门氏菌属物种、志贺菌属物种、大肠杆菌、耶尔森菌属物种、鼠疫菌、弗朗西斯菌属物种、F.tularensis、弯曲杆菌属物种、弧菌属物种、布鲁氏杆菌属物种、隐孢子虫属物种、贾第虫属物种、环孢子虫属物种和毛线虫属物种及其任意组合。在一个实施方式中，本发明的方法制备的过酸溶液可用于生物膜的去污，所述生物膜选自下组中：绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SRWC-10943)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(ATCC19112)及其任意组合。

在一个实施方式中，通过在45℃暴露至0.16wt％PAA溶液(从含过水解酶的酶/底物共输送系统中产生)中45分钟可以基本上除去(即减少约500-1000倍)污染不锈钢器械的包含假单胞菌属、葡萄球菌属和/或李斯特菌属的细菌培养物的病原性生物膜。

在多种实施方式中，用此处所述的包含过水解酶的输送系统去污的方法用于消毒/去污广泛的污染物品，包括硬表面、织品、食物、饲料、衣服、地毯、小地毯、织物、医疗器械、兽医器械，例如用于药物和生物技术过程的不锈钢物品和装置，包括大的反应器。

用此处所述的输送系统酶促产生的过酸溶液非常适用于清洁不锈钢物品和装置，因为水溶液中过酸与产生的相应酸的比例大大高于市售的溶液。例如，用MsAcT的S54V变体、过碳酸盐和丙二醇二乙酸酯(PGDA)的稳定组合物产生的过乙酸(PAA)溶液将具有大约10∶1的PAA与乙酸的比例。而市售的PAA溶液通常含有比PAA多的乙酸，甚至具有相反的比例(1∶10)。升高的PAA与乙酸的比例降低或完全避免了在PAA处理之后对不锈钢物品或装置进行进一步钝化处理的需要。所以，在一些实施方式中，用本发明的稳定组合物产生的过酸溶液可用于消毒用于药物和生物技术过程的不锈钢物品和装置，包括大反应器。在一些实施方式中，过酸溶液可用于在单个步骤中消毒不锈钢物品和装置，而不需任何进一步用钝化剂对该不锈钢的处理。

在又一些实施方式中，此处所述的输送系统可用于食品和/或饲料的去污，包括但不限于蔬菜、水果和其他食品和/或饲料物品。实际上，可预期的是本发明可用于水果、蔬菜、蛋、肉等的表面清洁。实际上，预期本发明可用于食品和/或饲料工业来从各种食物和/或饲料物品去除污染。在一些实施方式中，本领域技术人员已知的食品药品管理局和/或其他食品安全实体所设定的食物和/或饲料去污的方法都可以使用本发明。

在进一步的实施方式中，需要去污的物品选自硬表面、织品、食物、饲料、衣服、地毯、小地毯、织物、医疗器械和兽医器械。在一些实施方式中，食物选自水果、蔬菜、鱼、海鲜和肉。在一些进一步的实施方式中，硬表面选自家居表面和工业表面。在一些实施方式中，家居表面选自厨房工作台、水槽、茶几、切削板、桌子、架子、食物准备储存区域、浴室用具、地板、天花板、墙壁和卧室区域。在一些备选的实施方式中，工业表面选自食品加工区域、饲料加工区域、桌子、架子、地板、天花板、墙壁、水槽、切削板、飞机、汽车、火车和轮船。

试剂盒

本发明还提供包括多个部分试剂盒或多个试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒提供此处所述的酶/底物共输送系统，和在应用中使用的说明书，包括任何此处所述的方法(例如清洁方法或织物加工方法)，其中当稀释到水中时酶活性可用。提供适宜的包装。此处使用的“包装”是指习惯用于系统的固体基质或材料，并能够将此处所述的试剂盒的成分维持在固定的范围内，所述成分例如酶/底物共输送系统。

