ES2361838T3

ES2361838T3 - Perhidrolasa.

Info

Publication number: ES2361838T3
Application number: ES04812869T
Authority: ES
Inventors: Neelam S. Amin; Matthew G. Boston; Richard R. Bott; Marguerite A. Cervin; Edward M. Concar; Marc E. Gustwiller; Brian Edward Jones; Klaus Liebeton; Gregory S. Miracle; Hiroshi Oh; Ayrookaran J. Poulose; Sandra W. Ramer; Jeffrey J. Scheibel; Walter Weyler; Gregory M. Whited
Original assignee: Procter and Gamble Co; Danisco US Inc
Current assignee: Procter and Gamble Co; Danisco US Inc
Priority date: 2003-12-03
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2024-12-03
Also published as: HK1105428A1; DK2295554T3; CN103333870A; EP2295554A3; EP2292743B1; ATE500322T1; WO2005056782A3; EP2664670A1; CN1981035A; US20140302003A1; EP2295554B1; US9282746B2; MXPA06005652A; PT1689859E; DK2664670T3; EP1689859A2; CN1981035B; EP1689859B1; EP2292743A3; US8772007B2

Abstract

Una perhidrolasa aislada que es al menos un 70% idéntica a la perhidrolasa de M. smegmatis que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención proporciona procedimientos y composiciones que comprenden al menos una enzima perhidrolasa para limpieza y otras aplicaciones. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la generación de perácidos. La presente invención encuentra un uso particular en aplicaciones que implican limpieza, blanqueamiento y desinfección.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Los detergentes y otras composiciones limpiadoras incluyen típicamente una combinación compleja de ingredientes activos. Por ejemplo, la mayoría de productos de limpieza incluyen un sistema tensioactivo, enzimas para limpiar, agentes blanqueantes, agentes de refuerzo, supresores de jabonaduras, agentes de suspensión de la suciedad, agentes de liberación de la suciedad, abrillantadores ópticos, agentes suavizantes, dispersantes, compuestos inhibidores de la transferencia de tinte, abrasivos, bactericidas y perfumes. A pesar de la complejidad de los actuales detergentes, hay muchas manchas que son difíciles de eliminar completamente. Además, a menudo se produce la formación de residuos, que da como resultado decoloración (por ejemplo, amarilleamiento) y una estética reducida debido a una limpieza incompleta. Estos problemas se combinan con el uso aumentado de bajas temperaturas de lavado (por ejemplo, agua fría) y ciclos más cortos de lavado. Además, muchas manchas están compuestas por mezclas complejas de material fibroso, que incorporan principalmente carbohidratos y derivados de carbohidratos, fibra y componentes de la pared celular (por ejemplo, material vegetal, madera, suciedad basada en lodo/arcilla y fruta). Estas manchas presentan retos difíciles a la formulación y uso de composiciones limpiadoras.

[0003] Además, las prendas coloreadas tienden a desgastarse y a mostrar empeoramientos del aspecto. Una parte de esta pérdida de color es debida a la abrasión en el proceso de lavandería, particularmente en las lavadoras y secadoras automáticas. Además, la pérdida de resistencia a la tracción de la tela parece ser un resultado inevitable de la acción mecánica y química debido al uso, desgaste y/o lavado y secado. Por tanto, es necesario un medio para lavar eficiente y eficazmente prendas coloreadas de modo que se minimicen estos empeoramientos del aspecto.

[0004] Son bien conocidas en la técnica las composiciones limpiadoras que comprenden esterasas, lipasas y cutinasas. Sin embargo, estas enzimas tienen una relación de perhidrólisis a hidrólisis muy baja. Esto da como resultado la conversión de la mayoría del sustrato éster en ácido, en lugar del más deseable perácido. Esto es un grave inconveniente, puesto que las consideraciones de espacio y coste de la fórmula hacen factible incluir solo una cantidad limitada de sustrato.

[0005] El documento US-A-5.352.594 describe procedimientos de preparación y selección de enzimas esterasas que tienen una relación de perhidrólisis a hidrólisis mejorada.

[0006] El documento EP-A-0375102 describe un sistema de perhidrólisis enzimática y una enzima que es hidrolítica y perhidrolíticamente activa.

[0007] El documento WO 2004/058961 describe variantes de subtilisina que tienen actividad perhidrolasa mejorada.

[0008] En suma, a pesar de las mejoras de las capacidades de las composiciones limpiadoras, sigue habiendo la necesidad en la técnica de detergentes que eliminen manchas, mantengan el color y aspecto de la tela y eviten la transferencia de tinte. Además, sigue habiendo la necesidad de composiciones detergentes y/o de cuidado de la tela que proporcionen y/o restauren la resistencia a la tracción, así como que proporcionen propiedades antiarrugas, antiapelotonamiento y/o antiencogimiento a la tela, así como que proporcionen un control de la estática, suavidad a la tela, que mantengan el aspecto de color deseado y propiedades y beneficios antidesgaste de la tela. En particular, sigue habiendo la necesidad de la inclusión de composiciones que sean capaces de eliminar los componentes coloreados de las manchas, que a menudo permanecen unidos a la tela que se está lavando automáticamente. Además, sigue habiendo la necesidad de procedimientos y composiciones mejorados adecuados para el blanqueamiento textil. [0009] Además de en el campo de la limpieza de telas y prendas, el blanqueamiento se usa comúnmente en la industria de la pulpa y el papel. Antes de la producción de papel, se trata típicamente la pulpa para eliminar los contaminantes coloreados indeseables. Esto proporciona una pulpa que es adecuada para la producción de papel de mayor calidad que la pulpa que no se trata para eliminar los contaminantes coloreados y otros componentes indeseables presentes en la pulpa. Por ejemplo, en la industria del reciclaje del papel, es necesaria la eliminación de tinta. Aunque los procedimientos estándares son adecuados para destintar papel con tintas basadas en aceite o agua, el uso aumentado de tintas electrostáticas ha vuelto problemático el destintado, ya que estas tintas son mucho más difíciles de eliminar. Hay disponibles diversos procedimientos para destintar papel, incluyendo el uso de enzimas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.370.770). Sin embargo, sigue habiendo la necesidad en la técnica de procedimientos eficientes y económicos para el tratamiento de pulpa para la producción de producto de papel (reciclado y nuevo).

[0010] El blanqueamiento se usa comúnmente también en el mercado del cuidado personal (por ejemplo, blanqueantes dentales, decolorantes del cabello, etc.). Aunque los productos decolorantes del cuidado personal han mejorado con los años, sigue habiendo la necesidad de procedimientos de decoloración suaves, fáciles de usar y económicos para este escenario.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0011] La presente invención proporciona procedimientos y composiciones que comprenden al menos una enzima perhidrolasa como se define en la reivindicación 1 para limpieza y otras aplicaciones. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la generación de perácidos. La presente invención encuentra un uso particular en aplicaciones que implican limpieza, blanqueamiento y desinfección.

[0012] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones que comprenden al menos una perhidrolasa como se define en la reivindicación 1, en las que la que perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1.

[0013] La presente invención proporciona también perhidrolasas aisladas como se definen en la reivindicación 1, en las que las perhidrolasas exhiben una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones preferidas, la perhidrolasa es perhidrolasa de M. smegmatis. La perhidrolasa es al menos un 70% idéntica a la perhidrolasa de M. smegmatis. En realizaciones adicionales, la perhidrolasa es al menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a la perhidrolasa de M. smegmatis. En realizaciones preferidas adicionales, la perhidrolasa comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones preferidas, las perhidrolasas tienen reactividad inmunitaria cruzada con la perhidrolasa de M. smegmatis. En otras realizaciones adicionales, la perhidrolasa es al menos una porción de la perhidrolasa de M. smegmatis, en la que la perhidrolasa tiene una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En realizaciones alternativas, la perhidrolasa es un homólogo estructural de la perhidrolasa de M. smegmatis, en que el sitio activo es homólogo de al menos un aminoácido seleccionado del grupo constituido por S11, D192 y H195 de la perhidrolasa de M. smegmatis.

[0014] La presente invención proporciona también variantes de perhidrolasa aisladas como se definen en la reivindicación que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden al menos una modificación de un aminoácido realizada en una posición equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, se realiza al menos una modificación en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que el aminoácido modificado se selecciona del grupo constituido por Cys7, Asp10, Ser11, Leu12, Thr13, Trp14, Trp16, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Val125, Pyro138, Leu140, Pro146, Pro148, Trp149, Phe150, Ile153, Phe154, Thr159, Thr186, Ile 192, Ile194 y Phe196. En realizaciones adicionales, la modificación comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por M1, K3, R4, I5, L6, C7, D10, S11, L12, T13, W14, W16, G15, V17, P18, V19, D21, G22, A23, P24, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, V32, R33, W34, T35, G36, L38, Q40, Q41, D45, L42, G43, A44, F46, E47, V48, I49, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, I60, D61, D62, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, G70, A71, S72, Y73, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, D85, L86, V87, N94, D95, T96, K97, Y99F100, R101, R102, P104, L105, D106, I107, A108, L109, G110, M111, S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P146, P148, W149, F150, I153, F154, I194 y F196.

[0015] En algunas realizaciones preferidas, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la hidrólisis de perácido en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones, el cambio en la hidrólisis de perácido es una reducción, mientras que en otras realizaciones el cambio en la hidrólisis de perácido es un aumento.

[0016] En algunas realizaciones preferidas alternativas, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,1 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En realizaciones preferidas alternativas, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de

M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por R4, L12, G15, P18, R27, W34L38, A44, E51, G52, L53, S54, T58, R67, L68, S72, A79, T80, D85, L86, V87, N94, K97, R101, V118, L119, G124, G126 e I194.

[0017] En realizaciones alternativas adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,2 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En otras realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por R4, 15, D10, L12, W14, G15, P18, V19, T25, R27, W34, L38, A44, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T58, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S72, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94, T96, K97, R101, L82, P83, L86, V87, N94, T96, K97, F100, R101, L109, M111, L114, V118, L119, A122, G124, G126, T127, Y129, W149 e I194.

[0018] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,3 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por R4, I5, D10, L12, W14, G15, L12, P18, V19, G22, A23, T25, E26, R27, W34, G36, L38, Q41, L42, G43, A44, I49, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, N59, T58, D62, T64, D65, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94, T96, K97, Y99, F100, R101, R102, P104, L109, G110, M111, L114, V118, L119, A122, G124, V125, G126, T127, Y129, W149, F154 e I194.

[0019] En otras realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,4 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones preferidas, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por R4, 15, L6, D10, S11, L12, W14, G15, W16, P18, V19, G22, A23, T25, E26, R27, F28, W34, T35, G36, L38, Q41, L42, G43, A44, D45, E47, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, T58, 160, D62, T64, D65, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94, P66, T96, K97, Y99, F100, R101, R102, P104, I107, L109, G110, M111, S112, L114, V118, L119, S121, A122, G124, V125, G126, T127, Y129, W149, F150, F154, I194 y F196.

[0020] En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,5 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones preferidas, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, I49, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119; L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, 5121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.

[0021] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,6 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones preferidas, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, I49, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70,149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, I107, I194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, M111, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, S11, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, V125, V19, W16, Y129, Y73, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.

[0022] En otras realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,7 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones preferidas, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, RI01, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, I49, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, I49, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, I107, I194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, M111, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, S11, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, I49, I5, I60, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, M111, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y73, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.

[0023] En más realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,8 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones preferidas, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, I49, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, I49, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, I107, I194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, M111, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, S11, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, I49, I5, I60, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, M111, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y99, A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C77, D45, D61, D65, D85, D95, E47, E51, F150, F196, F46, G110, G126, G36, G43, G52, I107, I194, I49, I5, I60, 189, L114, L42, L53, L68, L78, L84, M111, N59, N94, P146, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, R101, R4, S112, S121, S72, T116, T120, T127, T13, T57, T96, V113, V125, V17, V19, V32, V87, W149, Y129, Y73, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.

[0024] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 1,5 o más, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones preferidas, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, I49, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, I49, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, I107, I194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, M111, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, S11, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, I49, I5, I60, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, M111, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y99, A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C77, D45, D61, D65, D85, D95, E47, E51, F150, F196, F46, G110, G126, G36, G43, G52, I107, I194, I49, I5, 160, I89, L114, L42, L53, L68, L78, L84, M111, N59, N94, P146, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, R101, R4, S112, S121, S72, T116, T120, T127, T13, T57, T96, V113, V125, V17, V19, V32, V87, W149, Y129 y Y73, Y99, A108, A44, C7, D10, D106, D31, D61, D85, E26, E51, F100, F28, F46, G110, G22, G36, G43, G52, G70, I107, I153, I49, I5, I89, K3, L105, L53, L6, L78, L86, M1, N69, P104, P146, P18, P24, P30, P83, Q117, Q40, Q41, R102, R27, R33, R4, S121, S72, S76, T120, T128, T13, T35, T80, T96, V115, V118, V32V48, V87, W34, G190, V191, G193, T197, E198, A199, R202, D203, G205, V206, A209, E210, Q211, S214 y L215.

[0025] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de entre aproximadamente 1,2 y aproximadamente 1,5, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones preferidas, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, C7, D106, D31, D61, D85, E26, E50, E51, F100, F150, F28, F46, G110, G126, G22, G70, I107, K3, L105, L42, L6, L78, M111, N59, N69, P104, P146, P148, P18, P30, P63, Q117, Q40, Q41, R102, R27, R33, R4, S54, S76, T116, T120, T128, T64, T80, T96, V113, V115, V118, W34 e Y73.

[0026] En otras realizaciones adicionales, la presente invención proporciona variantes de perhidrolasa en que las variantes de perhidrolasa exhiben un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de la variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de al menos aproximadamente 1,2. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por C7, D10, L12, G15, P18, V19, G22, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, G36, Q40, Q41, L42, G43, A44, D45, F46, E47, I49, E51, L53, S54, A55, T57, D61, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, A71, S72, Y73, S76, L78, A79, T80, L82, P83, D85, L86, D95, K97, R101, T103, P104, L105, D106, I107, L109, M111, V113, Q117, V118, S121, G124, V125, G126, T127, P148, F150, I153, F154 y F196.

[0027] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,8 o menos. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de

M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C7, C77, D10, D106, D21, D45, D61, D62, D65, D85, E26, E47, E50, E51, F100, F150, F154, F196, F28, F46, G110, G124, G126, G15, G22, G36, G52, G70, I107, I153, I194, I49, I5, I60, I89, K3, K97, L105, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L6, L68, L78, L82, L84, K86, M1, M111, N59N94, P146, P18, P24, P30, P66, P83, Q40, Q41, R101, R102, R27, R33, R4, R56, R67, S11, S112, S54, S72, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T25, T35, T57, T64, T80, T96, V113, V115, V118, V125, V17, V19, V32, V48, V87, W13, W149, W16, W34, Y129, Y73 y Y99.

[0028] En realizaciones alternativas, la presente invención proporciona variantes de perhidrolasa que comprenden al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C7, C77, D10, D106, D21, D31, D45, D61, D62, D65, D85, E26, E47, E50, E51, F100, F150, F154F196, F28, F46, G110, G124, G126, G15, G22, G36, G43, G52, G70, I107, I153, I194, I49, I5, I60, I89, K3, K97, L105, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L6, L68, L78, L82, L84, L86, M1, M111, N59, N69, N94, P104, P146, P148, P18, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, Q40, Q41, R101, R102, R27, R33, R4, R56, R67, S11, S112, S121, S54, S72, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T25, T35, T57, T58, T64, T80, T96, V113, V115, V118, V125, V17, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, Y129, Y73 e Y99.

[0029] En otras realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de entre aproximadamente 1,2 y aproximadamente 2. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por C7, D10, L12, G15, P18, V19, G22, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, G36, Q40, Q41, L42, G43, A44, D45, F46, E47, 49, E51, L53, S54, A55, T57, D61, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, A71, S72, Y73, S76, L78, A79, T80, L82, P83, D85, L86, D95, K97, R101, T103, P104, L605, D106, I107, L109, M111, V113, Q117, V118, S121, G124, V125, G126, T127, P148, F150, I153, F154, F196, G190, E198, A199, R202, D203, V206, A209, E210, Q211 y V212.

[0030] En más realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2,5. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A44, C7, D10, D85, D95, E26, E47, I107, L12, L42, P104, P148, S54, Q40, Q117, D203, V206, E210. En otras realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A44, C7, I107, K97, L12, L78, P104, Q40 y V125.

[0031] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 5. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por D10, D85, L53, L78 y S54.

[0032] En más realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,1 o menos. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16 y W34.

[0033] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,2 o menos. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de

M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129 y Y73.

[0034] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis a perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,3 o menos. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de

M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I147, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54; T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70,1153,1194, 160,189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34 e Y129.

[0035] En más realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,4 o menos. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, I89, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, I194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19 y V87.

[0036] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,5 o menos. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de

M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59; N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, I89, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, I194, I89, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, D10, D23, E26, E50, E51, F150, G110, G126, G15, G36, I107, I49, I5, K97, L109 ,L119, L12 L38, L6, L68, L84, L86, M111, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34 e Y129.

[0037] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,6 o menos. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de

M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, O110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, I89, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, 194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, D10, D23, E26, E50, E51, F150, G110, G126, G15, G36, I107, I49, 15, K97, L109 ,L119, L12 L38, L6, L68, L84, L86, M111, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34, Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, g126, G36, G52, I107, I5, I89, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, W149 e Y73.

[0038] En más realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,7 o menos. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W 149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, I194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, D10, D23, E26, E50, E51, F150, G110, G126, G15, G36, I107, I49, I5, K97, L109 ,LI19, L12 L38, L6, L68, L84, L86, M111, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34, Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, g126, G36, G52, I107, I5, I89, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115,V118, V32, V48, V87, W149,Y73, A122, A23, A29, A71, A79, C7, D61, D62, D85, E26, E51, F100, F28, F46, G110, G126, G52, G70, I107, I49, I5, I60, I89, L109, L114, L12, L38, L68, L82, L86, M111, N59, N94, P83, R102, R33, R4, S112, S72, S76, T103, T116, T128, T25, T35, T57, T58, T64, V19, V32, V48, V87, Y29, Y73 e Y99.

[0039] En realizaciones adicionales, la variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,8 o menos. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de

M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, TI3, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70,1153,1194,160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, I194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, D10, D23, E26, E50, E51, F150, G110, G126, G15, G36, I107, I49, I5, K97, L109 ,L119, L12 L38, L6, L68, L84, L86, M111, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33; R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34, Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, g126, G36, G52, I107, I5, I89, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115,V118, V32, V48, V87, W149,Y73, A122, A23, A29, A71, A79, C7, D61, D62, D85, E26, E51, F100, F28, F46, G110, G126, G52, G70, I107, I49, I5, 160, 189, L109, L114, L12, L38, L68, L82, L86, M111, N59, N94, P83, R102, R33, R4, S112, S72, S76, T103, T116, T128, T25, T35, T57, T58, T64, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73, Y99, A108, A122, A29, A55, C77, D10, D106, D45, D61, D62, D65, D85, E47, E50, F100, F150, F28, F46, G110, G124, G126, G15, G36, I153, I194, 15, I60, I89, K3, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L42, L68, L84, L86, M1, N59, P24, P30, P83, R101, R27, R4, R56, S112, S54, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T35, T64, VI13, V17, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73 e Y99.

[0040] La presente invención proporciona también variantes de perhidrolasa en las que las variantes de perhidrolasa exhiben mayor actividad de perhidrólisis y menor actividad de hidrólisis de perácido en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones, las variantes de perhidrolasa exhiben una relación de actividad de perhidrólisis de al menos aproximadamente 1,2 y una relación de actividad de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,8 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En realizaciones alternativas, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que se selecciona al menos una sustitución del grupo constituido por A29, A44, A55, A71, A79, C7, D10, D106, D31, D85, E26, E47, F150, F154, F196, F28, G124, G126, G36, G43, I153, L109, LA2, L53, L109, LA2, L53, L109, LA2, L53, L68, L82, L86, M111, N69, P104, P148, P18, P63, P66, P83, Q117, Q40, R101, R67, S54, S121, S72, S76, T25, T64, V115 y V19.

[0041] En realizaciones adicionales, la perhidrolasa exhibe una relación de actividad de perhidrólisis de al menos aproximadamente 1,2, una relación de actividad de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,8 o menos y una relación de concentración de proteína de al menos 0,5, en comparación con perhidrolasa natural. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que se selecciona al menos una sustitución del grupo constituido por A29, A44, A71, A79, C7, D85, E26, E47, E51, F150, F154, F196, F28, G124, G126, G36, I153, L109, L12, L53, L68, L82, M111, N69, P104, P148, P18, P63, P66, P83, Q117, Q40, R101, R67, S121, S54, S72, S76, T25, T64, V125 y V19.

[0042] La presente invención proporciona variantes de perhidrolasa como se definen en las reivindicaciones que exhiben un aumento en la expresión de las variantes de perhidrolasa, en comparación con la expresión de perhidrolasa natural. En algunas realizaciones, la variante de perhidrolasa comprende al menos una modificación que comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en la que se selecciona al menos una sustitución del grupo constituido por A2, I5, C7, F8, S11, L12, T13, W14, W16, V17, P18, V19, E20, G22, A23, P24, T25, A29, P30, V32, T35, G36, V37, A39, F46, E47, S54, A55, R56, T58, I60, D61, D62, P63, T64, P66, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, L74, P75, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, L86,189, T93, T96, K97, A98, Y99, F100, R101, R102, T103, P104, L105, D106, I107, A108, L109, G110, S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P130, P132, K133, L135, V136, S138, P141, L142, A143, M145, H147, W149, F150, Q151, I153, G157, Q159, T161, T162, L164, A165, R166, V167, Y168, A170, L171, A172, M175, K176, P178, A182, G183, S184, V185, I186, T188, I194, F196, V191, N201, L208, A209, Q211, Q213, S214, L215 y L216.

[0043] La presente divulgación proporciona también proteínas aisladas que comprenden homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis, en los que los homólogos son proteínas de la familia de proteínas de hidrolasa SGNH. Las proteínas aisladas pueden tener al menos aproximadamente un 35% de identidad con la secuencia de aminoácidos de perhidrolasa de M. smegmatis, en que la proteína comprende al menos tres restos seleccionados del grupo constituido por L6, W14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, G110, L114, L135, F180, G205, S11, D192 y H195. La perhidrolasa puede ser al menos aproximadamente un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% homóloga de la perhidrolasa de M. smegmatis. La perhidrolasa puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.

[0044] La presente divulgación proporciona también proteínas aisladas que tienen al menos aproximadamente un 38% de identidad con la secuencia de aminoácidos de perhidrolasa de M. smegmatis, en las que la proteína exhibe actividad de perhidrólisis. La perhidrolasa puede ser al menos aproximadamente un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%; 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% homóloga de la perhidrolasa de M. smegmatis.

La perhidrolasa puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.

[0045] La presente invención proporciona también homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis como se define en las reivindicaciones, en los que los homólogos son perhidrolasas que comprenden al menos un motivo seleccionado del grupo constituido por GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT. En realizaciones preferidas, los homólogos exhiben perhidrólisis. En algunas realizaciones particularmente preferidas, los homólogos exhiben una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 1. En otras realizaciones adicionales, los homólogos tienen reacción inmunitaria cruzada con anticuerpos creados frente a la perhidrolasa de M. smegmatis. En más realizaciones adicionales, los anticuerpos creados frente al homólogo reaccionan de forma cruzada con la perhidrolasa de M. smegmatis.

[0046] En algunas realizaciones particularmente preferidas, la presente invención proporciona proteínas como se definen en las reivindicaciones que tienen actividad perhidrolasa, en las que las proteínas están en forma de multímero en disolución. En algunas realizaciones más preferidas, la proteína es una perhidrolasa que comprende un dímero. En realizaciones particularmente preferidas alternativas, la proteína es una perhidrolasa que comprende un octámero. En otras realizaciones adicionales, la proteína está en forma de multímero en disolución y la proteína se selecciona del grupo constituido por perhidrolasa de M. smegmatis, homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis y variantes de perhidrolasa de M. smegmatis. En más realizaciones adicionales, la proteína se selecciona del grupo constituido por serina hidrolasas modificadas y cisteína hidrolasas modificadas, en el que las serina hidrolasas modificadas o cisteína hidrolasas modificadas comprenden una actividad perhidrolasa aumentada en comparación con las serina hidrolasas no modificadas o cisteína hidrolasas no modificadas.

[0047] La presente invención proporciona también proteínas como se definen en las reivindicaciones que tienen actividad perhidrolasa, en las que la proteína comprende al menos un motivo seleccionado del grupo constituido por GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT. En algunas realizaciones, la proteína se obtiene a partir de un miembro de Rhizobiales. En algunas realizaciones preferidas, la proteína se obtiene a partir de un miembro del género Mycobacterium.

[0048] La presente divulgación proporciona también genes aislados identificados usando al menos un cebador seleccionado del grupo constituido por las SEQ ID NOS:21-69.

[0049] La presente divulgación proporciona también procedimientos para identificar una perhidrolasa, que comprenden las etapas de: identificar la fuente de la perhidrolasa; analizar la fuente para identificar secuencias que comprendan al menos un motivo seleccionado del grupo constituido por GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT; expresar las secuencias identificadas en la etapa b) para producir la perhidrolasa y ensayar en la perhidrolasa la actividad de perhidrólisis. La etapa de análisis puede ser una etapa de amplificación en la que se usan las secuencias de cebadores expuestas en las SEQ ID NOS:21-69 para amplificar las secuencias que comprenden al menos un motivo seleccionado del grupo constituido por GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSNGRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT. La fuente puede seleccionarse del grupo constituido por fuentes ambientales y fuentes metagenómicas. La presente divulgación proporciona también proteínas identificadas usando los procedimientos expuestos en la presente memoria. La presente divulgación proporciona adicionalmente secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican las proteínas identificadas usando los procedimientos expuestos en la presente memoria. Las proteínas pueden exhibir una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 1. Las proteínas pueden exhibir una actividad de perhidrólisis que es de al menos aproximadamente 0,2, en comparación con la actividad de perhidrólisis exhibida por la perhidrolasa de M. smegmatis. Las proteínas pueden comprender al menos tres restos seleccionados del grupo constituido por L6, W14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, G110, L114, L135, F180, G205, S11, D192 y H195.

[0050] La etapa de análisis puede comprender la búsqueda en al menos una base de datos de aminoácidos. La etapa de análisis puede comprender la búsqueda en al menos una base de datos de ácidos nucleicos para identificar las secuencias de ácido nucleico que codifiquen las secuencias de aminoácidos de la perhidrolasa. La fuente puede seleccionarse del grupo constituido por fuentes ambientales y fuentes metagenómicas. La presente divulgación proporciona adicionalmente secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican las proteínas identificadas usando los procedimientos expuestos en la presente memoria. Las proteínas pueden exhibir una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 1. Las proteínas pueden exhibir una actividad de perhidrólisis que es de al menos aproximadamente 0,2, en comparación con la actividad de perhidrólisis exhibida por la perhidrolasa de M. smegmatis. Las proteínas pueden comprender al menos tres restos seleccionados del grupo constituido por L6, W14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, G110, L114, L135, F180, G205, S11, D192 y H195, como se expone en la SEQ ID NO:2.

[0051] La presente invención proporciona también variantes de perhidrolasa como se definen en las reivindicaciones que tienen especificidades de sustrato alteradas en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas realizaciones, las variantes de perhidrolasa tienen una actividad caproato de paranitrofenilo (PNC) alterada, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural.

[0052] La presente invención proporciona también variantes de perhidrolasa como se definen en las reivindicaciones que tienen valores de pI alterados en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas realizaciones, las variantes de perhidrolasa comprenden al menos una mutación cargada positivamente, mientras que en realizaciones alternativas, las variantes de perhidrolasa comprenden al menos una mutación cargada negativamente.

[0053] La presente invención proporciona también variantes de perhidrolasa como se definen en las reivindicaciones que tienen estabilidad aumentada en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas realizaciones preferidas, la estabilidad de la variante de perhidrolasa se selecciona del grupo constituido por termoestabilidad, estabilidad enzimática y estabilidad química.

[0054] La presente invención proporciona también variantes de perhidrolasa como se definen en las reivindicaciones, en las que las variantes de perhidrolasa exhiben al menos una propiedad de superficie alterada. En algunas realizaciones preferidas, las variantes comprenden al menos una mutación que comprende al menos una sustitución en sitios seleccionados del grupo constituido por los restos expuestos en la Tabla 15-1.

[0055] La presente invención proporciona también variantes de perhidrolasa como se definen en las reivindicaciones que tienen al menos una propiedad mejorada en comparación con la perhidrolasa natural.

[0056] La presente invención proporciona también vectores de expresión que portan una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos una variante de perhidrolasa como se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona adicionalmente células hospedadoras que comprenden al menos uno de dichos vectores de expresión. En algunas realizaciones preferidas, se selecciona una célula hospedadora del grupo constituido por Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia, y Pantoea sp. La presente invención proporciona también perhidrolasas producidas por las células hospedadoras.

[0057] La presente invención proporciona también composiciones que comprenden al menos una porción de al menos una perhidrolasa como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones preferidas, la perhidrolasa comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En realizaciones adicionales, la perhidrolasa está codificada por una secuencia de polinucleótidos que comprende la SEQ ID NO:1. La secuencia puede comprender al menos una porción de la SEQ ID NO:1. En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona vectores de expresión que comprenden la secuencia de polinucleótidos que codifica al menos una porción de al menos una perhidrolasa como se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona también un hospedador que comprende al menos un vector de expresión. En algunas realizaciones, las células hospedadoras se seleccionan del grupo constituido por Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia y Pantoea sp. La presente invención proporciona también perhidrolasas producidas por estas células hospedadoras.

[0058] La presente invención proporciona también variantes de perhidrolasa como se definen en las reivindicaciones, en las que las perhidrolasas comprenden al menos una sustitución correspondiente a las posiciones aminoacídicas de la SEQ ID NO:2, y en las que la variante de perhidrolasa tiene mejor rendimiento en al menos una propiedad, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural.

[0059] La presente divulgación proporciona adicionalmente polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos (i) que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad con la SEQ ID NO:1, o (ii) que es capaz de hibridar con una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:1 en condiciones de rigor intermedio a alto, o (iii) que es complementaria de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:1. La presente divulgación proporciona también vectores que comprenden estas secuencias de polinucleótidos. La presente invención proporciona también un hospedador que comprende al menos un vector de expresión. En algunas realizaciones, las células hospedadoras se seleccionan del grupo constituido por Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia y Pantoea sp. La presente divulgación proporciona también perhidrolasas producidas por estas células hospedadoras.

[0060] La presente divulgación proporciona también polinucleótidos que comprenden una secuencia complementaria de al menos una porción de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:1.

[0061] La presente invención proporciona también procedimientos de producción de enzimas que tienen actividad perhidrolasa que comprenden: transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica perhidrolasa que es al menos un 70% idéntico al polinucleótido de la SEQ ID NO:1; cultivar la célula hospedadora transformada en condiciones adecuadas para que la célula hospedadora produzca la perhidrolasa y recuperar la perhidrolasa. En algunas realizaciones preferidas, la célula hospedadora se selecciona del grupo constituido por especies de Streptomyces, Pantoea, Escherichia y Bacillus.

[0062] La presente divulgación proporciona también sondas que comprenden una secuencia de polinucleótidos de 4 a 150 unidades sustancialmente idéntica a un fragmento correspondiente de la SEQ ID NO:1, en las que la sonda se usa para detectar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que tiene actividad perhidrolasa.

[0063] La presente invención proporciona también composiciones limpiadoras que comprenden: a) al menos un 0,0001% en peso de una perhidrolasa de la presente invención; b) una molécula que comprende un resto éster y c) opcionalmente, un ingrediente auxiliar.

[0064] La presente invención proporciona adicionalmente composiciones limpiadoras que comprenden: a) al menos un 0,0001% en peso de una perhidrolasa de la presente invención; b) un material seleccionado del grupo constituido por una fuente de peroxígeno, peróxido de hidrógeno y mezclas de los mismos, estando seleccionada la fuente de peroxígeno del grupo constituido por: una sal de perácido, un peroxiácido orgánico, complejo de peróxido de hidrógeno y urea, una mezcla de carbohidrato y carbohidrato oxidasa y mezclas de los mismos; c) de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50% en peso de una molécula que comprende un resto éster y d) opcionalmente, un ingrediente auxiliar.

[0065] La presente invención proporciona también composiciones limpiadoras que comprenden: a) de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1% en peso de una variante de perhidrolasa como se define en las reivindicaciones que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una modificación de un aminoácido realizada en una posición equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2; b) un material seleccionado del grupo constituido por una fuente de peroxígeno, peróxido de hidrógeno y mezclas de los mismos, estando seleccionada la fuente de peroxígeno del grupo constituido por: una sal de perácido, un peroxiácido orgánico, complejo de peróxido de hidrógeno y urea, una mezcla de carbohidrato y carbohidrato oxidasa y mezclas de los mismos; c) de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50% en peso de una molécula que comprende un resto éster y d) opcionalmente, un ingrediente auxiliar. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones limpiadoras comprenden adicionalmente al menos un ingrediente auxiliar. En algunas realizaciones particularmente preferidas, el ingrediente auxiliar se selecciona del grupo constituido por tensioactivos, agentes de refuerzo, agentes quelantes, agentes inhibidores de la transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas y estabilizadores enzimáticos, materiales catalíticos, activadores del blanqueamiento, reforzadores del blanqueamiento, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de retirada de la suciedad de arcilla/antirredeposición, abrillantadores, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, agentes elastificantes de la estructura, suavizantes de la tela, vehículos, hidrotropos, auxiliares de procesamiento, pigmentos y mezclas de los mismos.

[0066] En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona composiciones limpiadoras en las que: la perhidrolasa exhibe una relación molar de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 0,1; la sal de perácido se selecciona del grupo constituido por perborato de metal alcalino, percarbonato de metal alcalino, perfosfatos de metal alcalino, persulfatos de metal alcalino y mezclas de los mismos; el carbohidrato se selecciona del grupo constituido por monocarbohidratos, dicarbohidratos, tricarbohidratos, oligocarbohidratos y mezclas de los mismos: la carbohidrato oxidasa se selecciona del grupo constituido por aldosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.9), galactosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.9), celobiosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.25), piranosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.10), sorbosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.11), hexosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.5), glucosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.4) y mezclas de las mismas; y la molécula que comprende un resto éster tiene la fórmula:

R1Ox [(R2)m (R3)n]p

(i): en la que R1 es un resto seleccionado del grupo constituido por H, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos;

(ii): cada R2 es un resto alcoxilato;

(iii) R3 es un resto formador de éster que tiene la fórmula:

R4CO-

en la que R4 es H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo;

(iv): x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un entero que es menor o igual al número de carbonos de R1;

(v): p es un entero que es menor o igual a x;

(vi): m es un entero de 0 a 50; y

(vii) n es al menos 1.

[0067] En realizaciones alternativas, la presente invención proporciona composiciones limpiadoras en las que: a) R1 es un resto alquilo o heteroalquilo C2-C32 sustituido o no sustituido; b) cada R2 es independientemente un resto etoxilato o propoxilato y c) m es un entero de 1 a 12. En algunas realizaciones, R3 es un resto formador de éster que tiene la fórmula: R4CO, en la que R4 es: a) un resto alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o no sustituido que comprende de 1 a 22 átomos de carbono; o b) un resto alquilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo sustituido o no sustituido que comprende de 4 a 22 átomos de carbono.

[0068] En otras realizaciones adicionales de las composiciones limpiadoras, la molécula que comprende el resto éster tiene la fórmula:

R1Ox[(R2)m(R3)n]p

en la que: a) R1 es H o un resto que comprende un resto amino primario, secundario, terciario o cuaternario, estando seleccionado el resto R1 que comprende un resto amino del grupo constituido por alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos; b) cada R2 es un resto alcoxilato; c) R3 es un resto formador de éter que tiene la fórmula: R4CO-, en la que R4 puede ser H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos; d) x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un entero que es menor o igual al número de carbonos de R1; e) p es un entero que es menor o igual a x; f) m es un entero de 0 a 12; yg) n es al menos 1.

[0069] En otras realizaciones adicionales de las presentes composiciones limpiadoras, la molécula que comprende un resto éster tiene un peso molecular medio numérico de menos de 600.000 Da. En más realizaciones adicionales, se selecciona el ingrediente auxiliar del grupo constituido por tensioactivos, agentes de refuerzo, agentes quelantes, agentes inhibidores de la transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas y estabilizadores enzimáticos, materiales catalíticos, activadores del blanqueamiento, reforzadores del blanqueamiento, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de retirada de la suciedad de arcilla/antirredeposición, abrillantadores, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, agentes elastificantes de la estructura, suavizantes de la tela, vehículos, hidrotropos, auxiliares de procesamiento, pigmentos y mezclas de los mismos.

[0070] La presente invención proporciona adicionalmente procedimientos de limpieza que comprenden las etapas de: a) poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende una tela con cualquiera de las composiciones limpiadoras proporcionadas anteriormente y/o una composición que comprende cualquiera de las composiciones limpiadoras proporcionadas anteriormente y b) lavar y/o aclarar opcionalmente la superficie o material.

[0071] La presente divulgación proporciona también procedimientos de limpieza, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende una tela con cualquier composición limpiadora proporcionada anteriormente y/o una composición que comprende cualquier producto de limpieza adecuado proporcionado anteriormente y b) lavar y/o aclarar opcionalmente la superficie o material.

[0072] La presente invención proporciona también composiciones de blanqueamiento que comprenden al menos una perhidrolasa de la presente invención. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0073] La presente invención proporciona también composiciones de blanqueamiento que comprenden al menos una variante de perhidrolasa como se define en las reivindicaciones, que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una modificación de un aminoácido realizada en una posición equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0074] La presente invención proporciona también composiciones de blanqueamiento que comprenden al menos una variante de perhidrolasa como se define en las reivindicaciones, que tiene al menos una propiedad mejorada en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0075] La presente invención proporciona también composiciones de blanqueamiento que comprenden al menos una variante de perhidrolasa como se define en las reivindicaciones, que comprende al menos una sustitución correspondiente a las posiciones aminoacídicas de la SEQ ID NO:2, y en la que la variante de perhidrolasa tiene mejor rendimiento en al menos una propiedad en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0076] Las composiciones de blanqueamiento comprenden al menos una perhidrolasa que es al menos un 70% idéntica a la perhidrolasa de M. smegmatis. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0077] La presente invención proporciona también composiciones desinfectantes que comprenden al menos una perhidrolasa como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0078] La presente invención proporciona también composiciones desinfectantes que comprenden al menos una variante de perhidrolasa como se define en las reivindicaciones, que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una modificación de un aminoácido realizada en una posición equivalente a una posición de perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0079] La presente invención proporciona también composiciones desinfectantes que comprenden al menos una variante de perhidrolasa como se define en las reivindicaciones, que tiene al menos una propiedad mejorada en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0080] La presente invención proporciona también composiciones desinfectantes que comprenden al menos una variante de perhidrolasa como se define en las reivindicaciones, que comprende al menos una sustitución correspondiente a las posiciones aminoacídicas de la SEQ ID NO:2, y en la que la variante de perhidrolasa tiene mejor rendimiento en al menos una propiedad en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0081] Las composiciones desinfectantes comprenden al menos una perhidrolasa que es al menos un 70% idéntica a la perhidrolasa de M. smegmatis. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas realizaciones, las composiciones de blanqueamiento comprenden adicionalmente al menos una enzima o derivado enzimático adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, manasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas.

[0082] La perhidrolasa es al menos un 70% idéntica a la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona perhidrolasas que reaccionan de forma cruzada con anticuerpo generado frente a la perhidrolasa de M. smegmatis, particularmente que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona perhidrolasas que son homólogos estructurales de la perhidrolasa de M. smegmatis, en que el sitio activo comprende sitios homólogos de S11, D192 y H195 de la perhidrolasa de M. smegmatis. En más realizaciones adicionales, la presente invención proporciona perhidrolasas que comprenden una o más modificaciones en los siguientes restos: Cys7, Asp10, Ser11, Leu12, Thr13, Trp14, Trp16, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Val125, Pro138, Leu140, Pro146, Pro148, Trp149, Phe150, Ile153, Phe154, Thr159, Thr186, Ile192, Ile194 y Phe196. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a perhidrolasas con estas modificaciones solo en estos restos, ya que las perhidrolasas con otras modificaciones encuentran también uso en la presente invención.

[0083] En algunas realizaciones, se usa al menos una perhidrolasa de la presente invención en un procedimiento de limpieza en el que se expone un artículo para limpiar a una cantidad suficiente de al menos una perhidrolasa en condiciones tales que la perhidrolasa limpie y/o blanquee y/o decolore cualquiera/todas las manchas presentes en el artículo (por ejemplo, detergentes de lavandería y lavavajillas). En algunas realizaciones, la limpieza comprende adicionalmente desinfección. En algunas realizaciones, el artículo limpiado, blanqueado y/o desinfectado usando al menos una perhidrolasa de la presente invención comprende productos textiles y/o superficies duras mientras que, en otras realizaciones, el artículo es papel o pulpa, y en otras realizaciones adicionales, se usa al menos una perhidrolasa como producto de cuidado personal para blanquear o decolorar cabello, dientes, piel, etc. Por tanto, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones para uso en diversas aplicaciones de limpieza, blanqueamiento y/o desinfección. Es más, no se pretende que la presente invención esté limitada a ninguna aplicación particular.

[0084] En algunas realizaciones preferidas, la perhidrolasa comprende la SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones preferidas alternativas, la perhidrolasa se codifica por la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO:1.

[0085] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona enzimas como se definen en las reivindicaciones con actividades que dan como resultado altas relaciones de perácido/ácido. En realizaciones alternativas, la presente invención proporciona la perhidrolasa de Mycobacterium smegmatis, así como homólogos de secuencia y/o estructurales de esta proteína como se definen en las reivindicaciones. En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona enzimas como se definen en las reivindicaciones que se han modificado para expresar actividad perhidrolasa con una alta relación de perhidrólisis a hidrólisis además de o en lugar de la actividad original de la enzima. En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona enzimas modificadas con especificidad de sustrato, Km, kcat, actividad perhidrolasa y/o actividad de degradación de perácido alteradas.

[0086] La presente divulgación proporciona medios para identificar, producir y caracterizar enzimas que comprenden la actividad de perhidrólisis de la presente invención. La presente invención proporciona adicionalmente procedimientos y composiciones que comprenden al menos una perhidrolasa para limpiar, desinfectar, blanquear y otras aplicaciones incluyendo, pero sin limitación, blanqueamiento de papel y pulpa, limpieza de telas y prendas, limpieza de superficies duras y aplicaciones de cuidado personal (por ejemplo, cuidado oral, cuidado del cabello y cuidado de la piel). En algunas realizaciones preferidas, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para blanquear algodón y otras telas. Es más, la presente invención encuentra uso en el blanqueo y limpieza de diversos productos textiles. No se pretende que la presente invención esté limitada a ningún entorno, aplicación o uso particular, ya que se contempla que encontrará uso en numerosas áreas en que se desea la generación enzimática de perácidos frente al uso de perácidos preformados o peróxido de hidrógeno u otros productos químicos blanqueantes, en condiciones que incluyen, pero sin limitación, un amplio intervalo de pH y temperaturas. La presente invención encuentra uso también en aplicaciones en que es útil la hidrólisis de perácido, tal como en la limpieza de perácidos.

[0087] Además, la presente invención proporciona medios para producir enzimas perhidrolasas adecuadas para limpieza, desinfección, blanqueamiento y otras aplicaciones, incluyendo el cuidado personal.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0088]

La Figura 1 proporciona un árbol filogenético de la perhidrolasa de M. smegmatis y otras secuencias relacionadas. La Figura 2 proporciona una visión general del árbol filogenético, mostrando las ramas mayoritarias de las bacterias y el origen de los clones/secuencias activos en comparación con M. smegmatis. La Figura 3 proporciona un esquema de cuatro familias estructurales de serina hidrolasas, incluyendo perhidrolasa (familia de la hidrolasa SGNH), quimotripsina, subtilisina e hidrolasa α/β. La Figura 4 proporciona un diagrama de la estructura de plegamiento de la perhidrolasa. La Figura 5 proporciona un mapa del plásmido pET26-M4aE11. La Figura 6 proporciona una tabla de purificación que muestra la actividad enzimática de la enzima de la presente invención a lo largo de diversas etapas del proceso de purificación. La Figura 7 proporciona una gráfica que muestra la relación de ácido perbutírico a ácido butírico generado por diversas enzimas a partir de tributirina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM en 40 minutos. La Figura 8 proporciona una gráfica que muestra la producción de perácido por equivalentes de acetato 30 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM, ensayado a diversos pH. Estos resultados muestran que, al usar la composición de perhidrolasa de la presente invención, hay generación de perácido en un amplio intervalo de pH. En contraposición, con TAED y peróxido de hidrógeno, la generación de perácido está limitada a las condiciones alcalinas. La Figura 9 proporciona una gráfica que muestra la producción de perácido por 0,1 ppm de enzima perhidrolasa en acetato de etilo 30 mM y peróxido de hidrógeno 20 mM a diversas temperaturas. Estos resultados muestran que la perhidrolasa de la presente invención funciona en un amplio intervalo de temperaturas, incluyendo temperaturas bajas. La Figura 10 proporciona una gráfica que muestra la relación de ácido perbutírico a ácido butírico generado por diversas enzimas a partir de tributirina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM en 4, 10 y 30 minutos. La Figura 11 proporciona una gráfica que muestra la relación de ácido peracético a ácido acético generado por diversas enzimas a partir de triacetina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM en 4 y 10 minutos. La Figura 12 proporciona un mapa del plásmido pMSATNcoI. La Figura 13 proporciona un mapa del plásmido pMSATNco1-1. La Figura 14 proporciona un mapa del plásmido pAH505. La Figura 15 proporciona un mapa del plásmido pSFNASally. La Figura 16 proporciona un mapa del plásmido pCP606. La Figura 17 proporciona un mapa del plásmido pCP649. La Figura 18 proporciona un mapa del plásmido pSECGT-MSAT. La Figura 19 proporciona un mapa del plásmido pSEGT-phdA4. LA Figura 20 proporciona un mapa del plásmido pMC355rbs. La Figura 21 proporciona una gráfica que muestra el grado de blanqueamiento por tres detergentes ensayados solos y en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis de la presente invención. La Figura 22 proporciona una gráfica que muestra la capacidad de blanqueamiento de la perhidrolasa de M. smegmatis ensayada en algodón. La Figura 23 proporciona una gráfica que muestra la capacidad de blanqueamiento de la perhidrolasa de M. smegmatis ensayada en lino.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0089] La presente invención proporciona procedimientos y composiciones que comprenden al menos una enzima perhidrolasa como se define en las reivindicaciones para limpieza y otras aplicaciones. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la generación de perácidos. En particular, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones mejorados que comprenden enzimas de perhidrólisis con altas relaciones de perácido/ácido para limpieza, blanqueamiento, desinfección y otras aplicaciones. En algunas realizaciones preferidas, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones mejorados para la generación de perácidos. La presente invención encuentra un uso particular en aplicaciones que implican limpieza, blanqueamiento y desinfección.

