MX2011004066A - Sistema de suministro para enzimas y sustratos co-formulados. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos, composiciones, sistemas y kits que incluyen un sistema de co-suministro de enzima/sustrato. El sistema de suministro líquido incluye por lo menos una enzima encapsulada en una matriz polimérica soluble en agua y un sustrato para la enzima en un líquido portador en el cual la matriz polimérica es insoluble. Cuando se agrega agua, la matriz polimérica se solubiliza y la enzima se libera de la matriz, permitiendo la acción catalítica en el sustrato.

Description

SISTEMA DE SUMINISTRO PARA ENZIMAS Y SUSTRATOS CO-FORMULADOS Campo de la Invención La invención se refiere a formulaciones líquidas para el co-suministro de enzimas y sustratos en las cuales por lo menos una enzima se encapsula en una matriz polimérica .

Antecedentes de la Invención En el suministro de sistemas de enzimas/sustratos, en general surgen dos problemas . El primer problema es que la efectividad óptima depende del mantenimiento de la relación apropiada de enzima : sustrato . El segundo problema es que la enzima se debe aislar físicamente de su sustrato hasta que se desee la reacción. Una forma de superar estos problemas es empacar la enzima separadamente del sustrato y combinarlos en el punto de uso. Sin embargo, este procedimiento es inconveniente, complicado y puede dar por resultado errores de mezclado en el punto de uso. También puede ser costoso puesto que la enzima se debe formular frecuentemente con sustancias estabilizantes. Otra forma de superar estos problemas es proporcionar una mezcla de enzima seca y sustrato seco, logrando de esta manera aislamiento físico mientras que se mantiene la relación apropiada de enzima a sustrato. Sin embargo, es frecuentemente deseable o necesario REF. :219278 proporcionar una formulación líquida para el uso en los procesos que no se preparan para manejar polvos, gránulos, u otros productos sólidos. Es necesario un procedimiento alternativo .

Sería deseable un procedimiento de co-formulación, con enzima y sustrato combinados en el mismo recipiente. Esto permitiría que un fabricante controle la relación de enzima : sustrato, dando por resultado ahorros de costo en los ingredientes de la formulación, y proporcionaría un producto simple, conveniente y "listo para usar" al consumidor. En algunos casos, la combinación de enzima y sustrato en la misma formulación líquida podría mitigar las preocupaciones de toxicidad (por ejemplo, los riesgos ambientales planteados por mediadores lacasa se podrían reducir sustancialmente si se pudieran manejar y transportar en el mismo recipiente como la enzima lacasa misma) .

Ounichi (Patente de E.U.A. No. 4,898,781) y Aronson (Patente de E.U.A. No. 5,281,355) enseñan la encapsulación de enzimas para aplicaciones de lavandería y para el cuidado en el hogar donde el producto resultante contiene solamente una enzima, y no contiene un sustrato reactivo. Sería deseable producir una formulación líquida que contenga tanto enzima como sustrato, con la enzima aislada del sustrato reactivo. Aplicaciones en las cuales esta co- formulación sería útil incluyen, pero no se limitan a, sistemas blanqueadores enzimáticos, por ejemplo, usando una enzima perhidrolasa con un sustrato de éster, y sistemas de tinción enzimática, por ejemplo, usando una enzima lacasa y un sustrato precursor de tinción .

Breve Descripción de la Invención En un aspecto, la invención proporciona un sistema de suministro líquido para enzima y sustrato co- formulados , en donde el sistema de suministro es una composición que contiene una enzima y un sustrato para la enzima, en donde la enzima se encapsula en una matriz polimérica soluble en agua. El sustrato está en una fase líquida sustancialmente no acuosa (es decir, menor que aproximadamente 5%, menor que aproximadamente 1%, o menor que aproximadamente 0.5% de agua) en contacto con la matriz polimérica que contiene la enzima, en donde el polímero no es soluble en la fase líquida. La enzima retiene el potencial catalítico en la matriz polimérica pero no reacciona sustancialmente con el sustrato en la composición durante por lo menos 10 días a 25°C. Después de la adición de agua a la composición, la matriz polimérica se solubiliza, liberando la enzima, permitiendo que ocurra la reacción catalítica con el sustrato.

En algunas modalidades, la composición contiene una o más enzimas seleccionadas de proteasas, celulasas, amilasas, peptinasas, perhidrolasas, peroxidasas, oxidasas de carbohidratos, enzimas oxidantes de fenol, cutinasas, lipasas, hemicelulasas, xilanasas, manasas, catalasas, y lacasas, y mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición contiene dos o más enzimas encapsuladas en la misma matriz polimérica. En algunas modalidades, la composición contiene dos o más enzimas encapsuladas en matrices poliméricas separadas. En algunas modalidades, la composición contiene dos o más enzimas encapsuladas en la misma matriz polimérica y por lo menos una enzima encapsulada en una matriz polimérica separada.

En algunas modalidades, la composición contiene por lo menos un tensoactivo.

En algunas modalidades, la matriz polimérica se selecciona de alcohol polivinílico, metilcelulosa, hidroxipropil -metilcelulosa , polivinil-pirrolidona, goma de guar, y derivados o copolímeros de los mismos. Un polímero adecuado para el uso en las composiciones proporcionado en este documento es uno en el cual una enzima se puede encapsular y el cual no es soluble en agua.

En algunas modalidades, la matriz polimérica que contiene enzimas está en la forma de partículas suspendidas en un líquido sustancialmente no acuoso que contiene el sustrato. En una modalidad, las partículas se mantienen en suspensión por un auxiliar de suspensión, en alguna modalidad, la suspensión líquida está en un recipiente que contiene una cantidad de enzima y sustrato suficiente para y/o propuesto para un solo uso (es decir, una sola dosis) en una aplicación en la cual es útil la reacción de enzima/sustrato, en donde el recipiente se puede abrir para dispensar el líquido, por ejemplo, al abrir una tapa o tapadera. En algunas modalidades, la suspensión líquida está en un recipiente con cierre que contiene una cantidad de enzima y sustrato suficientes para y/o propuestos para el uso de múltiples veces (es decir, múltiples dosis) , lo cual permite dispersar de forma repetida la suspensión al abrir y cerrar una tapa de recipiente, al abrir y cerrar una válvula u orificio de dispensación, o los similares. En algunas modalidades, la matriz polimérica que contiene enzimas está en la forma de un recipiente cerrado, es decir, sellado, tal como una bolsa o sobrecito, y el sustrato está en un líquido sustancialmente no acuoso dentro del recipiente polimérico.

El sustrato se solubiliza o se dispersa en una fase líquida sustancialmente no acuosa, que puede incluir un líquido no acuoso (fluido portador. Ejemplos de fluidos portadores incluyen, pero no se limitan a, glicoles, tensoactivos no iónicos, alcoholes, poliglicoles , ésteres de acetato, o una mezcla de los mismos. Un sustrato líquido o solido se puede combinar con uno o más de fluido portador y puede ser ya sea miscible con o suspendido en el (los) fluido(s) portador (es) . En algunas modalidades, el fluido el fluido portador contiene sal o una solución amortiguadora de pH agregados para crear condiciones adecuadas para la solubilización incrementada del sustrato y/o solubilización reducida del polímero encapsulante . En algunas modalidades, el fluido portador es un sustrato para la enzima, por ejemplo, un fluido portador de diacetato de propilenglicol puede servir como un sustrato para una enzima perhidrolasa encapsulada en una matriz polimérica que es insoluble en diacetato propilenglicol, por ejemplo, alcohol polivinílico, metil-celulosa, hidroxipropil-metil-celulosa, polivinil-pirrolidona) . En muchas modalidades, el suministro exhibe estabilidad incrementada comparada con un sistema de suministro comparable que carece del polímero.

En una modalidad, la enzima es una perhidrolasa y el sustrato es un sustrato de éster, tal como, por ejemplo, un éster de acetato, por ejemplo, diacetato de propilenglicol. En algunas modalidades, el sustrato de éster es diacetato de propilenglicol, y el polímero que comprende la enzima perhidrolasa está en la forma de partículas suspendidas en el diacetato de propilenglicol o en la forma de un recipiente cerrado que circunda el diacetato de propilenglicol, es decir, el diacetato de propilenglicol se encierra dentro del contendor polimérico.

En algunas modalidades, la enzima es una perhidrolasa, el sustrato es un sustrato de éster, la composición comprende además un compuesto generador de peróxido de hidrógeno, por ejemplo, seleccionado de percarbonato de sodio, perborato de sodio, y peróxido ácido de urea, y un perácido se produce después de que el agua se agrega a la composición. En algunas modalidades, el perácido se selecciona de ácido peracético, ácido pernonanoico, ácido perpropionico, ácido perbutanoico, ácido perpentanoico y ácido perhexanoico . En algunas modalidades, el sustrato de éster es diacetato de propilenglicol y el compuesto generador de peróxido de hidrógeno se suspende en el diacetato de propilenglicol .

En algunas modalidades, la enzima es una enzima perhidrolasa y la composición contiene sustratos para producir mono- y diglicéridos (por ejemplo, un donador de acilo y un aceptor de alcohol) o un éster de sorbitan (por ejemplo, un donador de acilo y sorbitan) . En algunas modalidades, la enzima es una enzima perhidrolasa y la composición contiene sustratos para producir un éster fragranté, por ejemplo, éster bencílico (por ejemplo, un donador de acilo y un alcohol volátil, por ejemplo alcohol bencílico) .

En algunas modalidades, la enzima es una enzima oxidante de fenol, tal como una enzima lacasa, y el sustrato es un mediador lacasa, por ejemplo, seleccionado de 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) , siringamida y siringonitrilo .

En varios aspectos, la invención proporciona una composición para el uso en una aplicación en la cual es útil una actividad enzimática, por ejemplo, una composición detergente, una composición de procesamiento textil, o una composición para el cuidado personal, en donde la composición contiene una enzima y un sustrato para la enzima, en donde la enzima se encapsula en una matriz polimérica soluble en agua y en donde la matriz polimérica que contiene enzima está en r contacto con e insoluble en una solución o suspensión líquida sustancialmente no acuosa que contiene el sustrato, como se describe en este documento.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit que contiene un sistema de suministro para enzima y sustrato co-formulados como se describe en este documento o una composición que contiene el sistema de suministro, y empaquetamiento. En algunas modalidades, el kit comprende además instrucciones para el uso en un método, por ejemplo, un método de descontaminación, un método de limpieza, un método de procesamiento textil o un método para el cuidado personal. En algunas modalidades, el kit comprende además instrucciones para incorporar el sistema de suministro dentro de una composición formulada para el uso en un método en el cual la actividad catalítica en la enzima en el sustrato es útil, por ejemplo, una composición detergente, una composición de procesamiento textil o una composición para el cuidado personal .

En otro aspecto, la invención proporciona un método para descontaminación, que comprende: (a) agregar una composición que contiene perhidrolasa como se describe en este documento al agua en presencia de una fuente de peróxido de hidrógeno y mezclar, generando en consecuencia una solución de perácido acuosa; y (b) poner en contacto un artículo que comprende un contaminante con la solución, reduciendo en consecuencia la concentración del contaminante. En algunas modalidades, el contaminante comprende una toxina seleccionada de toxina de botulinum, toxina de anthracis, ricina, toxina escombroide, ciguatoxina, tetradotoxina , micotoxinas, o combinaciones de las mismas. En algunas modalidades, el contaminante comprende un patógeno seleccionado de una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un prión, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, el artículo se selecciona de una superficie dura, una tela, un alimento, un forraje, una prenda de vestir, un tapete, una alfombra, un textil, un instrumento médico, y un instrumento veterinario. En algunas modalidades, el agua se esteriliza. En algunas modalidades, el contacto del artículo que se descontamina se realiza a alta temperatura.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para blanquear un textil, que comprende: (a) agregar una composición que contiene perhidrolasa como se describe en este documento a agua en presencia de una fuente de peróxido de hidrógeno y mezclar, generando en consecuencia una solución de perácido acuosa; y (b) poner en contacto un textil con la solución durante un período de tiempo y bajo condiciones adecuadas para permitir el blanqueamiento medible del textil, produciendo en consecuencia un textil blanqueado.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para limpiar, que comprende poner en contacto un artículo que comprende una mancha con una composición detergente como se describe en este documento en presencia de agua agregada, en donde se remueve por lo menos una porción de la mancha.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para blanquera un textil, que comprende poner en contacto un textil con una enzima oxidante de fenol (por ejemplo, lacasa) que contiene una composición como se describe en este documento en presencia de agua agregada durante un período de tiempo y bajo condiciones para permitir el blanqueamiento medible del textil, en donde la composición comprende un mediador que efectúa el blanqueamiento del textil, produciendo en consecuencia un textil blanqueado.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para cambiar el color de un textil, que comprende poner en contacto un textil con una enzima oxidante de fenol (por ejemplo, lactasa) que contiene una composición como se describe en este documento en presencia de agua agregada durante un período de tiempo y bajo condiciones adecuadas para permitir un cambio medible de color en el textil, en donde la composición comprende un mediador que efectúa un cambio de color en el textil bajo las condiciones usadas, produciendo en consecuencia un textil con un cambio en el color.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para teñir cabello, que comprende poner en contacto el cabello con una enzima oxidante de fenol (por ejemplo, lacasa) que contiene una composición como se describe en este documento en presencia de agua agregada durante un período de tiempo y bajo condiciones adecuadas para permitir un cambio medible de color en el cabello, en donde la composición comprende un mediador que efectúa un cambio de color en el cabello bajo las condiciones usadas, produciendo en consecuencia cabello con un cambio en el color.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el blanqueamiento y/o deslignificación de pulpa o papel, que comprende poner en contacto la pulpa o papel con una enzima oxidante de fenol (por ejemplo, lacasa) que contiene una composición como se describe en este documento en presencia de agua agregada durante un período de tiempo y bajo condiciones adecuadas para permitir el cambio medible de color y/o el contenido de lignina de la pulpa o papel, en donde la composición comprende un mediador que efectúa el cambio de color y/o contenido de lignina, produciendo en consecuencia pulpa o papel con un cambio de color y/o contenido de lignina.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para la activación enzimática de fibras de madera para producir compuestos de madera, que comprende poner en contacto madera con una enzima oxidante de fenol (por ejemplo, lacasa) que contiene una composición como se describe en este documento en presencia de agua agregada durante un período de tiempo y bajo condiciones adecuadas para permitir que el cambio medible del rendimiento del compuesto de madera, en donde la composición comprende un mediador que efectúa el cambio de rendimiento del compuesto de madera, produciendo en consecuencia madera con un cambio en la unión de fibras de madera.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar agua residual, que comprende poner en contacto un efluente de agua residual con una enzima oxidante de fenol (por ejemplo, lacasa) que contiene una composición como se describe en este documento en presencia de agua agregada durante un período de tiempo y bajo condiciones adecuadas para permitir una disminución medible en la concentración de fenol en el agua residual, en donde la composición comprende ¾ un mediador que efectúa la disminución en la concentración de fenol, produciendo en consecuencia un efluente de agua residual con una disminución en el contenido de fenol .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 representa esquemáticamente reacciones catalizadas por una enzima perhidrolasa .

