BRPI0921750B1

BRPI0921750B1 - sistema de liberação para enzima e substrato coformulados, kit e métodos para alvejar um têxtil e para descontaminação

Info

Publication number: BRPI0921750B1
Application number: BRPI0921750-9A
Authority: BR
Inventors: Nathaniel T. Becker; Michael Stoner; Mee-Young Yoon
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2021-01-05
Also published as: AU2009319967B2; ES2464216T3; DK2350250T4; BRPI0921750A2; EP2350250A1; CN102203231B; US8834865B2; EP2350250B1; US20110300201A1; CA2742294A1; WO2010062745A1; CA2742294C; PT2350250E; MX2011004066A; JP5837822B2; ES2464216T5; JP2012508295A; EP2350250B2; HK1162572A1; AU2009319967A1

Abstract

SISTEMA DE LIBERAÇÃO PARA ENZIMA E SUBSTRATO COFORMULADOS. A presente invenção refere-se a métodos, composições, sistemas e kits que incluem um sistema de coliberação de enzima/substrato. O sistema de liberação de líquido ao menos uma enzima encapsulada em uma matriz polimérica solúvel em água e um substrato para a enzima em um líquido veículo no qual a matriz polimérica é insolúvel. Quando água é adicionada, a matriz polimérica é solubilizada e a enzima é liberada a partir da matriz, permitindo a ação catalítica mediante o substrato.

Description

Prioridade

[0001] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisória U.S. No. Serial 61/110.832 depositado em 3 de novembro de 2008, que é aqui incorporado a título de referência.

Campo da Invenção

[0002] A presente invenção refere-se a formulações líquidas para a coliberação de enzimas e substratos nos quais ao menos uma enzima é encapsulada em uma matriz polimérica.

Antecedentes

[0003] Na liberação de sistemas de enzima/substrato, dois problemas geralmente surgem. O primeiro problema é que a eficácia ótima depende de manter a apropriada razão enzima:substrato . O segundo problema é que a enzima precisa ser fisicamente isolada de seu substrato até que a reação é desejada. Uma forma de superar esses problemas é empacotar a enzima separadamente do substrato e combiná-los no ponto de uso. Entretanto, essa abordagem é inconveniente, complicada, e pode resultar em erros de blenda no ponto de uso. Ela pode também ser custosa uma vez que a enzima frequentemente precisa ser formulada com substâncias estabilizantes. Outra forma de superar esses problemas é fornecer uma blenda de enzima seca e substrato seco, alcançando assim o isolamento físico enquanto mantendo a apropriada razão enzima para substrato . Entretanto, é frequentemente desejável ou necessário fornecer uma formulação líquida para uso em processos que não são configurados para manipular pós, grânulos, ou outros produtos sólidos. Uma abordagem alternativa é necessária.

[0004] A abordagem de coformulação seria desejável, com a enzima e o substrato combinados no mesmo recipiente. Isso permitiria que um fabricante controlasse a razão enzima:substrato, resultando em economias de custo nos ingredientes da formulação, e forneceria um produto simples, conveniente, e “pronto para uso” ao consumidor. Em alguns casos, combinar enzima e substrato na mesma formulação líquida poderia suavizar considerações de toxicidade (por exemplo, riscos ambientais propostos por mediadores de lacase poderiam ser substancialmente reduzidos se eles pudessem ser manipulados e transportados no mesmo recipiente da própria enzima lacase).

[0005] Ounichi (Patente U.S. No. 4.898.781) e Aronson (Patente U.S. No. 5.281.355) descrevem o encapsulamento de enzimas para aplicações em lavanderia e assistência domiciliar onde o produto resultante contém somente uma enzima, e não contém um substrato reativo. Seria desejável produzir uma formulação líquida contendo tanto enzima quanto substrato, com a enzima isolada do substrato reativo. Aplicações nas quais tal coformulação seria útil incluem, mas não estão limitadas a sistemas de alvejamento enzimático, por exemplo, usando uma enzima per-hidrolase com um substrato éster, e sistemas de corantes enzimáticos, por exemplo, usando uma enzima lacase e um substrato precursor de corante.

Resumido Sumário da Invenção

[0006] Em um aspecto, a invenção fornece um sistema de liberação de líquido para enzima e substrato coformulados, onde o sistema de liberação é uma composição contendo uma enzima e um substrato para a enzima, onde a enzima é encapsulada em uma matriz polimérica solúvel em água. O substrato está em uma fase líquida substancialmente não aquosa (isto é, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 1%, ou menos de aproximadamente 0,5% de água) em contato com a matriz polimérica que contém a enzima, onde o polímero não é solúvel na fase líquida. A enzima retém potencial catalítico na matriz polimérica, mas substancialmente não reage com o substrato na composição por ao menos 10 dias a 25° C. Após a adição de água à composição, a matriz polimérica é solubilizada, liberando a enzima, permitindo que a reação catalítica com o substrato ocorra.

[0007] Em algumas modalidades, a composição contém uma ou mais enzimas selecionadas a partir de proteases, celulases, amilases, pectinases, per-hidrolases, peroxidases, carboidrato oxidases, enzimas de oxidação de fenol, cutinases, lipases, hemicelulases, xilanases, mananases, catalases, e lacases, e misturas das mesmas. Em algumas modalidades, a composição contém duas ou mais enzimas encapsuladas na mesma matriz polimérica. Em algumas modalidades, a composição contém duas ou mais enzimas encapsuladas em matrizes poliméricas separadas. Em algumas modalidades, a composição contém duas ou mais enzimas encapsuladas na mesma matriz polimérica e ao menos uma enzima encapsulada em uma matriz polimérica separada.

[0008] Em algumas modalidades, a composição contém ao menos um tensoativo.

[0009] Em algumas modalidades, a matriz polimérica é selecionada a partir de polivinil álcool, metil celulose, hidroxipropil metil celulose, polivinil pirrolidona, goma guar, e derivados ou copolímeros dos mesmos. Um polímero adequado para uso nas composições fornecidas aqui é um no qual uma enzima pode ser encapsulada e que não é solúvel em água.

[00010] Em algumas modalidades, a matriz polimérica contendo enzima está na forma de partículas suspensas em um líquido substancialmente não aquoso contendo o substrato. Em uma modalidade, as partículas são mantidas em suspensão por um auxiliar de suspensão. Em algumas modalidades, a suspensão líquida está em um recipiente que contém uma quantidade de enzima e substrato suficiente e/ou destinada para um único uso (isto é, dose única) em uma aplicação na qual a reação enzima/substrato é útil, onde o recipiente pode ser aberto para liberar o líquido, por exemplo, abrindo uma tampa ou cobertura. Em algumas modalidades, a suspensão líquida está em um recipiente liberável que contém uma quantidade de enzima e substrato suficiente para destinadas múltiplas vezes de uso (isto é, múltiplas doses), que permite a liberação repetida da suspensão abrindo e fechando uma tampa de recipiente, abrindo e fechando uma válvula ou porta de liberação, ou similar. Em algumas modalidades, a matriz polimérica contendo enzima está na forma de um recipiente fechado, isto é, vedado, tal como um bolsa ou sachê, e o substrato está em um líquido substancialmente não aquoso dentro do recipiente polimérico.

[00011] O substrato é solubilizado ou disperso em uma fase líquida substancialmente não aquosa, que pode incluir um líquido não aquoso (fluido veículo). Exemplos de fluidos veículos incluem, mas não estão limitados a glicóis, tensoativos não iônicos, alcoóis, poliglicóis, ésteres de acetato, ou uma mistura desses. Um substrato líquido ou sólido pode ser combinado com um ou mais fluidos veículos e pode ser ou miscível com o fluido(s) veículo(s) ou suspenso neste(s). Em algumas modalidades, o fluido veículo contém sal ou um tampão de pH adicionado para criar condições adequadas para solubilização aumentada do substrato e/ou solubilização reduzida do polímero encapsulante. Em algumas modalidades, o fluido veículo é um substrato para a enzima, por exemplo, um fluido veículo de diacetato de propileno glicol pode servir como um substrato para uma enzima per- hidrolase encapsulada em uma matriz polimérica que é insolúvel em diacetato de propileno glicol, por exemplo, polivinil álcool, metil celulose, hidroxipropil metil celulose, polivinil pirrolidona. Em muitas modalidades, a liberação exibe estabilidade aumentada comparada a um sistema de liberação comparável carente do polímero.

[00012] Em uma modalidade, a enzima é uma per-hidrolase e o substrato é um substrato éster, tal como, por exemplo, um éster de acetato, por exemplo, diacetato de propileno glicol. Em algumas modalidades, o substrato éster é diacetato de propileno glicol, e o polímero compreendendo a enzima per-hidrolase está na forma de partículas suspensas no diacetato de propileno glicol ou na forma de um recipiente fechado circundando o diacetato de propileno glicol, isto é, o diacetato de propileno glicol está envolvido dentro do recipiente polimérico.

[00013] Em algumas modalidades, a enzima é uma per-hidrolase, o substrato é um substrato éster, a composição ainda compreende um composto de geração de peróxido de hidrogênio, por exemplo, selecionado a partir de percarbonato de sódio, perborato de sódio, e hidrogeno peróxido de ureia, e um perácido é produzido após água ser adicionada à composição. Em algumas modalidades, o perácido é selecionado a partir de ácido peracético, ácido pernonanoico, ácido perbutanoico, ácido perpentanoico, e ácido per-hexanoico. Em algumas modalidades, o substrato éster é diacetato de propileno glicol e o composto de geração de peróxido de hidrogênio é suspenso no diacetato de propileno glicol.

[00014] Em algumas modalidades, a enzima é enzima per-hidrolase e a composição contém substratos para produzir mono- e diglicerídeos (por exemplo, um doador de acila e aceptor de álcool) ou um éster de sorbitana (por exemplo, um doador de acila e sorbitana). Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima per-hidrolase e a composição contém substratos para produzir um éster fragrante, por exemplo, um benzil éster (por exemplo, um doador de acila e um álcool volátil, por exemplo, álcool benzílico).

[00015] Em algumas modalidades, a enzima é enzima de oxidação de fenol, tal como uma enzima lacase, e o substrato é um mediador de lacase, por exemplo, selecionado a partir de 2,2’-azino-bis(3- etilbenzotiazolina-6-sulfonato), siringamida e siringonitrila.

[00016] Em vários aspectos, a invenção fornece uma composição para uso em uma aplicação na qual uma atividade enzimática é útil, por exemplo, uma composição detergente, uma composição de processamento têxtil, ou uma composição de cuidado pessoal, onde a composição contém uma enzima e um substrato para a enzima, onde a enzima é encapsulada em uma matriz polimérica solúvel em água e onde a matriz polimérica contendo enzima está em contato com uma solução ou suspensão líquida substancialmente não aquosa contendo o substrato, e insolúvel nesta, como descrito aqui.

[00017] Em outro aspecto, a invenção fornece um kit contendo um sistema de liberação para enzima e substrato coformulados como descrito aqui ou uma composição contendo o sistema de liberação, e embalagem. Em algumas modalidades, o kit compreende instruções para uso em um método, por exemplo, um método de descontaminação, um método de limpeza, um método de processamento têxtil, ou um método para cuidados pessoais. Em algumas modalidades, o kit ainda compreende instruções para incorporar o sistema de liberação em uma composição formulada para uso em um método no qual a atividade catalítica da enzima mediante o substrato é útil, por exemplo, uma composição detergente, uma composição de processamento têxtil, ou uma composição para cuidados pessoais.

[00018] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para descontaminação, compreendendo: (a) adicionar uma composição contendo per-hidrolase como descrita aqui, à água na presença de uma fonte de peróxido de hidrogênio e misturar, gerando desse modo uma solução de perácido aquoso; e (b) contatar um item compreendendo um contaminante com a solução, reduzindo desse modo a concentração do contaminante. Em algumas modalidades, o contaminante compreende uma toxina selecionada a partir de toxina botulínica, toxina de anthracis, ricina, toxina escombroide, ciguatoxina, tetradotoxina, micotoxinas, ou uma combinação dessas. Em algumas modalidades, o contaminante compreende um patógeno selecionado a partir de uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, um príon, ou uma combinação desses. Em algumas modalidades, o item é selecionado a partir de uma superfície dura, um tecido, um alimento, uma ração, um item de vestuário, um tapete, um carpete, um têxtil, um instrumento médico, e um instrumento veterinário. Em algumas modalidades, a água é esterilizada. Em algumas modalidades, o contato do item a ser descontaminado é executado em alta temperatura.

[00019] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para alvejar um tecido, compreendendo: (a) adicionar uma composição contendo per-hidrolase como descrito aqui à água na presença de uma fonte de peróxido de hidrogênio e misturar, gerando desse modo uma solução de perácido aquoso; e (b) contatar um tecido com a solução por um período de tempo e sob condições adequadas para permitir a medição do branqueamento do tecido, produzindo desse modo um tecido alvejado.

[00020] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para limpar, compreendendo contatar um artigo compreendendo uma mancha com uma composição detergente como descrita aqui na presença de água adicionada, onde ao menos uma parte da mancha é removida.

[00021] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para alvejar um tecido, compreendendo contatar um tecido com uma composição contendo enzima de oxidação de fenol (por exemplo, lacase) como descrita aqui na presença de água adicionada por um período de tempo e sob condições para permitir medir o branqueamento do tecido, onde a composição compreende um mediador que efetua o branqueamento do tecido, produzindo desse modo um tecido alvejado.

[00022] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para mudar a cor de um tecido, compreendendo contatar um tecido com uma composição contendo enzima de oxidação de fenol (por exemplo, lactase) como descrita aqui na presença de água adicionada por um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma mudança mensurável de cor no tecido, onde a composição compreende um mediador que efetua uma mudança de cor no tecido sob as condições usadas, produzindo desse modo um tecido com uma mudança de cor.