[0090] A menos que se indique otra cosa, la práctica de la presente invención implica técnicas convencionales usadas comúnmente en los campos de biología molecular, microbiología, purificación de proteínas, ingeniería de proteínas, secuenciación de proteínas y ADN y ADN recombinante, que están dentro del alcance de la técnica. Dichas técnicas son conocidas por los especialistas en la materia y se describen en numerosos textos y trabajos de referencia (véanse, por ejemplo, Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición (Cold Spring Harbor), [1989]) y Ausubel y col., "Current Protocols in Molecular Biology" [1987]).

[0091] Además, los títulos proporcionados en la presente memoria no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invención, que se pueden tener como referencia de la memoria descriptiva en conjunto. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente antes se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en conjunto. No obstante, para facilitar la comprensión de la invención, se definen a continuación una serie de términos.

Definiciones

[0092] A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista en la materia a la que pertenece esta invención. Por ejemplo, Singleton y Sainsbury, “Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,” 2ª Ed., John Wiley and Sons, NY (1994) y Hale y Marham, “The Harper Collins Dictionary of Biology”, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a los especialistas en la materia diccionarios generales de muchos de los términos usados en la invención. Aunque algunos procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria encuentran uso en la práctica de la presente invención, los procedimientos y materiales preferidos se describen en la presente memoria. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se describen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en conjunto. También, como se usa en la presente memoria, los términos singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen las referencias plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. A menos que se indique otra cosa, los ácidos nucleicos se describen de izquierda a derecha en orientación 5’ a 3’; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxilo, respectivamente. Se ha de entender que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar, dependiendo del contexto en que se usen por los especialistas en la materia.

[0093] Se pretende que cada limitación numérica máxima dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluya cualquier limitación numérica menor, como si dichas limitaciones numéricas menores estuvieran escritas expresamente en la presente memoria. Cada limitación numérica mínima dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluirá cualquier limitación numérica mayor, como si dichas limitaciones numéricas mayores estuvieran escritas expresamente en la presente memoria. Cada intervalo numérico dado a lo largo de esta memoria descriptiva incluirá cualquier intervalo numérico más estrecho que entre dentro de dicho intervalo numérico más amplio, como si dichos intervalos numéricos más estrechos estuvieran escritos expresamente todos en la presente memoria.

[0094] Como se usa en la presente memoria, el término “blanqueamiento” designa el tratamiento de un material (por ejemplo, tela, ropas, pulpa, etc.) o superficie durante un periodo suficiente de tiempo y en condiciones de pH y temperatura apropiadas para efectuar un abrillantamiento (concretamente un blanqueamiento) y/o limpieza del material. Los ejemplos de productos químicos adecuados para blanqueamiento incluyen, pero sin limitación, ClO2, H2O2, perácidos, NO2, etc.

[0095] Como se usa en la presente memoria, el término “desinfección” designa la eliminación de contaminantes de las superficies, así como la inhibición o muerte de los microbios sobre las superficies de los artículos. No se pretende que la presente invención esté limitada a ninguna superficie ni artículo particulares ni a contaminante(s) o microbios para eliminar.

[0096] Como se usa en la presente memoria, el término “perhidrolasa” designa una enzima que es capaz de catalizar una reacción que da como resultado la formación de cantidades suficientemente altas de perácido adecuado para aplicaciones tales como limpieza, blanqueamiento y desinfección. En realizaciones particularmente preferidas, las enzimas perhidrolasas de la presente invención producen relaciones de perhidrólisis a hidrólisis muy altas. Las altas relaciones de perhidrólisis a hidrólisis de estas distintas enzimas hacen adecuadas a estas enzimas para uso en una muy amplia variedad de aplicaciones. En realizaciones preferidas adicionales, las perhidrolasas de la presente invención se caracterizan por tener una estructura terciaria y secuencia primaria distintas. En realizaciones particularmente preferidas, las perhidrolasas de la presente invención comprenden estructuras primarias y terciaras distintas. En algunas realizaciones particularmente preferidas, las perhidrolasas de la presente invención comprenden una estructura cuaternaria distinta. En algunas realizaciones, la perhidrolasa de la presente invención es la perhidrolasa de M. smegmatis, mientras que en realizaciones alternativas, la perhidrolasa es una variante de esta perhidrolasa, mientras que en otras realizaciones adicionales, la perhidrolasa es un homólogo de esta perhidrolasa. En realizaciones preferidas adicionales, se modifica por ingeniería genética una hidrolasa monomérica para producir una enzima multimérica que tiene mejor actividad perhidrolasa que el monómero. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a esta perhidrolasa de M. smegmatis específica, a variantes específicas de esta perhidrolasa ni a homólogos específicos de esta perhidrolasa. Las perhidrolasas de la invención son al menos un 70% idénticas a la perhidrolasa de M. smegmatis.

[0097] Como se usa en la presente memoria, el término “multímero” designa dos o más proteínas o péptidos que están asociados covalente o no covalentemente y existen en forma de complejo en disolución. Un “dímero” es un multímero que contiene dos proteínas o péptidos, un “trímero” contiene tres proteínas o péptidos, etc. Como se usa en la presente memoria, “octámero” designa un multímero de ocho proteínas o péptidos.

[0098] Como se usa en la presente memoria, la frase “relación de perhidrólisis a hidrólisis” es la relación de la cantidad de perácido producido enzimáticamente a la de ácido producido enzimáticamente por la perhidrolasa, en condiciones definidas y durante un tiempo definido. En algunas realizaciones preferidas, los ensayos proporcionados en la presente memoria se usan para determinar las cantidades de perácido y ácido producidas por la enzima.

[0099] Como se usa en la presente memoria, “productos de cuidado personal” significa productos usados en la limpieza, decoloración y/o desinfección de cabello, piel, cuero cabelludo y dientes incluyendo, pero sin limitación, champús, lociones corporales, geles de ducha, humectantes tópicos, pasta de dientes y/u otros limpiadores tópicos. En algunas realizaciones particularmente preferidas, estos productos se utilizan en seres humanos, mientras que en otras realizaciones, estos productos encuentran uso en animales no humanos (por ejemplo, en aplicaciones veterinarias).

[0100] Como se usa en la presente memoria “farmacéuticamente aceptable” significa que los fármacos, medicamentos y/o ingredientes inertes que el término describe son adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y otros animales sin toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

[0101] Como se usa en la presente memoria, “composiciones limpiadoras” y “formulaciones limpiadoras” designan composiciones que encuentran uso en la eliminación de compuestos indeseados de los artículos que se limpian, tales como tela, vajilla, lentes de contacto, otros sustratos sólidos, cabello (champús), piel (jabones y cremas), dientes (colutorios, pastas de dientes), etc. El término comprende cualquier material/compuesto seleccionado para el tipo particular de composición limpiadora deseada y la forma de producto (por ejemplo, composición líquida, en gel, gránulo o pulverizador), a condición de que la composición sea compatible con la perhidrolasa y las demás enzimas usadas en la composición. La selección específica de los materiales de la composición limpiadora se realiza fácilmente considerando la superficie, artículo o tela que se limpia y la forma deseada de la composición para las condiciones limpiadoras durante el uso.

[0102] Los términos designan adicionalmente cualquier composición que sea adecuada para limpieza, blanqueamiento, desinfección y/o esterilización de cualquier objeto y/o superficie. Se pretende que los términos incluyan, pero sin limitación, composiciones detergentes (por ejemplo, detergentes de lavandería líquidos y/o sólidos y detergentes de telas delicadas; formulaciones limpiadoras de superficies duras tales como encimeras y ventanas de vidrio, madera, cerámica y metal; limpiadores de alfombras; limpiadores de hornos; revitalizadores de tela; suavizantes de ropa y pretratadores textiles y de lavandería, así como detergentes lavavajillas).

[0103] Es más, el término “composición limpiadora” como se usa en la presente memoria, incluye, a menos que se indique otra cosa, agentes de lavado granulares o en forma de polvo multiusos o de alto rendimiento, especialmente detergentes de lavado; agentes de lavado multiusos líquidos, en forma de gel o pasta, especialmente los tipos denominados líquido de alto rendimiento (HDL); detergentes de telas delicadas; agentes lavavajillas a mano

o agentes lavavajillas de bajo rendimiento, especialmente aquellos de tipo de alta espumación; agentes lavavajillas a máquina, incluyendo los diversos tipos de comprimido, granular, líquido y agente de aclarado para uso doméstico e institucional; agentes de limpieza y desinfección líquidos, incluyendo los tipos para lavado de manos antibacteriano, pastilla de jabón, colutorios, limpiadores de dentadura, detergentes para coche o alfombra, limpiadores de baño; champús para el cabello y aclaradores capilares; geles de ducha y espumas de baño y limpiadores de metales; así como auxiliares de limpieza tales como aditivos de blanqueamiento y de tipos “barra quitamanchas” o pretratamiento.

[0104] Como se usa en la presente memoria, los términos “composición detergente” y “formulación detergente” se usan con referencia a mezclas que se pretenden para uso en un medio de lavado para la limpieza de objetos sucios. En algunas realizaciones preferidas, se usa el término con referencia al lavado automático de telas y/o prendas (por ejemplo, “detergentes de lavandería”). En realizaciones alternativas, el término designa otros detergentes, tales como los usados para limpiar vajilla, cubertería, etc. (por ejemplo, “detergentes lavavajillas”). No se pretende que la presente invención esté limitada a ninguna formulación o composición detergente particular. Es más, se pretende que, además de perhidrolasa, el término comprenda detergentes que contienen tensioactivos, transferasa(s), enzimas hidrolíticas, oxidorreductasas, agentes de refuerzo, agentes blanqueantes, activadores del blanqueamiento, agentes azulantes y tintes fluorescentes, inhibidores de la compactación, agentes enmascarantes, activadores enzimáticos, antioxidantes y solubilizantes.

[0105] Como se usa en la presente memoria, “rendimiento potenciado” en un detergente se define como aumentar la limpieza de manchas sensibles al blanqueamiento (por ejemplo, de hierba, té, vino, sangre, suciedad, etc.), determinado mediante la evaluación habitual después de un ciclo de lavado estándar. En realizaciones particulares, la perhidrolasa de la presente invención proporciona un rendimiento potenciado en la oxidación y eliminación de manchas y suciedades coloreadas. En realizaciones adicionales, la perhidrolasa de la presente invención proporciona un rendimiento potenciado en la eliminación y/o decoloración de manchas. En más realizaciones adicionales, la perhidrolasa de la presente invención proporciona un rendimiento potenciado en la eliminación de manchas y suciedades basadas en lípidos. En otras realizaciones adicionales, la perhidrolasa de la presente invención proporciona un rendimiento potenciado en la eliminación de suciedades y manchas de vajilla y otros artículos.

[0106] Como se usa en la presente memoria, el término “composición limpiadora de superficies duras” designa composiciones detergentes para limpiar superficies duras tales como suelos, paredes, azulejos, mobiliario de baño y cocina y similares. Dichas composiciones se proporcionan en cualquier forma incluyendo, pero sin limitación, sólidos, líquidos emulsiones, etc.

[0107] Como se usa en la presente memoria, “composición lavavajillas” designa todas las formas de las composiciones para lavar vajilla incluyendo, pero sin limitación, formas granulares y líquidas.

[0108] Como se usa en la presente memoria, “composición limpiadora de telas” designa todas las formas de composiciones detergentes para limpiar telas incluyendo, pero sin limitación, formas granulares, líquidas y en barra.

[0109] Como se usa en la presente memoria, “producto textil” designa tela tejida, así como fibras y filamentos cortados adecuados para conversión o uso como hebras, tejidos, géneros de punto, y telas no tejidas. El término comprende hebras hechas de fibras naturales, así como sintéticas (por ejemplo, fabricadas).

[0110] Como se usa en la presente memoria, “materiales textiles” es un término general para fibras, intermedios de hebra, hebras, telas y productos hechos de tela (por ejemplo, prendas y otros artículos).

[0111] Como se usa en la presente memoria, “tela” comprende cualquier material textil. Por tanto, se pretende que el término comprenda prendas así como telas, hebras, fibras, materiales no tejidos, materiales naturales, materiales sintéticos y cualquier otro material textil.

[0112] Como se usa en la presente memoria, el término “compatible” significa que los materiales de la composición limpiadora no reducen la actividad enzimática de la perhidrolasa en una extensión tal que la perhidrolasa no sea eficaz como se desea durante situaciones de uso normales. Los materiales de composición limpiadora específicos se ejemplifican con detalle a continuación en la presente memoria.

[0113] Como se usa en la presente memoria, “cantidad eficaz de enzima perhidrolasa” designa la cantidad de enzima perhidrolasa necesaria para conseguir la actividad enzimática necesaria en la aplicación específica (por ejemplo, producto de cuidado personal, composición limpiadora, etc.). Dichas cantidades eficaces se establecen fácilmente por un especialista en la materia y están basadas en muchos factores, tales como la variante de enzima particular usada, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición limpiadora y si se requiere una composición líquida o seca (por ejemplo, granular o barra), y similares.

[0114] Como se usa en la presente memoria, “composiciones limpiadoras no de telas” comprende composiciones limpiadoras de superficies duras, composiciones lavavajillas, composiciones limpiadoras de cuidado personal (por ejemplo, composiciones limpiadoras orales, composiciones limpiadoras de dentadura, composiciones de higiene personal, etc.) y composiciones adecuadas para uso en la industria de la pulpa y el papel.

[0115] Como usa en la presente memoria, “composiciones limpiadoras orales” designa dentífricos, pastas de dientes, geles de dientes, polvos de dientes, colutorios, pulverizadores bucales, geles bucales, gomas de mascar, pastillas masticables, saquitos, comprimidos, biogeles, pastas de profilaxis, disoluciones de tratamiento dental y similares. Las composiciones de cuidado oral que encuentran uso junto con las perhidrolasas de la presente invención son bien conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.601.750, 6.379.653 y 5.989.526).

[0116] Como se usa en la presente memoria, “composiciones de tratamiento de pulpa” designa el uso de las presentes enzimas perhidrolasas en composiciones adecuadas para uso en la fabricación de papel. Se pretende que el término comprenda composiciones adecuadas para el tratamiento de cualquier material de pulpa, incluyendo madera, así como materiales no de madera tales como “residuos agrícolas” y “cultivos fibrosos" incluyendo, pero sin limitación, paja de trigo, paja de arroz, tallos de maíz, bagazo (caña de azúcar), paja de ballico, paja de linaza, kenaf, cáñamo industrial, sisal, paja plana textil, hesperaloe, etc. Por tanto, la presente invención comprende también el uso de las perhidrolasas de la presente invención en procedimientos de tratamiento de pulpa.

[0117] Como se usa en la presente memoria, “producto químico oxidante” designa un producto químico que tiene la capacidad de blanquear pulpa o cualquier otro material. El producto químico oxidante está presente a una cantidad, pH y temperatura adecuados para el blanqueamiento. El término incluye, pero sin limitación, peróxido de hidrógeno y perácidos.

[0118] Como se usa en la presente memoria, “acilo” es el nombre general de los grupos ácido orgánico, que son los residuos de ácidos carboxílicos después de la retirada del grupo –OH (por ejemplo, el cloruro de etanoílo, CH3CO-Cl, es el cloruro de acilo formado a partir de ácido etanoico, CH3COO-H). Los nombres de los grupos acilo individuales se forman reemplazando el “-ico” del ácido por “-ilo”.

[0119] Como se usa en la presente memoria, el término “acilación” designa la transformación química que sustituye el grupo acilo (RCO-) en una molécula, generalmente por un hidrógeno activo de un grupo -OH.

[0120] Como se usa en la presente memoria, el término “transferasa” designa una enzima que cataliza la transferencia de compuestos funcionales a una serie de sustratos.

[0121] Como se usa en la presente memoria, “grupo saliente” designa el nucleófilo que se escinde del donante acilo tras sustitución por otro nucleófilo.

[0122] Como se usa en la presente memoria, el término “conversión enzimática” designa la modificación de un sustrato a un intermedio o la modificación de un intermedio a un producto final mediante la puesta en contacto del sustrato o intermedio con una enzima. En algunas realizaciones, el contacto se realiza exponiendo directamente el sustrato o intermedio a la enzima apropiada. En otras realizaciones, poner en contacto comprende exponer el sustrato o intermedio a un organismo que expresa y/o excreta la enzima, y/o metaboliza el sustrato y/o intermedio deseado hasta el intermedio y/o producto final deseado, respectivamente.

[0123] Como se usa en la presente memoria, la frase “estabilidad del detergente” designa la estabilidad de una composición detergente. En algunas realizaciones, la estabilidad se valora durante el uso del detergente, mientras que en otras realizaciones el término designa la estabilidad de una composición detergente durante el almacenamiento.

[0124] Como se usa en la presente memoria, la frase “estabilidad a la proteólisis” designa la capacidad de una proteína (por ejemplo, una enzima) de soportar la proteólisis. No se pretende que el término esté limitado al uso de cualquier proteasa particular para valorar la estabilidad de una proteína.

[0125] Como se usa en la presente memoria, “estabilidad frente a la oxidación” designa la capacidad de una proteína de funcionar en condiciones oxidantes. En particular, el término designa la capacidad de una proteína de funcionar en presencia de diversas concentraciones de H2O2 y/o perácido. La estabilidad en diversas condiciones oxidantes puede medirse mediante procedimientos estándar conocidos por los especialistas en la materia y/o mediante los procedimientos descritos en la presente memoria. Se evidencia un cambio sustancial en la estabilidad frente a la oxidación por un aumento o reducción de al menos aproximadamente un 5% o más (en la mayoría de las realizaciones, es preferiblemente un aumento) de la semivida de la actividad enzimática, en comparación con la actividad enzimática presente en ausencia de los compuestos oxidantes.

[0126] Como se usa en la presente memoria, “estabilidad al pH” designa la capacidad de una proteína de funcionar a un pH particular. En general, la mayoría de las enzimas tienen un intervalo de pH finito al que funcionarán. Además de las enzimas que funcionan a pH de intervalo medio (concretamente, aproximadamente pH 7), hay enzimas que son capaces de funcionar en condiciones con muy alto o muy bajo pH. La estabilidad a diversos pH puede medirse mediante procedimientos estándares conocidos por los especialistas en la materia y/o mediante los procedimientos descritos en la presente memoria. Se evidencia un cambio sustancial en la estabilidad al pH por un aumento o reducción de al menos aproximadamente un 5% o más (en la mayoría de realizaciones, es preferiblemente un aumento) de la semivida de la actividad enzimática, en comparación con la actividad enzimática al pH óptimo de la enzima. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún nivel de estabilidad al pH ni intervalo de pH.

[0127] Como se usa en la presente memoria, “estabilidad térmica” designa la capacidad de una proteína de funcionar a una temperatura particular. En general, la mayoría de las enzimas tienen un intervalo finito de temperaturas a las que funcionarán. Además de las enzimas que funcionan a temperaturas en el intervalo medio (por ejemplo, temperatura ambiente), hay enzimas que son capaces de funcionar a temperaturas muy altas o muy bajas. La estabilidad térmica puede medirse mediante procedimientos conocidos o mediante los procedimientos descritos en la presente memoria. Se evidencia un cambio sustancial en la estabilidad térmica por un aumento o reducción de al menos aproximadamente un 5% o más (en la mayoría de realizaciones, es preferiblemente un aumento) de la semivida de la actividad catalítica de un mutante cuando se expone a una temperatura diferente (concretamente, mayor o menor) que la temperatura óptima para la actividad enzimática. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún nivel de estabilidad a la temperatura ni intervalo de temperatura.

[0128] Como se usa en la presente memoria, el término “estabilidad química” designa la estabilidad de una proteína (por ejemplo, una enzima) frente a productos químicos que afectan adversamente su actividad. En algunas realizaciones, dichos productos químicos incluyen, pero sin limitación, peróxido de hidrógeno, perácidos, detergentes aniónicos, detergentes catiónicos, detergentes no iónicos, quelantes, etc. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún nivel de estabilidad química ni intervalo de estabilidad química particular.

[0129] Como se usa en la presente memoria, la frase “mejora de la actividad perhidrolasa” designa la mejora relativa de la actividad perhidrolasa, en comparación con una enzima estándar. En algunas realizaciones, el término designa una tasa mejorada de producto de perhidrólisis, mientras que en otras realizaciones, el término comprende composiciones de perhidrolasa que producen menos producto de hidrólisis. En realizaciones adicionales, el término designa composiciones de perhidrolasa con especificidad de sustrato alterada.

[0130] Como se usa en la presente memoria, la frase “alteración en la especificidad de sustrato” designa cambios en la especificidad de sustrato de una enzima. En algunas realizaciones, se define un cambio en la especificidad de sustrato como una diferencia entre la relación Kcat/Km observada con una enzima en comparación con variantes de la enzima u otras composiciones enzimáticas. Las especificidades de sustrato enzimático varían, dependiendo del sustrato ensayado. Se determina la especificidad de sustrato de una enzima comparando las eficacias catalíticas que exhibe con diferentes sustratos. Estas determinaciones encuentran un uso particular en la valoración de la eficacia de enzimas mutantes, ya que se desea en general producir variantes de enzimas que exhiban mayores relaciones para sustratos particulares de interés. Por ejemplo, las enzimas perhidrolasas de la presente invención son más eficaces para producir perácido a partir de un sustrato éster que las enzimas que se usan actualmente en aplicaciones de limpieza, blanqueamiento y desinfección. Es otro ejemplo de la presente invención una perhidrolasa con una menor actividad sobre la degradación de perácido en comparación con la natural. Es otro ejemplo de la presente invención una perhidrolasa con mayor actividad sobre grupos acilo más hidrófobos que el ácido acético. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a ninguna composición de sustrato particular ni especificidad de sustrato específica.

[0131] Como se usa en la presente memoria, “propiedad de superficie” se usa con referencia a la carga electrostática, así como propiedades tales como la hidrofobicidad y/o hidrofilicidad exhibida por la superficie de una proteína.

[0132] Como se usa en la presente memoria, la frase “se selecciona independientemente del grupo constituido por” significa que los restos o elementos que se seleccionan a partir del grupo de Markush referido pueden ser iguales, pueden ser diferentes o cualquier mezcla de elementos como se indican en el siguiente ejemplo:

[0133] Una molécula que tiene 3 grupos R en la que cada grupo R se selecciona independientemente del grupo constituido por A, B y C. Aquí, los tres grupos R pueden ser: AAA, BBB, CCC, AAB, AAC, BBA, BBC, CCA, CCB o ABC.

[0134] Con referencia a composiciones químicas, el término “sustituido” como se usa en la presente memoria significa que la composición orgánica o radical a que se aplica el término:

(a) se insatura mediante la eliminación de al menos un elemento o radical; o

(b): se reemplaza al menos un hidrógeno en el compuesto o radical por un resto que contiene uno o más de átomos de (i) carbono, (ii) oxígeno, (iii) azufre, (iv) nitrógeno o (v) halógeno; o

(c): tanto (a) como (b). [0135] Los restos que pueden reemplazar al hidrógeno como se describe en (b) inmediatamente antes, que contienen solo átomos de carbono e hidrógeno, son restos hidrocarburos que incluyen, pero sin limitación, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alquildienilo, cicloalquilo, fenilo, alquilfenilo, naftilo, antrilo, fenantrilo, fluorilo y esteroide, y combinaciones de estos grupos entre sí y con grupos hidrocarburos polivalentes tales como grupos alquileno, alquilideno y alquilidino. Los restos que contienen átomos de oxígeno que pueden reemplazar al hidrógeno como se describe en (b) inmediatamente antes incluyen, pero sin limitación, grupos que contienen hidroxilo, acilo o ceto, éter, epóxido, carboxilo y éster. Los restos que contienen átomos de azufre que pueden reemplazar al hidrógeno como se describe en (b) inmediatamente antes incluyen, pero sin limitación, los grupos ácido y éster de ácido que contienen azufre, grupos tioéter, grupos mercapto y grupos tioceto. Los restos que contienen átomos de nitrógeno que pueden reemplazar al hidrógeno como se describe en (b) inmediatamente antes incluyen, pero sin limitación, grupos amino, el grupo nitro, grupos azoicos, grupos amonio, grupos amida, grupos azido, grupos isocianato, grupos ciano y grupos nitrilo. Los restos que contienen átomos de halógeno que pueden reemplazar al hidrógeno como se describen en (b) inmediatamente antes incluyen grupos cloro, bromo, fluoro, yodo, y cualquiera de los restos descritos anteriormente en que un hidrógeno o grupo alquilo pendiente se sustituye por un grupo halo formando un resto sustituido estable.

[0136] Se entiende que cualquiera de los restos (b)(i) a (b)(v) anteriores pueden sustituirse entre sí en una sustitución monovalente o mediante la pérdida de hidrógeno en una sustitución polivalente, formando otro resto monovalente que puede reemplazar al hidrógeno en el compuesto o radical orgánico.

[0137] Como se usa en la presente memoria, los términos “purificado” y “aislado” designan la eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, las perhidrolasas se purifican mediante la eliminación de proteínas contaminantes y otros compuestos en una disolución o preparación que no son perhidrolasas. En algunas realizaciones, las perhidrolasas recombinantes se expresan en células hospedadoras bacterianas o fúngicas, y estas perhidrolasas recombinantes se purifican mediante la eliminación de los demás constituyentes de la célula hospedadora; el porcentaje de polipéptidos de perhidrolasa recombinante aumenta así en la muestra.

[0138] Como se usa en la presente memoria, “proteína de interés” designa una proteína (por ejemplo, una enzima o “enzima de interés)” que se está analizando, identificando y/o modificando. Las proteínas de origen natural, así como recombinantes, encuentran uso en la presente invención.

[0139] Como se usa en la presente memoria, “proteína” designa cualquier composición compuesta por aminoácidos y reconocida como una proteína por los especialistas en la materia. Los términos “proteína”, “péptido” y “polipéptido” se usan intercambiablemente en la presente memoria. Si un péptido es una porción de una proteína, los especialistas en la materia entenderán el uso del término en el contexto.

[0140] Como se usa en la presente memoria, las proteínas funcional y/o estructuralmente similares se considera que son “proteínas relacionadas”. En algunas realizaciones, estas proteínas derivan de un género y/o especie diferente, incluyendo diferencias entre clases de organismos (por ejemplo, una proteína bacteriana y una proteína fúngica). En algunas realizaciones, estas proteínas derivan de un género y/o especie diferente, incluyendo diferencias entre clases de organismos (por ejemplo, una enzima bacteriana y una enzima fúngica). En realizaciones adicionales, se proporcionan proteínas relacionadas de la misma especie. Es más, no se pretende que la presente invención esté limitada a proteínas relacionadas de ninguna fuente particular. Además, el término “proteínas relacionadas” comprende homólogos de estructura terciaria y homólogos de estructura primaria (por ejemplo, la perhidrolasa de la presente invención). En realizaciones adicionales, el término comprende proteínas que reaccionan inmunitariamente de forma cruzada. En las realizaciones más particularmente preferidas, las proteínas relacionadas de la presente invención muestran muy altas relaciones de perhidrólisis a hidrólisis. [0141] Como se usa en la presente memoria, el término “derivado” designa una proteína que deriva de otra proteína mediante la adición de uno o más aminoácidos a cualquiera o ambos de los extremos C- y N-terminales, la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o una serie de sitios diferentes en la secuencia de aminoácidos, y/o la deleción de uno o más aminoácidos en cualquiera o ambos extremos de la proteína o en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos, y/o la inserción de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos. La preparación de un derivado de proteína se consigue preferiblemente modificando una secuencia de ADN que codifica la proteína nativa, la transformación de esa secuencia de ADN en un hospedador adecuado y la expresión de la secuencia de ADN modificada, formando la proteína derivada.

[0142] Las proteínas relacionadas (y derivados) comprenden “variantes de proteína”. En algunas realizaciones preferidas, las variantes de proteína difieren de la proteína original y entre sí por un pequeño número de restos aminoacídicos. El número de restos aminoacídicos diferentes puede ser uno o más, preferiblemente, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más restos aminoacídicos. En algunas realizaciones preferidas, el número de aminoácidos diferentes entre variantes es de entre 1 y 10. En algunas realizaciones particularmente preferidas, las proteínas relacionadas y variantes de proteína particularmente preferidas comprenden al menos un 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos. Adicionalmente, una proteína relacionada o variante de proteína como se usa en la presente memoria, designa una proteína que difiere de otra proteína relacionada o de una proteína original en el número de regiones prominentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las variantes de proteína tienen 1, 2, 3, 4, 5 o 10 regiones prominentes correspondientes que difieren de la proteína original.

[0143] Son conocidos varios procedimientos en la técnica que son adecuados para generar variantes de las enzimas perhidrolasas de la presente invención incluyendo, pero sin limitación, mutagénesis con saturación de sitio, mutagénesis de barrido, mutagénesis insercional, mutagénesis aleatoria, mutagénesis dirigida a sitio y evolución dirigida, así como diversos otros enfoques recombinatorios.

[0144] En realizaciones particularmente preferidas, se modifican por ingeniería genética las proteínas homólogas para producir enzimas con la actividad o actividades deseadas. En algunas realizaciones particularmente preferidas, las proteínas modificadas por ingeniería genética se incluyen en la familia de proteínas de hidrolasa SGNH. En algunas de las realizaciones más preferidas, las proteínas modificadas por ingeniería genética comprenden al menos uno o una combinación de los siguientes restos conservados: L6, W14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, G110, L114, L135, F180, G205. En realizaciones alternativas, estas proteínas modificadas por ingeniería genética comprenden los motivos GDSL-GRTT y/o ARTT. En realizaciones adicionales, las enzimas son multímeros incluyendo, pero sin limitación, dímeros, octámeros y tetrámeros. En más realizaciones preferidas adicionales, las proteínas modificadas por ingeniería genética exhiben una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1.

[0145] Un resto aminoacídico de una perhidrolasa es equivalente a un resto de perhidrolasa de M. smegmatis si es homólogo (concretamente, tiene una posición correspondiente en la estructura primaria y/o terciaria) o análogo de un resto o porción específico de ese resto en la perhidrolasa de M. smegmatis (concretamente, tiene la misma o similar capacidad funcional para combinar, reaccionar y/o interaccionar químicamente).

[0146] En algunas realizaciones, para establecer la homología con la estructura primaria, se compara directamente la secuencia de aminoácidos de una perhidrolasa con la secuencia primaria de la perhidrolasa de M. smegmatis, y particularmente con un conjunto de restos conocidos por ser invariables en todas las perhidrolasas para las que es conocida la secuencia. Después de alinear los restos conservados, permitiendo las inserciones y deleciones necesarias para mantener el alineamiento (concretamente, evitando la eliminación de restos conservados mediante una deleción e inserción arbitraria), se definen los restos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de perhidrolasa de M. smegmatis. En realizaciones preferidas, el alineamiento de restos conservados conserva un 100% de dichos restos. Sin embargo, el alineamiento de más de un 75% o de solo un 50% de los restos conservados es también adecuado para definir restos equivalentes. En realizaciones preferidas, se mantiene la conservación de los restos de serina e histidina catalíticos. Los restos conservados se usan para definir los restos aminoacídicos equivalentes correspondientes de la perhidrolasa de M. smegmatis en otras perhidrolasas (por ejemplo, perhidrolasas de otras especies de Mycobacterium, así como de cualquier otro organismo).

[0147] En algunas realizaciones de la presente invención, se modifica la secuencia de ADN que codifica la perhidrolasa de M. smegmatis. En algunas realizaciones, se modifican los siguientes restos: Cys7, Asp10, Ser11, Leu12, Thr13, Trp14, Trp16, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Val125, Pro138, Leu140, Pro146, Pro148, Trp149, Phe150, De153, Phe154, Thr159, Thr186, Ile192, Ile194 y Phe196. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a la secuencia que se modifica en estas posiciones. Es más, se pretende que la presente invención comprenda diversas modificaciones y combinaciones de modificaciones.

[0148] En realizaciones adicionales, se definen los restos equivalentes determinando la homología en la estructura terciaria para una perhidrolasa cuya estructura terciaria se haya determinado mediante cristalografía de rayos X. En este contexto, “restos equivalentes” se define como aquellos para los que las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un resto aminoacídico particular de la carbonil hidrolasa y perhidrolasa de M. smegmatis (N en N, CA en CA, C e C y O en O) estén a 0,13 nm y preferiblemente a 0,1 nm después del alineamiento. Se consigue el alineamiento después de orientar y colocar el mejor modelo para dar la superposición máxima de coordenadas atómicas de los átomos de proteína no de hidrógeno de la perhidrolasa en cuestión con la perhidrolasa de M. smegmatis. Como es conocido en la técnica, el mejor modelo es el modelo cristalográfico que da el menor factor R para los datos de difracción experimental a la mayor resolución disponible. Los restos equivalentes que son funcional y/o estructuralmente análogos a un resto específico de la perhidrolasa de

M. smegmatis se definen como aquellos aminoácidos de las perhidrolasas que adoptan preferiblemente una conformación tal que alteran, modifican o modulan la estructura proteica, efectuando cambios en la unión a sustrato y/o catálisis de manera definida y atribuida a un resto específico de la perhidrolasa de M. smegmatis. Además, son aquellos restos de la perhidrolasa (en casos en que se ha obtenido una estructura terciaria mediante cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga en la medida en que, aunque los átomos de la cadena principal del resto dado pueden no satisfacer los criterios de equivalencia basándose en la ocupación de una posición homóloga, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del resto se encuentran a 0,13 nm de los correspondientes átomos de cadena lateral de la perhidrolasa de M. smegmatis. Las coordenadas de la estructura tridimensional de la perhidrolasa de M. smegmatis se han determinado y se exponen en la presente memoria (véase, por ejemplo, el ejemplo 14) y encuentran uso como se explica anteriormente para determinar los restos equivalentes a nivel de estructura terciaria.

[0149] En algunas realizaciones, algunos de los restos identificados para sustitución, inserción o deleción son restos conservados, mientras que otros no lo son. Los mutantes de perhidrolasa de la presente invención incluyen diversos mutantes, incluyendo aquellos codificados por ácido nucleico que comprende una secuencia señal. En algunas realizaciones de mutantes de perhidrolasa que están codificados por dicha secuencia, se secretan por un hospedador de expresión. En algunas realizaciones adicionales, la secuencia de ácido nucleico comprende un homólogo que tiene una señal de secreción.

[0150] La caracterización de las proteínas naturales y mutantes se logra mediante cualquier medio adecuado y está basada preferiblemente en la valoración de las propiedades de interés. Por ejemplo, se determinan pH y/o temperatura, así como estabilidad del detergente y/u oxidativa, en algunas realizaciones de la presente invención. Es más, se contempla que encontrarán uso enzimas que tengan diversos grados de estabilidad en una o más de estas características (pH, temperatura, estabilidad proteolítica, estabilidad del detergente y/o estabilidad frente a la oxidación). En aún otras realizaciones, se seleccionan perhidrolasas con baja actividad de degradación de perácido.

[0151] Como se usa en la presente memoria, “vector de expresión” designa una construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN que está ligada operativamente con una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión del ADN en un hospedador adecuado. Dichas secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión a ribosoma de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un hospedador adecuado, el vector puede replicase y funcionar independientemente del genoma del hospedador o, en algunos casos, puede integrarse en el genoma mismo. En la presente memoria descriptiva, “plásmido”, plásmido de expresión” y “vector” se usan a menudo intercambiablemente, ya que plásmido es la forma más comúnmente usada de vector actualmente. Sin embargo, se pretende que la invención incluya dichas otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que son, o se han vuelto, conocidas en la técnica.

[0152] En algunas realizaciones preferidas, el gen perhidrolasa está ligado en un plásmido de expresión apropiado. El gen de perhidrolasa clonado se usa entonces para transformar o transfectar una célula hospedadora para expresar el gen de perhidrolasa. Este plásmido puede replicarse en hospedadoras en el sentido de que contiene los elementos bien conocidos necesarios para la replicación del plásmido, o el plásmido puede diseñarse para integrarse en el cromosoma del hospedador. Se proporcionan los elementos necesarios para una expresión génica eficaz (por ejemplo, un promotor ligado operativamente con el gen de interés). En algunas realizaciones, se suministran estos elementos necesarios como el promotor homólogo del propio gen si es reconocido (concretamente, transcrito), por el hospedador y un terminador de la transcripción (una región de poliadenilación para células hospedadoras eucarióticas), que es exógeno o se suministra por la región terminadora endógena del gen de perhidrolasa. En algunas realizaciones, se incluye también un gen de selección tal como un gen de resistencia a antibiótico que posibilita el mantenimiento en cultivo continuo de células hospedadoras infectadas por plásmido mediante crecimiento en medio que contiene agente antimicrobiano.

[0153] Puede usarse el siguiente procedimiento de mutagénesis de módulo para facilitar la construcción de las variantes de perhidrolasa de la presente invención, aunque pueden usarse otros procedimientos.

[0154] En primer lugar, como se describe en la presente memoria, se obtiene y secuencia total o parcialmente un gen de origen natural que codifica la perhidrolasa. Se examina entonces en la secuencia el punto en que se desea hacer una mutación (deleción, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la perhidrolasa codificada. Se evalúa en las secuencias que flanquean este punto la presencia de sitios de restricción para reemplazar un segmento corto del gen por un conjunto de oligonucleótidos que, cuando se expresa, codificará diversos mutantes. Dichos sitios de restricción son preferiblemente sitios únicos en el gen de la proteína, para facilitar el reemplazo del segmento génico. Sin embargo, puede usarse cualquier sitio de restricción conveniente que no sea abiertamente redundante en el gen de perhidrolasa, a condición de que los fragmentos génicos generados por la digestión de restricción puedan reensamblarse en la secuencia apropiada. Si los sitios de restricción no están presentes en localizaciones a una distancia conveniente del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), se generan dichos sitios sustituyendo nucleótidos en el gen de tal modo que ni el marco de lectura ni los aminoácidos codificados cambien en la construcción final. Se logra la mutación del gen para cambiar su secuencia para conformar la secuencia deseada mediante extensión con el cebador M13 según procedimientos conocidos en general. La tarea de localizar las regiones flanqueantes adecuadas y de evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitio de restricción convenientes se hace rutinariamente por la redundancia del código genético, un mapa de enzimas de restricción del gen y el gran número de enzimas de restricción diferentes. Obsérvese que si está disponible un sitio de restricción flanqueante conveniente, el procedimiento anterior tiene que usarse solo con respecto a la región flanqueante que no contiene un sitio.

[0155] Una vez se clona el ADN de origen natural y/o ADN sintético, se digieren los sitios de restricción que flanquean las posiciones a mutar con las enzimas de restricción asociadas y se liga una pluralidad de módulos de oligonucleótidos complementarios de los extremos en el gen. Se simplifica la mutagénesis mediante este procedimiento, porque todos los oligonucleótidos pueden sintetizarse para tener los mismos sitios de restricción, y no son necesarios ligadores sintéticos para crear los sitios de restricción.

[0156] Como se usa en la presente memoria, “correspondiente a” designa un resto en la posición enumerada en una proteína o péptido, o un resto que es análogo, homólogo o equivalente a un resto enumerado en una proteína o péptido. [0157] Como se usa en la presente memoria, “región correspondiente” designa en general una posición análoga en proteínas relacionadas o una proteína original.

[0158] Los términos “molécula de ácido nucleico que codifica”, “secuencia de ácido nucleico que codifica”, “secuencia de ADN que codifica” y “ADN que codifica” designan el orden o secuencia de desoxirribonucleótidos en una hebra de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos en la cadena polipeptídica (proteína). La secuencia de ADN codifica por tanto la secuencia de aminoácidos.

[0159] Como se usa en la presente memoria, el término “secuencia análoga” designa una secuencia en una proteína que proporciona una función, estructura terciaria y/o restos conservados similares a la proteína de interés (concretamente, típicamente la proteína de interés original). Por ejemplo, en regiones epitópicas que contienen una estructura de hélice alfa o lámina beta, los aminoácidos de reemplazo en la secuencia análoga mantienen preferiblemente la misma estructura específica. El término designa también las secuencias nucleotídicas, así como las secuencias aminoacídicas. En algunas realizaciones, se desarrollan secuencias análogas tales que los aminoácidos de reemplazo dan como resultado una variante enzimática que muestra una función similar o mejorada. En algunas realizaciones preferidas, la estructura terciaria y/o restos conservados de los aminoácidos en la proteína de interés están localizados en o cerca del segmento o fragmento de interés. Por tanto, cuando el segmento o fragmento de interés contiene, por ejemplo, una estructura de hélice alfa o lámina beta, los aminoácidos de reemplazo mantienen preferiblemente esa estructura específica.

[0160] Como se usa en la presente memoria, “proteína homóloga” designa una proteína (por ejemplo, perhidrolasa) que tiene una acción y/o estructura similar a una proteína de interés (por ejemplo, una perhidrolasa de otra fuente). No se pretende necesariamente que los homólogos estén relacionados evolutivamente. Por tanto, se pretende que el término comprenda la misma enzima o mismas enzimas o similar o similares (concretamente, en términos de estructura y función) obtenidas de diferentes especies. En algunas realizaciones preferidas, es deseable identificar un homólogo que tenga una estructura cuaternaria, terciaria y/o primaria similar a la proteína de interés, ya que el reemplazo del segmento o fragmento en la proteína de interés por un segmento análogo del homólogo reducirá la inestabilidad del cambio. En algunas realizaciones, las proteínas homólogas tienen respuestas inmunitarias inducidas similares a una proteína de interés.

[0161] Como se usa en la presente memoria, “genes homólogos” designa al menos un par de genes de diferentes especies, siendo correspondientes dichos genes entre sí y siendo idénticos o muy similares entre sí. El término comprende genes que están separados por especiación (concretamente, el desarrollo de nuevas especies) (por ejemplo, genes ortólogos), así como genes que se han separado por duplicación genética (por ejemplo, genes parálogos). Estos genes codifican “proteínas homólogas”.

[0162] Como se usa en la presente memoria, “ortólogo” y “genes ortólogos” designan genes en diferentes especies que han evolucionado a partir de un gen ancestral común (concretamente, un gen homólogo) por especiación. Típicamente, los ortólogos retienen la misma función durante el transcurso de la evolución. La identificación de los ortólogos encuentra uso en la predicción fiable de la función génica en genomas recién secuenciados.

[0163] Como se usa en la presente memoria, “parálogo” y “genes parálogos” designan genes que están relacionados por duplicación en un genoma. Mientras los ortólogos retienen la misma función a lo largo del transcurso de la evolución, los parálogos evolucionan a nuevas funciones, aunque algunas funciones están a menudo relacionadas con la original. Los ejemplos de genes parálogos incluyen, pero sin limitación, los genes que codifican tripsina, quimotripsina, elastasa y trombina, que son todas serinproteasas y aparecen conjuntamente en la misma especie.

[0164] Como se usa en la presente memoria, las proteínas “originales” y “nativas” son aquellas encontradas en la naturaleza. Los términos “secuencia original” y “gen original” se usan intercambiablemente en la presente memoria para designar una secuencia que es nativa o de origen natural en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, la secuencia original designa una secuencia de interés que es el punto de partida de un proyecto de modificación por ingeniería de proteína. Los genes que codifican la proteína de origen natural pueden obtenerse según procedimientos generales conocidos por los especialistas en la materia. Los procedimientos comprenden en general sintetizar sondas marcadas que tienen secuencias que codifican presuntamente regiones de la proteína de interés, preparar colecciones genómicas a partir de organismos que expresan la proteína y cribar en las colecciones el gen de interés mediante hibridación con las sondas. Se cartografían y secuencian entonces los clones de hibridación positiva.

[0165] El término “ADN recombinante”, como se usa en la presente memoria, designa una molécula de ADN que está compuesta por segmentos de ADN unidos conjuntamente mediante técnicas de biología molecular.

[0166] El término “oligonucleótido recombinante” designa un oligonucleótido creado usando manipulaciones de biología molecular incluyendo, pero sin limitación, el ligamiento de dos o más secuencias oligonucleotídicas generadas por digestión con enzimas de restricción de una secuencia de polinucleótidos, la síntesis de oligonucleótidos (por ejemplo, la síntesis de cebadores u oligonucleótidos) y similares.

[0167] El grado de homología entre secuencias puede determinarse usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 [1988]; programas tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI) y Devereux y col., Nucl. Acid Res., 12: 387-395 [1984]).

[0168] Por ejemplo, PILEUP es un programa útil para determina los niveles de homología de secuencia.

PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usadas alineamientos progresivos pareados. Puede representar también un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del procedimiento de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol., 35: 351-360 [1987]). El procedimiento es similar al descrito por Higgins y Sharp (Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 [1989]). Los parámetros de PILEUP útiles incluyen una ponderación de hueco por defecto de 3,00, una ponderación de longitud de hueco por defecto de 0,10 y huecos finales ponderados. Es otro ejemplo de un algoritmo útil el algoritmo BLAST, descrito por Altschul y col., (Altschul y col., J. Mol. Biol., 215: 403-410, [1990] y Karlin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 [1993]). Es un programa BLAST particularmente útil el programa WUBLAST-2 (véase, Altschul y col., Meth. Enzymol. 266: 460-480 [1996]). Los parámetros "W", "T" y "X" determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 [1989]), alineamientos (B) de 50, expectativas (E) de 10, M’5, N’-4 y una comparación de ambas hebras.