说明书可以以印刷形式或电子介质的形式提供，例如软盘、CD或DVD，或以能够得到说明书的网址的形式提供。

下列实施例意在说明而不是限制本发明。

实施例

实施例1

用溶剂流延方法制备含酶的聚乙烯醇(PVA)基质。一份液体酶浓缩物(约35mg/ml酶)加入到9份10％聚合物溶液中，充分混合。将该溶液铺展到玻璃片上，室温干燥。干燥的聚合物膜含有约3.5质量％的酶，厚约50-100μm。把这些膜切到4mm直径的圆盘，用于后续实验。

用于该实验中的PVA聚合物是两种不同的杜邦商品级别：Elvanol51-05(88％水解，500标称聚合度)和Elvanol 71-30(98％水解，1500标称聚合度)。

酶沥滤

为了评价酶的沥滤，37℃下将圆盘在玻璃瓶中丙二醇二乙酸酯(PGDA)中孵育约46小时。孵育之后，从玻璃瓶中取出圆盘，过量的PGDA用纸巾吸除。将圆盘放到4ml H₂O中溶解PVA。用pNB速率法测量各个预孵育的圆盘中的酶活性，与新鲜切下，未进行PGDA孵育的圆盘的活性比较。

pNB速率法如下所述：

反应方程式：

对硝基苯丁酸盐                丁酸酯                对硝基苯酚盐

(“pNB”，无色)                                        (黄色)

分析缓冲液(100mM的Tris pH值8.0+0.1％的Triton X-100)

将100mL 1M Tris(pH8.0)和1.0mL Triton X-100稀释到Milli-Q水中，制得1000mL。

底物储液(100mM对-硝基苯丁酸盐，溶于DMSO)

将174.3μL pNB加入到10mL DMSO中，制得10mL。

分成1mL等份，并储存于-20℃。工作液置于室温下，当背景黄色变得不可接受的高时抛弃。

单比色皿方案

1.在25℃用标准AAPF实验程序设定分光光度计。

2.在一次性1mL比色皿中将10μL底物储液稀释至1ml试验缓冲液。25℃下平衡。

3.用10μl酶溶液起始反应。

4.启动分光光度计。

5.测定速率(ΔA₄₁₀/min)。

结果示于下表1中。

织物漂白

三片每个3in.x 4in.的100％棉织物样片(Testfabrics，style#428U，退浆的棉缎)和三个每个3in.x 4in.的棉毛布样片在含有或不含PVA过水解酶盘的耐洗牢度试验仪中洗涤，条件如下：

液比：50∶1

pH 7(100M磷酸钠缓冲液)

温度：60℃

PGDA：4ml/l

H₂O₂(50％)：4ml/l

孵育时间：60min

过水解酶：七个5/32英寸PVA过水解酶盘

关于100％棉缎样片的漂白性能，通过用Minolta CR-200色度计测量CIE L＊值来定量。较高的CIE L＊值表明较高漂白效果。结果示于表1。包括棉毛布作为压载物，棉毛布的漂白没有被评价。

无酶对照包括除了PVA过水解酶植物所有上述成分。

表1

实施例2

直径5/32英寸的圆盘从约50-100μm厚而且含有包封的过水解酶和α-淀粉酶的PVA膜(Elvanol 51-05)(PVA过水解酶/α-淀粉酶盘)。如上所述，将酶包封于聚合物基质中，只是9份10％聚合物溶液对各1份过水解酶浓缩液和淀粉酶浓缩液。得到的聚合物膜每种酶的含量为约2.5质量％。

酶沥滤

为了评价酶从这些盘中的沥滤，在37℃下将三个盘在具有或没有PGDA的密封玻璃瓶中孵育60小时。从瓶中取出后，各个盘溶于4mlMilli-Q水中。用从Megazyme International Ireland Limited得到的Ceralpha速率检测试剂盒测量α-淀粉酶活性。通过在过量的热稳定α-葡糖苷酶存在下的封闭对硝基苯麦芽庚糖苷的水解，得到对硝基苯麦芽庚糖苷片段向葡萄糖和游离对硝基苯酚的定量水解，以评价α淀粉酶活性。如实施例1所述用pNB速率实验测量过水解酶活性。结果示于下表2中。过水解酶活性(＊)是6次测量的平均值(每盘2次)，淀粉酶活性是3次测量的平均值(每盘1次)。两个酶的活性都用ΔA₄₁₀/min表示。