La Figura 2 muestra los resultados del experimento de lixiviación de enzimas con discos de PVA lacasa y mediador ABTS lacasa, como se describe en el ejemplo 3.

La Figura 3 muestra los resultados del experimento de lixiviación de enzimas con discos de PVA lacasa y mediador SA lacasa, como se describe en el ejemplo 3.

La Figura 4 muestra los resultados del experimento de lixiviación de enzimas con discos de PVA lacasa y mediador SN lacasa, como se describe en el ejemplo 3.

La Figura 5 muestra los resultados del blanqueo de mezclilla en los experimentos de placas de microtítulo de 12 pocilios descritos en el Ejemplo 3.

La Figura 6 muestra los resultados del blanqueo y tinción de mezclilla en los experimentos de Launder-Ometer descritos en el Ejemplo 3.

Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona un sistema de suministro para enzima y sustrato co-formulados . Las composiciones descritas en este documento contienen una enzima encapsulada en una matriz polimérica que contiene un polímero soluble en agua. Las composiciones también contienen un sustrato para la enzima. La enzima encapsulada se puede suspender en o en la forma de un recipiente sellado que circunda una composición líquida sustancialmente no acuosa que comprende, que consiste de, o que consiste esencialmente del sustrato, tal como, por ejemplo, un sustrato líquido, solución de sustrato, o una suspensión líquida de partículas de sustrato sólido o cápsulas que contienen el sustrato. La liberación de enzimas del polímero en la cual se encapsulan se desencadena por la dilución en agua.

Definiciones A menos que se defina de otra manera en este documento, todos los términos técnicos y específicos usados en este documento tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual está invención pertenece. Por ejemplo, Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2da Edición, John Wiley and Sons, NY (1994) ; y Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a aquellas personas de experiencia en la técnica con diccionarios generales de muchos de los términos usados en la invención. Cualquiera de los métodos y materiales similares equivalentes a aquellos descritos en este documento encuentran uso en la práctica de la presente invención. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se describen más totalmente a manera de referencia a la especificación en general. También, como se usa en este documento, los términos singulares "un", "una", y "el", "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se describen de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi , respectivamente. Se va a entender que esta invención no se limita a la metodología particular, protocolos, y reactivos descritos, ya que estos pueden variar, dependiendo del contexto en el cual se usan por aquellas personas de experiencia en la técnica.

Se propone que cada limitación numérica máxima proporcionada por toda esta especificación incluya cada limitación numérica inferior, ya que si tales limitaciones numéricas inferiores, como si estas limitaciones numéricas inferiores se escribieron expresamente en este documento. Cada limitación numérica mínima proporcionada por toda esta especificación, incluirá cada limitación numérica superior, 1 como si estas limitaciones numéricas superiores se escribieron expresamente en este documento. Cada intervalo numérico proporcionado por toda esta especificación incluirá cada intervalo numérico más reducido que se encuentra dentro de tal intervalo numérico más amplio, como si estos intervalos numéricos más reducidos se escribieron expresamente en este documento.

Como se usa en este documento, el término "enzima" se refiere a cualquier proteína que cataliza una reacción química. La función catalítica de una enzima constituye su "actividad" o "actividad enzimática" . Una enzima se clasifica típicamente de acuerdo con el tipo de función catalítica que lleva a cabo, por ejemplo, hidrólisis de enlaces de péptido.

Como se usa en este documento, el término "sustrato" se refiere a una sustancia (por ejemplo, un compuesto químico) sobre el cual una enzima realiza su actividad catalítica para generar un producto.

Como se usa en este documento, los términos "purificado" y "aislado" se refiere a la remoción de contaminantes de una muestra y/o un material (por ejemplo, una proteína, ácido nucleico, célula, etcétera) , es decir, un material que se remueve de por lo Menos- un componente el cual está naturalmente asociado. Por ejemplo, estos términos pueden referirse a un material el cual está sustancialmente o esencialmente libre de componentes los cuales lo acompañan normalmente como se encuentran en su estado nativo, tal como, por ejemplo, un sistema biológico intacto.

Como se usa en este documento, el término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y cualquier estructura tridimensional y de una o múltiples hebras (por ejemplo, hebra individual, hebra doble, triple hélice, etcétera), los cuales contienen desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , y/o análogos o formas modificadas de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, que incluyen nucleótidos modificados o bases o sus análogos. Debido a que el código genético es degenerado, se puede usar más de un codón para codificar un aminoácido particular, y la presente invención incluye polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos particular. Se puede usar cualquiera tipo de nucleótido modificado o análogo de nucleótido, siempre y cuando el polinucleótido retenga la funcionalidad deseada bajo condiciones de uso, que incluyen modificaciones que incrementan la resistencia a la nucleasa (por ejemplo, desoxi, 2'-0-Me, fosforotioatos , etcétera) . También se pueden incorporar etiquetas para propósitos de detección o captura, por ejemplo, etiquetas o anclas radioactivas o no radioactivas, por ejemplo, biotina. El término polinucleótido también incluye ácidos nucleicos de péptido (PNA) . Los polinucleótidos pueden ser de origen natural o no de origen natural. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico y "oligonucleótido" se usan en este documento intercambiablemente. Los polinucleótidos de la invención pueden contener AR , ADN, o ambos, y/o formas modificadas y/o análogos de los mismos. Una secuencia de nucleótidos se puede interrumpir por componente no de nucleótidos. Uno o más enlaces de fosfodiéster se pueden reemplazar por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, modalidades en donde el fosfato se reemplaza por P(0)S ("tioato"), P(S)S ( "ditioato" ) , (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO o CH2 ( "formacetalo" ) , en los cuales cada R o R' es independientemente H o alquilo de (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace de éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. Los polinucleótidos pueden ser lineales o circulares o comprenden una combinación de porciones lineales y circulares.

Como se usa en este documento, "polipéptido" se refiere a cualquier composición comprendida de aminoácidos y reconocida como una proteína por aquellas personas de experiencia en la técnica. Se usa en este documento el código convencional de una letra o tres letras para residuos de aminoácidos. Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en este documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y se puede interrumpir por no aminoácidos. Los términos también incluyen un polímero de aminoácido que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlace de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen por ejemplo, aminoácidos no naturales, etcétera), así como también otras modificaciones conocidas en la técnica.

Como se usa en este documento, las proteínas funcional y/o estructuralmente similares se considera que son "proteínas relacionadas." En algunas modalidades, estas proteínas se derivan de un género y/o especie diferente, incluyendo diferencias entre clases de organismos (por ejemplo, una proteína bacteriana y una proteína fúngica) . En modalidades adicionales, se proporcionan proteínas relacionadas de la misma especie. De hecho, no se propone que los procesos, métodos y/o composiciones descritas en este documento se limiten a proteínas relacionadas de cualquier fuente(s) particular (es ) . Además, el término "proteínas relacionadas" incluye homólogos estructurales terciarios y homólogos de secuencia primaria. En modalidades adicionales, el término incluye proteínas que son inmunológicamente de reacción cruzada.

Una "perhidrolasa" se refiere a una enzima que es capaz de catalizar una reacción de perhidrólisis que da por resultado la producción de una cantidad suficientemente alta de perácido adecuado para el uso en una aplicación tal como limpieza, blanqueado, desinfección o esterilización. En general, una enzima perhidrolasa usada en los métodos descritos en este documento exhibe una alta relación de perhidrólisis a hidrólisis. En algunas modalidades, la perhidrolasa comprende, consiste de, o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de perhidrolasa de Mycobacterium smegmatis expuesta en SEQ ID NO: 1, o una variante u homólogo de la misma. En algunas modalidades, la enzima perhidrolasa comprende actividad de acil-transferasa y cataliza una reacción de transferencia de acilo acuosa.

El término "perhidrolización" o "perhidrolizar" o "perhidrólisis" como se usa en este documento se refiere a una reacción en donde un perácido se genera de éster y sustratos de peróxido de hidrógeno. En una modalidad, la reacción de perhidrolización se cataliza con una perhidrolasa, por ejemplo, enzima aciltransferasa o arilesterasa . En algunas modalidades, un perácido se produce mediante perhidrólisis de un sustrato de éster de la fórmula RiC(=0)OR2, donde Ri y R2 son lo mismo o diferentes porciones orgánicas, en presencia de peróxido de hidrógeno (H202) . En una modalidad, -0R2 es -OH. En una modalidad, -0R2 se reemplaza por -NH2. En algunas modalidades, un perácido se produce por la perhidrólisis de un ácido carboxílico o un sustrato de amida.

El término "perácido" , como se usa en este documento, se refiere a una molécula derivada de un éster de ácido carboxílico la cual se ha hecho reaccionar con peróxido de hidrógeno para formar un producto altamente reactivo que es capaz de transferir uno de sus átomos de oxígeno, por ejemplo, un ácido orgánico de la fórmula RC(=0)00H. Es esta capacidad de transferir átomos de oxígeno que permite que un perácido, por ejemplo, un ácido peracético, funcione como un agente blanqueador.

La frase "fuente de peróxido de hidrógeno" incluye peróxido de hidrógeno así como también los componentes de un sistema que puede producir espontánea o enzimáticamente peróxido de hidrógeno como un producto de reacción.

La frase "relación de perhidrólisis a hidrólisis" se refiere a la relación de cantidad de perácido enzimáticamente producido a la cantidad de ácido enzimáticamente producido por una enzima perhidrolasa de un sustrato de éster bajo condiciones definidas y dentro de un tiempo definido.

Como se usa en este documento, el término "acilo" se refiere a un grupo orgánico con la fórmula general RCO- , derivado de un ácido orgánico por la remoción del grupo -OH. Típicamente, los nombres de grupo acilo terminan con el sufijo "-oil", por ejemplo, cloruro de metanoilo, CH3C0-C1, es el cloruro de acilo formado de ácido metanoico CH3CO-OH) .

Como se usa en este documento, el término "acilación" se refiere a una transformación química en la cual uno de los sustituyentes de una molécula se sustituye por un grupo acilo, o el proceso de introducción de un grupo acilo dentro de una molécula.

Como se usa en este documento, el término "transferasa" se refiere a una enzima que cataliza la transferencia de un grupo funcional de un sustrato a otro sustrato .

Como se usa en este documento, el término "conversión enzimática" se refiere a la modificación de un sustrato o intermediario a un producto, al poner en contacto el sustrato o intermediario con una enzima. En algunas modalidades, el contacto se hace al exponer directamente el sustrato o intermediario - a la enzima apropiada. En otras modalidades, el contacto comprende exponer el sustrato o intermediario a un organismo que expresa y/o excreta la enzima, y/o metaboliza el sustrato y/o intermediario deseado al intermediario deseado y/o producto final, respectivamente.

Como se usa en este documento, "cantidad efectiva de enzima" se refiere a la cantidad de enzimas necesaria para lograr la actividad requerida en la aplicación específica (por ejemplo, producción de ácido peracético por acil-transferasa para el uso en la descontaminación) . Estas cantidades efectivas se comprueban fácilmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica y se basan en muchos factores, tal como la variante de enzima particular usada, la composición específica, el método de descontaminación, el artículo que se descontamina, y los similares.

Como se usa en este documento, el término "estabilidad" en referencia. a una sustancia (por ejemplo, una enzima) o composición se refiere a su capacidad de mantener un cierto nivel de actividad funcional durante un período de tiempo bajo ciertas condiciones ambientales. Además, el término "estabilidad" se puede usar en una variedad de contextos más específicos que se refieren a la condición ambiental particular que es de interés. Por ejemplo, "estabilidad térmica" como se usa en este documento se refiere a la capacidad de una sustancia o composición para mantener su función (es decir, no se degrada) a temperatura incrementada. Se hace constar un cambio sustancial en la estabilidad mediante por lo menos aproximadamente un 5% o incremento o disminución mayor (en la mayoría de las modalidades, es preferiblemente un incremento) en la vida media de la actividad funcional que se somete a ensayo, como es comparada con la actividad presente en ausencia de las condiciones ambientales seleccionadas.

Como se usa en este documento, el término "estabilidad química" como se usa en referencia a una enzima se refiere a la estabilidad de la enzima en presencia de químicos que afectan adversamente su actividad. En algunas modalidades, estos químicos incluyen, pero no se limitan a peróxido de hidrógeno, perácidos, detergentes aniónicos, detergentes catiónicos, detergentes no iónicos, quelantes, etcétera. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ningún nivel de estabilidad químico particular tampoco a un intervalo de estabilidad química.

Como se usa en este documento, "estabilidad de pH" se refiere a la capacidad de una sustancia (por ejemplo, una enzima) o composición para funcionar en un pH particular. La estabilidad en varios pHs se puede medir en ya sea por procedimientos estándares conocidos por aquellas personas en la técnica y/o por los métodos descritos en este documento. Un cambio sustancial en la estabilidad de pH se hace constar mediante por lo menos aproximadamente 5% o incremento o disminución mayor (en la mayoría de las modalidades, es preferiblemente un incremento) en la vida media de la actividad funcional, como es comparada con la actividad en el pH óptimo. No se propone que la presente invención se limite a ningún nivel de estabilidad de pH tampoco a un intervalo de pH.

Como se usa en este documento, "estabilidad oxidante" se refiere a la capacidad de una sustancia (por ejemplo, una enzima) o composición que funciona bajo condiciones oxidantes, por ejemplo, en presencia de un químico oxidante .