[0169] Como se usa en la presente memoria, “identidad porcentual (%) de secuencia de ácido nucleico” se define como el porcentaje de restos nucleotídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos nucleotídicos de la secuencia.

[0170] Como se usa en la presente memoria, el término “hibridación” designa el proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria mediante apareamiento de bases, como es conocido en la técnica.

[0171] Como se usa en la presente memoria, la frase “condiciones de hibridación” designa las condiciones en que se realizan las reacciones de hibridación. Estas condiciones se clasifican típicamente por el grado de “rigor” de las condiciones en que se mide la hibridación. El grado de rigor puede estar basado, por ejemplo, en la temperatura de fusión (Tm) del complejo o sonda de unión a ácido nucleico. Por ejemplo, el “rigor máximo” aparece típicamente a aproximadamente Tm-5ºC (5ºC por debajo de la Tm de la sonda); el “rigor alto” a aproximadamente 5-10ºC por debajo de la Tm, el “rigor intermedio” a aproximadamente 10-20ºC por debajo de la Tm de la sonda y el “rigor bajo” a aproximadamente 20-25ºC por debajo de la Tm. Como alternativa, o además, las condiciones de hibridación pueden estar basadas en las condiciones de sal o fuerza iónica de la hibridación y/o uno o más lavados de rigor. Por ejemplo, 6xSSC = rigor muy bajo; 3xSSC = rigor bajo a medio; 1xSSC = rigor medio y 0,5xSSC= rigor alto. Funcionalmente, las condiciones de máximo rigor pueden usarse para identificar secuencias de ácido nucleico que tienen una identidad estricta o casi estricta con la sonda de hibridación, mientras que las condiciones de rigor alto se usan para identificar secuencias de ácido nucleico que tienen aproximadamente un 80% o más de identidad de secuencia con la sonda.

[0172] Para aplicaciones que requieran una alta selectividad, es típicamente deseable usar condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos (por ejemplo, se usan condiciones de contenido relativamente bajo de sal y/o alta temperatura).

[0173] Las frases “sustancialmente similar” y “sustancialmente idéntico” en el contexto de al menos dos ácidos nucleicos o polipéptidos significan típicamente que el polinucleótido o polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 40% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 50% de identidad, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 60% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 75% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 90%, todavía más preferiblemente aproximadamente un 95%, lo más preferiblemente aproximadamente un 97% de identidad, a veces del orden de aproximadamente un 98% y de aproximadamente un 99% de identidad de secuencia, en comparación con la secuencia de referencia (concretamente natural). La identidad de secuencia puede determinarse usando programas conocidos tales como BLAST, ALIGN y CLUSTAL usando parámetros estándares (véanse, por ejemplo, Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 [1990]; Henikoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 [1989]; Karin y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873 [1993] y Higgins y col., Gene 73: 237 - 244 [1988]). El software para efectuar los análisis BLAST está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information. También puede buscarse en bases de datos usando FASTA (Pearson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 [1988]). Un indicativo de que dos polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el primer polipéptido reaccione inmunitariamente de forma cruzada con el segundo polipéptido. Típicamente, los polipéptidos que difieren en sustituciones aminoacídicas conservativas reaccionan inmunitariamente de forma cruzada. Por tanto, un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo en una sustitución conservativa. Otro indicativo de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibriden entre sí en condiciones rigurosas (por ejemplo, en un intervalo de rigor medio a alto).

[0174] Como se usa en la presente memoria, “restos equivalentes” designa proteínas que comparten restos aminoacídicos particulares. Por ejemplo, los restos equivalentes pueden identificarse determinando la homología a nivel de estructura terciaria para una proteína (por ejemplo, perhidrolasa) cuya estructura terciaria se haya determinado por cristalografía de rayos X. Los restos equivalentes se definen como aquellos para los que las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un resto aminoacídico particular de la proteína que tiene presuntamente restos equivalentes y la proteína de interés (N en N, CA en CA, C en C y O en O) estén a 0,13 nm y preferiblemente 0,1 nm después del alineamiento. Se consigue el alineamiento después de orientar y colocar el mejor modelo para dar la superposición máxima de las coordenadas atómicas de los átomos de proteína no de hidrógeno de las proteínas analizadas. El modelo preferido es el modelo cristalográfico que da el menor factor R para los datos de difracción experimental a la mayor resolución disponible, determinados usando procedimientos conocidos por los especialistas en la materia de la cristalografía y la caracterización/análisis de proteína.

[0175] Como se usa en la presente memoria, los términos “perhidrolasas híbridas” y “perhidrolasas de fusión” designan proteínas que se modifican por ingeniería genética a partir de al menos dos proteínas diferentes u “originales”. En realizaciones preferidas, estas proteínas originales son homólogas entre sí. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una perhidrolasa híbrida o proteína de fusión preferida contiene el extremo N de una proteína y el extremo N de un homólogo de la proteína. En algunas realizaciones preferidas, los dos extremos terminales se combinan para corresponder a la proteína activa completa.

[0176] El término “elemento regulador”, como se usa en la presente memoria, designa un elemento genético que controla algunos aspectos de la expresión de secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es un elemento regulador que facilita la iniciación de la transcripción de una región de codificación ligada operativamente. Los elementos reguladores adicionales incluyen señales de corte y empalme, señales de poliadenilación y señales de terminación.

[0177] Como se usa en la presente memoria, las “células hospedadoras” son generalmente hospedadores procarióticos o eucarióticos que se transforman o transfectan con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Las células hospedadoras transformadas son capaces de replicar vectores que codifican las variantes de proteína o de expresar la variante de proteína deseada. En el caso de vectores que codifican la forma pre o prepro de la variante de proteína, dichas variantes, cuando se expresan, se secretan típicamente de la célula hospedadora al medio de la célula hospedadora.

[0178] El término “introducido”, en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa transformación, transducción o transfección. Los medios de transformación incluyen transformación de protoplastos, precipitación con cloruro de calcio, electroporación, ADN desnudo y similares como es conocido en la técnica (véanse Chang y Cohen, Mol. Gen. Genet., 168: 111-115 [1979]; Smith y col., Appl. Env. Microbiol., 51: 634 [1986] y el artículo de revisión de Ferrari y col., en Harwood, “Bacillus”, Plenum Publishing Corporation, pág. 57-72 [1989]).

[0179] El término “promotor/potenciador” denota un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar funciones tanto promotoras como potenciadoras (por ejemplo, las repeticiones terminales largas de retrovirus contienen tanto funciones promotoras como potenciadoras). El potenciador/promotor puede ser “endógeno” o “exógeno” o “heterólogo”. Es un potenciador/promotor endógeno aquel que está ligado naturalmente a un gen dado en el genoma. Un potenciador/promotor exógeno (heterólogo) es aquel que se dispone adyacente a un gen mediante manipulación genética (concretamente, técnicas de biología molecular).

[0180] La presencia de “señales de corte y empalme” en un vector de expresión da a menudo como resultado mayores niveles de expresión del transcrito recombinante. Las señales de corte y empalme median la retirada de intrones del transcrito de ARN primario y consisten en un sitio donante y aceptor de corte y empalme (Sambrook y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York [1989], pág. 16.7-16.8). Es un sitio donante y aceptor de corte y empalme usado comúnmente la zona de corte y empalme del ARN de 16S de SV40.

[0181] El término “transfección estable” o “transfectado establemente” designa la introducción e integración de ADN extraño en el genoma de la célula transfectada. El término “transfectante estable” designa una célula que ha integrado ADN extraño o exógeno en el ADN genómico de la célula transfectada.

[0182] Los términos “marcador seleccionable” o “producto génico seleccionable”, como se usan en la presente memoria, designan el uso de un gen que codifica una actividad enzimática que confiere resistencia a un antibiótico o fármaco en la célula en que se expresa el marcador seleccionable.

[0183] Como se usa en la presente memoria, los términos “amplificación” y “amplificación génica” designan un proceso mediante el cual se replican desproporcionadamente las secuencias de ADN específicas de tal modo que el gen amplificado se hace presente en un mayor número de copias de lo que estaba presente inicialmente en el genoma. En algunas realizaciones, la selección de células mediante crecimiento en presencia de un fármaco (por ejemplo, un inhibidor de una enzima que se puede inhibir) da como resultado la amplificación del gen endógeno que codifica el producto génico necesario para el crecimiento en presencia del fármaco o la amplificación de secuencias exógenas (concretamente, de entrada) que codifican este producto génico, o ambas. La selección de células mediante crecimiento en presencia de un fármaco (por ejemplo, un inhibidor de una enzima que se puede inhibir) puede dar como resultado la amplificación del gen endógeno que codifica el producto génico necesario para el crecimiento en presencia del fármaco o la amplificación de secuencias exógenas (concretamente, de entrada) que codifican este producto génico, o ambas.

[0184] "Amplificación” es un caso especial de replicación de ácido nucleico que implica la especificidad de molde. Ha de contrastarse con la replicación no específica de molde (concretamente, replicación que es dependiente de molde pero no dependiente de un molde específico). Las especificidad de molde se distingue aquí de la fidelidad de replicación (concretamente, la síntesis de la secuencia de polinucleótidos apropiada) y de la especificidad de nucleótido (ribo o desoxirribo). La especificidad de molde se describe frecuentemente en términos de especificidad de “diana”. Las secuencias diana son “dianas” en el sentido de que se busca separarlas de otros ácidos nucleicos. Las técnicas de amplificación se han diseñado principalmente para esta separación.

[0185] Como se usa en la presente memoria, el término “amplificación simultánea” designa la introducción en una sola célula de un marcador amplificable junto con otras secuencias génicas (concretamente, que comprenden uno o más genes no seleccionables tales como los contenidos en un vector de expresión) y la aplicación de la presión selectiva apropiada de tal modo que la célula amplifique tanto el marcador amplificable como las otras secuencias génicas no seleccionables. El marcador amplificable puede estar ligado físicamente a las otras secuencias génicas o, como alternativa, pueden introducirse en la misma célula dos trozos separados de ADN, uno que contiene el marcador amplificable y el otro que contiene el marcador no seleccionable.

[0186] Como se usa en la presente memoria, los términos “marcador amplificable”, “gen amplificable” y “vector de amplificación” designan un marcador, gen o vector que codifica un gen que permite la amplificación de ese gen en condiciones de crecimiento apropiadas.

[0187] Como se usa en la presente memoria, el término “ácido nucleico amplificable” designa ácidos nucleicos que pueden amplificarse mediante cualquier procedimiento de amplificación. Se contempla que el “ácido nucleico amplificable” comprenderá habitualmente el “molde de muestra”.

[0188] Como se usa en la presente memoria, el término “molde de muestra” designa el ácido nucleico originario de una muestra en que se analiza la presencia de “diana” (definida a continuación). En contraposición, “molde de fondo” se usa con referencia a un ácido nucleico distinto del molde de muestra que puede estar presente o no en una muestra. El molde de fondo pasa inadvertido lo más a menudo. Puede ser el resultado del arrastre, o puede ser debido a la presencia de contaminantes del ácido nucleico que se busca purificar de la muestra. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de organismos distintos de los que se quieren detectar pueden estar presentes como fondo en una muestra de ensayo.

[0189] La “especificidad de molde” se consigue en la mayoría de técnicas de amplificación mediante la elección de la enzima. Las enzimas de amplificación son enzimas que, en las condiciones que se usan, procesarán solo secuencias específicas de ácido nucleico en una mezcla heterogénea de ácidos nucleicos. Por ejemplo, en el caso de la replicasa Qβ, el ARN de MDV-1 es el molde específico para la replicasa (véase, por ejemplo, Kacian y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 3038 [1972]). Otros ácidos nucleicos no se replican por esta enzima de amplificación. De forma similar, en el caso de ARN polimerasa de T7, esta enzima de amplificación tiene una especificidad rigurosa por sus propios promotores (véase Chamberlin y col., Nature 228: 227 [1970]). En el caso de ADN ligasa de T4, la enzima no ligará dos oligonucleótidos o polinucleótidos cuando haya un desparejado entre el sustrato de oligonucleótidos o polinucleótidos y el molde en la zona de ligamiento (véase Wu y Wallace, Genomics 4: 560 [1989]). Finalmente, las polimerasas Taq y Pfu, en virtud de su capacidad de funcionar a alta temperatura, se encuentra que exhiben una alta especificidad por las secuencias unidas y por tanto definidas por los cebadores; la alta temperatura da como resultado condiciones termodinámicas que favorecen la hibridación del cebador con las secuencias diana y no la hibridación con las secuencias no diana.

[0190] Como se usa en la presente memoria, el término “cebador” designa un oligonucleótido, que tenga origen natural como en una digestión de restricción purificada o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis cuando se pone en condiciones en que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario de una hebra de ácido nucleico (concretamente, en presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados). El cebador es preferiblemente monocatenario para una eficacia máxima en la amplificación, pero puede ser como alternativa bicatenario. Si es bicatenario, se trata el cebador en primer lugar para separar sus hebras antes de usarse para preparar productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxinucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente de cebador y el uso del procedimiento.

[0191] Como se usa en la presente memoria, el término “sonda” designa un oligonucleótido (concretamente una secuencia de nucleótidos) de origen natural, como en una digestión de restricción purificada o producido de forma sintética, recombinante o mediante amplificación por PCR, que es capaz de hibridar con otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias génicas particulares. Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invención estará marcada con cualquier “molécula informadora”, de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección incluyendo, pero sin limitación, sistemas enzimáticos (por ejemplo, ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzimas), fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No se pretende que la invención esté limitada a ningún sistema de detección ni marcaje particular.

[0192] Como se usa en la presente memoria, el término “diana”, cuando se usa con referencia a procedimientos de amplificación (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa), designa la región del ácido nucleico unida limitada por los cebadores usada para reacción en cadena de la polimerasa. Por tanto, se busca separar la “diana” de otras secuencias de ácido nucleico. Un “segmento” se define como una región de ácido nucleico con la secuencia diana.

[0193] Como se usa en la presente memoria, el término “reacción en cadena de la polimerasa” (“PCR”) designa los procedimientos de las patentes de EE.UU. nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188, que incluyen procedimientos para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación ni purificación. Este proceso para amplificar la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores de oligonucleótidos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclación térmica en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios de sus respectivas hebras de la secuencia diana bicatenaria. Para efectuar la amplificación, se desnaturaliza la mezcla y se asocian entonces los cebadores con sus secuencias complementarias en la molécula diana. Después de la asociación, se extienden los cebadores con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, asociación de cebador y extensión por polimerasa pueden repetirse muchas veces (concretamente, desnaturalización, asociación y extensión constituyen un “ciclo”; puede haber numerosos “ciclos”) para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del proceso, el procedimiento se designa como “reacción en cadena de la polimerasa” (de aquí en adelante “PCR”). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se vuelven las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están “amplificados por PCR”.

[0194] Como se usa en la presente memoria, el término “reactivos de amplificación” designa aquellos reactivos (trifosfatos de desoxirribonucleótido, tampón, etc.) necesarios para la amplificación excepto los cebadores, molde de ácido nucleico y enzima de amplificación. Típicamente, los reactivos de amplificación junto con los demás componentes de reacción están dispuestos y contenidos en un recipiente de reacción (tubo de ensayo, micropocillo, etc.).

[0195] Con la PCR, es posible amplificar una sola copia de una secuencia diana específica en ADN genómico a un nivel detectable mediante varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una sonda marcada, incorporación de cebadores biotinilados seguida de detección con conjugado de avidina-enzima, incorporación de trifosfatos de desoxinucleótidos marcados con 32P, tales como dCTP o dATP, al segmento amplificado). Además del ADN genómico, puede amplificarse cualquier secuencia de oligonucleótidos de polinucleótidos con el conjunto apropiado de moléculas cebadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el proceso de PCR mismo son, a su vez, moldes eficaces para posteriores amplificaciones por PCR.

[0196] Como se usa en la presente memoria, los términos “producto de PCR”, “fragmento de PCR” y “producto de amplificación” designan la mezcla de compuestos resultante después de completar dos o más ciclos de las etapas de PCR de desnaturalización, asociación y extensión. Estos términos comprenden el caso en que ha habido amplificación de uno o más segmentos de una o más secuencias diana.

[0197] Como se usa en la presente memoria, los términos “endonucleasas de restricción” y “enzimas de restricción” designan enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta ADN bicatenario en o cerca de una secuencia de nucleótidos específica.

La presente invención

[0198] En algunas realizaciones entre las más particularmente preferidas, la presente invención encuentra uso en la generación enzimática de perácidos a partir de sustratos ésteres y peróxido de hidrógeno. En algunas realizaciones preferidas, los sustratos se seleccionan de uno o más de los siguientes: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. De forma importante, la presente invención proporciona medios para limpiar, blanquear y desinfectar eficazmente en amplios intervalos de pH y temperatura. En algunas realizaciones, el intervalo de pH utilizado en esta generación es de 4-12. En realizaciones alternativas, el intervalo de temperatura utilizado es entre 5 y 90ºC. La presente invención proporciona ventajas frente a los sistemas usados actualmente (véase, por ejemplo, la solicitud EP 87-304933.9) en que es posible el blanqueamiento al pH óptimo de la oxidación de perácido, así como proporcionar blanqueamiento a pH neutro, pH ácidos y a bajas temperaturas. Aunque la presente invención se describe en la presente memoria más completamente con respecto al cuidado de ropa y telas, no se pretende que la presente invención esté limitada a estas aplicaciones. Es más, la presente invención encuentra uso en diversos entornos, particularmente aquellos en que se desea el blanqueamiento por perácidos y/o peróxido de hidrógeno incluyendo, pero sin limitación, ropas, tratamiento de telas, procesamiento de pulpa y papel, aplicaciones de cuidado personal, desinfección y limpieza de superficies duras. Por ejemplo, se contempla que las composiciones de la presente invención encontrarán uso en el blanqueamiento de pulpa, incluyendo el uso en procedimientos tales como los expuestos en las patentes de EE.UU. nº 6.569.286, 5.785.812, 6.165.318 y 4.400.237.

[0199] Históricamente, se han usado perborato de sodio, y más recientemente, percarbonato de sodio, como compuestos blanqueantes, particularmente en detergentes de lavandería europeos. Este compuesto se descompone rápidamente en disolución acuosa proporcionando peróxido de hidrógeno (H2O2), que es la especie blanqueante activa. Como el perborato de sodio es más activo a temperaturas superiores a 80ºC y menos activo en el intervalo de temperatura de 40-60ºC (concretamente, temperaturas de lavado que se han vuelto las más comúnmente preferidas desde los años 50), se han incorporado activadores de blanqueamiento a los detergentes de lavandería que contienen perborato de sodio. Es más, la mayoría de detergentes de lavandería contienen activadores de blanqueamiento. Estos activadores son compuestos con grupos acetilo unidos por O o N que son capaces de reaccionar con el anión hidroperóxido fuertemente nucleófilo proporcionando ácido peroxiacético. Puesto que la especie reactiva es el anión hidroperóxido, los pH alcalinos son esenciales para la conversión eficaz de estos activadores de perácidos. El ácido peroxiacético se descompone en medio débilmente básico formando oxígeno singlete (véase Hofmann y col., J. Prakt. Chem., 334: 293-297 [1992]).

[0200] El peróxido de hidrógeno es un blanqueante particularmente eficaz en condiciones de altas temperaturas (por ejemplo, >40ºC) y pH (>10), que se usan típicamente en el lavado de telas en algunos entornos. Sin embargo, como se indica anteriormente, el lavado con agua fría se está volviendo el más comúnmente usado y da como resultado un blanqueamiento menos eficaz por H2O2 que el uso de agua caliente. Para superar esta desventaja de la baja temperatura, las formulaciones detergentes incluyen típicamente reforzantes de blanqueamiento, tales como TAED (N,N,N’N’-tetraacetiletilendiamina), NOBS (bencenosulfonato de nonailoxilo), etc. Estos reforzantes se combinan con el H2O2 formando ácido peracético, una especie de perácido que es más eficaz que el H2O2 solo. Aunque ayuda a la capacidad de blanqueamiento del detergente, la reacción con TAED es solo aproximadamente un 50% eficaz, ya que solo dos de los cuatro grupos acetilo de TAED se convierten en perácidos. Adicionalmente, la conversión de TAED en ácido peracético por peróxido de hidrógeno es eficaz solo a pH alcalinos y altas temperaturas. Por tanto, la reacción con TAED no está optimizada para uso en todas las aplicaciones de blanqueamiento (por ejemplo, aquellas que implican pH neutros o ácidos y agua fría). La presente invención proporciona medios para superar las desventajas del uso de TAED. Por ejemplo, la presente invención encuentra uso en aplicaciones en agua fría, así como aquellas que implican niveles de pH neutros o ácidos. Además, la presente invención proporciona medios para la generación de perácidos a partir de peróxido de hidrógeno, con una alta relación de perhidrólisis a hidrólisis. La presente invención proporciona adicionalmente ventajas frente a composiciones que contienen enzimas tales como esterasas y lipasas) que tienen muy bajas relaciones de perhidrólisis a hidrólisis.

[0201] Además de sus aplicaciones en detergentes, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para el uso de perácidos en el blanqueamiento textil y en diversas otras aplicaciones. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos de una etapa para aplicaciones de procesamiento textil incluyendo, pero sin limitación, procesos de desaprestado, desengrasado y blanqueamiento de una etapa (véanse, por ejemplo, los documentos EP WO 03002810, EP 1255888, WO 0164993 y US 20020007516). Como se describe con más detalle en la presente memoria, en algunas realizaciones el blanqueamiento implica procesar material textil antes de teñir y/o después de incorporar a géneros textiles. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún régimen de uso particular ni a ningún material textil particular.

[0202] Además, la tecnología de ácido peracético de la presente invención encuentra uso como bactericida eficaz (véase Baldry, J. Appl. Bacteriol., 54: 417-423 [1983]). Por tanto, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para la esterilización/desinfección de diversos objetos incluyendo, pero sin limitación, dispositivos médicos, equipamiento médico, equipamiento industrial y fermentadores, así como cualquier objeto adicional que necesite esterilizarse o desinfectarse. Como se debate con más detalle a continuación, durante el desarrollo de la presente invención, se usó la enzima de la presente invención en un experimento para matar células estándar para demostrar esta idoneidad. En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos adecuados para uso en el control de biopelículas, tales como en torres de refrigeración.

[0203] Como se describe también con más detalle en los ejemplos siguientes, la presente invención proporciona muchas ventajas para la limpieza y/o esterilización de un amplio intervalo de objetos incluyendo, pero sin limitación, ropas, telas, dispositivos médicos, etc. Además, la presente invención proporciona composiciones que son eficaces para limpiar, blanquear y desinfectar en un intervalo de temperaturas y pH de lavado. En realizaciones adicionales, la presente invención encuentra uso en la degradación de perácidos mediante la actividad de degradación de perácido de la perhidrolasa. En algunas realizaciones preferidas, se usa esta actividad en aplicaciones de limpieza de desechos de perácido.

[0204] Además, las enzimas perhidrolasas de la presente invención son activas sobre diversos sustratos donantes de acilo, así como son activas a bajas concentraciones de sustrato, y proporcionan medios para una perhidrólisis eficaz debido a la alta relación de perácido:ácido. Es más, se ha reconocido que se prefieren altas relaciones de perhidrólisis a hidrólisis para aplicaciones de blanqueamiento (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.352.594, 5.108.457, 5.030.240, 3.974.082 y 5.296.616). En realizaciones preferidas, las enzimas perhidrolasas de la presente invención proporcionan relaciones de perhidrólisis a hidrólisis que son mayores de 1. En realizaciones particularmente preferidas, las enzimas perhidrolasas proporcionan una relación de perhidrólisis a hidrólisis mayor de 1 y encuentran uso en el blanqueamiento.

[0205] Además, se ha mostrado que es activa en formulaciones detergentes usadas comúnmente (por ejemplo, Ariel Futur, WOB, etc.). Por tanto, la presente invención proporciona muchas ventajas en diversos entornos de limpieza.

[0206] Como se indica anteriormente, los componentes clave en la producción de perácido mediante perhidrólisis enzimática son enzima, sustrato éster y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno puede añadirse directamente por lotes o generarse continuamente “in situ”. Los polvos de lavado actuales usan adiciones en lotes de H2O2 en forma de sales de percarbonato o perborato que se descomponen espontáneamente en H2O2. Las enzimas perhidrolasas de la presente invención encuentran uso en el mismo procedimiento por lotes de polvo de lavado que la fuente de H2O2. Sin embargo, estas enzimas encuentran uso también con cualquier otra fuente adecuada de H2O2, incluyendo el generado por medios químicos, electroquímicos y/o enzimáticos. Son ejemplos de fuentes químicas los percarbonatos y perboratos mencionados anteriormente, mientras que es un ejemplo de una fuente electroquímica una célula de combustible alimentada con oxígeno e hidrógeno gaseosos, y un ejemplo enzimático incluye la producción de H2O2 a partir de la reacción de glucosa con glucosa oxidasa. La siguiente ecuación proporciona un ejemplo de un sistema acoplado en que encuentra uso la presente invención.

glucosa oxidasa glucosa + H2O ----------------------------------------------------------------- ácido glucónico + H2O2 + perhidrolasa H2O2 + sustrato éster ------------------------------------------------------------- alcohol + perácido

[0207] No se pretende que la presente invención esté limitada a ninguna enzima específica, ya que cualquier enzima que genere H2O2 con un sustrato adecuado encuentra uso en los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, las lactato oxidasas de especies de Lactobacillus, que son conocidas por crear H2O2 a partir de ácido láctico y oxígeno, encuentran uso en la presente invención. Es más, es una ventaja de los procedimientos de la presente invención que la generación de ácido (por ejemplo, ácido glucónico en el ejemplo anterior) reduce el pH de una disolución básica al intervalo de pH en que el perácido es más eficaz en el blanqueamiento (concretamente, en

o por debajo del pKa). Otras enzimas (por ejemplo, alcohol oxidasa, etilenglicol oxidasa, glicerol oxidasa, aminoácido oxidasa, etc.) que pueden generar peróxido de hidrógeno encuentran también uso con sustratos éster en combinación con las enzimas perhidrolasas de la presente invención para generar perácidos. En algunas realizaciones preferidas, los sustratos éster se seleccionan de uno o más de los siguientes ácidos: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. Por tanto, como se describe en la presente memoria, la presente invención proporciona ventajas definidas frente a los procedimientos y composiciones usados actualmente para la formulación y uso de detergente, así como diversas otras aplicaciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCIÓN

[0208] La presente invención proporciona procedimientos y composiciones que comprenden al menos una enzima perhidrolasa para limpieza y otras aplicaciones. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la generación de perácidos. La presente invención encuentra un uso particular en aplicaciones que implican limpieza, blanqueamiento y desinfección.

Clonación y caracterización de perhidrolasa de M. smegmatis

[0209] La clonación de la perhidrolasa de M. smegmatis (concretamente, designada en la presente memoria como el gen “phd” que codifica la proteína “Phd”; este gen de perhidrolasa se designa a veces en la presente memoria como el gen “act” y la proteína se designa a veces como la proteína “Act”) de la presente invención se basó en los datos de la secuencia peptídica de la aciltransferasa purificada a partir de Mycobacterium parafortuitum (conocida anteriormente como Corynebacterium oxydans) y la información publicada respecto al gen de ácido 7aminocefalosporánico (7-ACA) arilesterasa de Agrobacterium radiobacter (Sakai y col., J. Ferment. Bioengineer., 85: 138-143 [1998]). Se encontró que dos secuencias peptídicas de aciltransferasa de M. parafortuitum purificada eran similares a las regiones N- y C-terminales internas de la 7-ACA-arilesterasa de A. radiobacter (47% y 42% de identidad, respectivamente).

[0210] Se diseño un conjunto de cebadores de PCR basándose en la secuencia de aminoácidos de estos péptidos internos (designados "AtintF" y "AtintR"). Se desarrolló otro conjunto de cebadores basándose en los extremos 5’ y 3’ ("ATNcoI" y "ATBamH1") de la secuencia de ADN de 7-ACA de A. radiobacter. Se amplificó un solo producto del tamaño esperado a partir de ADN cromosómico de M. parafortuitum usando ambos conjuntos de cebadores. Se clonó el producto completo, amplificado por el par de cebadores ATNcoI/ATBamH1, en pET16b y se transformó en células BL21 (Novagen, Madison, WI). Este clon tenía una secuencia idéntica a la del gen de 7-ACA de A. radiobacter. Como se determinó que la perhidrolasa de M. parafortuitum purificada no era la 7-ACA acilesterasa, se concluyó que este no era el gen que codifica la perhidrolasa de la presente invención.

[0211] Por tanto, para la clonación y expresión de la perhidrolasa de la presente invención se centraron los esfuerzos en M. smegmatis . Para identificar al gen de M. parafortuitum basándose en el cribado de actividad enzimática, se construyó una colección de plásmidos de ADN de M. parafortuitum en M. smegmatis usando un plásmido con un promotor para controlar la expresión de genes clonados. Sorprendentemente, se encontró que la M. smegmatis misma era positiva de actividad perhidrolasa y aciltransferasa. Por tanto, en algunos casos de la presente memoria, la perhidrolasa se designa como "ACT" (o "Act"). Una búsqueda BLAST de proteína del genoma inacabado de M. smegmatis usando la secuencia de 7-ACA de A. radiobacter identificó un cóntigo de 2 kb que contenía un ORF (marco de lectura abierto) que codificaba una proteína hipotética que era similar, pero no idéntica, a la proteína de 7-ACA. Basándose en esta secuencia, se diseñaron y usaron cebadores para amplificar el gen de

M. smegmatis (ATCC 10143). Al añadir un sitio de unión a ribosoma de E. coli en dirección 5’ del codón de inicio, se obtuvo un clon que expresaba la enzima activa. El vector usado era pCR2.1TOPO o pBluntIITOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), en células Top10 de E. coli. Se expresó constitutivamente el gen a partir del promotor lac codificado por plásmido. Esta enzima llevaba a cabo las mismas reacciones que la aciltransferasa de M. parafortuitum descrita originalmente.

[0212] Durante la caracterización de la perhidrolasa de la presente invención, las búsquedas BLAST de proteína estándares identificaron unas pocas proteínas (<20) con una similitud de secuencia de 30-80%. Este grupo incluía las 7-ACA arilesterasas de A. radiobacter y otros organismos, que tienen un 43% de identidad con la perhidrolasa de M. smegmatis. Todos los homólogos identificados con al menos un 40% de similitud tienen un motivo GDS muy cerca del extremo N-terminal. Todas las proteínas contienen también la mayoría de los restos conservados que podrían situarlas en la familia sugerida de enzimas lipolíticas de GDSL (véase, por ejemplo, Upton y Buckley, Trends Biochem. Sci., 20: 178 [1995]). Sin embargo, las enzimas mencionadas en este artículo no aparecen en las búsquedas de homología con la proteína perhidrolasa. Es más, estas proteínas tienen menos de un 20% de similitud con la perhidrolasa y sus homólogos, sugiriendo que las enzimas relacionadas con aciltransferasa (y perhidrolasa de la presente invención) forman una subfamilia.

[0213] No se ha determinado bioquímicamente la función natural de la enzima de la presente invención y de las proteínas relacionadas estrechamente, aparte de la 7-ACA arilesterasa. M. smegmatis parece ser el único organismo con la aciltransferasa/perhidrolasa en un operón con una presunta proteína de unión a penicilina (PBP). Aunque no se pretende limitar la presente invención a ningún mecanismo particular, esto sugiere que la enzima puede estar implicada en la síntesis/estructura de pared celular o la modificación de moléculas captadas del ambiente. No hay homólogos de la perhidrolasa de la presente invención que se hayan identificado en M. tuberculosis o M. leprae hasta la fecha. Sin embargo, se ha determinado que algunos organismos tenían múltiples homólogos (por ejemplo, S. meliloti).

[0214] Durante el desarrollo de la presente invención, se realizaron diversas mutaciones en la perhidrolasa de M. smegmatis para valorar su actividad. Esta enzima contiene dos restos de cisteína que se teorizó que formaban potencialmente enlaces disulfuro, ambos de los cuales se cambiaron por alanina para determinar si los restos C tenían o no efecto sobre la actividad de la enzima. Los resultados del ensayo de actividad obtenidos usando el ensayo de transesterificación (en disolución acuosa) descrito en la presente memoria indicaban que C7A, así como C77A, y un mutante doble (C7A y C77A) eran del mismo tamaño y actividad específica.

[0215] Muchas enzimas tienen al aminoácido serina como parte de su sitio activo y, por lo tanto, se designan, entre otras referencias, como “serina hidrolasas”. El sitio activo puede consistir en una triada catalítica de S (serina), D (ácido aspártico) y H (histidina). Los ejemplos de dichas enzimas incluyen, pero sin limitación, subtilisina (D32H64-S215), quimotripsina (H57-D102-S195) y lipasas de la familia de hidrolasas alfa/beta (por ejemplo, S126-D176H206). Es un motivo típico de lipasas el motivo GDSL (Upton y Buckley, supra [1995]) en que la S es la serina del sitio activo. Puesto que se determinó que la perhidrolasa de la presente invención tenía un motivo GDSL (aminoácidos 9-12), se mutó S1 a A para confirmar la implicación de esta S en el sitio activo. Como se indica en los ejemplos, los resultados del ensayo de actividad indicaron que S11A tenía solo un 1% de la actividad de la enzima natural. La deleción de los 25 aminoácidos C-terminales dio también como resultado la anulación de la actividad, sugiriendo que estos aminoácidos contenían un resto implicado directamente en el sitio activo y/o que la estructura de la proteína estaba afectada de tal modo que el sitio activo ya no era capaz de catalizar las reacciones. Además, se mutaron los restos de sitio activos predichos, D192 y H195, a A. Ningún mutante tenía actividad, confirmando que los restos del sitio activo de la perhidrolasa de la presente invención consisten en S11, D192 y H195. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada por ningún mecanismo particular, ni que la presente invención está limitada a las mutaciones en ningún resto de sitio activo particular.

Clonación de perhidrolasa de M. parafortuitum

[0216] Había algunas diferencias entre la secuencia peptídica N-terminal obtenida a partir de la enzima de M. parafortuitum y la secuencia N-terminal de la perhidrolasa de M. smegmatis. Sin embargo, había una secuencia en la región C-terminal de la perhidrolasa de M. smegmatis idéntica a la secuencia peptídica C-terminal de la enzima de

M. parafortuitum. Se diseñaron dos cebadores para amplificar una secuencia parcial del gen de perhidrolasa de M. parafortuitum; la secuencia del cebador inverso era idéntica a la secuencia de la correspondiente región en el gen de perhidrolasa de M. smegmatis, y la secuencia del cebador directo estaba basada en el uso de codón en M. smegmatis. Cebador directo, MP5: 5’-ATGGGTACCCGACGAATTCTGTCCTTCGGTGATTCCCTGACCT-3’ (SEQ ID NO:11) y cebador inverso MPCintR 5’GATTCCGTCGACGCCGTCGGTGCTGATCACCGAACCCGCGTCGAAGAACGG-3’ (SEQ ID NO:12). Se amplificó el gen parcial a partir del cromosoma de M. parafortuitum y se clonó en pCR2.1TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). El análisis de secuencia mostró que la enzima es muy similar, pero no idéntica, a la perhidrolasa de M. smegmatis (77% de identidad). Basándose en los pesos moleculares de los monómeros de las perhidrolasas determinados por PAGE-SDS (MP AT: 26 kDa, MSAT: 24 kDa, MP AT clonado: ~18 kDa), se determinó que al clon a partir de los cebadores preparados para el fragmento interno le faltaban aproximadamente 70 aminoácidos (~8 kDa). La secuencia restante en el extremo 5’ del gen de M. parafortuitum puede obtenerse mediante cualquiera de varios procedimientos adecuados y familiares para los especialistas en la materia de la biología molecular incluyendo, pero sin limitación, PCR inversa, sondeo de colecciones de plásmidos/cósmidos de ADN cromosómico de M. parafortuitum, secuenciación del gen directamente a partir de ADN cromosómico (por ejemplo, como se efectúa por Fidelity Systems, Bethesda Maryland).

Expresión de perhidrolasa de M. smegmatis

[0217] La perhidrolasa es una proteína intracelular en su hospedador nativo. La producción de la perhidrolasa en hospedadores no nativos puede realizarse también de forma intracelular. Sin embargo, en algunas realizaciones, se añade una secuencia señal que facilita la expresión de la perhidrolasa mediante secreción al periplasma (concretamente, en organismos gramnegativos, tales como E. coli), o al espacio extracelular (concretamente, en organismos grampositivos, tales como Bacillus y Actinomycetes), u hospedadores eucarióticos (por ejemplo, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces y Pichia). Por supuesto, estos son solo unos pocos ejemplos de los posibles hospedadores procarióticos y eucarióticos. No se pretende que la presente invención esté limitada a estos hospedadores específicos, ya que diversos otros organismos encuentran uso como hospedadores de expresión en la presente invención.

[0218] Son de aplicación una variedad de sistemas de expresión comercialmente disponibles incluyendo, pero sin limitación pBAD, plac y T7, en la expresión de perhidrolasa en hospedadores gramnegativos (por ejemplo,

E. coli). En algunas realizaciones, los mismos tipos de promotores encuentran uso en otro hospedador gramnegativo, Pantoea citrea.

[0219] Para ensayar la expresión en E. coli se usaron dos estrategias: 1) añadir un RBS (sitio de unión a ribosoma) al extremo 5’ del gen phd y clonar el gen en pCRBLUNTIITOPO (Invitrogen), permitiendo así la expresión directamente a partir del promotor pLac disponible en ese vector y 2) clonar el gen phd bajo el control del promotor T7 en el plásmido pET16b (Novagen). En el último sistema, la expresión del gen es inducible por la adición de IPTG al cultivo en crecimiento y el uso de una célula hospedadora específica (por ejemplo, BL21(λDE3)pLysS (Novagen)) que contiene el lisogén λDE3 que codifica la ARN polimerasa T7. La primera estrategia produce un plásmido capaz de permitir la expresión de la proteína perhidrolasa en otros hospedadores gramnegativos (por ejemplo, P. citrea).

[0220] Para expresar la proteína en E. coli o P. citrea usando la primera estrategia, se cultivaron cultivos de colonias individuales purificadas a 37ºC durante una noche en caldo L más el antibiótico apropiado (por ejemplo, kanamicina 50 µg/ml). Se determinó la expresión de la proteína mediante el ensayo de pNB (véase el ejemplo 1) después de la lisis de las células.

[0221] La expresión de la perhidrolasa usando el sistema de expresión T7 requiere la inducción del cultivo con la adición de IPTG (por ejemplo, IPTG 100 mM añadido a una DO550 de 0,4). Se usan cultivos de una noche, inoculados a partir de una sola colonia, para inocular el cultivo de expresión del volumen deseado (25 ml a varios litros) a una DO550 de 0,1. Se cultivó entonces el cultivo de expresión a la temperatura deseada (por ejemplo, 25, 30, 37ºC) hasta alcanzar una DO550 de 0,4, después de lo cual se añadió IPTG. Se dejó continuar la expresión durante 3 horas hasta una noche. Se controló la expresión de proteína mediante el ensayo de actividad de pNB como se describe en el ejemplo 1. Habitualmente, la expresión del sistema T7 da una valoración alta de proteína, suficiente para un análisis adicional tal como cristalografía.

[0222] Las especies de Bacillus son bien conocidas como hospedadores adecuados para la expresión proteínas extracelulares (por ejemplo proteasas). La expresión intracelular de proteínas es menos conocida. La expresión de la proteína perhidrolasa intracelularmente en Bacillus subtilis puede realizarse usando una variedad de promotores incluyendo, pero sin limitación, pVeg, pSPAC, pAprE o pAmyE en ausencia de una secuencia señal en el extremo 5’ del gen. En algunas realizaciones, se consigue la expresión a partir de un plásmido replicante (de alto

o bajo número de copias), mientras que en realizaciones alternativas, se consigue la expresión integrando la construcción deseada en el cromosoma. La integración puede realizarse en cualquier locus incluyendo, pero sin limitación, el locus aprE, amyE o pps. En algunas realizaciones, la perhidrolasa se expresa a partir de una o más copias de la construcción integrada. En realizaciones alternativas, se obtienen múltiples copias integradas mediante la integración de una construcción capaz de amplificación (por ejemplo, ligada a un módulo antibiótico y flanqueada por secuencias repetidas directas), o mediante el ligamiento de copias múltiples y la posterior integración en el cromosoma. En algunas realizaciones, la expresión de la perhidrolasa con el plásmido replicante o la construcción integrada se controla usando el ensayo de actividad de pNB (descrito en la presente memoria) en un cultivo apropiado.

[0223] Como con Bacillus, en algunos experimentos se realiza la expresión de la perhidrolasa en el hospedador grampositivo Streptomyces usando un plásmido replicante mientras que, en otras realizaciones, la expresión de la perhidrolasa se logra mediante la integración del vector en el cromosoma de Streptomyces. Cualquier promotor capaz de ser reconocido en Streptomyces encuentra uso en el control de la transcripción del gen de perhidrolasa (por ejemplo, promotor de glucosa isomerasa, promotor A4). Los plásmidos replicantes, tanto vectores lanzadera como solo Streptomyces, encuentran también uso en la presente invención para expresión (por ejemplo, pSECGT).

Estructura de la perhidrolasa de M. smegmatis

[0224] Se determinó la estructura cristalina de la perhidrolasa de M. smegmatis a 2,2 Å. La estructura confirmó los hallazgos en columnas de filtración en gel por tamaño, que indicaron que esta enzima es un octámero. La estructura del monómero dispone a la enzima en la clase conocida como hidrolasas SGNH (véase, por ejemplo, Molgaard y col., Structure 8: 373-383 [2000]). Los restos del sitio activo se identificaron como S11-D192-H195 basándose en la homología, confirmando la identificación de la triada catalítica basándose en la actividad en las mutaciones S11A, D192A y H195A descritas anteriormente. La Figura 3 proporciona esquemas que muestran la estructura de la perhidrolasa de M. smegmatis, así como de otras serina hidrolasas. Como se indica, esta enzima tiene una estructura diferente que las enzimas mostradas aquí (quimotripsina, subtilisina e hidrolasa α/β). Es más, el análisis estructural de las perhidrolasas de la presente invención indica que este grupo de enzimas tiene una forma y sitio activo diferente que esas otras enzimas. Se ilustra en la Figura 4 un diagrama esquemático de la estructura del monómero. Se han resuelto las estructuras de otras cuatro enzimas de la familia de hidrolasa SGNH, a saber, ramnogalacturonano acetilesterasa de Aspergillus aculeatus (RGAE), factor activador de plaquetas de Bos taurus (PAF-AH(1b)), esterasa de Streptomyces scabies (SsEst) y tioesterasa/proteasa I/fosfolipasa L1 (TAP o Tes) de E. coli. Está presente muy poca o ninguna homología de secuencia o funcional en estas enzimas. Básicamente, la identidad de secuencia está reservada a los restos implicados en el sitio activo y aquellos que definen la familia. Aunque el plegamiento global de las enzimas es similar (véase, por ejemplo, Molgaard y col., supra [2000], para la superposición de las estructuras), hay diferencias estructurales. Por ejemplo, hay un bucle que cubre el sitio activo en SsEst, en comparación con RGAE y TAP, que tienen sitios activos que están expuestos en la superficie. La perhidrolasa de M. smegmatis tiene un sitio activo que está algo enterrado. Los restos de unión de la perhidrolasa de

M. smegmatis se identificaron como Cys7, Asp10, Ser11, Leu12, Thr13, Trp14, Trp16, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Val125, Pro138, Leu140, Pro146, Pro148, Trp149, Phe150, Ile153, Phe154, Thr159, Thr186, Ile192, Ile194 y Phe196. Estos sitios derivaban de la observación directa y de estudios de modelización para modelizar la unión de sustrato a la enzima, usando procedimientos conocidos en la técnica. Como se indica anteriormente, se encontró que la perhidrolasa de M. smegmatis era un octámero en estado cristalino. Sin embargo, se contempla que sea un hexámero u octámero en disolución. Se observa que el octámero es un tetrámero de dímeros, dos moléculas interaccionan mucho más estrecha y extensamente, y estas se denominan los dímeros de “transferasa act”. Varios de los sitios conservados se encuentran en la interfase de este dímero. Por ejemplo, se encontró que los restos Trp14, Arg27, Arg56, His81 y Pro83 están conservados en aislamientos naturales que tienen actividad perhidrolasa y se contempla que sean críticos en la formación de la interfase. Además, se identificó otro resto, Glu 51, que está conservado en todos excepto uno de los aislamientos naturales (y en ese caso es una enzima homóloga).

[0225] Es un rasgo adicional de interés que, en los aislamientos naturales que muestran actividad perhidrolasa, todos comparten una inserción de los restos 69-81. Esta región forma un bucle que está en la interfase del dímero. Sin este bucle, se cree que se perdería mucha de la interfase del dímero y es probable que no aparecieran dímeros ni la agregación posterior. Por tanto, hay una correlación de la inserción con la agregación estructural, particularmente la formación de dímero y la aparición de actividad perhidrolasa. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún mecanismo particular.

[0226] Se encontraron restos clave que estaban asociados con la actividad deseada en homólogos seleccionados. Es más, hay varios restos conservados que se contempla que tienen importancia para la actividad aciltransferasa. Estos incluyen Leu6, Trp14, Arg27, Trp34, Asp62, Leu74, Leu78, His81, Pro83, Met90, Lys97 y Leu114. En análisis adicionales, se investigó la asociación de la perhidrolasa con carbamato. Se determinó el octámero nativo en el grupo espacial P4, con dimensiones de la celda unitaria: a= 98,184 b= 98,184 y c= 230,119, α= 90,00, β= 90,00, γ= 90,00; este cristal difractaba a aproximadamente 2,0 Å. El cristal inhibido con carbamato crecía en el grupo espacial P1 con dimensiones de celda unitaria: a= 67,754, b= 80,096 y c= 85,974, α= 104,10º, β= 112,10º y γ= 97,40º, y estos cristales difractaban a una resolución superior a 1,0 Å.

