CN101821385A - 稳定的酶促过酸产生系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含过水解酶、过氧化氢来源和酯底物的稳定组合物，其能高效产生水性过酸溶液。产生的过酸溶液适于对被病原体或毒性化学品污染的宽范围的材料和设备进行去污和/或卫生处理。在一种优选的实施方式中，所述稳定组合物包含酰基转移酶、过碳酸钠和丙二醇二乙酸酯，并可稳定30天或更长。加入水中后，组合物被活化，产生具有高的过乙酸对乙酸比例的水溶液。

Description

稳定的酶促过酸产生系统
与相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2007年5月10日的美国临时申请No.60/917,252的权益，该申请通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及包含过水解酶(perhydrolase)、过氧化氢来源和酯底物的稳定组合物，其能高效产生水性过酸溶液，所述溶液适用于涉及多种化学和生物战争材料的去污以及适用于一般的表面清洁和去污。
发明背景
过酸作为去污/消毒剂被广泛接受。最特别地，过乙酸(也被称为“过氧乙酸”或“PAA”)被广泛使用，例如用于对食品工业和医院中使用的物品进行灭菌以及用于对生物毒害进行去污。PAA还可用作为漂白化学品，用于清洁组合物和工业工艺，例如，对纸浆漂白。PAA分解为易于在污水处理工厂降解的化合物，因此，其使用后所引起的废物处理问题相对较少。其针对微生物有较宽的活性谱，并且甚至在低温下也是有效的。
现有技术中已经描述了用于制备水性PAA溶液的大量非酶促、化学或电化学方法。见，例如，美国专利Nos.6,677,477、6,211,237、6,171,551、5,350,563和4,137,256，它们每份都通过引用并入本文。
典型的可商业获得的水性PAA溶液含有按重量计大约15％的PAA、按重量计大约14％的过氧化氢和按重量计28％的乙酸。这种类型的PAA溶液具有令人不喜的腐蚀性和助燃性质，因此使用它们会导致操作、贮藏、材料和运输方面的问题。因此，PAA具有大的化学“足迹(footprint)”——这意味着该化学品的安全生产和使用需要过度的能量和资源。
此外，这些商业溶液中，乙酸对PAA的比例较高，从而加剧了与清洁工艺期间不锈钢容器腐蚀相关的问题。乙酸的比例较低将降低用PAA清洁之后进一步处理(例如，钝化)钢容器的需求。
可通过开发用于在水溶液中原位产生过酸的酶促系统，来削弱这些问题中的一些。酶促过酸产生系统提供了大量显著的好处，因为基于水的生物化学溶剂的非苛性特性，使得使用者可安全使用该系统，而无须恐惧对其自身、其设备或环境的伤害。此外，因为酶系统易于运输，易于使用，并且较之传统去污方法需要使用的水少得多，故而也降低了后勤负担。此外，典型地，酶促过酸产生系统的副产物是可生物降解的。例如，PAA自发分解为乙酸或丙酸。
2006年12月8日提交的PCT/US06/47022(其通过引用并入本文)公开了能以足够用于去污和消毒应用范围的量高效产生水性过酸溶液的酶。在一些实施方式中，PCT/US06/47022公开了来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶及变体，当酶与过碳酸盐(percarbonate)和丙二醇二乙酸酯(PGDA)一起加入水中时，它们产生水性PAA溶液。
水溶性容器(container)提供了将经预测量的组合物递送到水溶液中的方便途径。已在大量美国专利中描述过与清洁组合物一起使用的此类容器。例如，美国专利No.5,783,541教导了一种放置在水溶性膜中的餐具洗涤组合物，其中水溶性膜被水不溶的胶包覆。美国专利No.6,037,319教导了一种水溶性囊(sachet)，其中含有含醇(alcohol)和己二醇的清洁组合物。美国专利No.6,465,413公开了含在水溶性膜囊中的洗衣和餐具洗涤产物，其中，该制剂包含颗粒化的过碳酸化合物，其与包含硫酸盐、羧甲基纤维素和非离子表面活性剂的包囊掺合物混合，并被封装于其中。美国专利No.6,492,312公开了一种水溶性囊，其中包含此类餐具洗涤组合物以及能增强在餐具洗涤机中的清洁的离散颗粒。US 20030199415 Al教导了一种清洁系统，其中包含含有液体清洁组合物的浓缩物的水溶性囊，所述组合物具有优秀的泡沫瓦解性质和优秀的油脂切割性质。
美国专利No.7,052,520公开了一种水可透过但并非水溶性的产品，其被称为“囊”或“生物袋(bio-bag)”，用于酶促织物清洁。该“生物袋”不溶于水，但含有产生酶的微生物，含有的方式使得它们不能从其中分散进清洗用水中。
尽管本领域中有了上述进展，但仍需要产生过酸的下述酶促系统，它们展示出更高的稳定性、更好的易用性，同时能减轻在商业去污应用中使用这类化学品产生的贮藏、运输和总体化学问题。
发明内容
本发明提供了在水溶液中酶促产生过酸的稳定的组合物、系统和试剂盒，并且它们可用于宽范围的去污方法和应用。
在一些实施方式中，本发明提供了可用于在水溶液中产生过酸的稳定的组合物，其中所述组合物包含：具有过水解酶活性的酶、过氧化氢来源和酯底物。通过加入到水中来活化这三种活性成分，导致水性过酸溶液的产生。本发明惊人地发现，这些组合物在活化(即，加入到水中)之前高度稳定，其中，稳定性对应于组合物在加入到水中时以能有效对物品进行卫生处理、消毒和/或去污的量产生过酸的能力。即，本发明的稳定的组合物能将其加入进水后产生过酸的能力(即，过酸产生活性)保持至少7天，大约14天，大约30天，大约60天或更长。
在一些实施方式中，稳定的组合物包括另外的活性成分，例如另外的酶、表面活性剂、洗涤剂(detergent)制剂和/或清洁组合物。但是，在一种优选的实施方式中，组合物包括三种活性成分：酰基转移酶、过氧化氢来源和酯底物。
在一种优选的实施方式中，稳定的组合物包含来自耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的酰基转移酶(MsAcT)、过碳酸钠和丙二醇二乙酸酯(PGDA)，其中，所述的酶和过碳酸盐是悬浮于液体PGDA中的固体。在一些实施方式中，过水解酶包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其变体或同源物。在一种实施方式中，过水解酶是SEQ ID NO：1的S54V变体。
在一种实施方式中，组合物包含按重量计大约0.001％至大约1％的MsAcT、按重量计大约35％至大约45％的过碳酸钠和按重量计大约65％至大约55％的丙二醇二乙酸酯。加入到水中时，稳定的组合物被活化，并开始产生过乙酸(PAA)。不管这些组合物之前于环境温度下贮藏至少7天，大约14天，大约30天，大约60天或更长时间后，水中产生的PAA的重量百分比并不显著减少。
在优选的实施方式中，得到的通过稳定的组合物产生的过酸水溶液是按重量计至少大约0.08％、0.16％、0.24％、0.32％、0.40％或更高百分比的过酸。在产生PAA的稳定组合物的实施方式中，得到的通过稳定的组合物产生的PAA水溶液为按重量计至少大约0.08％、0.16％、0.24％、0.32％、0.40％或更高百分比的PAA。在一种优选的实施方式中，PAA水溶液为按重量计至少大约0.16％PAA。
此外，通过加入到水中的稳定的组合物的酶促活性生产的过酸与酸的比例为至少大约2∶1、4∶1、5∶1、10∶1、20∶1或者甚至更高。在产生PAA的稳定组合物的实施方式中，加入到水中时产生的PAA与乙酸的比例为至少大约2∶1、4∶1、5∶1、10∶1、20∶1或者甚至更高。
本发明提供了在水溶液中产生过酸的系统和试剂盒，它们基于稳定的组合物的实施方式。因此，在一种实施方式中，本发明提供了在水溶液中产生过乙酸的系统，其中包含处于水溶性容器中的任何本发明的稳定组合物。在一些实施方式中，容器是从水溶性聚合物(优选地，聚乙烯醇聚合物)形成的。通常，水溶性容器可以是任何形式的，优选是囊、安瓿、胶囊或小球。在一种优选的实施方式中，水溶性容器是包含聚乙烯醇膜的囊。
在另一实施方式中，本发明提供了用于去污的试剂盒，其中包含包装的下述物质的组合：(a)处于密封容器中的、预先测量的量的任何本发明的稳定组合物，其中，稳定组合物的量能在加入到设定体积的水之后产生按重量计至少大约0.16％过乙酸的水溶液，和(b)使用稳定组合物的说明书。在一种实施方式中，试剂盒的密封容器足够大，从而能装下所述设定体积至少两倍的水。在另一实施方式中，试剂盒还包含包装在水溶性容器中的稳定组合物，所述水溶性容器包装在所述密封容器中。在一种优选的实施方式中，水溶性容器是聚乙烯醇膜制成的囊。在一种备选实施方式中，试剂盒的包装组合还包含处于第二密封容器中的设定体积的水，其中，所述水是经灭菌的。
通常，本发明的稳定组合物和包括稳定组合物的系统和试剂盒可用于多种方法，来制备用于对物品进行去污、消毒和/或卫生处理的水溶液。因此，本发明还提供了制备去污溶液的方法，所述方法包括向水中加入可用于产生过乙酸的稳定组合物，混合至少大约30分钟，20分钟，15分钟，10分钟或者甚至更少的分钟。
在一些实施方式中，用于去污的方法包括：(a)提供稳定的组合物，其中包含：具有过水解酶活性的酶，其中所述活性包含至少2∶1的过水解与水解的比例；过氧化氢来源和酯底物；以及(b)将所述组合物加入水中，混合至少20分钟，由此产生按重量计至少大约0.16％过乙酸的水溶液，以及小于大约9.0的pH；和(c)将包含污染物的物品暴露给所述溶液。在一种实施方式中，稳定组合物的溶液不包括能缓冲pH的其它成分。
在一种优选的实施方式中，本发明的去污方法包括：(a)提供稳定的组合物，其中包含酰基转移酶、过氧化氢来源和丙二醇二乙酸酯；(b)将所述组合物加入到水中，混合至少20分钟，由此产生按重量计至少大约0.16％的过乙酸的水溶液；和(c)将包含污染物的物品暴露给所述溶液。在制备溶液的方法的一些实施方式中，提供的稳定的组合物包含按重量计大约0.001％至大约1％的MsAcT，按重量计大约35％至大约45％的过碳酸钠以及按重量计大约65％至大约55％的丙二醇二乙酸酯。
在所述方法的一种优选的实施方式中，稳定的组合物被包含在水溶性容器中，并将该容器加入到水中。在一种优选的实施方式中，水溶性容器是从水溶性聚合物(优选地，聚乙烯醇聚合物)形成的囊、安瓿、胶囊或小球(sphere)。
在多种实施方式中，本发明的方法针对宽范围的污染物有用，所述污染物包括：选自肉毒杆菌毒素、炭疽毒素(anthracis toxin)、蓖麻毒蛋白、鲭毒素、鱼肉毒素、河鲀毒素、真菌毒素及其任何组合的毒素；选自细菌、病毒、真菌、寄生物、朊病毒及其任何组合的病原体。在一种实施方式中，本发明的方法针对生物薄膜有用，包括通过病原体形成的那些，所述病原体包括但不限于：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SRWC-10943)和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(ATCC 19112)。
在多种实施方式中，本发明的方法可用于对宽范围的被污染物品进行去污和/或卫生处理，所述物品包括：硬表面、织物、食品、饲料、衣服、小地毯(rug)、地毯、纺织品、医疗仪器、兽医仪器、药物加工设备和生物技术加工设备。在一种优选的实施方式中，使用本发明的稳定组合物产生的PAA溶液可用于对用于药物和生物技术工艺中的不锈钢设备(包括大反应器)进行卫生处理。
附图简述
图1提供的图显示了从过氧化氢或过碳酸盐酶促产生PAA。
图2提供的图显示了从葡萄糖和丙二醇二乙酸酯产生PAA。
图3提供的图显示了三种不同温度下PAA的产生(21℃、40℃和60℃)。
图4提供的图显示了乙酰基转移酶生产浓缩PAA的能力。
发明详述
I.综述
本发明提供了在水溶液中酶促产生过酸的稳定组合物、系统、试剂盒，它们可用于宽范围的去污方法和应用。本发明部分基于下述惊人发现：包含过水解酶(例如酰基转移酶)、过氧化氢来源和酯底物(例如丙二醇二乙酸酯)的组合物在使用前极其稳定。事实上，这三种组分的组合物可稳定至少7天，大约14天，大约30天，大约60天或者更长，其中稳定性对应于加入到水中时产生有效量的过酸的能力。
过酸(例如过乙酸)是已被详细分析过的去污剂，其被接受和批准用于宽范围的应用。在水中原位酶促产生过酸是根据本发明的稳定组合物、系统和试剂盒的一种优选实施方式来进行，这是人们需要的，因为其比在溶剂中进行反应化学产生要安全得多，并且需要的体积要少得多。因此，本发明提供了一种稳定的组合物，其可方便、简单地使用，并且对宽范围的去污方法和技术高度有效。例如，本发明的稳定的组合物可在对化学和生物战争材料的去污中使用，以及用于对一般表面的清洁和去污。
在一种优选的实施方式中，稳定的组合物包含酰基转移酶，来自耻垢分枝杆菌的MsAcT，和作为过氧化氢来源的过碳酸钠。在一种实施方式中，组合物包含按重量计大约0.001％至大约1％的MsAcT，按重量计大约35％至大约45％的过碳酸钠以及按重量计大约65％至大约55％的丙二醇二乙酸酯。
较之目前使用的利用过酸来清洁、消毒和/或去污的方法，本发明的稳定组合物提供了多种优点。显而易见地，所述组合物是稳定的“多合一”组合物，其中，所有成分都配制到一起(例如，在单个容器或包装中)。由此，使用所述组合物仅需要将单个容器的内含物加入到水中。此外，本发明还提供了处于密封的水溶性容器中的稳定组合物，其允许甚至无需开启容器的进一步的便利性。作为代替，水溶性容器中的组合物被加入到水中，由此提供了便于用于去污的水溶液。
II.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解相同的含义。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第二版，John Wiley和Sons，NY(1994)；以及Hale和Marham，The Harper CollinsDictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的很多术语的通用词典。虽然与本文所述相似或相当的任何方法和材料都可用于本发明的实践，但本文中描述了一些优选的方法和材料。因此，将参照作为整体的申请文件来完整描述下文紧接着定义的术语。此外，在本文中使用时，单数形式的术语“一个/种”、“这个/种”(“a”、“an”和“the”)也包括复数指代，除非上下文另有清楚指明。除非另有指示，分别地，核酸都是从左到右按照5’到3’的方向书写的；氨基酸序列都是从左到右按照氨基到羧基的方向书写的。应当理解，本发明不局限于所描述的特定的方法、方案和试剂，这些可以根据本领域技术人员使用它们的背景而有所变化。
