MXPA06005652A - Perhidrolasa. - Google Patents

Perhidrolasa.

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MXPA06005652A
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MX
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perhydrolase
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amino acid
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MXPA06005652A
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Gregory S Miracle
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Genencor Int
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Abstract

La presente invencion proporciona metodos y composiciones que comprenden por lo menos una enzima perhidrolasa para limpieza y otras aplicaciones. En algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invencion proporciona metodos y composiciones para generacion de peracidos. La presente invencion encuentra uso particular en aplicaciones que involucran limpieza, blanqueo y desinfeccion.

Description

PERHIDROIASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones que comprenden por lo "menos una enzima perhidrolasa para limpieza y otras aplicaciones. En algunas modalidades preferidas particularmente, la presente invención proporciona métodos y composiciones para la generación de perecidos. La presente invención encuentra uso particular en aplicaciones que involucran limpieza, blanqueado y desinfección. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las composiciones detergentes y otras composiciones limpiadoras típicamente incluyen una combinación compleja de ingredientes activos. Por ejemplo, la mayor parte de los productos limpiadores incluyen un sistema tensioactivo, enzimas para limpieza, agentes blanqueadores, mej oradores de detergencia, supresores de lodos, agentes que suspenden la mugre, agentes que liberan la mugre, abrillantadores ópticos, agentes suavizantes, dispersantes, compuestos de inhibición de transferencia de tinte, abrasivos, bactericidas y perfumes. Pese a la complejidad de los detergentes actuales, existen muchas manchas que son difíciles de eliminar completamente. Además, con frecuencia existen residuos que se acumulan, lo que resulta en cambio de coloración (por ejemplo REF. :172592 amarilleo) y una estética disminuida debido a una limpieza incompleta. Estos problemas se acumulan con el uso aumentado de bajas temperaturas de lavado (por ejemplo, agua fria) y ciclos de lavado más cortos. Además, muchas manchas están constituidas de mezclas complejas de material fibroso, que incorpora principalmente carbohidratos y derivados de carbohidratos, fibras y componentes de la pared celular (por ejemplo, material vegetal, madera, mugre basada en lodo-arcilla y fruta) . Estas manchas presentan restos difíciles para la formulación y uso de composiciones limpiadoras. Además, las prendas con colores tienden a desgastarse y presentar pérdidas de apariencia. Una porción de esta pérdida de color se debe a la abrasión en el procedimiento de lavandería, particularmente en máquinas de lavado y secado automatizado. Además, la resistencia a la tensión de las telas parece ser un resultado inevitable de la acción mecánica y química debido al uso, desgaste y/o lavado y secado. De esta manera, es necesario un medio para lavar eficiente y eficazmente prendas de vestir con color de manera que se minimicen dichas pérdidas de apariencia. Las composiciones limpiadoras que comprenden esterasas, lipasas y cutinasas son bien conocidas en el arte. No obstante, estas enzimas tienen una proporción muy baja de perhidrólisis respecto a hidrólisis. Esto resulta en la conversión de la mayor parte del sustrato éster en ácido, en vez del perácido, más deseable. Este es un incoveniente grave, dado que el espacio de fórmula y las consideraciones de costo vuelven factible incluir sólo una cantidad limitada de sustrato. Resumiendo, pese a las mejoras en las capacidades de las composiciones limpiadoras, permanece la necesidad en la técnica por detergentes que eliminen las manchas, mantengan el color y la apariencia de las telas y que eviten la transferencia de tinte. Además, permanece la necesidad por composiciones detergentes y/o para el cuidado de telas que proporcionen y/o restauren la resistencia a la tensión, y que igualmente proporcionen propiedades antiarrugas, antiestropeado y/o antiencogimiento a las telas, y que de igual manera proporcionen control estático, suavidad a la tela, mantengan la apariencia deseada de color y las propiedades y beneficios antidesgaste de la tela. En particular, permanece la necesidad por la inclusión de composiciones que sean capaces de eliminar los componentes coloreados de las manchas, las cuales con frecuencia permanecen unidas a la tela que es lavada. Además, permanece la necesidad por métodos y composiciones mejoradas que sean adecuadas para el blanqueado textil. Además del área de limpieza de telas y prendas de vestir, el blanqueado se utiliza comúnmente en la pulpa y en la industria del papel, antes de la producción de papel, la pulpa típicamente se trata para eliminar contaminantes indeseables con color. Esto proporciona una pulpa que es adecuada para la producción de papel con una calidad superior en comparación con la pulpa que no es tratada para eliminar los contaminantes coloreados y otros componentes indeseables que se encuentran presentes en la pulpa. Por ejemplo, en la industria del reciclado de papel, es necesaria la eliminación de tinta. Aunque los métodos estándar son adecuados para desteñir el papel con tintas basadas en aceite o en agua, el uso aumentado de tintas electrostáticas ha vuelto problemático el destintado, dado que estas tintas son mucho más difíciles de eliminar. Existen varios métodos disponibles para eliminar la tinta del papel, que incluye en el uso de enzimas (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,370,770). No obstante, permanece la necesidad en la técnica por métodos para el tratamiento de la producción de elaboración de pulpa o papel (reciclado y nuevo) . El blanqueado también se utiliza comúnmente en el mercado del cuidado personal (por ejemplo blanqueadores dentales, blanqueadores para el pelo, etcétera) . Aunque los productos blanqueadores para el cuidado personal han mejorado con respecto a los años, permanece la necesidad de métodos blanqueadores moderados, fáciles de utilizar, rentables para este ámbito. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones que comprenden por lo menos una enzima perhidrolasa para limpieza y otras aplicaciones. En "algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona métodos y composiciones para la generación de perecidos. La presente invención encuentra uso particular en aplicaciones que involucran limpieza, blanqueado y desinfección. En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones que comprenden por lo menos una perhidrolasa, en donde la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis mayor de 1. La presente invención también proporciona perhidrolasas aisladas, en donde las perhidrolasas presentan una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa es la perhidrolasa de M. smegmatís . En modalidades preferidas alternativas, la perhidrolasa es por lo menos aproximadamente 35% homologa a la perhidrolasa de M. smegmatis . En modalidades adicionales, la perhidrolasa es por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% homologa a la perhidrolasa de M. smegmatis . En modalidades preferidas adicionales la perhidrolasa comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En algunas modalidades preferidas, las perhidrolasas tienen reactividad cruzada inmunológica -con la perhidrolasa de M. smegmatis . En otras modalidades adicionales, la perhidrolasa es por lo menos una porción de la perhidrolasa de M. smegmatis, en donde la perhidrolasa tiene una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En modalidades alternativas, la perhidrolasa es un homólogo estructural de la perhidrolasa de M. smegmatis, en la cual el sitio activo es homólogo a por lo menos un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Sil, D1.92 y H195 de la perhidrolasa de M. smegmatis . La presente invención también proporciona variantes aisladas de perhidrolasa que tienen secuencias de aminoácidos que comprede por lo menos una modificación de un aminoácido realizada en la posición equivalente a la posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En algunas modalidades, se realiza por lo menos una modificación en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establecen en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en donde el aminoácido modificado se selecciona del grupo que consiste de Cys7, AsplO, Serll, Leul2, Thrl3, Trpl4, Trplß, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Vall25, Prol38, Leul40, Prol46, Prol48, Trpl49, Phel50, Ilel53, Phel54, Thrl59, Thrl8ß, Ilel92, Ilel94 y Phel96. En modalidades adicionales, la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tís que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de: Ml, K3, R4, 15, L6, C7, DIO, Sil, L12, T13, W14, W16, G15, V17, P18, V19, D21, G22, Q23, P24, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, V32, R33, W34, T35, G36, L38, Q40, Q41, D45, L42, G43, A44, F46, E47, V48, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, 160, D61, D62, Pß3, Tß4, D65, P66, R67, L68, N69, G70, A71, S72, Y73, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, D85, L86, V87, N94, D95, T96, K97, Y99F100, R101, R102, P104, L105, D106, 1107, A108, L109, G110, Mili, S112, V113, L114, V115, T116, A117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P146, P148, 149, F150, 1153, A194 y F196. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa variante presenta un cambio en la hidrólisis de perácido en comparación con la perhidrolasa natural (de tipo silvestre) . En algunas modalidades, el cambio en la hidrólisis de perácido es una disminución mientras que en otras modalidades el cambio en la hidrólisis de perácido es un incremento. En algunas modalidades preferidas alternativas, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.1 o menos, en comparación con la "perhidrolasa natural. En modalidades preferidas alternativas, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en la posición de aminoácidos equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de R4, L12, G15, P18, R27, 34L38, A44, E51, G52, L53, S54, T58, R67, L68, S72, A79, T80, D85, L86, V87, N94, K97, R101, V118, L119, G124, G126 e 1194. En modalidades alternativas adicionales, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.2 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en la posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de R4, 15, DIO, L12, W14, G15, P18, V19, T25, R27, 34, L38, A44, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T58, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S72, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94, T96, K97, R101, L82, P83, L86, V87, N94, T96, K97, F100, R101, L109, Mili, L114, V118, L119, A122, G124, G126, T127, Y129, W149 e 1194. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.3 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades adicionales, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en la posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de R4, 15, DIO, L12, W14, G15, L12, P18, V19, T25, E26, G36, Q41, L42, G43, A44, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, N59, T58, D62, T64, D65, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94, T96, K97, Y99, F100, R101, R102, P104, LIO9, G110, Mili, L114, V118, L119, A122, G124, V125, G126, T127, Y129, W149, F154 e 1194. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.4 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de R4, 15, L6, DIO, Sil, L12, W14, G15, 16, P18, V19, G22, A23, T25, E26, R27, F28, W34, T35, G36, L38, Q41, L42, G43, A44, D45, E47, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, T58, 160, D62, T64, D65, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94, P66, T96, K97, Y99, F100, R101, R102, P104, 1107, L109, G110, Mili, S112, L114, V118, L119, S121, A122, G124, V125, G126, T127, Y129, W149, F150, F154, 1194 y F196. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.5 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en la posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, R51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, Mili, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, 14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, 16, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.6 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, 149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, R51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, Mili, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, 149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, 1107, 1194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, Mili, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, Sil, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, V125, V19, 16, Y129, Y73, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.7 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición. de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, R51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, Mili, L114, L119, 149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, 149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, GllO, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, 16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, 1107, 1194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, Mili, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, Sil, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, 149, 15, 160, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y73, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.8 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste^ de A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, 149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, R51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, Mili, L114, L119, 149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, 149, 16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, 1107, 1194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, Mili, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, Sil, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7 , D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, 149, 15, 160, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y99, A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C77, D45, D61, D65, D85, D95, E47, E51, F150, F196, F46, G110, G126, G36, G43, G52, 1107, 1194, 149, 15, 160, 189, L114, L42, L53, L68, L78, L84, Mili, N59, N94, P146, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, R101, R4, S112, S121, S72, T116, T120, T127, T13, T57, T96, V113, V125, V17, V19, V32, V87, 149, Y129, Y73, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 1.5 o mayor, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, R51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, FlOO, R101, L109, Mili, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, 149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, GllO, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, 149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, DIO6, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, 1107, 1194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, Mili, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, Sil, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, 149, 15, 160, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y99, A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C77, D45, D61, D65, D85, D95, E47, E51, F150, F196, F46, GllO, G126, G36, G43, G52, 1107, 1194, 149, 15, 160, 189, L114, L42, L53, L68, L78, L84, Mili, N59, N94, P146, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, R101, R4, S112, S121, S72, T116, T120, T127, T13, T57, T96, V113, V125, V17, V19, V32, V87, W149, Y129 e Y73, Y99, A108, A44, C7, DIO, D106, D31, D85, E26, E51, FlOO, F28, F46, GllO, G22, G36, G43, G52, G70, 1107, 1153, 149, 15, 189, K3, L105, L53, L6, L78, L86, Ml, N69, P104, P146, P18, P24, -P30, P83, Q117, Q40, Q41, R102, R27, R33, R4, S121, S72, S76, T120, T128, T13, T35, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, W34, G190, V191, G193, T197, E198, A199, R202, D203, G205, V206, A209, E210, Q211, S214 y L215. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido entre aproximadamente 1.2 y aproximadamente 1.5, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatís que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, C7, D106, D31, D61, D85, E26, E50, E51, FlOO, F150, F28, GllO, G126, G22, G70, 1107, K3, L105, L42, L6, L78, mili, N59, N69, P104, P146, P148, P18, P30, P63, Q117, Q40, Q41, R102, R27, R33, R4, S54, S76, T116,T120, T128, T64, T80, T96, V113, V115, V118, 34 e Y73. En todavia modalidades adicionales, la presente invención proporciona perhidrolasas variantes en las cuales las perhidrolasas variantes presentan un cambio en la perhidrólisis, de manera que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de por lo menos aproximadamente 1.2. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que - se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de C7, DIO, L12, G15, P18, V19, G22, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, G36, Q40, Q41, L42, G43, A44, D45, F46, E47, 149, E51, L53, S54, A55, T57, D61, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, A71, S72, Y73, S76, L78, A79, T80, L82, P83, D85, L86, D95, K97, R101, T103, P104, L105, D106, 1107, L109, Mili, V113, A117, V118, S121, G124, V125, G126, T127, P148, F150, 1153, F154 y F196. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.8 o menos. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C7, C77, DIO, D106, D21, D45, D61, D62, D65, D85, E26, E47, E50, E51, FlOO, F150, F154, F196, F28, F46, GllO, G124, G126, G15, G22, G36, G52, G70, 1107, 1153, 1194, 149, 15, 160, 189, K3, K97, L105, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L6, L68, L78, L82, L84, K86, Ml, Mili, N59, N94, P146, P18, P24, P30, P66, P83, Q40, Q41, R101, R102, R27, R33, R4, R56, R67, Sil, S112, S54, S72, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T25, T35, T57, T64, T80, T96, V113, V115, V118, 125, V17, V19, V32, V48, V87, W13, W149, W16, W34, Y129, Y73 e Y99. En modalidades alternativas, la presente invención proporciona perhidrolasas variantes que comprenden por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste A108, A122, A23, A29, A44, A55, A7.1, A79, C7 , C77, DIO, D106, D21, D31, D45, D61, D62, D65, DS5, E26, E47, E50, E51, FlOO, F150, F154, F196, F28, F46, GllO, G124, G126, G15, G22, G36, G43, G52, G70, 1107, 1153, 1194, 149, 15, 160, 189, K3 , K97, L105, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L6, L68, L78, L82, L84, L86, Ml, Mili, N59, N69, N94, P104, P146, P148, P18, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, Q40, Q41, R101, R102, R27, R33, R4 , R56, R67, Sil, S112, S121, S54, 872, 876, T103, T116, T120, T127, T128, T13 , T25, T35, T57, T58, T64 , T80, T96, V113, V115, V118, V125, V17, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, 34, Y129, Y73 y Y99. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en la perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural está entre aproximadamente 1.2 y aproximadamente 2. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de C7, DIO, L12, G15, P18, V19, G22, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, G36, Q40, Q41, L42, G43, A44, D45, F46, E47, 149, E51, L53 , S54, A55, T57, D61, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, A71, S72, Y73, S76, L78, A79, T80, L82, P83, D85, L86, D95, K97, R101, T103, P104, L105, D106, 1107, L109, Mili, V113, Q117, V118, S121, G124, V125, G126, T127, P148, F150, 1153, F154, F196, G190, E198, A199, R202, D203, V206, A209, E210, Q211 y V212. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural está entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2.5. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A44, C7, DIO, D85, D95, E26, E47, 1107, L12, L42, P104, P148, S54, Q40, Q117, Q203, V206, E210. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural está entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 3. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A44, C7, 1107, K97, L12, L78, P104, Q40 y V125. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural está entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 5. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en .una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de DIO, D85, L53, L78 y S54. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.1 o menos. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, 14, S149, W16 y 34. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.2 o menos . En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N9 , P83, R102, R , R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14 , 149, 16, W34, A108, A23, A55, D62 , F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4 , R56, S112, S54, T127, T13 , T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, 34, Y129 y Y73. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.3 o menos . En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6 , L86, N94, P83, R102, R4 , R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, 14, 149, W16, 34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4 , R56, S112, S54; T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, 34, Y129, Y73 , A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, 14, W149, W16, W34 y Y129. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.4 o menos. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, 14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, 34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, 34, Y129, A55, C77, E51, FlOO, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19 y V87. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.5 o menos. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, 149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, RS6, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, 149, 16, W34, Y129, A55, C77, E51, FlOO, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56,S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T2S, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, DIO, D23, E26, E50, E51, F150, GllO, G126, G15, G36, 1107, 149, 15, K97, L109 ,L119, L12, L38, L6, L68, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4 , R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34 e Y129. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.6 o menos. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de. aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, 149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, RS6, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, W16, 34, Y129, A55, C77, E51, FlOO, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56,S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T2S, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, DIO, D23, E26, E50, E51, F150, GllO, G126, G15, G36, 1107, 149, 15, K97, L109 ,L119, L12, L38, L6, L68, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, 34 e Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, G126, G36, G52, 1107, 15, 189, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, 149 y Y73. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.7 o menos." En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, 16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, 16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4 , RS6, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, 14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, F100, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56,S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T2S, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, DIO, D23, E26, E50, E51, F150, GllO, G126, G15, G36, 1107, 149, 15, K97, L109 ,L119, L12, L38, L6, L68, L84, L86,. Mili, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34 y Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, gl26, G36, G52, 1107, 15, 189, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, W149, Y73, A122, A23, A29, A71, A79, C7, D61, D62, D85, E26, E51, FlOO, F28, F46, GllO, G126, G52, G70, 1107, 149, 15, 160, 189, L109, L114, L12, L38, L68, L82, L86, Mili, N59, N94, P83, R102, R33, R4, 8112, S72, S76, T103, T116, T128, T25, T35, T57, T58, T64, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73 e Y99. En modalidades adicionales, la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.8 o menos. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por " lo menos una sustitución sé selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F15O:,"" -F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53;""L6, ' L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, ~T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, 34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, RS6, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, 14, 149, 16, W34, Y129, A55, C77, E51, FlOO, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56,S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T2S, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, DIO, D23, E26, E50, E51, F150, GllO, G126, G15, G36, 1107, 149, 15, K97, L109 ,L119, L12, L38, L6, L68, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34 y Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, gl26, G36, G52, 1107, 15, 189, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, W149, Y73, A122, A23, A29, A71, A79, C7, D61, D62, D85, E26, E51, FlOO, F28, F46, GllO, G126, G52, G70, 1107, 149, 15, J6-0, 189, L109, L114, L12, L38, L68, L82, L86, Mili, N59, N94, P83, R102, R33, R4, 8112, S72, S76, T103, T116, T128, T25, T35, T57, T58, T64, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73, Y99, A108, A122, A29, A55, C77, DIO, D106, D45, D61, D62, D65, D85, E47, E50, FlOO, F150, F28, F46, GllO, G124, G126, G15, G36, 1153, 1194, 15, 160, 189, K3, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L42, L68, L84, L86, Ml, N59, P24, P30, P38, R101, R27, R4, R56, S112, S54, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T35, T64, V113, V17, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73 y Y99. La presente invención también proporciona variantes de perhidrolasa, en donde las variantes de perhidrolasa presentan una actividad de perhidrólisis mayor y una actividad de hidrólisis de perácido disminuida en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante presentan una proporción de actividad de perhidrólisis de por lo menos aproximadamente 1.2 y una proporción de actividad de de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.8 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural. En modalidades alternativas, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A29, A44, A55, A71, A79, Cl , DIO, D106, D31, D85, E26, E47, F150, F154-, F196, F28, G124, G126, G36, G43, 1153, L109, L42, L53, L109, L42, L53, L109, L42, L53, L68, L82, L86, Mili, N69, P104, P148, P18, P63, P66, P83, Q117, Q40, R101, R67, S54, S121, S72, S76, T25, T64, V115 y V19. En modalidades adicionales, la perhidrolasa presenta una proporción de actividad de perhidrólisis de por lo menos aproximadamente 1.2, una proporción de actividad de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.8 o menos y una proporción de concentración de proteina de por lo menos 0.5, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A29, A44, A55, A71, A79, C7, D85, E26, E47, E51, F150, F154, F196, F28, G124, G126, G36, 1153, L109, L12, L53, L68, L82, Mili, N69, P104, P148, P18, P63, P66, P83, Q117, Q40, R101, R67, S121, S54, S72, S76, T25, T64, V125 y V19. La presente invención proporciona variantes de perhidrolasas que presentan un incremento en la expresión de las variantes de perhidrolasa, en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades, la perhidrolasa variante comprende por lo menos una modificación que comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A2, 15, C7, F8, Sil, L12, T13, 14, W16, V17, P18, V19, E20, 022, A23, P24, T25, A29, P30, V32, T35, G36, V37, A39, F46, E47, S54, A55, R56, T58, 160, D61, D62, P63, T64, P66, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, L74, P75, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, L86, 189, T93, T96, K97, A98, Y99, FlOO, R101, R102, T103, P104, L105, D106, 1107, A108, L109, GllO, S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P130, P132, K133, L135, V136, S138, P141, L142, A143, M145, H147, W149, F150, Q151, 1153, G157, Q159, T161, T162, L164, A165, R166, V167, Y168, A170, L171, A172, M175, K176, P178, A182, G183, S184, V185, 1186, T188, 1194, F196, V191, N201, L208, A209, Q211, Q213, S214, L215 y L216. La presente invención también proporciona proteínas aisladas que comprenden homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis, en donde los homólogos son proteínas dentro de la familia de proteínas de SGNH-hidrolasa. En modalidades preferidas alternativas, las proteínas aisladas tienen por lo menos aproximadamente 35% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la perhidrolasa de M. smegmatis, en la cual la proteína comprende por lo menos tres residuos que se seleccionan del grupo que consiste de L6, 14, 34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, GllO, L114, L135, F180, G205, Sil, D192 y H195. En modalidades adicionales, la perhidrolasa es por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% homologa a la perhidrolasa de M. smegmatis . En modalidades preferidas adicionales, la perhidrolasa comprende la secuencia de aminoácidos que se estable en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 2. La presente invención también proporciona proteínas aisladas que tienen por lo menos aproximadamente 38% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la perhidrolasa de M. smegmatis, en donde la proteína presenta actividad de perhhidrólisis . En modalidades adicionales, la perhidrolasa es por lo menos aproximadamente 40%/ 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% homologa a la perhidrolasa de M. smegma tis . En modalidades preferidas adicionales la perhidrolasa comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. La presente invención también proporciona homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis, en donde los homólogos son perhidrolasa que comprenden por lo menos un motivo que se selecciona del grupo que consisten de GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT. En modalidades preferidas, los homólogos presentan perhidrólisis. En algunas modalidades particularmente preferidas, los homólogos presentan una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 1. En modalidades adicionales, los homólogos dan reacción cruzada inmunológica con los anticuerpos generados contra la perhidrolasa de M. smegmatis. En modalidades adicionales, los anticuerpos generados contra el homólogo dan reacción cruzada con perhidrolasa de M. smegmatis. La presente invención también proporciona proteínas aisladas que tienen por lo menos aproximadamente 35% de identidad con la secuencia de aminoácidos de por lo menos un homólogo de perhidrolasa de M. smegmatis, en donde las proteínas presentan actividad de perhidrólisis. En algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona proteínas que tienen actividad de perhidrolasa, en donde las proteínas están en forma de un multímero en solución. En algunas modalidades más preferidas, la proteína es una perhidrolasa que comprende un dímero. En modalidades particularmente preferidas alternativas, la proteína es una perhidrolasa que comprende un octámero. En modalidades adicionales, la p oteína está en forma de un multímero en solución y la proteína se selecciona del grupo que consiste de perhidrolasa de M. smegmatis, homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis y variantes de perhidrolasa de M. smegmatis. En modalidades adicionales, la proteína se selecciona del grupo que consiste de serina hidrolasas modificadas y cisteína hidrolasas modificadas, en donde las serina hidrolasas modificadas o las cisteína hidrolasas modificadas comprenden actividad aumentada de perhidrolasa en comparación con las serina hidrolasas no modificadas o las cisteína hidrolasas no modificadas. La presente invención también proporciona proteínas que tienen actividad de perhidrolasa, en donde la proteína comprende por lo menos un motivo que se selecciona del grupo que consiste de GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT. En algunas modalidades, la proteína se obtiene de un miembro de Rhizobiales . En algunas modalidades preferidas, la proteína se obtiene de un miembro del género Mycoba cterium. La presente invención también proporciona genes aislados identificados utilizando por lo menos un cebador que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 21-69. La presente invención también proporciona métodos para identiricar una perhidrolasa, que comprende las etapas de: identificar una fuente de la perhidrolasa; analizar la fuente para identificar secuencias que comprenden por lo menos un motivo que se selecciona del grupo que consiste de GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT; expresar las secuencias identificadas en la etapa b) para producir la perhidrolasa; y probar la perhidrolasa para determinar actividad de perhidrólisis . En algunas modalidades, la etapa de análisis es una etapa de amplificación en donde las secuencias de cebador establecidas en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 21-69 se utilizan para amplificar las secuencias que comprenden por lo menos un motivo que se selecciona del grupo que consiste de GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT. En modalidades adicionales, la fuente se selecciona del grupo que consiste de fuentes ambientales y fuentes metagenómicas . La presente invención también proporciona proteínas identificadas utilizando los métodos que se establecen en la presente . La presente invención proporciona además secuencias aisladas de ácido nucleico que codifican para las proteínas identificadas utilizando los métodos que se establecen en la presente . En algunas modalidades particularmente preferidas, las proteínas presentan una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 1. En modalidades adicionales, las proteínas presentan una actividad de perhidrólisis que es por lo menos aproximadamente 0.2, en comparación con la actividad de perhidrólisis presentada por la perhidrolasa de M. smegmatis. En modalidades adicionales, las proteínas comprenden por lo menos tres residuos que se seleccionan del grupo que consiste de L6, 14 , 34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, GllO, L114, L135," F180, G205, Sil, D192 y D195. En modalidades adicionales, la etapa de análisis comprende buscar por lo menos una base de datos de aminoácidos. En modalidades adicionales, la etapa de análisis comprende buscar por lo menos una base de datos de ácido nucleico para identificar las secuencias de ácido nucleico que codifican para las secuencias de aminoácidos de la perhidrolasa. En modalidades adicionales, la fuente se selecciona del grupo que consiste de fuentes ambientales y fuentes metagenómicas . La presente invención proporciona además secuencias aisladas de ácido nucleico que codifican para las proteínas identificadas utilizando los métodos que se establecen en la presente . En algunas modalidades particularmente preferidas, las proteínas presentan una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 1. En modalidades adicionales, las proteínas presentan una actividad de perhidrólisis que es por lo menos aproximadamente 0.2 en comparación con la actividad de perhidrólisis presentada por la perhidrolasa de M. smegmatis.
En modalidades adicionales, las proteínas comprenden por lo menos tres residuos que se seleccionan del grupo que consiste de L6, W14, 34, L38, R56, D6~2, L74, L78, H81, P83, M90, K97, GllO, L114, L135, F180, G205, Sil, D192 y D195, como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. La presente invención también proporciona perhidrolasas variantes que tienen especificidades de sustrato alteradas en comparación con perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas modalidades, las perhidrolasas variantes tienen una actividad alterada para caproato de nitrofenilo (PNC, por sus siglas en inglés) en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. La presente invención también proporciona perhidrolasas variantes que tienen valores de pl alterados, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas modalidades, las perhidrolasas variantes comprenden por lo menos una mutación cargada positivamente, mientras que en modalidades alternativas, las perhidrolasas variantes comprenden por lo menos una mutación cargada negativamente. La presente invención también proporciona perhidrolasas variantes que tienen estabilidad aumentada, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas modalidades preferidas, la estabilidad de la perhidrolasa variante se selecciona del grupo que consiste de termoestabilidad, estabilidad enzimática y estabilidad química. La presente invención también proporciona perhidrolasas variantes en donde la perhidrolasa variante presenta por lo menos una propiedad de superficie alterada. En algunas modalidades preferidas, las variantes comprenden por lo menos una mutación que comprende por lo menos una sustitución en sitios que se seleccionan del grupo que consiste de los residuos que se establecen en la tabla 15.1 La presente invención también proporciona variantes de perhidrolasa que. tienen por lo menos una propiedad mejorada en comparación con la perhidrolasa natural. La presente invención también proporciona vectores de expresión que comprenden una secuencia polinucleotídica que codifica para por lo menos una variante de perhidrolasa. La presente invención proporciona además células hospedadoras que comprenden por lo menos uno de tales vectores de expresión. En algunas modalidades preferidas, se selecciona una célula hospedadora del grupo que consiste del género Bacillus, género Streptomyces , género Escherichia y género Pantoea . La presente invención también proporciona perhidrolasas producidas por las células hospedadoras . La presente invención también proporciona composiciones que comprenden por lo menos una porción de por lo menos una perhidrolasa. En algunas modalidades, la perhidrolasa comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En modalidades adicionales, la perhidrolasa es codificada por una secuencia polinucleotídica que comprende la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. En modalidades adicionales, la secuencia comprende por lo menos una porción de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona vectores de expresión que comprenden la secuencia polinucleotídica que codifica para por lo menos una porción de por lo menos una perhidrolasa. La presente invención también proporciona hospedadores que comprenden por lo menos un vector de expresión. En algunas modalidades, las células hospedadoras se seleccionan del grupo que consiste del género Bacillus, género Streptomyces , género Escherichia y género Pantoea . La presente invención también proporciona perhidrolasas producidas por estas células hospedadoras . La presente invención también proporciona perhidrolasa variantes, en donde las perhidrolasa comprenden por lo menos una sustitución que corresponde a las posiciones de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, y en donde la perhidrolasa variante tiene un mejor desempeño en por lo menos una propiedad, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. La presente invención proporciona además polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia nucleotídica: (i) que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, o (ii) que son capaces de hibridizar con una sonda derivada de una secuencia nucleotídica que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, bajo condiciones de rigurosidad intermedia a elevada, o (iii) que son complementarias a la secuencia nucleotidica que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. En algunas modalidades, la presente invención también proporciona vectores que comprenden estas secuencias polinucleotídicas . En modalidades adicionales, la presente invención proporciona hospedadores que comprenden por lo menos un vector de expresión. "En algunas modalidades, las células hospedadoras se seleccionan del grupo que consiste del genero Bacillus, género Streptomyces, género Escherichia y género Pantoea . La presente invención también proporciona perhidrolasas producidas por estas células hospedadoras . La presente invención también proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia complementaria a por lo menos una porción de la secuencia que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. La presente invención también proporciona métodos para producir enzimas que tienen actividad de perhidrolasa, que comprenden: transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que tienen por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1; cultivar la célula hospedadora transformada bajo condiciones adecuadas para que la célula hospedadora produzca la perhidrolasa y