表2

织物漂白和退浆

三片每个3英寸x4英寸的本色棉缎织物样片(Testfabrics，型号#428R)和三个每个3英寸x4英寸的本色棉毛布样片在含有或不含PVA过水解酶/淀粉酶盘的耐洗牢度试验仪中洗涤，条件如下：

液比：50∶1

pH：7(100mM磷酸钠缓冲液)

温度：60℃

PGDA：4ml/l

H₂O₂(50％)：4ml/l

孵育时间：60min

酶：十五个5/32英寸PVA过水解酶/淀粉酶盘

为了评价退浆，从每个处理过的本色样片切下5/8英寸织物盘，然后室温下用碘溶液染色1分钟。然后用冷水漂洗织物盘，用擦拭巾轻拍，然后用Minolta CR-200色度计测量盘的颜色。计算CIE L＊值来定量碘染色的深度。如实施例1所述评价对样片的漂白性能。织物盘上越浅的颜色表示存在越少的淀粉，指示越高的退浆效果。结果示于下表3中。

表3

实施例3

来自Cerrena unicolor的漆酶，如PCT申请No.WO 2008/076322所述，包封于Elvanol 52-22聚乙烯醇中(88％水解，1300标定聚合度)，其在室温下溶于水。聚合物膜包含1.5质量％漆酶，8.5质量％来自发酵的非酶超滤浓缩固体和90质量％聚合物。直径5/32英寸的圆盘从含有包封的漆酶的PVA膜上切下(PVA漆酶盘)。该酶如实施例1中包封于聚合物中。

酶沥滤

用三个不同的漆酶中介物作为该酶的底物，评价PVA漆酶盘的酶沥滤。

1.ABTS

将两个PVA漆酶盘插入到具有1ml含有1wt％ABTS(二铵2，2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)的PGDA溶液的玻璃瓶中，并在室温下孵育10天(图2中的瓶2)。没有PVA漆酶盘的相同制品制备为阴性对照(图2中的瓶1)。此外，两个PVA漆酶盘溶解于100μl去离子水中，然后加入到含有1ml包含1％ABTS的PGDA的瓶中，作为阳性对照(图2中的瓶3)。监测这些溶液的颜色改变作为酶沥滤的指征。

室温下孵育约10天，在瓶1和2中没有观察到颜色变化。然而，溶解的漆酶一加入到瓶3中，其溶液颜色就变为暗绿色，这表明漆酶和中介物的反应。

2.SA

将两个PVA漆酶盘插入到具有1ml含有1wt％丁香酰胺(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酰胺；“SA”)的PGDA溶液的玻璃瓶中，并在室温下孵育10天(图3中的瓶4)。没有PVA漆酶盘的相同制品制备为阴性对照(图3中的瓶5)。此外，两个PVA漆酶盘溶解于100μl去离子水中，然后加入到含有1ml的包含1％SA的PGDA的瓶中，作为阳性对照(在图3中的6)。

含有溶解的漆酶的溶液(6)颜色从浅黄变为褐色，表示漆酶与中介物反应。但是，具有包封的酶盘(4)的相同制品在10天的孵育中不会改变颜色，这些结果说明包封的漆酶没有与SA在PGDA溶液中反应。

室温下孵育10天之后，离心孵育溶液，用分光光度计测量420nm处的吸光度。结果示于下表4中。

表4

3.SN

将两个PVA漆酶盘插入到具有1ml含有5wt％丁香腈(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲腈；“SN”)的PGDA溶液的玻璃瓶中，并在室温下孵育10天(图4中的瓶8)。没有PVA漆酶盘的相同制品制备为阴性对照(图4中的瓶7)。此外，两个PVA漆酶盘溶解于100μl去离子水中，然后加入到含有1ml包含1％SN的PGDA的瓶中，作为阳性对照(在图4中的9)。