本申请文件通篇中给出的每个最大数值限制都意欲包括每个比其较低的数值限制，就和这些较低的数值限制在本文中明确写出来一样。本申请文件通篇中给出的每个最小数值限制都将包括每个比其较高的数值限制，就和这些较高的数值限制在本文中明确写出来一样。本申请文件通篇中给出的每个数值范围都将包括落在这些较宽的数值范围中的每个比其较窄的数值范围，就和这些较窄的数值范围在本文中明确写出来一样。
在本文中使用时，术语“酶”表示催化化学反应的任何蛋白。酶的催化功能组成其“活性”或者“酶促活性”。典型地按照其发挥的催化功能的类型对酶加以分类，所述功能例如，对肽键的水解。
在本文中使用时，术语“底物”表示这样的物质(例如，化学化合物)，酶在其上发挥酶的催化活性从而产生产物。
“过水解酶”指能催化过水解反应的酶，所述反应导致产生足够高的量的、适于例如清洁、漂白、消毒或灭菌应用的过酸。通常，用于本文所述的方法中的过水解酶展示出高的过水解与水解的比例。在一些实施方式中，过水解酶包含SEQ ID NO：1所示的耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列或其变体或同源物，或者过水解酶由或基本上由SEQ ID NO：1所示的耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列或其变体或同源物构成。在一些实施方式中，过水解酶包含酰基转移酶活性，其能催化水性酰基转移反应。
“过酸”是式RC(＝O)OOH的有机酸。
“过水解”及其各种词性形式指产生过酸的酶促反应。在一些实施方式中，过酸是通过在过氧化氢(H2O2)存在下对式R1C(＝O)OR2的酯底物过水解产生的，其中，R1和R2是相同或不同的有机部分。
短语“过氧化氢来源”包括过氧化氢以及能自发或酶促产生作为反应产物的过氧化氢的系统的组分。
短语“过水解与水解的比例”指在给定的条件下和给定的时间内，通过过水解酶从酯底物酶促产生的过酸的量与酶促产生的酸的量的比例。
在本文中使用时，术语“酰基”指下述有机酸基团，其是羧酸中除去羟基(-OH)基团之后的剩余物(例如，乙酰氯，CH3CO-Cl是从乙酸CH3CO-OH形成的酰氯)。通常各酰基基团的名称是通过用“酰”代替酸的“酸”形成的(“-yl”代替“-ic”)。
在本文中使用时，术语“酰化”指这样的化学转化，其中，酰基(RCO-)基团被取代进分子，通常是针对-OH基团的活性氢。
在本文中使用时，术语“转移酶”指催化官能团从一个底物转移到另一个底物的酶。
在本文中使用时，术语“酶促转化”指通过将底物或中间产物与酶接触，将底物或中间产物修饰为产物。在一些实施方式中，接触通过将底物或中间产物直接暴露给合适的酶来进行。在其它一些实施方式中，接触包括将底物或中间产物暴露给表达和/或排出所述酶的生物和/或能将想要的底物和/或中间产物分别代谢为想要的中间产物和/或最终产物的生物。
在本文中使用时，“酶的有效量”表示获得特定应用中所需活性必须要的酶的量(例如，通过酰基转移酶生产过乙酸用于去污)。本领域普通技术人员易于确定此类有效量，它们基于很多因素，例如所使用的特定酶变体、具体组合物、去污的方法、待去污的物品等等。
在本文中使用时，提到物质(例如酶)或组合物时，术语“稳定性”表示其在某些环境条件下一定时间上保持一定水平的功能活性的能力。此外，术语“稳定性”可用于多种更为具体的上下文，其涉及感兴趣的特定环境条件。例如，在本文中使用时，“热稳定性”表示物质或组合物在增加的温度下保持其功能(即，不降解)的能力。稳定性的实质性改变通过与不存在选用的环境条件时存在的活性相比较而言测定的功能活性半寿期的至少大约5％或更高的增加或减少(在大多数实施方式中，优选是增加)来证实。
在本文中使用时，提到酶时使用的术语“化学稳定性”表示存在对其活性有不利影响的化学品时酶的稳定性。在一些实施方式中，此类化学品包括但不限于过氧化氢、过酸、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、非离子洗涤剂、螯合剂等。但是，本发明并不意欲受限于任何特定的化学稳定性水平或者化学稳定性范围。
在本文中使用时，“pH稳定性”表示物质(例如酶)或组合物在特定pH下发挥功能的能力。可通过本领域技术人员已知的标准流程和/或通过本文所述的方法来测量若干pH下的稳定性。pH稳定性的实质性改变通过与最优pH时的活性相比较而言功能活性半寿期的至少大约5％或更高的增加或减少(在大多数实施方式下，优选是增加)来证实。本发明并不意欲受限于任何pH稳定性水平或pH范围。
在本文中使用时，“氧化稳定性”指物质(例如酶)或组合物在氧化性条件(例如，存在氧化性化学品时)下发挥功能的能力。
在本文中使用时，“氧化性化学品”指具有漂白能力的化学品。氧化性化学品以适于漂白的量、pH和温度存在。该术语包括但不限于过氧化氢和过酸。
在本文中使用时，术语“经纯化”和“经分离”指从样品去除污染物。例如，通过去除污染蛋白和溶液或制备物中并非酰基转移酶的其它化合物来纯化酰基转移酶。
在本文中使用时，术语“污染物”指任何这样的物质，它们通过与另外的物质、材料或物品的接触或结合而使得其对于使用来说是不想要的、不纯的和/或不适合的。
在本文中使用时，术语“被污染的物品”或“需要去污的物品”指与污染物接触或结合和/或需要被去污的任何物品或东西。该术语并不意欲受限于任何特定的东西或物品类型。例如，在一些实施方式中，物品是硬表面，而在其它实施方式中，物品是服装物。在另外一些实施方式中，物品是纺织品。在还有一些实施方式中，物品用于医疗和/或兽医领域。在一些优选的实施方式中，物品是手术仪器。在另一些实施方式中，物品用于运输中(例如，道路、跑道、铁道、火车、汽车、飞机、轮船等)。在另一些实施方式中，该术语在提到食品和/或饲料时使用，这包括但不限于：肉、肉类副产品、鱼、海鲜、蔬菜、水果、乳制品、谷物、烘焙产品、青贮饲料、干草、草料(forage)等。事实上，该术语意欲包括适于使用本文提供的方法和组合物去污的任何物品。
在本文中使用时，术语“去污”指从被污染的物品除去基本上全部或全部污染物。在一些优选的实施方式中，去污包括消毒，在其它一些实施方式中，该术语包括灭菌。但是，该术语并不意欲受限于这些实施方式中，该术语也意欲包括除去没有生命的污染物以及微生物污染(例如，细菌、真菌、病毒、朊病毒等)。
在本文中使用时，术语“消毒”指从物品的表面除去污染物以及在物品的表面上抑制或杀死微生物。但本发明并不意欲受限于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或微生物。
在本文中使用时，术语“灭菌”指在表面杀死所有微生物生物体。
在本文中使用时，术语“杀孢子”指杀死微生物孢子，这包括但不限于真菌和细菌的孢子。该术语包括对防止孢子萌芽有效的组合物以及让孢子完全失活的组合物。
在本文中使用时，术语“杀细菌”、“杀真菌”和“杀病毒”指分别杀死细菌、真菌和病毒的组合物。术语“杀微生物”指抑制任何微生物(包括但不限于细菌、真菌、病毒、原生动物、立克次氏体等)生长和/或复制的组合物。
在本文中使用时，术语“制细菌”、“制真菌”和“抑病毒”指分别抑制细菌、真菌和病毒生长和/或复制的组合物。术语“抑微生物”指抑制任何微生物(包括但不限于细菌、真菌、病毒、原生动物、立克次氏体等)生长和/或复制的组合物。
本文使用术语“清洁组合物”是指可用于从待清洁的物品中去除不想要的化合物的组合物，所述物品如织物、盘碟、隐形眼镜、其它固体底物、毛发(洗发剂)、皮肤(肥皂和乳膏)、牙齿(漱口剂、牙膏)等。该术语还表示适用于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体和/或表面的任何组合物。该术语旨在包括，但不仅限于洗涤剂组合物(例如液体和/或固体衣物洗涤剂、精细织物洗涤剂；硬表面清洁制剂，例如用于玻璃、木、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物翻新剂(freshener)；织物柔软剂；和纺织品及衣物去渍剂(pre-spotter)，以及盘碟洗涤剂)。该术语还包括针对所需的特定类型的清洁组合物及其产品形式(例如液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)而选择的任何材料/化合物，只要该组合物与组合物中使用的洗氨基转移酶、过氧化氢来源PGDA和任何其它酶或物质相容即可。考虑到待清洁的表面、物品或织物，和针对使用期间的清洁条件所需的组合物形式之后，容易对清洁组合物材料做出特定的选择。事实上，除非另有说明，本文使用的术语“清洁组合物”包括颗粒或粉末形式的通用(all-purpose)或强效(heavy-duty)清洗剂，特别是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状形式的通用清洗剂，特别是所谓的强效液体(HDL)型；液体精细织物洗涤剂；手工洗碟剂或轻效(light-duty)洗碟剂，特别是高泡沫型的那些；用于家用和机构应用的机器洗碟剂，包括多种片状、颗粒、液体和漂清助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液(hand-wash)型、清洁棒(cleaningbar)、漱口剂、牙齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波(hair shampoo)和洗发水(hair-rinses)；沐浴凝胶和泡沫浴以及金属清洁剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“污渍粘除(stain-stick)”或预处理型。
本文使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”是指旨在用于清洗介质中的混合物方面使用，所述洗涤介质用于清洁脏污的对象。在一些优选的实施方案中，使用该术语涉及洗涤织物和/或衣服(例如“洗衣洗涤剂”)。在可选的实施方案中，该术语是指其它洗涤剂，例如用于清洁盘碟、刀叉等的洗涤剂(例如“洗盘碟洗涤剂”)。不旨在将本发明限制于任何特定的洗涤剂制剂或组合物。事实上，除了过水解酶(例如酰基转移酶)以外，该术语还旨在包括含有表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂的洗涤剂。
在本文中使用时，当用于清洁组合物材料的上下文中时，术语“酶相容”表示：在正常使用情况下，所述材料不将酶活性降低到相关酶不能像所期待的那样有效的程度。
在本文中使用时，“蛋白”指包含氨基酸并被本领域技术人员识别为蛋白的任何组合物。术语“蛋白”、“肽”和多肽在本文中可互换使用。其中肽是蛋白的一部分的情况下，本领域技术人员理解上下文中所述术语的使用。术语“野生型”和“天然”指自然界中发现的蛋白。在一些实施方式中，野生型蛋白的序列是蛋白工程的起点。
在本文中使用时，术语“相关蛋白”或“同源蛋白”指功能上和/或结构上相似的蛋白(即，具有相似作用和/或结构)。该术语意欲包括从不同物种获得的相同或相似的酶(即，在结构和功能方面)。本发明并不欲受限于来自任何特定来源的相关蛋白或进化上相关的蛋白。此外，术语相关蛋白或同源蛋白包括三级结构同源物和一级序列同源物。因此，所述术语包括具有相对于野生型序列来说是“变体”或“突变体”序列的蛋白。
在本文中使用时，术语“衍生物”是通过在C-和N-末端之一或二者添加一个或多个氨基酸，在氨基酸序列的一个或多个不同位点取代一个或多个氨基酸，和/或在氨基酸序列C-和N-末端的之一或两者或氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸，和/或在氨基酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而从亲本蛋白获得的蛋白。蛋白衍生物的制备通常可通过对编码天然蛋白的DNA序列加以修饰，将经修饰的DNA序列转化进合适的宿主以及表达经修饰的DNA序列以产生衍生蛋白来实现。
相关(和衍生)蛋白包括“变体蛋白”。变体蛋白与亲本蛋白和/或彼此不同，有少量的氨基酸残基差异。在一些实施方式中，有差异的氨基酸残基的数量是大约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50个中的任何。在一些实施方式中，变体有大约1至大约10个氨基酸不同。
在一些实施方式中，相关蛋白，例如变体蛋白，包含至少大约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％、99％或99.5％中任何的氨基酸序列同一性。
在本文中使用时，术语“类似序列”指蛋白中提供与参照蛋白相似的功能、三级结构和/或保守残基的多肽序列。例如，在含有α螺旋或β折叠结构的表位区域中，在类似序列中替换氨基酸能保持同样的结构元件。在一些实施方式中，提供了这样的类似序列，使得产生了展示出与变体所源自的亲本蛋白相似或改进的功能的变体酶。
在本文中使用时，“同源蛋白”指具有与参照蛋白(例如来自不同来源的过水解酶)相似功能(例如酶活性)和/或结构的蛋白(例如过水解酶)。同源物可来自进化上相关或不相关的物种。在一些实施方式中，同源物具有与参照蛋白相似的四级、三级和/或一级结构，因此潜在地允许用来自同源物的类似区段或片段替换参照蛋白中的区段或片段，这较之用来自非同源蛋白的序列替换区段或片段而言对参照蛋白的结构和/或功能的破坏降低。
在本文中使用时，“野生型”、“天然”和“天然存在的”蛋白是在自然界中发现的蛋白。术语“野生型序列”指在自然界中发现的或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些实施方式中，野生型序列是蛋白工程(例如产生变体蛋白)的起点。
III.在水溶液中酶促产生过酸
本发明的稳定组合物包含至少一种酶作为组分(即，成份)。通常，用于本发明中的酶必须具有显著的过水解酶活性，即，导致形成高含量的适用于例如清洁、漂白和消毒等应用的过酸的催化活性。WO05/056782(其通过引用整体并入本文)中描述了具有过水解酶活性的酶用于产生过酸的用途。
典型地，酶促过水解酶活性伴随水解酶活性。事实上，如下文所讨论的，存在过氧化氢时，很多水解酶也作为过水解酶发挥作用。在一些特别优选的实施方式中，本发明的酶具有非常高的过水解酶与水解酶活性的比例，由此产生相对于酸产物而言高比例的过酸(例如，至少大约2∶1、5∶1、10∶1或更高的过酸对酸的比例)。这些不同的酶的这些高的过水解与水解的比例使得这些酶适用于非常宽范围的应用。
除了具有显著的过水解酶活性之外，可用于本发明的稳定组合物中的酶在干燥的或基本不含水的条件下展示出相对较低的活性。在一些实施方式中，当组合物中存在按重量计少于大约1％的水时，稳定组合物的酶组分具有少于大约1％、0.5％、0.2％或少于大约0.1％的活性(过水解酶或水解酶)。在一些优选的实施方式中，当存在按重量计大约2％或更少的水时，酶展示出少于大约0.1％的活性。