Como se usa en este documento, "estabilidad térmica" se refiere a la capacidad de una proteína de funcionar a una temperatura particular. En general, la mayoría de las enzimas tiene un intervalo finito de temperaturas en las cuales funcionarán. Además de las enzimas que funcionan en temperaturas de intervalo medio (por ejemplo, temperatura ambiente) , hay enzimas que son capaces de funcionar en temperaturas muy altas y muy bajas. La estabilidad térmica se puede medir ya sea por procedimientos conocidos. Un cambio sustancial en la actividad térmica se hace constar mediante por lo menos un incremento o disminución de 5% o mayor en la vida media de la actividad catalítica de un mutante cuando se expone a una temperatura diferente (es decir, superior o inferior) que la temperatura óptima para la actividad enzimática. Sin embargo, no se propone que los procesos, métodos y/o composiciones descritas en este documento se limiten a ningún nivel de estabilidad de temperatura tampoco a un intervalo de temperatura.

Como se usa en este documento, "químico oxidante, se refiere a un químico que tiene la capacidad de blanquear. El químico oxidante está presente en una cantidad, pH y temperatura adecuados para el blanqueado. El término incluye, pero no se limita a peróxido de hidrógeno y per ácidos.

Como se usa en este documento, el término "contaminante" se refiere a cualquier sustancia que por su contacto o asociación de otra sustancia, material, o artículo se hace indeseable, impuro y/o inadecuado para el uso.

Como se usa en este documento, el término "un artículo contaminado" o "artículo en necesidad de descontaminación" se refiere a cualquier artículo o cosa en contacto o asociado con un contaminante y/o el cual necesita ser descontaminado. No se propone que el artículo se limite a ninguna cosa o tipo particular de artículo. Por ejemplo, en algunas modalidades, el artículo es una superficie dura, mientras que en otras modalidades, el artículo es una prenda de vestir. En todavía modalidades adicionales, el artículo es un textil. En todavía modalidades adicionales, el artículo se usa en los campos médicos y/o veterinarios. En algunas modalidades, el artículo es un instrumento quirúrgico. En modalidades adicionales, el artículo se usa en la transportación (por ejemplo, carreteras, pistas de aterrizaje, vías, trenes, carros, aviones, barcos, etcétera).

En modalidades adicionales, el término se usa con referencia a alimento y/o forrajes, que incluyen pero no se limitan a carne, subproductos de carne, pescado, mariscos, vegetales, frutas, productos lácteos, granos, productos para hornear, ensilaje, henos, forraje, etcétera. De hecho, se propone que el término incluya cualquier artículo que sea adecuado para la descontaminación usando los métodos y composiciones proporcionados en este documento.

Como se usa en este documento, el término "descontaminación" se refiere a la remoción de sustancialmente todo o todos los contaminantes de un artículo contaminado. En algunas modalidades, la descontaminación incluye desinfección, mientras que en otras modalidades, el término incluye esterilización. Sin embargo, no se propone que el término se limite a estas modalidades, ya que el término se propone para incluir la remoción de contaminantes inanimados, así como también contaminación microbiana (por ejemplo, bacteriana, fúngica, viral, priones, etcétera).

Como se usa en este documento, el término "desinfección" se refiere a la remoción de contaminantes de las superficies, así como también la inhibición o exterminio de microbios sobre las superficies de los artículos. No se propone que la presente invención se limite a ninguna superficie particular, artículo, o contaminante (s) o microbios a ser removidos.

Como se usa en este documento, el término "esterilización" se refiere al exterminio de todos los organismos microbianos sobre una superficie.

Como se usa en este documento, el término "esporicida" se refiere al exterminio de esporas microbianas, incluyendo pero no limitado a esporas fúngicas y bacterianas. El término incluye composiciones que son efectivas en la prevención de la germinación de esporas, así como también aquellas composiciones que vuelven las esporas completamente no viables.

Como se usa en este documento, los términos "bactericida", "fungicida", y "virucida" se refiere a composiciones que exterminan bacterias hongos y virus, respectivamente. El término "microbiocida" se refiere a composiciones que inhiben el crecimiento y/o replicación de cualquiera de los microorganismos, que incluyen pero no se limitan a bacterias, hongos, virus, protozoarios , rickettsie, etcétera .

Como se usa en este documento, los términos "bacteriostática" , "fungistática" y "virostática" se refiere a composiciones que inhiben el crecimiento y/o replicación de bacterias, hongos, y virus, respectivamente. El término "microbiostática" se refiere a las composiciones que inhiben el crecimiento y/o replicación de cualquiera de microorganismos, incluyendo pero no limitado a bacterias, hongos, virus, protozoarios , rickettsie, etcétera.

Como se usa en este documento, el término "composición de limpieza" se refiere a composiciones que encuentran uso en las remoción de compuestos indeseados de artículos que se limpia, tales como tela, platos, lentes de contacto, otros sustratos sólidos, cabello (champús) , piel, (jabones y cremas), dientes (lavados bucales, pastas de dientes) etcétera. El término se refiere además a cualquiera composición que sea adecuada para la limpieza, blanqueado, desinfección, y/o esterilización de cualquier objeto y/o superficie. Se propone que el término incluya, pero no se limita a composiciones detergentes (por ejemplo, detergentes para lavandería líquidos y/o sólidos y detergentes para tela fina; formulaciones de limpieza de superficie dura, tales como para vidrio, madera, cerámica y partes superiores de metal y ventanas; limpiadores de alfombras; limpiadores de hornos; eliminadores de olores para tela; suavizantes de telas; y pre-desmanchadores textiles y para lavandería, así como también detergentes para platos) . El término incluye además cualquiera de materiales/compuestos seleccionados para el tipo particular de composición de limpieza deseada y la forma de producto (por ejemplo, composición líquida, en gel, en gránulos o en rocío) , así siempre y cuando la composición sea compatible con la aciltransferasa, fuente de peróxido de hidrógeno, PGDA, y cualquier otra(s) enzima (s) o sustancia usadas en las composición. La selección específica de materiales de composición de limpieza se hace fácilmente al considerar la superficie, artículo o tela que se limpia, y la forma deseadas de la composición para las condiciones de limpieza durante el uso. De hecho, el término "composición de limpieza" como se usa en este documento, incluye a menos que se indique de otra manera, agentes de lavado para todo propósito o de uso industrial en forma granular o en polvo, especialmente detergentes de limpieza; agentes de lavado para todo propósito en forma de líquido, gel o pasta, especialmente los así llamados tipos de líquido de uso industrial (HDL) ; detergentes líquidos para telas finas; agentes de lavaplatos a mano o agentes de lavaplatos de uso ligero, especialmente de aquellos del tipo de alta espumación; agentes para lavaplatos a máquina, que incluyen los diversos tipos de tabletas, granulares, líquidos y auxiliares de enjuague para uso doméstico e institucional; agentes de limpieza y desinfectantes líquidos, que incluyen tipos de lavado de manos antibacterianos , barras de limpieza, lavados bucales, limpiadores de dentaduras, champús para carros o alfombra, limpiadores de baño; champús para el cabello y enjuagues para el cabello; geles de ducha y limpiadores de tinas y metal de espuma; así como también auxiliares de limpieza tales como aditivos blanqueadores y tipos de "barra para manchas" o de pretratamiento .

Como se usa en este documento, los términos "composición detergente" y "formulación detergente" se usan en referencia a las mezclas que se proponen para el uso en un medio de lavado para la limpieza de objetos sucios. En algunas modalidades, el término se usa en referencia para lavar telas y/o prendas (por ejemplo, "detergentes de lavandería"). En modalidades alternativas, el término se refiere a otros detergentes, tales como aquellos usados para limpiar platos, cubiertos, etcétera (por ejemplo, "detergentes para lavaplatos") . No se propone que la presente invención se limite a ninguna formulación o composición detergente particular. De hecho, se propone que además de una enzima perhidrolasa , por ejemplo, una acil-transferasa, el término incluya detergentes que contengan tensoactivos , transferasa (s) , enzimas hidrolíticas , óxido-reductasas , mej oradores, agentes blanqueadores, activadores de blanqueado, agentes azulados y tintes fluorescentes, inhibidores de aglomeración, agentes enmascarantes, activadores de enzimas, antioxidantes, y solubilizantes .

Como se usa en este documento, el término "compatible con enzimas" , cuando se usa en el contexto de materiales de composición de limpieza significa que los materiales no reducen la actividad enzimática a tal grado que la enzima relevante no es efectiva como se desea durante situaciones de uso normales.

Como se usa en este documento, el término "derivado" se refiere a una proteína que se deriva de una proteína precursora mediante la adición de uno o más aminoácidos a cualquiera o ambos del extremo (s) C- y N-terminales, sustitución de uno o más aminoácidos en uno o un número de diferente sitios en la secuencia de aminoácidos, y/o o supresión de uno o más aminoácidos en cualquiera o ambos extremo (s) C- y N-terminales y/o en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos, y/o inserción de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos. La preparación de un derivado de proteína se logra frecuentemente al modificar una secuencia de ADN que codifica la proteína nativa, transformación de la secuencia de ADN modificado en un hospedero adecuado, y expresión de la secuencia de ADN modificado para producir la proteína derivada .

Proteínas relacionadas (y derivados) incluyen proteínas "variantes" . Las proteínas variantes difieren de una proteína precursora y/o del uno al otro por un pequeño número de residuos de aminoácidos. En algunas modalidades, el número de diferentes residuos de aminoácidos es cualquiera de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50. En algunas modalidades, las variantes difieren por aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos.

En algunas modalidades, las proteínas relacionadas, tales como proteínas variantes, comprenden cualquiera de por lo menos aproximadamente 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, o 99.5% aminoácidos de identidad de secuencia de aminoácidos.

Como se usa en este documento, el término "secuencia análoga" se refiere a una secuencia de polipéptidos dentro de una proteína que proporciona una función similar, estructura terciaria, y/o residuos conservados con respecto a una proteína de referencia. Por ejemplo, en regiones de epítopo que contienen una hélice alfa o una estructura de lámina beta, reemplaza aminoácido ( s ) en una secuencia análoga manteniendo el mimo elemento estructural. En algunas modalidades, se proporcionan secuencias análogas que dan por resultado una enzima variante que exhibe una función similar o mejorada con respecto a la proteína precursora a partir de la cual se deriva la variante .

Como se usa en este documento, "proteína homologa" se refiere a una proteína (por ejemplo, una enzima perhidrolasa) que tiene función similar (por ejemplo, actividad enzimática) y/o estructura como una proteína de referencia (por ejemplo, una enzima perhidrolasa de una fuente diferente) . Los homólogos pueden ser de especies de manera evolucionada relacionadas o no relacionadas. En algunas modalidades, un homólogo tiene una estructura cuaternaria, terciaria y/o primaria similar a aquella de una proteína de referencia, permitiendo potencialmente en consecuencia el reemplazo de un segmento o fragmento en la proteína de referencia con un segmento o fragmento análogo del homólogo, con interrupción reducida de la estructura y/o función de la proteína de referencia en comparación con el reemplazo del segmento o fragmento con una secuencia de una proteína no homologa.

Como se usa en este documento, proteínas "de tipo natural" , "nativas" y "de origen natural" son aquellas encontradas en la naturaleza. El término "secuencia de tipo natural" se refiere a una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos que se encuentra en la naturaleza o de origen natural. En algunas modalidades, una secuencia de tipo natural es el punto de partida de un proyecto de ingeniería de proteínas, por ejemplo, producción de proteínas variantes.

El término "blanqueado" , como se usa en este documento, significa el proceso para tratar un material textil tal como una fibra, hilado, tela, prenda o material no tejido para producir un color más ligero en la fibra, hilado, tela, prenda o material no tejido. Por ejemplo, el blanqueado como se usa en este documento significa el blanqueamiento de textil mediante remoción, modificación o enmascaramiento de compuestos causantes de color en materiales celulósicos u otros textiles. De esta manera, "blanqueado" se refiere al tratamiento de un textil durante un período de tiempo suficiente y bajo condiciones de pH y temperatura apropiadas para efectuar un brillo (es decir, blanqueamiento) del textil. El blanqueado se puede realizar usado un (os) agente (s) blanqueador (es) químico (s) y/o agente (s) blanqueador (es) enzimáticamente generado(s). Ejemplos de agentes blanqueadores adecuados incluyen pero no se limitan a C102, H202, perácidos, N02, etcétera.

El término "agente blanqueador" como se usa en este documento incluye cualquier porción que sea capaz de blanquear un textil. Se puede requerir un activador de blanqueo. Ejemplos de agentes blanqueadores químicos adecuados útiles en los procesos, métodos y composiciones descritas en este documento son peróxido de borato de sodio, peranganato de potasio y perácidos. En algunos aspectos, el H202 se puede considerar un agente blanqueador químico cuando se ha generado enzimáticamente in situ. Una "composición blanqueadora química" contiene uno o más agente (s) blanqueador (es) químico (s).

La frase "sistema blanqueador enzimático" o "composición blanqueadora enzimática" contiene una o más enzima (s) y sustrato (s) capaz de generar enzimáticamente un agente blanqueador. Por ejemplo, un sistema blanqueador enzimático puede contener una enzima perhidrolasa , un sustrato de éster, y una fuente de peróxido de hidrógeno, para la producción de un agente blanqueador de perácido.

Un "sustrato de éster" en referencia a un sistema blanqueador enzimático que contiene una enzima perhidrolasa se refiere a un sustrato de perhidrolasa que contiene un enlace de éster. Los ésteres que comprenden ácidos carboxílicos alifáticos y/o aromáticos y alcoholes se pueden usar como sustratos con enzimas perhidrolasa. En algunas modalidades, la fuente de éster es un éster de acetato. En algunas modalidades, la fuente de éster se selecciona de uno o más de diacetato de propilenglicol , diacetato de etilenglicol , triacetina, acetato de etilo y tributirina. En algunas modalidades, la fuente de éster se selecciona de los ésteres de uno o más de los siguientes ácidos: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido no nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico.

El término "fuente de peróxido de hidrógeno" significa peróxido de hidrógeno que se agrega a un baño de tratamiento textil ya sea de una fuente exógena (es decir, una externa o exterior) o generada in situ por la acción de una oxidasa que genera peróxido de hidrógeno sobre un sustrato. "Fuente de peróxido de hidrógeno" incluye peróxido de hidrógeno así como también los componentes de un sistema que pueden producir espontánea o enzimáticamente peróxido de hidrógeno como un producto de reacción.