1个小时内，瓶9的颜色变成绿褐色，表示漆酶与SN反应。瓶7和8的颜色在10天的孵育阶段中没有改变。

应用试验

牛仔布的制备

退浆的硫磺黄底/靛蓝色染色牛仔布和退浆的100％靛蓝色染色牛仔布在55℃和pH4.8下在具有1g/L

44L纤维素酶的Unimac(50lb实验室规模)滚筒洗衣机中处理60分钟，液比为10∶1，然后进行两次漂洗，并干燥。

5/8英寸直径的圆织物样片从纤维素酶预处理过的牛仔布织物上切下用来进行下述12孔微滴定板实验。3英寸x4英寸织物样片从纤维素酶预处理过的牛仔布织物上切下，然后将边缘缝上以防止处理中磨损，用来进行下述耐洗牢度试验仪实验。

漂白性能的评价

为了定量漂白效果，在处理前后用Minolta的色度计CR-200测量每个牛仔布织物样片的反射计读数。总色差(ΔE)用下来公式计算：

总色度差 $\left(\mathrm{\ΔE}\right)=\sqrt{(\mathrm{\Δ}{L}^2+\mathrm{\Δ}{a}^2+\mathrm{\Δ}{b}^2)},$

其中ΔL，Δa，Δb的CIE L＊，CIE a＊和CIE b＊在漆酶漂白前后分别不同。

12孔微滴定板实验

5/8直径预处理牛仔布样片在下列条件下于12孔微滴定板中孵育：

1.仅有缓冲液

2.缓冲液+含5％SN的50μl的PGDA溶液

3.缓冲液+含5％SN+包封的漆酶的50μl的PGDA溶液

12孔微滴定板实验(2ml反应体积)

pH：6(50mM乙酸钠水缓冲液)

温度：60℃

孵育时间：60分钟

酶：每次检测5，5/32”英寸的漆酶包封膜盘

中介物：每次检测含5％丁香腈的50μl的PGDA溶液

结果示于图5中。当牛仔布样片与PVA漆酶盘孵育时观察到显著的的漂白效果。结果清楚地表明了水激发了漆酶从其所包封的聚合物膜中的释放，使其接近中介物，从而酶与中介物反应，导致了漂白。

耐洗牢度试验仪实验

在下列条件下在耐洗牢度试验仪中孵育3英寸x4英寸的纤维素酶预处理的牛仔布样片：

(A)含5％SN的1ml PGDA溶液

(B)含5％SN和0.15g包封的漆酶的1ml PGDA溶液

(C)含5％ABTS的1ml PGDA溶液

(D)含5％ABTS和0.15g包封的漆酶的1ml PGDA溶液

耐洗牢度试验仪(250ml总反应体积)

pH：6(50mM乙酸钠水缓冲液)

温度：60℃

孵育时间：60分钟

酶：0.15g包封的漆酶膜切成小的随机片

中介物：

丁香腈(SN)

二铵2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)(ABTS)

结果列于表5和图6中。用制品(B)(漆酶+SN共输送系统)处理的牛仔布样片被显著漂白。用制品(D)(漆酶+ABTS共输送系统)处理的牛仔布样片的颜色被染成了浅紫色。

表5

实施例4

稳定的酶漂白系统

此实施例说明了酶在聚合物基质中的包封如何可用于稳定单瓶酶促漂白或消毒系统。单瓶系统设计为用水稀释时产生过乙酸。其成分为：过硼酸钠、丙二醇二乙酸酯(PGDA)和芳基酯酶和非水性载液。在该实施方式中，载液为醇乙氧基化物非离子表面活性剂(Novel 1012-6，来自SasolCo.；Hamburg，DE)。

以两种方式把ArE酶成分加入该系统中：(1)直接从液体酶浓缩物加入和(2)作为喷雾干燥的粉末包封于聚合物中加入。该聚合物为羟丙甲基纤维素(HPMC，Methocel E5Premium LV，来自Dow Chemical Co.，Midland，MI，USA)。进行喷雾干燥以使得干燥的粉末为75％(质量)HPMC。

对于酶浓缩物和包封的酶，6个试管中每个加入12.5μg活性ArE，每个试管中包含1g载液，135mg过硼酸钠和2mg的PGDA。对于每套的六个试管，将其中的三个引发(用9ml Tris，pH 9.0缓冲液)和如下所述检测过乙酸。其他三个试管在37℃孵育5天，然后引发和检测过乙酸。