[00023] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para coloração de cabelo, compreendendo contatar o cabelo com uma composição contendo enzima de oxidação de fenol (por exemplo, lacase) como descrita aqui na presença de água adicionada por um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma mudança mensurável de cor no cabelo, onde a composição compreende um mediador que efetua uma mudança de cor no cabelo sob as condições usadas, produzindo desse modo um cabelo com uma mudança de cor.

[00024] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para alvejamento de polpa ou papel e/ou deslignificação, compreendendo contatar a polpa ou papel com uma composição contendo enzima de oxidação de fenol (por exemplo, lacase) como descrito aqui na presença de água adicionadas por um período de tempo e sob condições adequadas para permitir a mudança mensurável de cor e/ou teor de lignina da polpa ou papel, onde a composição compreende um mediador que efetua a mudança de cor e/ou teor de lignina, produzindo desse modo polpa ou papel com uma mudança de cor e/ou teor de lignina.

[00025] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a ativação enzimática de fibras de madeira para produzir compósitos de madeira, compreendendo contatar a madeira com uma composição contendo enzima de oxidação de fenol (por exemplo, lacase) como descrita aqui na presença de água adicionada por um período de tempo e sob condições adequadas para permitir a mudança mensurável de rendimento de compósito de madeira, onde a composição compreende um mediador que efetua a mudança de rendimento de compósito de madeira, produzindo desse modo madeira com uma mudança na ligação das fibras da madeira.

[00026] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar água residual, compreendendo contatar efluente de água residual com uma composição contendo enzima de oxidação de fenol (por exemplo, lacase) como descrita aqui na presença de água adicionada por um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma diminuição mensurável na concentração de fenol na água residual, onde a composição compreende um mediador que efetua a diminuição na concentração de fenol, produzindo desse modo efluente de água residual com uma diminuição no teor de fenol.

Breve Descrição dos Desenhos

[00027] A figura 1 representa esquematicamente reações catalisadas por uma enzima per-hidrolase.

[00028] A figura 2 mostra os resultados do experimento de lixiviação de enzima com discos de PVA lacase e mediador ABTS lacase, como descrito no exemplo 3.

[00029] A figura 3 mostra os resultados do experimento de lixiviação de enzima com discos de PVA lacase e mediador as lacase, como descrito no exemplo 3.

[00030] A figura 4 mostra os resultados do experimento de lixiviação de enzima com discos de PVA lacase e mediador SN lacase, como descrito no exemplo 3.

[00031] A figura 5 mostra os resultados de alvejamento de brim nos experimentos com placa de microtitulação com 12 cavidades descritos no exemplo 3.

[00032] A figura 6 mostra os resultados de alvejamento e pigmentação de brim nos experimentos em Launder-Ometer descritos no exemplo 3.

Descrição Detalhada

[00033] A invenção fornece um sistema de liberação para enzima e substrato coformulados. As composições descritas aqui contêm uma enzima encapsulada em uma matriz polimérica contendo um polímero solúvel em água. As composições também contêm um substrato para a enzima. A enzima encapsulada pode ser suspensa na forma de um recipiente vedado circundando uma composição líquida substancialmente não aquosa compreendendo, consistindo de, ou consistindo essencialmente do substrato, tal como, por exemplo, um substrato líquido, uma solução de substrato, ou uma suspensão líquida de partículas de substrato sólido ou cápsulas contendo o substrato. A liberação de enzima a partir do polímero no qual ela é encapsulada é disparada por diluição em água.

Definições

[00034] A menos que definido de outra forma aqui, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado geralmente entendido por um versado na técnica a qual esta invenção pertence. Por exemplo, Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); e Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) fornecem aos versados na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados na invenção. Quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui encontram uso na prática da presente invenção. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente descritos com relação ao relatório descritivo como um todo. Também, como usados aqui, os termos singulares “um”, “uma”, e “o”, “a” incluem referência plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. A menos que de outra forma indicado, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5’ a 3’; as sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação amino a carbóxi, respectivamente. Entende-se que esta invenção não está limitada a metodologia particular, protocolos e reagentes descritos, à medida que esses podem variar, dependendo do contexto no qual eles são usados pelos versados na técnica.

[00035] Pretende-se que cada limitação numérica máxima dada por toda esta especificação inclua cada limitação numérica inferior, como se cada tal limitação numérica inferior fosse expressamente escrita aqui. Cada limitação numérica mínima dada por toda esta especificação incluirá cada limitação numérica mais alta, como se tais limitações numéricas mais altas fossem expressamente escritas aqui. Cada faixa numérica dada por toda esta especificação incluirá cada faixa numérica mais estreita que cai dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem todas expressamente escritas aqui.

[00036] Como usado aqui, o termo “enzima” refere-se a qualquer proteína que catalisa uma reação química. A função catalítica de uma enzima constitui sua “atividade” ou “atividade enzimática”. Uma enzima tipicamente é classificada de acordo com o tipo de função catalítica que ela executa, por exemplo, hidrólise de ligações de peptídeo.

[00037] Como usado aqui, o termo “substrato” refere-se a uma substância (por exemplo, um composto químico) na qual uma enzima executa sua atividade catalítica para gerar um produto.

[00038] Como usados aqui, os termos “purificado” e “isolado” referem-se à remoção de contaminantes de uma amostra e/ou material (por exemplo, uma proteína, ácido nucleico, célula, etc.), isto é, um material que é removido de ao menos um componente com o qual ele está naturalmente associado. Por exemplo, esses termos podem se referir a um material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham como encontrado em seu estado nativo, tal como, por exemplo, um sistema biológico intacto.

[00039] Como usado aqui, o termo “polinucleotídeo” refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento e qualquer estrutura tridimensional e de filamento único ou multifilamentos (por exemplo, filamento único, filamento duplo, hélice tripla, etc.), que contém desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e/ou formas análogas ou modificadas de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, incluindo nucleotídeos modificados ou bases, ou seus análogos. Como o código genético é degenerado, mais de um códon pode ser usado para codificar um aminoácido particular, e a presente invenção abrange polinucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácido particular. Qualquer tipo de nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo modificado pode ser usado, contanto que o polinucleotídeo retenha a funcionalidade desejada sob condições de uso, incluindo modificações que aumentam a resistência à nuclease (por exemplo, deoxi, 2’-O-Me, fosforotioatos, etc.). As marcações podem ser incorporadas para propósitos de detecção ou captura, por exemplo, marcações radioativas ou não radioativas ou âncoras, por exemplo, biotina. O termo polinucleotídeo também inclui ácidos nucleicos peptídico (PNA). Os polinucleotídeos podem estar naturalmente ocorrendo ou não naturalmente ocorrendo. Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucleico” e “oligonucleotídeo” são usados aqui de forma intercambiável. Os polinucleotídeos da invenção podem conter RNA, DNA, ou ambos, e/ou formas modificadas e/ou análogos desses. Uma sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a modalidades onde o fosfato é substituído por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR’, CO ou CH2 (“formacetal”), no qual cada R ou R’ é independentemente H ou alquila substituída ou não substituída (1-20C) opcionalmente, contendo uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila, ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. Os polinucleotídeos podem ser lineares ou circulares ou compreendem uma combinação de porções lineares e circulares.

[00040] Como usado aqui, “polipeptídeo” refere-se a qualquer composição compreendida de aminoácidos e reconhecida como uma proteína pelos versados na técnica. O código convencional de uma letra ou três letras para resíduos de aminoácido é usado aqui. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados aqui de forma intercambiável para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

[00041] Como usadas aqui, proteínas funcional e/ou estruturalmente similares são consideradas como sendo “proteínas relacionadas”. Em algumas modalidades, essas proteínas são derivadas de um gênero e/ou espécie diferente, incluindo diferenças entre classes de organismos (por exemplo, uma proteína bacteriana e uma proteína fúngica). Em modalidades adicionais, proteínas relacionadas são fornecidas a partir da mesma espécie. De fato, não se pretende que os processos, métodos e/ou composições descritos aqui sejam limitados a proteínas relacionadas a partir de qualquer fonte(s) particular(es). Em adição, o termo “proteínas relacionadas” abrange homólogos estruturais terciários e homólogos de sequência primária. Em modalidades adicionais, o termo abrange proteínas que são imunologicamente reticuladas.

[00042] Uma “per-hidrolase” refere-se a uma enzima que é capaz de catalisar uma reação de per-hidrólise que resulta na produção de uma quantidade suficientemente alta de perácido adequado para uso em uma aplicação tal como limpeza, alvejamento, desinfecção, ou esterilização. Geralmente, uma enzima per-hidrolase usada em métodos descritos aqui exibe uma alta razão per-hidrólise para hidrólise. Em algumas modalidades, a per-hidrolase compreende, consiste de, ou consiste essencialmente da sequência de aminoácido de per-hidrolase de Mycobacterium smegmatis apresentada na SEQID NO: 1, ou uma variante ou homóloga desta. Em algumas modalidades, a enzima per- hidrolase compreende atividade de acil transferase e catalisa uma reação de transferência de acila aquosa.

[00043] O termo “per-hidrolisação” ou “per-hidrólise”, como usado aqui, refere-se a uma reação onde um perácido é gerado a partir de substratos éster e peróxido de hidrogênio. Em uma modalidade, a reação de per-hidrolisação é catalisada com uma enzima per-hidrolase, por exemplo, acil transferase ou aril esterase. Em algumas modalidades, um perácido é produzido por per-hidrólise de um substrato éster da fórmula R1C(=O)OR2, onde R1 e R2 são porções orgânicas iguais ou diferentes, na presença de peróxido de hidrogênio (H2O2). Em uma modalidade, -OR2 é -OH. Em uma modalidade, -OR2 é substituído por -NH2. Em algumas modalidades, um perácido é produzido por per- hidrólise de um substrato ácido carboxílico ou amida.

[00044] O termo “perácido”, como usado aqui, refere-se a uma molécula derivada de um éster de ácido carboxílico que foi reagido com peróxido de hidrogênio para formar um produto altamente reativo que é capaz de transferir um de seus átomos de oxigênio, por exemplo, um ácido orgânico da fórmula RC(=O)OOH. É essa capacidade de transferir átomos de oxigênio que permite que um perácido, por exemplo, ácido peracético, funcione como um agente alvejante.

[00045] A frase “fonte de peróxido de hidrogênio” inclui peróxido de hidrogênio, bem como os componentes de um sistema que pode ser espontâneo ou enzimaticamente produzir peróxido de hidrogênio como um produto reacional.

[00046] A frase “razão per-hidrólise para hidrólise” refere-se à razão da quantidade de perácido enzimaticamente produzido para a quantidade de ácido enzimaticamente produzido por uma enzima per- hidrolase a partir de um substrato éster sob condições definidas e dentro de um tempo definido.

[00047] Como usado aqui, o termo “acila” refere-se a um grupo orgânico com a formula geral RCO-, derivado de um ácido orgânico pela remoção do grupo -OH. Tipicamente, os nomes do grupo acila terminam com o sufixo “-oila”, por exemplo, cloreto de metanoila, CH3CO-Cl, é o cloreto de acila formado a partir de ácido metanoico, CH3CO-OH.

[00048] Como usado aqui, o termo “acilação” refere-se a uma transformação química na qual um dos substituintes de uma molécula é substituído por um grupo acila, ou o processo de introdução de um grupo acila em uma molécula.

[00049] Como usado aqui, o termo “transferase” refere-se a uma enzima que catalisa a transferência de um grupo funcional de um substrato para outro substrato.

[00050] Como usado aqui, o termo “conversão enzimática” refere-se à modificação de um substrato ou intermediário a um produto, contatando o substrato ou intermediário com uma enzima. Em algumas modalidades, o contato é feito expondo-se diretamente o substrato ou intermediário à enzima apropriada. Em outras modalidades, o contato compreende expor o substrato ou intermediário a um organismo que expressa e/ou excreta a enzima, e/ou metaboliza o substrato e/ou intermediário desejado no intermediário e/ou produto final desejado, respectivamente.

[00051] Como usado aqui, “quantidade eficaz de enzima” refere-se à quantidade de enzima necessária para alcançar a atividade exigida na aplicação específica (por exemplo, produção de ácido peracético por acil transferase para uso na descontaminação). Tais quantidades eficazes são prontamente verificadas por um versado na técnica e são baseadas em muitos fatores, tal como a variante de enzima particular usada, a composição específica, o método de descontaminação, o item a ser descontaminado, e similares.

[00052] Como usado aqui, o termo “estabilidade” em relação a uma substância (por exemplo, uma enzima) ou composição refere-se a sua capacidade de manter certo nível de atividade funcional ao longo de um período de tempo sob certas condições ambientais. Ademais, o termo “estabilidade” pode ser usado em um número de contextos mais específicos com relação à condição ambiental particular que é de interesse. Por exemplo, “estabilidade térmica”, como usado aqui, refere- se à capacidade de uma substância ou composição de manter sua função (isto é, não degradar) em temperatura aumentada. Uma mudança substancial em estabilidade é evidenciada por ao menos aproximadamente 5% ou mais de aumento ou diminuição (na maior parte das modalidades, é preferencial um aumento) na meia vida da atividade funcional sendo ensaiada, se comparado à atividade presente na ausência das condições ambientais selecionadas.

[00053] Como usado aqui, o termo “estabilidade química”, como usado em relação a uma enzima, refere-se à estabilidade da enzima na presença de produtos químicos que adversamente afetam sua atividade. Em algumas modalidades, tais produtos químicos incluem, mas não estão limitados a peróxido de hidrogênio, perácidos, detergentes aniônicos, detergentes catiônicos, detergentes não iônicos, quelantes, etc. Entretanto, não se pretende que a presente invenção esteja limitada a qualquer nível de estabilidade química particular nem faixa de estabilidade química.

[00054] Como usado aqui, “estabilidade em pH” refere-se à capacidade de uma substância (por exemplo, uma enzima) ou composição funcionar em um pH particular. A estabilidade em vários pHs pode ser medida ou por procedimentos padrão conhecidos pelos versados na técnica e/ou pelos métodos descritos aqui. Uma mudança substancial na estabilidade em pH é evidenciada por ao menos, aproximadamente 5% ou mais de aumento, ou diminuição (na maior parte das modalidades, é preferencial um aumento) na meia vida da atividade funcional, se comparado à atividade no pH ótimo. Não se pretende que a invenção esteja limitada a qualquer nível de estabilidade em pH nem faixa de pH.