El término "oxidasa que genera peróxido de hidrógeno" significa una enzima que cataliza una reacción de oxidación/reducción que implica oxígeno molecular (02) como el aceptor de electrones. En esta región, el oxígeno se reduce a agua (H20) o peróxido de hidrógeno (H202) . Una oxidasa adecuada para el uso en este documento es una oxidasa que genera peróxido de hidrógeno (como es opuesto al agua) sobre su sustrato. Un ejemplo de una oxidasa que genera peróxido de hidrógeno y su sustrato adecuado para el uso en este documento es glucosa-oxidasa y glucosa. Otras enzimas oxidasa que se pueden usar para la generación de peróxido de hidrógeno incluyen alcohol-oxidasa, etilenglicol -oxidasa, glicerol-oxidasa, aminoácido-oxidasa , etcétera. En algunas modalidades, la oxidasa que genera peróxido de hidrógeno es una carbohidrato-oxidasa .

Como se usa en este documento, "textil" se refiere a fibras, hilados, telas, prendas y no tejidos. El término incluye textiles hechos de mezclas naturales, sintéticas (por ejemplo, manufacturadas) , y varias mezclas naturales y sintéticas. De esta manera, el término "textil (es)" se refiere a fibras no procesadas y procesadas, hilados, telas hiladas o tejidas, no tejidas y prendas. En algunas modalidades, un textil contiene celulosa.

El término "textil (es) en necesidad de procesamiento" se refiere a textiles que necesitan ser desencolados, restregados, blanqueados, y/o teñidos o pueden estar en necesidad de otros tratamientos tal como biopulido, biolavado con piedra y/o suavización.

El término "textil (es) en necesidad de blanqueado" se refiere a textiles que necesitan ser blanqueados sin referencia a otros posibles tratamientos. Estos textiles pueden o no haber sido ya sometidos a otros tratamientos. Similarmente , estos textiles pueden o no necesitar tratamientos subsecuentes.

"Tela" se refiere a un ensamble manufacturado de fibras y/o hilados que tiene un área superficial sustancial en relación con su espesor y cohesión suficiente para proporcionar el ensamble con resistencia mecánica útil.

Como se usa en este documento, los términos "purificado" y "aislado" se refiere a la remoción de contaminantes de una muestra y/o a un material (por ejemplo, una proteína, ácido nucleico, célula, etcétera) que se remueve de por lo menos un componente con el cual se asocia naturalmente. Por ejemplo, estos términos pueden referirse a un material el cual está sustancial o esencialmente libre de componentes los cuales lo acompañan normalmente como es encontrado en su estado nativo, tal como, para.

Los términos "encolado" o "encolamiento" se refieren a compuestos usados en la industria textil para mejorar el desempeño del entretejido al incrementar la resistencia a la abrasión y resistencia del hilo. El encolado se hace usualmente de, por ejemplo, compuestos de almidón o similares a almidón.

Los términos "desencolado" o "desencolamiento" , como se usa en este documento, se refieren al proceso de eliminar el encolado, generalmente almidón, de textiles usualmente antes de aplicar acabados especiales, tintes o blanqueadores .

"Enzima (s) desencoladora (s) " como se usa en este documento se refiere a enzimas que se usan para remover enzimáticamente el encolado. Enzimas ejemplares son amilasas, celulasas y mananasas.

El término "restregado" , como se usa en este documento, significa remover impurezas, por ejemplo, muchos de los compuestos no celulósicos [por ejemplo, pectinas, proteínas, cera, motas, etcétera) encontrados naturalmente en el algodón u otros textiles. Además de las impurezas no celulósicas naturales, el restregado puede remover, en algunas modalidades, materiales residuales introducidos por los procesos de manufactura, tal como lubricantes de hilado, conicidad o encolado. En algunas modalidades, el blanqueado se puede emplear para remover impurezas de textiles.

El término "enzima (s) de biorestregado" se refiere a una(s) enzima (s) capaz de remover por lo menos una porción de las impurezas encontradas en el algodón u otros textiles.

El término "motas" se refiere a impurezas no deseadas, tal como fragmentos de semillas de algodón, hojas, tallos y otras partes de plantas, las cuales se adhieren a la fibra aún después del proceso de desmotado mecánico.

El término textiles "sin procesar" (gris pronunciado) , como se usa en este documento, se refiere a textiles que no han recibido ningún tratamiento de blanqueado, teñido o acabado después de ser producidos. Por ejemplo, cualquier tela tejida o hilada fuera del telar que todavía no se ha terminado (desencolado, restregado, etcétera) , blanqueado, o teñido, es llamado un textil sin procesar .

El término "teñido" , como se usa en este documento, se refiere a la aplicación de un color, especialmente mediante remojado en una solución colorante, a, por ejemplo, textiles .

El término fibra "celulósica no de algodón", hilado o tela significan fibras, hilados o telas los cuales están comprendidos principalmente de una composición basada en celulosa diferente al algodón. Ejemplos de estas composiciones incluyen lienzo, ramio, yute, lino, rayón, lyocell, acetato de celulosa y otras composiciones similares las cuales se derivan de celulósicos no de algodón.

El término "pectato-liasa" , como se usa en este documento, se refiere a un tipo de pectinasa. "Pectinasa" indica una enzima pectinasa definida de acuerdo con la técnica donde las pectinasas son un grupo de enzimas que escinden enlaces glicosídicos de sustancias pépticas principalmente poli ( 1 , 4-alfa-D-galacturonida) y sus derivados (véase Sakai y colaboradores (1993) Advances in Applied Microbiology 39:213-294). Preferiblemente, una pectinasa útil en este documento es una enzima pectinasa la cual cataliza la escisión aleatoria de los enlaces alfa-1 , 4 -glicosídicos en el ácido péptico también llamado ácido poligalacturónico por la transeliminación, tal como la enzima clase de poligalacturonato-liasa (EC 4.2.2.2) (PGL) , también conocida como poli (1 , 4 -alfa-D-galacturonido) -liasa, también conocida como pectato-liasa .

El término "pectina" indica pectato, ácido poligalacturónico y pectina la cual se puede esterificar a un grado superior o inferior.

El término "cutinasa" , como se usa en este documento, se refiere a una enzima derivada de plantas, bacteriana o fúngica usada en el procesamiento textil. Las cutinasas son enzimas lipolíticas capaces de hidrolizar la sustrato cutina. Las cutinasas pueden degradar ésteres de ácido graso y otras composiciones basadas en aceite necesarias para1 ser removidas en el procesamiento (por ejemplo, el restregado) de textiles. "Cutinasa" significa una enzima que tiene actividad significativa de hidrólisis de cutina de plantas. Especialmente, una cutinasa tendrá actividad hidrolítica sobre el polímero cutina de biopoliéster encontrada en las hojas de las plantas. Cutinasas adecuadas pueden aislar de muchas fuentes de plantas, fúngicas y bacterianas diferentes.

El término "a-amilasa" , como se usa en este documento, se refiere a una enzima que escinde los enlaces a ( 1-4) glicosídicos de amilosa para producir moléculas de maltosa (disacáridos de a-glucosa) . Las amilasas son enzimas digestivas encontradas en la saliva y también se producen por muchas plantas. Las amilasas degradan los carbohidratos de cadena larga (tal como el almidón) en unidades más pequeñas. Una oí-amilasa "estable oxidante" es una a-amilasa que es resistente a la degradación por medios oxidantes, cuando se compara con una a-amilasa estable no oxidante, especialmente cuando se compara con la forma de a-amilasa estable oxidante con la cual se derivó la a-amilasa estable oxidante.

El término "proteasa" significa una proteína o dominio de polipéptido de una proteína o polipéptido derivado de un microorganismo, por ejemplo, un hongo, bacteria, o de una planta o animal, y que tiene la capacidad de catalizar la escisión de enlaces de péptido en una o más de varias posiciones de una cadena principal de carbohidratos de proteína.

Como se usa en este documento, "productos para el cuidado personal" significa productos usados en la limpieza, blanqueado y/o desinfección de cabello, piel, cuero cabelludo, y dientes, que incluyen, pero no se limitan a champús, lociones para el cuerpo, geles de ducha, humectantes tópicos, pastas de dientes, y/u otros limpiadores tópicos. En algunas modalidades, estos productos se usan en humanos, mientras que en otras modalidades, estos productos encuentran uso con animales no humanos (por ejemplo, en aplicaciones veterinarias) .

Una "suspensión" o "dispersión" como se usan en este documento se refiere a una sistema de dos fases en donde una fase sólida discontinua se dispersa dentro de una fase líquida continua.

Un "auxiliar de suspensión" como se usa en este documento se refiere a un material agregado a una composición líquida para prevenir o reducir la sedimentación o flotación de partículas suspendidas. Los auxiliares de suspensión funcionan típicamente al incrementar ya sea la viscosidad o el límite elástico de un líquido portador. Los fluidos con un límite elástico significativo fluirán solamente cuando se aplica tensión la cual es mayor que el límite elástico, y de esta manera exhiben un comportamiento de adelgazamiento por corte o tixotrópico. Los agentes de suspensión efectivos actúan típicamente al formar una red reversible de partículas o fibras conectadas por fuerzas débiles. Ejemplos de agentes de suspensión incluyen, pero no se limitan a, goma de xantano y celulosa microfibrosa, por ejemplo, CELLULONMR (CP Kelco, San Diego, CA) .

"Encapsulada" como se usa en este documento se refiere a una sustancia que está contenida dentro de un material circundante. Este puede incluir morfologías de núcleo y/o cubierta o matriz como se describe en la técnica {véase, por ejemplo, "Microencapsulation" Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2005) .

"Miscible" como se usa en este documento se refiere a un líquido que es capaz de mezclarse con otro líquido, en una relación especificada de los dos líquidos, sin separación en fases.

"Matriz" como se usa en este documento se refiere a un material en el cual se encierra o se integra una sustancia .

Como se usa en este documento, una "biopelícula" es una colección de microorganismos integrados en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares y varios compuestos orgánicos e inorgánicos. Aunque algunas biopelículas pueden contener una sola especie de microorganismo, típicamente las biopelículas no1 solo comprenden diferentes especies de microorganismo sino diferentes tipos de microorganismos, por ejemplo algas, protozoarios , bacterias y otros.

Sistemas de co-suministro de enzima/sustrato La invención proporciona un sistema de suministro líquido para enzima y sustrato co-formulado en el cual por lo menos una enzima se encapsula en una matriz polimérica y se formula con un sustrato para la enzima. El sustrato está en una fase líquida sustancialmente no acuosa en contacto con la matriz polimérica y en la cual la matriz polimérica no es soluble. La matriz polimérica que contiene la enzima se puede suspender en o circundar la fase líquida que contiene el sustrato. La enzima y el sustrato no están en contacto en el sistema de suministro en una configuración en la cual puede ocurrir la catálisis enzimática. Cuando se pone en contacto con agua, en la cual la matriz polimérica es soluble y en la cual la enzima está catalíticamente activa hacia el sustrato, se lleva a cabo la actividad catalítica. Una o múltiples enzimas se pueden incluir en la composición, con por lo menos una enzima encapsulada en una matriz polimérica. En algunas modalidades, el sistema de suministro contiene dos o más enzimas, encapsuladas en la misma matriz polimérica o en matrices poliméricas separadas, y el sistema de suministro contiene un sustrato para por lo menos una de las enzimas.

El sustrato se solubiliza o suspende en un líquido portador que no es sustancialmente acuoso y en el cual la matriz polimérica no es soluble. Se seleccionan el líquido portador y el polímero tal que la matriz polimérica permanece en una forma sólida y sin .linchamiento durante el almacenamiento. Esto se puede lograr, por ejemplo, con bajo contenido de agua, reticulación reversible y/o baja temperatura de almacenamiento. En algunas modalidades, la fase líquida contiene menos que aproximadamente 5%, menos que aproximadamente 1%, o menos que aproximadamente 0.5% de agua, por ejemplo, aproximadamente 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, o 0.1% de agua.

La enzima encapsulada no reacciona sustancialmente con sustrato en la fase líquida durante almacenamiento del sistema de suministro. En algunas modalidades, menos que aproximadamente 20%, 10%, 5%, 1%, o 0.5% de sustrato en la fase líquida se convierte a producto durante almacenamiento durante por lo menos aproximadamente 10 días, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, o más prolongado a aproximadamente 25 °C. En algunas modalidades, menos que aproximadamente 20%, 10%, 5%, 1%, o 0.5% de sustrato en la fase líquida se convierte a producto durante almacenamiento durante aproximadamente 10 días, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, o más prolongado de aproximadamente 37°C. En algunas modalidades, menos que aproximadamente 20%, 10%, 5%, 1%, o 0.5% de sustrato en la fase líquida se convierte a producto durante almacenamiento durante por lo menos aproximadamente 10 días, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, o más prolongado de aproximadamente 50°C.

En un sistema de suministro como se describe en este documento, una enzima encapsulada retiene por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o esencialmente todo el potencial catalítico inicial en la matriz polimérica, liberable en contacto con agua, pero no reacciona sustancialmente con el sustrato en la composición durante por lo menos aproximadamente 10 días, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, o más prolongado 25°C, 37°C, o 50°C.

Matriz Polimérica La matriz polimérica comprende, consiste de, o consiste esencialmente de un polímero que es insoluble en un fluido portador que contiene el sustrato y es soluble en agua. En algunas modalidades, la matriz polimérica comprende, consiste de, o consiste esencialmente de alcohol polivinílico, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa , polivinilpirrolidona, goma de guar, o un derivado o copolímero de los mismos, o una mezcla de los mismos. En algunas modalidades, la matriz polimérica contiene uno o más de rellenador o extendedor (por ejemplo, almidón, azúcar, arcilla, talco, carbonato de calcio, dióxido de titanio, fibra de celulosa) , plastificante (por ejemplo, glicerol, sorbitol, propilenglicol ) , co-solvente, aglutinante, agente de hinchamiento (por ejemplo, poliacrilato, croscarmelosa sódica, glicolato de almidón de sodio, hidroxipropil-celulosa de baja sustitución, galactomanano, ater-Lok, ZapLoc) , o agente de liberación.