recuperar la perhidrolasa. En algunas modalidades preferidas, la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste de las especies Streptomyces, Pantoea, Escherichia y Bacillus. La presente invención también proporciona sondas que comprenden una secuencia de 4 a 150 polinucleótidos sustancialmente idéntica a un fragmento correspondiente de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, en donde las sondas se utilizan para detectar una secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima que tiene acitividad de perhidrolasa. La presente invención también proporciona composiciones limpiadoras que comprenden: a) por lo menos 0.0001 por ciento en peso de perhidrolasa que presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1; b) una molécula que comprende una porción éster; y c) opcionalmente un ingrediente adyuvante . La presente invención proporciona además composiciones limpiadoras que comprenden: a) por lo menos 0.0001 por ciento en peso de una perhidrolasa que presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1; b) un material que se selecciona del grupo que consiste de una fuente de peroxígeno, peróxido de hidrógeno y mezclas de los mismos, la fuente de peroxígeno se selecciona del grupo que consiste de: una persal; un peroxiácido orgánico; un peróxido de hidrógeno y urea; un carbohidrato y una mezcla de carbohidrato oxidasa, y mezclas de los mismos; c) de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50% en peso de una molécula que comprende una porción éster; y d) opcionalmente un ingrediente adyuvante . La presente invención también proporciona composiciones limpiadoras que comprenden: a) de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 1 por ciento en peso de una perhidrolasa varianter que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos una modificación de un aminoácido realizada en una posición equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; b) un material que se selecciona del grupo que consiste de una fuente de peroxígeno, peróxido de hidrógeno y mezclas de los mismos, la fuente de peroxígeno se selecciona del grupo que consiste de: una persal, un peroxiácido orgánico; peróxido de hidrógeno y urea; una mezcla de carbohidrato y carbohidrato oxidasa; y mezclas de los mismos; c) de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50% en peso de una molécula que comprende una porción éster; y d) opcionalmente, un ingrediente adyuvante. En algunas modalidades preferidas, las composiciones limpiadoras compreden además por lo menos un ingrediente adyuvante . En algunas modalidades particularmente preferidas, el ingrediente adyuvante se selecciona del grupo que consiste de tensioactivos, mej oradores de detergencia, agentes quelantes, agentes inhibidores de transferencia de tinte, auxiliares de deposición, enzimas dispersantes. y estabilizantes de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueador, refuerzos de blanqueador, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de eliminación/antirredeposición de mugre de acrilla, abrillantadores, supresores de lodos, tintes, perfumes, agentes elastificantes de estructura, suavizantes de telas, portadores, hidrotopos, auxiliares de procesamiento, pigmentos y mezclas de los mismos. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona composiciones limpiadoras en donde: la perhidrolasa presenta una proporción molar de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 0.1; la persal se selecciona del grupo que consiste de perborato de metal alcalino, percarbonato de metal alcalino, perfosfatos de metal alcalino, persulfatos de metal alcalino y mezclas de los mismos; y el carbohidrato se selecciona del grupo que consiste de monocarbohidratos, dicarbohidratos, tricarbohidratos y oligocarbohidratos y mezclas de los mismos; la carbohidrato oxidasa se selecciona del grupo que consiste de aldosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.9), galactosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.9), celobiosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.25), piranosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.10), sorbosa oxidada (IUPAC clasificación EC1.1.3.11) hexosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.5), glucosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.4) y mezclas de los mismos, y la molécula comprende una porción éster que tiene la fórmula: R1O?[ )R2)jR3) p (i) en donde R1 es una porción que se selecciona del grupo que consiste de H, las formas sustituida o no sustituida de alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; (ii) cada R2 es una porción alcoxilato; (iii) R3 es una porción formadora de éster que tiene la fórmula: R4C0- en donde R4 es H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; (iv) x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un número entero que es igual o menor que el número de carbonos en R1; (v) p es un número entero que es igual o menor que x; (vi) m es un número entero de 0 a 50; y (vii) n es por lo menos 1. En modalidades alternativas, la presente invención proporciona composiciones limpiadoras en donde: a) R1 es una porción alquilo o heteroalquilo sustituida o no sustituida de 2 a 32 átomos de carbono; b) cada R2 es independientemente una porción etoxilato propoxilato; y e) m es un número entero de 1 a 12. En algunas modalidades, R3 es una porción formadora de éster que tiene la fórmula: R4C0- en donde R4 es: a) una porción alquilo, alquenilo o alquinilo sustituida o no sustituida que comprende de 1 a 22 átomos de carbono; o b) una porción arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo sustituida o no sustituida que comprende de 4 a 22 átomos de carbono. En modalidades adicionales de las composiciones limpiadoras, la molécula que comprende la porción éster tiene la fórmula: en donde a) R1 es H o una porción que comprende una porción amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria, la porción R1 que comprende una porción amina se selecciona del grupo que consiste de las formas sustituida o no sustituida de alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; b) cada R2 es una porción alcoxilato; c) R3 es una porción formadora de éster que tiene la fórmula R4CO- en donde R4 puede ser H, la forma sustituida o no sustituida de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; d) x es 1 cuando R1 es H, cuando R1 no es H, x es un número entero que es igual o menor que el número de carbonos en R1; e) p es un número entero que es igual o menor que x; f) m es un número entero de 0 a 12; y g) n es por lo menos 1. En modalidades adicionales de las presentes composiciones limpiadoras, la molécula comprende una porción éster que tiene un peso promedio de peso molecular menor de 600,000 Daltons. En modalidades adicionales, se selecciona un ingrediente adyuvante del grupo que consiste de tensioactivos, mej oradores de detergencia, agentes quelantes, agentes que inhiben la transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas y estabilizantes de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueador, refuerzos de blanqueador, perácidos preformados, agentes de eliminación/antirredeposición de mugre de arcilla, abrillantadores, supresores de lodo, tintes, perfumes, agentes elastificantes de estructura, suavizantes de tela, portadores, hidrotopos, auxiliares de procesamiento, pigmentos y mezclas de los mismos . La presente invención proporciona además métodos de limpieza que comprenden las etapas de: a) poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende una tela con cualquiera de las composiciones limpiadoras proporcionadas antes y/o una composición que comprende cualquiera de las composiciones limpiadoras proporcionadas en lo anterior; y b) opcionalmente lavar y/o enjuagar la superficie o material. En modalidades alternativas, la presente invención proporciona métodos de limpieza, el método comprende las etapas de : a) poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende una tela con cualquier composición limpiadora adecuada proporcionada en lo anterior y/o una composición que comprende cualquier limpiador adecuado proporcionado en lo anterior; y b) opcionalmente lavar y/o enjuagar la superficie del material. La presente invención también proporciona composiciones limpiadoras que comprenden por lo menos una perhidrolasa. En algunas modalidades particularmente preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras compreden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas . La presente invención también proporciona composiciones blanqueadoras que comprenden por lo menos una variante de perhidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos una modificación de un aminoácido realizada en una posición equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En algunas modalidades particularmente preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras comprenden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas. La presente invención también proporciona composiciones blanqueadoras que comprenden por lo menos una variante de perhidrolasa que tiene por lo menos una propiedad mejorada en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades particularmente preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras comprenden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas . La presente invención también proporciona composiciones blanqueadoras que comprenden por lo menos una variante de perhidrolasa que comprende por lo menos una sustitución que corresponde a las posiciones de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y en donde la perhidrolasa variante tiene un funcionamiento mejor, en por lo menos una propiedad, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas modalidades particularmente preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras comprenden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas. La presente invención también proporciona composiciones blanqueadoras que comprenden por lo menos una perhidrolasa que es por lo menos aproximadamente 35% homologa a la perhidrolasa de M. smegmatis. En algunas modalidades particularmente preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1.
En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras comprenden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas. La presente invención también proporciona composiciones desinfectantes que comprenden por lo menos una perhidrolasa. En algunas modalidades particularmente preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras comprenden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas. La presente invención también proporciona composiciones desinfectantes que comprenden por lo menos una variante de perhidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos una modificación de un aminoácido realizada en una posición equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En algunas modalidades particulares preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras comprenden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas. La presente invención también proporciona composiciones desinfectantes que comprenden por lo menos una variante de perhidrolasa que tiene por lo menos una propiedad mejorada en comparación con la perhidrolasa natural. En algunas modalidades particularmente preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras comprenden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas . La presente invención también proporciona composiciones desinfectantes que comprenden por lo menos una variante de perhidrolasa que comprende por lo menos una sustitución que corresponda a las posiciones de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y en donde la perhidrolasa variante tiene un mejor desempeño en por lo menos una propiedad, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En algunas modalidades particularmente preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1. En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras comprenden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas. La presente invención también proporciona composiciones desinfectantes que comprenden por lo menos una perhidrolasa que es por lo menos aproximadamente 35% homologa a perhidrolasa de M. smegmatis. En algunas modalidades particularmente preferidas, la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor que 1. En algunas modalidades, las composiciones blanqueadoras comprenden además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa es por lo menos aproximadamente 70% homologa a perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En algunas modalidades, la presente invención proporciona perhidrolasa que dan reacción cruzada con anticuerpos generados contra perhidrolasa de M. smegmatis, particularmente que comprenden la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona perhidrolasa que son homólogos estructurales de la perhidrolasa de M. smegmatis en las cuales el sitio activo comprende sitios homólogos para Sil, D192 y H195 de la perhidrolasa de M. smegmatis. En modalidades adicionales, la presente invención proporcionan perhidrolasas que comprenden una o más modificaciones de los siguientes residuos: Cys7, AsplO, Serll, Leul2, Thr13 , Trpl , Trpl6, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Vall25, Prol38, Leul40, Prol46, Prol48, Trpl49, Phel50, Ilel53, Phel54, Thrl59, Thrl86, Ilel92, Ilel94 y Phel96. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a perhidrolasas con estas modificaciones únicamente en estos residuos, dado que también encuentran uso en la presente invención perhidrolasas con otras modificaciones . En algunas modalidades, por lo menos una perhidrolasa de la presente invención se utilizan en un procedimiento de limpieza en donde un artículo que va a ser limpiado se expone a una cantidad suficiente de por lo menos una perhidrolasa bajo condiciones tales que la perhidrolasa limpia y/o blanquea y/o decolora cualquier/todas las manchas presentes en el artículo (por ejemplo detergentes para lavandería y para trastes) . En algunas modalidades, el limpiador comprende además un desinfectante . En algunas modalidades, el artículo limpiado, - blanqueado y/o desinfectado utilizando por lo menos un perhidrolasa de la presente invención comprende materiales textiles y/o superficies duras, mientras que en otras modalidades el artículo es papel o pulpa y en modalidades adicionales se utiliza por lo menos una perhidrolasa como un producto para el cuidado personal para volver blanco o blanquear pelo, dientes, piel, etcétera. Así, en algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones para uso en diversas aplicaciones limpiadoras, blanqueadoras y/o desinfectantes. En realidad, no se pretende que la presente' invención esté limitada a una aplicación particular. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa comprende la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. En algunas modalidades preferidas alternativas, la perhidrolasa es codificada por la secuencia de ácido nucleico que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. En algunas modalidades, la presente invención proporciona enzimas con actividad que resultan en proporciones elevadas de perácido/ácido. En modalidades alternativas, la presente invención proporciona la perhidrolasa de Mycobacterium smegmatis, así como la secuencia y/u homólogos estructurales de esta proteína. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona enzimas que se han modificado de manera que expresan actividad de perhidrolasa con una proporción elevada de perhidrólisis a hidrólisis ya sea además de o en vez de la actividad original de la enzima. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona enzimas modificadas con especificidad de sustrato, Km, cat, actividad de perhidrolasa y/o actividad de degradación de perácido, alteradas . En modalidades adicionales, la presente invención proporciona un medio para identificar, producir y caracterizar enzimas que comprenden la actividad de perhidrolasa de la presente invención. La presente invención proporciona además métodos y composiciones que comprenden por lo menos una perhidrolasa para limpieza, desinfección, blanqueado y otras aplicaciones, que incluyen pero que no se limitan a blanqueado de papel y pulpa, limpieza de telas y prendas de vestir, limpieza de superficies duras y aplicaciones para el cuidado personal (por ejemplo cuidado bucal, cuidado del pelo y cuidado de la pieal) . En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona métodos y composiciones para blanquear algodón y otras telas. En realidad, la presente invención encuentra uso en el blanqueado y limpieza de diversos productos textiles. No se pretende que la presente invención esté limitada a algún ajuste, aplicación o uso particulares y se contempla que encontrará uso en numerosas áreas en donde se desea la generación enzimática de perácidos con respecto al uso de perácidos preformados o peróxido de hidrógeno u otras sustancias químicas blanqueadoras, bajo condiciones que incluyen pero que no se limitan a una amplia gama de valores de pH y temperaturas . La presente invención también encuentra uso en aplicaciones en donde la hidrólisis de perácido es útil, por ejemplo en la limpieza con perácidos. Además, la presente invención proporciona un medio para producir enzimas perhidrolasas adecuadas para limpiar, desinfectar, blanquear y otras aplicaciones, que incluyen el cuidado personal .
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 proporciona un árbol filogenético de perhidrolasa de M. smegmatis y otras secuencias relacionadas. La figura 2 proporciona una vista general del árbol filogenético, que muestra las ramas principales de las bacterias y el origen de los clones/secuencias activas en comparación con M. smegmatis . La figura 3 proporciona un esquema de cuatro familias estructurales de serina hidrolasas que incluyen perhidrolasa (familia de SGNH-hidrolasa) , quimiotripsina, subtilisina y o?/ß hidrolasa.
La figura 4 proporciona un diagrama de la estructura del pliegue de perhidrolasa. La figura 5 proporciona un mapa del plásmido pET26-M4aEll. La figura 6 proporciona una tabla de purificación que muestra la actividad de la enzima, de la enzima de la presente invención a través de diversas etapas en el procedimiento de purificación. La figura 7 proporciona una gráfica la cual muestra la proporción de ácido perbutírico a ácido butírico generada por diversas enzimas a partir de tributirina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM en 40 minutos. La figura 8 proporciona una gráfica que muestra la producción de perácido por equivalentes de acetato 30 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM, probados a diversos valores de pH. Estos resultados muestran que utilizando la composición de perhidrolasa de la presente invención, existe una generación de perácido sobre un intervalo de pH amplio. En contraste, con TAED y peróxido de hidrógeno, la generación de perácido se limita a condiciones alcalinas. La figura 9 proporciona una gráfica que muestra la producción de perácido por la enzima perhidrolasa 0.1 ppm en acetato de etilo 30 mM y peróxido de hidrógeno 20 mM a diversas temperaturas . Estos resultados muestran que la perhidrolasa de la presente invención funciona en un intervalo amplio de temperatura, que incluye bajas temperaturas . La figura 10 proporciona una gráfica que muestra la proporción de ácido perbutírico a ácido butírico generada por diversas enzimas a partir de tributirina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM a los 4, 10 y 30 minutos. La figura 11 proporciona una gráfica que muestra la proporción de ácido peracético a ácido acético generada por diversas enzimas a partir de triacetina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM a los 4 y 10 minutos. La figura 12 proporciona un mapa del plásmido pMSATNcoI . La figura 13 proporciona un mapa del plásmido pMSATNcol-1. La figura 14 proporciona un mapa del plásmido pAH505. La figura 15 proporciona un mapa del plásmido pSFNASally La figura 16 proporciona un mapa del plásmido Pcp606. La figura 17 proporciona un mapa del plásmido Pcp649. La figura 18 proporciona un mapa del plásmido pSECGT-MSAT. La figura 19 proporciona un mapa del plásmido pSEGT-phdA4. La figura 20 proporciona un mapa del plásmido pMC355rbs. La figura 21 proporciona una gráifica que muestra el grado de blanqueado por tres detergentes probados solos y en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis de la presente invención. La figura 22 proporciona una gráfica que muestra la capacidad blanqueadora de la perhidrolasa de M. smegmatis probada en algodón. La figura 23 proporciona una gráfica que muestra la capacidad blanqueadora de la perhidrolasa de M. smegmatis probada en lino .