在一些实施方式中，过水解酶是天然存在(即，细胞基因组编码的过水解酶)。在一些实施方式中，过水解酶包含下述氨基酸序列或由或基本上由下述氨基酸序列构成，所述氨基酸序列与天然存在的过水解酶的氨基酸序列至少大约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一。
在一些实施方式中，过水解酶具有至少为1的过水解∶水解比例。1.酰基转移酶-来自耻垢分枝杆菌的MsAcT
在一种实施方式中，本发明提供了一种稳定的组合物，其中包含能在水溶液中将过氧化氢和酯底物酶促转化为过酸的酰基转移酶。在一些优选的实施方式中，本发明的稳定组合物使用产生非常高的过水解与水解的比例的酰基转移酶。高的过水解与水解的比例意味着这些酶产生更高产率的过酸，使得它们在产生去污溶液中更为有效。
具有有利的过水解与水解比例使得其特别适用于本发明的酰基转移酶是耻垢分枝杆菌酰基转移酶(MsAcT)。例如，当用于酶促转化来自过碳酸盐的过氧化氢和PGDA时，MsAcT以较之乙酸至少5∶1的过量产生PAA产物。因为MsAcT产生高的PAA与乙酸的比例，得到的水性过酸溶液的pH得以保持为相对低的pH，小于大约pH 10，大约pH 9.0，大约pH 8.5，大约pH 8.0或者大约pH 7.5。此类低pH的PAA(或其它过酸)水溶液被认为较之含有高水平乙酸的典型商业PAA溶液来说对金属不具有腐蚀性(或者至少显著更少的腐蚀性)。
此外，MsAcT在不存在水中基本没有活性。MsAcT酶需要存在显著含量的水(即，相对高的水化作用)，以展示出过水解酶或水解酶活性。典型地，当包括酶的组合物中存在按重量计少于大约1％的水时，MsAcT及其变体展示出少于大约1％、0.5％、0.2％或少于大约0.1％的活性(过水解酶或水解酶)。
WO 05/056782(其通过引用整体并入本文)中描述了野生型耻垢分枝杆菌酰基转移酶。提交于2006年12月8日的PCT/US06/47022(也通过引用并入本文)公开了多种MsAcT变体(包括S54V-MsAcT)以及当将酶与过氧化氢来源和酯底物(例如，丙二醇二乙酸酯(PGDA))一起加入到水中时野生型和变体用于产生水性过酸溶液的用途。
在一些实施方式中，过水解酶是天然存在的耻垢分枝杆菌过水解酶。在一些实施方式中，过水解酶包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其变体或同源物或者由或基本上由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其变体或同源物构成。在一些实施方式中，过水解酶包含下述氨基酸序列或由或基本上由下述氨基酸序列构成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少大约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％相同。
耻垢分枝杆菌过水解酶的氨基酸序列如下文所示：MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGLSARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVIIMLGTNDTKAYFRRTPLDIALGMSVLVTQVLTSAGGVGTTYPAPKVLVVSPPPLAPMPHPWFQLIFEGGEQKTTELARVYSALASFMKVPFFDAGSVISTDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL(SEQ IDNO：1)
编码耻垢分枝杆菌过水解酶的相应多核苷酸序列是：5’-ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGCTGGGTCCCCGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCGCTGGACCGGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGCACCACCAACATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCAACGGCGCGAGCTACCTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTCGACCTGGTGATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACCCCGCTCGACATCGCGCTGGGCATGTCGGTGCTCGTCACGCAGGTGCTCACCAGCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTGGTGGTCTCGCCGCCACCGCTGGCGCCCATGCCGCACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAGGGCGGCGAGCAGAAGACCACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCGTCGTTCATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCACCGACGGCGTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGGCCCTCGCGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTAA-3’(SEQ ID NO：2)2.变体酰基转移酶
本发明的稳定组合物并不欲受限于包括野生型耻垢分枝杆菌酰基转移酶。在一些备选的实施方式中，可使用是MsAcT酰基转移酶的同源物或经工程改造变体的酰基转移酶。在另一些优选的实施方式中，对单体水解酶进行工程改造，产生比天然单体酶具有更好的酰基转移酶活性的单体或多聚体酶。在一些特别优选的实施方式中，变体包含MsAcT的取代S54V(在本文中称为“S54V-MsAcT”或“S54V变体”或“变体S54V”)。
在其它一些实施方式中，用于稳定组合物中的酰基转移酶是WO05/056782中公开和描述的变体酶或同源物之一。
在一些实施方式中，过水解酶包含处于等同于SEQ ID NO：1所示的耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列中位置的一个或多个氨基酸位置上的一处或多处取代。在一些实施方式中，过水解酶包含选自以下的氨基酸取代的任何一个或任何组合：M1，K3，R4，I5，L6，C7，D10，S11，L12，T13，W14，W16，G15，V17，P18，V19，D21，G22，A23，P24，T25，E26，R27，F28，A29，P30，D31，V32，R33，W34，T35，G36，L38，Q40，Q41，D45，L42，G43，A44，F46，E47，V48，I49，E50，E51，G52，L53，S54，A55，R56，T57，T58，N59，I60，D61，D62，P63，T64，D65，P66，R67，L68，N69，G70，A71，S72，Y73，S76，C77，L78，A79，T80，L82，P83，L84，D85，L86，V87，N94，D95，T96，K97，Y99F100，R101，R102，P104，L105，D106，I107，A108，L109，G110，M111，S112，V113，L114，V115，T116，Q117，V118，L119，T120，S121，A122，G124，V125，G126，T127，T128，Y129，P146，P148，W149，F150，I153，F154，I194，和F196.
在一些实施方式中，过水解酶包含处于等同于SEQ ID NO：1所示的耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列中的位置的一个或多个氨基酸位置上的下述取代中的一个或多个：L12C、Q或G；T25S、G或P；L53H、Q、G或S；S54V、L、A、P、T或R；A55G或T；R67T、Q、N、G、E、L、或F；K97R；V125S、G、R、A或P；F154Y；F196G。
在一些实施方式中，过水解酶包含处于等同于SEQ ID NO：1所示的耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列中的氨基酸位置的氨基酸位置上的氨基酸取代的组合：L12I S54V；L12M S54T；L12T S54V；L12Q T25S S54V；L53H S54V；S54P V125R；S54V V125G；S54V F196G；S54V K97R V125G；或A55G R67T K97R V125G.
本领域已知若干种方法适于产生本发明的酰基转移酶的变体，所述方法包括但不限于，位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及若干其它重组手段。
在一些实施方式中，可用于本发明的酰基转移酶包括SGNH水解酶家族蛋白中经工程改造的变体。在一些优选的实施方式中，经工程改造的蛋白包含下述保守残基的至少一个或组合：L6、W14、W34、L38、R56、D62、L74、L78、H81、P83、M90、K97、G110、L114、L135、F180、G205。在一些备选的实施方式中，这些经工程改造的蛋白包含GDSL-GRTT和/或ARTT基序。在另一些实施方式中，酶是多聚体，包括但不限于二聚体、八聚体和四聚体。在另一些其它优选的实施方式中，经工程改造的蛋白展示出高于大约1∶1、2∶1、5∶1或者甚至10∶1的过水解与水解的比例。
如果酰基转移酶的氨基酸残基与耻垢分枝杆菌酰基转移酶中特定的残基或该残基的特定部分同源(即，在一级和/或三级结构上具有相应的位置)或类似(即，具有相同或相似的组合、反应和/或化学相互作用的功能能力)的话，酰基转移酶的氨基酸残基与耻垢分枝杆菌酰基转移酶的残基就是等同的。
在一些实施方式中，为建立与一级结构的同源性，将酰基转移酶的氨基酸序列与耻垢分枝杆菌酰基转移酶一级序列直接相比较，特别是与已知在序列已知的所有酰基转移酶中都不变的一组残基直接相比较。对保守残基加以比对(允许必要的插入和缺失以保持比对(即，通过故意的缺失和插入来避免保守残基的消失))后，与耻垢分枝杆菌酰基转移酶的一级序列中特定氨基酸等同的残基被界定出来。在一些优选的实施方式中，对保守残基的比对保全了100％的此类残基。但是，对超过75％或少至50％的保守残基的比对也足以界定等同残基。在一些优选的实施方式中，保持了催化性的丝氨酸和组氨酸残基的保守性。
用保守残基来界定其它酰基转移酶(例如，来自其它分枝杆菌属(Mycobacterium)物种以及任何其它生物的酰基转移酶)中耻垢分枝杆菌酰基转移酶的相应等同氨基酸残基。
在一些实施方式中，修饰了耻垢分枝杆菌酰基转移酶的下述残基：Cys7，Asp10，Ser11，Leu12，Thr13，Trp14，Trp16，Pro24，Thr25，Leu53，Ser54，Ala55，Thr64，Asp65，Arg67，Cys77，Thr91，Asn94，Asp95，Tyr99，Val125，Pro138，Leu140，Pro146，Pro148，Trp149，Phe150，Ile153，Phe154，Thr159，Thr186，Ile192，Ile194，和Phe196。但是，本发明并不欲受限于在这些位置经修饰的序列。事实上，本发明旨在将包括多种修饰和修饰组合。
在一些实施方式中，鉴定出来用于取代、插入或缺失的残基中的一些是保守残基，而另一些不是。本发明的酰基转移酶突变体包括多种突变体，包括包含信号序列的核酸所编码的那些。在此类序列编码的酰基转移酶突变体的一些实施方式中，由表达宿主分泌。在另一些实施方式中，核酸序列包含具有分泌信号的同源物。
对野生型和突变体蛋白的表征通过任何合适的方法来进行，这优选基于对感兴趣的性质的评估。例如，在本发明的一些实施方式中，测定pH和/或温度以及洗涤剂和/或氧化稳定性。事实上，考虑使用具有在这些性质(pH、温度、蛋白水解稳定性、洗涤剂稳定性和/或氧化稳定性)中的一种或多种具有多种稳定性程度的酶。在另一些实施方式中，选择具有低过酸降解活性的酰基转移酶。3.其它酶
虽然来自耻垢分枝杆菌的酰基转移酶(MsAcT)用于稳定组合物的一种优选实施方式中，但是从任何来源获得的、能在存在过氧化氢时将酯底物大部分转化为过酸的任何过水解酶也可用于本发明。在一些优选的实施方式中，酶展示出高于大约2∶1、5∶1或甚至10∶1的过水解与水解的比例。因此，过酸与酸产物的比例高于大约2∶1、5∶1或者甚至10∶1，得到的水性过酸溶液的pH能保持为相对较低，例如，低于大约pH 10，大约pH9.0，大约pH 8.5，大约pH 8.0或者大约pH 7.5。
除了酰基转移酶之外，多种水解酶也具有过水解活性，这使得它们可用作为本发明组合物中的酶。因此，可用于本发明的水解酶包括但不限于：作用于酯键上的羧酸酯水解酶、硫代酸酯水解酶、磷酸单酯水解酶和磷酸二酯水解酶；作用于醚键上的硫醚水解酶；以及作用于肽键上的α-氨基-酰基肽水解酶、肽基-氨基酸水解酶、酰基-氨基酸水解酶、二肽水解酶和肽基-肽水解酶。此类水解酶可单独使用或与MsAcT或另外的过水解酶组合使用。它们中羧酸酯水解酶和肽基-肽水解酶是优选的。
其它合适的水解酶包括：(1)属于肽基-肽水解酶类的蛋白酶(例如，胃蛋白酶、胃蛋白酶B、凝乳酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶A、胰凝乳蛋白酶B、弹性蛋白酶、肠激酶、组织蛋白酶C、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、无花果蛋白酶、凝血酶、纤维蛋白溶酶、血管紧张肽原酶、枯草杆菌蛋白酶、曲霉肽酶A、胶原酶、梭菌肽酶B、激肽释放酶、gastrisin、组织蛋白酶D、菠萝蛋白酶、角蛋白酶、胰凝乳蛋白酶C、胃蛋白酶C、曲霉肽酶B、尿激酶、羧肽酶A和B以及氨肽酶)；(2)羧酸酯水解酶，包括，羧酸酯酶、脂肪酶、果胶酯酶和叶绿素酶；以及(3)具有高的过水解与水解比例的酶。它们中尤其有效的是脂肪酶，以及展示出高的过水解与水解比例的酯酶，以及使用本发明过水解酶的一级、二级、三级和/或四级结构特征进行了蛋白工程改造的酯酶、角质酶和脂肪酶。