En algunas modalidades, los polímeros son polímeros negativamente cargados, tal como hetero-polisacáridos que incluyen residuos de glucuronido y/o galacturonido . Estos polisacáridos pueden incluir por ejemplo un material producido por los organismos de los cuales las enzimas mismas se han producido, y pueden permanecer como contaminantes en las preparaciones de enzimas parcialmente purificadas aunque no tienen, tienen actividad enzimática útil. Alternativa o adicionalmente , estos polisacáridos se pueden agregar separadamente, en cantidades de hasta aproximadamente 1 a 5% en peso o más de la suspensión. Estas cantidades pueden ser comparables con aquellas de las enzimas mismas. En algunas modalidades, los polisacáridos están presentes (o agregados) antes del secado por rocío. Otros polímeros ejemplares son arabinogalactanos , xilogalactanos , y, en general, polisacáridos ácidos.

En algunas modalidades, la matriz polimérica incluye proteínas, péptidos, o derivados, de los mismos. Algunas o todas las proteínas o péptidos pueden estar presentes en un caldo de fermentación, medios de células, o preparaciones de proteínas parcialmente purificadas, y pueden permanecer como contaminantes en las preparaciones de enzimas parciamente purificadas aunque no tienen, tienen actividad enzimática útil. Alternativa o adicionalmente , estos polisacáridos se pueden agregar separadamente, en cantidades de hasta aproximadamente 1 a 5% en peso o más de la suspensión. Estas cantidades pueden ser comparables con aquellas de las enzimas mismas.

En varias modalidades, las enzimas (y opcionalmente sustratos) se encapsulan en polímeros que usan técnicas que incluyen, pero no se limitan a, fundición por solvente, secado por rocío, liofilización/secado por congelación, recubrimiento por rocío de lecho fluido, aglomeración de lecho fluido, enfriamiento por rocío, granulación húmeda, granulación por tambor, granulación de alto esfuerzo cortante, extrusión, recubrimiento por bandeja, coacervación, gelación y atomización. En modalidades particulares, se usa el secado por rocío.

En general, la cantidad de enzimas encapsuladas en la matriz polimérica es menor que 50% en peso. En varias modalidades, la cantidad de enzimas encapsuladas en la matriz polimérica es de aproximadamente 50%, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 25%, de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, o de aproximadamente 2% a aproximadamente 5% en peso.

En algunas modalidades, la matriz polimérica que contiene enzimas está en la forma de partículas que están suspendidas en una fase líquida que contiene el sustrato. En 5 varias modalidades, las partículas son de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, de aproximadamente 100 a aproximadamente 300, de aproximadamente 200 a aproximadamente 500, de aproximadamente 400 a aproximadamente 800, o de aproximadamente 600 a aproximadamente 1000 micrómetros en diámetro .

En algunas modalidades, la matriz polimérica está en la forma de una película es de aproximadamente 5 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 500, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 micrómetros en espesor .

En alguna modalidad, la matriz polimérica que contiene enzimas está en la forma de una película que forma un recipiente sellado (por ejemplo, una bolsa, sobrecito o cápsula) que circunda una fase líquida que contiene el sustrato .

Enzimas En varias modalidades, el sistema de suministro contiene una o más proteasas, esterasas, hidrolasas de serina, lipasas, perhidrolasas , oxidasas, enzimas oxidantes de fenol, lacasas, acil-transferasas , aril-esterasas , perhidrolasas, amilasas, pectinasas, xilanasas, celulasas, hemicelulasas , catalasas, peroxidasas, carbohidratos -oxidasa, mananasas, fitasas, pectinasas, peroxidasas, carbohidrato-oxidasas, cutinasas, catalasas, o una mezcla de las mismas.

En una modalidad, el sistema de suministro contiene una lacasa (una multi-cobre-oxidasa, EC 1.10.3.2, por ejemplo, de Cerrena unicolor) y un mediador (sustrato) para la lacasa, tal como sal de 2, 2' -azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) -diamonio (ABTS) , siringonitrilo (SN) , siringamida (SA) , siringado de metilo (MS) , o fenotiazina de 10-carboxipropilo (PTP) , o un mediador como se describe en la Patente Europea No. 1 064 359, 1141 321, o 0 805 465, Patente de E.U.A. No. 6,329,332, Solicitud PCT No. 00/05349, o Publicación de E.U.A. No. 2008/0196173.

En una modalidad, la enzima lacasa comprende, consiste de, o consiste esencialmente de, la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 1, a continuación, o una variante u homólogo, de la misma, que tiene por lo menos 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88. 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o aún 99% o más de identidad de secuencia, o una secuencia de aminoácidos como se describe en la solicitud PCT No. O2008/076322 , o una variante u homólogo de la misma que tiene por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99, o aún 99.5% o más de identidad de secuencia.

AIGPVADLHIV KDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRMLT PTSIH HGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLSTQYC DGLRGAFWYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTWGAATPDSTLINGLG RSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTV DSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNASVEEPKT VGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPA LLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKWELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWWRSAGS DEYNFDDAILRDWSIGAGTDEVTIRFVTDNPGP FLHCHIDWHLEAGLAIVFAEGINQT AAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI (SEQ ID NO : 1) .

En algunas modalidades, el sistema de suministro contiene una enzima perhidrolasa (por ejemplo, acil-transferasa; aril -esterasa) y sustrato (s) para producir un perácido por ejemplo, un donador de acilo tal como un sustrato de éster, por ejemplo, diacetato de propilenglicol (PGDA) , y una fuente de peróxido de hidrógeno, por ejemplo, percarbonato de sodio, perborato de sodio, peróxido ácido de urea, o un sistema generador de peróxido de hidrógeno enzimático, por ejemplo, una oxidasa generadora de peróxido de hidrógeno y su sustrato, por ejemplo, glucosa oxidasa y glucosa.

En algunas modalidades, la enzima perhidrolasa es una enzima perhidrolasa M. smegmatis de origen natural. En algunas modalidades, la enzima perhidrolasa comprende, consiste de, o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o una variante u homólogo de la misma. En algunas modalidades, la enzima perhidrolasa comprende, consiste de, o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o aún 99.5%, o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.

La secuencia de aminoácidos de perhidrolasa M. smegmatis se muestra a continuación: MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGLSARTT NIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVIIMLGTNDTKAYFRRTPLDIALGMSVLVTQV LTSAGGVGTTYPAPKVLWSPPPLAPMPHPWFQLIFEGGEQKTTELARVYSALASFMKV PFFDAGSVISTDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL (SEQ ID NO: 2) La secuencia de polinucleótidos correspondiente que codifica la perhidrolasa M. smegmatis es (5' -3') : ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGCTGGGTCCCCGTC GAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCGCTGGACCGGTGTGCT GGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGC ACCACCAACATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCAACGGCGCGAGCTACCTGCC GTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTCGACCTGGTGATCATCATGCTGGGCACCAA CGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACCCCGCTCGACATCGCGCTGGGCATGTCGG TGCTCGTCACGCAGGTGCTCACCAGCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCA CCCAAGGTGCTGGTGGTCTCGCCGCCACCGCTGGCGCCCATGCCGCACCCCTGGTTC CAGTTGATCTTCGAGGGCGGCGAGCAGAAGACCACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAG CGCGCTCGCGTCGTTCATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCAC CGACGGCGTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGG CCCTCGCGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTAA-3 ' (SEQ ID NO : 3).

En algunas modalidades, la enzima perhidrolasa comprende una o más sustituciones en una o más posiciones de aminoácidos equivalentes a la posición (es) en la secuencia de aminoácidos de perhidrolasa M. smegmatis expuesta en SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, la enzima perhidrolasa comprende cualquiera o cualquier combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionados de MI, K3 , R4 , 15, L6 , C7 , DIO, Sil, L12, T13 , W14 , W16, G15, V17, P18, V19, D21, G22 , A23 , P24, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, V32, R33, W34, T35, G36, L38, Q40, Q41, D45, L42, G43 , A44 , F46 , E47, V48, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, 160, D61, D62, P63, T64 , D65, P66, R67, L68, N69, G70, A71, S72, Y73, S76, C77, L78, A79, T80, L82 , P83 , L84, D85, L86, V87, N94 , D95, T96, K97, Y99F100, Rll, R102, P104, L105, D106, 1107, A108, L109, G110, Mili, S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P146, P148, W149, F150, 1153, F154, 1194, y F196.

En algunas modalidades, la enzima perhidrolasa comprende una o más de las siguientes sustituciones en una o más posiciones de aminoácidos equivalentes a la posición (es) en la secuencia de aminoácidos de perhidrolasa M. smegmatis expuesta en SEQ ID NO: 2: L12C, Q, o G; T25S, G, o P; L53H, Q, G, O S; S54V, L A, P, T, O R; A55G O T; R67T, Q, N, G, E, L, o F; K97R; V125S, G, R, A, O P; F154Y; F196G.

En algunas modalidades, la enzima perhidrolasa comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos equivalentes a las posiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de perhidrolasa M. smegmatis expuesta en SEQ ID NO : 2 : L12I+S54V; L12M+S54T; L12T+S54V; L12Q+T25S+S54V; L53H+S54V; S54P+V125R; S54V+V125G; S54V+F196G; S54V+K97R+V125G; o A55G+R67T+K97R+V125G .

En algunas modalidades, la suspensión líquida contiene una enzima perhidrolasa y sustratos para producir mono- y diglicéridos (por ejemplo, un donador de acilo y un aceptor de alcohol) o un éster de sorbitan (por ejemplo, un donador de acilo y sorbitan) . En algunas modalidades, la suspensión líquida contiene una enzima perhidrolasa y sustratos para producir un éster fragante, por ejemplo, un éster bencílico (por ejemplo, un donador de acilo y un alcohol volátil, por ejemplo alcohol bencílico) .

En algunas modalidades, la enzima es una perhidrolasa y el sistema de suministro contiene un sustrato de éster o mezcla de sustrato de éster, por ejemplo, un éster de acetato, por ejemplo, diacetato de propilenglicol (PGDA) , acetato de etilo, acetato de butilo, acetato de hexilo, acetato de octilo, propionato de etilo, propionato de butilo, propionato de hexilo, acetato de isoamilo, acetato de citronelilo, propionato de citronelilo, acetato de dodecilo, acetato de Neodol 23-3, acetato de Neodol 23-9, diacetato de etilenglicol , triacetina, tributirina, metoxiacetato de etilo, acetato de linalilo, butirato de etilo, isobutirato de etilo, butirato de etil-2-metilo, isovalerato de etilo, isovalerato de dietilo, maleato de dietilo, glicolato de etilo, o una mezcla de los mismos.

En algunas modalidades, en sistema de suministro contiene una proteasa y por lo menos otra enzima sensible a la proteasa, por ejemplo, una enzima que es hidrolizable por la proteasa, encapsulada en las mismas o matrices separadas poliméricas, o en donde una de la proteasa o la enzima sensible a la proteasa se encapsula en una matriz polimérica y la otra enzima está en una fase líquida en el sistema de suministro, y la proteasa no está sustancialmente de manera catalítica activa hacia la enzima sensible a la proteasa hasta que se agrega agua al sistema de suministro.

Líquidos Portadores El sistema de suministro incluye un sustrato para una enzima encapsulada en un líquido portador en el cual la matriz polimérica (en la cual la enzima se encapsula) es sustancialmente insoluble. Ejemplos no limitantes de líquidos portadores incluyen glicoles, tensoactivos no iónicos, alcoholes, poliglicoles y ésteres de acetato. En algunas modalidades, el líquido portador es, por sí mismo, un sustrato para la enzima.

Ingredientes adjuntos opcionales En algunas modalidades, el sistema de suministro incluye uno o más tensoactivos es decir, un tensoactivo no iónico, aniónico, catiónico, anfolítico, zwitteriónico , o no iónico semi-polar, o una mezcla de los mismos. En algunas modalidades, el sistema de suministro incluye uno o más de: un auxiliar de suspensión, un agente quelante, un agente estabilizador, un emulsificante, un agente regulador, y/o una mezcla de los mismos.

Composiciones La invención proporciona composiciones que contienen sistemas de co-suministro de enzima/sustrato como se describe en este documento. Composiciones ejemplares incluyen: una composición de limpieza, una composición desinfectante, una composición de descontaminación, una composición de procesamiento textil, una composición blanqueadora, una composición de tinción textil, una composición para el cuidado personal, una composición de tinción para el cabello, una composición de procesamiento de pulpa o papel, una composición de producción compuesta de madera, una composición de procesamiento de agua residual, una composición para hornear, una composición para elaboración de cerveza, una composición de alimento para animal, una composición de procesamiento de almidón y/o una 5 composición de fermentación de etano. El sistema de suministro se puede almacenar en la composición y se puede mezclar dentro de la composición en el punto de uso.

En una modalidad, se proporciona una composición detergente para el uso en una aplicación de limpieza. Además del sistema de co-suministro de enzima/sustrato descrito en este documento, una composición detergente puede contener uno o más ingredientes detergentes seleccionados de tensoact ivos , mej oradores, blanqueadores, precursores de blanqueado, estabilizantes de enzimas, agentes de complexión, agentes quelantes, reguladores de espuma, inhibidores de corrosión, agentes antielectrostáticos, tintes, perfumes, bactericidas, fungicidas y activadores. El sistema de suministro se puede almacenar en la composición detergente o se puede mezclar dentro de la composición en el punto de uso.

Métodos de uso Métodos de limpieza Los sistemas de co-suministro de enzima/sustrato descritos en este documento se pueden usar en métodos para limpieza. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para limpieza, que comprende, poner en contacto un artículo que contiene una mancha con una composición detergente que comprende un sistema co-suministro de enzima/sustrato como se describe en este documento en presencia de agua, en donde por lo menos se remueve una porción de la mancha. Enzimas adecuadas para el uso en métodos de limpieza en este documento incluyen, pero no se limitan a, proteasas, amilasas, perhidrolasas , oxidasas, lipasas, celulasas, xilanasas, mananasas, esterasas, cutinasas, poliesterasas , pectinasas, enzimas oxidantes de fenol, catalasas, lisozimas, y hemicelulasas .

En una modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la transferencia de tinte de una tela teñida a otra tela durante el lavado, que comprende un sistema de co-suministro de enzima/sustrato como se describe en este documento en presencia de agua, en donde el sistema de suministro contiene una enzima capaz de blanquear, por ejemplo, una enzima oxidante de fenol, tal como lacasa, o una peroxidasa, en donde por lo menos una porción de las sustancias coloreadas lixiviadas de la tela teñida y/o manchada se blanquean, previniendo en consecuencia la re-deposición de sustancias coloreadas a la otra tela en el lavado .