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones que comprenden por lo menos una enzima perhidrolasa para limpieza y otras aplicaciones . En algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona métodos y composiciones para generación de perácidos. En particular, la presente invención proporciona métodos y composiciones mejorados que comprende enzimas de perhidrólisis con proporciones elevadas de perácido/ácido para limpieza, blanqueado, desinfección y otras aplicaciones. En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona métodos y composiciones para la generación de perácidos . La presente invención encuentra uso particular en aplicaciones que involucran limpieza, blanqueado y desinfección. A menos que se indique de otra manera, la práctica de la presente invención involucra técnicas convencionales utilizadas habitualmente en biología molecular, microbiología, purificación de proteínas, ingeniería de proteínas, secuenciado de proteínas y ADN así como los campos de ADN recombinante, los cuales están dentro de las habilidades de la técnica. Tales técnicas son conocidas por los expertos en la técnica y se describen en numerosos textos y trabajos de referencia (véase, por ejemplo, Sambrook et al . , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda edición (Cold Spring Harbor),
[1989]); y Ausubel et al . , "Current Protocols in Molecular Biology"
[1987] ) . Todas las patentes, solicitudes de patentes, artículos y publicaciones mencionados en la presente, tanto en lo anterior como en lo que sigue, se incorporan de manera expresa en la presente como referencia. Además, los encabezados que se proporcionan en la presente no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la invención los cuales pueden considerarse como referencia a la especifición en su totalidad. En consecuencia, los términos que se definen inmediatamente en lo siguiente se definen de una manera más completa con referencia a la especificación en su totalidad. No obstante, con el fin de facilitar la comprensión de la invención, se definen a continuación numerosos términos .
Definiciones A menos que se defina de otra manera en la presente, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen los mismos significados a los entendidos comúnmente por aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Por ejemplo, Singleton y Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Segunda Edición., John wiley y Sons, NY (1994); y Hale y Marham, The harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a los expertos en la técnica diccionarios generales de muchos de los términos utilizados en la invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente encuentran uso en la práctica de la presente invención, se describen en la presente los métodos y materiales preferidos. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente en lo siguiente se describen de manera más completa con referencia a la especificación en su totalidad. Además, como se utiliza en la presente, los términos en sigular "uno", "un" y "el" incluyen una referencia a las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente en otro sentido. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben en una orientación de izquierda a derecha de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izuierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, y que estos pueden variar dependiendo del contexto en que se utilizan por aquellos expertos en la técnica. Se pretende que cada limitación numérica máxima proporcionada a través de esta especificación incluya una limitación numérica menor, por ejemplo si tales limitaciones numéricas menores están escritas de manera expresa en la presente . Cada limitación numérica mínima proporcionada a través de esta especificación incluirá a cada limitación numérica superior, como si tales limitaciones numéricas superiores se escribirán de manera expresa en la presente . Cada intervalo numérico proporcionado a través de esta especificación incluirá a cada intervalo numérico más estrecho que se encuentra del intervalo numérico más amplio, como si tales intervalos numéricos más estrechos estuvieran todos escritos expresamente en este documento. Como se utiliza en la presente, el término "blanqueador" se refiere al tratamiento de un material (por ejemplo tela, material de lavandería, pulpa, etcétera) o una superficie por un período de tiempo suficiente y bajo condiciones .apropiadas de pH y temperatura para llevar a cabo el abrillantamiento (por ejemplo blanqueado) y/o limpieza del material. Los ejemplos de sustancias químicas adecuadas para blanqueado incluyen, pero no se limitan a C102, H202, perácidos, N02, etcétera. Como se utiliza en la presente, el término "desinfectar" se refiere a la separación de contaminantes de las superficies así como la inhibición o destrucción de microbios sobre las superficies de los artículos . No se pretende que la presente invención esté limitada a alguna superficie, artículo o contaminante, o microbios particulares que deban eliminarse . Como se utiliza en la presente, el término "perhidrolasa" se refiere a una enzima que es capaz de catalizar una reacción que resulta en la formación de cantidades suficientemente elevadas de perácido adecuadas para aplicaciones tales como limpieza, blanqueado y desinfección. En modalidades particularmente preferidas, las enzimas perhidrolasa de la presente invención producen proporciones muy elevadas de perhidrólisis a hidrólisis. Las proporciones elevadas de perhidrólisis a hidrólisis de estas enzimas distintas vuelve a las enzimas adecuadas para uso en una amplia variedad de aplicaciones. En modalidades preferidas adicionales, las perhidrolasas de la presente invención están caracterizadas por tener una estructura terciaria y secuencia primaria distintas . En modalidades particularmente preferidas, las perhidrolasas de la presente invención comprenden estructuras primarias y terciarias distintas. En algunas modalidades particularmente preferidas, las perhidrolasa de la presente invención comprenden estructura cuaternaria distinta. En algunas modalidades preferidas, la perhidrolasa de la presente invención es la perhidrolasa de M. smegmatis mientras que en modalidades alternativas, la perhidrolasa es una variante de esta perhidrolasa mientras que en modalidades adicionales, la perhidrolasa es un homólogo de esta perhidrolasa. En modalidades preferidas adicionales, una perhidrolasa monomérica es alterada para producir una enzima multimérica que tiene una mejor actividad de perhidrolasa en comparación con el monómero. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a esta perhidrolasa específica de M. smegmatis, a variantes específicas de esta perhidrolasa ni a homólogos específicos de esta perhidrolasa. Como se utiliza en la presente, el término "multímero" se refiere a dos o más proteínas o péptidos que están asociados covale?te o no covalentemente que existen como un complejo en solución. Un "dímero" es un multímero que contiene dos proteínas o péptidos; un "trímero" contiene tres proteínas o péptidos, etcétera. Como se utiliza en la presente, "octámeros" se refiere a un multímero de ocho proteínas o péptidos . Como se utiliza en la presente, la frase "proporción perhidrólisis a hidrólisis" es la proporción de cantidad de perácido producido enzimáticamente respecto al ácido producido enzimáticamente por la perhidrolasa bajo condiciones definidas y dentro de un tiempo definido. En algunas modalidades preferidas, los ensayos que se proporcionan en la presente se utilizan para determinar las cantidades de perácido y ácido producidas por la enzima. Como se utiliza en la presente, los "productos para el cuidado personal" significan productos utilizados en la limpieza, blanqueado y/o desinfección del pelo, piel, cuero cabelludo y dientes, que incluyen pero que no se limitan a champús, lociones corporales, geles para baño, humectantes tópicos, pastas dentríficas y/u otros limpiadores tópicos. En algunas modalidades particularmente preferidas, estos productos se utilizan sobre los humanos mientras que en otras modalidades estos productos encuentran uso en animales diferentes a los humanos (por ejemplo en aplicaciones veterinarias) . De la manera en que se utiliza en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que las sustancias farmacéuticas, medicamentos y/o ingredientes inertes los cuales describe el término son adecuados para uso en contacto con los tejidos de humanos y otros animales sin una cantidad excesiva de toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, irritación, respuesta alérgica y similares, conmensurable con una proporción razonable de beneficio/riesgo . Como se utiliza en la presente, los términos "composiciones limpiadoras" y "formulaciones limpiadoras" se refieren a composiciones que encuentran uso en la separación de compuestos no deseados en los artículos que van a ser limpiados, tales como telas, vajillas, lentes de contaco y otros sustratos sólidos, pelo (champús) , piel (jabones y cremas) , dientes (enjuagues bucales, pastas dentríficas) , etcétera. El término abarca cualquier material/compuesto seleccionado para el tipo particular de composición limpiadora deseada y la forma del producto (por ejemplo líquido, gel, granulos o composición de aspersión) en la medida en que la composición sea compatible con la perhidrolasa y una o varias enzimas adicionales utilizadas en la composición. La selección específica de los materiales de la composición limpiadora se pueden realizar con facilidad al considerar la superficie, el artículo o la tela que va a ser blanqueada así como la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante su uso. Los términos se refieren adicionalmente a cualquier composición que sea adecuada para limpiar, blanquear, desinfectar y/o esterilizar cualquier objeto y/o superficie. Se pretende que los términos incluyen pero no se limiten a composiciones detergentes (por ejemplo detergentes de lavandería líquidos y/o sólidos así como detergentes para telas finas; formulaciones limpiadoras para superficies duras, tales como vidrio, madera, contratapas y ventanas cerámicos y de metal; limpiadores de alfombras; limpiadores de hornos, refrescantes para telas; suavizantes de telas y sustancias para colocar en manchas, textiles y de lavandería, así como detergentes para vajillas) . En realidad, el término "composición limpiadora", como se utiliza en la presente, incluye, a menos que se indique de otra manera, agentes granulares o en forma pulverizada para el lavado de propósito general o de uso pesado, especialmente detergentes limpiadores; agentes de lavado en líquido, gel o pasta de propósito general, especialmente los líquidos del tipo de los denominados uso pesado (HDL, por sus siglas en inglés) ; detergentes líquidos para telas finas; agentes para lavar vajillas manualmente o agentes para lavavaj illas de uso ligero, especialmente de aquellos del tipo de una alta producción de espuma; agentes para el lavado de vajillas a máquina que incluyen diversos tipos en forma de comprimidos, granulares, líquidos y auxiliares de enjuagado para uso casero e institucional; agentes líquidos limpiadores y desinfectantes que incluyen tipos de lavado manual antibacteriano, barras limpiadoras, enjuagues bucales, limpiadores de dentadura, champús para carro o alfombra, limpiadores de baño, champús para el pelo y enjuagues para el pelo; geles para bañarse y baños de espuma así como limpiadores metálicos e igualmente auxiliares limpiadores tales como aditivos para blanqueado y de los tipos de "eliminar manchas" o de tratamiento previo. Como se utiliza en la presente, los términos "composición detergente" y "formulación detergente" se utilizan con referencia a mezclas las cuales se pretende utilizar en un medio de lavado para la limpieza de objetos sucios. En algunas modalidades preferidas, el término se utiliza con referencia a el lavado de telas y/o prendas de vestir (por ejemplo "detergentes de lavandería") . En modalidades alternativas, el término se refiere a otros detergentes tales como aquellos utilizados para limpiar vajillas, cubiertos, etcétera, por ejemplo, detergentes de lavatrastes") . No se pretende que la presente invención esté limitada a una formulación o composición detergente particular. En realidad, se pretende que además de la perhidrolasa, el término abarque detergentes que contengan tensioactivos, transferasas, enzimas hidrolíticas, óxidorreductasas, mejoradores de detergencia, agentes blanqueadores, activadores de blanqueador, agentes azulantes y tintes fluorescentes, inhibidores de formación de torta, agentes enmascaradores, activadores de enzima, antioxidantes y solubilizantes. Como se utiliza en la presente, un "funcionamiento mejorado" en un detergente se define como una limpieza aumentada de manchas sensibles a blanqueador (por ejemplo pasto, té, vino, sangre, suciedad, etcétera) , determinado por evaluación habitual bajo un ciclo de lavado estándar. En modalidades particulares, la perhidrolasa de la presente invención proporciona un funcionamiento mejorado en la oxidación y eliminación de manchas y suciedad de colores. En modalidades adicionales, la perhidrolasa de la presente invención proporciona un funcionamiento mejorado en la eliminación y/o cambio de color de manchas . En modalidades adicionales, la perhidrolasa de la presente invención proporciona un funcionamiento mejorado en la eliminación de manchas y suciedad basada en lípidos . En modalidades adicionales, las perhidrolasas de la presente invención proporciona un funcionamiento mejorado para eliminar manchas y suciedad de trastos y otros artículos. Como se utiliza en la presente, el término "composición limpiadora de superficie dura" se refiere a composiciones detergentes para la limpieza de superficies duras, tales como pisos, paredes, tejas, accesorios de baño y cocina y similares. Tales composiciones se proporcionan en cualquier forma que incluyen pero que no se limitan a sólidos, líquidos, emulsiones, etcétera. Como se utiliza en la presente, una composición de "lavavaj illas" se refiere a todas las formas para composiciones para la limpieza de trastes o vajillas, que incluyen pero que no se limitan a las formas granular y líquida. Como se utiliza en la presente, una "composición limpiadora de telas" se refiere a todas las formas de composiciones detergentes para la limpieza de telas que incluye, pero que no se limita a las formas granular, líquida y en barra. Como se utiliza en la presente, el término "textil" se refiere a telas tejidas, así como fibras cortas y filamentos adecuados para conversión o para uso en telas de hilos, tejidas, tricotadas y telas no tejidas. El término abarca hilos elaborados de fibras naturales así como sintéticas (por ejemplo manufacturadas) . Como se utiliza en la presente, los "materiales textiles" es un término general para fibras, intermediarios de hilos, hilos, telas y productos elaborados de telas (por ejemplo prendas de vestir y otros artículos) . Como se utiliza en la presente, el término "tela" abarca cualquier material textil. Por lo tanto, se pretende que el término abarque prendas de vestir así como telas, hilos, fibras, materiales no tejidos, materiales naturales, materiales sintéticos y cualquier otro material textil. Como se utiliza en la presente, el término "compatible" significa que los materiales de la composición limpiadora no reduzcan la actividad enzimática de la perhidrolasa en un grado tal que la perhidrolasa no sea eficaz como se desea durante situaciones de uso normal . Los materiales de la composición limpiadora específica se ejemplifican con detalle en lo siguiente. Como se utiliza en la presente, el término "cantidad eficaz de enzima perhidrolasa" se refiere a la cantidad de enzima perhidrolasa necesaria para obtener la actividad enzimática requerida en la aplicación específica (por ejemplo, un cuidado para el producto personal, una composición limpiadora, etcétera) . Tales cantidades efectivas se determinan con facilidad por una persona habitualmente experta en la técnica y se basan en muchos factores, tales como la variante de enzima particular utilizada, la aplicación limpiadora, la composición específica de la composición limpiadora y si es líquida o seca (por ejemplo granular, en barra) de la composición que se requiere, y similares . Como se utiliza en la presente, las "composiciones limpiadoras que no son para telas" abarcan composiciones limpiadoras de superficie dura, composiciones para lavavaj illas, composiciones limpiadoras para el cuidado personal (por ejemplo composiciones limpiadoras bucales, composiciones limpiadoras de dentadura, composiciones limpiadoras personales, etcétera) , y composiciones adecuadas para uso en la industria de la pulpa y el papel . Como se utiliza en la presente, el término "composiciones limpiadoras orales" se refiere a dentrífieos, pastas dentales, geles dentales, polvos dentales, enjuagues bucales, aspersiones para la boca, geles para la boca, gomas masticables, grageas, saquitos, comprimidos, biogeles, pastas profilácticas, soluciones de tratamiento dental y similares. Las composiciones para el cuidado bucal que encuentran uso junto con las perhidrolasas de la presente invención son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,601,750, 6,379,653 y 5,989,526, la totalidad de las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Como se utiliza en la presente, las "composiciones de tratamiento de pulpa" se refiere al uso de las presentes enzimas perhidrolasa en composiciones adecuadas para uso en elaboración de papel. Se pretende que el término abarque composiciones adecuadas para