此外，本发明的稳定组合物可包含另外的酶。考虑到：通过使用酶的组合，所需的化学品的量将同时降低。另外的酶包括但不限于：微生物细胞壁降解酶和糖蛋白降解酶、溶菌酶、半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶(ligninase)、支链淀粉酶、鞣酶、戊聚糖酶(pentosanase)、malanases、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、内切葡聚糖酶、PNGase、淀粉酶等，以及其混合物。在一些实施方式中，稳定的组合物还可包括酶稳定剂。
本发明并不欲受限于用于产生过氧化氢的任何特定的酶，与合适的底物产生H2O2和酸的任何酶都可用于本发明的方法中。例如，已知从乳酸和氧产生H2O2的来自乳杆菌属(Lactobacillus)物种的乳酸氧化酶可用于本发明。事实上，本发明方法的一个优点是酸的产生将碱性溶液的pH降低到过酸在漂白中最有效的pH范围(即，处于或低于pKa)。
能产生过氧化氢的其它酶(例如，醇氧化酶、乙二醇氧化酶、甘油氧化酶、氨基酸氧化酶等)也与本发明的酰基转移酶或其它过水解酶组合用于酯底物，以产生过酸。从底物产生酸而不产生过氧化氢的酶也可用于本发明。此类酶的例子包括但不限于蛋白酶。因此，如本文所述，本发明提供了比目前使用的用于去污制剂和用途以及若干其它应用的方法和组合物要高的显著的优点。
此外，氧化酶可用于本发明，它们包括选自以下的糖类氧化酶：醛糖氧化酶(IUPAC分类EC1.1.3.9)、半乳糖氧化酶(IUPAC分类EC1.1.3.9)、纤维二糖氧化酶(IUPAC分类EC1.1.3.25)、吡喃糖氧化酶(IUPAC分类EC1.1.3.10)、山梨糖氧化酶(IUPAC分类EC1.1.3.11)和/或己糖氧化酶(IUPAC分类EC1.1.3.5)、葡糖氧化酶(IUPAC分类EC1.1.3.4)及其混合物。。
事实上，满足下述公式的任何合适的氧化酶都可用于本发明：酶+还原的底物-＞氧化的底物+H2O24.过氧化氢来源
本发明提供了包含过氧化氢来源的稳定的组合物。在一些实施方式中，过氧化氢来源是加入到水中时产生过氧化氢的固体化合物。此类化合物包括过氧化氢与多种无机或有机化合物的加合物，其中最为广泛使用的是过氧化水合碳酸钠(sodium carbonate perhydrate)，其也被称为过碳酸钠。
无机过氧化水合盐(perhydrate salt)是过氧化氢来源的一种优选实施方式。无机过氧化水合盐的例子包括过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐。无机过氧化水合盐通常是碱金属盐。
可用于本发明组合物的其它过氧化氢加合物包括过氧化氢与沸石的加合物或者脲过氧化氢。
过氧化氢来源化合物可作为结晶和/或基本上纯的固体包括进来，而无需额外的保护。但是对于某些过氧化水合盐而言，此类颗粒化合物的优选实施方式利用在颗粒产品中对过氧化水合盐提供更好的贮藏稳定性的材料包覆形式。合适的包覆包含：无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或者有机材料，例如蜡、油或脂肪皂。
在一些实施方式中，本发明提供了稳定的组合物，其中过氧化氢来源是酶促过氧化氢产生系统。在一种优选的实施方式中，酶促过氧化氢产生系统包含氧化酶及其底物。合适的氧化酶包括但不限于：葡糖氧化酶、山梨糖醇氧化酶、己糖氧化酶、胆碱氧化酶、醇氧化酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶、吡喃糖氧化酶、羧基醇氧化酶、L-氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、谷氨酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、赖氨酸氧化酶、乳酸氧化酶、香草基氧化酶、乙醇酸氧化酶、半乳糖氧化酶、尿酸氧化酶、草酸盐氧化酶和黄嘌呤氧化酶。
在一些实施方式中，产生过氧化氢的化合物和酶系统可以其基本上纯的形式组合进稳定的组合物。在一些备选的实施方式中，它们可与其它组分组合，例如表面活性剂、多价螯合剂(sequestrant)、助洗剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、加工添加剂，或者洗涤组合物、卫生处理组合物、消毒组合物或漂白添加剂的任何其它已知组分。在一种实施方式中，稳定的组合物包含洗涤剂。
在本发明的稳定组合物中可用作为过氧化氢来源的其它化合物和酶促系统包括但不限于U.S.S.N.10/581,014(其通过引用并入本文)中描述的那些。5.酯底物和过酸
本发明的稳定组合物并不欲受限于仅产生过乙酸的成分。还可制备能产生可用于清洁、消毒和去污的宽范围的任何过酸的稳定组合物。
可从根据本发明的教导制备的多合一组合物产生过壬酸以及从长链脂肪酸(即C10-C18)或者更长的链制备的过酸。在一些优选的实施方式中，过酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过戊酸和过己酸以及过壬酸。
根据本发明，加入到水中时产生特定过酸化合物的稳定的多合一组合物需要使用酯底物，其在酶促转化时产生想要的过酸。因此，在一些实施方式中，酯底物是选自以下的酸的稳定酯：乙酸、丙酸、丁酸(butanoic acid)、戊酸(pentanoic acid)、己酸(hexanoic acid)、壬酸、甲酸、丁酸(butyric acid)、戊酸(valeric acid)、己酸(caproic acid)、辛酸、癸酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸构成的列表的酸的稳定的酯。在一些另外的实施方式中，甘油三乙酸酯、甘油三丁酸酯、neodol酯和/或乙氧基化的neodol酯用作为过酸形成的酯底物。因此，示例性的乙酸酯底物包括但不限于：乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甘油三乙酸酯(1,3-二乙酰氧丙-2-基乙酸酯)和丙二醇二乙酸酯。
在优选的实施方式中，酯底物是酸的稳定的醇酯，其酶促转化产生想要的过酸。因此，在一种优选的实施方式中，酯底物是任何多元醇的酯化合物，例如，多元醇的二酯，例如PGDA。在另一优选的实施方式中，酯底物是二醇-二酯化合物。
WO 05/056782(其通过引用整体并入本文)中公开了针对可用于本发明的组合物中的过水解酶(例如酰基转移酶)的宽范围的酯底物。
可用于本发明的稳定组合物的酯底物可以是固体或液体的形式。通常，酯底物应当是干的或者基本上不含水(可活化组合物的酶组分)。在一些优选的实施方式中，酯底物包括按重量计少于大约5％，少于大约1％，少于大约0.5％，少于大约0.1％或者甚至更低的百分比的水。
在一些实施方式中，酯底物在室温下是稳定的液体，例如，丙二醇二乙酸酯(PGDA)。在一些实施方式中，酯底物是稳定的液体，其中，稳定组合物的酶和过氧化氢来源组分不溶。在一些优选的实施方式中，酯底物基本上不含水，由此使得在使用之前对组合物中酶和/或过氧化氢来源的任何活化最小化。6.辅助材料和另外的组分
另外的组分可用于本发明的制剂。虽然本发明的制剂并不受限，但本文中公开了多种组分。事实上，尽管此类组分对于本发明的目的来说并非必需，下文阐述的辅料的非限制性列表适用于本发明的组合物，并可依需要包括进本发明的某些实施方式中，例如帮助或增强清洁性能，用于处理待清洁的底物，或根据情况例如用香料、着色剂、染料等等修饰清洁组合物的美观。应当理解这类辅料是除本发明的酶、过氧化氢和/或过氧化氢来源以及包含酯部分的材料之外的。这些额外组分的精确性质及其掺入水平应取决于组合物的物理形式和要使用所述组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括但不仅限于表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、腐蚀抑制剂、额外的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白助促进剂、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污物去除/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、香料、结构增弹剂、运载体、水溶助长剂、操作助剂和/或色素。除了下文的公开以外，这类其它辅料的合适实例和使用水平参见美国专利Nos.5,576,282、6,306,812和6,326,348，其通过参考并入本文。上述辅助成分构成本发明的清洁组合物的平衡。
在一些实施方式中，本发明的酶系统还包含在实现去污之后除去任何残留的过酸和/或H2O2的酶。此类酶包括但不限于过氧化氢酶和/或水解酶。
重要地，本发明提供了在宽的pH和温度范围上有效清洁、漂白和消毒的手段。在一些实施方式中，该产生利用的pH为4至12。在一些备选的实施方式中，利用的温度范围在大约5℃至大约90℃之间。本发明提供了较之目前使用的系统(见，例如，EP Appln.87-304933.9)而言的优点：可在过酸氧化的最优pH下进行漂白，以及提供了在中性pH、酸性pH和低温下进行的漂白。IV.用于产生过酸溶液的稳定组合物的制备和用途
本发明的稳定组合物的一个重要优点在于它们是“多合一”制剂，其中，所有成分都在一个容器中。这些稳定的多合一组合物还具有可通过将成分(例如，酶、过氧化氢来源和酯底物)在合适的容具或容器中组合起来容易简单制备的优点。将成分混合起来的顺序并不特别重要，通常可顺序加入各种成分。
在一些实施方式中，组合物的所有成分都是固体，通过混合将它们简单组合。在其它一些实施方式中，成份中的至少一种(典型地是酯底物)是液体，通过将干的固体成分混合进液体来进行制备。
优选地，使用固体形式的酶和产生过氧化氢的化合物，将它们混合到一起使得其悬浮于底物酯化合物的液体形式中，来制备稳定的组合物。在一种优选的实施方式中，本发明的稳定组合物包含酰基转移酶、过氧化氢来源和液体酯底物PGDA。
在一种优选的实施方式中，固体成分可组合于“干制剂”中(例如，酰基转移酶+过碳酸盐)，然后将其加入到液体酯底物中，以产生悬浮液。见，例如，本文实施例9中公开的多合一组合物的制备。
在一种优选的实施方式中，稳定组合物的固体成分就照原样使用。例如，在容器中将过碳酸钠的颗粒或粉末(即，直接来自商业获得的试剂罐)与酰基转移酶的粗制固体或颗粒组合，然后加入到液体PGDA中，产生悬浮液。在一些备选的实施方式中，可在互相组合之前，或在加入到任何液相中之前处理固体成分。此类处理的例子可包括将酶颗粒和/或产生过氧化物的化合物封装，以抑制贮藏期间的活性或者实现加入水后随时间更慢的释放。
通常，组合物的稳定性高度依赖于使用之前防止底物的任何酶促转化和/或过氧化氢的产生。在全部组合物成份都是固体的实施方式中，这主要通过将混合的成分保持干燥或者基本上无水(即，按重量计少于大约2％、1％或0.5％的水)来实现。应当避免允许酶活性和/或过氧化氢的产生发生的甚至相对少量的水，以使得多合一组合物的稳定性最大化。由此，在一些实施方式中，稳定的组合物还包含干燥剂(dessicant)或干燥剂(drying agent)(例如，沸石化合物、分子筛等)。
在一种实施方式中，酶以颗粒形式或含酶的粗提取物的经喷雾干燥的包覆层(coating)被包括进稳定组合物。在其它一些实施方式中，组合物中使用的酶是基本上纯的，并且是颗粒的、经喷雾干燥的、经冻干的或其它干燥固体形式。在一些实施方式中，使用经配制的酶颗粒，以含有酶保护剂和溶解延缓材料(即，调节使用期间颗粒溶解的材料)。
本发明可与用于制造干的酶颗粒或过氧化氢来源化合物的干制剂(例如美国专利No.5,324,649(其通过引用整体并入本文)中描述的
Figure G2008800154892D00261
(Genencor International Inc.，Rochester，N.Y.)或Savinase颗粒(Novo Nordisk，Denmark)等)的任何数量的工艺组合使用。用于可用来制造本发明组合物的酶或其它化合物的其它示例性干制剂工艺包括美国专利4,106,991、4,689,297、5,814,501、5,879,920、6,248,706、6,413,749、6,534,466或PCT公开文本WO 97/12958、WO 99/32613、WO 01/29170中公开的那些和″Enzymes in Detergency，″编著Jan H.van Ee，等人，第15章，第310-312页(Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.(1997))中描述的那些技术；它们每篇都通过引用并入本文。
用于稳定组合物中的过氧化氢来源和酯底物的量取决于使用的特定化合物以及酶和过酸的最终浓度。通常，酶促产生过酸需要等摩尔量的过氧化氢和相应的酯底物化合物。因此，在一种优选的实施方式中，过氧化氢来源和底物中每种的重量百分比取决于特定化合物的结构式重量，并且将其选用为使得过氧化氢和底物等摩尔量。
按照目的所需的量将酶加入到组合物中。通常，酶应当优选以0.00001至5重量百分比的量加入，更优选地，0.02至3重量百分比。当使用粗制的酶时，以颗粒中经纯化的酶为0.001至50重量百分比的量，将颗粒加入到稳定组合物中。酶纯度增加的情况下使用按重量计相对较小的量。以0.002至20重量百分比以及优选0.1至10重量百分比的量来使用颗粒。最后，酶的特定的量将在一定程度上取决于特定酶针对特定过酸应用而言通过经验确定的活性。
例如，在一种优选的实施方式中，稳定的组合物包含来自耻垢分枝杆菌的酰基转移酶(MsAcT)、过碳酸钠和丙二醇二乙酸酯(PGDA)，其中，酶和过碳酸盐是悬浮于液体PGDA中的固体，并且其中，加入到水中时，稳定组合物能产生按重量计至少大约0.16％的过乙酸溶液。因为通过组合物产生的高的PAA与乙酸的比例，按重量计0.16％的PAA的水溶液具有大约8.6的pH。在一些实施方式中，对于水中组合物来说更长的混合/反应时间可产生甚至更高的PAA水平(例如，按重量计0.18％)并且具有更低的pH(大约pH 8.0)。
在该实施方式中，通过将过碳酸盐和酶的干制剂混合进PGDA来制备组合物。得到的稳定组合物是液体悬浮液，其优选包含：按重量计大约0.001％至大约1％的MsAcT、按重量计大约35％至大约45％的过碳酸钠和按重量计大约65％至大约55％的丙二醇二乙酸酯。该液体悬浮液的稳定性通过下述事实展示：尽管组合物之前在环境温度下贮藏至少7天，大约14天，大约30天，大约60天或更长的时间，但其在给定的水量中产生的过乙酸的重量百分比不显著减少。