Métodos de procesamiento textil Los sistemas de co-suministro de enzima/sustrato descritos en este documento se pueden usar en métodos para el procesamiento textil. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para el blanqueado de un textil, que comprende poner en contacto un textil con un sistema de co-suministro de enzima/sustrato que contiene por lo menos una enzima y un sustrato capaz de blanquear un textil, por ejemplo, una perhidrolasa y sustratos para producir un perácido o una enzima oxidante de fenol, por ejemplo, una lacasa, y un mediador capaz de producir un efecto blanqueador, en presencia de agua, durante un período de tiempo y bajo condiciones adecuadas para permitir el blanqueamiento medible del textil, produciendo en consecuencia un textil blanqueado. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para cambiar el color de un textil (por ejemplo, teñir el textil) , que comprende poner en contacto el textil con un sistema de co-suministro de enzima/sustrato que contiene una enzima y un sustrato capaces de cambiar el color de un textil, por ejemplo, una enzima oxidante de fenol, por ejemplo, una lacasa, y un mediador capaz de efectuar un cambio de color, en presencia de agua, durante un período de tiempo y bajo condiciones adecuadas para permitir un cambio de color medible en el textil, produciendo en consecuencia un textil con un cambio en el color .

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para pretratamiento combinado de textiles en un solo proceso, en donde el sistema de co-suministro de enzima/sustrato comprende por lo menos dos enzimas de procesamiento textil. Por ejemplo, un proceso combinado para desencolar, restregar, y blanquear incluye una enzima perhidrolasa y sustrato (s) (por ejemplo, sustrato de éster y fuente de peróxido de hidrógeno) como se describe en este documento y amilasa y enzimas pectinasa. Un proceso de restregado y blanqueado combinado incluye una enzima perhidrolasa y sustrato (s) como se describe en este documento y una enzima pectinasa. Un proceso de desencolado y blanqueado combinado incluye una enzima perhidrolasa y sustrato (s) como se describe en este documento y una enzima amilasa. Una enzima pectinasa en los métodos de pretratamiento textil combinados descrita en este documento se puede usar por sí misma o en combinación con una o más de otras enzimas tales como proteasa, lipasa, celulasa, cutinasa y/o hemicelulasa .

Métodos de esterilización, desinfección y/o descontaminación que usan una enzima perhidrolasa Los sistemas de co-suministro de enzima/sustrato de la presente invención (y sistema relacionados y kit que incorporan estas composiciones) se pueden usar en una gama de métodos para descontaminar, desinfectar y/o esterilizar artículos .

En algunas modalidades, el método para descontaminación comprende: (a) proporcionar un sistema de co-suministro de enzima/sustrato como se describe en este documento que comprende una enzima con actividad perhidrolasa encapsulada en un polímero soluble en agua, en donde la actividad comprende una relación de perhidrólisis a hidrólisis de por lo menos 2:1; una d peróxido de hidrógeno; y un sustrato; y (b) agregar la composición al agua y mezclar bajo condiciones y durante un período de tiempo suficiente para solubilizar la matriz polimérica y para generar una solución acuosa de por lo menos aproximadamente 0.16% de ácido peracético en peso, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20 minutos, y un pH menor que aproximadamente 9.0; y (c) exponer un artículo que comprende un contaminante a la solución.

En una modalidad, el método para descontaminación comprende: (a) proporcionar un sistema de co-suministro de enzima/sustrato que comprende una enzima aciltransferasa encapsulada en un polímero soluble en agua, una fuente de peróxido de hidrógeno, y diacetato de propilenglicol ; (b) agregar la composición al agua y mezclarla bajo condiciones y durante un período de tiempo suficiente para solubilizar la matriz polimérica y generar una solución acuosa de por lo menos aproximadamente 0.16% de ácido peracético en peso, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20 minutos; y (c) exponer un artículo que comprende un contaminante a la solución.

En algunas modalidades, la fuente de peróxido de hidrógeno es un compuesto generador de peróxido de hidrógeno, por ejemplo, seleccionado de percarbonato de sodio, perborato de sodio, y peróxido ácido de urea. En algunas modalidades, la fuente de peróxido de hidrógeno es un sistema enzimático, tal como una oxidasa generada de peróxido de hidrógeno y su sustrato, por ejemplo, glucosa-oxidasa y glucosa. La oxidasa generadora de peróxido de hidrógeno se puede encapsular en una matriz polimérica (la misma como o separada de la matriz polimérica en la cual la enzima perhidrolasa se encapsula) o se solubiliza o se suspende en la fase líquida en el sistema de suministro. El sustrato para la oxidasa generadora de peróxido de hidrógeno se puede encapsular en una matriz polimérica (la misma como o separada de la. matriz polimérica en la cual la enzima perhidrolasa se encapsula) o se solubiliza o se suspende en la fase líquida en el sistema de suministro .

Dependiendo del tipo específico de contaminante que se remueve, la etapa de exponer el artículo a la solución de perácido se puede realizar sobre un amplio intervalo de escalas de tiempo. Por ejemplo, en ciertos tiempos de exposición de procedimientos de esterilización o tan cortos como aproximadamente 30 segundos, 1 minuto, 5 minutos o 10 minutos pueden ser suficientes. Sin embargo, en otras aplicaciones (por ejemplo, remoción de biopelículas) , puede ser necesario exponer el artículo durante períodos considerablemente más prolongados de tiempo, tal como aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, o aún más prolongados, a fin de lograr un nivel adecuado de descontaminación.

De manera similar, la temperatura de la solución de perácido durante la etapa de exposición se puede ajustar dependiendo del tipo particular de contaminante. En una modalidad, la temperatura de exposición es la temperatura ambiente en la cual la solución se prepara, es decir, típicamente de manera aproximada 18-25°C. En otras modalidades, se pueden usar temperaturas más altas para facilitar el proceso de descontaminación. En general, las temperaturas más altas acelerarán la actividad de la solución de perácido, acelerando en consecuencia el proceso de descontaminación. De esta manera, en algunas modalidades, la etapa de exposición se puede llevar a cabo con la solución de perácido a aproximadamente 30°C, 37°C, 45°C, 50°C, 60°C, 75°C, 90°C, o aún más alto.

En una modalidad de los métodos, la matriz polimérica que contiene enzimas está en la forma de un recipiente soluble en agua en el cual los sustratos se encierran en una fase líquida y el recipiente se agrega al agua .

Los métodos de descontaminación son útiles contra una amplia gama de contaminantes que incluyen toxinas seleccionadas del grupo que consiste de toxina de botulinum, toxina de anthracis, ricina, toxina escombroide, ciguatoxina, tetradotoxina, micotoxinas, y cualquier combinación de las mismas; y patógenos seleccionados del grupo que consiste de bacterias, virus, hongos, parásitos, priones, y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, los métodos dados a conocer en este documento se pueden usar la contaminación de materiales contaminados con materiales que incluyen pero no se limitan a químicos tóxicos, mostaza, VX, esporas de B. anthracis, Y. pestis, F. tularensis, hongos y toxinas (por ejemplo, botulinum, ricina, micotoxinas, etcétera) , así como también células infectadas con virones infecciosos (por ejemplo, flavivirus, ortomixovirus , paramixovirus , arenavirus, rabdovirus, arbovirus, enterovirus, bunyavirus, etcétera) . En algunas modalidades, el por lo menos un patógeno se selecciona de Bacillus sp . , B. anthracis, Clostridium spp., C. botulinum, C. perfringens, histeria spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Salmonella spp., Shigella spp., E. coli, Yersinia spp., Y. pestis, Francisella spp., F. tularensis, Comply ohacter ssp., Vibrio spp., Brucella spp., Cryptosporidium spp., Giardia spp., Cyclospora spp., y Trichinella spp.

Las soluciones de perácido generadas usando los sistemas de suministro descritos en este documento y los métodos de su uso son efectivas en la descontaminación de biopelículas. Uno de los aspectos característicos de las biopelículas es que los microorganismos en las mismas actúan de manera cooperativa o sinérgicamente . Empíricamente se ha descubierto que los microorganismos que viven en una biopelícula se protegen mejor de biocidas que los microorganismos que viven fuera de una biopelícula. De esta manera, la remoción de biopelículas patogénicas representa un problema particularmente difícil en la descontaminación y/o esterilización de equipo.

En algunas modalidades, las composiciones estables hechas que se usan para generar una solución de perácido son útiles para remover biopelículas, incluyendo aquellas formadas por una o más bacterias patogénicas seleccionadas del grupo que consiste de: Bacillus spp., B. anthracis, Clostridium spp., C. botulinum, C. perfringens, Listeria spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Salmonella spp., Shigella ssp. , E. coli, Yersinia spp., Y. pestis, Francisella spp., F. tularensis, Camplyobacter ssp., Vibrio spp., Brucella spp., Cryptosporidium spp., Giardia spp., Cyclospora spp., Trichinella spp., y cualquiera combinación de las mismas. En una modalidad, una solución de perácido hecha por los métodos de la presente invención se puede usar para descontaminar biopelículas seleccionadas del grupo que consiste de: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (SRWC-10943) , Listeria onocytogenes (ATCC 19112) , y cualquiera combinación de las mismas.

En una modalidad, las biopelículas patogénicas que comprenden cultivos bacterianos de Pseudomonas spp . , Staphylococcus spp., y/o Listeria spp., que contaminan el equipo de acero inoxidable se pueden remover sustancialmente (es decir, reducción de ~ 500-1000 veces) mediante la exposición a 0.16% en peso de una solución de PAA. (generada del sistema de co-suministro de enzima/sustrato que contiene perhidrolasa) a 45°C durante 45 minutos.

En varias modalidades, los métodos de descontaminación que usan los sistemas de suministro que contienen perhidrolasa descritos en este documento son útiles para la esterilización/descontaminación de una amplia gama de artículos contaminados que incluyen superficies duras, telas, alimentos, prendas de vestir, tapetes, alfombras, textiles, instrumentos médicos, instrumentos veterinarios, por ejemplo, artículos y equipo de acero inoxidable, incluyendo reactores grandes, usados en los procesos farmacéuticos y de biotecnología.

Las soluciones de perácido generadas enzimáticamente usando los sistemas de suministro descritos en este documento son particularmente bien adecuados para limpiar artículos y equipo de acero inoxidable debido a la relación de perácido ácido correspondiente generada en la solución acuosa es mucho más alta que la encontrada en las soluciones comerciales. Por ejemplo, una solución de acido peracético (PAA) generada usando la composición estable de variante S54V de MsAcT, percarbonato, y diacetato de propilenglicol (PGDA) , tendrán una relación de PAA a ácido acético de aproximadamente 10:1. Las soluciones de PAA comerciales tienen típicamente más ácido acético que PAA y pueden tener aún la relación inversa (1:10) . La relación incrementada de PAA a ácido acético reduce, u obvia completamente, la necesidad de llevar a cabo tratamientos de pasivación adicionales del artículo o equipo de acero inoxidable después del tratamiento con PAA. De esta manera, en algunas modalidades, las soluciones de perácido generadas usando las composiciones estables de la presente invención se pueden usar para esterilizar artículos y equipo de acero inoxidable, incluyendo reactores grandes, usados en los procesos farmacéuticos y de biotecnología. En algunas modalidades, las soluciones de perácido se pueden usar para esterilizar artículos y equipo de acero inoxidable y en una sola etapa, sin la necesidad de ningún tratamiento adicional del acero con un agente de pasivación.

En modalidades aún adicionales, los sistemas de suministro descritos en este documento se pueden usar en la descontaminación de alimento y/o forraje, incluyendo pero no limitado a vegetales, frutas, y otros artículos de alimento y/o forraje. De hecho, se contempla que la presente invención encontrará uso en la limpieza de superficie de frutas, vegetales, huevos, carnes, etcétera. De hecho, se propone que la presente invención encontrará uso en las industrias alimenticias y/o de forraje para remover contaminantes de varios artículos alimenticios y/o de forraje. En algunas modalidades, los métodos para la descontaminación de alimentos y/o forraje expuestos por la administración de alimentos y fármacos y/u otras entidades de seguridad alimenticia, como es sabido por aquellas personas de experiencia en la técnica que encuentran uso con la presente invención .

En modalidades aún adicionales, el artículo en necesidad de descontaminación se selecciona de superficies duras, telas, alimento, forraje, prendas de vestir, tapetes, alfombras, textiles, instrumentos médicos e instrumentos veterinarios. En algunas modalidades, el alimento se selecciona de frutas, vegetales, pescado, mariscos, y carne. En algunas modalidades aún adicionales, las superficies duras se seleccionan de superficies domésticas y superficies industriales. En algunas modalidades, las superficies domésticas se seleccionan de encimeras de cocina, lavaderos, armarios, tablas de corte, mesas, estantería, reparación de alimentos, áreas de almacenamiento, accesorios de baño, pisos. Techos, paredes y áreas de dormitorio. En algunas modalidades alternativas, las superficies industriales se seleccionan de área de procesamiento de alimentos, áreas de procesamiento de forraje modalidades, mesas, estantería, pisos, techos, paredes, lavaderos, tablas de corte, aeroplanos, automóviles, trenes y botes.

Kits La invención también proporciona kits de partes o "kits" . En una modalidad, un kit proporciona un sistema de co-suministro de enzima/sustrato como se describe en este documento, con instrucciones para el uso en una aplicación, incluyendo cualquiera de los métodos descritos en este documento (por ejemplo, un método de limpieza o un método de procesamiento textil) , en el cual es útil la actividad enzimática en la dilución en agua. Se proporciona un empaquetamiento adecuado. Como se usa en este documento, "empaquetamiento" se refiere a una matriz o material sólido usado acostumbradamente en un sistema y capaz de mantener dentro de los límites fijos componentes de un kit como se describe en este documento, por ejemplo, un sistema de co-suministro de enzima/sustrato.

Se pueden proporcionar instrucciones en forma impresa o en la forma de un medio electrónico tal como un disco flexible, CD, o DVD, o en la forma de una dirección de internet donde se pueden obtener estas instrucciones.

Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar, pero no limitar, la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Se prepararon matrices de alcohol polivinílico que contienen enzimas (PVA) usando un método de fundición por solvente. Se agregó una parte de concentrado líquido de enzimas (aproximadamente 35 mg/ml de enzima) a nueve partes de una solución de polímero al 10% y se mezcló completamente. Esta solución se esparció sobre una lámina de vidrio y se dejó secar a temperatura ambiente. Las películas de polímero secas contuvieron aproximadamente 3.5% en masa de enzimas, y tuvo un espesor de aproximadamente 50-100 µt?. Estas películas se cortaron en discos circulares de 4 mm de diámetro para prueba subsecuente .

Los polímeros de PVA usados en este experimento fueron dos diferentes grados comerciales de DuPont : Elvanol 51-05 (hidrólisis al 88%, grado de polimerización nominal 500) y Elvanol 71-30 (hidrólisis al 98%, grado de polimerización nominal 1500) .

Lixiviación de Enzimas Para evaluar la lixiviación de enzimas, se incubaron discos de diacetato de propilenglicol (PGDA) durante aproximadamente 46 horas en viales de vidrio a 37°C. Después de la incubación, se removieron los discos de los viales de vidrio y se removió el PGDA de exceso mediante absorción con paños tejidos. Los discos se colocaron en 4 mi H20 para solubilizar el PVA. La actividad enzimática en cada disco pre- incubado se midió y se comparó con la actividad en discos recientemente cortados que no habían sido incubados en PGDA, usando el ensayo de velocidad de pNB .

El ensayo de velocidad de pNB se realizó como sigue: Esquema de reacción: Butirato de p- „ ,_ . p-Nitrofenolato , Butirato ,„ ... .

Nitrofenilo ( "pNB" , (Amarillo) Incoloro Solución Amortiguadora de Ensayo (Tris 100 mM pH 8.0 + Tritón al 0.1% X-100) Para preparar 1000 mL, diluir 100 mL de Tris 1M (pH 8.0) y 1.0 mL de Tritón X-100 en agua Milli-Q.

Solución Madre de Sustrato (p-Nitrofenil -Butirato 100 mM en DMSO) Para preparar 10 mL, agregar 174.3 µL de pNB a 10 7 mL de DMSO dividido en alícuotas de 1-mL y almacenar a -20°C. Se puede mantener una solución de trabajo a temperatura ambiente y descartar cuando el color amarillo de fondo se vuelve inaceptablemente intenso.

Protocolo de Cubeta Individual 1. Ajustar el espectrofotómetro con el programa de ensayo AAPF estándar, temperatura a 25°C. 2. Diluir 10 µ??? de Solución Madre de Sustrato en 1 mL de Solución Amortiguadora de Ensayo en una cubeta de 1-mL desechable. Equilibrar a 25°C. 3. Iniciar la reacción con 10 µ? de solución de enzima 4. Iniciar el espectrofotómetro . 5. Determinar la velocidad (AA4i0/min) .

Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Blanqueado Textil Tres muestras de tejido de 100% de algodón cada una de 7.62 cm x 10.16 cm (3 pulgadas x 4 pulgadas) (Testfabrics , estilo #428U, satín de algodón desencolado) y tres muestras entrelazadas de algodón de 7.62 cm x 10.16 cm (3 pulgadas x 4 pulgadas) cada una se lavaron en un Launder-0-Meter con y sin discos de perhidrolasa PVA, bajo las siguientes condiciones: Relación de licor: 50:1 pH 7 (solución amortiguadora de fosfato de sodio 100 M) Temperatura: 60 °C PGDA: 4 ml/l H202 (50%) : 4 ml/1 Tiempo de incubación: 60 minutos Enzima perhidrolasa : siete discos de perhidrolasa PVA de 0.40 era (5/32 pulgadas) .

Se cuantificó el desempeño del blanqueado con respecto a las muestras de satín de algodón al 100% al medir los valores CIE L* usando un Cromámetro Minolta CR-200. Los valores CIE L* más altos indican efectos de blanqueado más altos. Los resultados se muestran en la Tabla 1. El entrelazado de algodón se incluyó como balastro y no se evaluó el blanqueado de entrelazado.

Un control "sin enzimas" incluyó todos los componentes anteriores excepto los discos de PVA.

Tabla 1 Tipo Peso Velocidad (disuelto en 4 Disco de actividad Blanqueamiende del mi de HjO) de enzimática to (CIE L*) Pelícu disc total/mg la o 1 2 Pro. Desv . Pro. Desv. Pro. Des . (mg) Est. Est. Est .

Disco 2.0 0.7 0.7 0.77 0.03 153 recién- 9 5 7 te 1 1513 35 93.44 0.10 Disco 2.0 0.7 0.7 0.74 0.02 148 51-05 recient 3 6 8 e 2 Disco 1.9 0.6 0.6 0.68 0.01 114 incubad 8 9 1 0 1 Disco 2.0 0.7 0.7 0.75 0.03 150 1473 45 incubad 3 8 4 0 2 Disco 2.5 0.7 0.7 0.75 0.00 120 recient 5 6 6 e 1 1189 24 93.30 0.10 Disco 2.6 0.7 0.7 0.76 0.01 117 71-30 recient 6 7 2 e 2 Disco 2.3 0.7 0.7 0.73 0.01 126 incubad 2 3 1 o 1 Disco 2.6 0.7 0.7 0.77 0.01 118 1220 57 incubad 6 8 0 o 2 Sin 89.33 0.15 Enzima s Ejemplo 2 Se cortaron discos circulares de 0.40 cm (5/32 pulgadas) en diámetro de película de PVA (Elvanol 51-05) que fue de aproximadamente 50-100 µp? en espesor y contuvo enzimas perhidrolasa y a-amilasa encapsuladas ("discos de perhidrolasa/oí-amilasa PVA") - Las enzimas se encapsularon en la matriz polimérica como se describe anteriormente, pero con 9 partes de solución de polímero al 10% a una parte cada una de concentrado de perhidrolasa y concentrado de amilasa. La película de polímero resultante fue de aproximadamente 2.5% en masa de cada enzima.

Lixiviación de Enzimas Para evaluar la lixiviación de enzimas de los discos, se incubaron tres discos en viales de vidrio sellados con o sin PGDA a 37°C durante 60 horas. Después de la remoción de los viales, cada disco se disolvió en 4 mi de agua Milli-Q. Se midió la actividad de alfa-amilasa usando el kit de ensayo de velocidad Ceralpha disponible de Megazyme International Ireland Limited. La actividad de alfa-amilasa se evalúo por hidrólisis de maltoheptaosido de p-ni t rofeni lo bloqueado en presencia de niveles de exceso de una a-glucosidasa termoestable , dando por resultado hidrólisis cuantitativa del fragmento de maltosacárido de p-ni trofenilo a glucosa y sin p-ni trof enol . La actividad de la perhidrolasa se midió usando el ensayo de velocidad de pNB como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 2. La actividad de la Perhidrolasa (*) es el promedio de seis mediciones (dos por disco) y la actividad de la amilasa es el promedio de mediciones (una por disco) . La actividad se representa como AA4i0/min para ambas enzimas.

Tabla 2 Blanqueado y Desencolado de Textiles Tres muestras de tela de satín de algodón sin procesar de 7.62 cm x 10.16 cm (3 pulgadas x 4 pulgadas) (Testfabrics , estilo #428R) y tres muestras de tela entrelazada de algodón sin procesar de 7.62 cm x 10.16 cm (3 pulgadas x 4 pulgadas) se lavaron en un Launder-Ometer con y sin discos de perhidrolasa/amilasa PVA, bajo las siguientes condiciones : Relación de licor: 50:1 pH: 7 (solución amortiguadora de fosfato de sodio 100 mM) Temperatura: 60°C PGDA: 4 ml/1 H202 (50%) : 4 ml/1 Tiempo de incubación: 60 minutos Enzimas: quince discos de perhidrolasa PVA/amilasa de 0.40 cm (5/32 pulgadas) .

Para evaluar el desencolado, se cortaron discos de tela de 1.59 cm (5/8 pulgadas) de cada muestra sin procesar tratada, y luego los discos se mancharon con solución de yodo durante 1 minuto a temperatura ambiente. Los discos de tela luego se enjuagaron con agua fría, se limpiaron con toallitas, y el color de los discos luego se midió usando un cromámetro Minolta CR-200. Los valores CIE L* se calcularon para cuantificar la profundidad del manchado con yodo. El desempeño del blanqueado se evalúo para las muestras como se describe en el ejemplo 1. Un color más claro sobre un disco de tela indica que hay menos almidón presente, indicando una eficacia de desencolado superior. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 Ejemplo 3 Enzima lacasa de Cerrería unicolor, como se describe en la Solicitud PCT No. WO 2008/076322, se encapsuló en alcohol polivinílico Elvanol 52-22 (hidrólisis al 88%, grado de polimerización 1300 nominal) , el cual se disuelve en agua a temperatura ambiente. La película polimérica contuvo 1.5% en masa de lacasa, 8.5% en masa de sólidos concentrados de ultraf iltración sin enzimas de fermentación, y 90% en masa de polímero. Se cortaron discos circulares de 040 cm (5/32 pulgadas) en diámetro de la película de PVA que contiene enzima lacasa encapsulada ("discos de lacasa PVA") . La enzima se encapsuló en el polímero como se describe en el ejemplo 1.

Lixiviación de Enzimas La lixiviación de enzimas de los discos de lacasa PVA se evaluó usando tres mediadores diferentes de lacasa como sustratos para la enzima. 1. ABTS Se insertaron dos discos de lacasa PVA en un vial de vidrio con una solución de 1 mi de PGDA que contiene 1% en peso de ABTS (2 , 2 ' -azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato de diamonio) y se incubaron durante 10 días a temperatura ambiente (vial "2" en la Figura 2) . La misma preparación sin discos de lacasa PVA se preparó como un control negativo (vial "1" en la Figura 2) . Además, se disolvieron dos discos de lacasa PVA en 100 µ? de agua desionizada y luego se agregaron a un vial que contiene 1 mi de PGDA con ABTS al 1% como un control positivo (vial "3" en la Figura 2) . Se supervisaron los cambios de color de estas soluciones como una indicación de la lixiviación de enzimas.

Después de 10 días de incubación a temperatura ambiente, no se observaron cambios de color en los viales 1 y 2. Sin embargo el color de la solución en el vial 3 cambió de verde oscuro tanto pronto como la lacasa disuelta se agregó al vial, indicando la reacción de la lacasa y el mediador. 2. SA Se insertaron dos discos de lacasa PVA en un vial de vidrio con una solución de 1 mi de PGDA que contiene 1% en peso de siringamida (3 , 5-dimetoxi-4-hidroxibenzamida; "SA") y se incubaron durante 10 días a temperatura ambiente ("4" en la Figura 3) . Se preparó la misma preparación sin discos de lacasa PVA como un control negativo ("5" en la Figura 3) . Además, se disolvieron dos discos de lacasa PVA en 100 µ? de agua desionizada y luego se agregaron a un vial que contiene 1 mi de PGDA con SA al 1% como un control positivo ("6" en la Figura 3) .

El color de la solución que contiene lacasa disuelta ("6") cambió de amarillo claro a café, indicando la lacasa reaccionada con el mediador. Sin embargo, la misma preparación con los discos de enzimas encapsuladas ("4",) no cambió de color durante los 10 días de incubación y estos resultados sugieren que la lacasa encapsulada no reaccionó con la SA en la solución de PGDA.

Después de 10 días de incubación a temperatura ambiente, se centrifugaron las soluciones incubadas y la absorbancia se midió a 420 nm en un espectrofotómetro . Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 3. SN Se insertaron dos discos de la lacasa PVA en un vial de vidrio con una solución de 1 mi de PGDA que contiene 5% en peso de siringonitrilo (3 , 5-dimetoxi-4-hidroxibenzonitrilo ,- "SN") y se incubaron durante 10 días a temperatura ambiente ("8" en la Figura 4) . Se preparó la misma preparación sin los discos de lacasa PVA como un control negativo ("7" en la Figura 4) . Además, se disolvieron dos discos de lacasa PVA en 100 µ? de agua desionizada y luego se agregaron a un vial que contiene 1 mi de PGDA con SN al 1% como un control positivo ("9" en la Figura 4 ) .

Dentro de 1 hora, el color del vial 9 cambió de un color café verdoso, indicando que la lacasa reaccionó con el SN. El color de los viales 7 y 8 permaneció sin cambio durante el período de incubación de 10 días.

Prueba de aplicación Preparación de la ezclilla Mezclilla de fondo de azufre/teñida con índigo desencolada y mezclilla teñida con índigo al 100% desencolada se trataron en una lavadora giratoria (escala de laboratorio 501b) con lg/L de celulasa INDIAGE 44LMR a 55°C y pH 4.8 durante 60 minutos en una relación de licor de 10:1 seguido por dos enjuagues y luego se secó.

Para los experimentos de placas de microtítulo de 12 pocilios descritos a continuación, se cortaron muestras de tela redondas de 1.59 cm (5/8 pulgadas) de diámetro de la tela de mezclilla pre-tratada con celulasa. Para los experimentos Launder-Ometer descritos a continuación, se cortaron muestras de tela de 7.62 cm x 10. 16 cm (3 pulgadas x 4 pulgadas) de la tela de mezclilla pre-tratada con celulasa y luego los bordes se cosieron para prevenir el deshilado durante el tratamiento.

Evaluación del Desempeño del Blanqueado Para cuantificar los efectos de blanqueado, se tomaron lecturas del reflectómetro de cada muestra de tela de mezclilla antes y después del tratamiento usando un medidor Chroma CR-200 por Minolta. Se calculó la diferencia total de color (??) de acuerdo con la siguiente fórmula: Diferencia de color total (??) = --J[AL2 + Aa2+Ab2) , (donde AL, Aa, Ab, son diferencias en los valores CIE L*, CIE a*, y CIE b* respectivamente, antes y después del blanqueado con lacasa) .

Experimentos de Placas de Microtítulo de 12 Pocilios Se incubaron muestras de mezclilla pre-tratada de 1.59 cm (5/8 pulgadas) de diámetro en una placa de microtítulo de 12 pocilios bajo las siguientes condiciones: 1. Solución amortiguadora únicamente 2. Solución amortiguadora + 50 µ? de solución de PGDA que contiene SN al 5% 3. Solución amortiguadora + 50 µ? de solución de PGDA que contiene SN al 5% SN + lacasa encapsulada ¦ ensayo de placas de microtitulación de 12 pocilios (2 mi de volumen de reacción) ¦ pH : 6 (solución amortiguadora de acetato de sodio 50 en agua) ¦ Temperatura ¦ Tiempo de incubación: 60 minutos 4 ¦ Enzima: 5 discos de 0.40 cm (5/32 pulgadas) de película encapsulada con lacasa por prueba ¦ Mediador: 50 µ? de solución de PGDA que contiene siringonitrilo al 5% por prueba.