el tratamiento de cualquier material de pulpa, que incluye madera así como materiales que no son de madera tales como "residuos agrícolas" y "cosechas de fibra", que incluyen pero que no se limitan a paja de trigo, paja de arroz, tallos de maíz, bagazo (caña de azúcar) , paja de pasto de centeno, paja de semilla de lino, paja de lino, kenaf, cáñamo industrial, henequén, paja plana textil, hesperaloe, etcétera. Por lo tanto, la presente invención también abarca el uso de perhidrolasa de la presente invención en métodos de tratamiento de pulpa. Como se utiliza en la presente, una "sustancia química oxidante" se refiere a una sustancia química que tiene la capacidad de blanquear pulpa o cualquier otro material . La sustancia química oxidante está presente en una cantidad, pH y temperatura adecuados para blanqueado. El término incluye pero no se limita a peróxido de hidrógeno y perácidos . Como se utiliza en la presente, el término "acilo" es el nombre general para grupos de ácido orgánico, los cuales son residuos de ácidos carboxílicos después de la separación del grupo -OH (por ejemplo, cloruro de etanoilo, CH3CO-CI es el cloruro de acilo formado a partir de ácido etanoico, CH3COO-H) . Los nombres de los grupos acilo individuales se forman al sustituir la terminación "-ico" del acilo por "-ilo" . Como se utiliza en la presente, el término "acilación" se refiere a una transformación química la cual sustituye el grupo asilo (RCO-) en una molécula, generalmente or un hidrógeno activo de un grupo -OH. Como se utiliza en la presente, el término "transferasa" se refiere a una enzima que cataliza la transferencia de compuestos funcionales a una gama de sustratos. Como se utiliza en la presente, un "grupo saliente" se refiere a un nucleófico el cual se separa de un donador de acilo por sustitución con otro nucleófilo. como se utiliza en la presente, el término "conversión enzimática" se refiere a la modificación de un sustrato a un intermediario o la modificación de un intermediario a un producto final al poner el contacto el sustrato o el intermediario con una enzima. En algunas modalidades, el contacto se realiza por exposición directamente del sustrato o intermediario con la enzima apropiada. En otras modalidades, el contacto comprende exponer el sustrato o intermedario con un organismo que expresa y/o excreta la enzima, y/o metaboliza el sustrato y/o intermediario deseado con el intermediario y/o producto final deseado, respectivamente. Como se utiliza en la presente, la frase "estabilidad detergente" se refiere a la estabilidad de una composición detergente. En algunas modalidades, la estabilidad se determina durante el uso del detergente mientras que en otras modalidades el término se refiere a la estabilidad de una composición detergente durante su almacenamiento. como se utiliza en la presente, la frase "estabilidad a proteólisis" se refiere a la capacidad de una proteína (por ejemplo una enzima) a resistir proteólisis. No se pretende que el término esté limitado al uso de una proteasa particular para determinar la estabilidad de una proteína. Como se utiliza en la presente, el término "estabilidad oxidativa" se refire a la capacidad de una proteína para función bajo condiciones oxidativas . En particular, el término se refiere a la capacidad de la proteína para funcionar en presencia de varias concentraciones de H202 y/o perácido. La estabilidad bajo diversas condiciones oxidativas se puede medir ya sea por procedimientos estándar conocidos por aquellos expertos en la técnica y/o por los métodos descritos en la presente. Un cambio sustancial en la estabilidad oxidativa se vuelve evidente por al menos aproximadamente un incremento o disminución de 5% o mayor (en la mayor parte de las modalidades, preferiblemente es un incremento) en la vida media de la actividad enzimática, en comparación con la actividad enzimática presente en ausencia de compuestos oxidativos . Como se utiliza en la presente, el término "estabilidad a pH" se refiere a la capacidad de una proteína a funcionar a un pH particular. En general, la mayor parte de las enzimas tienen un intervalo de pH finito en el cual funcionarán. Además de las enzimas que funcionan en intervalos de pH moderados (por ejemplo de aproximadamente pH 7) existen enzimas que son capaces de trabajar bajo condiciones de pH muy alto o muy bajo. La estabilidad a diversos pH se puede medir ya sea por procedimientos estándar conocidos por aquellos expertos en la técnica y/o por los métodos descritos en la presente . Se vuelve evidente un cambio sustancial en la estabilidad de pH si se presenta por lo menos aproximadamente 5% o mayor de incremento o disminución (en la mayor parte de las modalidades preferiblemente es un incremento) en la vida media de la actividad enzimática, . en comparación con la actividad enzimática del pH óptimo de la enzima. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a un nivel o intervalo de pH para estabilidad de pH. Como se utiliza en la presente, "estabilidad térmica" se refiere a la capacidad de una proteína para funcionar a una temperatura particular. En general, la mayor parte de las enzimas tienen un intervalo de temperaturas finito en el cual funcionarán. Además de las enzimas que funcionan en el intervalo medio de temperatura (por ejemplo a temperatura ambiente) , existen enzimas que son capaces de trabajar a temperaturas muy altas o muy bajas. Se puede medir la estabilidad térmica ya sea por procedimientos conocidos o por métodos descritos en la presente . Un cambio sustancial en la estabilidad térmico se vuelve evidente por al menos 5% o más de incremento o disminución (en la mayor parte de las modalidades es preferible un incremento) en la vida media de la actividad catalítica de un mutante cuando se expone a una temperatura diferente (por ejemplo mayor o menor) que la temperatura óptima para actividad enzimática. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a un nivel de estabilidad de temperatura ni a un intervalo de temperatura. Como se utiliza en la presente, el término "estabilidad química" se refiere a la estabilidad de una proteína (por ejemplo una enzima) hacia sustancias químicas que perjudican su actividad. En algunas modalidades, tales sustancias químicas incluyen, pero no se limitan a peróxido de hidrógeno, perácidos, detergentes aniónicos, detergentes catiónicos, detergentes no iónicos, quelantes, etcétera. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a algún nivel particular de estabilidad química ni a ningún intervalo de estabilidad química. Como se utiliza en la presente, la frase "mejoramiento en la actividad de perhidrolasa" se refiere a la mejora relativa de la actividad de perhidrolasa en comparación con una enzima estándar. En algunas modalidades, el término se refiere a una velocidad mejorada de producto de perhidrólisis, mientras que en otras modalidades, el término abarca composiciones de perhidrolasa que producen menos producto de perhidrólisis. En modalidades adicionales, el término se refiere a composiciones de perhidrolasa con especificidad de sustrato aleterada. Como se utiliza en la presente, la frase "alteración en la especificidad de sustrato" se refiere a cambios en la especificidad de sustrato de una enzima. En algunas modalidades, un cambio en la especificidad de sustrato se define como una direrencia entre la proporción Kcat/K1Il que se observa con una enzima en comparación con las variantes de enzima u otras composiciones de enzima. Las especificidades de sustrato de la enzima pueden variar, dependiendo del sustrato probado. La especificidad de un sustrato de una enzima se determina al comparar las eficiencias catalíticas que presenta con diferentes sustratos . Estas determinaciones encuentran uso particular en la determinación de la eficiencia de enzimas mutantes, dado que generalmente se desea producir enzimas variantes que presenten proporciones mayores para sustratos de interés particulares. Por ejemplo, las enzimas perhidrolasas de la presente invención es eficientes en producir perácido a partir de un sustrato éster en comparación con las enzimas que se utilizan actualmente en aplicaciones limpiadoras, blanqueadoras y desinfectantes. Otro ejemplo de la presente invención es una perhidrolasa con una actividad menor en la degradación de perácido en comparación con la natural . Otro ejemplo de la presente invención es una perhidrolasa con una actividad superior en grupos acilo y más hidrofóbicos en comparación con el ácido acético. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a una composición de sustrato particular ni a una especificidad de sustrato específica. Como se utiliza en la presente, "propiedad de superfifie" se utiliza con referencia a una carga electrostática así como a propiedades tales como hidrofobicidad y/o hidrofilicidad presentadas por la superficie de una proteína. Como se utiliza en la presente, la frase "se selecciona independientemente del grupo que consiste de ... " significa que las porciones o elementos que son seleccionados del grupo Markush al que se hace referencia pueden ser iguales, pueden ser diferentes o una mezcla de elementos, como se indica en el siguiente ejemplo: una molécula que tiene tres grupos R en donde cada grupo se selecciona independientemente del grupo que consiste de A, B y C. Aquí, los tres grupos R pueden ser: AAA, BBB, CCC, AAB, AAC, BBA, BBC, CCA, CCB o ABC. Con referencia a las composiciones químicas, el término "sustituido", como se utiliza en la presente, significa que la composición orgánica o al radical al cual se aplica el término es : (a) se vuelve insaturado por eliminación de por lo menos un elemento o radical; o (b) por lo menos un hidrógeno en el compuesto o radical es sustituido con una porción que contiene uno o más de (i) carbono, (ii) oxígeno, (iii) azufre, (iv) nitrógeno, o (v) átomos de halógeno; o (c) ambos (a) y (b) . Las porciones las cuales pueden sustituir hidrógeno como se describe en el inciso (b) inmediatamente anterior, que únicamente contienen átomos de carbono e hidrógeno, son porciones de hidrocarburo que incluyen, pero que no se limitan a grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alquildienilo, cicloalquilo, fenilo, alquilfenilo, naftilo, antrilo, fenantrilo, fluorilo, grupos esteroides y combinaciones de estos grupos entre sí y con grupos de hidrocarburo polivalentes tales como alquileno, alquilideno y alquilidino. Las porciones que contienen átomos de oxígeno que pueden sustituir al hidrógeno como se describe en el inciso (b) inmediatamente anterior incluyen, pero no se limitan a hidroxi, acilo o ceto, éter, epoxi, carboxi y grupos que contienen éster. Las porciones que contienen átomos de azufre que pueden sustituir al hidrógeno como se describe en el inciso (b) inmediatamente anterior incluyen, pero no se limitan a ácidos que contienen azufre y grupos éster de ácido, grupos tioéter, grupos mercapto y grupos tioceto. Las porciones que contienen átomos de nitrógeno que pueden sustituir al hidrógeno como se describe en el inciso __ (b) inmediatamente anterior incluyen, pero no se limitan a grupos amino, el grupo nitro, grupos azo, grupos amonio, grupos amida, grupos azido, grupos isocianato, grupos ciano y grupos nitrilo. Las porciones que contienen átomos de halógeno que pueden sustituir al hidrógeno como se describe en el inciso (b) inmediatamente anterior incluyen grupos cloro, bromo, fluoro, yodo y cualquiera de las porciones descritas previamente en donde un hidrógeno o un grupo alquilo pendiente esté sustituido por un grupo halo para formar una porción sustituida estable. Se entiende que cualquiera de las porciones anteriores (b) (i) a (b) (v) se pueden sustituir entre sí ya sea en una sustitución monovalente o por pérdida de hidrógeno, en una sustitución polivalente para formar otra porción monovalente que puede sustituir al hidrógeno en el compuesto orgánico o radical. Como se utiliza en la presente, los términos "purificado" y "aislado" se refiere a la separación de los contaminantes de una muestra. Por ejemplo, las perhidrolasas se purifican por separación de proteínas contaminantes y otros compuestos dentro de una solución o preparación que no son perhidrolasas. En algunas modalidades, las perhidrolasas recombinantes se expresan en células hospedadoras bacterianas o micóticas y estas perhidrolasas recombinantes se purifican por la separación de otros constituyentes de la célula hospedadora; el porciento de polipéptidos de perhidrolasa recombinantes de esta manera se incrementa en la muestra. Como se utiliza en la presente, las "proteínas de interés" se refiere a una proteína (por ejemplo una enzima o "enzima de interés") la cual es analizada, identificada y/o modificada. Las proteínas que se encuentran en la naturaleza así como las recombinantes, encuentran uso en la presente invención. Como se utiliza en la presente, el término "proteína" se refiere a cualquier composición constituida de aminoácidos y reconocida por una proteína como aquellos expertos en la técnica. Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se utilizan de manera intercambiable en la presente. En donde un péptido es una porción de proteína, aquellos expertos en la técnica entenderán el uso del término en este contexto. Como se .utiliza en la presente, proteínas funcional y/o estructuralmente similares se considera que son "proteínas relacionadas". En algunas modalidades, estas proteínas se derivan de un género y/o especie diferente, que incluyen diferencias entre clases de organismos (por ejemplo una proteína bacteriana y una proteína micótica) . En algunas modalidades, estas proteínas se derivan de un género y/o especie diferente, que incluyen diferencias entre clases de organismos (por ejemplo una enzima bacteriana y una enzima micótica) . En modalidades adicionales, las proteínas relacionadas se proporcionan a partir de la misma especie. En realidad, no se pretende que la presente invención esté limitada a proteínas relacionadas de una fuente particular alguna. Además, el término "proteínas relacionadas" abarca homólogos estructurales terciarios y homólogos de secuencia primarios (por ejemplo, la perhidrolasa de la presente invención) . En modalidades adicionales, el término abarca proteínas que dan reacción cruzada inmunológica. En modalidades particularmente más preferidas, las proteínas relacionadas de la presente invención tienen proporciones muy altas de perhidrólisis a hidrólisis. Como se utiliza en la presente, el término "derivado" se refiere a una proteína la cual se deriva de una proteína por adición de uno o más aminoácidos ya sea en uno o en ambos de los extremos C y N terminales, sustitución de uno o más aminoácidos en uno o en un número de sitios diferentes en la secuencia de aminoácidos, y/o supresión de uno o más aminoácidos ya sea en cualquiera o ambos extremos de la proteína en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos, y/o inserción de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos . La preparación de un derivado de proteína preferiblemente se obtiene al modificar una secuencia de ADN la cual codifica para la proteína nativa, transformación de dicha secuencia de ADN en un hospedador adecuado y expresión de la secuencia de ADN modificada para formar la proteína derivada . Las proteínas relacionadas (y derivadas) comprenden "proteínas variantes". En algunas modalidades preferidas, las proteínas variantes difieren de una proteína de origen y de cualquier otra por un número pequeño de residuos aminoácidos.
El número de residuos aminoácidos diferentes pueden ser uno, o de manera más preferible 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más residuos aminoácidos. En algunas modalidades preferidas, el número de aminoácidos diferentes entre variantes está entre 1 y 10. En algunas modalidades particularmente preferidas, las proteínas relacionadas y particularmente las proteínas variantes comprenden por lo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos. De manera adicional, una proteína relacionada o una proteína variante, como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína que difiere de otra proteína relacionada o una proteína de origen en el número de regiones prominentes. Por ejemplo, en algunas modalidades, las proteínas variantes tienen 1, 2, 3, 4, 5 ó 10 regiones prominentes correspondientes que difieren de la proteína de origen. En la técnica se conocen varios métodos que son adecuados para generar variantes de las enzimas perhidrolasa de la presente invención, que incluyen pero que no se limitan a mutagénesis por saturación de sitio, mutagénesis de exploración, mutagénesis insercional, mutagénesis aleatoria, mutagénesis dirigida al sitio y evolución dirigida así como otras diversas soluciones de recombinacíón. En modalidades particularmente preferidas, las proteínas homologas se someten a ingeniería para producir enzimas con una o varias actividades deseadas . En algunas modalidades particularmente preferidas, las proteínas alteradas se incluyen dentro de la familia SGNH-hidrolasa de proteínas. En algunas modalidades más preferidas, las proteínas alteradas comprenden por lo menos uno o una combinación de los siguientes residuos conservados: L6 , W14, 34, L38, R56, D62, L74 , L78, H81, P83 , M90, K97, GllO, L114, L135, F180, G205. En modalidades alternativas, estas proteínas alteradas comprenden los motivos GDSL-GRTT y/o ARTT. En modalidades adicionales, las enzimas son multímeros, que incluyen pero que no se limitan a dímeros, octámeros y tetrámeros. En modalidades preferidas adicionales, las proteínas alteradas presentan una proporción en perhidrólisis a hidrólisis que es mayor que 1.