[00055] Como usado aqui, “estabilidade oxidativa” refere-se à capacidade de uma substância (por exemplo, uma enzima) ou composição de funcionar sob condições oxidativas, por exemplo, na presença de um produto químico oxidante.

[00056] Como usado aqui, “estabilidade térmica” refere-se à capacidade de uma proteína de funcionar em uma temperatura particular. Em geral, a maior parte das enzimas tem uma faixa finita de temperaturas na qual elas funcionarão. Em adição às enzimas que funcionam em temperaturas de nível intermediário (por exemplo, temperatura ambiente), há enzimas que são capazes de funcionar em temperaturas muito altas ou muito baixas. A estabilidade térmica pode ser medida por procedimentos padrão. Uma mudança substancial na estabilidade térmica é evidenciada por ao menos, aproximadamente 5% ou mais de aumento, ou diminuição na meia vida da atividade catalítica de um mutante quando exposto a uma temperatura diferente (isto é, maior ou menor) do que a temperatura ótima para a atividade enzimática. Entretanto, não se pretende que os processos, métodos e/ou composições descritos aqui estejam limitados a qualquer nível de estabilidade de temperatura nem faixa de temperatura.

[00057] Como usado aqui, “produto químico oxidante” refere-se a um produto químico que tem a capacidade de alvejamento. O produto químico oxidante está presente em uma quantidade, pH e temperatura adequados para alvejamento. O termo inclui, mas não está limitado a peróxido de hidrogênio e perácidos.

[00058] Como usado aqui, o termo “contaminante” refere-se a qualquer substância que por seu contato ou associação com outra substância, material ou item torna-o indesejável, impuro e/ou inadequado para uso.

[00059] Como usado aqui, o termo “um item contaminado” ou “item em necessidade de descontaminação” refere-se a qualquer item ou coisa em contato ou associado com um contaminante e/ou que precisa ser descontaminado. Não se pretende que o item esteja limitado a qualquer coisa particular ou tipo de item. Por exemplo, em algumas modalidades, o item é uma superfície dura, enquanto em outras modalidades, o item é um artigo de roupa. Em ainda modalidades adicionais, o item é um tecido. Em ainda modalidades adicionais, o item é usado nos campos médico e/ou veterinário. Em algumas modalidades, o item é um instrumento cirúrgico. Em modalidades adicionais, o item é usado em transporte (por exemplo, ruas, estradas, autovias, trens, carros, aviões, navios, etc.). Em modalidades adicionais, o termo é usado em relação a alimentos e/ou rações, incluindo, mas não limitados à carne, subprodutos de carne, peixe, frutos do mar, vegetais, frutas, laticínios, grãos, produtos de panificação, forragem, feno, relva, etc. De fato, pretende-se que o termo abranja qualquer item que é adequado para descontaminação usando os métodos e composições fornecidos aqui.

[00060] Como usado aqui, o termo “descontaminação” refere-se à remoção de todos ou substancialmente todos os contaminantes a partir de um item contaminado. Em algumas modalidades, a descontaminação abrange a desinfecção, enquanto em outras modalidades, o termo abrange esterilização. Entretanto, não se pretende que o termo esteja limitado a essas modalidades, à medida que o termo é destinado a abranger a remoção de contaminantes inanimados, bem como contaminação microbiana (por exemplo, bactérias, fungos, vírus, príons, etc.).

[00061] Como usado aqui, o termo “desinfecção” refere-se à remoção de contaminantes das superfícies, bem como a inibição ou morte de micróbios nas superfícies de itens. Não se pretende que a presente invenção esteja limitada a qualquer superfície particular, item, contaminante(s) ou micróbios a serem removidos.

[00062] Como usado aqui, o termo “esterilização” refere-se à morte de todos os organismos microbianos em uma superfície.

[00063] Como usado aqui, o termo “esporicida” refere-se à morte de esporos microbianos, incluindo, mas não limitados a esporos fúngicos e bacterianos. O termo abrange composições que são eficazes na prevenção de germinação de esporos, bem como aquelas composições que tornam os esporos completamente não viáveis.

[00064] Como usados aqui, os termos “bactericida”, “fungicida” e “viricida” referem-se a composições que matam bactérias, fungos e vírus, respectivamente. O termo “microbicida” refere-se a composições que inibem o crescimento e/ou replicação de quaisquer micro- organismos, incluindo, mas não limitados a bactérias, fungos, vírus, protozoários, rickettsia, etc.

[00065] Como usados aqui, os termos “bacteriostático”, “fungistático” e “virostático” referem-se a composições que inibem o crescimento e/ou replicação de bactérias, fungos e vírus, respectivamente. O termo “microbiostático” refere-se a composições que inibem o crescimento e/ou a replicação de quaisquer micro-organismos, incluindo, mas não limitados a bactérias, fungos, vírus, protozoários, rickettsia, etc.

[00066] Como usado aqui, o termo “composição de limpeza” refere- se a composições que encontram uso na remoção de compostos indesejados de itens a serem limpos, tal como tecido, louças, lentes de contato, outros substratos sólidos, cabelo (xampu), pele (sabões e cremes), dentes (enxaguatórios bucais, cremes dentais), etc. O termo ainda refere-se a qualquer composição que é adequada para limpar, alvejar, desinfetar, e/ou esterilizar qualquer objeto e/ou superfície. Pretende-se que o termo inclua, mas não esteja limitado a composições detergentes (por exemplo, detergentes de lavanderia líquidos e/ou sólidos e detergentes de tecido fino; formulações de limpeza de superfície dura, tal como vidro, madeira, cerâmica e balcões de metal e janelas; limpadores de carpete; limpadores de forno; desodorizantes de tecido; amaciantes de tecido; e tira-manchas têxteis e de lavandeira, bem como detergentes para louças). O termo ainda abrange quaisquer materiais/compostos selecionados para o tipo particular de composição de limpeza desejada e a forma do produto (por exemplo, composição líquida, em gel, em grânulos, ou em aspersão), contanto que a composição seja compatível com a acil transferase, fonte de peróxido de hidrogênio, PGDA, e quaisquer outras enzimas ou substâncias usadas na composição. A seleção específica de materiais de composição de limpeza é prontamente feita considerando a superfície, item, ou tecido a ser limpo, e a forma desejada da composição para as condições de limpeza durante o uso. De fato, o termo “composição de limpeza”, como usado aqui, inclui, a menos que de outra forma indicado, agentes de lavagem para todos os propósitos ou de limpeza pesada na forma granular ou em pó, especialmente detergentes de limpeza; agentes de lavagem para todos os propósitos na forma de líquido, gel ou pasta, especialmente os assim chamados tipos de líquidos de limpeza pesada (HDL); detergentes líquidos para tecidos finos; agentes de lavagem de louça manual ou agentes de lavagem de louça de limpeza leve, especialmente aqueles do tipo de alta espumação; agentes de lavagem de louça à máquina, incluindo os vários tipos de tablete, grânulos, líquidos e líquido secante para uso doméstico e institucional; agentes desinfetantes e de limpeza líquidos, incluindo tipos de lavagem manual antibacterianos, barras de limpeza, enxaguatórios bucais, limpadores de dentes, xampus para carro ou carpete, limpadores de banheiro; xampus para os cabelos e condicionador para enxague dos cabelos; géis de banho e banhos de espuma e limpadores de metal; bem como auxiliares de limpeza tal como aditivos de alvejamento e “removedor de manchas” ou tipos de pré-tratamento.

[00067] Como usados aqui, os termos “composição detergente” e “formulação detergente” são usados em relação a misturas que são destinadas ao uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em algumas modalidades, o termo é usado em relação ao branqueamento de tecidos e/ou vestimentas (por exemplo, “detergentes de lavanderia”). Em modalidades alternativas, o termo se refere a outros detergentes, tal como aqueles usados para limpar louças, talheres, etc. (por exemplo, “detergentes para lavar louças”). Não se pretende que a presente invenção esteja limitada a qualquer formulação detergente ou composição particular. De fato, pretende-se que em adição a uma enzima per-hidrolase, por exemplo, uma acil transferase, o termo abranja detergentes que contêm tensoativos, transferase(s), enzimas hidrolíticas, óxido redutases, encorpadores, agentes alvejantes, ativadores de alvejamento, agentes de azulamento e corantes fluorescentes, inibidores de aglomeração, agentes de mascaramento, ativadores de enzima, antioxidantes e solubilizantes.

[00068] Como usado aqui, o termo “compatível com enzima”, quando usado no contexto de materiais de composição de limpeza, significa que os materiais não reduzem a atividade enzimática a tal nível que a enzima relevante não seja eficaz como desejado durante situações de uso normais.

[00069] Como usado aqui, o termo “derivado” refere-se a uma proteína que é derivada de uma proteína de origem pela adição de um ou mais aminoácidos a qualquer uma ou ambas as extremidades C e N terminal, a substituição de um ou mais aminoácidos em um número de sítios diferentes na sequência de aminoácido, e/ou a deleção de um ou mais aminoácidos em qualquer uma ou ambas as extremidades C e N terminal e/ou em um ou mais sítios na sequência de aminoácido, e/ou a inserção de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na sequência de aminoácido. A preparação de um derivado de proteína é frequentemente alcançada modificando-se uma sequência de DNA que codifica uma proteína nativa, a transformação da sequência de DNA modificada em um hospedeiro adequado, e a expressão da sequência de DNA para produzir a proteína derivada.

[00070] As proteínas relacionadas (e derivadas) abrangem proteínas “variantes”. As proteínas variantes diferem de uma proteína de origem e/ou entre si por um pequeno número de resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades, o número de diferentes resíduos de aminoácido é qualquer um de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50. Em algumas modalidades, as variantes diferem por aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos.

[00071] Em algumas modalidades, as proteínas relacionadas, tal como proteínas variantes, compreendem qualquer um de ao menos aproximadamente 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência de aminoácido.

[00072] Como usado aqui, o termo “sequência análoga” refere-se a uma sequência de polipeptídeo dentro de uma proteína que fornece uma função similar, estrutura terciária, e/ou resíduos conservados com relação a uma proteína de referência. Por exemplo, em regiões de epítopo que contêm uma estrutura de hélice alfa ou lâmina beta, a substituição de aminoácido(s) em uma sequência análoga mantém o mesmo elemento estrutural. Em algumas modalidades, as sequências análogas são fornecidas, o que resulta em uma enzima variante exibindo uma função similar ou otimizada com relação à proteína de origem a partir da qual a variante é derivada.

[00073] Como usado aqui, “proteína homóloga” refere-se a uma proteína (por exemplo, uma enzima per-hidrolase) que tem função similar (por exemplo, atividade enzimática) e/ou estrutura como uma proteína de referência (por exemplo, uma enzima per-hidrolase de uma fonte diferente). Os homólogos podem ser de espécie evolucionariamente relacionada ou não relacionada. Em algumas modalidades, um homólogo tem uma estrutura quaternária, terciária, e/ou primária similar a de uma proteína de referência, permitindo potencialmente desse modo a substituição de um segmento ou fragmento na proteína de referência com um segmento análogo ou fragmento do homólogo, com ruptura reduzida da estrutura e/ou função da proteína de referência em comparação com a substituição do segmento ou fragmento com uma sequência de uma proteína não homóloga.

[00074] Como usado aqui, proteínas “de ocorrência natural”, “nativas” e “ocorrendo naturalmente” são aquelas encontradas na natureza. Os termos “sequência de ocorrência natural” referem-se a uma sequência de aminoácido ou de ácido nucleico que é encontrada na natureza ou ocorrendo naturalmente. Em algumas modalidades, uma sequência de ocorrência natural é o ponto de partida de um projeto de engenharia de proteína, por exemplo, produção de proteínas variantes.

[00075] O termo “alvejamento”, como usado aqui, significa o processo de tratar um material têxtil tal como uma fibra, fio, tecido, vestimenta ou material não tecido para produzir uma cor mais clara na dita fibra, fio, tecido, vestimenta ou material não tecido. Por exemplo, o alvejamento como usado aqui significa o branqueamento do tecido pela remoção, modificação ou mascaramento de compostos que causam a cor em materiais celulósicos ou outros materiais têxteis. Assim, o “alvejamento” refere-se ao tratamento de um tecido por um período suficiente de tempo e sob condições de pH e temperatura apropriadas para efetuar uma despigmentação (isto é, branqueamento) do tecido. O alvejamento pode ser executado usando agente(s) de alvejamento químico e/ou agente(s) alvejantes enzimaticamente gerados. Exemplos de agentes alvejantes adequados incluem, mas não estão limitados a ClO2, H2O2, perácidos, NO2, etc.

[00076] O termo “agente de alvejamento ou alvejante”, como usado aqui, abrange qualquer porção que é capaz de alvejar um tecido. Um ativador de alvejamento pode ser exigido. Exemplos de agentes de alvejamento químico adequados úteis nos processos, métodos e composições descritos aqui são peróxido de sódio, perborato de sódio, permanganato de potássio, e perácidos. Em alguns aspectos, H2O2 pode ser considerado um agente de alvejamento químico quando ele é gerado enzimaticamente in situ. Uma “composição de alvejamento químico” contém um ou mais agentes de alvejamento químico.

[00077] A frase “sistema de alvejamento enzimático” ou “composição de alvejamento enzimático” contém uma ou mais enzimas e substratos capazes de enzimaticamente gerar um agente alvejante. Por exemplo, um sistema de alvejamento enzimático pode conter uma enzima per- hidrolase, um substrato éster, e uma fonte de peróxido de hidrogênio, para a produção de um agente alvejante perácido”.