本发明的稳定组合物用于制备水溶液的用途是简单明了的：简单地将组合物加入到合适的量的水中并加以搅拌。通常，仅使用纯化的(例如MilliQ水)、蒸馏的、灭菌的和去离子的水。因此，本发明还提供了制备过酸溶液的方法，所述方法包括将稳定的组合物加入到水中，并混合至少大约30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟或者甚至更少的分钟。在一些实施方式中，制备方法包括：(a)提供稳定的组合物，其包含：具有过水解酶活性的酶(其中，所述活性包含至少2∶1的过水解与水解的比例)；过氧化氢来源和酯底物；以及(b)将所述组合物加入到水中，并混合至少20分钟，由此产生pH小于大约9.0的、按重量计至少大约0.16％的过乙酸的水溶液。在一种实施方式中，组合物和水不包含能缓冲pH的其它成分。
在一些优选的实施方式中，制备方法包括：(a)提供包含酰基转移酶、过氧化氢来源和丙二醇二乙酸酯的稳定的组合物；以及(b)将所述组合物加入到水中，并混合至少20分钟，由此产生按重量计至少大约0.16％的过乙酸的水溶液。
本发明包括：除了纯水之外，稳定的组合物还可用于多种水性系统中，包括具有大百分比的水的那些(例如，超过大约85％，或者超过大约95％的水)以及具有较低百分比的水的那些(例如小于大约85％)。还包括一些备选的实施方式，其中稳定组合物加入到水性缓冲溶液和/或包含其它成分(例如表面活性剂、清洁组合物或洗涤剂制剂)的溶液中。在此类实施方式中，包括在水溶液中的其它成分可影响产生过酸的酶的催化活性。对酶浓度、搅拌时间、温度和/或与稳定组合物的使用相关的其它参数的调节是本领域普通技术人员已知的，并且可由他们通过经验确定。
通常，通过在大约18℃至大约25℃或者大约20℃至大约22℃的典型温度下加入到水中，来意图使用本发明的稳定组合物。但是在一些应用中，可优选在更低或更高的温度下使用稳定组合物。稳定组合物能在宽的温度范围上发挥功能(例如，大约5℃至大约90℃；大约16℃至大约60℃；以及大约20℃至大约37℃)。通常，功能温度范围取决于酶保持足够活性的能力。因此，在一种实施方式中，本发明涉及包含具有高的热稳定性的野生型或经工程改造的酶的组合物。
此外，本发明提供了用于在水溶液中产生过酸的系统和试剂盒，这基于稳定的组合物实施方式。因此，在一种实施方式中，本发明提供了在水溶液中产生过酸的系统，其中包含处于水溶性容器中的本发明的任何稳定组合物。在一些实施方式中，从水溶性聚合物(优选地，聚乙烯醇聚合物)形成容器。通常，水溶性容器可以是任何形式的，例如，囊、安瓿、胶囊或小球。在一种优选的实施方式中，水溶性容器是包含聚乙烯醇膜的囊。V.水溶性容器
可用于递送本发明的稳定组合物的水溶性容器可以是以下形式：囊、胶囊或者其它吹塑的形状、注入塑形的安瓿或者其它注入塑形的形状或者旋转塑形(rotationally-molded)的小球或从水溶性热塑树脂形成的胶囊。
可用于形成容器的水溶性塑料包括低分子量和/或经化学修饰的聚交酯；此类聚合物已以名称HEPLONTM(Chronopol，Inc.)被生产和销售。
在一种实施方式中，可用于本发明的水溶性容器包含可熔融加工的聚乙烯醇树脂(PVA)。此类树脂包括VINEXTM(Texas PolymerServices，Inc.)和MONOSOLTM膜(ChrisCraft Film)。可使用任何数量或组合的PVA树脂。此类水溶性聚合物被描述于例如美国专利Nos.6,956,070、7,022,656和7,067,575中，每份都通过引用并入本文。
典型树脂性质是：
1.玻璃化转变温度(℃)＝28至38；优选是28至33。
2.重均分子量(Mw)＝15,000至95,000；优选是55,000-65,000。
3.数均分子量(Mn)＝7,500至60,000；优选是27,000至33,000。
在一种实施方式中，使用的聚(乙烯)醇树脂是MONOSOLTM7030或MONOSOLTM 8630。
吹塑的胶囊可从具有大约50,000至大约70,000的分子量以及大约28至大约33℃的玻璃转化温度的聚乙烯醇树脂形成。将粒化树脂和浓缩物进料至挤压机。它们被进料至的挤压机具有圆形、椭圆形、方形或矩形冲模以及合适的心轴。熔融的聚合物物质离开冲模，采用了冲模/心轴组合的形状。向挤出物(extrude)的内部体积吹风，同时令挤出物与一对对开模子(a pair of split molds)接触。所述的塑模控制包装的最终形状。当在塑模中时，向包装中装入合适体积的液体。塑模使得塑料淬火。液体被含有于经吹塑的包装的内部体积中。
从具有大约50,000至大约70,000的分子量以及大约28至大约38℃的玻璃化转变温度的聚(乙烯)醇树脂形成注入塑形的安瓿或胶囊。将粒化的树脂和浓缩物进料至往复式螺杆注入塑形机的狭道。螺杆的旋转推动球状物质前进，同时螺杆的直径增加将团块(pellete)压缩并驱使它们与机器中经加热的桶接触。通过桶传导给团块的热以及通过团块与旋转的螺杆接触产生的磨擦热的组合使得团块随着被推向前进的过程而熔融。随着螺杆旋转熔融的聚合物物质汇集于螺杆前部，并开始缩到机器的后面。在合适的时间，螺杆向前移动推动熔融物经过机器顶端的喷嘴进入塑模或热流道系统(其中装有若干塑模)。塑模控制完成的包装的形状。可同时在塑模中或从塑模排出之后向包装中装入液体。填装完成后，包装的填装口被热密封。该工艺可线内或离线进行。
从具有大约50,000至大约70,000的分子量以及大约28至大约38℃的玻璃化转变温度的聚(乙烯)醇树脂形成旋转塑形的小球或胶囊。将粒化树脂和浓缩物研至合适的筛目大小，典型地，35目。将特定重量的经研磨树脂进料至具有想要的形状和体积的冷塑模中。塑模被密封和加热，同时在三个方向上旋转。粉末熔融并包覆塑模的整个内表面。随着持续的旋转，塑模被冷却，使得树脂固化成型，其复制了塑模的大小和纹理。完成的包装排出后，使用经加热的针或探针向中空包装中注入液体，填装之后，对包装的注射口进行热密封。
可用于本发明的水溶性容器的其它合适树脂包括聚环氧乙烷(例如POLYOXTM；Union Carbide，Inc.)和源于纤维素的水溶性糖类(例如METHOCELTM；Dow Chemical，Inc.)。典型地，源于纤维素的水溶性聚合物不是易于熔融加工的。
在一些实施方式中，水溶性容器是囊。在一种特别优选的实施方式中，囊可从PVA膜形成。此类PVA膜囊是可商业获得的(Solupak，Ltd.，UK)。
通常，可用于本发明的PVA膜囊可以是商业获得的(例如，从Solupak，Ltd.，UK)或可使用本领域公知的聚合物膜生产技术来生产。例如，将粒化的、经预先干燥的、可熔融加工PVA树脂进料至膜挤压机。进料材料还可含有经预先干燥的颜色浓缩物(使用PVA运载树脂)。还可向挤压机中加入类似制备的其它添加剂，例如抗氧化剂、UV稳定剂、防结块添加剂等。树脂和浓缩物在挤压机中熔融掺合。挤压机冲模可由用于生产吹膜的圆形冲模或用于生产平挤薄膜的衣架模(coat hanger die)构成。圆形冲模可具有旋转的冲模嘴和/或心轴，以改变外观和/或性质。
用于本发明的水溶性囊的典型的PVA膜性质包括：1.拉伸强度(125mil，破碎，50％RH)＝4,700至5,700psi。2.拉伸模量(125mil，50％RH)＝47,000至243,000psi；优选范围是140,000至150,000psi。3.抗撕裂性(平均值)(ASTM-D-199gm/ml)＝900-1500。4.冲击强度(平均值)(ASTM-D-1709，gm)＝600-1,000。5.100％伸长(平均值)(ASTM-D-882，psi)＝300-600。6.透氧(oxygen transmission)(1.5mil，0％RH，1atm)＝0.0350至0.450cc/100sq.in./24h7.透氧(1.5mil，50％RH，1atm)＝1.20至1.50cc/100sq·in./24h8.100％模数(平均值)(ASTM-D-882，psi)＝1000-3000。9.溶解度(sec)(MSTM-205，75°F.)分裂＝1-15；溶解＝10-30。
挤出的膜被切割为合适的宽度并缠绕到核上。每个核中装有一卷轴的膜。经切割的膜的卷轴被装入垂直成型填装密封机(VFFS)或水平成型填装密封机(HFFS)。成型填装密封机(FFS)从膜制造合适的囊型(圆柱、方形、枕形、椭圆形等)，并纵向密封边缘(机器向密封)。FFS机还进行末端密封(横向密封)并将合适体积的非水性液体填装到起始的横向密封之上。然后FFS机应用另一末端密封。液体被含有在两个末端密封之间的体积内。
在一种实施方式中，使用的PVA膜是具有大约55,000至65,000的重均分子量范围和大约27,000至33,000的数均分子量范围的MONOSOLTM。
VI.试剂盒
本文描述的本发明的稳定组合物特别适合包装在多种试剂盒中。在一种实施方式中，本发明提供了用于去污的试剂盒，其中在合适的包装中包含预先测量的量的任何本文所述的稳定组合物，其中所述稳定组合物包含过水解酶、过氧化氢来源和酯底物，并且，其中，稳定组合物的量是加入到给定体积的水中之后产生按重量计至少大约0.16％过酸的水溶液的量。在一些实施方式中，试剂盒还包含在本文所述的去污方法中使用稳定组合物的说明书。说明书可以以打印形式提供或者以电子媒介形式(例如软盘、CD或DVD)提供或者以网址(可在其中获得此类说明书)形式提供。
在一种优选的实施方式中，提供了处于水溶性密封容器中的稳定组合物。在一种优选的实施方式中，试剂盒的水溶性容器是从水溶性热塑树脂形成的囊、胶囊、安瓿、小球的形式的，或者是其它注入塑形的形状的。在一些实施方式中，水溶性密封容器由选自聚乙烯醇、聚环氧乙烷、源于纤维素的水溶性糖类和聚交酯(polyactide)的水溶性聚合物材料制成。在一种优选的实施方式中，试剂盒的水溶性容器是由聚乙烯醇膜制成的囊。
在试剂盒的一种实施方式中，试剂盒还包含混合容器(container)(或容具(vessel))，其具有足够大的体积，大到能够装纳至少两倍所述设定体积的水。在该实施方式中，混合容器是一次性的桶或烧杯，任选是经灭菌的，其任选含有稳定组合物和在容器中的磁搅拌棒。
在一种实施方式中，包含稳定组合物的密封容器被包装在试剂盒的混合容器内。因此，使用这样的试剂盒仅需要在搅拌下将水加入到混合容器中。
在另一实施方式中，试剂盒还包含处于密封容器中的设定体积的水。在一种实施方式中，密封容器中的水是经灭菌的。在一种实施方式中，试剂盒在第一密封容器中包含稳定组合物并在第二密封容器中包含水。
在另一实施方式中，试剂盒包括搅拌装置(例如，勺子或类似器具)和/或磁搅拌棒，它们被包装在试剂盒内但在密封容器之外。在其它一些实施方式中，试剂盒还包含单独的包装，其中含有用于在使用后中和过酸溶液的组合物。
VII.用于卫生处理、消毒和/或去污的方法和用途
本发明的稳定组合物(以及包含这些组合物的相关系统和试剂盒)可在一系列方法中用于对物品去污、消毒和/或卫生处理。
在一些实施方式中，本发明的去污方法包括：(a)提供稳定的组合物，其包含：具有过水解酶活性的酶(其中，所述活性包含至少2∶1的过水解与水解的比例)；过氧化氢来源和酯底物；以及(b)将所述组合物加入到水中，并混合至少20分钟，由此产生pH小于大约9.0的、按重量计至少大约0.16％的过乙酸的水溶液；以及(c)将包含污染物的物品暴露给所述溶液。
在一种优选的实施方式中，本发明的去污方法包括：(a)提供包含酰基转移酶、过氧化氢来源和丙二醇二乙酸酯的稳定的组合物；以及(b)将所述组合物加入到水中，并混合至少20分钟，由此产生按重量计至少大约0.16％的过乙酸的水溶液；以及(c)将包含污染物的物品暴露给所述溶液。在用于制备溶液的方法的一些实施方式中，提供的稳定的组合物包含按重量计大约0.001％至大约1％的MsAcT、按重量计大约35％至大约45％的过碳酸钠以及按重量计大约65％至大约55％的丙二醇二乙酸酯。
取决于待去除的污染物的特定类型，将物品暴露给过酸溶液的步骤可在宽范围的时间规模上进行。例如，在某些卫生处理流程中，短至大约30秒、1分钟、5分钟或10分钟的暴露时间可能是足够的。但是，在其它一些应用(例如，除去生物膜)中，可能必须要将物品暴露长得多的时间段，例如大约30分钟、1小时、6小时、12小时、24小时或者甚至更长，以获得足够的去污水平。
类似地，可根据污染物的特定类型，对暴露步骤期间过酸溶液的温度加以调节。在一种优选的实施方式中，暴露温度是制备溶液的环境温度，即，通常大约18-25℃。在其它一些实施方式中，可使用更高的温度来协助去污过程。通常，更高的温度将加速过酸溶液的反应活性，由此加速去污过程。因此，在一些实施方式中，可在大约30℃、37℃、45℃、50℃、60℃、75℃、90℃或者甚至更高时用过酸溶液进行暴露步骤。
在所述方法的一种优选实施方式中，稳定组合物被含有在水溶性容器中，并将所述容器加入到水中。在一种优选的实施方式中，水溶性容器是从水溶性聚合物(优选地，聚乙烯醇聚合物)形成的囊、安瓿、胶囊或小球。
在多种实施方式中，使用稳定组合物的去污方法可针对宽范围的污染物有用，所述污染物包括：选自肉毒杆菌毒素、炭疽毒素(anthracistoxin)、蓖麻毒蛋白、鲭毒素(scombroid toxin)、鱼肉毒素、河鲀毒素、真菌毒素及其任何组合的毒素；选自细菌、病毒、真菌、寄生物、朊病毒及其任何组合的病原体。例如，本文公开的方法可用于对被包括但不限于毒性化学品、芥子、VX、炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)孢子、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)、真菌和毒素(例如，肉毒杆菌(botulinum)、蓖麻毒蛋白、真菌毒素等)的物质污染的物质，以及被感染性病毒体(例如黄病毒、正黏病毒、副黏病毒、沙粒病毒、棒状病毒、虫媒病毒、肠道病毒、布尼亚病毒等)感染的细胞进行去污。在一些特别优选的实施方式中，至少一种病原体选自芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)、梭菌属物种(Clostridiumspp.)、肉毒梭菌(C.botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、利斯特氏菌属物种(Listeria spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)、链球菌属物种(Streptococcusspp.)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、志贺氏菌属物种(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia spp.)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、弗朗西丝氏菌属物种(Francisella spp.)、土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)、Camplyobacter ssp.、弧菌属物种(Vibrio spp.)、布鲁氏菌属物种(Brucella spp.)、隐孢子虫属物种(Cryptosporidium spp.)、贾第虫属物种(Giardia spp.)、环孢子虫属物种(Cyclospora spp.)和毛线虫属物种(Trichinella spp.)。生物膜是嵌入细胞外聚合物物质和多种有机和无机化合物的基质中的微生物集合。虽然一些生物膜可含有单物种的微生物，但是通常生物膜不仅包含不同微生物物种还包括不同类型的微生物，例如，藻类、原生动物、细菌等。已经发现，生物膜的特征性特征之一是其中的微生物是合作或协同的。已靠经验发现，生物膜中生活的微生物比在生物膜外生活的微生物受到更好的保护以抵挡杀生物剂。因此，除去病原体生物膜代表了去污和/或卫生处理设备中特别难的问题。