Un residuo aminoácido - del perhidrolasa es equivalente a un residuo de perhidrolasa de M. smegmatis - si son homólogos (es decir, que tienen una posición correspondiente ya sea en la estructura primaria y/o terciaria) o análogo a un residuo específico o una porción de dicho residuo en la perhidrolasa de M. smegmatis (es decir, que tiene una capacidad funcional o similar para combinarse, reaccionar y/o interactuar químicamente) . En algunas modalidades, con el fin de establecer homología con la estructura primaria se compara directamente la secuencia de aminoácidos de perhidrolasa con la secuencia primaria de perhidrolasa de M. smegmatis y particularmente con un conjunto de residuos conocidos que son invariables en todas las perhidrolasas para las cuales se conoce secuencia. Después de alinear los residuos conservados, permitir las inserciones y supresiones necesarias con el fin de mantener a alineación (es decir, evitar la eliminación de residuos conservados a través de supresión e inserción arbitrarias) , se definen los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de perhidrolasa de M. smegmatis. En modalidades preferidas, la alineación de los residuos conservados conserva 100% de dichos residuos. No obstante, una alineación de más de 75% o una cantidad tan pequeña como 50% de residuos conservados también es adecuada para definir residuos equivalentes. En modalidades preferidas, se mantiene la conservación de los residuos serina e histidina catalíticos. Se utilizan los residuos conservados para definir los residuos de aminoácidos equivalentes correspondientes de perhidrolasa de M. smegmatis en otras perhidrolasa (por ejemplo, perhidrolasas de otra especie de Mycobacterium así como cualquier otro organismo) . En algunas modalidades de la presente invención, la secuencia de ADN que codifica para la perhidrolasa de M. smegmatis está modificada. En algunas modalidades se modifican los siguientes residuos: Cys7, AsplO, Serll, Leul2 , Thrl3, Trpl4, Trpl6, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Vall25, Prol38, Leul40, Prol46, Prol48, Trpl49, Phel50, Ilel53, Phel54, Thrl59, Thrl86, Ilel92, Ilel94 y Phel96. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a una secuencia que está modificada en estas posiciones. En realidad, se pretende que la presente invención abarque diversas modificaciones y combinaciones de modificaciones . En modalidades adicionales los residuos equivalentes se definen al determinar la homología a nivel de estructura terciaria de una perhidrolasa cuya estructura terciaria se ha determinado por cristalografía de rayos X. En este contexto, los "residuos equivalentes" se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de carbono principales de un residuo aminoácido particular de la carbonilhidrolasa y la perhidrolasa de M. smegmatis (N sobre N, CA sobre CA, C sobre C y O sobre O) están dentro de 0.13 nm y preferiblemente dentro de 0.1 nm después de la alineación. La alineación se obtiene después de que se ha orientado y colocado el modelo de mejor ajuste para proporcionar la superposición máxima de las coordenadas atómicas de átomos de proteína diferentes de hidrógeno de la perhidrolasa en cuestión con la perhidrolasa de M. smegmatis. Como se sabe en la técnica, el mejor modelo es el modelo • cristalográfico que proporciona el más bajo factor R para datos de difracción experimentales a la mayor resolución disponible . Los residuos equivalentes los cuales son funcional y/o estructuralmente análogos a un residuo específico de perhidrolasa de M. smegmatis se definen como aquellos aminoácidos de las perhidrolasas que adoptan de manera preferencial una conformación tal que se puede alterar, modificar o modular la estructura de proteína, para llevar a cabo cambios en la unión de sustrato y/o la catálisis de una manera definida y atribuida a un residuo específico de la perhidrolasa de M. smegmatis. Además, están aquellos residuos de la perhidrolasa (en casos en donde se ha obtenido una estructura terciaria por cristalografía de rayos X) la cual ocupa una posición análoga en la medida en que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo puedan no satisfacer los criterios de equivalencia en base en la ocupación de una posición homologa, las coordenadas atómicas de por lo menos dos de los átomos de cadena lateral del residuo se encuentran a los 0.13 nm de los átomos de cadena lateral correspondientes de la perhidrolasa de M. smegmatis. Las coordenadas de la estructura tridimensional de la perhidrolasa de M. smegmatis se determina y se establecen en lo siguiente (véase, por ejemplo, el ejemplo 14) y encuentran uso como se indica en lo anterior para determinar residuos equivalentes a nivel de estructura terciaria. En algunas modalidades, algunos de los residuos identificados para sustitución, inserción o supresión son residuos conservados mientras que otros no. Los mutantes de perhidrolasa de la presente invención incluyen diversos mutantes que incluyen aquellos codificados por ácido nucleico que comprende una secuencia de señal . En algunas modalidades de mutantes de perhidrolasa que son codificados por tal secuencia se secretan por un hospedador de expresión. En algunas modalidades adicionales, la secuencia de ácido nucleico comprende un homólogo que tiene una señal de secreción. La caracterización de proteínas tanto naturales como mutantes se lleva a cabo vía diversos medios adecuados y preferiblemente se basa en la determinación de propiedades de interés. Por ejemplo en algunas modalidades de la presente invención se determinan pH y/o temperatura así como detergente y/o estabilidad oxidativa. En realidad, se contempla que las enzimas que tienen grados variables de estabilidad en una o más de estas características (pH, temperatura, estabilidad proteolítica, estabilidad a detergente y/o estabilidad oxidativa) encontrarán uso. En otras modalidades adicionales se seleccionan perhidrolasas con una actividad de degradación de perácido baja. Como se utiliza en la presente, un "vector de expresión" se refiere a una construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN que está unida operablemente a una secuencia de control adecuada capaz de llevar a cabo la expresión del ADN en un hospedador adecuado. Tales secuencias de control incluyen un promotor para llevar a cabo la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica para los sitios de unión de ribosoma del ARNm adecuados y secuencias las cuales controlan la finalización de la transcripción y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un hospedador adecuado, el vector se puede replicar y funcionar independientemente del genoma hospedador o, en algunos casos, pueden integrarse dentro del genoma mismo. En la presente especificación, con frecuencia se utilizan de manera intercambiable los términos "plásmido" , "plásmido de expresión" y "vector" dado que el plásmido es la forma utilizada más comúnmente de vector hasta ahora. No obstante, se pretende que la invención incluya a " - dichas otras formas de vectores de expresión que tienen funciones equivalentes y las cuales son conocidas o se conocerán en la técnica. En algunas modalidades preferidas , el gen para perhidrolasa se liga a un plásmido de expresión apropiado . El gen para perhidrolasa clonado después se utiliza para transformar o transfectar una célula hospedadora con el fin de expresar el gen para perhidrolasa. Este plásmido se puede replicar en hospedadores en el sentido en que contiene elementos bien conocidos necesarios para la replicación del plásmido y el plásmido se puede diseñar para integrarse en el cromosoma del hospedador. Los elementos necesarios se proporcionan para expresión eficaz del gen (por ejemplo un promotor unido operablemente al gen de interés) . En algunas modalidades, estos elementos necesarios se suministran como el promotor homólogo propio del gen, si es reconocido (es decir, transcrito por el hospedador) , un terminador de transcripción (una región de poliadenilación para células hospedadoras eucarióticas) el cual es exógeno o es suministrado por la región terminadora endógena del gen para perhidrolasa. En algunas modalidades, también se puede incluir un gen de selección tal como un gen de resistencia a antibiótico que permite el mantenimiento continuo del cultivo de células hospedadoras infectadas con plásmido mediante crecimiento en medio que contiene una sustancia antimicrobiana . Se puede utilizar el siguiente método de mutagénesis de cásete para facilitar la construcción de las variantes de perhidrolasa de la presente invención, aunque se pueden utilizar otros métodos. En primer lugar, como se describe en la presente, se obtiene un gen como se encuentra de manera natural, que codifica para la perhidrolasa y se secuencia en su totalidad o en parte. A continuación, se escanea la secuencia desde un punto en el cual se desea realizar una mutación (supresión, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la perhidrolasa codificada. Las secuencias que flanquean este punto son evaluadas para determinar la presencia de sitios de restricción para sustitución de un segmento corto del gen con un acumulado holigonucleotídico el cual cuando se expresa codificará para diversos mutantes. Tales sitios de restricción preferiblemente son sitios únicos dentro del gen para proteína de manera que facilita la sustitución del segmento del gen. No obstante, cualquier sitio de restricción conveniente el cual no se superponga de manera redundante en el gen para perhidrolasa puede ser utilizado, con la condición de que los fragmentos de gen generados por la digestión por restricción se puedan reensamblar en una secuencia adecuada. Si no están presentes sitios de restricción en los lugares dentro de una distancia conveniente a partir del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos) , tales sitios se generan al sustituir nucleótidos en el gen de manera tal que ni el marco de lectura ni los aminoácidos codificados cambian en la construcción final. La mutación del gen con el fin de cambiar su sencuencia para adoptarla a la secuencia deseada se lleva a cabo por la extensión del cebador M13 de acuerdo con métodos conocidos de manera general . La tarea de localizar regiones flanqueantes adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitios de restricción convenientes se realice de manera habitual por la redundancia del código genético, un mapa de enzimas de restricción del gen y una gran cantidad de diferentes enzimas de restricción. Nótese que si está disponible un sitio de restricción flanqueante conveniente, el método anterior necesita ser utilizado únicamente con respecto a la región flanqueante la cual no contiene un sitio. Una vez que el ADN como se encuentra en la naturaleza o un ADN sintético se clona, los sitios de restricción que flanquean las posiciones que se van a mutar se digieren con enzimas de restricción similares y se ligan al gen una pluralidad de casetes oligonucleotídicos con partes terminales complementarias . Se simplifica la mutagénesis por este método debido a que la totalidad de los oligonucleótidos se pueden sintetizar de manera .que queden los mismos sitios de restricción y que no sean necesarios enlazantes sintéticos para crear los sitios de restricción. Como se utiliza en la presente, "correspondiente a" se refiere a un residuo en la posición enumerada en una proteína o péptido, o un residuo que es análogo, homólogo o equivalente a un residuo enumerado en una proteína o péptido. Como se utiliza en la presente, una "región correspondiente" generalmente se refiere a una posición análoga a lo largo de proteínas relacionadas o de una proteína de origen. Los términos "molécula de ácido nucleico codificante", "secuencia de ácido nucleico codificante", "secuencia de ADN codificante" y "ADN codificante" se refiere al orden de secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica (proteína) . Las secuencias de ADN de esta manera codifican para la secuencia de aminoácidos . Como se utiliza en la presente, el término "secuencia análoga" se refiere a una secuencia dentro de una proteína que proporciona una función similar, una estructura terciaria y/o residuos conservados con la proteína de interés (es decir, típicamente la proteína de interés original) . Por ejemplo, en regiones de epítopo que contienen una estructura de hélice o; o una lámina ß, los aminoácidos de sustitución en la secuencia análoga preferiblemente mantienen la misma estructura específica. El término también se refiere a secuencia nucleotídicas así como secuencias de aminoácidos. En algunas modalidades se desarrollan secuencias análogas de manera tal que la sustitución de aminoácidos resulta en una enzima variante que muestra una función similar o mejorada. En algunas modalidades, la estructura terciaria y/o los residuos conservados de los aminoácidos en la proteína de interés se localizan en o cerca del segmento o fragmento de interés. Por lo tanto, cuando el segmento o fragmento de interés contiene, por ejemplo una hélice a o una estructura de lámina ß , los aminoácidos de sustitución preferiblemente mantienen dicha estructura específica. Como se utiliza en la presente, una "proteína homologa" se refiere a una proteína (por ejemplo perhidrolasa) que tienen una acción y/o estructura similar, que la proteína de interés (por ejemplo una perhidrolasa de otra fuente) . No se pretende que los homólogos se relacionen necesariamente de manera evolutiva. Por lo tanto, se pretende que el término abarque una o varias enzimas iguales o similares (es decir, en términos de estructura y función) obtenida de una especie diferente. En algunas modalidades preferibles, es deseable identificar un homólogo que tenga una estructura cuaternaria, terciaria y/o primaria similar a la de la proteína de interés, como sustitución para el segmento o fragmento en la proteína de interés con un segmento análogo a partir del homólogo lo que reducirá la interrupción del cambio. En algunas modalidades, las proteínas homologas tienen una o varias respuestas inmunológicas similares que la proteína de interés . Como se utiliza en la presente, "genes homólogos" se refieren a por lo menos un par de genes de especies diferentes, genes los cuales corresponden entre sí y los cuales son idénticos o muy similares entre sí. El término abarca genes que están separados por especie (es decir, el desarrollo de especies nuevas) (por ejemplo genes ortólogos) así como genes que han sido separados por duplicación genética (por ejemplo genes parálogos) . Estos genes codifican para "proteínas homologas" . Como se utiliza en la presente, los términos "ortólogo" y "genes ortólogos" se refieren a genes en especies diferentes que han evolucionado de un gen ancestral común (es decir, un gen homólogo) por diferenciación en especies. Típicamente, los ortólogos retienen la misma función durante el desarrollo de la evolución. La identificación de ortólogos encuentra uso en la predicción confiable de la función del gen en genomas recién secuenciados . Como se utiliza en la presente, el término "parálogo" y "genes parálogos" se relaciona por la duplicación dentro de un genoma. Aunque los ortólogos retienen la misma función durante el desarrollo de la evolución, los parálogos generan funciones nuevas, aunque algunas de las funciones con frecuencia se relacionan con la original. Los ejemplos de genes parálogos incluyen, pero no se limitan a genes que codifican para tripsina, quimiotripsina, elastasa y trombina todos los cuales son serina proteasas y se presentan junto dentro de las mismas especies . Como se utiliza, las proteína "naturales" y "nativas" son aquellas que se encuentran en la naturaleza. Los términos "secuencia natural" y "gen natural" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a una secuencia que es nativa o que se encuentra en la naturaleza en una célula hospedadora. En algunas modalidades, la secuencia natural se refiere a una secuencia de interés que es el punto de inicio de un proyecto de ingeniería para proteínas . Los genes que codifican para la proteína como se encuentra en la naturaleza se pueden obtener de acuerdo con los métodos generales conocidos o por aquellos expertos en la técnica. Los métodos generalmente comprenden sintetizar sondas marcadas que tienen secuencias putativas que codifican "para regiones de la proteína de interés, prepara bibliotecas genómicas de organismos que expresan la proteína y criban las bibliotecas en búsqueda del gen de interés -por hibridación de las sondas . Los clones hibridizantes positivamente después se mapean y secuencian. El término "molécula de ADN recombinante" , como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ADN que está constituida de segmentos de ADN unidos por medio de técnicas de biología molecular. El término "oligonucleótido recombinante" se refiere a un oligonucleótido creado utilizando manipulaciones biológicas moleculares que incluyen pero que no se limitan a ligación de dos o más secuencias oligonucleotídicas generadas por digestión con enzimas de restricción de una secuencia polinucleotídica, síntesis de oligonucleótidos (por ejemplo síntesis de cebadores u oligonucleótidos) y similares. El grado de homología entre las secuencias se puede determinar utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Smith y Waterman, Adv. Appl.