[0227] El carbamato se unía de manera que explotaba las interacciones entre el oxígeno de ceto del carbamato y los restos que forman el hueco de oxianión, los átomos N de amida de Ser11 y Ala55 y ND2 de Asn92. La cadena lateral hidrófoba se extiende a lo largo de la superficie hidrófoba del sitio de unión hasta la abertura superficial entre los pares de dímeros en la estructura octamérica. La dirección del resto de carbamato destaca el papel central de la mutación S54V. El resto hidrófobo pasa adyacente a la cadena lateral de la Ser54. Mutar la cadena lateral de serina a valina aumentaba la hidrofobicidad, y servía también como salvaguardia para evitar que nucleófilos hidrófilos (por ejemplo, agua) compitieran con los nucleófilos desacilantes deseados. Se espera que los restos que rodean al resto carbamato en la misma molécula y vecinas que forman la entrada extendida influyan en la selección del nucleófilo desacilante óptimo. La estructura mostró que cada monómero se inhibía con carbamato unido covalentemente. Por tanto, se encontró que todos los sitios activos del octámero eran activos y funcionales. La cadena lateral de carbamato se parece a los grupos salientes de los sustratos ensayados. Por tanto, el resto carbamato indica la dirección de acceso para el sustrato.

La perhidrolasa de M. smegmatis es una hidrolasa SGNH

[0228] La perhidrolasa de la presente invención tiene ciertos componentes que indican que está en la familia de enzimas hidrolasa SGNH. Esta familia se define por tener los cuatro aminoácidos conservados SGN y H en cuatro bloques, de forma similar a los bloques que describen la familia de enzimas lipolíticas (véase Upton y Buckley, supra). En el caso de perhidrolasa de M. smegmatis, estos corresponden a S11, G52, N94 y H195, que corresponden a los bloques I, II, III y V según Upton y Buckley (Upton y Buckley, supra) y Molgaard y col. (Molgaard y col., supra). Estos aminoácidos están también conservados en los homólogos de secuencia más cercanos de la perhidrolasa.

[0229] Como se indica en la presente memoria, se alinearon las secuencias usando el programa de alineamiento de Vector NTi (Informax, Invitrogen). En el siguiente alineamiento que proporciona una comparación de secuencias homólogas, el doble subrayado indica los restos implicados en el sitio activo. AR: Q9KWA6 de Agrobacterium rhizogenes; RR: NF006 de Rhizobium rhizogenes; SM: RSM02162 de Sinorhizobium meliloti; MS: Act de Mycobacterium smegmatis; MP: secuencia parcial de Phd de Mycobacterium parafortuitum; PD: RVM04532 de Prosthecobacter dejongeii. Los aminoácidos en los bloques que definen la familia de hidrolasa SGNH se indican en negrita.

imagen1

[0230] Se proporcionan a continuación los cebadores usados para identificar homólogos en cada uno de los bloques indicados anteriormente:

5 Bloque I (directo 5’-3) [0231]

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Bloque III (inverso 5’-3) [0232]

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Bloque III (directo 5’-3) [0233]

imagen2

imagen1

imagen2

Bloque V (inverso 5’-3)

[0234]

[0235] Como se describe con mayor detalle en la presente memoria, los resultados de secuencia y estructura están respaldados por los datos de actividad, que indican que las enzimas perhidrolasas de la presente invención difieren de las enzimas lipolíticas conocidas en la técnica.

10

Identificación de homólogos

[0236] Como es bien conocido en la técnica, las proteínas con una actividad deseada pueden identificarse de varios modos incluyendo, pero sin limitación: 1) buscando en bases de datos disponibles proteínas con homología

15 de secuencia (30-100%); 2) cribando en aislamientos ambientales la actividad deseada y 3) examinando las cepas tipo de la ATCC del género identificado por tener actividades (por ejemplo, Mycobacterium y Corynebacterium, como se describe en la presente memoria en realizaciones particulares).

[0237] Al realizar una búsqueda BLAST de proteína-proteína estándar, se identificaron varios homólogos a

20 partir de genomas total o parcialmente secuenciados. A partir de la secuencia génica conocida, se amplificaron varios homólogos por PCR a partir del cromosoma del organismo original y se clonaron en un vector de expresión pET, esencialmente como se describe para la clonación de phd a partir de M. smegmatis en pETl6b. Los homólogos identificados por esta búsqueda BLAST incluían: Q9KWA6 de Agrobacterium rhizogenes, Q9KWB1 de A. rhizogenes, Q8UFG4 de A. tumefaciens, Q8UAC0 de A. tumefaciens (ahora AgrL, idéntica a la 7-ACA arilesterasa),

25 Q9ZI09 de A. tumefaciens, ACA de A. tumefaciens (radiobacter), RVM04532 de Prosthecobacter dejongeii, Q98MY5 de Rhizobium loti, Q92XZ1 de R. meliloti, Q9EV56 de R. meliloti, NF006 de R. rhizogenes, NF00602875 de R. rhizogenes, Q8XQI0 de R. solanacerarum, RSM02162 de Sinorhizobium meliloti, RSM05666 de S. meliloti, RMLO00301 de Mesorhizobium loti, Q9KWA6 de A. rhizogenes y Q9KWB1 de A. rhizogenes.

30 [0238] Basándose en estos resultados, se generó un árbol de homología de proteínas con homología de secuencia (20-80%) con perhidrolasa de M. smegmatis. Como se muestra en la Figura 2, es una enzima de la familia de enzimas lipolíticas descritas por Upton y Buckley (supra) la de V. mimicus. Este árbol filogenético se generó usando el programa de alineamiento de Vector NTi (Informax, Invitrogen). La flecha verde indica la perhidrolasa de

M. smegmatis, la flecha roja la 7-ACA arilesterasa de A. radiobacter, la flecha azul indica TAP de E. coli y la flecha 35 negra indica RGAE de A. aculeatus.

[0239] Como se indica adicionalmente en la Figura 2, la perhidrolasa no está relacionada estrechamente con esta enzima. La perhidrolasa y sus parientes más cercanos, RVM04532 de Prosthecobacter dejongeii, NF006 de R. rhizogenes, Q9KWA6 de A. rhizogenes, Q92XZ1 de R. meliloti, RSM02162 de S. meliloti, Q9KWB1 de A. rhizogenes y NF00602875 de R. rhizogenes, provienen de su propia rama (concretamente, una rama que es diferente de las proteínas de tipo 7-ACA arilesterasa y las proteínas de tipo RGAE/TAP). Sin embargo, se contempla que algunos

5 homólogos adicionales relacionados más distantemente encontrarán uso en la presente invención, debido a la actividad perhidrolasa, o servirán como esqueleto adecuado para la modificación de la actividad perhidrolasa deseada.

[0240] Además del análisis de secuencia y homología, se cultivaron aislamientos ambientales en un medio

10 rico (N-MISO: g/l: glucosa 10 g, extracto de levadura 10 g, KNO3 1,5, KH2PO4 3,4 g, NaH2PO4·H2O 3,4 g, disolución salina C 10 ml [disolución salina C: g/l: MgSO4·7H2O 25, FeSO4·7H2O 2,8, MnSO4·H2O 1,7, NaCl 0,6, NaMoSO4·2H2O, ZnSO4·7H2O 0,06, en HCl 0,1N]), se ensayaron y se purificaron los positivos de reacción de transesterificación como se describe en los ejemplos. Este es uno de los procedimientos de cribado que pueden usarse para identificar perhidrolasa. Estos datos muestran que la presente invención encuentra uso en la

15 identificación de enzimas adicionales con la actividad perhidrolasa deseada. Investigaciones adicionales de homólogos [0241] Además de los análisis anteriores, se creó una colección enzimática de esterasas “de tipo GDSL” novedosas que son homólogas de la perhidrolasa de M. smegmatis prototípica. Para identificar nuevas esterasas de tipo “GDSL”, se estableció un procedimiento de cribado basado en la homología de secuencia y se usó para cribar

20 colecciones establecidas a partir de ADN metagenómico (en BRAIN). [0242] Se desarrolló una colección enzimática que comprendía 19 esterasas de tipo “GDSL” (véase a continuación). Las secuencias en esta colección eran:

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[0243] En total, se identificaron 9 de las nuevas esterasas de tipo “GDSL” en 6 colecciones metagenómicas y la colección de esterasa/lipasa de BRAIN. 8 de estos genes se expresaban heterólogamente en E. coli, y en las

5 enzimas resultantes se analizó la actividad en los ensayos descritos en la presente memoria. La caracterización en estas enzimas de la actividad perhidrolasa reveló que una exhibía la actividad deseada. Se predijo que una segunda mostraba esta actividad debido a la presencia de aminoácidos conservados entre este grupo de enzimas.

[0244] La comparación de las secuencias de enzimas para las que se determinó la presencia o ausencia de

10 la actividad perhidrolasa deseada condujo a la identificación de 19 posiciones aminoacídicas que estaban conservadas entre las enzimas que exhibían la actividad perhidrolasa deseada. Por tanto, se contempla que estos aminoácidos conservados son esenciales para la reacción de perhidrolasa y/o son un rasgo estructural de las enzimas perhidrolasas.

15 [0245] Se usó uno de los motivos estructurales identificados ("G/ARTT") conservados entre esterasas con la actividad perhidrolasa deseada para diseñar cebadores degenerados que proporcionaban los medios para centrar el cribado en las perhidrolasas verdaderas entre las esterasas de tipo “GDSL”. Es más, el uso de estos cebadores "G/ARTT" condujo a la identificación de enzimas con la actividad perhidrolasa deseada a partir del metagenoma. Sin embargo, no se pretende que el uso del metagenoma esté limitado a ningún procedimiento de ensayo particular. Es

20 más, se contempla que pueda buscarse en el metagenoma mediante ensayo de una actividad o actividades enzimáticas particulares deseadas (por ejemplo, actividad de perhidrólisis y/o aciltransferasa (dependiente o independiente de cofactor)). Además, el cribado usando antisueros poli- y/o monoclonales dirigidos contra una proteína de interés encuentra uso en la presente invención. En realizaciones adicionales, se busca en el metagenoma usando conjuntos de cebadores degenerados basados en la secuencia de la proteína de interés.

[0246] Además, el conocimiento de la relación estructura/función de las perhidrolasas permitió la búsqueda de estas enzimas en secuencias genómicas de microorganismos cultivables. De las 16 esterasas de tipo “GDSL” identificadas en diferentes aislamientos bacterianos, se amplificaron los correspondientes genes de 10 enzimas y se expresaron heterólogamente en E. coli. Se analizaron las muestras enzimáticas resultantes de 7 clones usando los 10 ensayos descritos en la presente memoria. De las 5 muestras caracterizadas hasta la fecha, 4 enzimas mostraron de hecho la actividad deseada y todos los resultados confirmaron la relación propuesta entre determinantes estructurales primarios y la función de las perhidrolasas. Por tanto, se estableció una colección enzimática de 19 esterasas de tipo “GDSL” que comprende al menos 6 perhidrolasas con la actividad perhidrolasa deseada. La correlación identificada entre la estructura y función de las perhidrolasas proporciona una definición del espacio de

15 secuencia usado por las enzimas con la actividad perhidrolasa deseada.

[0247] Se realizaron comparaciones en secuencias proteicas de enzimas de la ausencia o presencia de la actividad perhidrolasa deseada. Esto reveló una correlación entre la presencia de ciertos aminoácidos y la capacidad de efectuar reacciones de perhidrolasa. Este conocimiento se usó para identificar enzimas que contenían estos

20 aminoácidos conservados en genomas secuenciados de microorganismos cultivables. Se identificaron las siguientes enzimas y se efectuaron experimentos para amplificar los genes a partir del ADN genómico de las correspondientes cepas usando cebadores específicos.

Tabla 1. Esterasas de tipo “GDSL” con un motivo “GRTT” a partir de aislamientos bacterianos

Aislamiento: Identificador de proteína Acrónimo Amplicón Vector de expresión

Sinorhizobium meliloti: Sma1993 Sme I Sí pLO_SmeI

Sinorhizobium meliloti: Q92XZ1 Sme II Sí pET26_SmeII

Sinorhizobium meliloti: Q9EV56 Sme III Sí pET26_SmeIII

Agrobacterium rhizogenes: Q9KWB1 Arh I No -

Agrobacterium rhizogenes: Q9KWA6 Arh II No -

Agrobacterium tumefaciens: AAD02335 Atu III Si pET26_AtuIII

Mesorhizobium loti: Q98MY5 Mlo I Sí pET26_MloI

Mesorhizobium loti: ZP_00197751 Rso No -

Ralstonia eutropha: ZP_00166901 Reu Sí n.d.

Moraxella bovis: AAK53448 Mbo Sí pET26_Mbo

Burkholderia cepacia: ZP_00216984 Bce No -

Chromobacterium violaceum: Q7NRP5 Cvi Sí pET26_Cvi

Pirellula sp.: NP_865746 Psp n.d. n.d.

Vibrio vulnificus: AA007232 Vvu Sí pET26_Vvu

Salmonella typhimurium: AAC38796 Sty Sí pET26_Stm

[0248] En los casos de A. rhizogenes, M. loti (enzima II), R. solanacearum y B. cepacia, no pudo generarse

25 amplicón. Se pensó que esto era debido probablemente a diferencias genéticas entre las cepas usadas en esta investigación y las usadas para la secuenciación de los genes depositados en las bases de datos de dominio público. Una razón podría ser que los correspondientes genes están localizados en plásmidos que no están presentes en las cepas usadas en esta investigación. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún mecanismo ni teoría particular.

30 [0249] Se secuenciaron los amplicones de todas las demás cepas. En muchos casos, había diferencias entre la secuencia de las bases de datos y la secuencia determinada durante el desarrollo de la presente invención. Al secuenciar dos clones a partir de amplificaciones independientes, pudieron casi excluirse las mutaciones introducidas por la polimerasa. Se proporcionan a continuación las secuencias de los genes y las secuencias de

35 aminoácidos deducidas de las esterasas de tipo “GDSL” con un motivo “GRTT” o variaciones de aislamientos

bacterianos: SMa1993_Sinorhizobium meliloti (Sme I) (SEQ ID NOS:88 y 89) Q92XZ1_Sinorhizobium meliloti (Sme II) (SEQ ID NOS:90 y 91) Q9EV56_Sinorhizobium meliloti (Sme III) (SEQ ID NOS:92 y 93)

40 AAD02335_Agrobacterium tumefaciens (Atu III) (SEQ ID NOS: 94 y 95) Q98MY5_Mesorhizobium loti (Mlo I) (SEQ ID NOS:96 y 97) ZP_00166901_Ralstonia eutropha (Reu) (SEQ ID NOS:104 y 105) AAK53448_Moraxella bovis (Mbo) (SEQ ID NOS: 98 y 99) Q7NRP5_Chromobacterium violaceum (Cvi) (SEQ ID NOS:100 y 101) AA007232_Vibrio vulnificus (Vvu) (SEQ ID NOS:102 y 103) AAC38796-Salmonella typhimurium (Stm) (SEQ ID NOS:106 y 107)

imagen1

Como se ha indicado anteriormente, las secuencias anteriores son las secuencias proteicas y las secuencias de

codificación de esterasas “de tipo GDSL” con un motivo “GRTT” o motivos similares de diferentes aislamientos

5 bacterianos. Las secuencias de ADN representan el ADN diana del que se dedujeron los cebadores específicos.

Todos los amplicones se ligaron como fragmentos NdeI/XhoI a pET26, eliminando así la secuencia líder pelB de

este vector. Todas las esterasas “de tipo GDSL” de estos aislamientos se expresaron en Rosetta de E. coli (DE3) a

28ºC. Se indujo la expresión mediante la adición de IPTG 100 µM a una DO580= 1 y se recogieron las células 20 h

después de la inducción. Solo las células que expresan las enzimas de M. bovis y S. typhimurium se recogieron 4 h 10 después de la inducción, puesto que experimentos previos habían mostrado que podía obtenerse la máxima

actividad en este punto temporal. La tabla 2 resumen los experimentos de expresión.

Tabla 2: Expresión y caracterización de esterasas “de tipo GDSL” a partir de aislamientos bacterianos para actividad perhidrolasa Cepa Enzima Nivel de Solubilidad3 Actividad4 Actividad Motivo expresión2 perhidrolasa GRTT

S. meliloti Sme I +++ ++ 5770,0 Sí ARTT

S. meliloti Sme II +++ +++ 85,0 Sí GRTT

S. meliloti Sme III +++ ++ 746,5 n.d. GRTT

A. tumefaciens Atu III n.d.5 n.d. n.d. n.d. GRTT

M. loti Mlo I +++ ++ 1187,3 Sí GRTT

M. bovis1 Mbo + n.d. 25,2 Sí ARTT

C. violaceum Cvi + + 2422,7 n.d. GETS

V. vulnificus Vvu n.d. n.d. n.d. n.d. GDTT

R. eutropha Reu n.d. n.d. n.d. n.d. GRRT

S. typhimurium1 Sty + n.d. 17,2 No GRRT 1 proteína autotransportadora localizada en la membrana externa 2 nivel de expresión: + sobreexpresión moderada; ++ sobreexpresión fuerte; +++ sobreexpresión muy fuerte, a juzgar por el análisis de PAGE-SDS3 a juzgar por el análisis PAGE-SDS 4 frente a butirato de p-nitrofenilo 6 no determinado

[0250] Con la excepción de la enzima de S. typhimurium, el resto de enzimas ensayadas mostraron la actividad perhidrolasa deseada, según la correlación entre la presencia de ciertos aminoácidos conservados y la

5 capacidad de efectuar reacciones de perhidrolasa. Aunque la enzima de S. typhimurium contiene el motivo GRTT, es diferente de las demás enzimas por la localización de este motivo en dirección 3’ del bloque V. En todas las demás enzimas, este motivo está localizado entre el bloque I y III, indicando que podría haber una función diferente en la enzima de S. typhimurium. Por tanto, la ausencia de actividad perhidrolasa en la enzima de S. typhimurium apoya también la relación estructura/función identificada de las perhidrolasas proporcionada por la presente invención.

10

Cribado de esterasas de “tipo GDSL” en colecciones metagenómicas i) Colección S279 [0251] Se completó la secuencia completa del gen del clon M75bA2 como se proporciona a continuación.

imagen3

imagen1

[0252] En la secuencia de S279_M75bA2 proporcionada anteriormente (ADN, SEQ ID NO:80 y secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO:81), la secuencia de codificación que va de la posición 104 a la 1312 se muestra con 5 fondo gris. Los motivos estructurales conservados se muestran subrayados y en negrita.

[0253] La secuencia de aminoácidos derivada mostró la mayor homología con una proteína hipotética (Y17D7A.2) de Caenorhabditis elegans (BlastP2; swisspir), aunque con un valor muy alto de E de 2,5 (concretamente, indicando una coincidencia no fiable). El hecho de que ninguna esterasa esté entre las proteínas 10 homólogas identificadas por el análisis BlastP2 indica que esta enzima es una esterasa “de tipo GDSL” bastante inhabitual. Además, la enzima se caracteriza por péptidos inhabitualmente largos entre el extremo N y el motivo “GDSL” y el motivo “DXXH” del bloque V (que contiene el ácido aspártico y la histidina del sitio activo) y el extremo

C. La misma secuencia C-terminal muestra similitud con un sitio de unión a lípido de lipoproteína de membrana. No se identificó la correspondiente secuencia señal de lipoproteínas. Se amplificó el gen que codifica M75bA5, pero no

15 se hicieron esfuerzos adicionales con esta enzima puesto que no tenía los aminoácidos conservados típicos de la perhidrolasa de la presente invención.

ii) Colección S248

[0254] Se identificó el clon (M31bA11) que porta la secuencia marcadora SP7_3j5h, que podría haber sido

5 parte de un gen que codifica una esterasa “de tipo GDSL” y se alargó la secuencia. Esto facilitó la determinación de que esta secuencia no codificaba una esterasa “de tipo GDSL”, porque no pudo identificarse el bloque V. La generación de este amplicón puede explicarse por una hibridación “inespecífica” del cebador 5h con los primeros desparejamientos en los nucleótidos 10, 14 y 15 del extremo 3’ del cebador. La secuencia mostró la máxima homología con una proteína hipotética (KO3E5.5) de Caenorhabditis elegans con un valor de E de 1,6, indicando

10 una coincidencia no fiable. Se proporciona a continuación la secuencia marcadora del clon S248_M31bA11.

imagen1

[0255] En la secuencia marcadora anterior del clon S248_M31bA11, se indican los cebadores 3j y 5h. Se indica la hibridación entre cebador y molde por flechas, los desparejamientos por círculos blancos. Los motivos 5 estructurales presuntamente conservados se indican en negrita y subrayados.

[0256] Se generaron varias secuencias marcadoras adicionales usando diferentes pares de cebadores de los cebadores 2 y 5, pero ninguna resultó codificar una esterasa “de tipo GDSL”. Se completó el cribado de esta colección.

10

iii) Colección M091

[0257] El alargamiento del amplicón SP3_1j5h, que se identificó en el ADN del inserto del clon M24dG12, probó que la correspondiente secuencia no codifica una esterasa “de tipo GDSL”. Aunque se encontró la secuencia

15 que codifica un presunto bloque V (DGTHP; SEQ ID NO:124), faltaba la correspondiente secuencia que codifica el bloque I. Se generó el amplicón debido a una hibridación “inespecífica” del cebador 1j con los primeros desparejamientos en las posiciones 5, 10, 11 y 12 del extremo 3’ del cebador. Se muestra a continuación la secuencia marcadora del clon M091_M24dG12:

imagen4

imagen1

[0258] Secuencia marcadora del clon M091_M24dG12. Los cebadores 1j y 5h se indican en la secuencia marcadora anterior del clon M091_M24dG12. La hibridación entre cebador y molde se indica por flechas, los 5 desparejamientos por círculos blancos. Los motivos estructurales presuntamente conservados se muestran en negrita y subrayados.

[0259] Se generó una secuencia marcadora adicional (SP1_2b5h) usando el par de cebadores 2b/5h. Un análisis BlastX de la secuencia de este marcador proporcionó la máxima homología a una arilesterasa de 10 Agrobacterium tumefaciens, con un 70% de identidad. Se identificó un solo clon que portaba el correspondiente gen (M4aE11) y se determinó que la secuencia completa era como se muestra a continuación:

imagen1

[0260] En la secuencia anterior, los motivos estructurales conservados se muestran en negrita y subrayados. El análisis BlastP con la secuencia de aminoácidos completa deducida identificó la misma coincidencia con una identidad de un 48%. La estructura primaria de esta enzima mostró el motivo “GRTT”, probando la utilidad de los cebadores dirigidos al bloque 2 para la identificación de esterasas “GRTT”. Se amplificó el gen para introducir sitios de reconocimiento de enzima de restricción únicos y se confirmó la ausencia de segundas mutaciones de sitio mediante secuenciación. Se ligó el gen con pET26 y se expresó en Rosetta de E. coli (DE3). Se proporciona el mapa del vector en la figura 5. Se cultivaron las cepas de expresión y control en LB en presencia de kanamicina (25 µg/ml), cloranfenicol (12,5 µg/ml) y 1% de glucosa. A una DO580 de 1, se indujo la expresión mediante la adición de IPTG 100 µM. Se tomaron muestras a las 2, 4 y 20 horas después de la inducción. Se separaron las células del sobrenadante de cultivo mediante centrifugación, se resuspendieron después en tampón de muestra y se incubaron durante 10 minutos a 90ºC. Se aplicó una cantidad de células que presentaban una DO580 de 0,1 a un gel en gradiente de acrilamida de 4-12%, que se tiñó con azul brillante Coomasie R250.

[0261] Se detectó una fuerte sobreexpresión del gen ya 2 h después de la inducción con IPTG 100 µM, como se determina por análisis PAGE-SDS de los extractos celulares brutos de pET26_M4aE11 de Rosetta de E. coli (DE3). La cantidad de proteína que presentaba M4aE11 (tamaño calculado 23,2 kDa) aumentó adicionalmente con el tiempo.

[0262] Se determinó la actividad esterasa de extractos celulares brutos de cepas que expresan la esterasa M4aE11 “de tipo GDSL”. Se resuspendió una cantidad de células correspondiente a una DO580= 2 en 200 µl de Tris/HCl 5 mM, pH 8,0, y se lisó por ultrasonicación. Se usaron entonces 20 µl de cada muestra para determinar la actividad esterasa frente a butirato de p-nitrofenilo en un volumen total de 200 µl. Se corrigió la actividad con la actividad de fondo de la cepa de control. La actividad frente a butirato de p-nitrofenilo alcanzó aproximadamente 125 nmol/ml/min 20 h después de la inducción.

[0263] Además, se realizó el análisis PAGE-SDS de la fracción soluble e insoluble de los extractos celulares brutos de pET26_M4aE11 de Rosetta de E. coli (DE3). Se lisaron por ultrasonicación células de un cultivo inducidas con IPTG 100 µM y recogidas 4 h y 20 h después de la inducción, y se separaron en fracción soluble e insoluble por centrifugación. Se añadió tampón de muestra y se aplicaron cantidades directamente comparables de fracciones solubles e insolubles a un gel en gradiente de acrilamida al 4-12%, que se tiñó con azul brillante de Coomasie R250. Los resultados de este análisis revelaron que M4aE11 es parcialmente soluble (estimación de 80%). Se completó el cribado de la colección M091.

[0264] Por tanto, se identificaron en total 9 esterasas “de tipo GDSL” diferentes en 6 colecciones metagenómicas de inserto grande diferentes, y la colección de esterasas/lipasas de BRAIN que comprende más de 4,3 Gpb. 8 de estos genes se expresaron heterólogamente en E. coli. Se caracterizaron las muestras enzimáticas resultantes de 7 clones mediante la actividad perhidrolasa deseada. Dos de las enzimas mostraban esta actividad. La tabla 3 resume el cribado, expresión y caracterización de las esterasas “de tipo GDSL” metagenómicas.

Tabla 3: Expresión y caracterización de esterasas “de tipo GDSL” metagenómicas

Esterasa de tipo GDSL Homología1 Nivel de Solubilidad3 Actividad4 Actividad expresión2 perhidrolasa

S248_M2bB11 12,9% ++ + 136 - S248_M40cD4 14,8% +++ ++ 50 -/+6 S248_M44aA5 12,4% +++ ++ 75 -/+

+7

S261_M2aA12 36,9% ++ ++ 72 S279_M70aE8 11,9% +++ + 167 -S279_M75bA2 5,7% n.d.5 n.d. n.d. n.d.5 M091_M4aE11 33,9% +++ ++ 125 n.d. Est105 4,3% +++ --n.d. Est114 7,8% n.d. n.d. 13 -1 identidad con la enzima prototípica de M. smegmatis calculada con el algoritmo dialign (Morgenstern y col., 1996) 2 nivel de expresión: + sobreexpresión moderada, ++ sobreexpresión fuerte, +++ sobreexpresión muy fuerte, a juzgar por el análisis de PAGE-SDS3 a juzgar por el análisis de PAGE-SDS 4 frente a butirato de p-nitrofenilo, dado como nmol/(ml x min) 5 no determinado 6 actividad de perhidrólisis 2x fondo 7 actividad perhidrolasa más de 2x fondo

Modificación por ingeniería genética de la perhidrolasa

[0265] Basándose en la estructura de la perhidrolasa, se identificaron los restos que pueden alterar la

10 especificidad de sustrato (por ejemplo, Km, kcat, Vmáx, longitud de cadena, etc.) y/o la naturaleza multimérica de la proteína. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún resto particular. No obstante, se construyen colecciones de saturación de sitio de los restos D10, L12, T13, W14, W16, S54, A55, N94, K97, Y99, P 146, W149, F150, I194, F196, así como colecciones combinatorias de los restos: E51A, Y73A, H81D, T127Q y mutaciones sencillas de los restos de sitio activo D192A, H195A y una colección de saturación de sitio de D95

15 conservado. Los procedimientos para la producción de dichas colecciones son conocidos por los especialistas en la materia e incluyen kits comercialmente disponibles como el kit de mutagénesis dirigida a sitio Quikchange™ de Stratagene y/o el kit de mutagénesis dirigida Quikchange™ Multi-Site.

Actividad perhidrolasa

20 [0266] El uso de enzimas obtenidas a partir de microorganismos viene de antiguo. Es más, hay numerosos biocatalizadores conocidos en la técnica. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.240.835 proporciona una descripción de la actividad transacilasa obtenida a partir de C. oxydans y su producción. Además, la patente de EE.UU. nº 3.823.070 proporciona una descripción de una Corynebacterium que produce ciertos ácidos grasos a

25 partir de una n-parafina. La patente de EE.UU. nº 4.594.324 proporciona una descripción de una Methylcoccus capsulatus que oxida alquenos. Son conocidos en la técnica biocatalizadores adicionales (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.008.125 y 4.415.657). El documento EP 0.280.232 describe el uso de una enzima de C. oxydans en una realización entre un diol y un éster de ácido acético para producir monoacetato. Referencias adicionales describen el uso de una enzima de C. oxydans para preparar ácido hidroxicarboxílico quiral a partir de

30 un diol proquiral. Se proporcionan detalles adicionales respecto a la actividad de la transacilasa de C. oxydans, así como del cultivo de C. oxydans, preparación y purificación de la enzima, por la patente de EE.UU. n 5.240.835. Por tanto, eran conocidas las capacidades de transesterificación de esta enzima, usando principalmente ésteres de ácido acético. Sin embargo, la determinación de que esta enzima podría llevar a cabo una reacción de perhidrólisis era bastante inesperada. Era incluso más sorprendente que estas enzimas exhibieran eficacias muy altas en

35 reacciones de perhidrólisis. Por ejemplo, en presencia de tributirina y agua, la enzima actúa produciendo ácido butírico, mientras que en presencia de tributirina, agua y peróxido de hidrógeno, la enzima actúa produciendo principalmente ácido peracético y muy poco ácido butírico. Esta alta relación de perhidrólisis a hidrólisis es una propiedad única exhibida por la clase de enzimas perhidrolasas de la presente invención y es una característica única que no es exhibida por lipasas, cutinasas ni esterasas descritas anteriormente.

[0267] La perhidrolasa de la presente invención es activa en un amplio intervalo de pH y temperatura y acepta un amplio intervalo de sustratos para transferencia de acilo. Los aceptores incluyen agua (hidrólisis), peróxido de hidrógeno (perhidrólisis) y alcoholes (transferencia de acilo clásica). Para las medidas de perhidrólisis, se incuba la enzima en un tampón de elección a una temperatura especificada con un sustrato éster en presencia de peróxido de hidrógeno. Los sustratos típicos usados para medir la perhidrólisis incluyen ésteres tales como acetato de etilo, triacetina, tributirina, ésteres acetato de neodol etoxilados y otros. Además, la enzima natural hidroliza nitrofenilésteres de ácidos de cadena corta. Estos últimos son sustratos convenientes para medir la concentración de enzima. Pueden medirse perácido y ácido acético mediante los ensayos descritos en la presente memoria. Se describe también la hidrólisis de nitrofeniléster.

[0268] Aunque el ejemplo primario usado durante el desarrollo de la presente invención es la perhidrolasa de

M. smegmatis, cualquier perhidrolasa obtenida a partir de cualquier fuente que convierta el éster mayoritariamente en perácidos en presencia de peróxido de hidrógeno encuentra uso en la presente invención.

Sustratos

[0269] En algunas realizaciones preferidas de la presente invención, se utilizan ésteres que comprenden ácidos carboxílicos alifáticos y/o aromáticos y alcoholes con las enzimas perhidrolasas de la presente invención. En algunas realizaciones preferidas, los sustratos se seleccionan de uno o más de los siguientes: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. En realizaciones adicionales, triacetina, tributirina, ésteres de neodol y/o ésteres de neodol etoxilados sirven como donantes de acilo para la formación de perácido.

Formulaciones limpiadoras y detergentes

[0270] Las composiciones detergentes de la presente invención se proporcionan en cualquier forma adecuada incluyendo, por ejemplo, como diluyente líquido, en gránulos, en emulsiones, en geles y pastas. Cuando se emplea una composición detergente sólida, el detergente se formula preferiblemente como gránulos. Preferiblemente, los gránulos se formulan conteniendo adicionalmente un agente protector (véase, por ejemplo, la solicitud de EE.UU. nº de serie 07/642.669, presentada el 17 de enero de 1991).

[0271] Igualmente, en algunas realizaciones, los gránulos se formulan de modo que contengan materiales para reducir la velocidad de disolución del gránulo en el medio de lavado (véase la patente de EE.UU. nº 5.254.283).

[0272] Además, las enzimas perhidrolasas de la presente invención encuentran uso en formulaciones en que están presentes sustrato y enzima en el mismo gránulo. Por tanto, en algunas realizaciones, la eficacia de la enzima aumenta por la provisión de altas concentraciones locales de enzima y sustrato (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. US2003/0191033).

[0273] Muchas de las variantes de proteína de la presente invención son útiles en la formulación de diversas composiciones detergentes. Una serie de compuestos conocidos son tensioactivos adecuados útiles en composiciones que comprenden los mutantes de proteína de la invención. Estos incluyen detergentes no iónicos, catiónicos, aniónicos o bipolares (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.404.128 y 4.261.868). Es una formulación de detergente adecuada la descrita en la patente de EE.UU. nº 5.204.015. Los especialistas en la materia están familiarizados con las diferentes formulaciones que encuentran uso como composiciones limpiadoras. Como se indica anteriormente, en algunas realizaciones preferidas, las composiciones detergentes de la presente invención emplean un agente tensioactivo que incluye tensioactivos aniónicos, no iónicos y anfolíticos bien conocidos por su uso en composiciones detergentes. Se describen algunos tensioactivos adecuados para uso en la presente invención en la solicitud de patente del Reino Unido nº 2.094.826 A. En algunas realizaciones, se usan mezclas de tensioactivos en la presente invención.

[0274] Los tensioactivos aniónicos adecuados para uso en la composición detergente de la presente invención incluyen alquilbencenosulfonatos lineales o ramificados; alquil-o alqueniletersulfatos que tienen grupos alquilo o grupos alquenilo lineales o ramificados; alquisulfatos o alquenilsulfatos; olefinosulfonatos; alcanosulfonatos y similares. Los contraiones adecuados para tensioactivos aniónicos incluyen iones de metales alcalinos tales como sodio y potasio, iones de metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio, ión amonio y alcanolaminas que tienen de 1 a 3 grupos alcanol de número de carbonos 2 o 3.

[0275] Los tensioactivos anfolíticos que encuentran uso en la presente invención incluyen sulfonatos de sal de amonio cuaternario, tensioactivos anfolíticos de tipo betaína y similares. Dichos tensioactivos anfolíticos tienen tanto grupos cargados positivos como negativos en la misma molécula.

[0276] Los tensioactivos no iónicos que encuentran uso en la presente invención comprenden generalmente polioxialquilenéteres, así como alcanolamidas de ácido graso superior o aductos de óxido de alquileno de las mismas, monoésteres de glicerina de ácido graso y similares.

[0277] En algunas realizaciones preferidas, el tensioactivo o mezcla tensioactiva incluido en las composiciones detergentes de la presente invención se proporciona en una cantidad de aproximadamente 1% en peso a aproximadamente 95% en peso de la composición detergente total, y preferiblemente de aproximadamente 5% en peso a aproximadamente 45% en peso de la composición de detergente total. En diversas realizaciones, se incluyen numerosos otros componentes en las composiciones de la presente invención. Muchos de estos se describen a continuación. No se pretende que la presente invención esté limitada a estos ejemplos específicos. Es más, se contempla que compuestos adicionales encontrarán uso en la presente invención. Las descripciones ilustran meramente algunos componentes opcionales.

[0278] Las proteínas, particularmente la perhidrolasa de la presente invención, pueden formularse en detergentes en polvo y líquidos conocidos que tienen un pH entre 3 y 12,0, a niveles de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 5% (preferiblemente de 0,1 a 0,5%) en peso. En algunas realizaciones, estas composiciones limpiadoras detergentes incluyen adicionalmente otras enzimas tales como proteasas, amilasas, mananasas, peroxidasas, oxidorreductasas, celulasas, lipasas, cutinasas, pectinasas, pectina liasas, xilanasas y/o endoglucosidasas, así como agentes de refuerzo y estabilizadores.

[0279] Además de las composiciones limpiadoras típicas, se entiende fácilmente que las variantes de perhidrolasa de la presente invención encuentran uso en cualquier fin en que se use la enzima nativa o natural. Por tanto, pueden usarse dichas variantes, por ejemplo, en aplicaciones de jabón en barra y líquido, formulaciones para el cuidado de la vajilla, aplicaciones de limpieza de superficies, disoluciones o productos de limpieza de lentes de contacto, tratamiento de desechos, aplicaciones textiles, blanqueamiento de pulpa, desinfectantes, cuidado de la piel, cuidado oral, cuidado del cabello, etc. Es más, no se pretende que ninguna variante de la perhidrolasa de la presente invención esté limitada a ningún uso particular. Por ejemplo, las variantes de perhidrolasa de la presente invención pueden comprender, además de una alergenicidad reducida, un rendimiento potenciado en una composición detergente (en comparación con la perhidrolasa natural o no modificada).

[0280] La adición de proteínas a composiciones limpiadoras convencionales no crea ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuado para el detergente es también adecuado para las presentes composiciones, a condición de que el pH esté dentro del intervalo en que la enzima o enzimas son activas, y que la temperatura esté por debajo de la temperatura de desnaturalización de la proteína descrita. Además, las proteínas de la invención encuentran uso en composiciones limpiadoras, blanqueamiento y desinfección sin detergentes, de nuevo solas o en combinación con una fuente de peróxido de hidrógeno, un sustrato éster (por ejemplo, añadido o inherente al sistema utilizado, tal como con manchas que contienen ésteres, pulpa que contiene ésteres, etc.), otras enzimas, tensioactivos, agentes de refuerzo, estabilizadores, etc. Es más, no se pretende que la presente invención esté limitada a ninguna formulación ni aplicación particular.

Sustratos

[0281] En algunas realizaciones preferidas de la presente invención, se utilizan ésteres que comprenden ácidos carboxílicos alifáticos y/o aromáticos y alcoholes con las enzimas perhidrolasas en las formulaciones detergentes de la presente invención. En algunas realizaciones preferidas, los sustratos se seleccionan de uno o más de los siguientes: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. Por tanto, en algunas realizaciones preferidas, se proporcionan detergentes que comprenden al menos una perhidrolasa, al menos una fuente de peróxido de hidrógeno y al menos un éster de ácido.

Hidrolasas

[0282] Además de la perhidrolasa descrita en la presente memoria, diversas hidrolasas encuentran uso en la presente divulgación incluyendo, pero sin limitación, hidrolasa de éster carboxilato, hidrolasa de tioéster, hidrolasa de monoéster fosfato e hidrolasa de diéster fosfato, que actúan sobre enlaces éster; una hidrolasa de tioéter que actúa sobre enlace éter y α-aminoacilpeptido hidrolasa, peptidilaminoácido hidrolasa, acilaminoácido hidrolasa, dipéptido hidrolasa y peptidilpéptido hidrolasa, que actúan sobre enlaces peptídicos, teniendo todas estas enzimas altas relaciones de perhidrólisis a hidrólisis (por ejemplo, >1). Se prefieren entre ellas éster carboxilato hidrolasa y peptidilpéptido hidrolasa. Las hidrolasas adecuadas incluyen: (1) proteasas que pertenecen a la clase de peptilpéptido hidrolasas (por ejemplo, pepsina, pepsina B, renina, tripsina, quimotripsina A, quimotripsina B, elastasa, enterocinasa, catepsina C, papaína, quimopapaína, ficina, trombina, fibrinolisina, renina, subtilisina, aspergilopeptidasa A, colagenasa, clostridiopeptidasa B, calicreína, gastrisina, catepsina D, bromelina, queratinasa, quimotripsina C, pepsina C, aspergilopeptidasa B, urocinasa, carboxipeptidasa A y B y aminopeptidasa); (2) éster carboxilato hidrolasas, incluyendo carboxilo esterasa, lipasa, pectina esterasa y clorofilasa y (3) enzimas que tienen altas relaciones de perhidrólisis a hidrólisis. Son especialmente eficaces entres ellas las lipasas, así como esterasas que exhiben altas relaciones de perhidrólisis a hidrólisis, así como esterasas cutinasas y lipasas modificadas por ingeniería de proteínas usando los rasgos estructurales primarios, secundarios, terciarios y/o cuaternarios de las perhidrolasas de la presente invención.

[0283] La hidrolasa se incorpora a la composición detergente como se requiera según su fin. Debería incorporarse preferiblemente en una cantidad de 0,0001 a 5% en peso, y más preferiblemente de 0,02 a 3% en peso. Esta enzima debería usarse en forma de gránulos compuestos de enzima bruta sola o en combinación con otras enzimas y/o componentes en la composición detergente. Los gránulos de enzima bruta se usan en una cantidad tal que la enzima purificada sea de 0,001 a 50% en peso de los gránulos. Se usan los gránulos en una cantidad de 0,002 a 20, y preferiblemente, de 0,1 a 10% en peso. En algunas realizaciones, se formulan los gránulos para contener un agente protector de enzima y un material retardante de la disolución (concretamente, material que regula la disolución de los gránulos durante el uso).

Tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga

[0284] Dichos tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga incluyen sales de ácido saturado o graso o sales de ácido alquil- o alqueniletercarboxílico, sales o ésteres de ácido α-sulfograso, tensioactivos de tipo aminoácido, tensioactivos de éster fosfato, sales de amonio cuaternario, incluyendo aquellas que tienen 3 a 4 sustituyentes alquilo y hasta 1 sustituyente alquilo sustituido con fenilo. Los tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga adecuados incluyen los dados a conocer en la solicitud de patente del Reino Unido nº 2.094.826 A. La composición puede contener de aproximadamente 1 a aproximadamente 20% en peso de dichos tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga.

Agentes de refuerzo

[0285] En algunas realizaciones de la presente invención, la composición contiene de aproximadamente 0 a aproximadamente 50% en peso de uno o más componentes agentes de refuerzo seleccionados del grupo constituido por sales de metales alcalinos y sales de alcanolamina de los siguientes compuestos: fosfatos, fosfonatos, fosfonocarboxilatos, sales de aminoácidos, aminopoliacetatos, electrolitos de alto peso molecular, polímeros no disociantes, sales de ácidos dicarboxílicos y sales de aluminosilicato. Se dan a conocer ejemplos de agentes secuestrantes divalentes adecuados en la solicitud de patente del Reino Unido nº 2.094.826 A.

[0286] En realizaciones adicionales, las composiciones de la presente invención contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 50% en peso, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 30% en peso, basado en la composición de una o más sales de metales alcalinos de los siguientes compuestos como bases o electrolitos inorgánicos: silicatos, carbonatos y sulfatos, así como bases orgánicas tales como trietanolamina, dietanolamina, monoetanolamina y triisopropanolamina.

Agentes antirredeposición

[0287] En más realizaciones adicionales de la presente invención, las composiciones contienen de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5% en peso de uno o más de los siguientes compuestos como agentes antirredeposición: polietilenglicol, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y carboximetilcelulosa. En algunas realizaciones preferidas, se utiliza una combinación de carboximetilcelulosa y/o polietilenglicol con la composición de la presente invención como composiciones útiles para retirar la suciedad.

Agentes blanqueantes [0288] El uso de las perhidrolasas de la presente invención en combinación con agentes blanqueantes adicionales, tales como percarbonato de sodio, perborato de sodio, aducto de sulfato de sodio/peróxido de hidrógeno y aducto de cloruro de sodio/peróxido de hidrógeno y/o un tinte blanqueante fotosensible tal como sal de cinc o aluminio de ftalocianina sulfonada, mejora adicionalmente los efectos detergentes. En realizaciones adicionales, se usan las perhidrolasas de la presente invención en combinación con reforzantes del blanqueamiento (por ejemplo, TAED y/o NOBS).

Agentes azulantes y tintes fluorescentes

[0289] En algunas realizaciones de la presente invención, se incorporan agentes azulantes y tintes fluorescentes a la composición. Se dan a conocer ejemplos de agentes azulantes y tintes fluorescentes adecuados en la solicitud de patente del Reino Unido nº 2.094.826 A.

Inhibidores del apelmazamiento

[0290] En algunas realizaciones de la presente invención en que la composición es en polvo o sólida, se incorporan inhibidores del apelmazamiento a la composición. Los ejemplos de inhibidores del apelmazamiento adecuados incluyen sales del ácido p-toluenosulfónico, sales del ácido xilenosulfónico, sales del ácido acético, sales del ácido sulfosuccínico, talco, sílice finamente pulverizada, arcilla, silicato de calcio (por ejemplo, Micro-Cell de Johns Manville Co.), carbonato de calcio y óxido de magnesio.

Antioxidantes

[0291] Los antioxidantes incluyen, por ejemplo, terc-butilhidroxitolueno, 4,4’-butilidenbis-(6-terc-butil-3metilfenol), 2,2’-butilidenbis-(6-terc-butil-4-metilfenol), cresol monoestirenado, cresol diestirenado, fenol monoestirenado, fenol diestirenado y 1,1-bis-(4-hidroxifenil)ciclohexano.

Solubilizadores

[0292] En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen también solubilizadores incluyendo, pero sin limitación, alcoholes inferiores (por ejemplo, etanol, sales de bencenosulfonato y sales de alquilbencenosulfonato inferior tales como sales de p-toluenosulfonato), glicoles tales como propilenglicol, sales de acetilbencenosulfonato, acetamidas, amidas del ácido piridindicarboxílico, sales de benzoato y urea.

[0293] En algunas realizaciones, la composición detergente de la presente invención se usa en un amplio intervalo de pH desde pH ácido a alcalino. En una realización preferida, la composición detergente de la presente invención se usa en medios de lavado detergente moderadamente ácidos, neutros o alcalinos, que tienen un pH de más de 4 a no más de aproximadamente 12.

[0294] Además de los ingredientes descritos anteriormente, perfumes, tampones, conservantes, tintes y similares encuentran también uso en la presente invención. Estos compuestos se proporcionan en concentraciones y formas conocidas por los especialistas en la materia.