[00078] Um “substrato éster” em relação a um sistema de alvejamento enzimático contendo uma enzima per-hidrolase refere-se a um substrato per-hidrolase que contém uma ligação éster. Ésteres compreendendo ácidos carboxílicos alifáticos e/ou aromáticos e alcoóis podem ser utilizados como substratos com enzimas per-hidrolase. Em algumas modalidades, a fonte de éster é um éster de acetato. Em algumas modalidades, a fonte de éster é selecionada a partir de um ou mais dentre diacetato de propileno gilcol, diacetato de etileno glicol, triacetina, acetato de etila e tributirina. Em algumas modalidades, a fonte de éster é selecionada a partir dos ésteres de um ou mais dos seguintes ácidos: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido valérico, ácido capriônico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido oleico.

[00079] O termo “fonte de peróxido de hidrogênio” significa que peróxido de hidrogênio é adicionado a um banho de tratamento têxtil ou a partir de uma fonte exógena (isto é, externa) ou gerado in situ pela ação de uma oxidade de geração de peróxido de hidrogênio em um substrato. A “fonte de peróxido de hidrogênio” inclui peróxido de hidrogênio, bem como os componentes de um sistema que pode espontâneo ou enzimaticamente produzir peróxido de hidrogênio como um produto reacional.

[00080] O termo “oxidase de geração de peróxido de hidrogênio” significa uma enzima que catalisa uma reação de oxidação/redução envolvendo oxigênio molecular (O2) como o aceptor de elétrons. Em tal reação, o oxigênio é reduzido em água (H2O) ou peróxido de hidrogênio (H2O2). Uma oxidase adequada para uso aqui, é uma oxidase que gera peróxido de hidrogênio (oposto à água) em seu substrato. Um exemplo de uma oxidase de geração de peróxido de hidrogênio e seu substrato adequado para uso aqui, é glicose oxidase e glicose. Outras enzimas oxidase que podem ser usadas para a geração de peróxido de hidrogênio incluem álcool oxidase, etileno glicol oxidase, glicerol oxidase, aminoácido oxidase, etc. Em algumas modalidades, a oxidase de geração de peróxido de hidrogênio é um carboidrato oxidase.

[00081] Como usado aqui, “têxtil” refere-se a fibras, fios, tecidos, vestimentas, e não tecidos. O termo abrange tecidos feitos de blendas naturais, sintéticas (por exemplo, manufaturados) e várias blendas naturais e sintéticas. Assim, o termo “têxtil(eis)” refere-se a fibras não processadas e processadas, fios, tecidos entrelaçados ou de tricô, não tecidos, e vestimentas. Em algumas modalidades, um têxtil contém celulose.

[00082] O termo “têxtil(eis) em necessidade de processamento” refere-se a têxteis que precisam ser desengomados, lavados, alvejados, e/ou pigmentados ou podem precisar de outros tratamentos tais como biopolimento, biodesbotamento e/ou amaciamento.

[00083] O termo “têxtil(eis) em necessidade de alvejamento” refere- se a têxteis que precisam ser alvejados sem referência a outros possíveis tratamentos. Esses têxteis podem ou não já ter sido submetidos a outros tratamentos. Similarmente, esses têxteis podem ou não precisar de tratamentos subsequentes.

[00084] “Tecido” refere-se a um conjunto de fibras e/ou fios manufaturado que tem área de superfície substancial em relação a sua espessura e suficiente coesão para obter a resistência mecânica útil do conjunto.

[00085] Como usados aqui, os termos “purificado” e “isolado” referem- se à remoção de contaminantes de uma amostra e/ou material (por exemplo, proteína, ácido nucleico, célula, etc.) que é removido de ao menos um componente com o qual está naturalmente associado. Por exemplo, esses termos podem se referir a um material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham-no em seu estado nativo.

[00086] Os termos “engomar” ou “engomamento” referem-se a compostos usados na indústria têxtil para otimizar o desempenho da tecelagem aumentando a resistência à abrasão e resistência do fio. O tamanho é usualmente feito, por exemplo, de compostos de amido ou similares a amido.

[00087] Os termos “desengomar” ou “desengomamento”, como usados aqui, referem-se ao processo para eliminar goma, geralmente amido, de têxteis usualmente antes de aplicar acabamentos especiais, corantes ou alvejantes.

[00088] “Enzima(s) para desengomar”, como usado aqui, refere-se a enzimas que são usadas para remover enzimaticamente a goma. As enzimas exemplificadas são amilases, celulases e mananases.

[00089] O termo “lavagem”, como usado aqui, significa remover impurezas, por exemplo, muitos dos compostos não celulósicos (por exemplo, pectinas, proteínas, cera, partículas, etc.) naturalmente encontrados em algodão ou outros tecidos. Em adição às impurezas não celulósicas naturais, a lavagem pode remover, em algumas modalidades, materiais residuais introduzidos por processos de manufatura, tal como lubrificantes de fiação, bobinagem ou slashing. Em algumas modalidades, o alvejamento pode ser empregado para remover impurezas de tecidos.

[00090] O termo “enzima(s) de biolavagem” refere-se a uma enzima(s) capaz de remover ao menos uma parte das impurezas encontradas no algodão ou outros tecidos.

[00091] O termo “partículas” refere-se a impurezas indesejadas, tal como fragmentos de semente de algodão, folhas, caules e outras partes da planta, que aderem à fibra mesmo após o processo de descaroçamento mecânico.

[00092] O termo tecidos “crus” (cinza pronunciado), como usado aqui, refere-se a tecidos que não receberam qualquer alvejamento, pigmentação ou tratamento de acabamento após ser produzido. Por exemplo, qualquer tecido entrelaçado ou de tricô que não foi ainda acabado (desengomado, lavado, etc.), alvejado ou pigmentado é chamado um tecido cru.

[00093] O termo “pigmentação”, como usado aqui, refere-se à aplicação de cor, especialmente enxaguando-se em uma solução corante, a, por exemplo, tecidos.

[00094] O termo fibra, fio ou tecido “celulósico não algodão” significa fibras, fios ou tecidos que são compreendidos principalmente de uma composição baseada em celulose, além de algodão. Exemplos de tais composições incluem linho, rami, juta, raiom, liocel, acetato de celulose e outras composições similares que são derivadas de celulósicos não algodão.

[00095] O termo “pectato liase”, como usado aqui, refere-se a um tipo de pectinase. “Pectinase” denota uma enzima pectinase definida de acordo com a técnica onde as pectinases são um grupo de enzimas que clivam ligações glicosídicas de substâncias pécticas principalmente poli(1,4-alfa-D-galacturonida) e seus derivados (ver Sakai e outros (1993) Advances in Applied Microbiology 39: 213 a 294). Preferencialmente, uma pectinase útil aqui é uma enzima pectinase que catalisa a clivagem aleatória de ligações alfa-1,4-glicosídicas em ácido péctico também chamado ácido poligalacturônico por transeliminação, tal como a classe de enzima poligalacturonato liase (EC 4.2.2.2) (PGL), também conhecida como poli(1,4-alfa-D-galacturonida)liase, também conhecida como pectato liase.

[00096] O termo “pectina” denota pectato, ácido poligalacturônico e pectina que podem ser esterificados em um grau mais alto ou mais baixo.

[00097] O termo “cutinase”, como usado aqui, refere-se como uma enzima de planta, bactéria ou fungo derivada usada no processamento têxtil. As cutinases são enzimas lipolíticas capazes de hidrolisar o substrato cutina. As cutinases podem decompor ésteres de ácido graxo e outras composições à base de óleo precisam ser removidas no processamento (por exemplo, lavagem) de tecidos. “Cutinase” significa uma enzima que tem atividade de hidrólise de cutina de planta significativa. Especificamente, uma cutinase terá atividade hidrolítica na cutina de polímero biopoliéster encontrada nas folhas de plantas. As cutinases adequadas podem ser isoladas de muitas fontes vegetais, fúngicas e bacterianas diferentes.

[00098] O termo “α-amilase”, como usado aqui, refere-se a uma enzima que cliva as ligações α(1,4)glicosídicas de amilose para produzir moléculas de maltose (dissacarídeos de α-glicose). As amilases são enzimas digestivas encontradas na saliva e são também produzidas por muitas plantas. As amilases decompõem carboidratos de cadeia longa (tal como amido) em unidades menores. Uma α-amilase “oxidativa estável” é uma α-amilase que é resistente à degradação por meios oxidativos, quando comparada à α-amilase estável não oxidativa, especialmente quando comparada à α-amilase estável não oxidativa a partir da qual a α-amilase estável oxidativa foi derivada.

[00099] O termo “protease” significa um domínio de proteína ou polipeptídeo de uma proteína ou polipeptídeo derivado de um micro- organismo, por exemplo, um fungo, bactéria, ou de uma planta ou animal, e que tem a capacidade de catalisar a clivagem de ligações peptídicas em uma ou mais das várias posições de uma estrutura de carboidrato e proteína.

[000100] Como usado aqui, “produtos para cuidados pessoais” significa produtos usados na limpeza, alvejamento e/ou desinfecção de cabelo, pele, couro cabeludo, e dentes, incluindo, mas não limitados a xampus, loções corporais, géis de banho, umidificadores tópicos, cremes dentais, e/ou outros limpadores tópicos. Em algumas modalidades, esses produtos são utilizados em humanos, enquanto em outras modalidades, esses produtos encontram uso com animais não humanos (por exemplo, em aplicações veterinárias).

[000101] Uma “suspensão” ou “dispersão”, como usada aqui, refere- se a um sistema de duas fases onde uma fase sólida descontínua é dispersa dentro de uma fase líquida contínua.

[000102] Um “auxiliador de suspensão”, como usado aqui, refere-se a um material adicionado a uma composição líquida para impedir ou reduzir a sedimentação ou flutuação de partículas suspensas. Os auxiliares de suspensão tipicamente trabalham para aumentar ou a viscosidade ou a tensão de corte de um líquido veículo. Os fluidos com um estresse resultante significativo fluirão somente quando a tensão que é aplicada for maior do que a tensão de corte, e exibir assim um comportamento de pseudoplasticidade ou tixotrópico. Os agentes de suspensão eficazes tipicamente agem formando uma rede reversível de partículas ou fibras ligadas por forças fracas. Exemplos de agentes de suspensão incluem, mas não estão limitados à goma xantana e celulose microfibrosa, por exemplo, CELLULON® (CP Kelco, San Diego, CA).

[000103] “Encapsulado”, como usado aqui, refere-se a uma substância que está contida dentro de um material circundante. Esse pode incluir morfologias de núcleo/invólucro ou matriz como descrito na técnica (ver, por exemplo, “Microencapsulation”, Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2005).

[000104] “Miscível”, como usado aqui, refere-se a um líquido que é capaz de se misturar com outro líquido, em uma razão específica dos dois líquidos, sem separação em fases.

[000105] “Matriz”, como usado aqui, refere-se a um material no qual uma substância é incorporada ou embebida.

[000106] Como usado aqui, um “biofilme” é uma coleção de micro- organismos embebidos em uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares e vários compostos orgânicos e inorgânicos. Embora alguns biofilmes possam conter uma única espécie de micro-organismo, os biofilmes tipicamente compreendem não somente espécies diferentes de micro-organismos, mas tipos diferentes de micro- organismos, por exemplo, algas, protozoários, bactérias e outros.

Sistemas de coliberação enzima/substrato

[000107] A invenção fornece um sistema de liberação de líquido para enzima e substrato coformulados no qual ao menos uma enzima é encapsulada em uma matriz polimérica e é formulada com um substrato para a enzima. O substrato está em uma fase líquida substancialmente não aquosa em contato com a matriz polimérica e no qual a matriz polimérica não é solúvel. A matriz polimérica contendo a enzima pode ser suspensa na fase líquida contendo o substrato ou circundando-a. A enzima e o substrato não estão em contato no sistema de liberação em uma configuração na qual a catálise enzimática pode ocorrer. Quando em contato com a água, na qual a matriz polimérica é solúvel e na qual a enzima é cataliticamente ativa em direção ao substrato, a atividade catalítica ocorre. Uma ou múltiplas enzimas podem ser incluídas na composição, com ao menos uma enzima encapsulada em uma matriz polimérica. Em algumas modalidades, o sistema de liberação contém duas ou mais enzimas, encapsuladas na mesma matriz polimérica ou em matrizes poliméricas separadas, e o sistema de liberação contém um substrato para ao menos uma das enzimas.

[000108] O substrato é solubilizado ou suspenso em um líquido veículo que é substancialmente não aquoso e no qual a matriz polimérica não é solúvel. O líquido veículo e o polímero são escolhidos tal que a matriz polimérica permaneça em uma forma sólida e sem dilatar durante o armazenamento. Isso pode ser alcançado, por exemplo, com baixo teor de água, reticulação reversível, e/ou baixa temperatura de armazenamento. Em algumas modalidades, a fase líquida contém menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 1%, ou menos de aproximadamente 0,5% de água, por exemplo, aproximadamente 4%, 3%, 2%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% ou 0,1% de água.

[000109] A enzima encapsulada substancialmente não reage com o substrato na fase líquida durante o armazenamento do sistema de liberação. Em algumas modalidades, menos de aproximadamente 20%, 10%, 5%, 1% ou 0,5% de substrato na fase líquida é convertido em produto durante o armazenamento por ao menos aproximadamente 10 dias, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, ou mais em aproximadamente 25° C. Em algumas modalidades, menos de aproximadamente 20%, 10%, 5%, 1% ou 0,5% de substrato na fase líquida é convertido em produto durante o armazenamento por ao menos aproximadamente 10 dias, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, ou mais em aproximadamente 37° C. Em algumas modalidades, menos de aproximadamente 20%, 10%, 5%, 1% ou 0,5% de substrato na fase líquida é convertido em produto durante o armazenamento por ao menos aproximadamente 10 dias, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, ou mais em aproximadamente 50° C.

[000110] Em um sistema de liberação descrito aqui, uma enzima encapsulada retém ao menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou essencialmente todo o potencial catalítico inicial na matriz polimérica, liberável mediante o contato com água, mas substancialmente não reage com o substrato na composição por ao menos aproximadamente 10 dias, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses ou mais a 25° C, 37° C ou 50° C.