使用本发明的稳定组合物及其使用方法产生的过酸溶液对针对生物膜去污是有效的。在一种实施方式中，稳定组合物被制造来产生可用于除去生物膜的过酸溶液，所述生物膜包括由选自以下的一种或多种病原性细菌形成的那些：芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)、梭菌属物种(Clostridium spp.)、肉毒梭菌(C.botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、利斯特氏菌属物种(Listeria spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、葡萄球菌属物种(Staphylococcusspp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、沙门氏菌属物种(Salmonellaspp.)、志贺氏菌属物种(Shigella ssp.)、大肠杆菌(E.coli)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia spp.)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、弗朗西丝氏菌属物种(Francisella spp.)、土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)、Camplyobacter ssp.、弧菌属物种(Vibrio spp.)、布鲁氏菌属物种(Brucellaspp.)、隐孢子虫属物种(Cryptosporidium spp.)、贾第虫属物种(Giardiaspp.)、环孢子虫属物种(Cyclospora spp.)、毛线虫属物种(Trichinellaspp.)及其任何组合。在一种优选的实施方式中，通过本发明的方法制造的过酸溶液可用于对选自铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌(SRWC-10943)、单核细胞增生利斯特氏菌(ATCC 19112)及其任何组合的生物膜进行去污。
在一种优选的实施方式中，可通过在45℃暴露给按重量计0.16％的PAA溶液(从稳定的组合物产生的)45分钟，来基本上除去污染不锈钢设备的包含假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)和/或利斯特氏菌属物种(Listeria spp.)的细菌培养物的病原性生物膜。
在多种实施方式中，使用稳定的组合物进行去污的方法可用于对宽范围的被污染的物品进行去污，所述物品包括：硬表面、织物、食品、饲料、衣服、小地毯、地毯、纺织品、医疗仪器、兽医仪器，卫生处理和不锈钢物品和设备(包括用于药物和生物技术工艺的大型反应器)。
使用本发明的稳定组合物酶促产生的过酸溶液特别适用于清洁不锈钢物品和设备，因为，水溶液中产生的过酸与相应的酸的比例要比在商用溶液中发现的高得多。例如，使用S54V-MsAcT、过碳酸盐和PGDA的稳定组合物产生的PAA溶液将具有大约10∶1的PAA与乙酸的比例。商用PAA溶液通常具有多过PAA的乙酸，并且甚至可能具有相反的比例(1∶10)。PAA与乙酸的比例增加降低了在PAA处理之后对不锈钢物品或设备进行进一步钝化处理的需求，或者完全无须这种需求。因此，在一些实施方式中，使用本发明的稳定组合物产生的过酸溶液可用于对不锈钢物品和设备(包括用于药物和生物技术工艺的大型反应器)进行卫生处理。在一些优选的实施方式中，过酸溶液可用于在单个步骤中对不锈钢物品和设备加以卫生处理，而无须用钝化剂对不锈钢进行任何进一步的处理。
在还一些实施方式中，本发明可用于对食品和/或饲料(包括但不限于蔬菜、水果和其它食品和/或饲料物品)进行去污。事实上，本发明将可用于对水果、蔬菜、蛋、肉等进行表面清洁。事实上，本发明意欲用于食品和/或饲料工业，以从多种食品和/或饲料物品除去污染物。在一些特别优选的实施方式中，如本领域技术人员已知的，食品和药品管理局(Foodand Drug Administration)和/或其它食品安全机构指出的用于食品和/或饲料去污的方法可用于本发明。
在还有一些优选的实施方式中，需要去污的物品选自硬表面、织物、食品、饲料、衣服、小地毯、地毯、纺织品、医疗仪器和兽医仪器。在一些特别优选的实施方式中，食品选自水果、蔬菜、鱼、海产食品和肉。在还一些优选的实施方式中，硬表面选自家居表面和工业表面。在一些特别优选的实施方式中，家居表面选自厨房台面、水池、柜橱、案板、桌子、搁架、食品制备贮藏区、浴室装置、地板、天花板、墙和卧室区域。在一些备选的实施方式中，工业表面选自食品加工区、饲料加工区、桌子、搁架、地板、天花板、墙、水池、案板、飞机、汽车、火车和船。
实施例
提供下述实施例以展现和进一步阐述本发明的某些优选实施方式和方面，它们并不应当被解释为对其范围加以限制。
在下文的实验公开内容中，应用了下述缩写：℃(摄氏度)、RT(室温)、rpm(每分钟转数)、H2O(水)、dH2O(蒸馏水)、HCl(盐酸)、aa(氨基酸)、bp(碱基对)、kb(千碱基对)、kD(千道尔顿)、gm(克)、μg和ug(微克)、mg(毫克)、ng(纳克)、μl和ul(微升)、ml(毫升)、mm(毫米)、nm(纳米)、μm和um(微米)、M(摩尔)、mM(毫摩尔)、μM和uM(微摩尔)、U(单位)、V(伏特)、MW(分子量)、sec(秒)、min(s)(分钟)、hr(s)(小时)、MgCl2(氯化镁)、NaCl(氯化钠)、OD420(420nm处的光密度)、PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)、EtOH(乙醇)、LB(Luria培养基)、LA(Luria琼脂)、PBS(磷酸缓冲的盐溶液[150mM NaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、w/v(重量体积比)、v/v(体积体积比)、wt％(重量百分比)、PGDA(1，2-丙二醇二乙酸酯)、PAA(过乙酸)、Per(过水解酶)、per(过水解酶基因)、Ms(耻垢分枝杆菌)、MsAcT(耻垢分枝杆菌酰基转移酶)、S54V-MsAcT或S54V变体(包含S54V取代的耻垢分枝杆菌酰基转移酶变体)、MS(质谱)、Dial(Dial Brands，Inc.，Scottsdale，AZ)、Kemira(Kemira Industrial Chemicals，Helsingborg，Sweden)、EM Science(EMScience，Gibbston，NJ)、HP(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)、ICN(ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA)、Dial(Dial，Corp.，Scottsdale，AZ)、Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)、Amicon(Amicon，Inc.，Beverly，MA)、ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA)、Amersham(Amersham Biosciences，Inc.，Piscataway，NJ)、Becton Dickinson(BectonDickinson Labware，Lincoln Park，NJ)、BioRad(BioRad，Richmond，CA)、Difco(Difco Laboratories，Detroit，MI)、GIBCO BRL或Gibco BRL(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)、MIDI(MIDI Labs，Newark，DE)、Sigma或Aldrich(Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)、Sorvall(SorvallInstruments，DuPont Co.的子公司，Biotechnology Systems，Wilmington，DE)、Agilent(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)、Minolta(KonicaMinolta，Ramsey，NJ)和Zeiss(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)。实施例1过乙酸(PAA)对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)孢子的杀菌曲线
在本实施例中，进行实验来测定过乙酸(PAA)和PAA组合洗涤剂(商业可获得的
Figure G2008800154892D00391
[Dial]用于本实施例中)对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)孢子的杀菌曲线。在这些实验中，按照本领域的已知来制备枯草芽孢杆菌(B.subtilis)孢子(见，例如，Siccardi等人，J.Bacterid.，121：13-19[1975])。在96孔圆底微滴定板(Costar)中，用过乙酸(32wt％，处于乙酸中；Aldrich)一式两份进行测定。在50mM KPO4缓冲液(pH 7.1)(“缓冲液”)中或在处于同样缓冲液中的Purex(原制剂；Dial)的1∶500稀释液(“缓冲液+Det”)中，对PAA进行系列稀释(总体积为50μl)。加入测定中的PAA的量为0、0.4、4或40mM。然后将体积为5μl的孢子悬浮液(含有109-1010个孢子)加入到每个孔中，在RT下对测定进行15分钟的孵育。然后向每个孔中加入冰冷的LB(150μl)(见，例如，Sambrook等人，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，第二版(Cold Spring Harbor)，[1989])，混合，并将100μl转移到新的96孔板中。制备每种溶液的系列稀释液(总体积为100μl/孔)。将每种稀释液取5μl体积点滴(spot)到LA板(上文的Sambrook等人)上，在37℃孵育17-24小时。对菌落加以计数，测定相对于各对照(仅缓冲液或缓冲液+洗涤剂，其中没有过酸)的％孢子杀死率。结果作为来自一次实验的双份重复的平均值示于表1中。但是，实验一式两份进行两次，具有相似的结果。基于这些结果，大约4至大约40mM的范围内的PAA被确定为足以在15分钟内杀死枯草芽孢杆菌(B.subtilis)孢子。
Figure G2008800154892D00401
实施例2酶促产生PAA
在本实施例中，描述了用于通过酰基转移酶产生PAA的三种方法。在一种方法中，将至少一种酰基转移酶(野生型或变体)与至少一种酯底物和过氧化氢在缓冲液或洗涤剂中(有或没有一种或多种表面活性剂)组合。在一种备选的方法中，将至少一种酰基转移酶(野生型或变体)、至少一种酯底物以及过碳酸钠(或者H2O2的其它来源)在缓冲液或洗涤剂中(有或没有一种或多种其它表面活性剂)组合。在还一种方法中，将至少一种酰基转移酶(野生型或变体)与葡糖氧化酶和葡萄糖(浓度足以产生能杀死孢子的量的PAA)在缓冲液或洗涤剂中组合。在一些制剂中，还包括一种或多种其它表面活性剂。产生H2O2的其它酶也可用于该系统，包括氧化酶、氧化还原酶(例如，甘油氧化酶或己糖氧化酶)。在一些优选的实施方式中，使用独立于辅因子的醇氧化酶。测定PAA浓度
在这些实验中，用本领域已知的方法来测定PAA的浓度(见，例如，Pinkernell等人，Analyst，122：567-571[1997])。在该ABTS测定中，将100μl待测溶液加入到1ml125mM柠檬酸钾缓冲液(pH 5.0)(含有1.0mM 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和50uM KI)中，令其在RT下孵育3分钟。在HP 8452A二极管阵列分光光度计中测量420nm处的吸光度，并将其与使用权威标准(authentic standard)制备的标准曲线相比较。通过加入酶来起始酶促反应以形成PAA，反应在室温下进行。在指定的时间从反应中取等分试样，针对PAA浓度对其加以分析。用于这些实验的过碳酸钠是从Kemira获得的，过氧化氢是从EM Science获得的。将自H2O2或过碳酸钠酶促产生的PAA相比较
在320mM KPO4(pH 7.1)中制备39mM过碳酸钠溶液(过氧化水合碳酸钠(sodiu m carbon ate peroxyhydrate)，技术级85％，产生100mM有效的H2O2；Kemira)。固体过碳酸盐溶解后，得到的溶液具有7.6的pH。为对相同pH条件下由制备的H2O2(32wt％，Aldrich)或由从过碳酸盐形成的H2O2进行的PAA酶促生产加以比较，制备两项反应。一项反应含有处于320mM KPO4(pH 7.6)中的100mM H2O2、100mM 1，2-丙二醇二乙酸酯(Aldrich)和2ppm变体S54V。从标签声称的值来假定H2O2的绝对浓度，未通过分析加以验证。第二项反应含有处于320mMKPO4(pH 7.1)中的39mM过碳酸钠、100mM 1，2-丙二醇二乙酸酯和2ppm变体S54V。通过加入酶来起始反应。在指出的时间取样，按照实施例1所述测定PAA浓度。