[0295] En algunas realizaciones, las bases de detergente en polvo de la presente invención se preparan mediante cualquier procedimiento de preparación conocido incluyendo un procedimiento de secado por pulverización y un procedimiento de granulación. Se prefieren las bases de detergente obtenidas particularmente mediante el procedimiento de secado por pulverización y/o granulación con secado por pulverización. La base de detergente obtenida mediante el procedimiento de secado por pulverización no está limitada con respecto a las condiciones de preparación. La base de detergente obtenida mediante el procedimiento de secado por pulverización es gránulos huecos que se obtienen pulverizando una suspensión densa acuosa de ingredientes termorresistentes, tales como agentes tensioactivos y agentes de refuerzo, en un espacio caliente. Después del secado por pulverización, pueden añadirse perfumes, enzimas, agentes blanqueantes y agentes de refuerzo alcalinos inorgánicos. Con una base de detergente granular obtenida tal como mediante el procedimiento de secado por pulverización, pueden añadirse también diversos ingredientes después de la preparación de la base.

[0296] Cuando la base detergente es un líquido, puede estar en disolución homogénea o en dispersión no homogénea.

[0297] Las composiciones detergentes de esta invención pueden incubarse con tela, por ejemplo tela sucia, en usos industriales y domésticos a las temperaturas, tiempos de reacción y relaciones de baño empleadas convencionalmente en estos entornos. Las condiciones de incubación (concretamente, las condiciones eficaces para tratar materiales con las composiciones detergentes según la presente invención) son fácilmente determinables por los especialistas en la materia. En consecuencia, las condiciones apropiadas eficaces para el tratamiento con los presentes detergentes corresponden a aquellas que usan composiciones detergentes similares que incluyen perhidrolasa natural.

[0298] Como se indica anteriormente, pueden formularse adicionalmente los detergentes según la presente invención como prelavado a la disolución apropiada a un pH intermedio en que existe suficiente actividad para proporcionar las mejoras deseadas en suavizamiento, desapelmazamiento, prevención del apelmazamiento, retirada

o limpieza de fibras de superficie. Cuando la composición detergente es una composición de prerremojo (por ejemplo, prelavado o pretratamiento), en forma de composición líquida, pulverizador, gel o pasta, la enzima perhidrolasa se emplea generalmente de aproximadamente 0,00001% a aproximadamente 5% en peso basada en el peso total de la composición de prerremojo o pretratamiento. En dichas composiciones, puede emplearse opcionalmente un tensioactivo, y cuando se emplea, está generalmente presente a una concentración de aproximadamente 0,0005 a aproximadamente 1% en peso basada en el peso total del prerremojo. El resto de la composición comprende componentes convencionales usados en el prerremojo (por ejemplo, diluyente, tampones, otras enzimas (proteasas), etc.) a sus concentraciones convencionales.

Composiciones limpiadoras que comprenden perhidrolasa

[0299] Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden emplearse ventajosamente, por ejemplo, en aplicaciones de lavandería, limpieza de superficies duras, aplicaciones lavavajillas automáticas, así como aplicaciones cosméticas tales como en dentaduras, dientes, cabello y piel. Sin embargo, debido a las ventajas únicas de eficacia aumentada en disoluciones a menor temperatura y al superior perfil de seguridad del color, las enzimas de la presente invención son idealmente adecuadas para aplicaciones de lavandería tales como el blanqueamiento de telas. Además, las enzimas de la presente invención encuentran uso tanto en composiciones granulares como líquidas.

[0300] Las enzimas de la presente invención encuentran uso también en productos aditivos limpiadores. Los productos aditivos limpiadores, incluyendo las enzimas de la presente invención, son idealmente adecuados para inclusión en procesos de lavado en que se desea una eficacia de blanqueamiento adicional. Dichos casos incluyen, pero sin limitación aplicaciones de limpieza en disolución a baja temperatura. El producto aditivo puede ser, en su forma más sencilla, una o más de las enzimas de la presente invención. Dicho aditivo puede empaquetarse en una forma de dosificación para adición a un proceso de limpieza en que se emplea una fuente de peroxígeno y se desea una eficacia de blanqueamiento aumentada. Dicha forma de dosificación unitaria puede comprender una píldora, comprimido, cápsula de gelatina u otra unidad de dosificación unitaria tal como polvos o líquidos premedidos. Puede incluirse una carga o material portador para aumentar el volumen de dicha composición. Los materiales de carga o portadores adecuados incluyen, pero sin limitación, diversas sales de sulfato, carbonato y silicato, así como talco, arcilla y similares. Los materiales de carga o portadores para composiciones líquidas pueden ser agua o alcoholes primarios y secundarios de bajo peso molecular, incluyendo polioles y dioles. Los ejemplos de dichos alcoholes incluyen, pero sin limitación: metanol, etanol, propanol e isopropanol. Las composiciones pueden contener de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 90% de dichos materiales. Pueden usarse cargas ácidas para reducir el pH. Como alternativa, el aditivo limpiador puede incluir una fuente de peroxígeno activado definida a continuación o los ingredientes adjuntos definidos a continuación.

[0301] Las composiciones limpiadoras y aditivos limpiadores de la presente invención requieren una cantidad eficaz de las enzimas proporcionadas por la presente invención. El nivel necesario de enzima puede conseguirse mediante la adición de una o más especies de perhidrolasa de M. smegmatis, variantes, homólogos y/u otras enzimas o fragmentos enzimáticos que tengan la actividad de las enzimas de la presente invención. Típicamente, las composiciones limpiadoras de la presente invención comprenden al menos un 0,001% en peso, de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1, de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,5 o incluso de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1% en peso de al menos una enzima de la presente invención.

[0302] En algunas realizaciones, las composiciones limpiadoras de la presente invención comprenden un material seleccionado del grupo constituido por una fuente de peroxígeno, peróxido de hidrógeno y mezclas de los mismos, estando seleccionada dicha fuente de peroxígeno del grupo constituido por:

(i) de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20, o incluso de aproximadamente 1 a aproximadamente 10% en peso de una sal de perácido, un peroxiácido orgánico, complejo de peróxido de hidrógeno y urea y mezclas de los mismos;

(ii) de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20, o incluso de aproximadamente 1 a 10% en peso de un carbohidrato y de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1, de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,5, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1% en peso de carbohidrato oxidasa y

(iii) mezclas de los mismos. [0303] Las sales de perácidos adecuados incluyen aquellas seleccionadas del grupo constituido por perborato de metal alcalino, percarbonato de metal alcalino, perfosfatos de metal alcalino, persulfatos de metal alcalino y mezclas de las mismas.

[0304] El carbohidrato puede seleccionarse del grupo constituido por monocarbohidratos, dicarbohidratos, tricarbohidratos, oligocarbohidratos y mezclas de los mismos. Los carbohidratos adecuados incluyen carbohidratos seleccionados del grupo constituido por D-arabinosa, L-arabinosa, D-celobiosa, 2-desoxi-D-galactosa, 2-desoxi-Dribosa, D-fructosa, L-fucosa, D-galactosa, D-glucosa, D-glicero-D-guloheptosa, D-lactosa, D-lixosa, L-lixosa, Dmaltosa, D-manosa, melecitosa, L-melibiosa, palatinosa, D-rafinosa, L-ramnosa, D-ribosa, L-sorbosa, estaquiosa, sacarosa, D-trehalosa, D-xiosa, L-xilosa y mezclas de las mismas.

[0305] Las carbohidrato oxidasas adecuadas incluyen carbohidrato oxidasas seleccionadas del grupo constituido por aldosa oxidasa (clasificación IUPAC EC 1.1.3.9), galactosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.9), celobiosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.25), piranosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.10), sorbosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.11) y/o hexosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.5), glucosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.4) y mezclas de las mismas.

[0306] En algunas realizaciones preferidas, las composiciones limpiadoras de la presente invención incluyen también de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 99,9, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0,1 a 20, o incluso de aproximadamente 1 a aproximadamente 15% en peso de una molécula que comprende un resto éster. Las moléculas adecuadas que comprenden un resto éster pueden tener la fórmula:

R1Ox[(R2)m(R3)n]p en la que R1 es un resto seleccionado del grupo constituido por H o un alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, arilalquilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos; en un aspecto de la presente invención, R1 puede comprender de 1 a 50.000 átomos de carbono, de 1 a 10.000 átomos de carbono, o incluso de 2 a 100 átomos de carbono;

cada R2 es un resto alcoxilato, en un aspecto de la presente invención, cada R2 es independientemente un resto etoxilato, propoxilato o butoxilato;

R3 es un resto formador de éster que tiene la fórmula:

R4CO- en la que R4 puede ser H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos; en un aspecto de la presente invención, R4 puede ser un resto alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o no sustituido que comprende de 1 a 22 átomos de carbono, un resto alquilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo que comprende de 4 a 22 átomos de carbono, o R4 puede ser un resto alquilo C1-C22 sustituido o no sustituido o

R4 puede ser un resto alquilo C1-C12 sustituido o no sustituido;

x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un entero que es menor o igual al número de carbonos de R1

p es un entero que es menor o igual a x

m es un entero de 0 a 50, un entero de 0 a 18 o un entero de 0 a 12, yn es al menos 1.

[0307] En un aspecto de la presente invención, la molécula que comprende un resto éster es un resto etoxilato o propoxilato de alquilo que tiene la fórmula R1Ox[(R2)m(R3)n]p en la que:

R1 es un resto alquilo o heteroalquilo C2-C32 sustituido o no sustituido; cada R2 es independientemente un resto etoxilato o propoxilato;

R3 es un resto formador de éster que tiene la fórmula:

R4CO-, en la que R4 puede ser H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos; en un aspecto de la presente invención, R4 puede ser un resto alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o no sustituido que comprende de 1 a 22 átomos de carbono, un resto arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo sustituido o no sustituido que comprende de 4 a 22 átomos de carbono, o R4 puede ser un resto alquilo C1-C22 sustituido o no sustituido, o R4 puede ser un resto alquilo C1-C12 sustituido o no sustituido;

x es un entero que es menor o igual al número de carbonos de R1

p es un entero que es menor o igual a x

m es un entero de 1 a 12, y n es al menos 1.

[0308] En un aspecto de la presente invención, la molécula que comprende el resto éster tiene la fórmula:

R1Ox[(R2)m(R3)n]p en la que R1 es H o un resto que comprende un resto amino primario, secundario, terciario o cuaternario, estando seleccionado dicho resto R1 que comprende un resto amino del grupo constituido por un alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituido o no sustituido; en un aspecto de la invención de los solicitantes, R1 puede comprender de 1 a 50.000 átomos de carbono, de 1 a 10.000 átomos de carbono, o incluso de 2 a 100 átomos de carbono;

cada R2 es un resto alcoxilato; en un aspecto de la presente invención, cada R2 es independientemente un resto etoxilato, propoxilato o butoxilato;

R3 es un resto formador de éster que tiene la fórmula:

R4CO- en la que R4 puede ser H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos; en un aspecto de la presente invención, R4 puede ser un resto alquilo alquenilo o alquinilo sustituido o no sustituido que comprende de 1 a 22 átomos de carbono, un resto alquilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo sustituido o no sustituido que comprende de 4 a 22 carbonos, o R4 puede ser un resto alquilo C1-C22 sustituido o no sustituido, o R4 puede ser un resto alquilo C1-C12 sustituido o no sustituido;

x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un entero que es menor o igual al número de carbonos en

R1

p es un entero que es menor o igual a x m es un entero de 0 a 12 o incluso de 1 a 12, y n es al menos 1.

[0309] En cualquiera de los aspectos anteriormente mencionados de la presente invención, la molécula que comprende un resto éster puede tener un peso molecular medio ponderado menor de 600.000 Da, menor de

300.000 Da, menor de 100.000 Da o incluso menor de 60.000 Da.

[0310] Las moléculas adecuadas que comprenden un resto éster incluyen policarbohidratos que comprenden un resto éster.

[0311] Las composiciones limpiadoras proporcionadas en la presente memoria se formularán típicamente de tal modo que, durante el uso en operaciones de limpieza acuosas, el agua de lavado tendrá un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 11,5, o incluso de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 10,5. Las formulaciones de producto líquido se formulan típicamente para tener un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 9,0. Los productos de lavandería granulares se formulan típicamente para tener un pH de aproximadamente 9 a aproximadamente 11. Las técnicas para controlar el pH a los niveles de uso recomendados incluyen el uso de tampones, bases, ácidos, etc., y son bien conocidas por los especialistas en la materia.

[0312] Cuando la enzima o enzimas de la presente invención se emplean en una composición granular o líquida, puede ser deseable para la enzima o enzimas estar en forma de una partícula encapsulada para proteger a dicha enzima de otros componentes de la composición granular durante el almacenamiento. Además, la encapsulación es también un medio de controlar la disponibilidad de la enzima o enzimas durante el proceso de limpieza, y puede potenciar el rendimiento de la enzima o enzimas. A este respecto, la enzima o enzimas pueden encapsularse con cualquier material encapsulante conocido en la técnica.

[0313] El material encapsulante encapsula típicamente al menos una parte de la enzima o enzimas. Típicamente, el material encapsulante es hidrosoluble y/o hidrodispersable. El material encapsulante puede tener una temperatura de transición vítrea (Tg) de 0ºC o mayor. La temperatura de transición vítrea se describe con más detalle en el documento WO 97/11151, especialmente en la página 6, línea 25 a página 7, línea 2.

[0314] El material encapsulante puede seleccionarse del grupo constituido por carbohidratos, gomas naturales o sintéticas, quitina y quitosano, celulosa y derivados de celulosa, silicatos, fosfatos, boratos, poli(alcohol vinílico), polietilenglicol, ceras de parafina y combinaciones de los mismos. Cuando el material encapsulante es un carbohidrato, puede seleccionarse típicamente del grupo constituido por monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y combinaciones de los mismos. Típicamente, el material encapsulante es un almidón. Se describen almidones adecuados en los documentos EP 0.922.499; US 4.977.252; US 5.354.559 y US 5.935.826.

[0315] El material encapsulante puede ser una microesfera compuesta por plástico tal como termoplástico, acrilonitrilo, metacrilonitrilo, poliacrilonitrilo, polimetacrilonitrilo y mezclas de los mismos; son microesferas comercialmente disponibles que pueden usarse las suministradas por Expancel de Stockviksverken, Suecia, con la marca comercial EXPANCEL®, y las suministradas por PQ Corp. de Valley Forge, Pensilvania, EE.UU., con el nombre comercial PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® y SPHERICEL®.

Procedimientos para preparar y usar las composiciones limpiadoras de la presente invención

[0316] Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden formularse en cualquier forma adecuada y prepararse mediante cualquier proceso elegido por el formulador, de los que se describen ejemplos no limitantes en los documentos U.S. 5.879.584; U.S. 5.691.297; U.S. 5.574.005; U.S. 5.569.645; U.S. 5.565.422 Del Greco y col.; U.S. 5.516.448; U.S. 5.489.392 y U.S. 5.486.303.

Materiales auxiliares además de las enzimas de la presente invención, peróxido de hidrógeno y/o fuente de peróxido de hidrógeno y material que comprende un resto éster

[0317] Aunque no son esenciales para los fines de la presente invención, la lista no limitante de auxiliares mostrada a continuación en la presente memoria es adecuada para uso en las composiciones limpiadoras actuales y puede incorporarse deseablemente a ciertas realizaciones de la invención, por ejemplo, para ayudar o potenciar el rendimiento de limpieza, para el tratamiento del sustrato que se va a limpiar o para modificar la estética de la composición limpiadora, como es el caso de perfumes, colorantes tintes o similares. Se entiende que dichos auxiliares están además de de las enzimas de la presente invención, peróxido de hidrógeno, fuente de peróxido de hidrógeno y/o material que comprende un resto éster. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales, y los niveles de incorporación de los mismos, dependerá de la forma física de la composición y de la naturaleza de la operación de limpieza para la que se vaya a usar. Los materiales auxiliares adecuados incluyen, pero sin limitación, tensioactivos, agentes de refuerzo, agentes quelantes, agentes inhibidores de la transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas adicionales y estabilizadores enzimáticos, materiales catalíticos, activadores de blanqueamiento, reforzadores de blanqueamiento, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de retirada de la suciedad de arcilla/antirredeposición, abrillantadores, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, agentes elastificantes de la estructura, suavizantes de la tela, vehículos, hidrotropos, auxiliares de procesamiento y/o pigmentos. Además de la divulgación siguiente, se encuentran ejemplos adecuados de dichos otros auxiliares y niveles de uso en las patentes de EE.UU. nº 5.576.282, 6.306.812 y 6.326.348. Los ingredientes auxiliares anteriormente mencionados pueden constituir el resto de las composiciones limpiadoras de la presente invención.

[0318] Tensioactivos- las composiciones limpiadoras según la presente invención pueden comprender un tensioactivo o sistema tensioactivo en el que el tensioactivo puede seleccionarse de tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos anfolíticos, tensioactivos bipolares, tensioactivos no iónicos semipolares y mezclas de los mismos.

[0319] El tensioactivo está típicamente presente a un nivel de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60%, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50% o incluso de aproximadamente 5 a aproximadamente 40% en peso de la composición limpiador en cuestión.

[0320] Agentes de refuerzo- las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden comprender uno

o más agentes de refuerzo de detergente o sistemas agentes de refuerzo. Cuando se usa un coadyuvante, la composición limpiadora en cuestión comprenderá típicamente al menos aproximadamente un 1%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 60% o incluso de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% de coadyuvante en peso de la composición limpiadora en cuestión.

[0321] Los agentes de refuerzo incluyen, pero sin limitación, las sales de metal alcalino, amonio y polifosfatos de alcanolamonio, silicatos de metal alcalino, carbonatos de metal alcalinotérreo y alcalino, agentes de refuerzo de aluminosilicato, compuestos de policarboxilato, eterhidroxipolicarboxilatos, copolímeros de anhídrido maleico con etileno o vinilmetiléter, ácido 1,3,5-trihidroxibenceno-2,4,6-trisulfónico y ácido carboximetiloxisuccínico, las diversas sales de metal alcalino, de amonio y de amonio sustituido de ácidos poliacéticos tales como ácido etilendiaminotetraacético y ácido nitrilotriacético, así como policarboxilatos tales como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, ácido benceno-1,3,5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico y sales solubles de los mismos.

[0322] Agentes quelantes- Las composiciones de limpieza de la presente memoria pueden contener un agente quelante. Los agentes quelantes adecuados incluyen agentes quelantes de cobre, hierro y/o manganeso y mezclas de los mismos.

[0323] Cuando se usa un agente quelante, la composición limpiadora puede comprender de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 15% o incluso de aproximadamente 3,0% a aproximadamente 10% de agente quelante en peso de la composición limpiadora en cuestión.

[0324] Auxiliar de deposición- Las composiciones limpiadoras de la presente memoria pueden contener un auxiliar de deposición. Los auxiliares de deposición adecuados incluyen polietilenglicol, polipropilenglicol, policarboxilato, polímeros liberadores de suciedad tales como poli(ácido tereftálico), arcillas tales como caolinita, montmorillonita, atapulgita, ilita, bentonita, haloisita y mezclas de las mismas.

[0325] Agentes inhibidores de la transferencia de tinte- Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden incluir también uno o más agentes inhibidores de la transferencia de tinte. Los agentes inhibidores de la transferencia de tinte poliméricos adecuados incluyen, pero sin limitación, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de los mismos.

[0326] Cuando están presentes en una composición limpiadora en cuestión, los agentes inhibidores de la transferencia de tinte pueden estar presentes a niveles de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5% o incluso de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 3% en peso de la composición limpiadora.

[0327] Dispersantes – las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden contener también dispersantes. Los materiales orgánicos hidrosolubles adecuados incluyen los ácidos homopoliméricos o copoliméricos o sus sales, en que el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono.

[0328] Enzimas – Las composiciones limpiadoras pueden comprender una o más enzimas detergentes que proporcionan beneficios al rendimiento de limpieza y/o al cuidado de la tela. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero sin limitación, hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, queratinasas, reductasas, oxidadas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, β-glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasas, condroitinasas, lacasas y amilasas, o mezclas de las mismas. Es una combinación típica el cóctel de enzimas aplicables convencional como proteasa, lipasa, cutinasa y/o celulasa junto con amilasa.

[0329] Estabilizadores enzimáticos-Las enzimas para uso en detergentes pueden estabilizarse mediante diversas técnicas. Las enzimas empleadas en la presente memoria pueden estabilizarse en presencia de fuentes hidrosolubles de iones de calcio y/o magnesio en las composiciones acabadas que proporcionan dichos iones a las enzimas.

[0330] Complejos metálicos catalíticos- Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden incluir complejos metálicos catalíticos. Es un tipo de catalizador de blanqueamiento que contiene metal un sistema catalizador que comprende un catión de metal de transición de actividad catalítica blanqueante definida, tal como cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, wolframio, molibdeno o manganeso, un catión metálico auxiliar que tiene poca o ninguna actividad catalítica blanqueante, tal como cationes de cinc o aluminio, y un secuestrante que tiene constantes de estabilidad definidas para los cationes metálicos catalíticos y auxiliares, particularmente ácido etilendiaminotetraacético, ácido etilendiaminotetra(metilenfosfórico) y sales hidrosolubles de los mismos. Dichos catalizadores se dan a conocer en el documento U.S. 4.430.243.

[0331] Si se desea, las composiciones de la presente memoria pueden catalizarse mediante un compuesto de manganeso. Dichos compuestos y los niveles de uso son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los catalizadores basados en manganeso dados a conocer en el documento U.S. 5.576.282.

[0332] Son conocidos catalizadores blanqueantes de cobalto útiles en la presente memoria y se describen, por ejemplo, en los documentos U.S. 5.597.936 y U.S. 5.595.967. Dichos catalizadores de cobalto se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos, tales como los enseñados, por ejemplo, en los documentos U.S.

5.597.936 y U.S. 5.595.967.

[0333] Las composiciones de la presente memoria pueden incluir también adecuadamente un complejo de metal de transición de un ligando rígido macropolicíclico, abreviado como “MRL”. A modo práctico, y no a modo de limitación, las composiciones y procesos de limpieza de la presente memoria pueden ajustarse para proporcionar del orden de al menos una parte por 100 millones de especie de MRL activa en el medio de lavado acuoso, y proporcionarán preferiblemente de aproximadamente 0,005 ppm a aproximadamente 25 ppm, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 ppm a aproximadamente 10 ppm, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1 ppm a aproximadamente 5 ppm, del MRL en la disolución de lavado.

[0334] Los metales de transición preferidos en el presente catalizador blanqueante de metal de transición incluyen manganeso, hierro y cromo. Los MRL preferidos en la presente memoria son un tipo especial de ligando ultrarrígido que es de puente cruzado, tal como 5,12-dietil-1,5,8,12-tetraazabiciclo[6.6.2]hexadecano.

[0335] Los MRL de metal de transición adecuados se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos, tales como los enseñados, por ejemplo, en los documentos WO 00/332601 y U.S. 6.225.464.

Procedimiento de uso

[0336] Las composiciones limpiadoras dadas a conocer en la presente memoria pueden usarse para limpiar una localización de, entre otros, una superficie o tela. Típicamente, se pone en contacto al menos una porción de la localización con una realización de la composición limpiadora de los solicitantes, en forma pura o diluida en una disolución de lavado, y se lava y/o aclara entonces opcionalmente la localización. Con los fines de la presente invención, el lavado incluye, pero sin limitación, fregado y agitación mecánica. La tela puede comprender mayoritariamente cualquier tela susceptible de ser lavada en condiciones de uso de consumidor normal. Las composiciones limpiadoras dadas a conocer se emplean típicamente a concentraciones de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 15.000 ppm en disolución. Cuando el disolvente de lavado es agua, la temperatura del agua está típicamente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 90ºC, y, cuando la localización comprende una tela, la relación de agua a masa de tela es típicamente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente

30:1.

PARTE EXPERIMENTAL

[0337] Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención, y no se consideran limitantes del alcance de la misma.

[0338] En la divulgación experimental siguiente, se aplican las siguientes abreviaturas: ºC (grados centígrados)); rpm (revoluciones por minuto); H2O (agua); HCl (ácido clorhídrico); aa (aminoácido); pb (par de bases); kb (par de kilobases); kDa (kilodalton); g (gramos); µg y ug (microgramos); mg (miligramos); ng (nanogramos); µl y ul (microlitros); ml (mililitros); mm (milímetros); nm (nanometros); µm y um (micrómetros); M (molar); mM (milimolar); µM y uM (micromolar); U (unidades); V (voltios); PM (peso molecular); s (segundos); min (minuto/minutos); h (hora/horas); MgCl2 (cloruro de magnesio); NaCl (cloruro de sodio); DO280 (densidad óptica a 280 nm); DO600 (densidad óptica a 600 nm); PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida); EtOH (etanol); PBS (disolución salina tamponada con fosfato [NaCl 150 mM, tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2]); SDS (dodecilsulfato de sodio); Tris (tris(hidroximetil)aminometano); TAED (N,N,N’N’-tetraacetiletilendiamina); p/v (peso a volumen); v/v (volumen a volumen); Per (perhidrolasa); per (gen de perhidrolasa); Ms (M. smegmatis); EM (espectroscopia de masas); BRAIN (BRAIN Biotechnology Research and Information Network, AG, Zwingenberg, Alemania); TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD); AATCC (American Association of Textile and Coloring Chemists); WFK (wfk Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Alemania); Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Amersham (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Genaissance (Genaissance Pharmaceuticals, Inc., New Haven, CT); DNA 2.0 (DNA 2.0, Menlo Park, CA); MIDI (MIDI Labs, Newark, DE) InvivoGen (InvivoGen, San Diego, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Sorvall (Sorvall Instruments, una filial de DuPont Co., Biotechnology Systems, Wilmington, DE); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ); Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA); Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ) y Zeiss (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).

[0339] En los siguientes ejemplos, se usaron diversos medios. El medio “TS” se preparó (por litro) usando Tryptone (16 g) (Difco), Soytone (4 g) (Difco), hidrolizado de caseína (20 g) (Sigma), K2HPO4 (10 g) y H2O d (hasta 1 l). Se esterilizó el medio en autoclave. Se añadió entonces glucosa estéril a una concentración final de 1,5%. Se preparó el medio de producción de Streptomyces (por litro) usando ácido cítrico·(H2O) (2,4 g), extracto de levadura de Biospringer (6 g), (NH4)2SO4 (2,4 g), MgSO4·7 H2O (2.4 g), Mazu DF204 (5 ml) y oligoelementos (5 ml). Se ajustó el pH a 6,9 con NaOH. Se sometió entonces a autoclave el medio para esterilizar. Después de esterilizar, se añadieron al medio CaCl2·2 H2O (2 ml de disolución 100 mg/ml), KH2PO4 (200 ml de una disolución al 13% (p/v) a pH 6,9) y 20 ml de disolución de glucosa al 50%.

[0340] En estos experimentos, se usó un espectrofotómetro para medir la absorbancia de los productos formados después de la terminación de las reacciones. Se usó un reflectrómetro para medir la reflectancia de los recortes. A menos que se indique otra cosa, se estimaron las concentraciones de proteína por azul de Coomasie Plus (Pierce), usando BSA como patrón.

EJEMPLO 1

Análisis enzimático

[0341] En este ejemplo, se describen los procedimientos para valorar la pureza y actividad enzimática usados en los posteriores ejemplos y a lo largo de la presente memoria descriptiva.

Ensayo de actividad enzimática (ensayo de pNB)

[0342] Se midió esta actividad mediante la hidrólisis de butirato de p-nitrofenilo. Se preparó la mezcla de reacción añadiendo 10 µl de butirato de p-nitrofenilo 100 mM en dimetilsulfóxido a 990 ml de tampón Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 que contenía 0,1% de Triton X-100. Se midió la tasa de hidrólisis de fondo a 410 nm antes de la adición de la enzima. Se inició la reacción mediante la adición de 10 µl de enzima a 990 ml de la reacción, y se midió el cambio de absorbancia a 410 nm a temperatura ambiente (~23ºC). Se reseñan los resultados corregidos con el fondo como δA410/min/ml o δA410/min/mg de proteína.

Transesterificación

[0343] Se midió la transesterificación mediante separación por CG de los productos en reacciones acuosas tamponadas. Las reacciones para medir la transesterificación de acetato de etilo con propanol contenían 1 ml de KPO4 50 mM, pH 7,0; acetato de etilo 200 mM, 1-propanol 200 mM y enzima. Las reacciones para medir la transesterificación de acetato de etilo con neopentilglicol (NPG) contenían 1 ml de KPO4 50 mM, pH 7,0; acetato de etilo 303 mM, NPG 100 mM y enzima. Se incubaron las reacciones a las temperaturas indicadas y durante los tiempos indicados. Se efectuaron las separaciones usando una columna 30M FFAP (Phenomenex). La relación de división a la entrada era de aproximadamente 1:25, el inyector estaba a 250ºC, la presión de columna a 68,95 kPa de He y la detección era mediante FID a 250ºC. El programa de cromatografía era 40ºC iniciales durante 4 min, seguido de un gradiente de 15ºC/min hasta 180ºC. Los componentes eluyeron en el siguiente orden y no se cuantificaron: acetato de etilo, alcohol etílico, acetato de propilo, alcohol propílico, ácido acético, diacetato de NPG, monoacetato de NPG y NPG.

Perhidrolasa usada en estudios de cristalografía

[0344] Se usó esta preparación de perhidrolasa para estudios de cristalografía. Además, se cultivó y purificó proteína no marcada de manera similar. Se cultivó un precultivo de 500 ml de E. coli BL21(DE3)/pLysS/pMSATNcol1 en un matraz Fernbach con deflectores de 2,8 l en LB que contenía carbenicilina 100 µg/ml. Después de un cultivo durante una noche a 37ºC y 200 rpm en un agitador rotativo, se recogieron las células mediante centrifugación y se resuspendieron en medio M9 que contenía: glucosa, 2 g/l; Na2HPO4, 6 g/l; KH2PO4, 3 g/l; NH4Cl, 1 g/l; NaCl, 0,5 g/l; tiamina, 5 mg/l; MgSO4, 2 mM; CaCl2, 100 µM; ácido cítrico·H2O, 40 mg/l; MnSO4·H2O, 30 mg/l; NaCl, 10 mg/l; FeSO4·7H2O, 1 mg/l; CoCl2•6H2O, 1 mg/l; ZnSO4·7H2O, 1 mg/l; CuSO4•5H2O, 100 µg/l; H3BO3·5H2O, 100 µg/l y NaMoO4·2H2O, 100 µg/l, y se complementó con carbenicilina 100 mg/l. Se usaron las células resuspendidas para inocular 6 matraces Fernbach que contenían cada uno 500 ml de medio M9 complementado con carbenicilina (100 mg/l). Se incubaron los cultivos a 20ºC y 200 rpm en un agitador rotativo hasta que la DO600 alcanzó aproximadamente 0,7, en cuyo momento se añadieron lisina, treonina y fenilalanina 100 mg/l y leucina, isoleucina, valina y selenometionina 50 mg/l. Después de incubación adicional durante 30 min, se añadió IPTG a una concentración final de 50 µM. Se incubaron entonces los cultivos durante una noche (~15 h) y se recogieron mediante centrifugación. Se lavó el sedimento celular 2 veces con tampón KPO4 50 mM, pH 6,8. El rendimiento fue de 28,5 g de peso húmedo de células, a las que se añadieron 114 ml de tampón KPO4 100 mM, pH 8,2 y 5 mg de ADNasa. Se congeló esta mezcla a -80ºC y se descongeló 2 veces.

[0345] Se lisó la suspensión celular descongelada mediante desestabilización en una prensa French a 138 MPa. Se sedimentaron las células no fraccionadas y el material de membrana celular mediante centrifugación a

100.000 x g durante 1 hora. Se dispuso entonces el extracto bruto del sobrenadante, 128 ml (CE) en un vaso de 600 ml y se agitó durante 10 minutos en un baño de agua a 55ºC para precipitar las proteínas inestables. Después de 10 min, se agitó el vaso en agua con hielo durante 1 min, seguido de centrifugación a 15.000 x g durante 15 min. El sobrenadante de este procedimiento, HT, contenía 118 ml. Se redujo entonces el extracto de HT al 20% saturando con (NH4)2SO4 mediante la adición lenta de 12,7 g de (NH4)2SO4. Se cargó esto en una columna Fast Flow Phenyl Sepharose (Pharmacia) de 10 cm X 11,6 cm equilibrada con tampón de KPO4 100 mM, pH 6,8, que contenía un 20% de saturación (109 g/l) de (NH4)2SO4. Después de cargar el extracto, se lavó la columna con 1700 ml de tampón de partida y se eluyó con un gradiente de dos etapas. La primera etapa era un gradiente lineal de 1900 ml de tampón de partida al mismo tampón sin (NH4)2SO4, la segunda era una elución de 500 ml con KPO4 100 mM, pH 6,8 que contenía 5% de EtOH. Se combinaron las fracciones activas, 241 ml, se diluyeron un 100% con agua y se cargaron en una columna de intercambio aniónico fuerte Poros HQ de 1,6 mm X 16 mm equilibrada con Tris-HCl 100 mM, pH 7,6. Después de cargar el extracto, se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de partida. Se eluyó la proteína con un gradiente de 15 volúmenes de columna de tampón de partida a tampón de partida que contiene KCl 175 mM. Se combinaron las fracciones activas y se concentraron usando un Centriprep 30 (Millipore) a 740 µl. La Figura 6 proporciona una tabla de purificación que muestra la actividad de la enzima de la presente invención a lo largo de diversas etapas en el proceso de purificación.

[0346] La presente solicitud debe usarse para determinar los valores respectivos de los parámetros de la presente invención.

[0347] A menos que se observe otra cosa, todos los niveles de componente o composición están en referencia con el nivel activo de ese componente o composición, y están exentos de impurezas, por ejemplo, disolventes residuales o subproductos, que pueden estar presentes en fuentes comercialmente disponibles.

[0348] Los pesos de los componentes enzimáticos proporcionados en la presente memoria están basados en la proteína activa total. Todos los porcentajes y relaciones se calcularon en peso a menos que se indique otra cosa. Todos los porcentajes y relaciones se calcularon basándose en la composición total a menos que se indique otra cosa.

EJEMPLO 2

Determinación de la relación entre la formación de perácido y ácido

[0349] En este ejemplo, se describen procedimientos para determinar la relación de perhidrólisis a hidrólisis. En particular, este ejemplo proporciona procedimientos para determinar la relación entre la formación de perácido (concretamente, perhidrólisis) y la formación de ácido (concretamente, hidrólisis) resultantes de la actividad enzimática sobre un sustrato éster en presencia de peróxido en un sistema acuoso.

A. Determinación de la relación de perhidrólisis a hidrólisis Preparación de sustrato

[0350] Se prepararon los sustratos como se describe en la presente memoria. Se diluyeron acetato de etilo (AcOEt) y otros ésteres hidrosolubles en un tampón deseado a una concentración de éster 10 mM. Se prepararon la tributirina y otros sustratos no hidrosolubles haciendo recortes de sustrato. Se cortaron recortes de poliéster de tela de poliéster no teñida (Polycotton, PCW 22) usando un troquel de 16 mm y se dispusieron en una placa de microvaloración de 24 pocillos (Costar, Cell Culture Plate). Se diluyó el éster insoluble a 1,03 M en hexano. Se adsorbieron entonces 10 µl de la disolución de éter insoluble sobre el recorte de poliéster.

Determinación de la hidrólisis (ensayo de CG)

[0351] Se usó el ensayo hidrolítico descrito a continuación para determinar la cantidad de hidrólisis de sustrato. En este ensayo, la disolución de ensayo comprendía fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5, sustrato éster 10 mM, peróxido de hidrógeno 29 mM y cloruro de potasio 20 mM en un volumen total de 0,99 ml y una cantidad de enzima que generara 20 nmol de ácido acético por minuto a 25ºC.

[0352] Para medir la hidrólisis de éter no hidrosoluble, se añadió la mezcla de reacción al recorte de tela de éster insoluble. El recorte se preparó como se describe anteriormente (“preparación de sustrato”). Todas las demás condiciones para el ensayo fueron las mismas, excepto por la exclusión de otros sustratos ésteres.

[0353] Se midió la actividad hidrolítica controlando el aumento de ácidos generado por la enzima a partir de sustratos donantes de acilo usando cromatografía de gases acoplada con detección por ionización de llama. Se realizó el ensayo pipeteando en primer lugar 50 µl de disolución de ensayo que contenía todos los componentes excepto la enzima a 200 ml de metanol (pureza HPLC) para determinar la cantidad de ácido en la disolución de ensayo a tiempo 0. Se añadieron entonces 10 µl de enzima a la disolución de ensayo a la concentración final deseada que producía aproximadamente 20 nmol de ácido por minuto. Se activó un cronómetro y se tomaron alícuotas de 50 µl de la disolución de ensayo y se añadieron a 200 µl de metanol a diversos tiempos, típicamente 2, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos, después de la adición de la enzima.

[0354] Se inyectaron entonces estas muestras inactivadas con metanol en un cromatógrafo de gases equipado con un detector por ionización de llama (Agilent 6890N) y se analizaron los componentes hidrolíticos, ácidos acético y butírico. Se realizó la cromatografía de gases usando una columna de polietilenglicol modificada con ácido nitrotereftálico (Zebron FFAP; de dimensiones: 30 m de longitud, 250 µm de diámetro, 250 nm de grosor de película). Se aplicó una alícuota de 3 µl de muestra a la columna mediante una inyección sin división a flujo de helio constante de 1,0 ml/minuto. Se mantuvo la entrada a una temperatura de 250ºC y se purgó de cualquier componente de muestra residual después de 2 minutos. Cuando se analizó ácido acético, se mantuvo la temperatura de la columna a 75ºC durante 1 minuto después de la inyección, se aumentó a 25ºC/minuto a 100ºC y se aumentó entonces a 15ºC/minuto a 200ºC.

[0355] Cuando se analizó ácido butírico, se controló la temperatura de la columna como se ha descrito anteriormente, excepto porque se aumentó adicionalmente la temperatura a 25ºC/minuto a 225ºC y se mantuvo a 225ºC durante 1 minuto. Se mantuvo el detector por ionización de llama a lo largo de la cromatografía a 250ºC y a flujo de hidrógeno constante de 25 ml/minuto, flujo de aire de 200 ml/minuto y flujo de helio de columna y composición combinadas de 30 ml/minuto. Se determinó entonces la cantidad de ácido hidrolizado en la muestra integrando el pico de ácido en el cromatograma para el recuento iónico total, y calculando el ácido a partir del recuento iónico usando una curva patrón generado en las condiciones anteriores para ácidos acético y butírico a concentraciones variables en la disolución de ensayo (sin enzima).

Determinación de la perhidrólisis (ensayo de OPD)

[0356] Se usó el ensayo de actividad perhidrolítica descrito a continuación para determinar la cantidad de perácido formada en la reacción. En estos ensayos, la disolución comprendía fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5, sustrato éster 10 mM, peróxido de hidrógeno 29 mM, cloruro de potasio 20 mM y O-fenilendiamina 10 mM.

[0357] Cuando se usó éster no hidrosoluble como donante de acilo, se usó un recorte de tela con éster adsorbido como sustrato, preparado como se describe anteriormente (“preparación de sustrato”).

[0358] Se midió la actividad perhidrolítica controlando el aumento de absorbancia a 458 nm de la Ofenilendiamina (OPD) oxidada mediante el perácido generado por la enzima. Se preparó la disolución de ensayo de actividad perhidrolítica de la misma manera que la disolución de ensayo de actividad hidrolítica, excepto porque se añadió OPD a la disolución de ensayo a una concentración final de 10 mM. Se preparó la disolución de OPD inmediatamente antes de realizar el ensayo disolviendo 72 mg de OPD (Sigma-Aldrich, diclorhidrato) en 19,94 ml del mismo tampón y se ajustó el pH añadiendo lentamente 60 µl de hidróxido de potasio 13,5 M. Se midió el pH y, si es necesario, se añadieron pequeñas cantidades de hidróxido de potasio para devolver el pH al pH original del tampón. Se añadieron entonces 495 µl de esta disolución de OPD con los demás componentes de ensayo a un volumen de ensayo final de 0,990 ml. Se preparó también una disolución de inactivación del ensayo disolviendo 36 mg de OPD en 20 ml de ácido cítrico 10 mM y 70% de etanol.

[0359] Se realizó típicamente el ensayo a 25ºC. Se inició el ensayo pipeteando 100 µl de disolución de ensayo antes de la adición de la enzima a 200 µl de disolución inactivadora para determinar la cantidad de componentes perhidrolíticos y la absorbancia de fondo en la disolución de ensayo a tiempo 0. Se añadieron entonces 10 µl de enzima a la disolución de ensayo a la concentración final deseada que producía aproximadamente 10 nmol de perácido por minuto. Se activó un cronómetro y se tomaron alícuotas de 100 µl de la disolución de ensayo y se añadieron a 200 µl de disolución inactivadora a diversos tiempos, típicamente 2, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos, después de añadir la enzima. Se incubaron las disoluciones de ensayo inactivadas durante 30 minutos para permitir al perácido residual oxidar la OPD. Se transfirieron entonces 100 µl de cada disolución de ensayo inactivada

5 a una placa de microvaloración de 96 pocillos (Costar) y se midió la absorbancia de la disolución a 458 nm mediante un lector de placa espectrofotométrico (Molecular Devices, SpectraMAX 250). Se calculó la cantidad de perácido en cada muestra inactivada usando una curva patrón generada en las condiciones anteriores con ácido peracético a concentraciones variables en la disolución de ensayo (sin enzima).

10 Relación de perhidrólisis/hidrólisis:

[0360] Relación de perhidrólisis/hidrólisis= perhidrólisis medida en el ensayo de perhidrólisis/(ácido total detectado en el ensayo de hidrólisis-perhidrólisis medida en el ensayo de perhidrólisis).

15 [0361] Se proporcionan los resultados de estos experimentos en las Figuras Figures 7, 10 y la Figura 11. La Figura 7 proporciona una gráfica que muestra la relación de ácido perbutírico a ácido butírico generado por diversas enzimas a partir de tributirina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM en 40 minutos. La Figura 10 muestra la relación de ácido perbutírico a ácido butírico generado por diversas enzimas a partir de tributirina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM a los 4, 10 y 30 minutos. La Figura 11 muestra la relación de ácido perácetico a ácido acético

20 generada por diversas enzimas a partir de triacetina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM a los 4 y 10 minutos. Los resultados obtenidos en estos experimentos indicaron que los homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis exhibían una relación superior a 1 en los ensayos de OPD/CG descritos anteriormente, mientras que otras clases de enzimas exhibían relaciones significativamente menores de 1.

25 [0362] La Tabla 2-1 proporciona datos que muestran la actividad de perhidrólisis de diversos homólogos descritos en la presente memoria sobre la triacetina, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. Los resultados proporcionados en la Tabla 2-2 indican que la perhidrolasa tiene actividad en un amplio intervalo de sustratos. Además de los resultados proporcionados en estas Tablas, las Figuras 8 y 9 proporcionan datos que muestran que la perhidrolasa de la presente invención tiene actividades en un amplio intervalo de pH y temperatura.

30

Tabla 2-1. Actividad de perhidrólisis de homólogos de perhidrolasa sobre triacetina en comparación con perhidrolasa de M. smegmatis

Experimento: Proteína Relación de perhidrólisis (homólogo de perhidrolasa)

A.

pET26_Mlo: 0,6

pET26b_Mbo: 0,87

pET26_SmeII: 2,1

pET26b_Stm: 0,17

pLO_SmeI: 0,7

Perhidrolasa: 1,0000

Blanco: 0,0660

B.

pET26_S261_M2aA12: 1,5

Perhidrolasa: 1

Blanco: 0,3

C.

pet26_M40cD4: 0,14

pet26_M44aA5: 0,16

Perhidrolasa: 1

Blanco: 0,01

Tabla 2-2. Producción de perácido por 1 ppm de perhidrolasa natural con H2O2 29 mM y diversos ésteres en nmol/ácido peracético/min

Éster: Éster 10 mM Éster 10 mM Éster 10 mM

con 0,5% de neodol: en recorte de Polycotton

Acetato de etilo: 5,00

Acetato de butilo: 8,06 8,72

Acetato de hexilo: 7,96 5,86

Acetato de octilo: 8,03 0,48

Propionato de etilo: 0,90 1,43

Propionato de butilo: 2,47 3,39

Propionato de hexilo: 4,00 2,66

Acetato de isoamilo: 7,83 17,69

Acetato de citronelilo: 7,25 4,27

Propionato de citronelilo: 2,85 3,21

Acetato de dodecilo: 3,95 0,19

Acetato de neodol 23-3: 2,25 8,77

Acetato de neodol 23-6,5: 2,73 10,12

Acetato de neodol 23-9: 2,97 10,20

Diacetato de etilenglicol: 13,30

Diacetato de propilenglicol: 13,17

Triacetina: 11,91

Tributirina: 0,66 2,70

Metoxiacetato de etilo: 0,49

Acetato de linalilo: 0,30

Butirato de etilo: 0,31

Isobutirato de etilo: 0,10

2-Metilbutirato de etilo: 0,11

Isovalerato de etilo: 0,37

Maleato de dietilo: 0,75

Glicolato de etilo: 1,91

B. Ensayo típico de generación de perácido por perhidrolasa:

5 [0363] La perhidrolasa se encuentra activa en un amplio intervalo de pH y temperatura y acepta un amplio intervalo de sustratos para transferencia de acilo. Los aceptores incluyen agua (hidrólisis), peróxido de hidrógeno (perhidrólisis) y alcoholes (transferencia de acilo clásica). Para las medidas de perhidrólisis, se incubó enzima en el tampón de elección a una temperatura especificada con un sustrato éster en presencia de peróxido de hidrógeno.

10 Los sustratos típicos para medir la perhidrólisis incluyen acetato de etilo, triacetina, tributirina, ésteres acetato de neodol etoxilados y otros. Además, se encontró que la enzima natural era capaz de hidrolizar ésteres de nitrofenilo de ácidos de cadena corta. Estos últimos son sustratos convenientes para medir la concentración enzimática. En algunas realizaciones, se midieron el ácido peracético y acético mediante ensayos de ABTS o HPLC como se describe a continuación. Se describe también a continuación la hidrólisis de éter de nitrofenilo.