Los resultados se muestran en la Figura 5. Se observó un efecto de blanqueado notable cuando las muestras de mezclilla se incubaron con discos de lacasa PVA. Los resultados indicaron claramente que el agua desencadenó la liberación de la lacasa de la película polimérica en la cual se encapsuló, proporcionando acceso al mediador y dando por resultado la reacción de la enzima con el mediador para ocasionar el blanqueado.

Experimentos de Launder-Qmeter Se incubaron muestras de mezclilla pre-tratada con celulasa de 7.62 cm x 10. 16 cm (3 pulgadas x 4 pulgadas) en un Launder-Ometer bajo las siguientes condiciones: (A) 1 mi de solución de PGDA que contiene SN al 5% (B) 1 mi de solución de PGDA que contiene SN al 5% y 0.15 g de lacasa encapsulada (C) 1 mi de solución de PGDA que contiene ABTS al 5% (D) 1 mi de solución de PGDA que contiene ABTS al 5% y 0.15 g de lacasa encapsulada ¦ Launder-Ometer (250 mi de volumen de reacción total) ¦ pH: 6 (solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM en agua) ¦ Temperatura: 60 °C ¦ Tiempo de incubación: 60 minutos ¦ 0.15 g de película de lacasa encapsulada cortada en piezas pequeñas aleatorias ¦ Mediador: o Siringonitrilo (SN) o 2,2' -azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) de diamonio (ABTS) Los resultados se muestran en la Tabla 5 y en la Figura 6. Las muestras de mezclilla tratadas con la preparación (B) (lacasa + sistema de co-suministro SN) se blanquearon significativamente. El color de las muestras de mezclilla tratadas con la preparación (D) (lacasa + sistema de co-suministro ABTS) se tiñó en un color púrpura claro.

Tabla 5 Diferencia de Color Entre Antes y Después de los Tratamientos Delta L Delta a Delta b Delta E Pro. Desv. Pro. Desv. Pro. Desv . Pro. Desv .

Est . Est . Est . Est .

Solución amortiguadora + PGDA + 0.38 0 . 62 -0.15 0 . 18 0.37 0 . 02 0.65 0 .41 Mediador (SN) Solución amortiguadora + PGDA + 16.35 1 .49 -2.78 o . os 6.39 1 .04 17.96 1 .76 Mediador (SN) + Lacasa Encapsulada Solución amortiguadora + PGDA + 0.32 0 . 71 -0.07 0 . 15 0.29 0 . 11 0.64 0 . 32 Mediador (ABTS) Solución amortiguadora + PGDA + 17.41 0 . 28 1.45 0 .25 7.31 0 .06 18.94 0 .26 Mediador (ABTS) + Lacasa Encapsulada Ejemplo 4 Sistema de blanqueado con enzimas estabilizadas Este ejemplo demuestra como la encapsulación de enzimas con una matriz de polímero se puede usar para estabilizar un sistema de blanqueado o desinfección enzimática de una botella. El sistema de una botella se designa para producir ácido peracético en la dilución con agua. Sus componentes son: perborato de sodio, diacetato de propilenglicol (PGDA) y arilesterasa (ArE) y un fluido portador no acuoso. En esta modalidad, el fluido portador fue un tensoactivo no iónico de etoxilado de alcohol (Novel 1012-6 de Sasol Co.; Hamburg, DE).

El componente enzima ArE se agregó al sistema en dos formas: (1) directamente de un concentrado de enzimas líquido, y (2) encapsulado en polímero como un polvo seco por rocío. El polímero fue hidroxipropil-metilcelulosa (HPMC, Methocel E5 Premium LV de Dow Chemical Co., Midland, MI, EUA) . Se condujo el secado por rocío tal que el polvo seco fue 75% de HPMC (en masa) .

Para tanto el concentrado de enzima como la enzima encapsulada, se agregaron 12.5 pg de ArE activo a cada uno de los seis tubos de prueba que contienen 1 g de fluido portador, 135 mg de perborato de sodio, y 2 mg de PGDA. Para cada conjunto de seis tubos, se activaron tres de los tubos (por dilución con 9 mi de solución amortiguadora de Tris, pH 9.0,) y se sometieron a ensayo para ácido peracético como se describe posteriormente. Los otros tres tubos se incubaron a 37°C durante cinco días, luego se activaron y se sometieron a ensayo para ácido peracético.

Ensayo para ácido peracético Materiales y Métodos : ¦ Ácido peracético: Sigma-Fluka P/N 77240; L/N 11244491, 38.8% (5.115M, F. . = 76.05 g/mol), ácido peracético según C de A. ¦ sal de 2 , 2 ' -Azino-bis (3 -etilbenzotiazolin-6 -ácido sulfónico) -diamonio (ABTS) : Fluka P/N A10917, IVN 1135552 54804068, 99+% puro (HPLC) , F. . = 548.64 g/mol ¦ ácido cítrico: Sigma P/N C1857, IVN 0054K0001, F.W. = 192.13 ¦ Yoduro de potasio (KI) : P/N Sigma P4286, L/N 124K0151, F.W. = 166.0 Soluciones madre : ¦ Ácido cítrico 125 mM, pH a 5.0 con NaOH, filtro estéril 0.22 µ??, indefinidamente estable a temperatura ambiente hasta el crecimiento evidente (usualmente hongos en este pH) - ABTS 100 mM en H20 Milli Q (MQ) . Se forman en alícuotas en alícuotas de 500 il¡ y se almacenan a -20°C por hasta seis meses.

KI 25 mM en H20 MQ. Indefinidamente estable a temperatura ambiente.

Sustrato de trabajo: 1. Agregar 50 mL de solución amortiguadora de ácido cítrico madre 125 mM a un recipiente a prueba de luz (es aceptable una botella de vidrio envuelta con lámina delgada de aluminio) 2. Descongelar una alícuota de 500 L de solución madre ABTS y agregarla a la solución de ácido cítrico. 3. Agregar 100 pL de KI 25 mM al ácido cítrico. 4. Remolinear suavemente para mezclar y tapar. Se forma una buena solución por hasta 54 horas cuando se almacena en la oscuridad a temperatura ambiente.

Preparación de la Curva Estándar: 1. Obtener ácido peracético madre (usualmente 39%; -390 g/L; 390 (g/L) /76.05 (g/mol) -5.13 M. NOTA: Esta concentración actual se determinará por el número de ensayo actual reportado en el CofA. 2. Hacer una dilución de 1:100 de PAA madre en ácido cítrico 125 mM. Tapar y mover en forma de vórtice durante 15 segundos. 3. Tomar la dilución de 1:100 de la etapa 2 y diluirla 1:100 (esto haría una dilución de 1:10000 del PAA madre) en ácido cítrico 125 mM. Tapar y moverlo en forma de vórtice durante 15 segundos. Esta concentración de PAA ahora es ~ 5000 mM / 10000 = - 0.5 ttiM = ~ 500 uM 4. Tomar la solución del paso 3 y diluir 4 partes estándar (el estándar ~ 500 uM de 13) a l parte de ácido cítrico para hacer un estándar de aproximadamente 400 uM 5. Tomar la solución del paso 3 y diluir 3 partes estándar (el estándar ~ 500 uM de #3) a 2 partes de ácido cítrico para hacer un estándar de aproximadamente 300 uM 6. Tomar la solución del paso 3 y diluir 2 partes estándar (el estándar ~ 500 uM de #3) a 3 partes de ácido cítrico para hacer un estándar de aproximadamente 200 uM 7. Tomar la solución del paso 3 y diluir 1 parte estándar (el estándar ~ 500 uM de #3) a 4 partes de ácido cítrico para hacer un estándar de aproximadamente 100 uM Ensayo : 1. En una placa de microtítulo, colocar 20 µ? de todos los estándares en orden de dilución descendente en triplicado ya sea en formato de filas o formato de columnas (un estándar por pocilio) . 2. Al final de la curva estándar, colocar 20 µ? de ácido cítrico en pocilios de triplicado (estos son los blancos) . 3. En filas o columnas separadas colocar 20 µ? de muestras diluidas en pocilios de triplicado. 4. Vaciar una cantidad adecuada de sustrato de trabajo en una bandeja de sustrato (o tapa de caja de Petri limpia o base, o una tapa de caja de punta de pipeta limpia) 5. Con una pipeta multicanal, agregar 200 µ? de sustrato a cada pocilio de la placa de microtítulo que tiene estándar, blanco, y muestra. 6. Con un cronómetro, permitir que procesa la reacción durante 3 minutos (+/- 0.5 min) 7. Leer los pocilios en un lector de microplacas @ 420 nm 8. Transferir los datos en Excel o usar el programa de lectura de placas para generar la curva estándar, calcular a la inclinación y calcular la intercepción y por la regresión lineal usando los datos estándares (calcular medio, SD, etcétera) . 9. Calcular las concentraciones de muestra usando la inclinación e intercepción usando y = m*x+b y multiplicando por el factor de dilución de muestra.

Resultados Se promediaron y se tabularon los resultados del ácido peracético para cada conjunto de tres tubos. Los resultados . se muestran en la Tabla 6. La muestra encapsulada demostró una estabilidad significativamente incrementada después de 5 días a 37°C.

Tabla 6 Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplos para propósitos de claridad de entendimiento, será evidente para aquellas personas expertas en la técnica que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, la descripción no se debe considerar como limitante del alcance de la invención.

Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas en este documento se incorporan por este medio a manera de referencia en sus totalidades para todos los propósitos y al mismo grado como si cada publicación, patente, o solicitud de patente individual se indicó específica e individualmente para ser de esta manera incorporada a manera de referencia.

Se hace constar que con esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un sistema de suministro líquido para enzima y sustrato co- formulados, caracterizado porque el sistema de suministro es una composición que comprende, una enzima y un sustrato para la enzima, en donde la enzima se encapsula en una matriz polimérica soluble en agua.

2. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sustrato está presente en una fase líquida sustancialmente no acuosa en contacto con la matriz polimérica en la cual la enzima se encapsula, en donde el polímero no es soluble en la fase líquida .

3. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la fase líquida sustancialmente no acuosa comprende menos que aproximadamente 5% de agua.

4. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la fase líquida sustancialmente no acuosa comprende menos que aproximadamente 1% de agua.

5. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la fase líquida sustancialmente no acuosa comprende menos que aproximadamente 0.5% de agua .

6. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la enzima retiene el potencial catalítico en la matriz polimérica pero no reacciona sustancialmente con el sustrato en la composición durante por lo menos 10 días a 25°C.

7. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque después de la adición de agua a la composición, la matriz polimérica se solubiliza, liberando la enzima, permitiendo que se lleve a cabo la reacción catalítica con el sustrato.

8. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de proteasas, celulasas, amilasas, pectinasas, perhidrolasas , peroxidasas, carbohidrato-oxidasas , enzimas oxidantes de fenol, cutinasas, lipasas, hemicelulasas , xilanasas, mananasas, catalasas, lacasas, y mezclas de las mismas.

9. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende dos o más enzimas encapsuladas en la misma matriz polimérica.

10. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende dos o más enzimas encapsuladas en las matrices poliméricas separadas.

11. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende por lo menos un tensoactivo. 5

12. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la matriz polimérica se selecciona del grupo que consiste de alcohol polivinílico, metilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, polivinil- pirrolidona, goma de guar, y derivados o copolímeros de los 10 mismos.

13. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque, la enzima encapsulada en una matriz polimérica en la forma de partículas se suspende en un líquido sustancialmente no acuoso que contiene 15 el sustrato.

14. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque, las partículas se I mantienen en suspensión por un auxiliar de suspensión.

15. El sistema de suministro de conformidad con la 20 reivindicación 1, caracterizado porque el sustrato se solubiliza o se dispersa en una fase líquida sustancialmente no acuosa, la cual puede incluir opcionalmente un líquido no acuosos (fluido portador) .

16. El sistema de suministro de conformidad con la 25 reivindicación 15, caracterizado porque el fluido portador se selecciona del grupo que consiste de glicoles, tensoactivos no iónicos, alcoholes, poliglicoles , ásteres de acetato, y una mezcla de los mismos.

17. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el fluido portador es un sustrato para la enzima.

18. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima es una perhidrolasa y el sustrato es un sustrato de éster.

19. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima es una perhidrolasa y el sustrato es diacetato de propilenglicol .

20. El sistema de suministro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque además comprende un compuesto generador de peróxido de hidrógeno seleccionado de percarbonato de sodio, perborato de sodio y peróxido ácido de urea, en donde se produce un perácido después de que el agua se agrega a la composición.

21. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima es una enzima lacasa y el sustrato es un mediador lacasa.

22. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima es una enzima oxidante de fenol, y el sustrato se selecciona del grupo que consiste de 2 , 2 ' -azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) , siringamida y siringonitrilo .

23. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima es una perhidrolasa y el sustrato es un sustrato de éster, y el sistema de suministro comprende además perborato de sodio

24. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el sistema de suministro incrementa la estabilidad de almacenamiento comparado con un sistema de suministro comparable que carece del polímero.

25. Un kit, caracterizado porque contiene el sistema de suministro para co-formular la enzima y el sustrato de conformidad de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 e instrucciones para el uso.

26. Un método para blanquear un textil, caracterizado porque comprende: (a) agregar el sistema de suministro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20 al agua en presencia de una fuente de peróxido de hidrógeno y mezclar, generando en consecuencia una solución de perácido acuosa; y (b) poner en contacto un textil con la solución durante un período de tiempo bajo condiciones adecuadas para permitir el blanqueamiento medible del textil, produciendo en consecuencia un textil blanqueado.

27. Un método para descontaminación, caracterizado porque comprende: (a) agregar el sistema de suministro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20 al agua en presencia de una fuente de peróxido de hidrógeno y mezclar, generando en consecuencia una solución de perácido acuosa; y (b) poner en contacto un artículo que comprende un contaminante con la solución, reduciendo en consecuencia la concentración del contaminante.

28. El método de conformidad con la reivindicación 26 o 27, caracterizado porque la fuente de peróxido de hidrógeno es perborato de sodio.