图1中显示了PGDA作为底物的结果。如图1所示，两种情况下反应进程和PAA的终浓度都相似。
为研究不同丙醇乙酸酯底物的使用，使用与上文针对PGDA所述相同的一般性方法来产生PAA，但是其中使用乙酸丙酯或甘油三乙酸酯作为酯底物。观察到，这另外的两种酯底物也在系统中与S54V-MsAcT反应，从而制造PAA。针对三种酯底物而言，观察到转化成PAA的相对转化速率为：PGDA＞甘油三乙酸酯＞乙酸丙酯。实施例3PAA的酶促产生杀死枯草芽孢杆菌(B.subtilis)孢子
在本实施例中，描述了用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)孢子评估测试的酶促产生的PAA的杀死能力所进行的实验。基于在实施例1和2中描述的实验中获得的结果，4至40mM范围的PAA被确定为足以表明杀死枯草芽孢杆菌I-168的孢子。在这些实验中，在缓冲液以及洗涤剂中对孢子杀死进行了评估。在缓冲液中的孢子杀死
在本实验中，用过碳酸钠作为H2O2的来源。最终的溶液在800μl的总体积中含有100mM 1，2-丙二醇二乙酸酯、2ppm S54V变体、39mM过碳酸钠(技术级85％；产生100mM有效的H2O2)(处于320mM KPO4pH7.1中)。对该混合物(产生40mM PAA)进行系列稀释，产生了另外的混合物，其产生4.9、9.9和20.5mM PAA。用仅与400mM KPO4 pH7.1的混合物来测定没有PAA存在时的总孢子计数。令混合物在室温下孵育3分钟。然后将每种混合物取180μl的体积，分进圆底96孔板(Costar)的双份重复孔中，孔中含有20μl实施例1中使用的孢子悬浮液，从而在每个孔中产生了200μl的总体积。轻柔抽吸液体4-5次，以确保组分混合。将混合物再在室温下与孢子孵育15或30分钟。在15和30分钟的时间点，从每个孔中取20μl，加入到新的96孔板的孔中，在LB中系列稀释至10-7(总体积100μl)。从每种孢子混合物的每种稀释液取5μl的体积，点滴到LA板上，令其干燥，然后在37℃孵育过夜。还在15和30分钟的时间点，从每个孔取合适的体积，将其在dH2O中充分稀释，以产生按照实施例1所述采用标准以规模方式(on scale)用ABTS测定可测量到的PAA的量。这些测定的结果在表2中显示。孢子杀死的结果作为双份重复的平均值表示。
Figure G2008800154892D00421
在洗涤剂中的孢子杀死
实验完全依所述进行，除了用Purex在320mM KPO4 pH 7.1中的1∶500稀释液代替缓冲液。结果示于表3(双份重复的平均值)。对照包括处于400mM KPO4 pH7.1缓冲液中的多种反应组分：2ppm S54V变体、2ppm S54V变体与39mM过碳酸盐、100mM 1，2-丙二醇二乙酸酯、100mM 1，2-丙二醇二乙酸酯和39mM过碳酸钠、39mM过碳酸钠。所有这些处理在30分钟的孵育之后都给出了等价的孢子/ml水平，只除了仅过碳酸钠的情况(1×109孢子/ml，其它对照中是5×109孢子/ml)。在过碳酸钠与其它组分组合的情况下没有看到这种减少，并且这种减少并没有采用相当水平的所有三种组分的混合物时看到的杀死效果那么显著(100％杀死)。
Figure G2008800154892D00431
实施例4酶促产生PAA以杀死里氏木霉(Trichoderma reesei)孢子
在本实施例中，描述了进行来评估PAA对里氏木霉(T.reesei)孢子的杀死能力的实验。通过在马铃薯右旋葡萄糖(dextrose)(PDA)培养基上在30℃对菌株进行大约4天的培养，来制备里氏木霉孢子。当平板有75％被真菌生长覆盖时，在室温下再孵育若干天，直到汇合生长。使用棉签从板上刮下孢子，将其重新悬浮于1ml10％的甘油中，在-80℃冷冻，直到使用。在孢子杀死测定中使用之前，对孢子悬浮液解冻，通过离心使孢子沉淀，用1ml dH2O洗两次，再重悬浮于1ml dH2O中。按照实施例3所述进行孢子杀死实验，只是向96孔板的孔中加入20μl真菌孢子制备物，代替芽孢杆菌属孢子。此外，制备这样的混合物，使得产生PAA的量为40、13.3、4.4和1.5mM。将15和30分钟孵育的稀释液涂布到PDA培养基上。在15和30分钟的时间点，按照实施例1所述，测定产生的PAA的实际的量。结果示于表4中。这些结果表明，MsAcT系统产生的PAA以比枯草芽孢杆菌(B.subtilis)孢子更低水平的PAA杀死真菌孢子。
Figure G2008800154892D00441
实施例5从葡萄糖和PGDA产生PAA
在该实施例中，描述了评估从葡萄糖和丙二醇二乙酸酯产生的过乙酸的量的实验。制备15ml溶液，其中含有50mM KPO4 pH 7.1以及60mM葡萄糖和20mM 1，2-丙二醇二乙酸酯(Aldrich)。向溶液中持续喷入空气，并在室温下搅拌。通过加入100个单位的葡糖氧化酶(OxygenHP，Genencor International)来起始产生H2O2的反应，反应进行1小时。取样，并针对PAA加以测试，之后加入2ppm S54V变体，以起始从形成的H2O2对PAA的生产。结果示于图2中。在图2示出的时间取更多样品，按照上文所述测定PAA的浓度。在添加酶之前没有检测到PAA，而从20mM 1，2-丙二醇二乙酸酯和由葡萄糖/葡糖氧化酶反应产生的H2O2产生了大约9.5mM的PAA。实施例6通过MsAcT在不同温度下产生PAA
在本实施例中，描述了进行来评估MsAcT在不同温度下的过乙酸产生的实验。此类产生提供了解决与PAA在多种温度下的贮藏不稳定性相关的问题的手段。在这些实验中，在大约20℃至大约60℃的温度范围上，用MsAcT产生PAA。在一些实验中，使用的温度例如21℃、40℃和60℃。
在这些实验中，准备三项反应，它们由320mM KPO4 pH7.1、100mM 1，2-丙二醇二乙酸酯(Aldrich)和100mM过碳酸钠构成。在21℃、40℃和60℃对反应加以平衡，然后通过加入S54V变体至2ppm的终浓度来起始反应。结果示于图3中。在图中指出的时间取样，按照上文所述测定PAA浓度。这些结果表明，酶系统在至少高至60℃时是有功能的。实施例7通过MsAcT产生浓缩的过乙酸
在本实施例中，进行实验来测定MsAcT产生过乙酸的浓缩溶液的能力。进行这些实验，以展示制备适用于加入或稀释进不同溶液以备使用的浓缩过乙酸溶液的潜在好处。在该实验中，反应含有50mM KPO4、2M H2O2(EM Science)、2M 1，2-丙二醇二乙酸酯(Aldrich)和S54V变体(终浓度为160ppm)。偶尔振荡反应体系使得反应物混合，因为它们在该浓度下不易混合。在室温下进行混合。结果示于图4中。在指出的时间稀释样品，按照上文所述测定过乙酸浓度。实施例8具有高的杀孢子活性的酶促PAA产生系统
本实施例显示了使用三种组分制剂(来自耻垢分枝杆菌的酰基转移酶的S54V突变体(S54V-MsAcT)、1，2-丙二醇二乙酸酯(PGDA)(作为酯底物)和过碳酸钠(作为过氧化氢来源))产生的按重量计0.16％的过乙酸(PAA)溶液在多种EPA认可的去污测定中的有效性。材料和方法
制备250mL PAA测试溶液：在15mL锥形管中制造干制剂，其中每份含有大约1.20g至大约1.30g的过碳酸钠以及大约26.0mg至大约31.9mg的S54V-MsAcT酶颗粒。对于每个干制剂的管而言，制备另一15mL锥形管，其中含有1.8mL的酯底物，丙二醇二乙酸酯(PGDA)。在单个拉链锁袋中装入一个干制剂的管和一个PGDA管。一个拉链锁袋的内含物(即，一个干制剂的管和一个PGDA管)构成了加入到250mL水中时产生0.16％PAA的一个单位。
通过将来自一个单位的干制剂加入到250mL室温下经灭菌的去离子水中直到完全溶解，来制备PAA测试溶液。用250mL测试溶液中的一些来将任何残余的干制剂从管中洗到溶液中。然后将管中的PGDA液体加入至搅拌250mL的溶液，并再次用一些溶液将任何残余的PGDA从管中洗进溶液。然后对PAA测试溶液进行20分钟的搅拌。进行视觉检查判断，PAA测试溶液是均匀的。其在制备的2小时内使用。
制备2000mL PAA溶液：在15mL锥形管中制造干制剂，每份含有大约9.6g至大约9.8g的过碳酸钠以及大约216mg至大约226mg的S54V-MsAcT酶的颗粒。对于每个干制剂的样品而言，制备另一15mL锥形管，其中含有1.8mL的酯底物，丙二醇二乙酸酯(PGDA)。在单个拉链锁袋中装入一个干制剂的管和一个PGDA管。一个拉链锁袋的内含物(即，一个干制剂的管和一个PGDA管)构成了加入到2000mL水中时产生0.16％PAA的一个单位。
按照与上文针对250mL测试溶液所述相同的方式来制备2000mL PAA测试溶液，但是使用更大量的干制剂、PGDA液体和水。
测定1：杀菌和洗涤剂卫生处理作用
按照上文250mL的方案来制备PAA测试溶液。将金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)或大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC 11229)细胞的悬浮液暴露给PAA测试溶液30秒或60秒。暴露之后，转移等分试样到中和传代培养基(Letheen肉汤+0.1％硫代硫酸钠+0.01％过氧化氢酶)中，使用倾倒涂板技术和胰蛋白胨葡萄糖提取物琼脂(TGEA)来测定存活物。还进行了适当的数量对照，纯度、无菌(sterility)、存活和中和对照。
测定2：无生命的(inanimate)非食品接触表面卫生处理效果
按照上文250mL的方案来制备PAA测试溶液。细菌细胞的膜在载玻片载体的表面上干燥。使用两种不同的细菌金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)(ATCC 13048)，来制备四组不同的八块载玻片。被污染的载玻片中的五块在18.0℃被暴露给PAA测试溶液两分钟或5分钟。暴露之后，向含有载玻片载体和PAA测试溶液的每个罐中加入中和传代培养基(Letheen肉汤+0.1％硫代硫酸钠+0.01％过氧化氢酶)，针对存活物对溶液加以测定。来自每个组的三块对照载玻片没有暴露给水溶液，但用中和传代培养基进行了相似的处理。
测定3：AOAC杀菌效果-使用-稀释方法
按照上文2000mL的方案来制备PAA测试溶液。细菌细胞的膜在一组30件不锈钢载体物品的表面上干燥。使用三种不同的细菌：铜绿假单胞菌(ATCC 15442)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)(ATCC 10708)，来制备三个不同的组。每个被污染的物品在室温下(20.0℃)暴露给PAA测试溶液5分钟或10分钟。暴露之后，将物品转移到含有中和传代培养基(Letheen肉汤+0.1％硫代硫酸钠+0.01％过氧化氢酶)的容器中，针对存活的细菌加以测定。还进行了适当的纯度、存活、载体物品无菌性、中和传代培养基无菌性、存活、中和验证和载体群对照。
测定4：AOAC杀孢子效果：
按照上文250mL的方案来制备PAA测试溶液。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC 19659)孢子悬浮液在30根Dacron缝线的组上干燥。产芽胞梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)(ATCC 3584)的悬浮液在一组30件瓷penicylinders上干燥。每个被污染的物品在室温下(20.0℃)暴露给PAA测试溶液2小时或5.5小时。暴露之后，将物品转移到含有中和传代培养基(巯基乙酸培养基+0.1％硫代硫酸钠+0.01％过氧化氢酶)的容器中，针对存活的细菌加以测定。还进行了适当的HCl、存活、纯度、无菌、被污染物品定量和中和对照。结果
测定1：PAA测试溶液展示：在20.0℃暴露仅30秒后，金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)或大肠杆菌(ATCC 11229)就有＞99.999％的降低。
测定2：PAA测试溶液展示：在18.0℃暴露2分钟(或5分钟)后，载玻片上的金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)或产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)(ATCC 13048)降低＞99.9％。
测定3：被污染的不锈钢载体物品暴露给PAA测试溶液5分钟导致30个传代培养管中的任何管中铜绿假单胞菌(ATCC 15442)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和猪霍乱沙门氏菌(ATCC 10708)都没有显现的生长。暴露给PAA溶液10分钟的30件物品之一展示出铜绿假单胞菌(ATCC 15442)的生长，但是十分钟暴露的任何传代培养管中的任何其它细菌都没有显现的生长。
测定4：当用在20.0℃暴露给PAA溶液2小时或5.5小时的被污染的Dacron缝线进行测试时，在30份初级传代培养物的任何中没有显现的枯草芽孢杆菌(ATCC 19659)的生长，并且在30份次级传代培养物中的任何中都没有生长。类似地，当用在20.0℃暴露给PAA溶液2小时或5.5小时的被污染的瓷penicylinder进行测试时，在30份初级传代培养物的任何中没有显现的产芽胞梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)(ATCC 3584)的生长，并且在30份次级传代培养物中的任何中没有生长。结论
使用S54V-MsAcT酶、丙二醇二乙酸酯(作为酯底物)和过碳酸钠(作为过氧化物来源)的三种组分制剂产生的0.16％PAA溶液在测试的所有四种经EPA认可的消毒/去污测定中都高度有效。消毒剂的杀菌和洗涤卫生处理作用测试结果显示了高于99.999％的针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的有效性。推荐给无生命的非食品接触表面的卫生消毒剂效果的标准测试方法的测试结果显示了超过99.9％的针对金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的有效性。AOAC使用-稀释方法测试结果显示了针对金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesius)的100％的有效性以及针对铜绿假单胞菌的96.7％的有效性。消毒剂的杀孢子活性(AOAC)测定展示了PAA溶液针对枯草芽孢杆菌和产芽胞梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)的孢子的100％的效果。实施例9具有高杀孢子活性的稳定的“多合一”PAA产生组合物