15

C. Ensayo de ABTS (1 ml):

[0364] Este ensayo proporciona la determinación del ácido peracético producido por perhidrolasa. Se adaptó este protocolo a partir de Karst y col., Analyst, 122: 567-571 [1997]). Brevemente, se añadió una alícuota de 100 µl

20 de disolución a analizar a 1 ml de citrato de K+ 125 mM pH 5, ABTS 1 mM y KI 50 µM. Se midió la absorbancia a 420 nm para sensibilidad máxima. Sin embargo, se usaron a veces longitudes de onda múltiples adicionales por todo el amplio espectro de absorción del ABTS. Se construyeron curvas de calibración basándose en series de concentración de perácido conocidas.

25 D. Determinación por HPLC (modelo - Agilent 1100) de productos de reacción de perhidrolasa:

[0365] Para la determinación de la relación de perhidrólisis a hidrólisis de la reacción de perhidrolasa, se inactivaron muestras de la reacción de perhidrolasa mediante acidificación a una concentración final de 0,24% de ácido metanosulfónico, y se separaron los productos mediante HPLC en fase inversa en una columna Dionex OA (nº

30 de cat. 062903; Dionex Corporation, Sunnyvale, CA). La fase móvil era NaPO4 10 mM, pH 3,9 (el tampón se preparó valorando Na2PO4 100 mM con ácido metanosulfónico a pH 3,9) procesada en condiciones isocráticas a 30ºC. La detección era a 210 nm. Se calcularon las concentraciones de productos mediante comparación de las áreas de pico integradas frente a los patrones de calibración.

E. Ensayo cinético de hidrólisis de éster de nitrofenilo

[0366] Se incubaron enzima y sustrato en Tris/HCl 100 mM pH 8,0 (o B(OH)3 50 mM pH 9,5 u otro tampón). Se controló la absorbancia a 402 nm. En algunos experimentos, se llevó a cabo el ensayo en cubetas estándar de 1 ml, mientras que en otros experimentos se usaron pocillos de placa de microvaloración. Se usó este último procedimiento para el cribado de colecciones mutantes. Se determinó la concentración enzimática mediante comparación con curvas patrón obtenidas en las mismas condiciones de reacción.

F. Ensayo de hidrólisis de caproato de para-nitrofenilo

[0367] Se preparó la disolución de sustrato pNC6 mezclando pNC6 1 mM (disolución madre 100 mM), 1 ml de DMSO, 19 ml de fosfato 100 mM (pH 8) y glicerol a una concentración final de un 10%. Para ensayar muestras, se añadieron 10 µl del lisado celular a 190 µl de la disolución de sustrato, y se ensayaron a 405 nm durante 15 minutos en un espectrofotómetro. Los resultados se presentan como la media de dos experimentos.

G. Ensayo de hidrólisis de acetato de para-nitrofenilo (pNA)

[0368] Se diluyeron alícuotas del sobrenadante celular lisado 1-100 en tampón fosfato 100 mM (pH 8). Para ensayar las muestras, se dispusieron 5 µl del sobrenadante celular diluido 1-100 en cada pocillo de una placa de microvaloración. Se añadieron entonces 195 µl de una mezcla de tampón de reacción/sustrato (pNA 1 mM, fosfato 100 mM, pH 8, 10% de glicerol) y se midió la tasa de absorbancia a 405 nm durante 3 minutos (programa cinético, lector de placa de microvaloración). Los resultados se presentan como la media de dos experimentos.

EJEMPLO 3

Ensayos que incluyen composiciones detergentes

[0369] En este ejemplo, se proporcionan los sistemas de ensayo usados para cribar la superior actividad perhidrolasa en detergentes con sustratos particulares. Estos ensayos incluyen aquellos que miden la degradación de perácido de la perhidrolasa, así como la actividad de síntesis de perácido de la enzima.

Materiales y procedimientos para los ensayos de formación de ácido peracético (PAF) y degradación de ácido peracético (PAD)

[0370] Esta sección proporciona los materiales y procedimientos usados para cribar las perhidrolasas superiores en Ariel con sustrato éster C9E2OAC.

Materiales:

[0371]

Ariel Futur sin blanqueador, perfume ni enzimas (P&G, Ariel "C") C9E2OAc (P&G) Peróxido de hidrógeno al 30% (Sigma) Ácido peroxiacético al 32% ("perácido", PAA)(nº de cat. Sigma), PM= 76,05; 4,208M Ácido cítrico anhidro, PM= 192,12 Hidróxido de potasio, PM= 56,11 ABTS (nº de cat. Sigma A1888), PM= 548,68 Yoduro de potasio, PM= 166,0 Fosfato de potasio mono y dibásico

Disoluciones madre:

[0372] Disolución madre de detergente Ariel: Se disolvió Ariel Futur sin blanqueante, perfume ni enzimas ("Ariel C") en agua a 6,72 g/l. Se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se dejó entonces asentar. Se dividió entonces en alícuotas convenientes y se almacenó a 4ºC hasta el uso. Cuando se preparó y usó reciente, se filtró la disolución en lugar de asentar.

C9E2OAc 100 mM en disolución madre de detergente Ariel: En primer lugar, se añadieron 30 µl de C9E2OAc a 970 µl de disolución madre de detergente Ariel usando una pipeta de desplazamiento positivo. Se sometió a sonicación en un baño de sonicación hasta que se formó una dispersión lechosa (15-60 s). La dispersión era estable durante aproximadamente 2 horas. Cuando se usó, se usaron 10 µl de dispersión por ml de mezcla de reacción.

Disolución madre de ácido peroxiacético 42 mM: Justo antes de usar, se diluyó la disolución de PAA al 32% de Sigma 1:100 en agua. Se añadieron entonces 5,7 µl de la disolución madre 42 mM por ml de mezcla de reacción.

Peróxido de hidrógeno 2 M: Se añadió 1 ml de peróxido de hidrógeno al 30% Sigma a 3,41 ml de agua. Se preparó reciente esta disolución, justo antes de usar. Se usó a 10 µl por ml de mezcla de reacción.

Tampón citrato 125 mM, pH 5,0: Se preparó éste a 24,0 g por litro. Se conformó a 800 ml y se valoró a pH 5,0 con KOH al 50%. Se ajustó el volumen a 1 l y se almacenó a temperatura ambiente.

Disolución madre de ABTS 100 mM: Se preparó ésta usando 549 mg de ABTS en 10 ml de agua. Se congeló a 80ºC en alícuotas convenientes en tubos Eppendorf opacos. La disolución madre era estable indefinidamente cuando se mantenía congelada en la oscuridad. El ABTS precipitará cuando se descongele de -80ºC, pero vuelve a la disolución al mezclar. En el uso, se usaron 10 µl de disolución madre de ABTS por ml de reactivo de ABTS.

KI 250 mM: Se preparó éste como 415 mg en 10 ml de agua. Se mantuvo a 4ºC. Se diluyó a una disolución madre de trabajo 25 mM, y se usaron 2 µl de disolución madre de trabajo por ml de reactivo de ABTS.

Tampón fosfato de potasio 25 mM, pH 8,0.

Procedimiento:

[0373] La noche antes de la práctica de los ensayos, se comprobaron las placas que contenían células lisadas que contenían perhidrolasa para asegurar que se habían congelado dos veces. El día del ensayo, se dejaron descongelar las placas 30 a 45 minutos. Se preparó el reactivo de ABTS y el Multidrop (instrumento Multidrop 384, ThermoElectron) para rellenar las placas de detección con 200 µl por pocillo. Se almacenan las placas rellenadas cubiertas a temperatura ambiente en la oscuridad hasta que sea necesario. Se prepararon diluciones de los patrones de modo que cuando se añadieron 20 µl del patrón estándar a los 180 µl de la mezcla de reacción, la concentración en el pocillo fuera 1 ppm. Se prepararon 4 diluciones en serie de 2 veces con un conjunto de 6 patrones: 1, 0,5, 0,25, 0,125 y 0,0625 ppm de concentración final en los pocillos.

[0374] Para ensayar, se añadieron 20 µl de los patrones a la placa de dilución 1:10 descongelada. Se prepararon las mezclas de reacción y se usó el Multidrop para rellenar una placa de reacción por cada placa a ensayar (180 µl/pocillo). Obsérvese que las mezclas de reacción son diferentes para los ensayos PAF y PAD.

Ensayo de hidrólisis de perácido (degradación de perácido, PAD):

[0375] Este ensayo mide la cantidad de ácido peracético residual después de una incubación de 100 minutos con enzima en un fondo de detergente Ariel. Se detecta la cantidad de perácido residual haciendo reaccionar una alícuota de la mezcla de reacción con el reactivo de detección de ABTS.

[0376] En este ensayo, se transfirieron muestras enzimáticas de 20 µl desde la placa de dilución 1:10 descongelada, una columna cada vez con una pipeta de 8 canales, a la correspondiente columna de la placa de reacción PAD prerrellenada. Se activó un cronómetro en cuanto se realizó la transferencia de la primera columna; las columnas posteriores se transfirieron a intervalos de 15 s (concretamente, la última columna se terminó 2 min y 45 s después de iniciar la primera). Se mezcló la placa durante 30 s en un termomezclador (750 rpm, para evitar salpicaduras). Se transfirió entonces la placa a una cámara humidificada a 25ºC. Se incubó la placa durante un total de 100 minutos desde el momento en que se añadió la primera columna de enzima. A los 100 minutos de incubación, se retiró la placa de reacción del incubador. Se transfirieron entonces alícuotas de 20 µl de la mezcla de reacción una placa de reactivo ABTS, en el mismo orden y con el mismo intervalo de tiempo de 15 s en que se añadieron originalmente las muestras enzimáticas a la placa de reacción. Se dejó reposar la placa de ABTS a temperatura ambiente durante 3 minutos después de añadir la última columna de mezcla de reacción. Se leyó entonces la placa en el lector de placa espectrofotométrica a 420 y 740 nm.

Ensayo de perhidrólisis (formación de perácido, PAF)

Protocolo optimizado Multidrop: cribado de una perhidrólisis superior en Ariel con sustrato éster C9E2OAC

[0377] Se usaron en estos experimentos los mismos materiales y disoluciones madre descritas anteriormente para PAD, como se indica a continuación.

Procedimiento:

[0378] Se diseñaron procedimientos para ensayar alícuotas de 20 µl a partir de una placa de dilución 1:100. Se produjeron las placas de ensayo de dilución 1:100 de 20 µl durante el proceso de obtención de las concentraciones de proteína, y se almacenaron a -80ºC. Se descongelaron las placas durante aproximadamente 30 a 45 minutos antes del uso. Se prepararon diluciones de patrones S54V de modo que cuando se añadieran 2 µl de patrón diluido a 20 µl de lisado celular diluido 1:100, la concentración en el pocillo fuera de 0,1 ppm. Se prepararon 4 diluciones en serie de 2 veces para producir un conjunto de 6 patrones: 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 y 0,0625 ppm de concentración final en los pocillos. Se añadieron entonces 2 µl de los patrones a las placas de ensayo de dilución

1:100 de 20 µl descongeladas en los pocillos indicados.

Ensayo de perhidrólisis (formación de perácido, PAF):

[0379] Este ensayo mide la cantidad de ácido peroxiacético que se produce en 10 minutos a partir del sustrato C9E20Ac en un fondo de detergente Ariel. Se detecta la cantidad de perácido formado después de 10 minutos mediante reacción de una alícuota de la mezcla de reacción con el reactivo de detección ABTS.

[0380] Se usó el Multidrop para suministrar 180 µl/pocillo de la mezcla de reacción PAF a la placa de dilución

1:100 preparada. Se activó el cronómetro y se dispuso la placa de reacción en el termomezclador, con la temperatura fijada a 25ºC. Se cubrió la placa y se mezclaron las disoluciones durante 30 s a 750 rpm. Se dejó reposar entonces la placa en el termomezclador sin mezclar durante un total de 10 minutos desde el momento en que se añadió la mezcla de reacción. A los 10 minutos, se usó el Multidrop para añadir 20 µl/pocillo del reactivo ABTS x10. El reactivo x10 era una suspensión lechosa. Se usó el termomezclador para agitar brevemente la placa. El reactivo ABTS se disolvió rápidamente. Se dejó reposar la placa a temperatura ambiente durante 3 minutos después de añadir el reactivo ABTS. Se leyó entonces la placa en el lector de placa espectrofotométrica a 420 nm.

EJEMPLO 4

Clonación de perhidrolasa de Mycobacterium smegmatis

[0381] En este ejemplo, se describe la clonación de perhidrolasa de M. smegmatis. Se purificó una enzima con actividad aciltransferasa a partir de Corynebacterium oxydans (ahora Mycobacterium parafortuitum ATCC 19686). Se obtuvieron dos secuencias peptídicas a partir de la proteína purificada. Se determinó un péptido mediante degradación de Edman con escisión con bromuro de cianógeno de la enzima purificada usando procedimientos conocidos en la técnica. Se determinó que la secuencia de este péptido era KVPFFDAGSVISTDGVDGI (SEQ ID NO:3). Se analizó el segundo péptido usando secuenciación N-terminal, y se encontró que tenía la secuencia GTRRILSFGDSLTWGWIPV (SEQ ID NO:4). Una búsqueda BLAST frente a la base de datos genómica inacabada TIGR identificó una secuencia de interés potencial en Mycobacterium smegmatis, que se muestra a continuación:

imagen1

[0382] La correspondiente secuencia de ADN del gen es:

imagen1

5 [0383] Se diseñaron los cebadores basándose en la secuencia génica para amplificar y clonar el gen. Los cebadores usados para amplificación fueron:

imagen1

10 [0384] Se realizó la amplificación del gen mediante PCR usando ADN polimerasa Taq (Roche) según las instrucciones del fabricante, con aproximadamente 500 ng de ADN cromosómico de Mycobacterium smegmatis como ADN de molde y la adición de DMSO al 1% a la mezcla de reacción de PCR. Se añadieron a la mezcla 30 pmol de cada uno de los cebadores MsRBSF y MspetBamR. El ciclo de amplificación fue: 30 ciclos de (95ºC durante

15 1 min, 55ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min).

[0385] Se separaron los fragmentos obtenidos a partir de la reacción PCR en un gel de agarosa al 1,2% y se identificó una sola banda del tamaño esperado de 651 pb (secuencia de codificación y codón de terminación). Se clonó esta banda directamente en el vector de clonación pCR2.1 TOPO (Invitrogen) y se transformó en células 20 Top10 de E. coli (Invitrogen) con selección en agar L (triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 5 g/l, agar 20 g/l) que contenía carbenicilina 100 µg/ml y X-gal (20 µg/ml, Sigma-Aldrich) para selección azul/blanca, y se incubó durante una noche a 37ºC. Se analizó en 5 colonias blancas la presencia del fragmento de PCR. Se usó cada colonia para inocular 5 ml de caldo L (agar L sin la adición de agar) que contenía carbenicilina 100 µg/ml y se

cultivaron los cultivos durante una noche a 37ºC con agitación a 200 rpm. Se purificó el ADN de plásmido de los cultivos usando el kit Quikspin (Qiagen). Se determinó la presencia del fragmento correcto mediante digestión con enzima de restricción EcoRI para liberar el fragmento, y secuenciando usando los cebadores suministrados por el fabricante de pCR2.1 (Invitrogen). Se designó al plásmido correcto como pMSATNcoI (véase la Figura 12 para el

5 mapa de este plásmido))). Se proporciona a continuación la secuencia de este plásmido.

imagen1

Construcción del plásmido de expresión T7 de perhidrolasa

5 [0386] Se usó también el par cebador usado para crear pMSATNco1 para crear un sitio NcoI (CCATGG), en el que el ATG es el codón de inicio del gen de aciltransferasa, y un BamH1 (GGATCC) justo después del codón de terminación TAA. Se digirió el plásmido pMSATNco1 con NcoI/BamH1 como se recomienda por el fabricante (Roche) y se purificó el fragmento de 658 pb que contiene el gen de perhidrolasa usando procedimientos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, Sambrook y col.). Se ligó el fragmento usando procedimientos estándares

10 conocidos en la técnica (por ejemplo, Sambrook y col.) en el plásmido de expresión del promotor T7, pET16b (Novagen), también digerido con NcoI/BamH1. Se transformó la reacción de ligamiento mediante procedimientos estándares en células Top10 de E. coli (Invitrogen) y se seleccionaron en agar L que contenía carbenicilina 100 µ/ml durante una noche a 37ºC. Se recogieron 10 colonias de varios transformantes y se usaron para inocular 5 ml de LB que contenía carbenicilina 100 µg/ml. Se cultivaron los cultivos durante una noche a 37ºC con agitación a 200 rpm.

15 Se purificó el ADN de plásmido de los cultivos usando el kit Qiagen Quikspin (Qiagen). Se determinó la presencia del fragmento correcto mediante digestión con enzima de restricción NcoI/BamH1 como indica el fabricante. Se designó el plásmido correcto pMSATNcoI-1 (véase la Figura 13 para el mapa de este plásmido). En esta figura, se indican los siguientes elementos: -LacI: gen que codifica la proteína represora LacI, localizada en las pb 1455-2534, ori: origen de replicación de plásmido en las pb 4471, bla: gen de β-lactamasa localizado en las pb 6089-5232; promotor T7:

20 localizado en las pb 1068-1052; terminador T7: localizado en las pb 259-213, per: gen de perhidrolasa de M. smegmatis localizado en las pb 981-334. Se proporciona a continuación la secuencia de este plásmido:

imagen1

[0387] Se transformó este plásmido en la cepa de E. coli BL21(λDE3)pLysS (Novagen), que contiene el gen que codifica la ARN polimerasa T7, con selección en LA que contiene carbenicilina 100 µg/ml. Se cultivaron las 5 células durante una noche a 37ºC. Se seleccionó un transformante y se designó la cepa MSATNco1.

Producción de perhidrolasa en MSATNco1-1

[0388] Se realizó la producción de perhidrolasa en cultivo celular. Por ejemplo, se inocularon 5 ml de LB con

10 carbenicilina a una concentración de 100 µg/ml con una sola colonia de MSATNco1, y se cultivó durante una noche a 37ºC con agitación a 200 rpm. Se usó este cultivo para inocular 100 ml de LB con carbenicilina a una concentración de 100 µg/ml (en un matraz con deflectores de 250 ml) hasta una DO600 de 0,1. Se cultivaron los cultivos a 30ºC con agitación a 200 rpm hasta que alcanzaron una DO600 de 0,4. Se indujo entonces la expresión del gen de perhidrolasa mediante la adición de IPTG 100 µM y se continuó la agitación durante una noche. Se recogieron los cultivos mediante centrifugación (10 min a 7000 rpm, rotor Sorvall SS34), se retiró el sobrenadante y se lavaron los sedimentos con KPO4 50 mM, pH 6,8. Se centrifugaron las células de nuevo, se retiraron los sobrenadantes y se determinó el peso húmedo de las células. Se resuspendieron las células en KPO4 100 mM en un volumen que era 4x el peso húmedo. Se congelaron las células resuspendidas a -70ºC. Se descongelaron las

5 células y se lisaron en una celda de presión French usando procedimientos estándares conocidos en la técnica. Se proporcionan en el Ejemplo 1 las etapas de purificación y procedimientos de valoración. La Figura 6 proporciona una tabla de purificación que muestra la actividad enzimática de la perhidrolasa de la presente invención en diversas etapas del proceso de purificación.

10 La perhidrolasa de M. smegmatis está en un operón

[0389] Se determinó en experimentos adicionales que la perhidrolasa de M. smegmatis es parte de un operón. El gen (phd) es el primer gen de un operón que contiene al menos 2 genes, incluyendo phd, que están separados por 10 pb (GGCTGGGGGC [SEQ ID NO:7]) sin incluir el codón de terminación TAA de phd. También es

15 posible que haya tres genes en el operón, estando el tercero a 48 pb o 61 pb del siguiente ORF (marco de lectura abierto). Los dos últimos genes candidatos no tienen homología significativa con proteínas de la base de datos.

[0390] Se identificó un presunto promotor para el operón phd de M. smegmatis, TTGGGC (-35) SP (18) CCAGAT mediante análisis de secuencia y comparación con promotores de M. smegmatis conocidos (véase, por

20 ejemplo, Salazar y col., Microbiol., 149: 773-784 [2003]). No se pretende que la presente invención esté limitada a ningún diseño de promotor y/o construcción particular, ya que se contempla que encontrarán uso en la presente invención otros diseños de promotores y construcciones.

[0391] El segundo gen en el operón phd codifica una proteína (presunta PBP-3) con la secuencia: 25

imagen1

[0392] La correspondiente secuencia de ADN del gen que codifica la presunta PBP-3:

imagen1

[0393] Una búsqueda BLAST estándar frente a la base de datos de proteína identificó homología con varias

5 proteínas de unión a penicilina de clase 3 (PBP-3). Mediante alineamiento de secuencia y comparación con la bibliografía (por ejemplo, Goffin y Ghysen, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66: 702-38 [2002]), se encontró que la PBP contenía los códigos de barras necesarios (secuencias proteicas conservadas que definen una clase de proteínas) para situarla en la superfamilia de aciltransferasas SxxK, con un dominio aciltransferasa C-terminal y un dominio N-terminal de función desconocida, pero con homología con las fusiones de proteína Penr (concretamente, resistentes

10 a penicilina) de tipo II y III de clase B. Este dominio aciltransferasa de proteína de unión a penicilina no comparte homología significativa con la perhidrolasa de la presente invención, aunque comparte homología con aciltransferasas dependientes de Co-A conocidas en la técnica. Se proporciona a continuación la secuencia de aminoácidos.

imagen1

[0394] Los códigos de barra identificadores de familia proporcionados en la revisión anterior fueron: (19) V

(20) G/A (140) PVxDRTG (142) TxDx3Q (22) TGGxLAx4PaxDP (13) SxxK (51) SCN (131) KTG (50) marcados en

5 negrita en la secuencia anterior. Las letras representan la secuencia de aminoácidos que define el código de barras; los números entre paréntesis son el número de aminoácidos intermedios entre los códigos de barras particulares; "x" representa cualquier aminoácido (concretamente, los aminoácidos no están conservados en el código de barras, pero se conserva el número de aminoácidos (por ejemplo, x3 correspondiente a 3 aminoácidos intermedios). Basándose en estos resultados y otros datos como se describen en la presente memoria, resulta evidente que la

10 perhidrolasa de la presente invención representa una clase enzimática única.

EJEMPLO 5

Expresión de perhidrolasa en P. citrea

15 [0395] En este ejemplo, se describen procedimientos usados para expresar la perhidrolasa en P. citrea. Se transformó el plásmido pMSATNcoI en P. citrea mediante electroporación usando esencialmente el procedimiento conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y col., supra), excepto porque se realizaron todos los cultivos y recuperaciones a 30ºC. Se sembraron los transformantes en agar L + carbenicilina (200 µg/ml) y se incubaron

20 durante una noche a 30ºC. Se recogieron tres tranformantes para análisis. Se usó cada colonia para inocular un cultivo de 30 ml de LB + carbenicilina (200 µg/ml) y se cultivó durante una noche a 30ºC con agitación a 200 rpm. Se sedimentaron las células mediante centrifugación, se lavaron una vez con tampón fosfato 50 mM, pH 7,2, y se resuspendieron finalmente en 4x el peso celular húmedo de tampón fosfato 100 mM, pH 8,0. Se lisaron las células mediante tratamiento con lisozima (2 µl de una disolución 10 mg/ml por ml de cultivo de P. citrea) a 37ºC durante 1

25 hora. Se sedimentó el desecho celular a 13.000 rpm en una microcentrífuga durante 5 min. Se usó el sobrenadante resultante para análisis adicional en PAGE-SDS y transferencias Western, así como ensayos de actividad enzimática.

[0396] Se llevó a cabo el análisis PAGE-SDS como es conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook

30 y col., supra) sobre los sobrenadantes. Se realizó la detección de la proteína perhidrolasa por transferencia Western usando antisueros policlonales anti-perhidrolasa (preparados a partir de proteína perhidrolasa purificada por Covance). Se reveló la transferencia según las sugerencias de fabricante usando el kit ECL plus (Amersham).

[0397] Se detectó la actividad enzimática de la perhidrolasa expresada mediante el ensayo de pNB (butirato 35 de para-nitrofenilo) como se describe en el ejemplo 1. Se proporcionan los resultados en la

Tabla 5-1. Actividad enzimática de perhidrolasa expresada por P. citrea

Clon: DO405 Tasa Concentración (mg/l)

P. citrea/pMSATNcoI: 3,1129 0,47948 7,1922

Control (P. citrea): 2,6187 -9,8312 0

[0398] Los resultados de PAGE-SDS y transferencia Western, así como los resultados de ensayo, indicaron

que la perhidrolasa se expresa por P. citrea y es activa.

EJEMPLO 6

Expresión de perhidrolasa en Bacillus subtilis

[0399] Se expresó intracelularmente la perhidrolasa en B. subtilis. Encuentran uso en esta realización una variedad de promotores incluyendo, pero sin limitación, pSPAC, pAprE, pAmyE, pVeg y pHpaII. En algunas realizaciones, la construcción está presente en un plásmido replicante (por ejemplo, pBH1), mientras que en otras realizaciones está integrada en el cromosoma en una o más copias. Los ejemplos de sitios para integración incluyen, pero sin limitación las regiones aprE, amyE, veg o pps. Es más, se contempla que otros sitios conocidos por los especialistas en la materia encontrarán uso en la presente invención.

A. Expresión intracelular de perhidrolasa en Bacillus subtilis a partir de un plásmido replicante

[0400] B. subtilis expresa una lipasa/esterasa codificada por el gen pnbA que hidroliza el sustrato pNB usado para detectar actividad de la perhidrolasa. Para identificar las cepas de B. subtilis que expresan perhidrolasa después de la transformación con plásmidos replicantes o integrantes, se eliminó en primer lugar el gen pnbA (toda la secuencia de codificación) del hospedador deseado usando el procedimiento de deleción del módulo loxP descrito en el documento WO 03/083125.

[0401] Se observa también que otras cepas de Bacillus pueden contener una o más lipasas/esterasas capaces de hidrolizar pNB u otro sustrato usado como indicador de actividad perhidrolasa. En algunas realizaciones, para una detección óptima de la expresión y/o actividad, es necesario eliminar una o más de las lipasas/esterasas de los hospedadores. La cepa de Bacillus subtilis usada en este ejemplo tiene el genotipo Bacillus subtilis comK pnbA (pnbAloxP-spec, aprE, nprE, degUHy32, oppA, spoIIE3501) y se designará como "B. subtilis pnbA" (véase, por ejemplo, el documento WO 03/083125, supra).

[0402] En estos experimentos, se usó un sitio de unión a ribosoma (RBS) de Bacillus de consenso. No se pretende que el RBS de consenso sea la única secuencia usada para expresión, ya que un RBS no de consenso encuentra también uso en la presente invención. El RBS de pMSATNcoI (véase el ejemplo 4) se cambió por un RBS de consenso de Bacillus del ARNr de 16S (5’-ATAAGGAGGTGATC-3’ [SEQ ID NO:132]) de B. subtilis y se añadió un sitio HindIII al extremo 5’ del RBS mediante PCR usando un cebador (cebador directo 502rbs) que contiene los cambios deseados. Se llevó a cabo la reacción usando un dispositivo PCR de MJ Research con 30 ciclos (1 min a 95ºC, 1 min a 5ºC y 1 min a 72ºC). Se añadió ADN de molde (pMSATrbs) a una reacción de 50 µl (10 ng) y se usaron 10 pmol de cada cebador.

[0403] Se clonó el módulo de phd generado por PCR en el vector de clonación de PCR pCR-Script CM (Stratagene), y se transformó en células Top10 de E. coli (Invitrogen) para preparar pAH502R. Se proporciona a continuación la secuencia completa de este plásmido.

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[0404] Se seleccionaron los transformantes en agar L que contenía carbenicilina 100 µg/ml. Se confirmó la construcción mediante ensayos de secuenciación y bioquímicos (por ejemplo, ensayo de actividad de pNB).

5 [0405] Conjunto cebador para la construcción de pAH502R: Cebador directo 502rbs: 5’- ccaagcttaaggaggtgatctagaattccatggccaagcgaattctgtgtttcg-3’ (SEQ ID NO:134) Cebador inverso 502:

10 5’- ggggatccttttacagcaggctccgcacct-3’ (SEQ ID NO:135)

[0406] Se clonó el fragmento de ADN HindIII-RBS-phd-BamH1 de pAH502R en el vector pMUTIN4 que contiene pSPAC (véase Vagner y col., Microbiol., 144, 3097-3104 [1998]), creando la construcción pAH503. Se proporciona a continuación la secuencia completa de pAH503:

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[0407] Se confirmó la construcción de pAH503 mediante los ensayos de actividad de RFLP y pNB. Se aisló el módulo de ADN de pSPAC-RBS-phd en forma de una digestión BglII/SmaI y se subclonó entonces en el plásmido 5 replicante pBH1, digerido con BamH1/EcoRV (véase, por ejemplo, el documento EP 0275509) creando pAH505 (véase la Figura 14). Se proporciona a continuación la secuencia completa del plásmido.

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[0408] Se transformó la mezcla de ligamiento de pAH505 en Bacillus subtilis pnbA. Se verificaron los transformantes correctos mediante RFLP y secuenciación de ADN de plásmido aislado. Se seleccionó un transformante para análisis (B. subtilis pnbA/pAH505).

[0409] Se ensayó la expresión de perhidrolasa en Bacillus usando el ensayo de actividad de pNB descrito en la presente memoria, después de cultivar la cepa deseada en matraz agitado. Los datos mostraron que la perhidrolasa se expresaba en B. subtilis pnbA.

B. Expresión intracelular de perhidrolasa en B. subtilis pnbA mediante integración en el cromosoma

[0410] Una construcción adicional útil para determinar la expresión del gen de perhidrolasa (act) integrado en el cromosoma de B. subtilis pnbA implicaba el uso del promotor spoVG, que se ha encontrado que controla la expresión del gen de perhidrolasa en un plásmido no replicante (concretamente, integrante). En algunas realizaciones, es un sitio de integración la región aprE de B. subtilis, aunque se pretende que la integración ocurra en cualquier sitio adecuado. Es más, no se pretende que la presente invención esté limitada a este sitio específico ni a este promotor específico, ya que diversos otros sitios promotores encontrarán uso en la presente invención.

[0411] La configuración del promotor/gen en el locus aprE del cromosoma de Bacillus subtilis era la siguiente: los primeros 7 codones de pAprE-aprE-terminación de la traducción-pSpoVG-ATG-gen de perhidrolasa desde el segundo codón.

[0412] Se construyó el clon como se describe a continuación. Los cebadores usados fueron: Up5’F caggctgcgcaactgttgggaag (SEQ ID NO:138) FuaprEAct34R agtagttcaccaccttttccctatataaaagcattagtgtatcaatttcagatccacaattttttgcttctcactctttac (SEQ ID NO:139) FuaprEAct4F Aattgatacactaatgcttttatatagggaaaaggtggtgaactactatggccaagcgaattctgtgtttcggtg (SEQ ID NO:140) BsmI-DnAct504R gtgagaggcattcggatccttttacagcaggctccg (SEQ ID NO:141)

[0413] La fusión por PCR es una técnica bien conocida en la técnica, en que se generan dos o más fragmentos de ADN mediante digestión de restricción o amplificación por PCR. Los fragmentos tienen segmentos superpuestos, habitualmente de al menos 18 bases de longitud. En el caso de usar dos fragmentos, el extremo 3’ del fragmento nº 1 tiene una secuencia superpuesta con el extremo 5’ del fragmento nº 2. Se usan los dos fragmentos como molde en una reacción PCR en que el conjunto de cebadores usado hibrida con el extremo 5’ del fragmento nº 1 (cebador directo) y el extremo 3’ del fragmento nº 2 (cebador inverso). Durante la amplificación, las dos regiones de superposición hibridan formando un solo molde del que los dos cebadores pueden amplificar un fragmento completo, una “fusión” de los fragmentos nº 1 y n1 2. Pueden usarse en dicha reacción múltiples fragmentos de cualquier longitud, limitado solo por la capacidad de la polimerasa elegida de amplificar trozos largos de ADN.

[0414] En el presente ejemplo, se realizó la construcción anterior mediante fusión por PCR de dos productos

de PCR. El primero era una construcción con el promotor spoVG añadido en dirección 3’ del gen phd. El segundo era el promotor aprE y los primeros 7 codones de aprE, seguido de un codón de terminación. Se añadieron regiones de 20 pb superpuestas en los extremos 5’ y 3 de los productos, respectivamente, para permitir la reacción de fusión por PCR. Se usó el conjunto de cebadores FuaprEAct4FBsmI-DnAct504R para amplificar el gen de perhidrolasa a

5 partir de pAH505 como se describe anteriormente, que añadió la secuencia promotora spoVG (contenida en el cebador) al extremo 5’ del gen y cambió el codón de inicio de ATG a GTG. Para crear el segundo producto (pAprE más los 7 primeros codones de aprE) para la fusión, se usó el conjunto de cebadores Up5’F/FuaprEAct34R para amplificar un fragmento de pBSFNASally. La Figura 15 proporciona un mapa de este plásmido. Se proporciona a continuación la secuencia completa de pBSFNASally.

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[0415] Se sometieron los dos productos de PCR a fusión por PCR como es conocido en la técnica, creando la fusión de 1,5 kb. Se clonó entonces el producto de fusión resultante en PCR2.1TOPO, produciendo pCP609 5 (véase la Figura 16 y la secuencia a continuación).

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[0416] Se digirió el plásmido PCP609 con BamH1/XmaI para liberar el fragmento que contiene la construcción pAprE-aprE-terminación-pSpoVG-phd y se ligó en pBSFNASally digerido con XmaI/BclI, dando el 5 plásmido pCP649. La Figura 17 proporciona un mapa de pCP649. Se proporciona a continuación la secuencia completa de pCP649.

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[0417] Se confirmaron todas las construcciones mediante análisis de secuencia. Se realizaron las reacciones PCR usando polimerasa Hercules (Roche) según las instrucciones del fabricante.

[0418] Se transformó pCP649 en B. subtilis comK pnbA y se seleccionaron integrantes en agar L que contenía cloranfenicol (5 µg/ml). Se determinó la actividad de la perhidrolasa expresada mediante el ensayo de actividad de pNB como se describe en la presente memoria. Los resultados indicaron que la perhidrolasa se expresaba y era activa.

EJEMPLO 7

Expresión de perhidrolasa en Streptomyces.

[0419] En este ejemplo, se describen experimentos realizados para valorar la expresión de perhidrolasa en Streptomyces. Para ensayar la expresión de perhidrolasa en Streptomyces, se construyó un plásmido replicante con el gen phd que se expresa por la glucosa isomerasa (GIT) o el promotor A4 (véase, por ejemplo, el documento US/PCT2004/038787, presentado el 18 de noviembre de 2004). Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a estos promotores específicos, ya que cualquier promotor adecuado encontrará uso en la presente invención. Además, aunque la cepa usada para la expresión de perhidrolasa en este ejemplo era Streptomyces lividans TK-23, se contempla que cualquier Streptomyces encontrará uso en la presente invención.

[0420] Se transformaron las cepas de Streptomyces y se manipularon usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Kieser y col., “Practical Streptomyces Genetics”, John Innes [2000]).

Construcción de pSECGT-MSAT y pSECA4-MSAT

[0421] Usando procedimientos estándares conocidos en la técnica, se clonó la secuencia de codificación de phd (véase el ejemplo 4) en pSECGT para poner al gen bajo el control del promotor GI. De forma similar, se clonó el gen en el mismo plásmido con el promotor A4 usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento US/PCT2004/038787, presentado el 18 de noviembre de 2004). Se seleccionaron en primer lugar transformantes en E. coli, se verificaron por análisis de secuencia y se transformaron entonces en S. lividans TK-23

5 usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Kieser y col., [2000], supra). Los clones correctos expresados a partir del promotor GI y el promotor A4 se designaron "pSECGT-MSAT" y "pSECA4-phd." Se proporciona a continuación la secuencia de pSECGT-MSAT, mientras que la Figura 18 proporciona un mapa del plásmido.

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[0422] La Figura 19 proporciona un mapa de pSEGT-phdA4, mientras que la secuencia se proporciona a continuación:

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[0423] Se inocularon dos colonias de S. lividans TK-23 pSECA4-phd en 10 ml de medio TS + 50 ppm de tioestreptona y se incubaron a 37ºC con agitación a 200 rpm durante 2 días. Se usaron 3 ml de caldo para inocular 50 ml de Streptomyces. Se incubó medio de producción 1 y el cultivo durante 4 días a 37ºC con agitación a 200 rpm.

[0424] Se tomó una muestra para ensayar la medida de la actividad perhidrolasa como sigue: se añadieron 10 µl de lisozima 20 mg/ml a 200 µl de muestra. Después de 1 hora de incubación a 37ºC, se centrifugaron las muestras y se midió la actividad usando el ensayo de actividad de pNB descrito anteriormente. Se prepararon también PAGE-SDS y transferencias Western usando ambos clones (pSECA4-phd y pSECGT-MSAT) como es conocido en la técnica. Brevemente, después de PAGE-SDS, se transfirieron las proteínas a membrana PVDF y se realizó el análisis de transferencia Western. Se detectó la perhidrolasa usando un antisuero policlonal antiperhidrolasa (dilución 1:500) preparado frente a proteína perhidrolasa purificada por Covance. Se reveló la transferencia usando el kit ECL de Amersham. Los resultados indicaron que las cepas de Streptomyces lividans eran capaces de expresar perhidrolasa activa.

EJEMPLO 8

Mutagénesis de barrido de sitio del gen de perhidrolasa de M. smegmatis

[0425] En este ejemplo, se describen experimentos que implican la mutagénesis de barrido de sitio del gen de perhidrolasa de M. smegmatis. En estos experimentos, se usó el kit de mutagénesis dirigida a sitio QuikChange® (QC; Stratagene) o el kit de mutagénesis dirigida a multisitio QuikChange® (QCMS; Stratagene) para crear colecciones de saturación de sitio en cada codón de todo el gen de perhidrolasa de M. smegmatis contenido en el plásmido pMSAT-NcoI. Se mutagenizó cada codón de perhidrolasa mediante reemplazo por el codón degenerado NNG/C (NNS; 32 combinaciones), que codifica los 20 aminoácidos y un codón de terminación. En el caso del procedimiento de QC, se diseñaron cebadores superpuestos para cada codón de interés con 18 bases flanqueantes del codón NNS (véanse las Tablas 8-1 y 8-2). Una comparación de los cebadores purificados por cartucho frente a no purificados (solo desalados) reveló una mejor representación de aminoácidos en las colecciones preparadas con cebadores purificados (15-19 aminoácidos frente a 11-16 con cebadores no purificados). Por tanto, se creó la mayoría de colecciones con el procedimiento QC y cebadores purificados. Se preparó un pequeño número de colecciones usando el procedimiento QCMS y un solo cebador directo 5’-fosforilado que contenía 18 bases flanqueantes de ambos lados del codón NNS (véase la tabla 8-1), sin embargo este procedimiento dio como resultado un fondo natural mayor y menores sustituciones de aminoácidos por sitio en comparación con los procedimientos QC. Las colecciones "nsa301" y "nsa302" se prepararon usando el procedimiento QCMS, pero se incorporó a los cebadores una mezcla trinucleotídica compuesta por un solo codón para cada uno de los 20 aminoácidos (concretamente, más de 32 posibilidades codificadas por NNS para los 20 aminoácidos) en los sitios de interés.

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Procedimiento QC para crear colecciones de saturación de sitio

5 [0426] La reacción QC consistía en 40,25 µl de H2O destilada estéril, 5 µl de PfuTurbo, 10x tampón del kit, 1 µl de dNTP del kit, 1,25 µl de cebador directo (100 ng/µl), 1,25 µl de cebador inverso (100 ng/µl), 0,25 µl de ADN miniprep de pMSAT-NcoI como molde (~50 ng) y 1 µl de PfuTurbo del kit, para un total de 50 µl. Las condiciones de ciclación fueron 95ºC durante 1 min una vez, seguido de 19-20 ciclos de 95ºC durante 30 a 45 s, 55ºC durante 1 min y 68ºC durante 5 a 8 min. Para analizar la reacción, se procesaron 5 µl de la reacción en un gel E al 0,8%

10 (Invitrogen) tras la terminación. A continuación, se llevó a cabo la digestión con DpnI dos veces secuencialmente, con 1 µl y 0,5 µl de enzima a 37ºC durante 2 a 8 horas. Se llevó a cabo un control negativo en condiciones similares, pero sin cebadores. Se transformó entonces 1 µl del producto de reacción digerido con DpnI en 50 µl de células electrocompetentes inmediatas Top10 (Invitrogen) usando un electroporador BioRad. Se añadieron entonces 300 µl de SOC proporcionado con las células Top10 (Invitrogen) a las células electroporadas y se incubaron con agitación

15 durante 1 hora antes de sembrar en placas LA que contenían 10 ppm de kanamicina. Se incubaron las placas a 37ºC durante una noche. Después de esta incubación, se inocularon 96 colonias de cada una de las colecciones (concretamente, cada sitio) en 200 µl de LB que contenía 10-50 ppm de kanamicina en placas de microvaloración de 96 pocillos. Se congelaron las placas a -80ºC después de la adición de glicerol a una concentración final de un 20%, y se usaron para secuenciación de alto rendimiento en Genaissance con los cebadores M13F y M13R.

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Procedimiento QCMS para crear colecciones de saturación de sitio

[0427] La reacción QCMS consistía en 19,25 µl de H2O destilada estéril, 2,5 µl de 10x tampón del kit, 1 µl de dNTP del kit, 1 µl de cebador directo 5’-fosforilado (100 ng/µl), 0,25 µl de ADN miniprep de pMSAT-NcoI como molde 5 (~50 ng) y 1 µl de la combinación enzimática del kit para un total de 25 µl. Las condiciones de ciclación fueron 95ºC durante 1 min una vez, seguido de 30 ciclos de 95ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min y 68ºC durante 8 min. Para analizar el producto de reacción, se procesaron 5 µl de la reacción en un gel E al 0,8% (Invitrogen) tras la terminación. A continuación, se llevó a cabo la digestión con DpnI dos veces secuencialmente con 0,5 µl de enzima a 37ºC durante 2 a 8 horas. Los controles, transformación y secuenciación se efectuaron como para el

10 procedimiento QC descrito anteriormente.

Detalles de la preparación de la placa de cribado

[0428] Usando una herramienta de estampado esterilizada con 96 puntas, se estamparon los clones

15 congelados de cada placa de colección secuenciada en una gran placa LA que contenía 10 ppm de kanamicina. Se incubó entonces la placa durante una noche a 37ºC. Se inocularon clones mutantes individuales que representaban cada una de las 19 sustituciones (o todas las que se obtuvieron) en una placa de 96 pocillos Costar que contenía 195 µl de LB preparado con extracto de levadura 2x y 10 ppm de kanamicina. Se inoculó por cuadruplicado cada clon mutante para un sitio dado. Se cultivó la placa a 37ºC y 225 rpm de agitación durante 18 h en una cámara

20 humidificada. En una placa separada de 96 pocillos, se añadieron 26 µl de BugBuster (Novagen) con ADNasa a cada pocillo. A continuación, se añadieron 125 µl de cultivos de clon de colección a la placa que contenía BugBuster en los correspondientes pocillos y se congeló la placa a -80ºC. Se descongeló la placa, se congeló y se descongeló de nuevo antes del uso de los lisados en los ensayos de formación de perácido e hidrólisis de perácido descritos en la presente memoria.

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Colecciones combinatorias y mutantes

[0429] A partir del cribado de las colecciones de saturación de un sitio, se identificaron los sitios y

sustituciones importantes y se combinaron en diferentes colecciones combinatorias. Por ejemplo, las colecciones

30 descritas en la Tabla 8-3 se crearon usando los siguientes sitios y sustituciones:

L12C, Q, G

T25S, G, P

L53H, Q, G, S

S54V, L, A, P, T, R

35: A55G, T

R67T, Q, N, G, E, L, F

K97R

V125S, G, R, A, P

F154Y

40: F196G

TABLA 8-3. Colecciones

ColecciónNSAA1: Descripción L12G S54(NNS) Molde original L12G Procedimiento QC

NSAA2: S54V L12(NNS) S54V QC

NSAA3: L12(NNS) S54(NNS) WT QCMS

NSAB1: S54V T25(NNS) S54V QC

NSAB2: S54V R67(NNS) S54V QC

NSAB3: S54V V125(NNS) S54V QC

NSAB4: L12I S54V T25(NNS) L12I S54V QC

NSAB5: L12I S54V R67(NNS) L12I S54V QC

NSAB6: L12I S54V V125(NNS) L12I S54V QC

NSAC1: S54(NNS) R67(NNS) V125(NNS) WT QCMS

NSAC2: colección de 43 cebadores, 10 sitios (100 ng de cebadores S54V QCMS

totales)

NSAC3: igual que nsaC2, pero 300 ng de cebadores totales S54V QCMS

NSAC4: colección de 32 cebadores, 8 sitios (100 ng de cebadores S54V QCMS

totales)

NSAC5: igual que nsaC4, pero 300 ng de cebadores totales S54V QCMS

NSAC6: 8 cebadores, 7 sustituciones, 5 sitios (100 ng de cebadores S54V QCMS

totales) NSAC7 Igual que nsaC6 pero 300 ng de cebadores totales S54V QCMS *NNS indica colección de saturación de sitio **Todos los moldes originales derivaban del plásmido pMSAT-NcoI y contenían mutaciones en los codones indicados en el gen de perhidrolasa de M. smegmatis

[0430] Su usaron los procedimientos QC o QCMS para crear las combinaciones. La reacción QC se llevó a cabo como se describe anteriormente, siendo una excepción el plásmido molde, que consistía en 0,25 µl de ADN miniprep de plásmido de mutante L12G, mutante S54V o doble mutante L12I S54V derivado de pMSAT-NcoI. Se 5 llevó a cabo también la reacción QCMS como se describe anteriormente, con la excepción de molde y cebadores. En este caso, se usaron 0,25 µl de molde pMSAT-NcoI para las colecciones NSAC1 y NSAA3 o molde S54V para NSAC2-C7. Las colecciones NSAA3 y NSAC1 se prepararon usando 100 ng de cada uno de los cebadores mostrados en la Tabla 8-4. Las colecciones NSAC2, NSAC4 y NSAC6 se prepararon con un total de 100 ng de todos los cebadores (siendo equimolares todos los cebadores), y las colecciones NSAC3, NSAC5 y NSAC7 se

10 prepararon con un total de 300 ng de todos los cebadores (siendo todos los cebadores aproximadamente equimolares).