Matriz Polimérica

[000111] A matriz polimérica compreende, consiste de, ou consiste essencialmente de um polímero que é insolúvel em um fluido veículo contendo o substrato e solúvel em água. Em algumas modalidades, a matriz polimérica compreende, consiste de, ou consiste essencialmente de polivinil álcool, metil celulose, hidroxipropil metil celulose, polivinil pirrolidona, goma guar, ou um derivado ou copolímero desses, ou uma mistura dos mesmos. Em algumas modalidades, a matriz polimérica contém uma ou mais cargas ou expansores (por exemplo, amido, açúcar, argila, talco, carbonato de cálcio, dióxido de titânio, fibras de celulose), plasticizador (por exemplo, glicerol, sorbitol, propileno glicol), cosolvente, ligante, agente de dilatação (por exemplo, poliacrilato, croscarmelose de sódio, amido glicolato de sódio, hidroxipropil celulose de baixa substituição, galactomanana, Water-Lok, ZapLoc), ou agente de liberação.

[000112] Em algumas modalidades, os polímeros são polímeros negativamente carregados, tal como heteropolissacarídeos incluindo resíduos de glucuronida e/ou galacturonida. Tais polissacarídeos podem, por exemplo, incluir material produzido pelos organismos a partir dos quais as próprias enzimas foram produzidas, e podem permanecer como contaminantes nas preparações de enzima parcialmente purificada mesmo que eles não tenham atividade enzimática útil. Alternativamente ou adicionalmente, tais polissacarídeos podem ser adicionados separadamente, em quantidades até aproximadamente 1 a 5% em peso ou mais da pasta fluida. Tais quantidades podem ser comparáveis às das próprias enzimas. Em algumas modalidades, os polissacarídeos estão presentes (ou adicionados) antes da secagem por aspersão. Outros polímeros exemplificados são arabinogalactanas, xilogalactanas, e geralmente, polissacarídeos ácidos.

[000113] Em algumas modalidades, a matriz polimérica inclui proteínas, peptídeos, ou derivados desses. Alguns ou todos os peptídeos ou proteínas podem estar presentes em um caldo de fermentação, meio celular, ou preparações de proteína parcialmente purificada, e podem permanecer como contaminantes nas preparações de enzimas parcialmente purificadas mesmo que eles não tenham atividade enzimática útil. Alternativamente ou adicionalmente, tais polissacarídeos podem ser adicionados separadamente, em quantidades até aproximadamente 1 a 5% em peso ou mais da pasta fluida. Tais quantidades podem ser comparáveis às das próprias enzimas.

[000114] Em várias modalidades, as enzimas (e opcionalmente os substratos) são encapsuladas em polímeros usando técnicas incluindo, mas não limitadas à evaporação de solvente, secagem por aspersão, liofilização/secagem por congelamento, revestimento por aspersão em leito fluidizado, aglomeração em leito fluidizado, resfriamento por aspersão, granulação a úmido, granulação em tambor, granulação com alto cisalhamento, extrusão, revestimento em recipiente rotativo, coacervação, gelação, e atomização. Em particular, a secagem por aspersão é usada.

[000115] Geralmente, a quantidade de enzima encapsulada na matriz polimérica é menor do que 50% em peso. Em várias modalidades, a quantidade de enzima encapsulada na matriz polimérica é aproximadamente 0,01% a aproximadamente 50%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 25%, aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, ou aproximadamente 2% a aproximadamente 5% em peso.

[000116] Em algumas modalidades, a matriz polimérica contendo enzima está na forma de partículas que são suspensas em uma fase líquida contendo substrato. Em várias modalidades, as partículas têm diâmetro de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 micrometros, aproximadamente 50 a aproximadamente 250 micrometros, aproximadamente 100 a aproximadamente 300 micrometros, aproximadamente 200 a aproximadamente 500 micrometros, aproximadamente 400 a aproximadamente 800 micrometros, ou aproximadamente 600 a aproximadamente 1000 micrometros.

[000117] Em algumas modalidades, a matriz polimérica está na forma de um filme que tem espessura de aproximadamente 5 a aproximadamente 1000 micrometros, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 micrometros, aproximadamente 100 a aproximadamente 200 micrometros, ou aproximadamente 200 a aproximadamente 500 micrometros, ou aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 micrometros.

[000118] Em algumas modalidades, a matriz polimérica contendo enzima está na forma de um filme formando um recipiente vedado (por exemplo, uma bolsa, um sachê, ou uma cápsula) circundando uma fase líquida que contém o substrato. Enzimas

[000119] Em várias modalidades, o sistema de liberação contém uma ou mais proteases, esterases, serina hidrolases, lipases, per-hidrolases, oxidases, enzimas de oxidação de fenol, lacases, acil transferases, aril esterases, amilases, pectinases, xilanases, celulases, hemicelulases, catalases, peroxidases, carboidrato oxidase, mananases, fitases, pectinases, peroxidases, cutinases, catalases ou uma mistura dos mesmos.

[000120] Em uma modalidade, o sistema de liberação contém uma lacase (uma multicobre oxidase, EC 1.10.3.2, por exemplo, de Cerrena unicolor) e um mediador (substrato) para a lacase, tal como, ácido de 2,2’-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- sulfônico) sal diamônio (ABTS), siringonitrila (SN), siringamida (AS), siringato de metila (MS), ou 10- carboxipropil fenotiazina (PTP), ou um mediador descrito na Patentes europeias No. 1 064 359, 1 141 321 ou 0 805 465, Patente U.S. No. 6.329.332, Pedido PCT No. 00/05349, ou Publicação U.S. No. 2008/0196173.

[000121] Em uma modalidade, a enzima lacase compreende, consiste de, ou consiste essencialmente da sequência de aminoácido representada na SEQID NO: 1, abaixo, ou uma variante ou homólogo, dessa, tendo ao menos 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou até 99% ou mais de identidade de sequência, ou uma sequência de aminoácido descrita no Pedido PCT No. WO 2008/076322, ou uma variante ou homólogo dessa tendo ao menos 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 ou até 99,5% ou mais de identidade de sequência. AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNV IDDLTDDRMLTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYD FDVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDD GGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLINGLGRSQTGPADAELAVIS VEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVNTRPLTVDSIQ IFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNA SVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVP- GGADINHRLNLTFSNGLFSINNASFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLP TGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHNFWVVRSAGSDEYN FDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAGLAIVF AEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI (SEQ ID NO: 1).

[000122] Em algumas modalidades, o sistema de liberação contém uma enzima per-hidrolase (por exemplo, acil transferase, aril transferase) e o substrato(s) para produzir um perácido, por exemplo, um doador de acila tal como um substrato éster, por exemplo, diacetato de propileno glicol (PGDA), e uma fonte de peróxido de hidrogênio , por exemplo, percarbonato de sódio, perborato de sódio, hidrogeno peróxido de ureia, ou um sistema de geração de peróxido de hidrogênio enzimático, por exemplo, uma oxidase de geração de peróxido de hidrogênio e seu substrato, por exemplo, glicose oxidase e glicose.

[000123] Em algumas modalidades, a enzima per-hidrolase é uma enzima per-hidrolase de M. smegmatis naturalmente ocorrendo. Em algumas modalidades, a enzima per-hidrolase compreende, consiste de, ou consiste essencialmente da sequência de aminoácido apresentada na SEQID NO: 2 ou uma variante ou homólogo dessa. Em algumas modalidades, a enzima per-hidrolase compreende, consiste de, ou consiste essencialmente de uma sequência de aminoácido que é ao menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou até 99,5% ou mais idêntica à sequência de aminoácido apresentada na SEQID NO: 4.

[000124] A sequência de aminoácido de per-hidrolase de M. smegmatis é mostrada abaixo: MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGAD FEVIEEGLSARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVIIMLGTN DTKAYFRRTPLDIALGMSVLVTQVLTSAGGVGTTYPAPKVLVVSPPPL APMPHPWFQLIFEGGEQKTTELARVYSALASFMKVPFFDAGSVISTD GVDGIHFTEANNRDLGVALAEQV RSLL (SEQ ID NO: 2).

[000125] A sequência de polinucleotídeo correspondente codificando a per-hidrolase de M. smegmatis é (5’-3’):: ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGC TGGGTCCCCGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCC CCGACGTGCGCTGGACCGGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGC GGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGCACCACCA ACATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCAACGGCGCGAGCTAC CTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTCGACCTGGTGAT CATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCA CCCCGCTCGACATCGCGCTGGGCATGTCGGTGCTCGTCACGCAG GTGCTCACCAGCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCAC CCAAGGTGCTGGTGGTCTCGCCGCCACCGCTGGCGCCCATGCCG CACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAGGGCGGCGAGCAGAAGAC CACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCGTCGTTCATGA AGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCACCGACGGC GTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGG GGTGGCCCTCGCGGAACAGGTGCG GAGCCTGCTGTAA-3’ (SEQ ID NO: 3).

[000126] Em algumas modalidades, a enzima per-hidrolase compreende uma ou mais substituições em uma ou mais posições de aminoácido equivalentes à posição(ões) na sequência de aminoácido de per-hidrolase de M. smegmatis apresentada em SE ID NO: 2. Em algumas modalidades, a enzima per-hidrolase compreende qualquer uma ou qualquer combinação de substituições de aminoácidos selecionadas a partir de M1, K3, R4, I5, L6, C7, D10, S11, L12, T13, W14, W16, G15, V17, P18, V19, D21, G22, A23, P24, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, V32, R33, W34, T35, G36, L38, Q40, Q41, D45, L42, G43, A44, F46, E47, V48, I49, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, I60, D61, D62, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, G70, A71, S72, Y73, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, D85, L86, V87, N94, D95, T96, K97, Y99F100, R101, R102, P104, L105, D106, I107, A108, L109, G110, M111, S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P146, P148, W149, F150, I153, F154, I194, e F196.

[000127] Em algumas modalidades, a enzima per-hidrolase compreende uma ou mais das seguintes substituições em uma ou mais posições de aminoácido equivalentes à posição(ões) na sequência de aminoácido de per-hidrolase de M. smegmatis apresentada na SEQID NO: 2: L12C, Q, ou G; T25S, G, ou P; L53H, Q, G, ou S; S54V, L A, P, T, ou R; A55G ou T; R67T, Q, N, G, E, L, ou F; K97R; V125S, G, R, A, ou P; F154Y; F196G.

[000128] Em algumas modalidades, a enzima per-hidrolase compreende uma combinação de substituições de aminoácido em posições de aminoácido equivalentes às posições de aminoácido na sequência de aminoácido de per-hidrolase de M. smegmatis apresentada na SEQID NO: 2: SEQ ID NO:2: L12I+S54V; L12M+S54T; L12T+S54V; L12Q+T25S+S54V; L53H+S54V; S54P+V125R; S54V+V125G; S54V+F196G; S54V+K97R+V125G; ou A55G+R67T+K97R+V125G.

[000129] Em algumas modalidades, a suspensão líquida contém uma enzima per-hidrolase e substratos para produzir mono- e diglicerídeos (por exemplo, um doador de acila e aceptor de álcool) ou um éster de sorbitana (por exemplo, um doador de acila e sorbitana). Em algumas modalidades, a suspensão líquida contém uma enzima per-hidrolase e substratos para produzir um éster fragrante, por exemplo, um benzil éster (por exemplo, um doador de acila e um álcool volátil, por exemplo, álcool benzílico).

[000130] Em algumas modalidades, a enzima é uma per-hidrolase e o sistema de liberação contém um substrato éster ou mistura de substrato éster, por exemplo, um acetato éster, por exemplo, diacetato de propileno glicol (PGDA), acetato de etila, acetato de butila, acetato de hexila, acetato de octila, etil propionato, butil propionato, hexil propionato, isoamil acetato, citronelil acetato, citronelil propionato, dodecil acetato, Neodol 23-3 acetato, Neodol 23-9 acetato, diacetato de etileno glicol, triacetina, tributirina, metóxi acetato de etila, linalil acetato, etil butirato, etil isobutirato, butirato de etil-2-metila, etil isovalerato, dietil isovalerato, dietil maleato, etil glicolato, ou uma mistura dos mesmos

[000131] Em algumas modalidades, o sistema de liberação contém uma protease e ao menos uma outra enzima sensível à protease, isto é, uma enzima que é hidrolisável pela protease, encapsulada na mesma matriz polimérica ou em matrizes poliméricas separadas, ou onde uma dentre a protease e a enzima sensível à protease é encapsulada em uma matriz polimérica e a outra enzima está em uma fase líquida no sistema de liberação, e a protease é substancialmente não cataliticamente ativa em direção à enzima sensível à protease até que água é adicionada ao sistema de liberação.

Líquidos veículos

[000132] O sistema de liberação inclui um substrato para uma enzima encapsulada em um líquido veículo no qual a matriz polimérica (na qual a enzima é encapsulada) é substancialmente insolúvel. Exemplos não limitantes de líquidos veículos incluem glicóis, tensoativos não iônicos, alcoóis, poliglicóis, e ésteres de acetato. Em algumas modalidades, o líquido veículo é um substrato para a enzima.

Ingredientes Adjuntos Opcionais

[000133] Em algumas modalidades, o sistema de liberação inclui um ou mais tensoativos, isto é, um tensoativo não iônico, aniônico, catiônico, anfolítico, zwiteriônico, ou não iônico semipolar, ou uma mistura dos mesmos. Em algumas modalidades, o sistema de liberação inclui um ou mais dentre: um auxiliar de suspensão, um agente quelante, um agente estabilizante, um emulsificante, um agente de tamponagem, e/ou uma mistura desses.

Composições

[000134] A invenção fornece composições contendo sistema de coliberação de enzima/substrato como descrito aqui. As composições exemplificadas incluem: uma composição de limpeza, uma composição desinfetante, uma composição de descontaminação, uma composição de processamento têxtil, uma composição de alvejamento, uma composição de pigmentação têxtil, uma composição para cuidados pessoais, uma composição de coloração de cabelos, uma composição de processamento de polpa ou papel, uma composição de produção de compósito de madeira, uma composição de processamento de água residual, uma composição de assamento, uma composição de produção de cerveja, uma composição de ração animal, uma composição de processamento de amido, e/ou uma composição de fermentação de etanol. O sistema de liberação pode ser armazenado na composição ou pode ser misturado na composição no ponto de uso.