检测过乙酸

材料和方法：

过乙酸：Sigma-Fluka P/N 77240；L/N 11244491，38.8％(5.115M，F.W.＝76.05g/mol)，过乙酸。

2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：Fluka P/NWA10917，L/N 113555254804068，99+％纯(HPLC)，F.W.＝548.64g/mol

柠檬酸：Sigma P/N C1857，L/N 0054K0001，F.W.＝192.13

碘化钾(KI)：P/N Sigma P4286，L/N 124K0151，F.W.＝166.0

储液：

125mM柠檬酸，用NaOH调节pH至5.0，0.22μm过滤除菌，在室温下无限期稳定直至增长明显(在此pH下通常是真菌)。

100mM ABTS溶于Milli Q(MQ)H₂O中。每份500μl，在-20℃储存至多六个月。

25mM KI溶于MQ H₂O。室温下无限期稳定。

工作底物：

1.将50ml的125mM柠檬酸缓冲液储液加入到不透光的容器中(可以用铝箔包住玻璃瓶)

2.熔化1份500μL的ABTS储液，加入到该柠檬酸溶液中。

3.向柠檬酸中加入25mM KI 100μL。

4.轻轻涡旋混合并盖盖。室温储存于暗处时溶液能够保持至多54小时。

生成标准曲线：

1.获得储存的过乙酸(通常～39％；～390g/L；390(g/L)/76.05(g/mol)～5.13M。

注意：实际浓度应通过CofA报告的实际检测数来测定。

2.向125mM柠檬酸中制备PAA储液的1∶100稀释液。盖盖，涡旋15秒。

3.取步骤2中的1∶100稀释液，将其以1∶100稀释至125mM柠檬酸中(这将得到PAA储液的1∶10000稀释液)。盖盖，涡旋15秒。PAA的浓度现在是～5000mM/10000＝～0.5mM＝～500μM。

4.取步骤3的溶液，将4份标准液(步骤3中的该约500μM标准液)稀释至1份柠檬酸中，得到约400μM的标准液。

5.取步骤3的溶液，将3份标准液(步骤3中的该约500μM标准液)稀释至2份柠檬酸中，得到约300μM的标准液。

6.取步骤3的溶液，将2份标准液(步骤3中的该约500μM标准液)稀释至3份柠檬酸中，得到约200μM的标准液。

7.取步骤3的溶液，将1份标准液(步骤3中的该约500μM标准液)稀释至4份柠檬酸中，得到约100μM的标准液。

检测：

1.在微滴定板中，放入20μl的所有标准液，沿行方向或列方向逐渐稀释的顺序，重复三行或三列(每孔一个标准液)。

2.标准曲线的末端，向三个孔中加入20μl柠檬酸(作为空白对照)。

3.在隔开的行或列放置20μl稀释的样品至三个孔中。

4.向底物盆(或干净的培养皿盖或底，或干净的吸头盒盖)中倾倒适量的工作底物。

5.用多通道移液器，向具有标准液、空白或样品中的各个微滴定板孔中加入200μl底物。

6.用计时器使反应进行3分钟(±0.5分钟)。

7.在微滴定板读书器中于420nm读取各孔读数。

8.将数据转移至Excel，或用读书器程序生成标准曲线，用标准数据通过线性回归计算斜率和y截距(计算平均值、SD等)。

9.利用y＝m＊x+b，用斜率和截距计算样品浓度，乘以样品稀释系数。

结果

将每套三个试管各自的过乙酸结果取平均值，并制表。结果示于下表6中。包封的样品在37℃，5天后表现出显著升高的稳定性。

表6

虽然已经为清楚理解的目的通过图解和示例的方式详细说明了上述发明，对本领域技术人员明显的是可以进行某些改变和修饰而不会背离本发明的精神和范围。所以，该说明书不应认为是对本发明范围的限制。

此处引用的所有出版物、专利和专利申请都通过整体引入作为参考用于所有目的，而且以相同的程度，就像各个单独的出版物、专利或专利申请被具体而单独地描述一样通过整体引入而作为参考。

Claims (28)