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Cribado de colecciones combinatorias y mutantes

[0431] Para cada una de las colecciones NSAB1-B6, se secuenció en primer lugar una placa de 96 pocillos llena de clones. Una vez se analizaron los resultados de secuenciación, se inocularon los mutantes obtenidos para cada colección por cuadruplicado, de forma similar a las colecciones de saturación de sitio descritas anteriormente. Para las colecciones NSAC1-C7, se inocularon inicialmente 96 colonias por placa/colección, y se cribó cada placa sin secuenciación. Tras el cribado, algunas colecciones parecían mejores que otras. Se cribaron varias placas de cada una de las colecciones NSAC1, C2, C4 y C6. Los “ganadores” de estas placas de cribado de aislamiento único se sembraron en estrías individualmente o se cribaron directamente por cuadruplicado como en las colecciones de saturación de sitio (concretamente, como se describe anteriormente). Sólo los “ganadores” identificados se secuenciaron.

EJEMPLO 9

Propiedades mejoradas de variantes de perhidrolasa mutadas de forma múltiple

[0432] En este ejemplo, se describen experimentos realizados para valorar las propiedades de variantes de perhidrolasa mutadas de forma múltiple. En estos experimentos, se ensayaron en mutantes combinatorios de colecciones combinatorias su rendimiento de perhidrólisis, hidrólisis de perácido y relación de perhidrólisis a hidrólisis. Se midieron estos parámetros en los ensayos de HPLC o ABTS descritos en el ejemplo 2 anterior. Las variantes combinatorias ensayadas fueron:

L12I S54V,

L12M S54T,

L12T S54V,

L12Q T25S S54V, L53H S54V, S54P V125R, S54V V125G,

5 S54V F196G, S54V K97R V125G y A55G R67T K97R V125G,

[0433] Como se indica en la Tabla 9-1 siguiente, todas estas variantes eran mejores que la enzima natural en al menos una de las propiedades de interés.

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Tabla 9-1. Resultados de variantes múltiples

Variante múltiple: Mejora en veces de la propiedad

Perhidrólisis: Hidrólisis de perácido Relación

L12I S54V: 2 2,5

L12M S54T: 1,6 3

L12T S54V: 1,5 2,5

L12Q T25S S54V: 4 a 5

L53H S54V: 2 4 a 5

S54P V125R: 4

S54V V125G: 2 4

S54V F196G: 2

S54V K97R V125G: 2

A55G R67T K97R V125G: 1,6 4 a 5

EJEMPLO 10

Ensayos PAF y PAD de variantes de perhidrolasa

15 [0434] En este ejemplo, se proporcionan los resultados de ensayo de ensayos PAF y PAD de variantes de perhidrolasa. Se realizaron los ensayos como se describe en el ejemplo 1 anterior. Además, se proporcionan tablas en que la expresión de proteína de la variante era mayor que la natural en las mismas condiciones de cultivo (descritas en la presente memoria). Estos resultados se indican como el “índice de rendimiento de proteína”. Por

20 tanto, un número mayor de “1” en el índice de rendimiento de proteína indica que se preparó más proteína por la variante particular que la natural. En las siguientes tablas, “WT” indica el resto del aminoácido natural, “Pos” indica la posición en la secuencia de aminoácidos, “Mut” y “Var” indican el resto del aminoácido sustituido en esa posición particular, “Prot” indica proteína e “Ind. rend” indica el índice de rendimiento.

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[0435] La siguiente tabla proporciona variantes con resultados de PAF que eran mejores que los observados para perhidrolasa de M. smegmatis natural. En esta tabla, la columna media indica el resto del aminoácido en la 5 perhidrolasa natural (WT), seguido del número de posición y el aminoácido variante en esa posición (Var).

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[0436] La siguiente tabla proporciona variantes con un IR de PAF mayor de 1,5.

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[0437] La Tabla 10-4 proporciona variantes con valores de IR de PAF mayores de 2,0.

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[0438] La siguiente tabla proporciona resultados del ensayo PAD para diversas variantes.

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[0439] La siguiente tabla proporciona variantes que son mejores que la natural en la degradación de perácidos (concretamente el índice de rendimiento para la variante es mejor que para la natural)

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[0440] La siguiente tabla proporciona variantes que exhibían una degradación de perácido que era menor que la natural.

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[0441] La siguiente tabla proporciona variantes que tienen mejores índices de rendimiento de proteína (IR de proteína) mejores que la natural.

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[0442] La siguiente tabla proporciona variantes que tienen un IR de PAD que es mayor de 1,5, de PAF que es mayor o igual a 0,1 y un IR de proteína que es mayor o igual a 0,1

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[0443] La siguiente tabla proporciona variantes con un IR de PAD que es menor de 0,5, un PAF que es mayor o igual a 0,1 y un IR de proteína que es mayor o igual a 0,1

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[0444] Además de los resultados de ensayo descritos anteriormente, se encontró que diversas mutaciones daban como resultado proteína inestable de tal modo que no se expresaba la proteína perhidrolasa. Por tanto, en

5 contraposición con las sustituciones que dieron como resultado una expresión potenciada en comparación con la natural, había algunas sustituciones que no eran tan favorables, al menos en las condiciones usadas en la presente memoria. Sin embargo, no se pretende que la presente invención excluya estas sustituciones, ya que se contempla que estas sustituciones, tomadas por separado o en combinación, encontrarán uso en realizaciones alternativas de la presente invención.

10 [0445] La siguiente tabla proporciona los índices de rendimiento obtenidos en ensayos de PAF y PAD para diversas variantes, así como el índice de rendimiento de proteína.

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EJEMPLO 11

5 Clonación y expresión de un homólogo de perhidrolasa de M. smegmatis, RSM02162 de Sinorhizobium meliloti

[0446] En este ejemplo, se describen la clonación y expresión de un homólogo de perhidrolasa de S. meliloti.

Se proporcionan a continuación las secuencias usadas en la clonación y expresión. Se sintetizó el gen RSM02162 10 (SEQ ID NO:625) mediante DNA2.0. Se le dio al gen la referencia "G00355" y se proporcionó clonado en el vector disponible comercialmente pDRIVE (InvivoGen). Se amplificó el gen mediante PCR a partir de este clon usando el conjunto de cebadores G00355rbsF/G00355R, ADN polimerasa Taq (Roche) según las instrucciones del fabricante, con G00355 como molde (10 ng/50 µl de reacción) y 10 pmol (por 50 µl de reacción) de cada cebador. Se llevó a cabo la amplificación en un dispositivo de PCR de MJ Research usando 30 ciclos de (1 minuto a 95ºC, 1 minuto a

5 55ºC y 1 minuto a 72ºC). Se confirmó la amplificación del fragmento del tamaño correcto mediante electroforesis en gel de agarosa. Se clonó directamente el fragmento en pCR2.1TOPO (Invitrogen) y se transformó en células Top10 de E. coli (Invitrogen). Se seleccionaron los transformantes en agar L que contenía carbenicilina (100 µg/ml) a 37ºC. Se confirmó la construcción correcta mediante análisis de secuencia y se designó "pMC355rbs." La Figura 20 proporciona un mapa de este plásmido.

10 [0447] Secuencias de cebadores:

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15 [0448] Secuencia génica (incluyendo el codón de terminación) de RSM02162:

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[0449] Secuencia de la proteína G00355:

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[0450] Secuencia completa de pDRIVEG00355:

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[0451] Secuencia completa de pMC355rbs:

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Expresión de homólogo de pMC355rbs

5 [0452] Para expresar la proteína RSM02162 de S. meliloti a partir del plásmido pMC355rbs (véase la Figura 20 para un mapa de este plásmido), se inoculó una sola colonia en 5 ml de caldo L que contenía carbenicilina 100 µg/ml y se cultivó durante una noche a 37ºC con agitación a 200 rpm. Se prepararon los lisados sedimentando las células a partir de 1 ml del cultivo de una noche mediante centrifugación, y se lisaron con BugBuster (Novagen). Se ensayaron los sobrenadantes usando el ensayo de actividad de pNA y el ensayo de pNC6 (para ensayar su

10 capacidad de hidrolizar cadenas carbonadas mayores de C4), como se describe en la presente memoria.

Resultados de ensayo

[0453] La siguiente tabla (Tabla 11-1) proporciona una comparación de la actividad de hidrólisis de pNA por 15 G00355 en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis.

Tabla 11-1. Actividad de hidrólisis de pNA

Cepa: Tasa de hidrólisis de pNA* Tasa comparada con la perhidrolasa

E. coli/pMSATNcoI: 85 1

E. coli/pMC355rbs: 80 0,94

E. coli/pCR2.1: 34,6 0,41

*La tasa es unidades de absorbancia/min leídas a 405 nm en un espectrofotómetro

[0454] La siguiente tabla (Tabla 11-2) proporciona una comparación de la perhidrólisis de triacetina por G00355 en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis.

20

Tabla 11-2. Actividad de perhidrólisis de triacetina

Cepa: Actividad de hidrólisis

Máx: Vmáx

E. coli/pMSATNcoI: 1,04 11,88

E. coli/pMC355rbs: 1.17 25,05

E. coli/pCR2.1: 0,1 2,9

[0455] La siguiente tabla (Tabla 11-3) proporciona una comparación de la hidrólisis de pNC6 por G00355 en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis.

Tabla 11-3. Actividad de hidrólisis de pNC6

Cepa: Tasa de hidrólisis de pNC6* Tasa comparada con la perhidrolasa de Ms

E. coli/pMSATNcoI: 0,58 1

E. coli/pMC355rbs: 6,57 11,3

E. coli/pCR2.1: 0,47 0,8

[0456] Como indican estos resultados, el homólogo RSM02162 de S. meliloti identificado por homología de secuencia de aminoácidos con la perhidrolasa de M. smegmatis demostró una actividad de perhidrólisis similar, 5 aunque menor, que la perhidrolasa de M. smegmatis. Sin embargo, esta enzima exhibía diferente especificidad de sustrato, ya que era capaz de hidrolizar pNC6, mientras que la perhidrolasa de M. smegmatis natural no puede.

[0457] Los resultados del ensayo de hidrólisis de pNC6 indicaron que ciertas posiciones/sustituciones proporcionaban una mejora a la capacidad de la enzima de utilizar sustratos de cadena larga. Las posiciones y

10 sustituciones identificadas en los cribados preliminares se proporcionan en la siguiente tabla. No se pretende que la presente invención esté limitada a estas posiciones y sustituciones específicas, ya que se contempla que posiciones y/o sustituciones adicionales proporcionarán también una actividad mejorada sobre sustratos de cadena larga.

Tabla 11-4. Posiciones/sustituciones con actividad mejorada en el ensayo de PNC6

Resto/posición natural: Variante(s) de aminoácido

L12: G, P, Q

S54L: T

I153: F, P

F154: O, S, T, V

I194: G

F196: A, C, G, I, N, P, O, S, V

15 EJEMPLO 12 Amplificación de genes que codifican homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis a partir de aislamientos ambientales

20 [0458] En este ejemplo, se describen los procedimientos usados para amplificar genes que codifican homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis a partir de aislamientos ambientales.

[0459] Se purificaron organismos de muestras de suciedad que eran positivos de reacción de transesterificación en colonias individuales. Para amplificar los genes por PCR, se usaron los conjuntos de 25 cebadores degenerados 1AF/5AR y 1eF/5iR en una reacción PCR que contenía ADN cromosómico aislado de 8 cepas ambientales que exhibían la reacción de transesferificación. Se llevó a cabo la reacción de PCR usando ADN polimerasa Taq (Roche) según el protocolo del fabricante, con 1 µg de ADN cromosómico añadido como molde y 10 pmol de cada cebador en una reacción de 50 µl. Se llevó a cabo la reacción durante 30 ciclos de (1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 72ºC). Puesto que ya se había aislado la secuencia de codificación parcial del gen de

30 perhidrolasa a partir de Mycobacterium parafortuitum, se usó la misma cepa como control positivo. Se designaron las cepas como: 2G, 2D, 9B, 14B, 18D, 19C, 20A. Como se indica a continuación, se tipificó 20A como Mycobacterium Parafortuitum y 9B es Mycobacterium gilvum. Basándose en la homología de proteína, se dedujo que 2D es también

M. parafortuitum y 14B es M. gilvum.

35 Secuencias de cebadores

[0460]

1AF: 40 5’-gccaagcgaattctgtgtttcggngaytcnyt-3’ (SEQ ID NO:631)

5AR: 5’-cgattgttcgcctcgtgtgaartgnrtnccrtc-3’ (SEQ ID NO:632)

leF:

5 5’-acggtcctgtgctttggngaytcnyt-3’ (SEQ ID NO:633)

5iR:

5’-ccgctggtcctcatctggrtgntcnccrtc-3’ (SEQ ID NO:634)

10 [0461] Se esperaba que la amplificación con los conjuntos de cebadores anteriores proporcionara bandas de aproximadamente 500 pb. En todos los casos, excepto 2G, el conjunto de cebadores 1AF/5AR produjo una banda del tamaño esperado. En el caso de 19C, ambos conjuntos de cebadores produjeron bandas del tamaño esperado. Se purificaron las bandas de ~500 pb a partir de geles de agarosa usando un kit de purificación en gel (Qiagen) y se

15 analizaron mediante secuenciación. Aunque las cepas 2G y 19C proporcionaron bandas del tamaño esperado con ambos conjuntos de cebadores, no eran los fragmentos que codifican el homólogo de perhidrolasa de M. smegmatis.

[0462] Secuencias parciales del homólogo 2D de perhidrolasa y proteína:

20 [0463] Gen:

imagen1

[0464] Proteína:

25

imagen1

[0465] Secuencias parciales del homólogo 9B de perhidrolasa y proteína: 30 [0466] Gen:

imagen1

[0467] Proteína:

imagen2

[0468] Secuencias parciales del homólogo 14B de perhidrolasa y proteína: [0469] Gen:

10

imagen1

[0470] Proteína:

imagen3

[0471] Secuencias parciales del homólogo 20A de perhidrolasa y proteína: [0472] Gen:

imagen1

[0473] Proteína:

imagen1

Identificación de los aislamientos naturales

[0474] Para tipificar los aislamientos ambientales usados en este ejemplo, se enviaron placas de cepas purificadas al MIDI para tipificación del ARNr de 16S. 20A es Mycobacterium parafortuitum, 9B es Mycobacterium gilvum. Mediante la homología de proteína, se deduce que 2D es también M. parafortuitum y 14B es M. gilvum.

EJEMPLO 13 Análisis de secuencia y taxonómico de homólogos de perhidrolasa [0475] En este ejemplo, se proporcionan análisis de secuencia y taxonómicos de homólogos de perhidrolasa

de M. smegmatis.

Atribución taxonómica

[0476] Se convirtieron las secuencias de proteína básicas de la “lista de 60”, de acceso en bases de datos públicas y usadas para la construcción de conjuntos de cebadores de colecciones metagenómicas (BRAIN), en un documento que ilustra los orígenes taxonómicos microbianos de las proteínas, como se describe a continuación. Se usó esta información para producir el siguiente alineamiento.

imagen1

[0477] El árbol de alineamiento del alineamiento CLUSTALW (que se aproxima a un árbol filogenético) sugiere 3 o 4 agrupamientos.

5 [0478] A partir de este alineamiento, se construyó una secuencia proteica hipotética a partir de la secuencia consenso. Cuando no existía consenso, se rellenó el sitio con el aminoácido Per; los huecos se ignoraron. Esto proporcionó una secuencia consenso Per: [0479] Se usó esta secuencia consenso para una búsqueda BLASTP frente a una base de datos no redundante. Esta búsqueda identificó 55 coincidencias. La mayoría de las “coincidencias” eran moléculas de tipo

imagen1

5 GDSL o GDSI que cubren un amplio intervalo de diversidad microbiana. Sin embargo, solo las primeras 14 “coincidencias” tenían valores de e y valores de bit en el intervalo fiable. A primera vista, esto parecía proporcionar moléculas adicionales con un motivo GDSL/N - G/ARTT, pero se encontró que esto era debido a diferencias en la codificación (Swiss Prot frente a GenBank)

10 [0480] El cribado de 3 colecciones ambientales (en BRAIN) dio como resultado 10 clones con un motivo BDSL. 2 clones adicionales derivaron de la colección BRAIN. La siguiente tabla (Tabla 13-1) enumera los clones e indica su actividad.

Tabla 13-1. Clones con motivos GDSL Colección Clon Actividad perhidrolasa

S248Fa S248_M40cD4 No S248Fa S248_M44aA5 No S248Fa S248_M18bH12 Sin perhidrolasa S248Fa S248_M36bC5 Sin perhidrolasa S248Fa S248_M50cD9 Sin perhidrolasa S248Fa S248_M2bB11 ? baja S261 S261_M2aA12 Sí S279 S279_M75bA2 No realizado S279 S279_M11aC12 Sin GDSL S279 S279_M70aE8 ? baja M091 M091_M4aE11 No ensayada BRAIN Est114 No BRAIN Est105 No realizado

15 M40cD4

[0481] Mayor coincidencia: arilesterasa de Brucella melitensis (46% idéntica). Motivos: GDSL-GAND; GQTT en lugar de GRTT. El alineamiento de secuencia frente a la lista básica de organismos la sitúa cercana a Caulobacter vibrioides y Brucilla melitensis en las alfa-Proteobacteria.

20

imagen1

M44aA5

25 [0482] Mayor coincidencia: acil-CoA tioesterasa de Pseudomonas aeruginosa (43% idéntica). Motivos: GDSLGGND; sin GRTT ni equivalente. El alineamiento de secuencia frente a la lista básica de organismos la sitúa cercana a Pseudomonas sp en las gamma-Proteobacteria.

imagen1

M2bB11

5 [0483] Mayor coincidencia: arilesterasa de Brucella melitensis. Motivos: GDSL-GAND; sin GRTT ni equivalente. El alineamiento de secuencia frente a la lista básica de organismos la sitúa entre las alfa- y gamma-Proteobacteria.

imagen1

10

M2aA12

[0484] Mayor coincidencia: arilesterasa de Agrobacterium tumefaciens (42% idéntica). Motivos: GDSL-GRTTGTND. El alineamiento de secuencia frente a la lista básica de organismos la sitúa cercana a Agrobacterium 15 tumefaciens en las alfa-Proteobacteria.

imagen1

M75bA2

[0485] Mayor coincidencia: incompleta. La búsqueda BLAST no reveló nada significativo. Motivos: GDSLGTND; sin GRTT ni equivalente. El alineamiento de secuencia frente a la lista básica de organismos no muestra asociaciones convincentes. Los vecinos más cercanos parecen estar en los grupos Vibrio-Aeromonas de gamma

5 Proteobacteria.

imagen1

M70aE8

10 [0486] Mayor coincidencia: acil-CoA tioesterasa de E. coli (30% idéntica) y arilesterasa hidrolasa de Vibrio mimicus (27% idéntica). Basado en la secuencia de esterasa de tipo GDSL incompleta (BRAIN) de Neisseria meningitidis (50% idéntica). Motivos: GDSL-GGND; sin GRTT – reemplazado por GRTV. El alineamiento de secuencia frente a la lista básica de organismos muestra la asociación más estrecha con Neisseria meningitidis, un miembro de las beta-Proteobacteria.

15

imagen1

M4aE11

20 [0487] Mayor coincidencia: arilesterasa de Agrobacterium tumefaciens (59% de identidad). Motivos: GDSLGRTT-GTND. El alineamiento de secuencia frente a la lista básica de organismos muestra la asociación más estrecha con miembros de las alfa-Proteobacteria tales como Agrobacterium.

imagen1

Est114

5 [0488] Mayor coincidencia: fosfatidilcolina esterol aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (gamma-Proteobacteria) (30% idéntica). Motivos: GDSL-GPND; sin GRTT, pero GATT puede ser un equivalente. El alineamiento de secuencia frente a la lista básica de organismos muestra la asociación más estrecha con Acidophilium sp. y Aeromonas/Vibrio en las gamma-Proteobacteria.

imagen1

10

Est105

[0489] Mayor coincidencia: esterasa de membrana externa de Pseudomonas aeruginosa y una proteína hipotética de Pseudomonas putida (27% idéntica). Motivos: GDSL-GAND, sin GRTT ni equivalente. El alineamiento 15 de secuencia frente a la lista básica de organismos muestra la asociación más estrecha con miembros de las gamma-Proteobacteria.

imagen1

[0490] Un alineamiento global de estos clones/secuencias (mostrado aquí subrayado) indica que están dispersados a lo largo del árbol de alineamiento de las cepas, indicando que el cribado metagenómico ha proporcionado una variedad de secuencias y no una diversidad limitada.

imagen1

Minería genética para esterasas de tipo GRTT

(clones con actividad perhidrolasa)

[0491]

Motivos de Sma1993-proteína hipotética_Sme de Sinorhizobium meliloti: GDSL-ARTT–GTND

Motivos de Q92XZ1-proteína hipotética_Sme de Sinorhizobium meliloti: GDSN-GRTT–GTND

Motivos de Q98MY5-arilesterasa_Mlo de Mesorhizobium loti: GDSL-ORTT–GAND

Motivos de AAK53448 (lipasa) de Moraxella bovis: GDSL-GSND, sin GRTT ni equivalente en este orden de secuencia, (actividad perhidrolasa baja, secuencia cuestionable)

Motivos de Q8UACO de Agrobacterium tumefaciens: GDSL-GRTT–GTND

Motivos de Q8UFG4 de Agrobacterium tumefaciens: GDSL-GRTT–GTND

Motivos de RMLO00301 de Mesorhizobium loti: GDSL-GRTT–GAND

Motivos de RSM05666 de Sinorhizobium meliloti: GDSL-GRTT-GSND (este clon estaba inactivo para la actividad perhidrolasa, y probablemente representa un falso negativo)

Motivos de RSM02162 de Sinorhizobium meliloti: GDSL-ARTT–GTND

Motivos de RVM05432 de Prosthecobacter dejongeii: GDSN-GRTT–GTND

Un motivo GDSx1-x2RTT-Gx3ND caracteriza los clones/secuencias activos, en que:

x1 = L o N

x2 = A o G

x3 = T o Aor S.

[0492] La secuencia AAK53448 de Moraxella bovis no se ajusta a este patrón y se excluye del análisis de alineamiento proporcionado a continuación:

Alineamiento de secuencia múltiple de clones/secuencias activos [0493]

imagen1

[0494] Se proporciona a continuación un árbol guía (concretamente, una aproximación de un árbol filogenético) del alineamiento CLUSTALW de clones/secuencias activos.

imagen1

Tabla 13-2. Similitud e identidad de clones/secuencias en comparación con perhidrolasa de M. smegmatis

Clon/secuencia: % de identidad % de similitud

Sma1993 de Sinorhizobium meliloti: 55,5 71,6

Q92XZ1 de Sinorhizobium meliloti: 38,7 54,7

Q98MY5 de Mesorhizobium loti: 38,8 53,4

AAK53448 de Moraxella bovis: 5,0 9,7

Q8UACO de Agrobacterium tumefaciens: 36,7 47,7

Q8UFG4 de Agrobacterium tumefaciens: 37,1 50,4

RMLO00301 de Mesorhizobium loti: 34,8 50,9

RSM05666 de Sinorhizobium meliloti: 37,4 52,5

RSM02162 de Sinorhizobium meliloti: 58,3 75,2

RVM05432 de Prosthecobacter dejongeii: 51,6 55,7

S261_M2aA12: 39,3 54,3

M091_M4aE11: 34,7 50,2

[0495] Basándose en los resultados, se encontró que los clones activos tenían una identidad global con 5 perhidrolasa de M. smegmatis de 38,7-58,3%. Se encontró que AAK53448 de Moraxella bovis era una excepción y la secuencia de aminoácidos (traducida) es cuestionable.

Redundancia [0496] A partir de los análisis anteriores, resultó evidente que existe cierta redundancia en el alineamiento

10 proporcionado al inicio de este ejemplo que tendrá una ponderación añadida indebida a la secuencia de consenso. Además, se añadieron secuencias GDSL-GRTT adicionales. Por tanto, se hicieron los siguientes cambios en el alineamiento revisado a continuación:

Eliminados:

15 Aislamiento natural 14B Aislamiento natural 2D RSM02162_Sm Q98MY5 de Mesorhizobium loti

20 Añadidos:

BAB16197 (Arh II) BAB16192 (Arh I)

25 NP 00197751 (Mlo II) NP 00216984 (Bce) NP 522806 (Rso)

Alineamiento no redundante:

imagen1

[0497] El árbol guía del alineamiento CLUSTALW (que se aproxima a un árbol filogenético) indica claramente 3 agrupamientos:

5 1) el grupo GDSL-ARTT incluyendo Act 2) el grupo GDSL-GRTT compuesto por miembros de Rhizobiales y metagenoma y 3) un grupo intermedio de motivos mixtos.

[0498] Se contempla también que los resultados sugieren cierta forma de duplicación génica y eventos de 10 mutación en Rhizobiales y transferencia génica lateral a Mycobacterium.

imagen1

[0499] Usando el alineamiento no redundante, se construyó una nueva Act de consenso denominada “Act 15 quimérica”

imagen1

[0500] El alineamiento de la Act quimérica con Act de Ms (alineamiento quimérico) indica un 91,6% de 20 similitud y un 86,0% de identidad, como se indica a continuación.

imagen1

[0501] Una búsqueda BLASTP con Act quimérica no reveló ninguna secuencia adicional.

5 [0502] La Act quimérica se “fuerza” en la secuencia Per en las posiciones en que no existe consenso. Sin embargo, una secuencia de consenso básica “no forzada” no proporcionó más información a partir de una búsqueda blastp o análisis de alineamiento. Por tanto, la comparación con los homólogos más distantes en la lista de “coincidencias” de blastp se consideró más útil para definir los restos/posiciones importantes en el espacio de secuencia de Act. Este fue un ejercicio útil, ya que estas secuencias no se usaron en el alineamiento no redundante.

10 [0503] Por ejemplo, se comparó Rhodopirellula baltica (NP_865748; Psp; una Planctomycetes y bastante diferente de Mycobacterium o Rhizobiales) como se muestra a continuación.

imagen1

[0504] El siguiente es un alineamiento con Ralstonia eutropha (Reu):

imagen2

[0505] Basándose en estos resultados, se llegó a las siguientes conclusiones. Una búsqueda de base de datos BLASTp nr con una secuencia de consenso de perhidrolasa reveló lipasas/esterasas GDSL o GDSI de una amplia variedad de organismos. Sin embargo, solo 12 o 14 de estos eran homólogos fiables de Per. Casi todos estos derivaban de un pequeño grupo de bacterias, a saber, las Rhizobiales (concretamente, bacterias gramnegativas del suelo que pertenecen a las alfa-Proteobacteria). Se encontraron unos pocos miembros de beta-Proteobacteria, pero no Mycobacterium sp. Esto proporciona una indicación de que el gen/proteína de perhidrolasa (Per) no está ampliamente distribuido en la naturaleza.

[0506] La proteína de Mycobacterium se caracteriza por el motivo GDSL-ARTT, mientras que la mayoría de las Rhizobiales se caracterizan por un motivo GDSL-GRTT. Hay también algunos motivos mixtos o intermedios (por ejemplo, GDSN-GRTT, GDSNARTT y SDSL-GRTT). Esto puede indicar duplicación génica y eventos de mutación y transferencia génica lateral. Los restos de consenso identificados en estos experimentos fueron L6, W14, R27, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, G110, L114, L135, F180 y G205.

[0507] Usando alineamiento no redundante y comparación con homólogos distantes, puede definirse el siguiente espacio de secuencia partiendo de la posición 5 de la perhidrolasa de M. smegmatis y terminando en la posición 195, con la perhidrolasa mostrada en los restos en negrita [I, V][L][X][F, Y][T, S][W, Y, H][G][X] 2[P, A][X] 14[R, L][W] [X] 7[L][X] 5[V, I][I, V, H][X][E, D][G, C][L, Q][X][X] 2[D, E][D] [X] 7[G][X] 3[L][X] 6[H][X][P, I][L, I, V][D, A][V, I][X] 2[M, L][L] [X] 36[P][X] 6[P][P, A][X] 31[A][X] 19[D][G][X][H] (SEQ ID NO: 701)

[0508] En suma, resulta evidente a partir de los análisis anteriores que los clones/secuencias activos con un motivo GDSx1-x2RTT-Gx3ND se han encontrado todos entre las alfa-Proteobacteria, bacterias gramnegativas asociadas a la rizosfera del suelo. Esto está en franca contraposición con la perhidrolasa prototípica de M. smegmatis – una bacteria grampositiva de alto contenido en GC atribuida a la clase de Actinobacteria. Esta división se ilustra en la Figura 2, que proporciona un árbol filogenético que muestra las ramas mayoritarias de las bacterias y el origen de los clones/secuencias activos en comparación con M. smegmatis.

EJEMPLO 14

Estimación del peso molecular nativo de homólogos de perhidrolasa

[0509] En este ejemplo, se describen experimentos realizados para estimar los pesos moleculares nativos de homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis.

Preparación de muestras para purificación (determinación del tamaño)

[0510] Se inoculó una sola colonia de las cepas deseadas en 50 ml de caldo Terrific y se incubó durante una noche a 37ºC con agitación a 200 rpm. Se sedimentaron las células mediante centrifugación durante 10 minutos a 7000 rpm en una centrífuga Sorvall SuperSpeed. Se resuspendieron entonces los sedimentos en 10 ml de bis-Tris 25 mM (pH 6,5) y se lisaron mediante pasada por una celda de presión French dos veces. Se centrifugaron entonces los lisados a 15000 rpm en una centrífuga Sorvall SuperSpeed. Se trató térmicamente a 55ºC la fracción soluble durante 1 hora para precipitar las proteínas celulares. Se centrifugaron entonces las muestras a 10000 rpm en una centrífuga Sorvall SuperSpeed y se usaron las fracciones solubles para purificación o ensayo adicional.

Columnas de exclusión molecular

[0511] Se procesaron los sobrenadantes (preparados como se describe anteriormente) en una columna de exclusión molecular Sephadex 200 en fosfato 20 mM (pH 8,0) a un caudal de 0,5 ml/min. Se calibró la columna antes de procesar las muestras con patrones de PM (enumerados a continuación) y proteína perhidrolasa purificada de M. smegmatis. Se determinaron los volúmenes de elución de muestra bruta recogiendo fracciones de 0,5 ml y ensayando en las fracciones la actividad de pNB. Pesos moleculares y volúmenes de elución de los patrones:

Tiroglobulina, PM 669 kDam volumen de elución 16 ml, Aldolasa, PM 158 kDa, volumen de elución 24 ml Ovoalbúmina, PM 43 kDa, volumen de elución 26 ml Ribonucleasa, PM 14 kDa, volumen de elución 32 ml Perhidrolasa, volumen de elución 24 ml

Resultados

[0512] La siguiente tabla (Tabla 14-1) proporciona el volumen de elución de algunos de los homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis identificados en la presente memoria.

Tabla 14-1. Volumen de elución (peso molecular estimado) de homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis Muestra de homólogo Volumen de elución (ml)

pLO SmeI 24 pET26 SmeII 24 pET26 MlO 24 pET26b Stm 24 pET26b Mbo 24 M7OaEB_pET26 32 pET26_m2aA12 24 pET26b_S2487am 32 RSM02162 de S. meliloti (G00355) 24 PET_M2aA12 ( 5261) 24 Perhidrolasa de M. smegmatis 24

[0513] Los datos de la tabla anterior y los resultados de ensayo obtenidos para estos homólogos indicaron que estas enzimas tienen una secuencia de aminoácidos similar a la perhidrolasa de M. smegmatis. Como con la perhidrolasa de M. smegmatis, estos homólogos exhiben actividad de perhidrólisis como multímeros. Como se

10 describe en la presente memoria, la perhidrolasa es un octámero, mientras que los homólogos, aunque eluyen en un volumen similar, se contempla que son dímeros, trímeros, tetrámeros, hexámeros y/u octámeros.

EJEMPLO 15

15 Estructura cristalina de la perhidrolasa

[0514] En este ejemplo, se describe el análisis cristalográfico de la perhidrolasa. Se obtuvieron los cristales de perhidrolasa en dos condiciones: [NH4]2SO4 2,0 M, 2% de PEG400, Tris 0,1 M pH 7,1 (dando cristales triclínicos P1) y dihidrogenofosfato de amonio 1,0 M y citrato de sodio 0,1 M, pH 5,6 (dando cristales tetragonales P4). Ambas 20 formas cristalinas dieron una difracción adecuada más allá de una resolución de 2,0 Å. Se escinde proteolíticamente la metionina N-terminal de una proteína derivada de una determinación en fase MAD usando metionina que contiene selenio que reemplaza al azufre, dando como resultado una molécula proteica que tiene cuatro selenometioninas.De las dos formas, P1 triclínica a= 83,77Å, b= 90,07Å, c= 112,115Å, a =73,32° β= 77,30° γ= 88,07° y P4 a=b=98,18Å, c= 230,12Å, el cristal P4 daba datos que era posible usar para la determinación de la estructura. Se

25 recogieron conjuntos de datos de MAD de tres longitudes de onda a las longitudes de onda correspondientes al borde de absorción de Se, cerca del punto de inflexión y una tercera alejada del borde de absorción.

[0515] Se recogieron 333 marcos (oscilaciones de 0,3º por marco) para cada longitud de onda con un tiempo de exposición de 1 s a partir de un monocristal P4 del grupo espacial tetragonal. La estructura pudo resolverse con

30 los programas informáticos SOLVE o SHELX, dando soluciones similares para las 32 posibles posiciones de Se. Se ajustó el mapa usando el programa “O”. Fue posible trazar la densidad electrónica para los restos 3-216 de las 8 moléculas independientes. Se refinó la estructura final de estas 8 moléculas usando CNS. El factor R cristalográfico actual es de un 21%. Las coordenadas se proporcionan a continuación.

imagen1

[0516] Además de las determinaciones descritas anteriormente, se produjo y analizó también un cristal de perhidrolasa inhibido por carbamato. En estos experimentos, se usó un derivado de N-hexilcarbamato de perhidrolasa natural. Se valoró la perhidrolasa natural (14,5 mg en 1 ml de tampón NaPO4 67 mM, pH 7) a temperatura ambiente con alícuotas de 1,25 µl de N-hexilcarbamato de p-nitrofenilo 400 mM disuelto en DMSO. Se midió la actividad perhidrolasa con el ensayo de butirato de p-nitrofenilo (véase el ejemplo 2) en función del tiempo después de cada adición del inhibidor. Se requirieron varias adiciones durante varias horas para completar la inhibición de la enzima. Después de completar la inhibición, se intercambió el tampón de la disolución enzimática inhibida por HEPES 10 mM, pH 8,3. Se almacenó esta disolución a -80ºC hasta su uso para realizar experimentos de cribado de cristalización como se describe anteriormente. Se preparó el inhibidor N-hexilcarbamato de pnitrofenilo mediante procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hosie y col., J. Biol. Chem., 262: 260-264 [1987]). Brevemente, se cristalizó la perhidrolasa inhibida por carbamato mediante difusión de vapor usando el procedimiento de gota pendiente conocido en la técnica. Se mezcló una disolución de 1 ml de perhidrolasa inhibida (a 15 mg/ml en HEPES 10 mM, pH 8,2) con 4 µl de una disolución de almacenamiento (30% de PEG-4.000 con sulfato de litio 0,2 M y Tris 0,1 M, pH 8,5) en un cubreobjetos de plástico, se invirtió entonces y se selló en un pocillo de una placa Linbro de 6x4 que contenía 0,5 ml de la disolución de almacenamiento y se dejó equilibrar. Se formaron cristales a los pocos días. Se ultracongelaron los cristales en nitrógeno líquido y se analizaron como se describe anteriormente.

[0517] Aunque el octámero nativo se determinó en el grupo espacial P4 con dimensiones de celda unitaria: a= 98,184, b= 98,184 y c= 230,119, α= 90,00, β= 90,00, γ= 90,00, este cristal difractaba a aproximadamente 2,0 Å. El cristal inhibido por carbamato crecía en el grupo espacial P1 con dimensiones de celda unitaria a= 67,754, b= 80,096 y c= 85,974, α= 104,10°, β= 112,10º y γ= 97,40º, y estos cristales difractaban a una resolución superior a 1,0 Å.

[0518] El carbamato se unía de manera que explotaba las interacciones entre el oxígeno de ceto del carbamato y los restos que forman el agujero de oxianión, los átomos de N de amida de Ser11 y Ala55 y ND2 de Asn94. La cadena lateral hidrófoba se extiende a lo largo de la superficie hidrófoba del sitio de unión a la abertura de unión entre los pares de dímeros en la estructura octamérica. La dirección del resto carbamato destaca el papel central de la mutación S54V. El resto hidrófobo pasa adyacente a la cadena lateral de la Ser54. Mutar la cadena lateral de serina a valina aumentaba la hidrofobia, y servía también como salvaguardia para evitar que nucleófilos hidrófilos (por ejemplo agua) compitieran con los nucleófilos desacilantes deseados. Se espera que los residuos t circundantes del resto carbamato en la misma molécula y vecinas que forman la entrada extendida influyan en la selección del nucleófilo desacilante óptimo.

[0519] Además, se identificaron los restos con átomos de cadena lateral accesibles a la superficie usando el programa "AreaMol," del paquete de programas CCP4. La Tabla 15-1 enumera estos restos. En esta tabla, se proporcionan el número de resto, el nombre de resto, el número de átomos de cadena lateral accesibles a lasuperficie que tienen al menos 10,0 átomos cuadrados de área superficial accesible y el área superficial máxima (Å2) para cualquier átomo de cadena lateral en ese resto (o CA para restos GLY) en la estructura octamérica de la perhidrolasa.

imagen1

EJEMPLO 16

Eliminación de manchas

[0520] En este ejemplo, se describen experimentos realizados para valorar las capacidades de eliminación de manchas de la perhidrolasa.

[0521] Se usaron pocillos individuales de placas de cultivo de 24 pocillos para imitar las condiciones encontradas en las lavadoras normales. Se rellenó cada pocillo con detergente comercialmente disponible (por ejemplo, Ariel [Procter & Gamble], WOB [AATCC] y WFK [WFK]), y se añadieron discos de paño previamente manchada cortados para ajustarse al interior de cada pocillo. Se lograron la temperatura y agitación uniendo la placa al interior de un incubador/agitador de laboratorio común. Para medir la eficacia de blanqueamiento de la perhidrolasa, se usó tela manchada con té (EMPA nº 167, comercialmente disponible en Test Fabrics). Se dispuso un solo disco de ropa en cada pocillo, y se añadió 1 ml de detergente líquido que contenía enzima, sustrato éster y peróxido. Después de agitar a 100-300 rpm a 20-60ºC, se retiraron los discos de tela, se aclararon con agua corriente y se dejaron secar durante una noche. Se midió la reflectancia de cada disco de ropa individual y se representó como el valor “L”. Se proporcionan estos resultados en la Figura 21, que muestra que la adición de la perhidrolasa de la presente invención al detergente proporciona consistentemente un mayor grado de blanqueamiento que los detergentes solos. En esta figura, “E” indica los resultados para cada uno de los detergentes ensayados en combinación con la perhidrolasa de la presente invención.

EJEMPLO 17

Blanqueamiento de algodón

[0522] En este ejemplo se describen experimentos para valorar el uso de la perhidrolasa de la presente invención para blanquear tela de algodón.

[0523] En estos experimentos, se trataron 6 recortes de algodón por bidón a 55ºC durante 60 minutos en un Launder-O-meter. Los sustratos usados en estos experimentos fueron: 3 428U (7,62 cm x 7,62 cm) y 3 400U (7,62 cm x 7,62 cm) por experimento. Se ensayaron dos tipos diferentes de tela de algodón al 100% no blanqueada de Testfabrics, el estilo 428U (raso de algodón cardado militar desaprestado pero no blanqueado) y el estilo 400U (paño impreso de algodón desaprestado pero no blanqueado). La relación de disolución era de aproximadamente 26 a 1 (~7,7 g de tela/~200 ml de volumen de disolución). Se ensayó la enzima perhidrolasa a 12,7 mgP/ml, con acetato de etilo (3% (v/v)), peróxido de hidrógeno (1500 ppm) y Triton X-100 (0,001%), en un tampón fosfato (100 mM) para pH 7 y pH 8, así como en tampón carbonato de sodio (100 mM) para pH 9 y pH 10.

[0524] Se cuantificaron los efectos de blanqueamiento con la diferencia de color total, tomando 4 valores de L*a*b* de CIE por cada recorte antes y después de los tratamientos, usando un Chroma Meter CR-200 (Minolta), y se calculó la diferencia de color total de los rectores después de los tratamientos de la siguiente forma

222

Diferencia de color total (E) imagen1 (L a b )

[0525] (en que ΔL, Δa y Δb son las diferencias de los valores de L* de CIE, a* de CIE y b* de CIE antes y después respectivamente de los tratamientos).

[0526] Los valores mayores de E indican mayores efectos de blanqueamiento. Los resultados (véase la Figura 22) indicaron que la perhidrolasa mostraba efectos de blanqueamiento significativamente mejorados en ambos tipos de tela de algodón al 100% a pH 7 y pH 8 en las condiciones ensayadas.

[0527] Se observó también que desaparecían altas cantidades de motas (por ejemplo, puntos pigmentados) en los sustratos tratados con enzima.

EJEMPLO 18

Blanqueamiento de lino

[0528] En este ejemplo se describen experimentos realizados para valorar la capacidad de blanqueamiento de lino de la perhidrolasa de la presente invención. Se usaron los mismos procedimientos y condiciones descritos anteriormente para el ensayo de algodón (en el ejemplo 17) para ensayar los recortes de lino Como se indica anteriormente, se realizaron los experimentos en un Launder-O-meter usando una tela de lino (tela para trajes de lino, Style L-53; Testfabrics).

[0529] Se trataron en estos experimentos 3 recortes de lino (10,16 cm x 10,16 cm) con enzima perhidrolasa 12,7 mgP/ml con acetato de etilo (3%, v/v), peróxido de hidrógeno (1200 ppm) y Triton X-100 (0,001%) en tampón de fosfato de sodio (100 mM) para pH 7 y pH 8. Se calcularon los efectos de blanqueamiento como se describe anteriormente en el ejemplo 17. La Figura 23 proporciona una gráfica que muestra los efectos de blanqueamiento de la perhidrolasa de la presente invención ensayada a pH 7 y pH 8 sobre lino.

EJEMPLO 19

Composiciones detergentes

[0530] Se ejemplifican en el siguiente ejemplo diversas composiciones detergentes. En estas formulaciones, se expresan los niveles enzimáticos por enzima pura en peso de la composición total y, a menos que se especifique otra cosa, los ingredientes detergentes se expresan en peso de las composiciones totales. Las identificaciones de componente abreviadas en la presente memoria tienen los siguientes significados:

LAS alquilbenceno sulfonato de sodio C11-13 lineal. TAS alquilsulfato de sodio de sebo. CxyAS alquilsulfato de sodio C1x-C1y. CxyEz alcohol primario C1x-C1y predominantemente lineal condensado con una media de z

moles de óxido de etileno. CxyAEzS alquilsulfato de sodio C1x-C1y condensado con una media de z moles de óxido de etileno. Nombre de molécula añadido en los ejemplos. no iónico alcohol graso etoxilado/propoxilado mixto, por ejemplo, Plurafac LF404, que es un

alcohol un grado medio de etoxilación de 3,8 y un grado medio de propoxilación de 4,5. QAS R2.N+(CH3)2(C2H4OH) con R2 = C12-C14. silicato silicato de sodio amorfo (relación SiO2:Na2O= 1,6-3,2:1). metasilicato metasilicato de sodio (relación SiO2:Na2O= 1,0). zeolita A aluminosilicato hidratado de fórmula Na12(AlO2SiO2)12. 27H2O SKS-6 silicato laminar cristalino de fórmula δ-Na2Si2O5.

sulfato: sulfato de sodio anhidro

STPP: tripolifosfato de sodio

MA/AA: copolímero aleatorio de acrilato/maleato 4:1, peso molecular medio de

aproximadamente 70.000-80.000.