[000135] Em uma modalidade, uma composição detergente é fornecida para uso em uma aplicação de limpeza. Em adição ao sistema de coliberação de enzima/substrato descrito aqui, uma composição detergente pode conter um ou mais ingredientes detergentes selecionados a partir de tensoativos, encorpadores, alvejantes, precursores de alvejamento, estabilizantes de enzima, agentes complexantes, agentes quelantes, reguladores de espuma, inibidores de corrosão, agentes antieletrostáticos, corantes, perfumes, bactericidas, fungicidas, e ativadores. O sistema de liberação pode ser armazenado na composição detergente ou pode ser misturado na composição no ponto de uso.

Métodos de Uso Métodos de Limpeza

[000136] Os sistemas de coliberação de enzima/substrato descritos aqui podem ser usados em métodos para limpeza. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para limpar, compreendendo um artigo contendo uma mancha com uma composição detergente compreendendo um sistema de coliberação de enzima/substrato como descrito aqui na presença de água, onde ao menos uma parte da mancha é removida. As enzimas adequadas para uso em métodos de limpeza aqui incluem, mas não estão limitadas a proteases, amilases, per-hidrolases, oxidases, lipases, celulases, xilanases, mananases, esterases, cutinases, poliesterases, pectinases, enzimas de oxidação de fenol, catalases, lisozimas, e hemicelulases.

[000137] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para inibir a transferência de corante de um tecido pigmentado para outro tecido durante a lavagem, compreendendo um sistema de coliberação de enzima/substrato como descrito aqui, na presença de água, onde o sistema de liberação contém uma enzima capaz de alvejar, por exemplo, uma enzima de oxidação de fenol, tal como uma lacase, ou uma peroxidase, onde ao menos uma parte das substâncias coloridas lixiviadas a partir de tecido pigmentado e/ou manchado é alvejada, impedindo desse modo a redeposição das substâncias coloridas no outro tecido na lavagem.

Métodos de Processamento Têxtil

[000138] Os sistemas de coliberação de enzima/substrato descritos aqui podem ser usados em métodos para processamento têxtil. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para alvejamento de um tecido, compreendendo contatar um tecido com um sistema de coliberação de enzima/substrato contendo ao menos uma enzima e substrato capaz de alvejar um tecido, por exemplo, uma per-hidrolase e substratos para produzir um perácido ou uma enzima de oxidação de fenol, por exemplo, uma lacase, e um mediador capaz de produzir um efeito alvejante, na presença de água, por um período de tempo e sob condições adequadas para permitir o branqueamento mensurável do tecido, produzindo desse modo um tecido alvejado. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para mudar a cor de um tecido (por exemplo, pigmentando o tecido), compreendendo contatar um tecido com um sistema de coliberação de enzima/substrato contendo uma enzima e substrato capaz de mudar a cor de um tecido, por exemplo, uma enzima de oxidação de fenol, por exemplo, uma lacase, e um mediador capaz de efetuar uma mudança de cor, na presença de água, por um período de tempo e sob condições adequadas para permitir uma mudança mensurável da cor no tecido, produzindo desse modo um têxtil com uma mudança na cor.

[000139] Em algumas modalidades, a invenção fornece método para o pré-tratamento combinado de tecidos em um único processo, onde o sistema de coliberação de enzima/substrato compreende ao menos duas enzimas de processamento têxtil. Por exemplo, um processo combinado para desengomar, lavar, e alvejar inclui uma enzima per- hidrolase e substrato(s) (por exemplo, substrato éster e fonte de peróxido de hidrogênio) como descrito aqui e enzimas amilase e pectinase. Um processo de lavagem e alvejamento combinado inclui uma enzima per-hidrolase e substrato(s) como descrito aqui e uma enzima pectinase. Um processo combinado de desengomar e alvejar inclui uma enzima per-hidrolase e substrato(s) como descrito aqui e uma enzima amilase. Uma enzima pectinase nos métodos de pré- tratamento têxtil combinados descritos aqui pode ser usada por ela mesma ou em combinação com uma ou mais enzimas tais como protease, lípase, celulase, cutinase, e/ou hemicelulase. Métodos de Sanitização, Desinfecção e/ou Descontaminação Usando Uma Enzima Per-hidrolase

[000140] Os sistemas de coliberação de enzima/substrato da presente invenção (e sistemas relacionados e kits incorporando essas composições) podem ser usados em uma faixa de métodos para descontaminar, desinfetar e/ou sanitizar itens.

[000141] Em algumas modalidades, o método para descontaminação compreende: (a) fornecer um sistema de coliberação de enzima/substrato como descrito aqui compreendendo uma enzima com atividade per-hidrolase encapsulada em um polímero solúvel em água, onde a dita atividade compreende uma razão de per-hidrólise para hidrólise de ao menos 2:1, uma fonte de peróxido de hidrogênio, e um substrato éster; e (b) adicionar a composição à água e misturar sob condições e por um período de tempo suficiente para solubilizar a matriz polimérica e para gerar uma solução aquosa de ao menos aproximadamente 0,16% em peso de ácido peracético, por exemplo, ao menos aproximadamente 20 minutos, e um pH menor do que aproximadamente 9,0; e (c) expor um item compreendendo um contaminante à solução.

[000142] Em uma modalidade, o método para descontaminação compreende: (a) fornecer um sistema de coliberação de enzima/substrato compreendendo uma enzima acil transferase encapsulada em um polímero solúvel em água, uma fonte de peróxido de hidrogênio, e um diacetato de propileno glicol; (b) adicionar a composição à água e misturar sob condições e por um período de tempo suficiente para solubilizar a matriz polimérica e para gerar uma solução aquosa de ao menos aproximadamente 0,16% em peso de ácido peracético, por exemplo, ao menos aproximadamente 20 minutos; e (c) expor um item compreendendo um contaminante à dita solução.

[000143] Em algumas modalidades, a fonte de peróxido de hidrogênio é um composto de geração de peróxido de hidrogênio, por exemplo, selecionado a partir de percarbonato de sódio, perborato de sódio, e peróxido de ureia e hidrogênio. Em algumas modalidades, a fonte de peróxido de hidrogênio é um sistema enzimático, tal como uma oxidase de geração de peróxido de hidrogênio e seu substrato, por exemplo, glicose oxidase e glicose. A oxidase de geração de peróxido de hidrogênio pode ser encapsulada em uma matriz polimérica (a mesma matriz polimérica ou separada da matriz polimérica na qual a enzima per-hidrolase é encapsulada) ou solubilizada ou suspensa na fase líquida no sistema de liberação. O substrato para a oxidase de geração de peróxido de hidrogênio pode ser encapsulado em uma matriz polimérica (a mesma matriz polimérica ou separada da matriz polimérica na qual a enzima per-hidrolase é encapsulada) ou solubilizado ou suspenso na fase líquida no sistema de liberação.

[000144] Dependendo do tipo específico de contaminante a ser removido, a etapa de expor o item à solução de perácido pode ser executada ao longo de uma ampla faixa de escalas de tempo. Por exemplo, em certos procedimentos de sanitização, os tempos de exposição mais curtos possíveis são de aproximadamente 30 segundos, 1 minuto, 5 minutos ou 10 minutos podem ser suficientes. Entretanto, em outras aplicações (por exemplo, remoção de biofilmes), pode ser necessário expor o item por períodos de tempo consideravelmente mais longos, tal como aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, ou ainda maiores, de modo a alcançar o nível adequado de descontaminação.

[000145] Similarmente, a temperatura da solução de perácido durante a etapa de exposição pode ser ajustada dependendo do tipo particular de contaminante. Em uma modalidade, a temperatura de exposição é a temperatura ambiente na qual a solução é preparada, isto é, tipicamente aproximadamente 18 a 25° C. Em outras modalidades, temperaturas mais altas podem ser usadas para facilitar o processo de descontaminação. Geralmente, temperaturas mais altas acelerarão a reatividade da solução de perácido, acelerando desse modo o processo de descontaminação. Assim, em algumas modalidades, a etapa de exposição pode ser executada com a solução de perácido em aproximadamente 30° C, 37° C, 45° C, 50° C, 60° C, 75° C, 90° C, ou ainda mais.

[000146] Em uma modalidade dos métodos, a matriz polimérica contendo enzima está na forma de um recipiente solúvel em água no qual os substratos são incorporados em uma fase líquida e o recipiente é adicionado à água.

[000147] Os métodos de descontaminação são úteis contra uma ampla faixa de contaminantes incluindo toxinas selecionadas a partir do grupo que consiste de toxina butolínica, toxina de anthracis, ricina, toxina escombroide, ciguatoxina, tetradotoxina, micotoxinas, ou uma combinação das mesmas; e os patógenos selecionados a partir do grupo que consiste de bactérias, vírus, fungos, parasitas, príons, e qualquer combinação desses. Por exemplo, os métodos descritos aqui podem ser usados para descontaminação de materiais contaminados com materiais incluindo, mas não limitados a produtos químicos tóxicos, mostarda, VX, esporos de B. anthracis, Y. pestis, F. tularensis, fungos, e toxinas (por exemplo, butolínica, ricina, micotoxinas, etc.), bem como células infectadas com vírions infecciosos (por exemplo, flavivírus, ortomixovírus, paramixovírus, arenavírus, rabdovírus, arbovírus, enterovírus, buniavírus, etc.). Em algumas modalidades, ao menos um patógeno é selecionado a partir de Bacillus spp., B. anthracis, Clostridium spp., C. botulinum, C. perfringens, Listeria spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Salmonella spp., Shigella spp., E. coli, Yersinia spp., Y. pestis, Francisella spp., F. tularensis, Camplyobacter ssp., Vibrio spp., Brucella spp., Cryptosporidium spp., Giardia spp., Cyclospora spp., e Trichinella spp.

[000148] As soluções de perácido geradas usando os sistemas de liberação descritos aqui e os seus métodos de uso são eficazes em descontaminar biofilmes. Uma das características dos biofilmes é que os micro-organismos nestes agem cooperativamente ou sinergisticamente. Empiricamente, concluiu-se que os micro-organismos que vivem em um biofilme são melhores protegidos de biocidas do que os micro- organismos que vivem fora de um biofilme. Assim, a remoção de biofilmes patogênicos representa um problema particularmente difícil em descontaminar e/ou sanitizar equipamento.

[000149] Em algumas modalidades, as composições estáveis obtidas para serem usadas para gerar uma solução de perácido são úteis para remover biofilmes, incluindo aqueles formados por uma ou mais bactérias patogênicas selecionadas a partir do grupo que consiste de: Bacillus spp., B. anthracis, Clostridium spp., C. botulinum, C. perfringens, Listeria spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Salmonella spp., Shigella ssp., E. coli, Yersinia spp., Y. pestis, Francisella spp., F. tularensis, Camplyobacter ssp., Vibrio spp., Brucella spp., Cryptosporidium spp., Giardia spp., Cyclospora spp., Trichinella spp., e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, uma solução de perácido obtida pelos métodos da presente invenção pode ser usada para descontaminar biofilmes selecionados a partir do grupo que consiste de: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (SRWC-10943), Listeria monocytogenes (ATCC 19112), e qualquer combinação dos mesmos.Em uma modalidade, os biofilmes patogênicos compreendendo culturas bacterianas de Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., e/ou Listeria spp., contaminando equipamento de aço inoxidável podem ser substancialmente removidos (isto é, redução de ~ 500 a 1000 vezes) pela exposição a uma solução de 0,16% em peso de PAA (gerada a partir do sistema de coliberação de enzima/substrato contendo per-hidrolase) em 45° C por 45 minutos.

[000150] Em várias modalidades, os métodos de descontaminação usando os sistemas de liberação contendo per-hidrolase descritos aqui são úteis para sanitizar/descontaminar uma ampla faixa de itens contaminados incluindo superfícies duras, tecidos, alimento, ração, vestimentas, tapetes, carpetes, têxteis, instrumentos médicos, instrumentos veterinários, por exemplo, itens e equipamentos de aço inoxidável, incluindo grandes reatores, usados em processos farmacêuticos e de biotecnologia.

[000151] As soluções de perácido geradas enzimaticamente usando os sistemas de liberação descritos aqui são particularmente bem adequadas para limpar itens e equipamentos de aço inoxidável porque a razão de perácido para o ácido correspondente gerado em solução aquosa é muito maior do que a encontrada em soluções comerciais. Por exemplo, uma solução de ácido perácido (PAA) gerada usando a composição estável de variante S54V de MsAcT, percarbonato, e diacetato de propileno glicol (PGDA), terá uma razão de PAA para ácido acético de aproximadamente 10:1. As soluções de PAA comercial tipicamente têm mais ácido acético do que PAA e podem ainda ter a razão revertida (1:10). A razão aumentada de PAA para ácido acético reduz, ou completamente evita a necessidade de executar tratamentos passivadores adicionais do item ou equipamento de aço inoxidável após o tratamento com PAA. Assim, em algumas modalidades, as soluções de perácido geradas usando as composições estáveis da presente invenção podem ser usadas para sanitizar itens e equipamentos de aço inoxidável, incluindo reatores grandes, usados em processos farmacêuticos e de biotecnologia. Em algumas modalidades, as soluções de perácido podem ser usadas para sanitizar itens e equipamento de aço inoxidável em uma única etapa, sem a necessidade de qualquer tratamento adicional do aço com um agente passivador.

[000152] Em ainda modalidades adicionais, os sistemas de liberação descritos aqui podem ser usados na descontaminação de alimentos e/ou ração, incluindo, mas não limitados a vegetais, frutas, e outros itens de alimento e/ou ração. De fato, observa-se que a presente invenção encontrará uso na limpeza de superfície de frutas, vegetais, ovos, carnes, etc. De fato, pretende-se que a presente invenção encontre uso na indústria de alimentos e/ou ração para remover contaminantes de vários itens de alimento e/ou ração. Em algumas modalidades, os métodos para descontaminação de alimento e/ou ração apresentados pela entidade Food and Drug Administration e/ou outras entidades de segurança de alimentos, como conhecido pelos versados na técnica encontram uso com a presente invenção.