Math., 2;482
[1981] ; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443
[1970]; Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444
[1988] ; programas tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, Wl) ; y Devereux et al . , Nucí. Acid Res., 12:387-395
[1984] ) . Por ejemplo, PILEUP es un programa útil para determinar niveles de homología de secuencia. PILEUP genera una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones progresivas pareadas . También puede graficar un árbol que muestre las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresivo de Feng y Doolittle, (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360
[1987]). El método es similar al descrito por Higgins y Sharp (Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153
[1987]) . Los -parámetros de PILEUP útiles incluyen una separación implícita ponderada de 3.00, una longitud de separación implícita ponderada de 0.10 y separaciones de extremo ponderadas. Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al . , (Altschul et al . , J. Mol. Biol.., 215-403-410,
[1990]; y Karlin et al . , (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787
[1993]). Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 (véase, Altschul et al . , Meth. Enzymol, 266:460-480
[1996]). Los parámetros "W" , "T" y "X" determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza como valores implícitos una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de calificación BL0SUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915
[1989]), alineaciones (B) de 50, una esperanza (E) de 10, M'5, N' -4 y una comparación de ambas cadenas . Como se utiliza en la presente, el término "por ciento (%) de identidad de ácido nucleico" se define como el porcentaje de residuos nucleotídicos en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos nucleotídicos de la secuencia. Como se utiliza en la presente, el término "hibridación" se refiere a un procedimiento por el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de preamiento de bases, como se conoce en la técnica. Como se utiliza en la presente, la frase "condiciones de hibridación" se refiere a las condiciones bajo las cuales se llevan a cabo las reacciones de hibridación. Estas condiciones típicamente se clasifican por el grado de "rigurosidad" de las condiciones bajo las cuales se mide la hibridación. El grado de rigurosidad se puede basar, por ejemplo, en la temperatura de fusión (Tm) del complejo o sonda de unión de ácido nucleico. Por ejemplo, una "rigurosidad máxima" típicamente se produce a aproximadamente Tm-5°C (5o debajo de la Tm de la sonda) ; la "rigurosidad elevada" es aproximadamente 5-10° debajo de la Tm; la "rigurosidad intermedia" es aproximadamente 10-20° por debajo de Tm de la sonda; y la "rigurosidad baja" es aproximadamente a 20-25° por debajo de la Tm. De manera alternartiva o adicional, las condiciones de hibridación se puede basar en las condiciones de fuerza salina o iónica de hibridación y/o uno o más lavados de rigurosidad. Por ejemplo, 6 x SSC = rigurosidad muy baja; 3 x SSC = rigurosidad baja a media; 1 x SSC = rigurosidad media; y 0.5 x SSC = rigurosidad alta. Funcionalmente, las condiciones de rigurosidad máxima se pueden utilizar para identificar secuencias de ácido nucleico que tengan identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridación; mientras que las condiciones de rigurosidad se utilizan para identificar secuencias de ácido nucleico que tienen aproximadamente 80% o más de identidad de secuencia con la sonda. Para aplicaciones que requieren alta selectividad, típicamente es deseable utilizar condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos (por ejemplo se utilizan condiciones de una concentración relativamente baja de sal y/o de temperatura elevada) . Las frases "sustancialmente similar" y "sustancialmente idéntico" en el contexto de por lo menos dos ácidos nucleicos o polipéptidos típicamente significa que un polinucleótido o polipéptido comprende una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 40% de identidad, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 50% de identidad, de manera aún más preferible por lo menos aproximadamente 60% de identidad, preferiblemente por lo menos aproximadamente 75% de identidad, de manera ás preferible por lo menos aproximadamente 80% de identidad, de manera aún más preferible por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferible aproximadamente 95% y de manera mucho más preferible aproximadamente 97% de identidad, algunas veces tanto como aproximadamente 98% y aproximadamente 99% de identidad de secuencia, en comparación con la secuencia de referencia (es decir, natural) . La identidad de secuencia se puede determinar utilizando programas conocidos tales como BLAST, ALIGN y CLUSTAL utilizando parámetros estándar (véase, por ejemplo Altschul, et al . , J. Mol. Biol., 215:403-410
[1990]; Henikoff et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915
[1989]; Karin et al . , Proc. Nati. Acad. Sci USA 90:5873
[1993]; y Higgins et al . , Gene 73:237-244
[1988]). Los programas (software) para realizar el análisis BLAST están disponibles públicamente a través del National Center for Biotechnology Information. Además, las bases de datos pueden ser examinadas utilizando FASTA (Pearson et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444-2448
[1988] ) . Una indicación de que dos polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el primer polipéptido da una reacción cruzada inmunológica con el segundo polipéptido. Típicamente, los polipéptidos que difieren por sustituciones coservadoras de aminoácidos dan reacciones cruzadas inmunológicamente . Por lo tanto, un polipéptido es sutancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren únicamente por una sustitución conservadora. Otra indicación de que las dos secuencias de ácido nucleico están sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridizan entre sí bajo condiciones rigurosas (por ejemplo dentro de un intervalo de rigurosidad media a elevada) . Como se utiliza en la presente, "residuos equivalentes" se refiere a proteínas que comparten residuos aminoácidos particulares. Por ejemplo, se pueden identificar residuos equivalentes al determinar homología al nivel de estructura terciaria de una proteína (por ejemplo una perhidrolasa) cuya estructura terciaria se ha determinado por cristalografía de rayos X. Los residuos equivalentes se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo aminoácido particular de la proteína tienen residuos equivalentes putativos y la proteína de interés (N, sobre N, CA sobre CA, C sobre C y 0 sobre O) que se encuentran dentro de 0.13 nm y preferiblemente 0.1 nm después de la alineación. La alineación se obtiene después de que se ha orientado y colocado el mejor modelo para proporcionar la superposición máxima de las coordenadas atómicas de átomos de proteína que no son de hidrógeno de las proteínas analizadas.
El modelo preferido es el modelo cristalográfico que proporciona el factor R más bajo para datos de difracción experimentales a la mayor resolución disponible, determinar utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica de cristalografía y caracterización/análisis de proteínas . Como se utiliza en la presente, los términos "perhidrolasas híbridas" y "perhidrolasas de fusión" se refieren a proteínas que son alteradas por al menos dos proteínas diferentes u "originales" . En modalidades preferidas, estas proteína originales son homólogos entre sí. Por ejemplo, en algunas modalidades, una perhidrolasa híbrida preferida de proteína de fusión contiene la parte N-terminal de una proteína y la parte C terminal de un homólogo de la proteína. En alguna modalidad preferida, los dos extremos terminales se combinan para que correspondan a la proteína activa de longitud completa. El término "elemento regulador" , como se utiliza en la presente, se refiere a un elemento genético que controla algún aspecto de la expresión de las secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es un elemento regulador el cual facilita el inicio de transcripción de una región codificante unida operablemente . Los elementos reguladores adicionales incluyen señales de empalme, señales de poliadenilación y señales de terminación.
Como se utiliza en la presente, las "células hospedadoras" generalmente son hospedadores procarióticos o eucarióticos los cuales se transforman o transfectan con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas en el arte . Las células hospedadoras transformadas son capaces de replicar vectores que codifican para las variantes de proteína o que expresan la variante de proteína deseada. En el caso de vectores los cuales codifican para la forma pre- o prepro- de la variante de proteína, tales variantes, cuando se expresan, típicamente son secretadas de la célula hospedadora al medio de la célula hospedadora. El término "introducido" en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa transformación, transducción o transfección. El medio de transformación incluye transformación por protoplastos, precipitación con cloruro de calcio, electroporación, ADN desnudo y similares, como se conocen en la técnica (véase, Chang y Cohén, Mol. Gen. Genet., 168:111 - 115
[1979]; Smith et al . , Appl Env. Microbiol., 51:634
[1986]; y el artículo de revisión por Ferrari et al . , en Harwood, Bacillus , Plenum Publishing Corporation, pp. 57-72
[1989]). El término "promotor/mejorador" indica un segmento de ADN el cual contiene una secuencia capaz de proporcionar funciones tanto promotoras como mej oradoras (por ejemplo, las secuencias repetidas terminales largas de retrovirus contienen funciones tanto promotoras como mejoradoras) . El mej orador/promotor puede ser "endógeno", "exógeno" o "heterólogo" . Un mej orador/promotor endógeno es aquel el cual se une de manera natural con un gen dado en el genoma. Un mej orador/promotor exógeno (heterologous) es aquel el cual se coloca en yuxtaposición con un gen por medio de manipulación genética (por ejemplo técnicas biológicas moleculares) . La presencia de "señales de empalme" en un vector de expresión con frecuencia resulta en concentraciones más altas de expresión del transcrito recombinante. Las señales de empalme media la separación de intrones del transcrito de ARN primario y consisten de un sitio donador y aceptor de empalme (Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York
[1989], pp. 16.7-16.8). Un sitio donador y aceptor de empalme utilizado habitualmente es la unión de empalme de ARN 16S de SV40. Los términos "transfección estable" o "transfectado de manera estable" se refiere a la introducción e integración de ADN extraño en el genoma de la célula transfectada. El término "transfectante estable" se refiere a una célula la cual ha integrado de manera estable ADN extraño o exógeno en el ADN genómico de la célula transfectada. Los términos "marcador seleccionable" o "producto de gen seleccionable" , como se utiliza en la presente, se refieren al uso de un gen el cual codifica para una actividad enzimática que confiere resistencia a un antibiótico o medicamento sobre la célula en la cual se expresa el marcador seleccionable . Como se utiliza en la presente, los términos "amplificación" y "amplificación de gen" se refiere a un procedimiento por el cual secuencias de ADN específicas se replican de manera desproporcionada de manera tal que el gen amplificado se encuentra presente en un número muy alto de copias en comparación con el presente inicialmente en el genoma. En algunas modalidades, la selección de células por crecimiento en presencia de un medicamento (por ejemplo un inhibidor de una enzima susceptibles de ser inhibida) resulta en la amplificación de ya sea el gen endógeno que codifica para el producto de gen requerido para crecimiento en presencia del medicamento o bien por amplificación de secuencias exógenas (es decir, introducidas) que codifican para este producto de gen, o ambas. La selección de células por crecimiento en presencia de un medicamento (por ejemplo un inhibidor de una enzima susceptible de ser inhibida) puede resultar en la amplificación ya sea del gen endógeno que codifica para el producto de gen requerido para crecimiento en presencia del medicamento o por amplificación de secuencias exógenas (es decir, introducidas) que codifican para este producto de gen, o ambos.
La "amplificación" es un caso especial de replicación de ácido nucleico que involucra especificidad de plantilla. Se puede contrastar con la replicación de plantilla no específica (es decir, replicación que es dependiente de plantilla pero que no depende de una plantilla específica) . --La especificidad de plantilla aquí se diferencia de la fidelidad de replicación (es decir, la síntesis de la secuencia polinucleotídica apropiada) y la especificidad nucleotídica (ribonucleótido o desoxirribonucleótido) . La especificidad de plantilla con frecuencia se describe en términos de la especificidad "objetivos". Las secuencias objetivo son los "objetivos" en el sentido de que se busca que se clasifiquen a partir de otro ácido nucleico. Se han diseñado técnicas de amplificación principalmente para este sistema de clasificación. Como se utiliza en la presente, el término "coamplificación" se refiere a la introducción en una célula única de un marcador amplificable junto con otras secuencias de gen (es decir, que comprende uno o más genes no seleccionables tales como aquellos contenidos dentro de un vector de expresión) y la aplicación de la presión selectiva apropiada de manera tal que la célula amplifica tanto el marcador amplificable como otras secuencias de genes no seleccionables . El marcador amplificable puede estar relacionado físicamente a otras secuencias de gen o alternativamente dos piezas separadas de ADN, una que contiene el marcador amplificable y la otra que contiene un marcador no seleccionable, se pueden introducir en la misma célula. Como se utiliza en la presente, los términos "marcador amplificable" , "gen amplificable" y "vector de amplificación" se refiere a un marcador, gen o un vector que codifica para un gen el cual permite la amplificación de dicho gen bajo condiciones de crecimiento apropiadas. Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico amplificable" se refiere a ácidos nucleicos los cuales pueden ser amplificados por cualquier método de amplificación. Se contempla que un "ácido nucleico amplificable" habitualmente comprenderá una "plantilla de muestra" . Como se utiliza en la presente, el término "plantilla de muestra" se refiere a un ácido nucleico que se origina de una muestra la cual es analizada para determinar la presencia del "objetivo" (definida en lo siguiente) . En contraste, se utiliza "plantilla de fondo" con referencia al ácido nucleico diferente a la plantilla de muestra la cual puede o no estar presente en una muestra. La plantilla de fondo con mayor frecuencia pasa inadvertida. Puede ser el resultado de un recambio, o puede deberse a la presencia de ácido nucleico contaminante que se busca purificar eliminándolo de la muestra. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de organismos diferentes a aquellos que se van a detectar pueden estar presentes como fondo en una muestra de prueba. La "especificidad de plantilla" se obtiene en la mayor parte de las técnicas de amplificación por la selección de la enzima. Las enzimas de amplificación son enzimas que, bajo las condiciones en las que se utilizan, procesarán únicamente secuencias específicas de ácido nucleico en una mezcla heterogénea de ácido nucleico. Por ejemplo, en el caso de la replicasa Qß el ARN MDV-1 es la plantilla específica para la replicasa (véase, por ejemplo Kacian et al . , Proc. Nati. Acad. Ssi . USA 69:3038
[1972]). Otros ácidos nucleicos no son replicados por esta enzima de amplificación. Similarmente, en el caso de la ARN polimerasa T7, esta enzima de amplificación tiene una especificidad de rigurosidad por sus promotores propios (véase, Chamberlin et al . , Nature 228:227
[1970]) . En el caso de la ADN ligasa T4 , la enzima no ligará los dos oligonucleótidos o polinucleótidos cuando exista un mal pareamiento entre el sustrato oligonucleotídico o polinucleotídico y la plantilla en la unión de ligación (véase Wu y Wallace, Genomics 4:560
[1989]). Finalmente, las polimerasas Taq y Pfu, en virtud en su capacidad de funcionar a alta temperatura, se encuentra que presentan una alta especificidad por las secuencias unidas y por lo tanto definidas por los cebadores; la temperatura elevada resulta en condiciones termodinámicas que favorecen la hibridación de cebador con las secuencias objetivo y no la hibridación con - -secuencias que no son objetivo. Como se utiliza en la presente, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea que se encuentra de manera natural en un digerido de restricción purificado o producido de manera sintética, el cual es capaz de actuar como un punto de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador el cual es complementario a una cadena de ácido nucleico (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados) . El cebador preferiblemente es de cadena sencilla para eficiencia máxima de amplificación, pero alternativamente puede ser de cadena doble. Si es de cadena doble, el cebador primero se trata para separar sus cadenas antes de que se utilicen para preparar los productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores que incluyen temperatura, fuente del cebador y el uso del método. Como se utiliza en la presente, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos) que se encuentran de manera natural como en un digerido de restricción purificado o producidos de manera sintética, recombinante o por amplificación de PCR, los cuales son capaces de hibridizar con otro oligonucleótido de interés . Una sonda puede ser de cadena sencilla o de cadena doble. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias particulares de gen. Se contempla que cualquier sonda utilizada en la presente invención estará marcada con una "molécula indicadora" , de manera que sea detectable en cualquier sistema de detección que incluya, pero que no se limita a sistemas enzimáticos (por ejemplo ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en la enzima) , fluorescentes, radioactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invención esté limitada a algún sistema o etiqueta de detección particular alguno. Como se utiliza en la presente, el término "objetivo", cuando se utiliza con referencia a los métodos de amplificación (por ejemplo reacción en cadena de polimerasa) se refiere a la región de ácido nucleico unida por los cebadores utilizada para la reacción en cadena de polimerasa. Por lo tanto, el "objetivo" se busca que sea clasificado de otras secuencias de ácido nucleico. Se define un "segmento" como una región de ácido nucleico dentro de la secuencia obj etivo . Como se utiliza en la presente, el término "reacción en cadena de polimerasa" ("PCR") se refiere a los métodos de las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,965,188, incorporada en la presente como referencia, la cual incluye métodos para incrementar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este procedimiento para amplificar la secuencia objetivo consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores oligonucleotídicos a la mezcla de ADN que contiene la secuencia objetivo deseada, seguido por una secuencia precisa de ciclado térmico en presencia de ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus cadenas respectivas de la secuencia objetivo de cadena doble . Para llevar a cabo la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores después se reasocian a sus secuencias complementarias dentro de la molécula objetivo. Después de la reasociación, los cebadores se extienden con una polimerasa de manera que forman un par nuevo de cadenas complementarias . Se pueden repetir muchas veces las etapas de desnaturalización, reasociación de cebador y extensión de polimerasa (es decir, desnaturalización, reasociación y extensión constituyen un "ciclo"; existen numerosos "ciclos") para obtener una concentración elevada de un segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores uno con respecto al otro, y por lo tanto esta longitud es un parámetro controlable . En virtud de los aspectos repetidos del procedimiento, el método se denomina como "reacción en cadena de polimerasa" (a continuación, "PCR", por sus siglas en inglés) , debido a que los segmentos amplificados deseados de" la secuencia objetivo se vuelven la secuencia predominante (en términos de concentración) en la mezcla, se dicen que han sido "amplificados por PCR" . Como se utiliza en la presente, el término "reactivos de amplificación" se refiere a aquellos reactivos (trifosfatos de desoxirribonucleótidos, amortiguador, etcétera) , necesarios para amplificación excepto cebadores, plantilla de ácido nucleico y la enzima de amplificación. Típicamente, los reactivos de amplificación junto con otros componentes de reacción se colocan y están contenidos en un recipiente de reacción (tubo de ensayo, micropozo, etcétera) . Con PCR, es posible amplificar una copia única de una secuencia objetivo específica en ADN genómico a un nivel detectable por varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una zona marcada; incorporación de los cebadores biotinados seguido por detección del conjugado avidina-enzima; incorporación de trifosfatos de desoxinucleótidos marcados con 32P, tales como dCTP o dATP, en el segmento amplificado) . Además del ADN genómico, cualquier secuencia oligonucleotídica o polinucleotídica puede ser amplificada con el conjunto apropiado de moléculas cebadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el procedimiento de PCR en sí mismos son plantillas eficaces para amplificaciones subsecuentes por PCR. Como se utiliza en la presente, los términos "producto de PCR" , "fragmento de PCR" y "producto de amplificación" se refieren a la mezcla resultante de compuestos después de que se completan dos o más ciclos de las etapas en PCR de desnaturalización, reasociación y extensión. Estos términos abarcan el caso en donde ha habido amplificación de uno o más segmentos de una o más secuencias objetivo. Como se utiliza en la presente, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta un ADN de cadena doble en o cerca de una secuencia nucleotídica específica.