本实施例描述了处于液体酯底物，丙二醇二乙酸酯中的S54V-MsAcT酶和过碳酸钠的“多合一”组合物的制备和随时间的稳定性。该实施例还描述了该组合物用于产生按重量计0.16％的PAA溶液的用途。材料和方法
多合一组合物：向按照实施例8所述制备的干制剂的管(含有1.22g过碳酸钠和28.0mg S54V-MsAcT颗粒)中加入1.8mL的PGDA液体。
对多合一组合物的活化和测定：在搅拌下将按照上文所述制备的多合一组合物加入到250mL去离子水中。根据上文实施例8所述的250mL和2000mL的方案来制备两种另外的PAA溶液。
在t＝20分钟时，测量这三种溶液中每种的pH，发现其为10.3。在t＝20分钟时，从三种溶液中的每种取20μL的等分试样，将其加入到了980μL 125mM柠檬酸钠(pH 5.0)中。然后使用上文所述的ABTS测定，针对PAA浓度，对这三份稀释样品加以测定。
稳定性研究：制备另外两种多合一组合物样品。在250mL水中活化并且测定PAA浓度之前，一种被放置4天。另一种在250mL水中活化并且测定PAA浓度之前于室温下放置33天。为进行比较，按照实施例8所述制备样品，其中，在水中活化之前，干制剂组分与液体PGDA组分在室温下分开放置同样的4天和33天阶段。
可变的PAA产生组合物：制备一套5种过碳酸钠的量不同的多合一组合物，以表明在标准组合物的大约60％至160％的范围上改变产生PAA的浓度的能力。根据表5列出的量来制造这五种多合一组合物样品。表5
  样品号  过碳酸钠(g)   酶(mg)   PGDA(mL)
  1   0.768   30.7   1.8
  2   1.003   30.9   1.8
  3   1.251   29.6   1.8
  4   1.501   28.7   1.8
  5   2.009   30.5   1.8
然后在环境温度下(20℃)搅拌下将这五种样品加入到250mL去离子水中。在10、20和30分钟时取等分试样样品用于测定。使用ABTS测定在微滴定板中测定PAA浓度。
杀孢子功效测定：在15.0mL锥形管中制备含有1.37g过碳酸钠、33.30mg S54V-MsAcT(与1.80mL PGDA混合)的多合一组合物。在20分钟的搅拌下，将组合物加入到无菌去离子水中。向4个25×150mm管中的每个中装入10ml得到的PAA测试溶液。将这些管放在20℃培养箱，令其达到温度。使用灭菌镊子，向每个管中加入5个被枯草芽孢杆菌(B.subtilis)污染的penicylinder或者5个被枯草芽孢杆菌(B.subtilis)污染的缝线环。向每种溶液中加入所有滚轴式骨针(cylinder)或缝线之后，保持5分钟的时间，以备之后再将其从管中取出。20℃下1小时的接触时间后，取出penicylinder或缝线，使用弯曲的无菌塑料针(无菌下在袋内将尖端弯曲成钩)，将它们每个放到另外的10mL流体巯基乙酸培养基(Difco Cat.#225650)的管中。向巯基乙酸培养基的初级管转移完成之后，将滚轴式骨针和缝线转移到新鲜的巯基乙酸培养基(10mL)管中，于37℃孵育21天。如果21天后没有观察到生长，在80℃对管进行热激，并在37℃再孵育另外的72小时。进行19至20份重复。结果
当在搅拌下于250mL水中活化20分钟时，多合一组合物产生了0.18％过酸的溶液。同一测定中制备的250mL和2000mL的方案分别产生了具有0.17％和0.17％过酸的溶液。
用在室温下保持4天和33天的多合一组合物制备的溶液产生的过酸浓度为预期的100％。类似地，使用单独的干制剂和液体组分制备的溶液也产生了其预期PAA浓度的接近100％。
用不同的过碳酸钠量制备的五种多合一组合物样品在20分钟的时间点产生了0.11％至0.33％范围内的PAA浓度，这构成了标准使用条件。因此，多合一组合物可被“调谐”以提供所指出的范围内的想要的PAA浓度。在这个特别的实施例中，产生的PAA浓度范围在19-51mM之间，这是28.5-76.5mM H2O2(Na2CO31.5H2O2)。H2O2的最大转化率为61.7％，这是在t＝30分钟时用样品5观察到的。基于此，可通过调节过碳酸盐水平或PGDA水平或二者，来获得想要的PAA的量。
用1.37g过碳酸钠、33.30mg S54V-MsAcT混合1.80mL PGDA(在250mL水中)制备的多合一组合物在针对被枯草芽孢杆菌(B.subtilis)污染的缝线和penicylinder的杀孢子功效方面没有展示出失败。结论
与干组分和液体PGDA酯底物分开贮藏的制剂一样，在单个管中含有用于酶促PAA产生的所有三种组分的“多合一”组合物可用于产生有效的PAA去污溶液(0.16％)。明显地，在水中活化之前，于室温下甚至33天之后，多合一组合物显示了在PAA产生的性能上的0％损失的稳定性。此外，当在被污染的缝线和瓷penicylinder上进行测定时，使用“多合一”组合物制备的PAA溶液显示出高水平的杀孢子功效，与分开的干和液体组分制剂等价。
此外，发现，可通过改变所用的过碳酸钠的量，来“调谐”多合一组合物，使其产生大约0.11％至0.33％范围内的PAA浓度。实施例10水溶性囊用于递送多合一PAA产生组合物的用途
本实施例描述了对在水溶性囊中配制的用于产生PAA的多合一组合物的制备和用途。材料和方法
从Solupak Ltd.(Manchester，UK)获得水溶性聚乙烯醇(PVA)囊。制备10个这样的囊用于多合一组合物，其中每个中装入7.5g PGDA、4.8g过碳酸钠和110mg酰基转移酶S54V-MsAcT。然后使用热密封仪密封每个囊。
将囊从UK运到US，使得使用前有7天的运输时间。收到后，于21℃将囊溶于2000mL经纯化的水(MilliQ)中。在50分钟的时间段内，在选择的时间点，测量2000mL溶液的pH和PAA浓度。按照上文所述，使用ABTS在柠檬酸盐测定中测定PAA。结果
溶于2000mL溶液中的囊如预期那样递送了多合一组合物，并且得到了下表6中列出的PAA浓度和pH值。表6
  时间(分钟)   PAA(wt.％)   pH
  0.00   0.02   5.20
  5.00   0.02   10.10
  10.00   0.04   10.19
  15.00   0.08   9.78
  20.00   0.12   9.37
  25.00   0.14   8.97
  30.00   0.16   8.62
  50.00   0.18   8.12
如上所示，囊递送系统可规模运行。其产生了目标PAA浓度，并且给出了典型的pH模式，在20分钟(预设溶解时间)时产生了pH 8.6，这是通常认为非腐蚀性的pH范围。结论
多合一组合物是稳定的，并且可在水溶性聚乙烯醇囊中被有效递送至溶液。30分钟后，得到的溶液的PAA浓度和pH值等于不用囊时观察到的情况。
本说明书中提及的所有专利和出版物指出了本发明所属技术领域的技术人员的水平。所有专利和出版物通过参考并入本文至这样的程度，即好像每个单独的出版物都表示为明确地分别通过参考并入本文。
尽管已经描述了本发明的优选实施方案，对本领域普通技术人员显而易见的是，可以对公开的实施方案进行各种修改，而且此种修改旨在被包括在本发明的范围内。
本领域技术人员容易认识到，本发明完全可以进行调整以实现目标并获得所提及的以及固有的结果和优势。本文中描述的组合物和方法，代表了优选的实施方案，是示范性的，而不意图成为对本发明范围的限制。对本领域技术人员显而易见的是，可以对本文中公开的发明进行各种置换和修改，而不脱离本发明的精神和范围。
本文中例证地描述的本发明可以在缺少本文中未具体公开的任一元素或许多元素、限定或许多限定的情况下适宜地实施。已被使用的术语和表述，是被用作描述性术语的，而不是限定性的，并且本发明的意图不是在使用这些术语和表述时排除显示和描述的特征或其部分的等价物，应认识到在要求保护的发明范围内各种修改是可能的。因此，应该理解，尽管本发明通过优选的实施方案和可选的特征被具体地公开，但本领域技术人员可以重新对本文公开的概念进行修改和变化，而这些修改和变化被认为包含在如附带的权利要求限定的本发明的范围之内。
在本文中，本发明已以宽泛的和一般性的方式被描述。落入该概括性公开内容中的每一较窄的种类和亚类也形成本发明的一部分。这包括发明的这样的概括性描述，其带有附加条件或从该类中除去任何主题的负限定，不论删除的该物质是否在本文中被具体地详述。

Claims (35)

1.组合物，其包含过水解酶、过氧化氢来源和酯底物，其中所述组合物与水混合时产生过酸，并且，其中，所述组合物在至少大约7天的时间内保持产生过酸的活性。
2.权利要求1的组合物，其中所述酯底物是液体，所述过水解酶和过氧化氢来源是悬浮于液体中的固体。
3.权利要求1的组合物，其中所述过酸选自过乙酸、过壬酸、过丙酸、过丁酸、过戊酸和过己酸。
4.权利要求4的组合物，其中所述过酸是过乙酸。
5.权利要求1的组合物，其中所述酯底物是丙二醇二乙酸酯。
6.权利要求1的组合物，其中所述过水解酶包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
7.权利要求1的组合物，其中所述过水解酶是SEQ ID NO：1的S54V变体。
8.权利要求1的组合物，其中所述过氧化氢来源是产生过氧化氢的化合物，所述化合物选自过碳酸钠、过硼酸钠和脲过氧化氢。
9.权利要求8的组合物，其中所述过氧化氢来源是过碳酸钠。
10.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含按重量计大约0.001％至大约1％的过水解酶、按重量计大约35％至大约45％的过碳酸钠和按重量计大约55％至大约65％的丙二醇二乙酸酯。
11.权利要求1的组合物，其中所述过氧化氢来源是包含氧化酶及其底物的酶促过氧化氢产生系统。
12.权利要求11的组合物，其中所述氧化酶选自葡糖氧化酶、山梨糖醇氧化酶、己糖氧化酶、胆碱氧化酶、醇氧化酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶、吡喃糖氧化酶、羧基醇氧化酶、L-氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、谷氨酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、赖氨酸氧化酶、乳酸氧化酶、香草基氧化酶、乙醇酸氧化酶、半乳糖氧化酶、尿酸氧化酶、草酸盐氧化酶和黄嘌呤氧化酶。
13.权利要求1的组合物，其还包含选自蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和微生物细胞壁降解酶的至少一种另外的酶。
14.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含至少一种表面活性剂。
15.制备去污溶液的方法，所述方法包括将权利要求1至14中任意一项的组合物加入到水中，并混合至少大约20分钟。
16.用于去污的方法，所述方法包括：
(a)提供权利要求1至14中任意一项的组合物；
(b)将所述组合物加入水中并混合，由此产生水性过酸溶液；
(c)将包含污染物的物品暴露给所述溶液。
17.权利要求16的方法，其中所述组合物被包含在水溶性容器中。
18.权利要求18的方法，其中所述容器是聚乙烯醇膜制成的囊。
19.权利要求16的方法，其中所述水是经灭菌的。
20.权利要求16的方法，其中所述暴露包括将所述物品在高温下暴露给所述溶液。
21.权利要求16的方法，其中所述污染物包含选自肉毒杆菌毒素、炭疽毒素、蓖麻毒蛋白、鲭毒素、鱼肉毒素、河鲀毒素、真菌毒素及其任何组合的毒素。
22.权利要求16的方法，其中所述污染物包含选自细菌、病毒、真菌、寄生物、朊病毒及其任何组合的病原体。
23.权利要求22的方法，其中所述病原体选自芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)、梭菌属物种(Clostridiumspp.)、肉毒梭菌(C.botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、利斯特氏菌属物种(Listeria spp.)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、志贺氏菌属物种(Shigella ssp.)、大肠杆菌(E.coli)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia spp.)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、弗朗西丝氏菌属物种(Francisella spp.)、土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)、Camplyobacterssp.、弧菌属物种(Vibrio spp.)、布鲁氏菌属物种(Brucella spp.)、隐孢子虫属物种(Cryptosporidium spp.)、贾第虫属物种(Giardia spp.)、环孢子虫属物种(Cyclospora spp.)和毛线虫属物种(Trichinella spp.)。
24.权利要求16的方法，其中所述物品选自硬表面、织物、食品、饲料、衣服、小地毯、地毯、纺织品、医疗仪器和兽医仪器。
25.包含水溶性容器的系统，所述容器包含根据权利要求1至15中任意一项的稳定组合物。
26.权利要求25的系统，其中所述容器是囊、安瓿、胶囊或小球。
27.权利要求26的系统，其中所述水溶性容器由水溶性聚合物材料聚乙烯醇、聚环氧乙烷、源于纤维素的水溶性糖类和聚交酯制成。
28.制备去污溶液的方法，所述方法包括将权利要求26的系统加入到水中并进行混合。
29.用于去污的试剂盒，所述试剂盒在包装中包含权利要求1至15中任意一项的稳定组合物。
30.权利要求29的试剂盒，其中所述组合物在水溶性容器中。
31.权利要求30的试剂盒，其中所述水溶性容器是囊、安瓿、胶囊或小球。
32.权利要求30的试剂盒，其中所述水溶性容器由选自聚乙烯醇、聚环氧乙烷、源于纤维素的水溶性糖类和聚交酯的水溶性聚合物材料制成。
33.权利要求29的试剂盒，其还包含空的混合容器，用于将所述组合物与水混合。
34.权利要求29的试剂盒，其还包含处于密封容器中的水，其中所述水是经灭菌的。
35.权利要求29的试剂盒，其还包含用于在根据权利要求16的方法中使用的说明书。
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