[000153] Em ainda modalidades adicionais, o item que precisa de descontaminação é selecionado a partir de superfícies duras, tecidos, alimento, ração, vestimentas, tapetes, carpetes, têxteis, instrumentos médicos e instrumentos veterinários. Em algumas modalidades, o alimento é selecionado a partir de frutas, vegetais, peixe, frutos do mar, e carne. Em ainda algumas modalidades adicionais, as superfícies duras são selecionadas a partir de superfícies domésticas e superfícies industriais. Em algumas modalidades, as superfícies domésticas são selecionadas a partir de bancadas de cozinha, pias, armários, tábuas de corte, mesas, estantes, áreas de armazenamento para preparação de alimentos, utensílios de banheiro, pisos, tetos, paredes e áreas de quarto. Em algumas modalidades, as superfícies industriais são selecionadas a partir de áreas de processamento de alimentos, áreas de processamento de ração, mesas, estantes, pisos, tetos, paredes, pias, tábuas de corte, aviões, automóveis, trens e barcos.

Kits

[000154] A invenção também fornece kits de partes ou “kits”. Em uma modalidade, um kit fornece um sistema de coliberação de enzima/substrato como descrito aqui, com instruções para uso em uma aplicação, incluindo qualquer um dos métodos descritos aqui (por exemplo, um método de limpeza ou um método de processamento têxtil), no qual a atividade enzimática mediante a diluição em água é útil. A embalagem adequada é fornecida. Como usada aqui, “embalagem” refere-se a um material sólido ou material geralmente usado em um sistema e capaz de manter dentro de componentes de limites fixos de um kit como descrito aqui, por exemplo, um sistema de coliberação de enzima/substrato.

[000155] Instruções podem ser fornecidas na forma impressa ou na forma de um meio eletrônico tal como um disco flexível, CD ou DVD, ou na forma de endereços de sítios da rede onde tais instruções podem ser obtidas.

[000156] Os seguintes exemplos são destinados a ilustrar, mas não limitar, a invenção.

Exemplos Exemplo 1

[000157] Matrizes de polivinil álcool (PVA) contendo enzima foram preparadas usando um método de evaporação de solvente. Uma parte do concentrado de enzima líquido (aproximadamente 35 mg/ml de enzima) foi adicionada a nove partes de uma solução de 10% de polímero e misturada a fundo. Essa solução foi aspergida em uma lâmina de vidro e deixada secar em temperatura ambiente. Os filmes de polímero secos continham aproximadamente 3,5% em massa de enzima, e tinham espessura de aproximadamente 50 a 100 μm. Esses filmes foram cortados em discos circulares de 4 mm de diâmetro para teste subsequente.

[000158] Os polímeros PVA usados neste experimento foram dois graus comerciais DuPonto diferentes: Elvanol 51-05 (88% de hidrólise, grau nominal 500 de polimerização) e Elvanol 71-30 (98% de hidrólise, grau nominal 1500 de polimerização).

Lixiviação de Enzimas

[000159] Para avaliar a lixiviação de enzimas, os discos foram incubados em diacetato de propileno glicol (PGDA) por aproximadamente 46 horas em frascos de vidro a 37° C. Após a incubação, os discos foram removidos dos frascos de vidro e o PGDA em excesso foi removido por blotting com lenços de tecido. Os discos foram localizados em 4 ml de H2O para solubilizar o PVA. A atividade enzimática em cada disco pré-incubado foi medida e comparada com a atividade em discos recentemente cortados que não foram incubados em PGDA, usando o ensaio de taxa pNB.

[000160] O ensaio de taxa pNB foi executado como segue:

[000161] Esquema Reacional:

Tampão de ensaio (100 mM de Tris pH 8,0 + 0,1% de Triton X-100)

[000162] Para preparar 1000 ml, diluir 100 ml de 1M de Tris (pH 8,0) e 1,0 ml de Triton X-100 em água Milli-Q. Estoque de substrato (100 mM de p-Nitrofenil Butirato em DMSO)

[000163] Para preparar 10 ml, adicionar 174,3 μl de pNB a 10 ml de DMSO. Dividir em alíquotas de 1 ml e armazenar a 20° C. Uma solução de trabalho pode ser mantida em temperatura ambiente e descartada quando a cor amarela de fundo se torna inaceitavelmente alta. Protocolo de Único Cadinho 1. Configurar um espectrofotômetro com um programa de ensaio AAPF padrão, temperatura a 25° C. 2. Diluir 10 μl de estoque de substrato em 1 ml de tampão de ensaio em um cadinho de 1 ml descartável. Equilibrar a 25° C. 3. Iniciar a reação com 10 μl de solução de enzima. 4. Iniciar espectrofotômetro. 5. Determinar taxa (ΔA4io/min).

[000164] Os resultados são mostrados na Tabela 1. Alvejamento Têxtil

[000165] Três retalhos de tecido de 100% algodão de 7,62 cm x 10,16 cm (3 x 4 pol) cada (Testfabrics, style #428U, cetineta de algodão desengomado) e três retalhos de interloque de algodão de 7,62 cm x 10,16 cm (3 x 4 pol) cada foram lavados em um Launder-O-Meter com e sem discos de PVA-per-hidrolase, sob as seguintes condições: Razão de líquido: 50:1 pH 7 (tampão de 100 M de fosfato de sódio) Temperatura: 60° C PGDA: 4 ml/l H2O2 (50%): 4 ml/l Tempo de incubação: 60 min Enzima per-hidrolase: sete discos de PVA-hidrolase de 0,39 cm (5/32 pol.).

[000166] O desempenho de alvejamento com relação aos retalhos de cetineta de 100% algodão foi quantificado medindo-se valores CIE L* usando um colorímetro Chomameter CR-200 Minolta. Os valores CIE L* mais altos indicam efeitos alvejantes maiores. Os resultados são mostrados na tabela 1. O interloque de algodão foi incluído como lastro e o alvejamento de interloque não foi avaliado.

[000167] Um controle “sem enzima” incluiu todos os componentes acima, exceto os discos de PVA-per-hidrolase. Tabela 1

Exemplo 2

[000168] Discos circulares de diâmetro de 0,39 cm (5/32 pol.) foram cortados a partir de filme de PVA (Elvanol 51-05) que tinha aproximadamente 50 a 100 μm de espessura e continham enzimas per-hidrolase e α-amilase encapsulada (“discos de PVA-per-hidrolase/α-amilase”). As enzimas foram encapsuladas na matriz polimérica como descrito acima, mas com 9 partes de solução de polímero a 10% para 1 parte de concentrado de per-hidrolase e concentrado de amilase cada. O filme de polímero resultante foi aproximadamente 2,5% em massa de cada enzima.

Lixiviação de Enzima

[000169] Para avaliar a lixiviação da enzima a partir dos discos, três discos foram incubados em frascos de vidro vedados com ou sem PGDA a 37° C por 60 horas. Após a remoção dos frascos, cada disco foi dissolvido em 4 ml de água Milli-Q. A atividade de alfa-amilase foi medida usando o kit de ensaio de taxa Ceralpha disponível a partir de Megazyme International Ireland Limited. A atividade de alfa-amilase foi avaliada por hidrólise de p-nitrofenil maltoheptaosida bloqueada na presença de níveis em excesso de uma α-glucosidase termoestável, resultando em hidrólise quantitativa do fragmento p-nitrofenil maltossacarídeo em glicose e p-nitrofenol livre. A atividade da per- hidrolase foi medida usando o ensaio de taxa pNB como descrito no exemplo 1. Os resultados são mostrados na tabela 2. A atividade de per-hidrolase (*) é a média de seis medições (duas por disco) e a atividade de amilase é a média de três medições (um por disco). A atividade é representada como ΔA4w/min para ambas as enzimas. Tabela 2

Alvejamento e Desengomamento Têxtil

[000170] Três retalhos de tecido cetineta de algodão cru de 7,62 cm x 10,16 cm (3 x 4 pol.) (Testfabrics, estilo #428R) e três retalhos de interloque de algodão cru de 7,62 cm x 10,16 cm (3 x 4 pol.) foram lavados em um Launder-Ometer com e sem discos de PVA per- hidrolase/amilase, sob as seguintes condições: Razão de líquido: 50:1 pH 7 (tampão de 100 M de fosfato de sódio) Temperatura: 60° C PGDA: 4 ml/l H2O2 (50%): 4 ml/l Tempo de incubação: 60 min Enzimas: quinze discos de PVA-hidrolase/amilase de 0,39 cm (5/32 pol.).

[000171] Para avaliar o desengomamento, discos de tecido de 1,58 cm (5/8 pol.) foram cortados a partir de cada retalho cru tratado, e então os discos foram manchados com solução de iodo por 1 min em temperatura ambiente. Os discos de tecido foram então enxaguados com água fria, secados com lenços, e a cor dos discos foi então medida usando um colorímetro Chromameter CR-200 Minolta. Os valores CIE L* foram calculados para quantificar a profundidade da mancha de iodo. O desempenho do alvejamento foi avaliado para os retalhos descritos no exemplo 1. Uma cor mais clara em um disco de tecido indica que há menos amido presente, indicando maior eficácia de desengomamento. Os resultados são mostrados na tabela 3. Tabela 3

Exemplo 3

[000172] A enzima lacase de Cerrena unicolor, como descrito no Pedido PCT No. WO 2008/076322, foi encapsulada em polivinil álcool Elvanol 52-22 (88% de hidrólise, grau nominal 1300 de polimerização), que dissolve em água em temperatura ambiente. O filme polimérico continha 1,5% em massa de lacase, 8,5% em massa de sólidos concentrados por ultrafiltração sem enzima a partir de fermentação, e 90% em massa de polímero. Os discos circulares de 0,39 cm (5/32 pol.) de diâmetro foram cortados a partir do filme de PVA contendo enzima lacase encapsulada (“discos de PVA lacase”). A enzima foi encapsulada no polímero como descrito no exemplo 1.

Lixiviação de Enzima

[000173] A lixiviação de enzima a partir de discos de PVA lacase foi avaliada usando três mediadores de lacase diferentes como substratos para a enzima. 1. ABTS

[000174] Dois discos de PVA lacase foram inseridos em um frasco de vidro com uma solução de 1 ml de PGDA contendo 1% em peso de ABTS (2,2’-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfônico) sal diamônio) e incubados por 10 dias em temperatura ambiente (frasco “2” na figura 2). A mesma preparação sem discos de PVA lacase foi preparada como um controle negativo (frasco “1” na figura 2). Em adição, dois discos de PVA lacase foram dissolvidos em 100 μl de água deionizada e então adicionados a um frasco contendo 1 ml de PGDA com 1% de ABTS como um controle positivo (frasco “3” na figura 2). As mudanças de cor dessas soluções foram monitoradas como uma indicação de lixiviação de enzima.

[000175] Após 10 dias de incubação em temperatura ambiente, nenhuma mudança de cor foi observada nos frascos 1 e 2. Entretanto, a cor da solução no frasco 3 mudou para verde escuro tão logo a lacase dissolvida seja adicionada ao frasco, indicando a reação de lacase e mediador. 2. SA

[000176] Dois discos de PVA lacase foram inseridos em um frasco de vidro com uma solução de 1 ml de PGDA contendo 1% em peso de siringamida (3,5-dimetóxi-4-hidroxibenzamida; “SA") e incubados por 10 dias em temperatura ambiente (“4” na figura 3). A mesma preparação sem discos de PVA lacase foi preparada como um controle negativo (“5” na figura 3). Em adição, dois discos de PVA lacase foram dissolvidos em 100 μl de água deionizada e então adicionados a um frasco contendo 1 ml de PGDA com 1% de SA como um controle positivo (“6” na figura 3).

[000177] A cor da solução contendo lacase dissolvida (“6”) mudou de amarelo claro para marrom, indicando que a lacase reagiu com o mediador. Entretanto, a mesma preparação com discos de enzima encapsulada (“4”) não mudou de cor ao longo dos 10 dias de incubação e esses resultados sugerem que a lacase encapsulada não reagiu com o SA na solução de PGDA.

[000178] Após 10 dias de incubação em temperatura ambiente, as soluções incubadas foram centrifugadas e a absorbância foi medida a 420 nm em um espectrofotômetro. Os resultados são mostrados na tabela 4. Tabela 4

[000179] Dois discos de PVA lacase foram inseridos em um frasco de vidro com uma solução de 1 ml de PGDA contendo 5% em peso de siringonitrila (3,5-dimetóxi-4-hidroxibenzonitrilo; “SN”) e incubados por 10 dias em temperatura ambiente (“8” na figura 4). A mesma preparação sem discos de PVA lacase foi preparada como um controle negativo (“7” na figura 4). Em adição, dois discos de PVA lacase foram dissolvidos em 100 μl de água deionizada e então adicionados a um frasco contendo 1 ml de PGDA com 1% de SN como um controle positivo (“9” na figura 4).

[000180] Dentro de 1 hora, a cor do frasco 9 mudou para uma cor marrom esverdeado, indicando que a lacase reagiu com o SN. A cor dos frascos 7 e 8 permaneceu inalterada ao longo do período de incubação de 10 dias.

Teste de Aplicação Preparação de Brim

[000181] Brim de cor índigo/fundo de enxofre desengomado e brim de cor 100% índigo desengomado foram tratados em uma lavadora de tambor Unimac (escala de laboratório 50 lb) com 1 g/l de celulase INDIAGE® 44L a 55° C e pH 4,8 por 60 minutos em uma razão de líquido de 10:1 seguido por dois enxágues e então secos.