1.一种用于共配制的酶和底物的液体输送系统，其中所述输送系统是包含酶和该酶底物的组合物，其中所述酶封装于水溶性的聚合物基质中。

2.如权利要求1所述的输送系统，其中所述底物存在于基本上非水性的液相中，所述液相接触所述酶封装于其中的所述聚合物基质，其中所述聚合物不溶于所述液相。

3.如权利要求2所述的输送系统，其中所述基本上非水性的液相包含少于约5％的水。

4.如权利要求2所述的输送系统，其中所述基本上非水性的液相包含少于约1％的水。

5.如权利要求2所述的输送系统，其中所述基本上非水性的液相包含少于约0.5％的水。

6.如权利要求2所述的输送系统，其中所述酶在所述聚合物基质中保持催化能力，但是在25℃下至少10天内，基本上不与所述组合物中的底物反应。

7.如权利要求1所述的输送系统，其中在向该组合物中加入水之后，该聚合物基质溶解，释放酶，使得酶与该底物的催化反应发生。

8.如权利要求1所述的输送系统，包括一种或多种选自由蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、过水解酶、过氧物酶、碳水化合物氧化酶、酚氧化酶、角质酶、脂肪酶、半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、过氧化氢酶和漆酶及其混合物组成的组中的酶。

9.如权利要求1所述的输送系统，包括在相同的聚合物基质中封装的两种或多种酶。

10.如权利要求1所述的输送系统，包括在不同的聚合物基质中封装的两种或多种酶。

11.如权利要求1所述的输送系统，还包括至少一种表面活性剂。

12.如权利要求1所述的输送系统，其中所述聚合物基质选自由聚乙烯醇、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶及其衍生物或共聚物组成的组中。

13.如权利要求1所述的输送系统，其中所述酶封装于颗粒形式的聚合物基质中，该颗粒悬浮于包含所述底物的基本上非水性液体中。

14.如权利要求13所述的输送系统，其中所述颗粒通过悬浮助剂保持悬浮。

15.如权利要求1所述的输送系统，其中所述底物溶于或分散于基本上非水性的液相中，所述液相可任选地包含非水性液体(载液)。

16.如权利要求15所述的输送系统，其中所述载液选自由乙二醇、非离子表面活性剂、乙醇、聚乙二醇、乙酸酯及其混合物组成的组中。

17.如权利要求15所述的输送系统，其中所述载液为所述酶的底物。

18.如权利要求1所述的输送系统，其中所述酶为过水解酶，而且所述底物为酯底物。

19.如权利要求1所述的输送系统，其中所述酶为过水解酶，而且所述底物为丙二醇二乙酸酯。

20.如权利要求1-19中任一项所述的输送系统，进一步包括产生过氧化氢的化合物，所述化合物选自过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化脲，其中向所述组合物中加入水之后产生过酸。

21.如权利要求1所述的输送系统，其中所述酶为漆酶，而且所述底物为漆酶中介物。

22.如权利要求1所述的输送系统，其中所述酶为酚氧化酶，而且所述底物选自由2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸酯)、丁香酰胺和丁香腈组成的组中。

23.如权利要求1所述的输送系统，其中所述酶为过水解酶，而且所述底物为酯底物，而且所述输送系统还包括过硼酸钠。

24.如权利要求23所述的输送系统，其中所述输送系统与缺乏所述聚合物的相当输送系统相比提高了贮存稳定性。

25.一种试剂盒，包含如权利要求1-22中任一项所述的用于共配制的酶和底物的输送系统和使用说明。

26.一种漂白织物的方法，包括：(a)在过氧化氢源存在下将如权利要求18-20中任一项所述的输送系统加入到水中并混合，从而产生含水过酸溶液；和(b)将织物与该溶液在适于测量该织物增白的条件下接触一定时间长度，从而产生漂白的织物。

27.一种去污的方法，包括：(a)在过氧化氢源存在下将如权利要求18-20中任一项所述的输送系统加入到水中并混合，从而产生含水过酸溶液；和(b)将包含污染物的物品与所述溶液接触，从而降低所述污染物的浓度。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述过氧化氢源为过硼酸钠。

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