AA policarboxilato

BB1 BB2 PB1 PB4 percarbonato TAED NOBS DTPA HEDP DETPMP

EDDS diamina

DETBCHD PAAC Parafina Sulfonato de parafina

aldosa oxidasa galactosa oxidasa proteasa

amilasa

lipasa

celulasa

Pectina liasa PVP PVNO PVPVI abrillantador 1 antiespumante de silicona

supresor de jabonaduras SRP 1 PEG X PVP K60 ® Jeffamine ® ED-2001 Isachem ® AS MME PEG (2000) DC3225C

polímero de poliacrilato de sodio de peso molecular medio 4.500. copolímero que comprende una mezcla de monómeros carboxilados tales como acrilato, maleato y metacrilato, con un intervalo de PM entre 2.000-80.000, tal como Sokolan, comercialmente disponible en BASF, que es un copolímero de ácido acrílico de PM

4.500. propanosulfonato de 3-(3,4-dihidroisoquinolinio) decano-2-sulfato de 1-(3,4-dihidroisoquinolinio) perborato de sodio monohidratado perborato de sodio tetrahidratado de fórmula nominal NaBO3.4H2O. percarbonato de sodio de fórmula nominal 2 Na2CO3.3 H2O2. tetraacetiletilendiamina. Nonanoiloxibencenosulfonato en forma de la sal de sodio. ácido dietilentriaminopentaacético. ácido 1,1-hidroxietanodifosfónico. penta(metilen)fosfonato de dietiltriamina comercializado por Monsanto con el nombre comercial Dequest 2060. ácido etilendiamino-N,N’-disuccínico, isómero (S,S), en forma de su sal de sodio dimetilaminopropilamina, 1,6-hexanodiamina, 1,3-propanodiamina, 2-metil-1,5pentanodiamina, 1,3-pentanodiamina, 1-metildiaminopropano. dicloruro de 5,12-dietil-1,5,8,12-tetraazabiciclo[6,6,2]hexadecano, sal de Mn (II). acetato de pentaamina, sal de cobalto (III). aceite de parafina vendido con el nombre comercial Winog 70 por Wintershall. un aceite o cera de parafina en que algunos de los átomos de hidrógeno se han reemplazado por grupos sulfonato. enzima oxidasa vendida con el nombre comercial aldosa oxidasa por Novozymes A/S galactosa oxidasa de Sigma enzima proteolítica vendida con los nombres comerciales Savinase, Alcalase y Everlase por Novo Nordisk A/S, y los siguientes de Genencor International, Inc: "proteasa A" descrita en el documento US RE 34.606 en las Figuras 1A, 1B y 7, y en la columna 11, líneas 11-37; "proteasa B" descrita en los documentos US 5.955.340 y US 5.700.676 en las Figuras 1A, 1B y 5, así como en la Tabla 1 y “proteasa C” descrita en los documentos US 6.312.936 y US 6.482.628 en las figuras 1-3 [SEQ ID 3], y en la columna 25, línea 12, siendo "proteasa D" la variante 101G/103A/104I/159D/232V/236H/245R/248D/252K (numeración BPN’) descrita en el documento WO 99/20723. enzima amilolítica vendida con el nombre comercial Purafact Ox Am® descrita en los documentos WO 94/18314, WO96/05295 y vendida por Genencor como Natalase®, Tenmamyl®, Fungamyl® y Duramyl®, todas disponibles en Novozymes A/S. enzima lipolítica vendida con el nombre comercial Lipolase Ultra por Novozymes A/S y Lipomax por Gist-Brocades. enzima celulítica vendida con el nombre comercial Carezyme, Celluzyme y/o Endolase por Novozymes A/S. Pectaway® y Pectawash® disponibles en Novozymes A/S. polivinilpirrolidona con un peso molecular medio de 60.000 N-óxido de polivinilpirrolidona, con un peso molecular medio de 50.000. copolímero de vinilimidazol y vinilpirrolidona, con un peso molecular medio de 20.000. 4,4’-bis-(2-sulfoestiril)bifenilo de disodio controlador de la espuma de polidimetilsiloxano con copolímero de siloxano-oxialquileno como agente dispersante con una relación de dicho controlador de espuma a dicho agente dispersante de 10:1 a 100:1. 12% de silicona/sílica, 18% de alcohol estearílico, 70% de almidón en forma granular. poliésteres de extremo terminado aniónicamente. polietilenglicol de peso molecular x. homopolímero de vinilpirrolidona (PM medio 160.000) polietilenglicol con terminación de Huntsman un alquilsulfato de alcohol ramificado de Enichem monometileterpolietilenglicol (PM 2000) de Fluka Chemie AG. supresor de jabonaduras de silicona, mezcla de aceite de silicona y sílice de Dow Corning.

TEPAE etoxilato de tetraetilenpenaamina. BTA benzotriazol. betaína (CH3)3N+CH2COOazúcar D-glucosa de pureza industrial o azúcar de pureza alimentaria

5 CFAA alquil C12-C14-N-metilglucamida TPKFA ácidos grasos de corte completo reducidos C12-C14. arcilla un silicato de aluminio hidratado de fórmula general Al2O3SiO2·xH2O. Tipos: caolinita,

montmorillonita, atapulgita, ilita, bentonita, haloisita. MCAEM ésteres de fórmula R1Ox[(R2)m(R3)n]p 10 pH medido en disolución al 1% en agua destilada a 20ºC.

EJEMPLO 20

Detergentes líquidos de lavandería

15 [0531] Se preparan las siguientes composiciones detergentes líquidas de lavandería de la presente invención.

I: II III IV V

LAS: 18,0 - 6,0 - -

AE1,8S C12-C15: - 2,0 8,0 11,0 5,0

propildimetilamina C8-C10: 2,0 2,0 2,0 2,0 1,0

óxido de alquildimetilamina C12-C14: - - - - 2,0

AS C12-C14: - 17,0 - 7,0 8,0

CFAA: - 5,0 4,0 4,0 3,0

etoxilato de alcohol graso C12-C14: 12,0 6,0 1,0 1,0 1,0

ácido graso C12-C18: 11,0 11,0 4,0 4,0 3,0

ácido cítrico (anhidro): 5,0 1,0 3,0 3,0 2,0

DETPMP: 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5

monoetanolamina: 11,0 8,0 5,0 5,0 2,0

hidróxido de sodio: 1,0 1,0 2,5 1,0 1,5

percarbonato: - 3,5 - 2,5 -

propanodiol: 12,7 14,5 13,1 10 8,0

etanol: 1,8 1,8 4,7 5,4 1,0

pectina liasa: - - - 0,005 -

amilasa: - 0,002 - -

celulasa: - - 0,0002 0,0001

lipasa: 0,1 - 0,1 - 0,1

proteasa A: 0,05 0,3 0,055 0,5 0,2

aldosa oxidasa: 0,03 - 0,3 - 0,003

PAAC: 0,01 0,01 - - -

DETBCHD: - - 0,02 0,01 -

SRP1: 0,5 0,5 - 0,3 0,3

ácido bórico: 2,4 2,4 2,8 2,8 2,4

xilenosulfonato de sodio: - - 3,0 - -

DC 3225C: 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

2-butiloctanol: 0,03 0,04 0,04 0,03 0,03

DTPA: 0,5 0,4 0,35 0,28 0,4

abrillantador 1: 0,18 0,10 0,11 - -

perhidrolasa: 0,05 0,3 0,08 0,5 0,2

MCAEM (acetato E6,5 C12-C13): 3,0 8,0 12,0 1,5 4,8

Resto hasta 100% perfume/tinte y/o agua

20 EJEMPLO 21 Composiciones detergentes líquidas lavavajillas a mano

335

[0532] Se preparan las siguientes composiciones detergentes líquidas lavavajillas a mano de la presente invención.

I: II III IV V VI

AE1,8S C12-C15: 30,0 28,0 25,0 - 15,0 10,0

LAS: - - - 5,0 15,0 12,0

sulfonato de parafina: - - - 20,0 - -

óxido de alquildimetilamina C10-C18: 5,0 3,0 7,0 - - -

betaína: 3,0 - 1,0 3,0 1,0 -

amida de ácido graso poli-OH C12: 5,0 3,0 7,0 - - -

amida de ácido graso poli-OH C14: - 1,5 - - - -

C11E9: 2,0 - 4,0 - - 20,0

DTPA: - - - - 0,2 -

citrato de trisodio dihidratado: 0,25 - - 0,7 - -

diamina: 1,0 5,0 7,0 1,0 5,0 7,0

MgCl2: 0,25 - - 1,0 - -

proteasa A: 0,02 0,01 0,02 0,01 0,02 0,05

amilasa: 0,001 - - 0,002 - 0,001

aldosa oxidasa: 0,03 - 0,02 - 0,05 -

cumenosulfonato de sodio: - - - 2,0 1,5 3,0

PAAC: 0,01 0,01 0,02 - - -

DETBCHD: - - - 0,01 0,02 0,01

PB1: 1,5 2,8 1,2 - -

perhidrolasa: 0,02 0,01 0,03 0,01 0,02 0,05

MCAEM (acetato E7 C14-C15): 3,4 2,8 4,0 2,6 4,6 6,8

Resto hasta 100% de perfume/tinte y/o agua El pH de las composiciones (I)-(VI) es de aproximadamente 8 a aproximadamente 11

5 EJEMPLO 22 Detergente lavavajillas líquido automático [0533] Se preparan las siguientes composiciones detergentes lavavajillas líquidas automáticas de la

10 presente.

I II IIIIV V

STPP 16 1618 16 16 sulfato de potasio -10 8 -10 1,2-propanodiol 6,0 0,5 2,0 6,0 0,5 sulfato de potasio -10 8 -10 ácido bórico 4,0 3,0 3,0 4,0 3,0 CaCl2 dihidratado 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 no iónico 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 proteasa B 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 amilasa 0,02 -0,02 -0,02 -aldosa oxidasa -0,15 0,02 -0,01 galactosa oxidasa --0,01 --0,01 PAAC 0,01 --0,01 -DETBCHD -0,01 --0,01 perhidrolasa 0,1 0,03 0,05 0,03 0,06 MCAEM (acetato E12 C14-C15) 5,0 3,0 12,0 8,0 1,0 Resto hasta 100% perfume/tinte y/o agua

EJEMPLO 23

15 Composiciones de lavandería

[0534] Se preparan las siguientes composiciones de lavandería de la presente invención, que pueden estar en forma de gránulos o comprimidos.

Producto básico I II III IV V

AS C14-C15 o TAS 8,0 5,0 3,0 3,0 3,0 LAS 8,0 -8,0 -7,0 AE3S C12-C15 0,5 2,0 1,0 --E5 o E3 C12-C15 2,0 -5,0 2,0 2,0 QAS ---1,0 1,0 zeolita A 20,0 18,0 11,0 -10,0 SKS-6 (adición en seco) --9,0 --MA/AA 2,0 2,0 2,0 --AA ----4,0 citrato de trisodio·2H2O -2,0 ---ácido cítrico (anhidro) 2,0 -1,5 2,0 -DTPA 0,2 0,2 ---EDDS --0,5 0,1 -HEDP --0,2 0,1 -PB1 3,04,8 --4,0 percarbonato --3,8 5,2 -NOBS 1,9 ----NACA OBS --2,0 --TAED 0,5 2,0 2,0 5,0 1,00 BB1 0,06 -0,34 -0,14 BB2 -0,14 -0,20-carbonato de sodio anhidro 15,0 18,0 8,0 15,0 15,0 sulfato 5,0 12,0 2,0 17,0 3,0 silicato -1,0 --8,0 proteasa B 0,033 0,033 ---proteasa C --0,033 0,046 0,033 lipasa -0,008 ---amilasa 0,001 ---0,001 celulasa -0,0014 ---pectina liasa 0,001 0,001 0,001 0,001 0,0011 aldosa oxidasa 0,03 -0,05 --PAAC -0,01 --0,05 perhidrolasa 0,03 0,05 1,0 0,06 0,1 MCAEM** 2,0 5,0 12,0 3,5 6,8

Resto hasta 100% humedad y/o productos minoritarios*

* Perfume/tinte/abrillantador/SRP1/carboximetilcelulosa de sodio/fotoblanqueante/MgSO4/PVPI/supresor de jabonaduras/PEG de alto peso molecular/arcilla. ** MCAEM se selecciona del grupo constituido por acetato E2,5 C9-C11, [C12H25N(CH3)(CH2CH2OAc)2]+ Cl-, (CH3)2NCH2CH2OCH2CH2OAc, o mezclas de los mismos

EJEMPLO 24

5

Detergentes líquidos de lavandería

[0535] Se preparan las siguientes formulaciones detergentes líquidas de lavandería de la presente invención.

I I II III IV V

LAS 11,5 11,5 9,0 -4,0 -AE2,85S C12-C15 --3,0 18,0 -16,0 E2,5S C14-C15 11,5 11,5 3,0 -16,0 -E9 C12-C13 --3,0 2,0 2,0 1,0 E7 C12-C13 3,2 3,2 ----CFAA ---5,0 -3,0 TPKFA 2,0 2,0 -2,0 0,5 2,0 ácido cítrico (anhidro) 3,2 3,2 0,5 1,2 2,0 1,2 formiato de calcio 0,1 0,1 0,06 0,1 --Resto hasta 100% perfume/tinte y/o agua

formiato de sodio: 0,5 0,5 0,06 0,1 0,05 0,05

culmenosulfonato de sodio: 4,0 4,0 1,0 3,0 1,2 -

borato: 0,6 0,6 - 3,0 2,0 3,0

hidróxido de sodio: 6,0 6,0 2,0 3,5 4,0 3,0

etanol: 2,0 2,0 1,0 4,0 4,0 3,0

1,2-propanodiol: 3,0 3,0 2,0 8,0 8,0 5,0

monoetanolamina: 3,0 3,0 1,5 1,0 2,5 1,0

TEPEE: 2,0 2,0 - 1,0 1,0 1,0

PB1: - 4,5 - 2,8 -

proteasa A: 0,03 0,03 0,01 0,03 0,02 0,02

lipasa: - - - 0,002 - -

amilasa: - - - - 0,002 -

celulasa: - - - - - 0,0001

pectina liasa: 0,005 0,005 - - -

aldosa oxidasa: 0,05 - - 0,05 - 0,02

galactosa oxidasa: - 0,04

perhidrolasa: 0,03 0,05 0,01 0,03 0,08 0,02

MCAEM (acetato E6 C12-C15): 3,2 4,6 1,8 3,5 6,2 2,8

PAAC: 0,03 0,03 0,02 - - -

DETBCHD: - - - 0,02 0,01 -

SRP1: 0,2 0,2 - 0,1 - -

DTPA: - - - 0,3 - -

PVNO: - - - 0,3 - 0,2

abrillantador 1: 0,2 0,2 0,07 0,1 - -

silicona antiespumante: 0,04 0,04 0,02 0,1 0,1 0,1

EJEMPLO 25

Detergentes lavavajillas compactos de alta densidad 5

[0536] Se preparan los siguientes detergentes lavavajillas compactos de alta densidad de la presente

invención:

I II III IVV VI STPP -45,0 45,0 --40,0 citrato de trisodio·2H2O 17,0 --50,0 40,2 -carbonato de sodio 17,5 14,0 20,0 -8,0 33,6 bicarbonato ---26,0 --silicato 15,0 15,0 8,0 -25,0 3,6 metasilicato 2,5 4,5 4,5 ---PB1 --4,5 ---PB4 ---5,0 --percarbonato -----4,8 BB1 -0,10,1 -0,5-BB2 0,02 0,05 -0,1 -0,6 no iónico 2,0 1,5 1,5 3,0 1,9 5,9 HEDP 1,0 -----DETPMP 0,6 -----PAAC 0,03 0,05 0,02 ---parafina 0,5 0,4 0,4 0,6 --proteasa B 0,072 0,053 0,053 0,026 0,059 0,01 amilasa 0,012 -0,012 -0,21 0,006 lipasa -0,001 -0,005 --pectina liasa 0,001 0,001 0,0001 ---aldosa oxidasa 0,05 0,05 0,03 0,01 0,02 0,01 perhidrolasa 0,072 0,053 0,053 0,026 0,059 0,01 MCAEM (acetato E6,5 C12-C13) 3,5 2,8 1,6 7,5 4,2 0,8 BTA 0,3 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 policarboxilato 6,0 ---4,0 0,9 perfume 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 Resto hasta 100% humedad y/o productos minoritarios* *Abrillantador/tinte/SPR1/carboximetilcelulosa de sodio/fotoblanqueante/MgSO4/PVPVI/supresor de jabonaduras/PEG de alto peso molecular/arcilla

El pH de las composiciones (I) a (VI) es de aproximadamente 9,6 a aproximadamente 11,3.

EJEMPLO 26

5 Composiciones detergentes en comprimido

[0537] Se preparan las siguientes composiciones detergentes en comprimido de la presente invención mediante la compresión de una composición detergente lavavajillas granular a una presión de 13 kN/cm2 usando una prensa rotativa de 12 cabezales estándar.

10

I: II III IV V VI VII VIII

STPP: - 48,8 44,7 38,2 - 42,4 46,1 36,0

citrato de trisodio·2H2O: 20,0 - - - 35,9 - - -

carbonato de sodio: 20,0 5,0 14,0 15,4 8,0 23,0 20,0 28,0

silicato: 15,0 14,8 15,0 12,6 23,4 2,9 4,3 4,2

lipasa: 0,001 - 0,01 - 0,02 - - -

proteasa B: 0,042 0,072 0,042 0,031 - - - -

proteasa C: - - - - 0,052 0,023 0,023 0,029

perhidrolasa: 0,01 0,08 0,05 0,04 0,052 0,023 0,023 0,029

MCAEM (acetato E6,5 C12-C13): 2,8 6,5 4,5 3,8 4,6 2,8 2,8 2,8

amilasa: 0,012 0,012 0,012 - 0,015 - 0,017 0,002

pectina liasa: 0,005 - - 0,002 - - - -

aldosa oxidasa: - 0,03 - 0,02 0,02 - 0,03 -

PB1: - - 3,8 - 7,8 - - 8,5

percarbonato: 6,0 - - 6,0 - 5,0 - -

BB1: 0,2 - 0,5 - 0,3 0,2 - -

BB2: - 0,2 - 0,5 - - 0,1 0,2

no iónico: 1,5 2,0 2,0 2,2 1,0 4,2 4,0 6,5

PAAC: 0,01 0,01 0,02 - - - - -

DETBCHD: - - - 0,02 0,02 - - -

TAED: - - - - - 2,1 - 1,6

HEDP: 1,0 - - 0,9 - 0,4 0,2 -

DETPMP: 0,7 - - - - - - -

parafina: 0,4 0,5 0,5 0,5 - - 0,5 -

BTA: 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 -

policarboxilato: 4,0 - - - 4,9 0,6 0,8

PEG-400-30.000: - - - - - 2,0 - 2,0

glicerol: - - - - - 0,4 - 0,5

perfume: - - - 0,05 0,2 0,2 0,2 0,2

Resto hasta 100% humedad o productos minoritarios*

*Abrillantador/tinte/SRP1/carboximetilcelulosa de sodio/fotoblanqueante/MgSO4/PVPVI/supresor de jabonaduras/PEG de alto peso molecular/arcilla El pH de las composiciones 7(I) a 7(VIII) es de aproximadamente 10 a aproximadamente 11,5. El peso de comprimido de las composiciones 7(I) a 7(VIII) es de aproximadamente 20 g a aproximadamente 30 g

EJEMPLO 27

Detergentes de limpieza de superficies duras

[0538] Se preparan las siguientes composiciones detergentes líquidas limpiadoras de superficies duras de la presente invención.

I: II III IV V VI VII

E5 C9-C11: 2,4 1,9 2,5 2,5 2,5 2,4 2,5

E5 C12-C14: 3,6 2,9 2,5 2,5 2,5 3,6 2,5

E6 C7-C9: - - - - 8,0 - -

E21 C12-C14: 1,0 0,8 4,0 2,0 2,0 1,0 2,0

LAS: - - - 0,8 0,8 - 0,8

culmenosulfonato de sodio: 1,5 2,6 - 1,5 1,5 1,5 1,5

Isachem® AS: 0,6 0,6 - - - 0,6 -

Na2CO3: 0,6 0,13 0,6 0,1 0,2 0,6 0,2

citrato de trisodio·2H2O: 0,5 0,56 0,5 0,6 0,75 0,5 0,75

NaOH: 0,3 0,33 0,3 0,3 0,5 0,3 0,5

ácido graso: 0,6 0,13 0,6 0,1 0,4 0,6 0,4

2-butiloctanol: 0,3 0,3 - 0,3 0,3 0,3 0,3

PEG DME-2000®: 0,4 - 0,3 0,35 0,5 - -

PVP: 0,3 0,4 0,6 0,3 0,5 - -

MME PEG (2000)®: - - - - - 0,5 0,5

Jeffamine® ED-2001: - 0,4 - - 0,5 - -

PAAC: - - - 0,03 0,03 0,03 -

DETBCHD: 0,03 0,05 0,05 - - - -

proteasa B: 0,07 0,05 0,05 0,03 0,06 0,01 0,04

amilasa: 0,12 0,01 0,01 - 0,02 - 0,01

lipasa: - 0,001 - 0,005 - 0,005 -

perhidrolasa: 0,07 0,05 0,08 0,03 0,06 0,01 0,04

MCAEM (acetato E8 C12-C15): 3,5 5,6 4,8 5,3 3,6 8,0 4,7

pectina liasa: 0,001 - 0,001 - - - 0,002

PB1: - 4,6 - 3,8 - - -

aldosa oxidasa: 0,05 - 0,03 - 0,02 0,02 0,05

Resto hasta 100% de perfume/tinte y/o agua El pH de las composiciones (I) a (VII) es de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 9,5

[0539] Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de los especialistas en la materia a la que pertenece la invención.

5 [0540] Habiéndose descrito las realizaciones preferidas de la presente invención, resultará evidente para los especialistas en la materia que pueden hacerse diversas modificaciones a las realizaciones dadas a conocer, y que dichas modificaciones se pretende que estén dentro del alcance de la presente invención.

10 [0541] Los especialistas en la materia apreciarán fácilmente que la presente invención está bien adaptada a llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los inherentes a la misma.

[0542] La invención descrita ilustrativamente en la presente memoria puede practicarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se dé a conocer específicamente en la 15 presente memoria. Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos descriptivos y no limitantes, y no hay intención de que en el uso de dichos términos y expresiones se excluya cualquier equivalente de los rasgos mostrados y descritos o porciones de los mismos, sino que se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro de la invención. Por tanto, debe entenderse que, aunque la presente memoria se ha dado a conocer específicamente mediante realizaciones preferidas y rasgos opcionales, puede recurrirse a la modificación y

20 variación de los conceptos de la presente memoria por los especialistas en la materia.

[0543] La invención se ha descrito amplia y genéricamente en la presente memoria. Cada una de las especies más concretas y agrupamientos subgenéricos que entran dentro de la divulgación genérica forma también parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con la condición o limitación negativa de

25 eliminar cualquier material en cuestión del género, independientemente de si el material retirado se indica específicamente en la presente memoria o no.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una perhidrolasa aislada que es al menos un 70% idéntica a la perhidrolasa de M. smegmatis que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.
2.

La perhidrolasa de la reivindicación 1, en la que la perhidrolasa es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.
3.

La perhidrolasa de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la perhidrolasa es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
4.

La perhidrolasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha perhidrolasa comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.
5.

La perhidrolasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha perhidrolasa exhibe una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis e hidrólisis como se describen en el ejemplo 2.
6.

La perhidrolasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que:

(a)

dicha perhidrolasa es al menos una porción de dicha perhidrolasa de M. smegmatis, en la que dicha perhidrolasa tiene una relación de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis e hidrólisis como se describen en el ejemplo 2; o

(b)

dicha perhidrolasa es un homólogo estructural de dicha perhidrolasa de M. smegmatis, donde el sitio activo es homólogo de al menos un aminoácido seleccionado del grupo constituido por S11, D192 y H195 de la perhidrolasa de M. smegmatis.
7.

Una variante de perhidrolasa aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la variante de perhidrolasa tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una modificación de un aminoácido realizada en una posición equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.
8.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que la al menos una mutación comprende una modificación en una posición equivalente a Ser54 en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.
9.

La perhidrolasa de la reivindicación 8, en la que la mutación es la sustitución por una valina en la posición equivalente a Ser54.
10.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que:

(i)

dicha al menos una modificación se realiza en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicho aminoácido modificado se selecciona del grupo constituido por Cys7, Asp10, Ser11, Leu12, Thr13, Trp14, Trp16, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, The41,, Asn94, Asp95, Tyr99, Va1125, Pro138, Leu140, Pro146, Pro148, Trp149, Phe150, Ile153, Phe154, Thr159, Thr186, Ile192, Ile194 y Phe196; o

(ii)

dicha modificación comprende a menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por M1, K3, R4, 15, L6, C7, D10, S11, L12, T13, W 14, W16, G15, V17, P 18, V19, D21, G22, A23, P24, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, V32, R33, W34, T35, G36, L38, Q40, Q41, D45, L42, G43, A44, F46, E47, V48, 49, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, I60, D61, D62, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, G70, A71, S72, Y73, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, D85, L86, V87, N94, D95, T96, K97, Y99F100, R101, R102, P104, L105, D106, I107, A108, L109, G110, M111, S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P146, P148, W149, F150, I153, F154, I194 y F196.
11.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la hidrólisis de perácido en comparación con la perhidrolasa natural.
12.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 11, en la que dicho cambio en la hidrólisis de perácido

es una reducción.
13.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 11, en la que dicho cambio en la hidrólisis de perácido es un aumento.
14.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,1 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, y en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por R4, L12, G15, P18, R27, W34L38, A44, E51, G52, L53, S54, T58, R67, L68, S72, A79, T80, D85, L86, V87, N94, K97, R101, V118, L119, G124, G126 e I194.
15.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,2 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por R4, 15, D10, L12, W14, G15, P18, V19, T25, R27, W34, L38, A44, I49, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T58, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S72, S76, C77, A79, T80, D85, L86, V87, N94, K97, R101, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, V118, L119, A122, G124, G126, T127, Y129, W149 e I194.
16.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,3 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por R4, 15, D10, L12, W14, G15, L12, P18, V19, G22, A23, T25, E26, R27, W34, G36, L38, Q41, L42, G43, A44, 49, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, N59, T58, D62, T64, D65, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94, T96, K97, Y99, F100, R101, R102, P104, L109, G110, M111, L114, V118, L119, A122, G124, V125, G126, T127, Y129, W149, F154 e I194.
17.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,4 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por R4,15, L6, D10, S11, L12, W14, G15, W16, P18, V19, G22, A23, T25, E26, R27, F28, W34, T35, G36, L38, Q41, L42, G43, A44, D45, E47, 49, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, T58, I60, D62, T64, D65, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94, P66, T96, K97, Y99, F100, R101, R102, P104, I107, L109, G110, M111, S112, L114, V118, L119, S121, A122, G124, V125, G126, T127, Y129, W149, F150, F154, I194 y F196.
18.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,5 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F 150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67,L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, I49, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122,

A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, 15, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.
19.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,6 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F1S0, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V12S, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, I49, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V25, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, I107, I194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, M111, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, S11, S112, S54, S72, T16, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, V125, V19, W16, Y129, Y73, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.
20.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,7 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, GS2, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34,149, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70,149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, I107, I194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, M111, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, S11, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, 149, I5, I60, LI05, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, M111, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y73, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.
21.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,8 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, I49, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, I49, K97, L109, L114, L119, L12,

L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, I107, I194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, M111, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, S11, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, I49, I5, I60, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, M111, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y99, A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C77, D45, D61, D65, D85, D95, E47, E51, F150, F196, F46, G110, G126, G36, G43, G52, I107, I194, I49, I5, I60, I89, L114, L42, L53, L68, L78, L84, M111, N59, N94, P146, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, R101, R4, S112, S121, S72, T116, T120, T127, T13, T57, T96, V113, V125, V17, V19, V32, V87, W149, Y129, Y73, G190, V191, G193, T 197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.
22.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de aproximadamente 1,5 o mayor, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, I49, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, I49, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, I107, I194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, M111, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, S11, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, I49, I5, I60, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, M111, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y99, A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C77, D45, D61, D65, D85, D95, E47, E51, F150, F196, F46, G110, G126, G36, G43, G52, I107, I194, I49, I5, I60, I89, L114, L42, L53, L68, L78, L84, M111, N59, N94, P146, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, R101, R4, S112, S121, S72, T116, T120, T127, T13, T57, T96, V113, V125, V17, V19, V32, V87, W149, Y129 y Y73, Y99, A108, A44, C7, D10, D106, D31, D61, D85, E26, E51, F100, F28, F46, G110, G22, G36, G43, G52, G70, I107, I153, I49, I5, I89, K3, L105, L53, L6, L78, L86, M1, N69, P104, P146, P18, P24, P30, P83, Q117, Q40, Q41, R102, R27, R33, R4, S121, S72, S76, T120, T128, T13, T35, T80, T96, V115, V118, V32V48, V87, W34, G190, V191, G193, T197, E198, A199, R202, D203, G205, V206, A209, E210, Q211, S214 y L215.
23.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe una relación de hidrólisis de perácido de entre aproximadamente 1,2 y aproximadamente 1,5, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que la relación se determina usando ensayos de hidrólisis de perácido como se describen en el ejemplo 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, C7, D106, D31, D61, D85, E26, E50, E51, F100, F150, F28, F46, G110, G126, G22, G70, I107, K3, L105, L42, L6, L78, M111, N59, N69, P104, P146, P148, P18, P30, P63, Q117, Q40, Q41, R102, R27, R33, R4, S54, S76, T116, T120, T128, T64, T80, T96, V113, V115, V118, W34 e Y73.
24.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de al menos aproximadamente 1,2, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del

grupo constituido por C7, D10, L12, G 15, P18, V19, G22, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, G36, Q40, Q41, L42, G43, A44, D45, F46, E47, I49, E51, L53, S54, A55, T57, D61, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, A71, S72, Y73, S76, L78, A79, T80, L82, P83, D85, L86, D95, K97, R101, T103, P104, L105, D106, I107, L109, M111, V113, Q117, V118, S121, G124, V125, G126, T127, P148, F150, I153, F154 y F196.
25.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio en la perhidrólisis tal que la relación de perhidrólis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,8 o menos, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C7, C77, D10, D106, D21, D45, D61, D62, D65, D85, E26, E47, E50, E51, F100, F150, F154, F196, F28, F46, G110, G124, G126, G15, G22, G36, G52, G70, I107, I153, I194, I49, I5, I60, I89, K3, K97, L105, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L6, L68, L78, L82, L84, K86, M1, M111, N59, N94, P146, P18, P24, P30, P66, P83, Q40, Q41, R101, R102, R27, R33, R4, R56, R67, S11, S112, S54, S72, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T25, T35, T57, T64, T80, T96, V113, V115, V118, V125, V17, V19, V32, V48, V87, W 13, W149, W16, W34, Y129, Y73 y Y99.
26.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C7, C77, D10, D106, D21, D31, D45, D61, D62, D65, D85, E26, E47, E50, E51, F100, F150, F154, F196, F28, F46, G110, G124, G126, G15, G22, G36, G43, G52, G70, I107, I153, I194, I49, I5, I60, I89, K3, K97, L105, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L6, L68, L78, L82, L84, L86, M1, M111, N59, N69, N94, P104, P146, P148, P18, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, Q40, Q41, R101, R102, R27, R33, R4, R56, R67, S11, S112, S121, S54, S72, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T25, T35, T57, T58, T64, T80, T96, V113, V115, V118, V125, V17, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, Y129, Y73 y Y99.
27.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural está entre aproximadamente 1,2 y aproximadamente 2, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por C7, D10, L12, G15, P18, V19, G22, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, G36, Q40, Q41, L42, G43, A44, D45, F46, E47, I49, E51, L53, S54, A55, T57, D61, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, A71, S72, Y73, S76, L78, A79, T80, L82, P83, D85, L86, D95, K97, R101, T103, P104, L105, D106, I107, L109, M111, V113, Q117, V118, S121, G124, V125, G126, T127, P148, F150, I153, F154, F196, G190, E198, A199, R202, D203, V206, A209, E210, Q211 y V212.
28.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural está entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2,5, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A44, C7, D10, D85, D95, E26, E47, I107, L12, L42, P104, P148, S54, Q40, Q117, D203, V206, E210.
29.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural está entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A44, C7, I107, K97, L12, L78, P104, Q40 y V125.
30.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un

cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural está entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 5, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por D10, D85, L53, L78 y S54.
31.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,1 o menos, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16 y W34.
32.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,2 o menos, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, y en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V 19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W 149, W16, W34, Y129 y Y73.
33.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,3 o menos, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34 y Y129.
34.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,4 o menos, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W 16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, I89, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, I194, I89, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19 y V87.
35.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa

natural es de aproximadamente 0,5 o menos, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, I89, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, I194, I89, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, D10, D23, E26, E50, E51, F150, G110, G126, G15, G36, I107, I49, I5, K97, L109 ,L119, L12, L38, L6, L68, L84, L86, M111, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34 e Y129.
36.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,6 o menos, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, I89, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, I194, I89, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, D10, D23, E26, E50, E51, F150, G110, G126, G15, G36, I107, I49, I5, K97, L109 ,L119, L12 L38, L6, L68, L84, L86, M111, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34, Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, g126, G36, G52, I107, I5, 189, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, W149 e Y73.
37.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,7 o menos, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, y en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, I89, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, I194, I89, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, D10, D23, E26, E50, E51, F150, G110, G126, G15, G36, I107, I49, I5, K97, L109 ,L119, L12 L38, L6, L68, L84, L86, M111, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34, Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, g126, G36, G52, I107, I5, I89, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115,V118, V32, V48, V87, W149,Y73, A122, A23, A29, A71, A79, C7, D61, D62, D85, E26, E51, F100, F28, F46, G110, G126, G52, G70, I107, I49, I5, I60, I89, L109, L114, L12, L38, L68, L82, L86, M111, N59, N94, P83, R102, R33, R4, S112, S72, S76, T103, T116, T128, T25, T35, T57, T58, T64, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73 y Y99.
38.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un

cambio de perhidrólisis tal que la relación de perhidrólisis de variante de perhidrolasa a perhidrólisis de perhidrolasa natural es de aproximadamente 0,8 o menos, en la que la relación se determina usando ensayos de perhidrólisis como se describen en el ejemplo 2, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A23, A55, D10, D62, F150, F196, F28, G110, G52, G70, I107, I194, I5, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, S11, 854. T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, G110, G22, G52, G70, I194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, D10, D62, F150, G110, G22, G70, I153, I194, I60, I89, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, M111, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, S11, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, G110, G126, G22, I194, I89, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, D10, D23, E26, E50, E51, F150, G110, G126, G15, G36, I107, I49, I5, K97, L109 ,L119, L12 L38, L6, L68, L84, L86, M111, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34, Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, g126, G36, G52, I107, I5, I89, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115,V118, V32, V48, V87, W149,Y73, A122, A23, A29, A71, A79, C7, D61, D62, D85, E26, E51, F100, F28, F46, G110, G126, G52, G70, I107, I49, I5, I60, I89, L109, L114, L12, L38, L68, L82, L86, M111, N59, N94, P83, R102, R33, R4, S112, S72, S76, T103, T116, T128, T25, T35, T57, T58, T64, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73, Y99, A108, A122, A29, A55, C77, D10, D106, D45, D61, D62, D65, D85, E47, E50, F100, F150, F28, F46, G110, G124, G126, G15, G36, I153, I194, I5, I60, I89, K3, K97, L10S, L109, L114, L119, L38, L42, L68, L84, L86, M1, N59, P24, P30, P83, R101, R27, R4, R56, S112, S54, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T35, T64, V113, V17, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73 e Y99.
39.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha variante exhibe una mayor actividad de perhidrólisis y una actividad de hidrólisis de perácido reducida en comparación con la perhidrolasa natural.
40.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha perhidrolasa exhibe una relación de actividad de perhidrólisis de al menos aproximadamente 1,2 y una relación de actividad de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,8 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que las relaciones se determinan usando ensayos de perhidrólisis e hidrólisis de perácido como se describen en los ejemplos 2 y 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A29, A44, A55, A71, A79, C7, D10, D106, D31, D85, E26, E47, F150, F154, F196, F28, G124, G126, G36, G43, I153, L109, L42, L53, L109, L42, L53, L109, L42, L53, L68, L82, L86, M111, N69, P104, P148, P18, P63, P66, P83, Q117, Q40, R101, R67, S54, S121, S72, S76, T25, T64, V115 y V19.
41.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 7, en la que dicha perhidrolasa exhibe una relación de actividad de perhidrólisis de al menos aproximadamente 1,2, una relación de actividad de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0,8 o menos y una relación de concentración de proteína de al menos 0,5, en comparación con la perhidrolasa natural, en la que las relaciones se determinan usando ensayos de perhidrólisis e hidrólisis de perácido como se describen en los ejemplos 2 y 3, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A29, A44, A71, A79, C7, D85, E26, E47, E51, F150, F154, F196, F28, G124, G126, G36, I153, L109, L12, L53, L68, L82, M111, N69, P104, P148, P18, P63, P66, P83, Q117, Q40, R101, R67, S121, S54, S72, S76, T25, T64, V125 y V19.
42.

Una variante de perhidrolasa de la reivindicación 1, en la que dicha variante de perhidrolasa exhibe un aumento de la expresión de dicha variante de perhidrolasa en comparación con la expresión de perhidrolasa natural, en la que dicha modificación comprende al menos una sustitución en una posición del aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y en la que dicha al menos una sustitución se selecciona del grupo constituido por A2, I5, C7, F8, S11, L12, T13, W14, W16, V17, P18, V19, E20, G22, A23, P24, T25, A29, P30, V32, T35, G36, V37, A39, F46, E47, S54, A55, R56, T58, I60, D61, D62, P63, T64, P66, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, L74, P75, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, L86, 89, T93, T96, K97, A98, Y99, F100, R101, R102, T103, P104, L105, D106, I107, A108, L109, G110, S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P130,

P132, K133, L135, V136, S138, P141, L142, A143, M145, H147, W149, F150, Q151, I153, G157, Q159, T161, T162, L164, A165, R166, V167, Y168, A170, L171, A172, M175, K176, P178, A182, G183, S184, V185, I186, T188, I194, F196, V191, N201, L208, A209, Q211, Q213, S214, L215 y L216.
43.

Una perhidrolasa aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la perhidrolasa comprende al menos tres restos seleccionados del grupo constituido por L6, W14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, G110, L114, L135, F180, G205, S11, D192 y H195.
44.

Una perhidrolasa aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que tiene actividad perhidrolasa, en la que dicha perhidrolasa está en forma de un multímero en disolución.
45.

La perhidrolasa de la reivindicación 44, en la que dicha proteína está en forma de un multímero en disolución y dicha proteína se selecciona del grupo constituido por perhidrolasa de M. smegmatis, homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis y variantes de perhidrolasa de M. smegmatis.
46.

La proteína aislada de la reivindicación 44 o la reivindicación 45, en la que:

(i)

dicha proteína es una perhidrolasa que comprende un dímero; o

(ii)

dicha proteína es una perhidrolasa que comprende un octámero; o

(iii) dicha proteína se selecciona del grupo constituido por serina hidrolasas modificadas y cisteína hidrolasas modificadas, en la que dichas serina hidrolasas modificadas y cisteína hidrolasas modificadas comprenden una actividad perhidrolasa aumentada en comparación con las serina hidrolasas no modificadas o cisteína hidrolasas no modificadas.
47.

Una perhidrolasa aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que tiene actividad perhidrolasa, en la que dicha perhidrolasa comprende al menos un motivo seleccionado del grupo constituido por GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSNARTT y SDSL-GRTT.
48.

Una variante de perhidrolasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha variante de perhidrolasa tiene una especificidad de sustrato alterada en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural.
49.

Una variante de perhidrolasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha variante de perhidrolasa tiene un pI alterado en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural.
50.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 48, en la que dicha variante tiene actividad de caproato de para-nitrofenilo (PNC) alterada, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural.
51.

La variante de perhidrolasa de la reivindicación 49, en la que:

(a)

dicha variante de perhidrolasa comprende al menos una mutación cargada positivamente; o

(b)

dicha variante de perhidrolasa comprende al menos una mutación cargada negativamente.
52.

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una perhidrolasa de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, o una secuencia complementaria de la misma.
53.

Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 52.
54.

Una célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 53.
55.

Un procedimiento de producción de una enzima que tiene actividad perhidrolasa que comprende:

(a)

transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica perhidrolasa que es al menos un 70% idéntico al polinucleótido de la SEQ ID NO:1;

(b)

cultivar dicha célula hospedadora transformada en condiciones adecuadas para que dicha célula hospedadora produzca dicha perhidrolasa; y

(c)

recuperar dicha perhidrolasa.
56.

El procedimiento de la reivindicación 55, en el que dicha célula hospedadora se selecciona del grupo constituido por especies de Streptomyces, Pantoea, Escherichia y Bacillus.
57.

Una composición que comprende una perhidrolasa aislada de la reivindicaciones 1 a 50.
58.

La composición de la reivindicación 57, que es una composición limpiadora, una composición blanqueante o una composición desinfectante.
59.

Una composición limpiadora que comprende: a) al menos un 0,0001% en peso de dicha perhidrolasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

50; b) una molécula que comprende un resto éster; y c) opcionalmente, un ingrediente auxiliar.
60.

Una composición limpiadora de la reivindicación 59, que comprende: a) al menos un 0,001% en peso de dicha perhidrolasa; b) un material seleccionado del grupo constituido por una fuente de peroxígeno, peróxido de hidrógeno

y mezclas de los mismos, estando seleccionada dicha fuente de peroxígeno del grupo constituido por:

i. una sal de perácido;

ii. un peroxiácido orgánico;

iii. complejo de urea-peróxido de hidrógeno;

iv.

una mezcla de carbohidrato y carbohidrato oxidasa, y

v.

mezclas de los mismos; c) de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50% en peso de una molécula que comprende un

resto éster; y d) opcionalmente, un ingrediente auxiliar.
61.

Una composición limpiadora según la reivindicación 60, comprendiendo dicha composición un ingrediente auxiliar.
62.

Una composición limpiadora según la reivindicación 60 o 61, en la que dicho ingrediente auxiliar se selecciona del grupo constituido por tensioactivos, agentes de refuerzo, agentes quelantes, agentes inhibidores de la transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas y estabilizadores enzimáticos, materiales catalíticos, activadores de blanqueamiento, reforzadores de blanqueamiento, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de eliminación de suciedad de arcilla/antirredeposición, abrillantadores, supresores de jabonaduras, tinte, perfumes, agentes elastificantes de la estructura, suavizantes de la tela, vehículos, hidrotropos, auxiliares de procesamiento, pigmentos y mezclas de los mismos.
63.

Una composición limpiadora según la reivindicación 62, en la que: a) dicha perhidrolasa exhibe una relación molar de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 0,1;

b) dicha sal de perácido se selecciona del grupo constituido por perborato de metales alcalinos, percarbonato de metales alcalinos, perfosfatos de metales alcalinos, persulfatos de metales alcalinos y mezclas de los mismos;

c) dicho carbohidrato se selecciona del grupo constituido por monocarbohidratos, dicarbohidratos, tricarbohidratos, oligocarbohidratos y mezclas de los mismos;

d) dicha carbohidrato oxidasa se selecciona del grupo constituido por aldosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.9), galactosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.9), celobiosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.25), piranosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.10), sorbosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.11), hexosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.5), glucosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.4) y mezclas de las mismas; y

e) dicha molécula que comprende un resto éster tiene la fórmula: R1Ox [(R2)m (R3)n]p

(i)

en la que R1 es un resto seleccionado del grupo constituido por H, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos;

(ii) cada R2 es un resto alcoxilato;

(iii) R3 es un resto formador de éster que tiene la fórmula: R4CO- en la que R4 es H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo;

(iv)

x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un entero que es menor o igual al número de carbonos de R1;

(v)

p es un entero que es menor o igual a x;

(vi)

m es un entero de 0 a 50; y

(vii) n es al menos 1.
64.

La composición limpiadora de la reivindicación 63, en la que: a) R1 es un resto alquilo o heteroalquilo C2-C32 sustituido o no sustituido; b) cada R2 es independientemente un resto etoxilato o propoxilato; y c) m es un entero de 1 a 12.
65.

La composición limpiadora de la reivindicación 64, en la que R3 es un resto formador de éster que tiene la fórmula: R4CO- en la que R4 es: a) un resto alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o no sustituido que comprende de 1 a 22 átomos de carbono; o

b) un resto alquilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo sustituido o no sustituido que comprende de 4 a 22 átomos de carbono.
66.

La composición limpiadora de la reivindicación 63, en la que la molécula que comprende el resto éster tiene la fórmula: R1Ox[(R2)m(R3)n]p en la que:

a) R1 es H o un resto que comprende un resto amino primario, secundario, terciario o cuaternario, estando seleccionado dicho resto R1 que comprende un resto amino del grupo constituido por alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos;

b) cada R2 es un resto alcoxilato; c) R3 es un resto formador de éster que tiene la fórmula: R4CO en la que R4 puede ser H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos; d) x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un entero que es menor o igual al número de

carbonos de R1; e) p es entero que es menor o igual a x f) m es un entero de 0 a 12; y g) n es al menos 1.
67.

La composición limpiadora de la reivindicación 60, en la que dicha molécula que comprende un resto éster tiene un peso molecular medio ponderado menor de 600.000 Da.
68.

La composición limpiadora de la reivindicación 67, en la que dicho ingrediente auxiliar se selecciona del grupo de tensioactivos, agentes de refuerzo, agentes quelantes, agentes inhibidores de la transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas y estabilizadores enzimáticos, materiales catalíticos, activadores de blanqueamiento, reforzadores de blanqueamiento, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de eliminación de suciedad de arcilla/antirredeposición, abrillantadores, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, agentes elastificantes de la estructura, suavizantes de la tela, vehículos, hidrotropos, auxiliares de procesamiento, pigmentos y mezclas de los mismos.
69.

La composición blanqueante o desinfectante de la reivindicación 58, que comprende adicionalmente al menos una enzima o derivado de enzima adicional seleccionado del grupo constituido por proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas, lisozima, enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la pared celular fúngica, hemicelulasas y celulasas.
70.

La composición blanqueante o desinfectante según la reivindicación 58, en la que la composición comprende adicionalmente un éster y una fuente de peróxido de hidrógeno.
71.

La composición blanqueante o desinfectante según la reivindicación 70, en la que el éster se selecciona del grupo constituido por: diacetato de propilenglicol, diacetato de etilenglicol y triacetina.
72.

La composición blanqueante o desinfectante según la reivindicación 70, en la que la fuente de peróxido de hidrógeno comprende percarbonato de sodio.
73.

Un procedimiento de desinfección y/o blanqueamiento de una superficie o artículo, comprendiendo el procedimiento poner en contacto dicha superficie o artículo con una perhidrolasa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51, o con una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 58 y

70 a 72.
74.

El procedimiento según la reivindicación 73, en el que la superficie o artículo se selecciona de

productos textiles, superficies duras, papel, pulpa, cabello, dientes, piel, dispositivos médicos, equipamientos 5 médicos, equipamientos industriales y fermentadores.
75. Uso de una perhidrolasa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51 de o una composición como se define en la reivindicación 57 para el control de biopelículas.

10 76. Un procedimiento de limpieza que comprende las etapas de: a) poner en contacto una superficie y/o artículo que comprende una tela con una composición limpiadora como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 58 a 68 y b) lavar y/o aclarar opcionalmente la superficie o material.