[000182] Para os experimentos com placas de microtitulação com 12 cavidades descritos abaixo, retalhos de tecido redondos de 1,58 cm (5/8 pol.) de diâmetro foram cortados a partir do tecido brim pré-tratado com celulase. Para os experimentos em Launder-Ometer descritos abaixo, retalhos de tecido de 7,62 cm x 10,16 cm (3 x 4 pol.) foram cortados a partir do tecido brim pré-tratado com celulase e então as bordas foram costuradas para impedir que desfie durante o tratamento.

Avaliação do Desempenho do Alvejamento

[000183] Para quantificar os efeitos alvejantes, as leituras em refletômetro de cada retalho de tecido de brim foram obtidas antes e após o tratamento usando um colorímetro Chromameter CR-200 Minolta. A diferença de cor total (ΔE) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:

(onde ΔL, Δa, Δb são diferenças nos valores CIE L*, CIE a* e CIE b* respectivamente, antes e após o alvejamento com lacase). Experimentos com Placa de Microtitulação com 12 cavidades

[000184] Retalhos de brim pré-tratado de 1,58 cm (5/8 pol.) de diâmetro foram incubados em uma placa de microtitulação com 12 cavidades sob as seguintes condições: 1. Tampão somente 2. Tampão + 50 μl de solução de PGDA contendo 5% de SN + lacase encapsulada - ensaio com placa de microtitulação com 12 cavidades (2 ml de volume reacional) - pH: 6 (50 mM de tampão de acetato de sódio em água) - Temperatura: 60° C - tempo de incubação: 60 minutos - Enzima: 5 discos de 0,39 cm (5/32 pol.) de filme com lacase encapsulada por teste

[000185] Os resultados são mostrados na figura 5. Um efeito de alvejamento dramático foi observado quando os retalhos de brim foram incubados com discos de PVA lacase. Os resultados indicaram claramente que a liberação disparada por água da lacase a partir do filme polimérico no qual ela foi encapsulada, fornecendo acesso ao mediador e resultando na reação da enzima com o mediador causou alvejamento.

Experimentos em Launder-Ometer

[000186] Retalhos de brim pré-tratados com celulase de 7,62 cm x 10,16 cm (3 x 4 pol.) foram incubados em um Launder-Ometer sob as seguintes condições: (A) 1 ml de solução de PGDA contendo 5% de SN (B) 1 ml de solução de PGDA contendo 5% de SN e 0,15 g de lacase encapsulada (C) 1 ml de solução de PGDA contendo 5% de ABTS (D) 1 ml de solução de PGDA contendo 5% de ABTS e 0,15 g de lacase encapsulada - Launder-Ometer (250 ml de volume reacional total) - pH: 6 (50 mM de tampão de acetato de sódio em água) - Temperatura: 60° C - Tempo de incubação: 60 minutos - Enzima: 0,15 g de filme com lacase encapsulada cortado em pequenos pedaços aleatórios - Mediador: - Siringonitrilo (SN) - 2,2’-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfônico) sal diamônio (ABTS)

[000187] Os resultados são mostrados na tabela 5 e na figura 6. Os retalhos de brim tratados com a preparação (B) (sistema de coliberação de lacase + SN) foram significativamente alvejados. A cor dos retalhos de brim tratados com a preparação (D) (sistema de coliberação de lacase + ABTS) pigmentada em uma cor roxa clara. Tabela 5

Exemplo 4 Sistema de Alvejamento com Enzima Estabilizado

[000188] Este exemplo demonstra como o encapsulamento da enzima dentro de uma matriz polimérica pode ser usado para estabilizar um sistema de desinfecção e alvejamento enzimático de única garrafa. O sistema de única garrafa é projetado para produzir ácido peracético mediante diluição com água. Seus componentes são: perborato de sódio, diacetato de propileno glicol (PGDA) e aril esterato (ArE) e um fluido veículo não aquoso. Nesta modalidade, o fluido veículo foi um tensoativo não iônico álcool etoxidado (Novel 1012-6 de Sasol Co.; Hamburg, DE).

[000189] O componente de enzima ArE foi adicionado ao sistema de duas formas: (1) diretamente a partir de um concentrado de enzima líquido, e (2) encapsulado em polímero como um pó seco por aspersão. O polímero foi hidroxipropril metil celulose (HPMC, Methocel E5 Premium LV de Dow Chemical Co., Midland, MI, USA). A secagem por aspersão foi conduzida tal que o pó seco foi 75% em massa de HPMC.

[000190] Para tanto o concentrado de enzima quanto a enzima encapsulada, 12,5 μg de ArE ativo foram adicionados a cada um dos seis tubos de teste contendo 1 g de fluido veículo, 135 mg de perborato de sódio, e 2 mg de PGDA. Para cada conjunto de seis tubos, três dos tubos foram disparados (por diluição com 9 ml de Tris, pH 9,0, tampão) e ensaiados com ácido peracético como descrito abaixo. Os outros três tubos foram incubados a 37° C por cinco dias, então disparados e ensaiados com ácido peracético. Ensaio com Ácido Peracético Materiais e Métodos: - Ácido peracético: Sigma-Fluka P/N 77240; L/N 11244491, 38.8% (5,115 M, F.W. = 76,05 g/mol), ácido peracético como por C de A. - 2,2’-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfônico) sal diamônio (ABTS): Fluka P/N WA10917, L/N 1135552 54804068, 99+% puro (HPLC), F.W. = 548,64 g/mol - Ácido cítrico: Sigma P/N C1857, L/N 0054K0001, F.W. = 192,13 - Iodeto de potássio (KI): P/N Sigma P4286, L/N 124K0151, F.W. = 166,0.

[000191] Soluções Estoque: - 125 mM de ácido cítrico, pH para 5,0 com NaOH, filtro estéril de 0,22 μm, estável indefinidamente em temperatura ambiente até crescimento aparente (usualmente fungos nesse pH) - 100 mM de ABTS em H2O Milli Q (MQ). Aliquotar em alíquotas de 500 μl e armazenar a -20° C por até seis meses. - 25 mM de KI em H2O MQ. Estável indefinidamente em temperatura ambiente.

[000192] Substrato de Trabalho: 1. Adicionar 50 ml de 125 mM de tampão de ácido cítrico estoque a um recipiente à prova de luz (uma garrafa de vidro envolvida em folha de alumínio é aceitável) 2. Descongelar uma alíquota de 500 μl de ABTS estoque e adicionar à solução de ácido cítrico. 3. Adicionar 100 μl de 25 mM de KI ao ácido cítrico. 4. Agitar delicadamente para misturar e tampar. A solução está boa por até 54 horas quando armazenada no escuro em temperatura ambiente.

[000193] Preparação de Curva Padrão: 1. Obter ácido peracético estoque (usualmente ~39%; ~ 390 g/l; 390 (g/l)/76,05 (g/mol) ~5,13 M. NOTA: Esta concentração real será determinada pelo número de ensaio real relatado no CofA. 2. Efetuar uma diluição de 1:100 de PAA estoque em 125 mM de ácido cítrico. Tampar e agitar em vórtice por 15 segundos. 3. Obter a diluição de 1:100 da etapa 2 e diluí-la 1:100 (isso obteria uma diluição 1:10000 do PAA estoque) em 125 mM de ácido cítrico. Tampar e agitar em vórtice por 15 segundos. Essa concentração de PAA é agora ~5000 mM / 10000 = ~ 0,5 mM = ~ 500 uM. 4. Obter a solução da etapa três e diluir 4 partes padrão (os ~ 500 uM padrão de #3) para 1 parte de ácido cítrico para obter um padrão em torno de 400 uM 5. Obter a solução da etapa três e diluir 3 partes padrão (os ~ 500 uM padrão de #3) para 2 partes de ácido cítrico para obter um padrão em torno de 300 uM 6. Obter a solução da etapa três e diluir 2 partes padrão (os ~ 500 uM padrão de #3) para 3 partes de ácido cítrico para obter um padrão em torno de 200 uM 7. Obter a solução da etapa três e diluir 1 parte padrão (os ~ 500 uM padrão de #3) para 4 partes de ácido cítrico para obter um padrão em torno de 100 uM.

[000194] Ensaio: 1. Em uma placa de microtitulação, colocar 20 μl de todos os padrões, em ordem de diluição descendente em triplicata ou em forma de linha ou em formato de coluna (um padrão por cavidade). 2. No fim da curva padrão, colocar 20 μl de ácido cítrico em cavidades triplicadas (esses são os brancos). 3. Em linhas ou colunas separadas, colocar 20 μl de amostras diluídas em cavidades em triplicata. 4. Derramar uma quantidade adequada de substrato de trabalho em uma bacia de substrato (ou tampa ou base de disco de Petri limpo, ou uma tampa de caixa de ponta de pipeta limpa). 5. Com uma pipeta multicanal, adicionar 200 μl de substrato a cada cavidade da placa de microtitulação que tem padrão, branco e amostra. 6. Com um temporizador, deixar a reação prosseguir por 3 minutos (+/- 0,5 min). 7. Ler cavidades em um leitor de microplacas @ 420 nm. 8. Transferir os dados para Excel ou usar o programa leitor de placa para gerar curva padrão, calcular a inclinação e calcular o ponto de interseção com o eixo y por regressão linear usando os dados padrões (calcular média, desvio padrão, etc.). 9. Calcular concentrações de amostra usando a inclinação e interseção usando y = m*x+b e multiplicar pelo fator de diluição de amostra. Resultados

[000195] Os resultados de ácido peracético para cada conjunto de três tubos foram ponderados e arrumados em uma tabela. Os resultados são mostrados na tabela 6. A amostra encapsulada demonstrou estabilidade significativamente aumentada após 5 dias a 37° C. Tabela 6

[000196] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplos para propósitos de esclarecer o entendimento, estará claro para os versados na técnica que certas mudanças e modificações podem ser praticadas sem abandonar o espírito e escopo da invenção. Então, a descrição não deveria ser construída como limitante do escopo da invenção.

[000197] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patentes citados aqui são aqui incorporados a título de referência em suas totalidades para todos os propósitos e no mesmo grau se cada publicação, patente, ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo assim incorporado a título de referência.

Claims

1. Sistema de liberação de líquidos para enzima e substrato co-formulados, caracterizado pelo fato de que é uma composição que compreende uma enzima e um substrato para a enzima, em que a enzima é encapsulada em uma matriz polimérica solúvel em água e o substrato está presente em uma fase líquida substancialmente não aquosa em contato com a matriz polimérica na qual a enzima é encapsulada, em que o polímero não é solúvel na fase líquida, em que a fase líquida substancialmente não aquosa compreende menos de 5% de água; em que (a) a enzima é uma peridrolase e o substrato é um substrato éster; ou (b) a enzima é uma peridrolase e o substrato propilenoglicol diacetato; (c) a enzima é uma enzima lacase e o substrato é um mediador da lacase; ou (d) a enzima é uma enzima oxidante de fenol e o substrato é selecionado do grupo que consiste em 2,2'-azino-bis (3- etilbenzotiazolina-6-sulfonato), siringamida e siringonitrila; ou (e) a enzima é uma peridrolase e o substrato é um substrato éster, e o sistema de liberação compreende ainda perborato de sódio.

2. Sistema de liberação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fase líquida substancialmente não aquosa compreende menos de 1% de água.

3. Sistema de liberação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fase líquida substancialmente não aquosa compreende menos que 0,5% de água.

4. Sistema de liberação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a enzima retém o potencial catalítico na matriz polimérica, mas não reage substancialmente com o substrato na composição por pelo menos 10 dias a 25 °C.

5. Sistema de liberação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que após a adição de água à composição, a matriz polimérica é solubilizada, liberando a enzima, permitindo que ocorra reação catalítica com o substrato.

6. Sistema de liberação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) duas ou mais enzimas encapsuladas na mesma matriz polimérica; ou (b) duas ou mais enzimas encapsuladas em matrizes poliméricas separadas.

7. Sistema de liberação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um tensoativo.

8. Sistema de liberação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que: (a) a matriz polimérica é selecionada do grupo que consiste em álcool polivinílico, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirrolidona, goma de guar e derivados ou copolímeros dos mesmos; e/ou (b) a enzima encapsulada em uma matriz polimérica na forma de partículas suspensas em um líquido substancialmente não aquoso contendo o substrato, opcionalmente, em que as partículas são mantidas em suspensão por um auxiliar de suspensão; e/ou (c) o substrato é solubilizado ou disperso em uma fase líquida substancialmente não aquosa, que pode opcionalmente incluir um líquido não aquoso (fluido transportador).

9. Sistema de liberação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que: (a) o fluido transportador é selecionado a partir do grupo que consiste em glicóis, tensoativos não iônicos, álcoois, poliglicóis, ésteres de acetato e uma mistura dos mesmos; ou (b) o fluido transportador é um substrato para a enzima.

10. Sistema de liberação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um composto gerador de peróxido de hidrogênio selecionado a partir de percarbonato de sódio, perborato de sódio e peróxido de hidrogênio da ureia, em que um perácido é produzido após a adição de água à composição.

11. Sistema de liberação, de acordo com a reivindicação 1(e), caracterizado pelo fato de que o sistema de liberação possui estabilidade de armazenamento aumentada em comparação com um sistema de liberação comparável sem o polímero.

12. Kit, caracterizado pelo fato de que contém o sistema de liberação para enzima e substrato co-formulados como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e instruções de uso.

13. Método para alvejar um têxtil, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) adicionar o sistema de liberação da reivindicação 1(e) ou 11 à água na presença de uma fonte de peróxido de hidrogênio e misturar, gerando assim uma solução aquosa de perácido; e (b) entrar em contato com um têxtil com a solução por um período de tempo e sob condições adequadas para permitir um branqueamento mensurável do têxtil, produzindo assim um têxtil branqueado.

14. Método para descontaminação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) adicionar o sistema de liberação da reivindicação 1(e) ou 11 à água na presença de uma fonte de peróxido de hidrogênio e misturar, gerando assim uma solução aquosa de perácido; e (b) contatar com um item que compreende um contaminante com a solução, reduzindo assim a concentração do contaminante.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a fonte de peróxido de hidrogênio é perborato de sódio.