La Presente Invención En algunas modalidades más preferidas particularmente, la presente invención encuentra uso en la generación enzimática de perácidos a partir de sustratos de éster y peróxido de hidrógeno. En algunas modalidades preferidas, los sustratos se seleccionan de uno o más de los siguientes: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. De manera importante, la presente invención proporciona un medio para la limpieza, blanqueado y desinfección eficaces sobre un intervalo de pH y temperatura amplios. En algunas modalidades, el intervalo de pH utilizado en esta generación es 4-12. En modalidades alternativas, el intervalo de temperatura utilizado está entre 5° y 90°C. la presente invención proporciona ventajas sobre los sistemas utilizados actualmente (véase, por ejemplo, la solicitud de EP 87-304933.9) en que el blanqueado es posible a un pH óptimo de oxidación de perácido, así como proporcionar blanqueado a pH neutro, pH ácido y a temperatura bajas. Aunque la presente invención se describe en la presente de manera más completa con respecto a lavandería y cuidado de telas, no se pretende que la presente invención esté limitada a estas aplicaciones. En realidad, la presente invención encuentra uso en diversos ámbitos, particularmente aquellos en los cuales se desea blanqueado por perácidos y/o peróxido de hidrógeno, que incluyen, pero que no se limitan a lavandería, tratamiento de telas, procesamiento de pulpa y papel, aplicaciones de cuidado personal, desinfección y limpieza de superficies duras. Por ejemplo, se contempla que las composiciones de la presente invención encontrarán uso en el blanqueado de pulpa, que incluyen el uso en métodos tales como los que se establecen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,569,286, 5,785,812, 6,165,318 y 4,400,237, la totalidad de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Históricamente, se han utilizado perborato de sodio, y más recientemente percarbonato de sodio como compuestos blanqueadores, particularmente en detergentes de lavandería en Europa. Este compuesto se descompone con rapidez en solución acuosa para proporcionar peróxido de hidrógeno (H202) , el cual es la especie blanqueadora activa. Dado que el perborato de sodio es más activa a temperaturas superiores a 80 °C y menos activo en un intervalo de temperatura de 40-60°C (es decir, las temperaturas de lavado que han sido preferidas más comúnmente desde la década de 1950) , los activadores blanqueadores se han incorporado en detergentes de lavandería que contienen perborato de sodio. En realidad, la mayor parte de los detergentes de lavandería contienen actividades blanqueadores . Estos activadores son compuestos con grupos acetilo unidos a O o N que son capaces de reaccionar con un anión hidroperoxi fuertemente nucleofílico para proporcionar un ácido peroxiacético. Dado que las especies reactivas son el anión hidroperoxi, un pH alcalino es esencial para una conversión eficaz de estos activadores a perácidos. El ácido peroxiacético se descompone en un medio débilmente básico para formar un singulete de oxígeno (véase, Hofmann et al . , J. Prakt, Chem., 334:293-297
[1992] ) . El peróxido de hidrógeno es un blanqueador particularmente eficaz a altas temperaturas (por ejemplo >40°C) y condiciones de pH (>10) que típicamente se utilizan en lavado de telas en algunos ambientes. No obstante, como se indica en lo anterior, el lavado en agua fría se utiliza cada vez más y los resultados son menos eficaces en el blanqueado por H202 en comparación con el uso de agua caliente. Para corregir esta desventaja de la baja temperatura, las formulaciones de detergente típicamente incluyen refuerzos de blanqueador tal como TAED (N,N,N',N'-tetraacetiletilendiamina) , NOBS (sulfonato de nonanoiloxibenceno) , etcétera. Estos refuerzos se combinan con H202 para formar ácido peracético, una especie de perácido que es más eficaz que H202 solo. Aunque ayuda en la capacidad blanqueadora del detergente, la reacción de TAED es sólo aproximadamente 50% eficaz, y únicamente dos de los cuatro grupos acetilo en TAED se convierten a perácidos . Adicionalmente, la conversión de TAED en ácido peracético por peróxido de hidrógeno es eficiente únicamente a pH alcalino y temperaturas elevadas. Por lo tanto, la reacción con TAED no se optimiza para uso en todas las aplicaciones de blanqueador (por ejemplo, aquellas que involucran pH neutro o ácido y agua fría) . La presente invención proporciona un medio para corregir las desventajas del uso de TAED. Por ejemplo, la presente invención encuentra uso en aplicaciones de agua fría, así -como aquellas que involucran niveles de pH neutro o ácido. Además, la presente invención proporciona un medio para la generación de perácido a partir de peróxido de hidrógeno, con una proporción elevada de perhidrólisis a hidrólisis. La presente invención proporciona además ventajas sobre composiciones que contienen enzimas tales como esterasas y lipasas) , las cuales presentan proporciones muy bajas de perhidrólisis a hidrólisis. Además de sus aplicaciones en detergentes, la presente invención proporciona métodos y composiciones para el uso de perácidos en el blanqueado textil y en diversas aplicaciones diferentes. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos de una etapa para aplicaciones de procesamiento textil que incluyen pero que no se limitan a eliminación de apresto en una etapa, procedimientos de fregado y blanqueado (véanse, por ejemplo, EP WO 03002810, EP 1255888, WO 0164993 y US 20020007516, la totalidad de las cuales se incorpora en la presente como referencia) . Como se describe con mayor detalle en la presente, en algunas modalidades, el blanqueado involucra procesamiento de material textil antes de que se tina y/o después de que se incorpore en artículos textiles. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a algún régimen de uso particular o algún material textil particular. Además, la tecnología de peracético de la presente invención encuentra uso como un bactericida eficaz (véase Baldry, J. Appl. Bacteriol., 54:417-423
[1983]). Por lo tanto, la presente invención proporciona composiciones y métodos para la esterilización/desinfección de diversos objetos que incluyen, pero que no se limitan a dispositivos médicos, equipo médico, equipo industrial y fermentadores así como cualquier objeto adicional que necesite ser esterilizado o desinfectado. Como se expone con mayor detalle en lo siguiente, durante el desarrollo de la presente invención, se utiliza la enzima de la presente invención en un experimento de destrucción de células estándar para demostrar su adecuación. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona composiciones y método adecuados para uso en control de biopelículas, tales como torres de enfriamiento. Además, como se describe con mayor detalle en los ejemplos siguientes, la presente invención proporciona muchas ventajas para la limpieza y/o esterilización de una amplia gama de objetos que incluye, pero que no se limitan a prendas de vestir, telas, dispositivos médicos, etcétera. Además, la presente invención proporciona composiciones que son eficaces en limpieza, blanqueado y desinfección, sobre una amplia gama de temperaturas y pH de lavado. En modalidades adicionales, la presente ivención encuentra uso en degradación de perácidos a través de la actividad de degradación de perácido de perhidrolasa. En algunas modalidades preferidas, esta actividad se utiliza en aplicaciones de limpieza de desperdicio de perácido. Además, las enzimas perhidrolasa de la presente invención son activas sobre diversos sustratos donadores de acilo, e igualmente son activas a bajas concentraciones de sustrato y proporcionan un medio para perhidrólisis eficaz debido a una proporción elevada de perácido: ácido. En realidad, se ha reconocido que las proporciones más elevadas de perhidrólisis a hidrólisis se prefieren para aplicaciones de blanqueado (véanse, por ejemplo, las patentes de E.U.A. No.s 5,352,594, 5, 108,457, 5,030,240, 3974,082 y 5,296,616, las cuales se incorporan en la presente como re erencia) . En las modalidades preferidas, las enzimas perhidrolasa de la presente invención proporcionan proporciones de perhidrólisis a hidrólisis que son mayores de 1. En modalidades particularmente preferidas, las enzimas perhidrolasa proporcionan una proporción perhidrólisis a hidrólisis mayor que 1 y encuentran uso en el blanqueado . Además, se ha demostrado que son activas en las formulaciones detergentes utilizadas habitualmente (por ejemplo Ariel Futur, WOB, etcétera) . Por lo tanto, la presente invención proporciona muchas ventajas en diversos ámbitos de limpieza. Como se indica en lo anterior, los componentes clave para la producción de perácido por perhidrólisis enzimática son enzima, sustrato éster y peróxido de hidrógeno . El peróxido de hidrógeno se puede agregar directamente ~en lotes, o se pueden generar continuamente "in si tu". Los- polvos para lavado actuales utilizan adiciones por lote de H202 en forma de sales de percabonato o perborato que se descomponen espontáneamente a H202. Las enzimas perhidrolasas de la presente invención encuentran uso en el mismo método de lotes de polvos de lavado como la fuente de H202. No obstante, estas enzimas también encuentran uso con cualquier otra fuente adecuada de H202 que incluyen los generados por medios químicos, electroquímicos y/o enzimáticos. Los ejemplos de las fuentes químicas son los percarbonato y perboratos mencionados antes, mientras que un ejemplo de una fuente electroquímica es una celda de combustible que alimenta oxígeno e hidrógeno gaseoso y un ejemplo enzimático incluye la producción de H202 a partir de la reacción de glucosa con glucosa oxidasa. La siguiente ecuación' proporciona un ejemplo de un sistema acoplado que encuentra uso en la presente invención. Glucosa oxidasa Glucosa + H20 > ácido glucónico + H202 + Perhidrolasa H202 + sustrato éster alcohol + perácido No se pretende que la presente invención esté limitada a una enzima específica dado que cualquier enzima que genera H202 con un sustrato adecuado encuentra uso en los métodos en la presente invención. Por ejemplo, las lactato oxidasas de la especie Lactobacillus las cuales se sabe que generan H202 a partir de ácido láctico y oxígeno encuentran uso en la presente invención. En realidad, una ventaja de los métodos de la presente invención es que la generación de ácido (por ejemplo ácido glucónico en el ejemplo anterior) reduce el pH de una solución básica al intervalo de pH en el cual el perácido es más eficaz para blanquear (es decir, en o por debajo de su pKa) . Otras enzimas que pueden generar peróxido de hidrógeno (por ejemplo alcohol oxidasa, etilenglicol oxidasa, glicerol oxidasa, aminoácido oxidasa, etcétera) también encuentran uso con los sustratos de éster en combinación con las enzimas perhidrolasa de la presente invención para generar perácidos . En algunas modalidades preferidas, los sustratos éster se seleccionan de uno o más de los siguientes ácidos: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. Por lo tanto, como se describe en la presente invención proporciona ventajas definidas sobre los métodos y composiciones utilizados actualmente para formulación y uso de detergentes así como otras aplicaciones diversas .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCIÓN La presente invención proporciona —métodos y composiciones que comprenden por lo menos una enzima perhidrolasa para limpieza y otras aplicaciones . En algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona métodos y composiciones para la generación de perácidos. La presente invención encuentra uso particular en aplicaciones que involucran limpieza, blanqueado y desinfección.
Clonación y Caracterización de la Perhidrolasa de M. smegmatis La clonación de la perhidrolasa de M. smegmatis (es decir, denominada en la presente como el gen "phd" el cual codifica para la proteína "Phd" ; este gen para perhidrolasa algunas veces se denomina en la presente como el gen "act" y la proteína algunas veces se denomina como la proteína "Act") de la presente invención, se basa en datos de secuencia de péptidos a partir de aciltransferasa purificada de Mycobacterium paraf ortui tum (conocida previamente como Corynebacterium oxydans) e información publicada respecto al gen para la ácido 7-aminocefalosporánico (7-ACÁ, por sus siglas en inglés) arilesterasa de Agrobacterium radiobacter (Sakai et al . , J. Ferment . Bioengineer; 138-143
[1998]). Se encontró que dos secuencias peptídicas de la aciltransferasa de M._ parafortui tum purificadas son similares a las regiones N y C terminales internas de la 7-ACA-arilesterasa de A. radiobacter (47% y 42% de identidad, respectivamente) . Se diseña un conjunto de cebadores de PCR en base en la secuencia de r aminoácidos de estos péptidos internos (denominados "AtintF" y "AtintR"). Se desarrollo otro conjunto de cebadores en base en los extremos 5' y 3' ("ATNcoI" y "ATBamHl") de la secuencia de ADN para 7-ACÁ de A. radiobacter. Un producto único del tamaño esperado se amplifica del ADN cromosómico de M. parafortui tum utilizando ambos conjuntos de cebadores. El producto de longitud completa, amplificado por el par cebador ATNcoI/ATBamHl se clonan en pET16b y se transforma en células BL21 (Novagen, Madison, Wl) . Este clon tiene una secuencia idéntica al gen para 7-ACÁ de A. radiobacter. Como se ha determinado que la perhidrolasa purificada de M. parafortui tum no es la 7-ACÁ acilesterasa, se concluye que este no es el gen que codifica para la perhidrolasa de la presente invención. Por lo tanto, los expertos se enfocan adicionalmente en M. smegmatis para clonación y expresión de la perhidrolasa de la presente invención. Para identificar el gen de M. parafortuitum basado en cribado de actividad enzimática se construye una biblioteca de plásmidos del ADN de M. parafortui tum en M. smegmatis utilizando un plásmido con un promotor para activar la expresión de los genes clonados. Sorprentendemente, se encontró que M. smegmatis mismo es positivo para actividades de perhidrolasa y aciltransferasa. Por lo tanto, en algunos casos en la presente, la perhidrolasa se denomina como "ACT" (o "Act"). Una búsqueda BLAST de proteínas del genoma no terminado de M. smegmatis utilizando la secuencia de 7-ACA de A. radiobacter identificando una secuencia continua de 2 kilobases que contiene un ORF (siglas en inglés para marco de lectura abierta) que codifica para una proteína hipotética que es similar pero no idéntica a la proteína 7-ACÁ. En base en esta secuencia, los cebadores se diseñan y utilizan para amplificar el gen de M. smegmatis (ATCC 10143) . Al agregar un sitio de unión de ribosoma de E. coli hacia el extremo 5 ' del codón de inicio se obtiene un clon que express enzima activa. El vector utilizado es pCR2.1TOPO o pBluntlITOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) en células E. coli Top 10. El gen se expresa de manera constitutiva a partir del promotor lac codificado por el plásmido. Esta enzima lleva a cabo las mismas acciones que la aciltransferasa de M. parafortui tum descrita originalmente . Durante la caracterización de la perhidrolasa de la presente invención, la búsqueda BLAST de proteína estándar identifica algunas proteínas (<20) con similitud de secuencia de 30-80%. Este grupo incluye las 7-ACA ariltransferasas de A. radiobacter y otros organismos, los cuales tienen 43% de identidad con la perhidrolasa de M. smegmatis. Todos los homólogos identificados con por lo menos 40% de similitud tienen un motivo GDS muy cercano al extremo N terminal . Todas las proteínas también contienen la mayor parte de los residuos conservados los cuales pueden colocarlos dentro de la familia GDSL sugerida de enzimas lípolíticas (véase, por ejemplo, Upton y Buckley, Trends Biochem. Sci., 20:178
[1995] ) . No obstante, las enzimas mencionadas en este documento no aparecen en búsquedas de homología con la proteína perhidrolasa. En realidad, estas proteínas tienen menos de 20% de similitud con la perhidrolasa y sus homólogos, lo que sugiere que las enzimas relacionadas con aciltransferasa (una perhidrolasa de la presente invención) forman una subfamilia. La función natural de la enzima de la presente invención y las proteínas relacionadas estrechamente, además de la 7-ACÁ arilesterasa, no se han determinado bioquímicamente. M. smegmatis parece ser el único organismo con la aciltransferasa/perhidrolasa en un operón con una proteína putativa que une penicilina (PBP, por sus siglas en inglés) . Aunque no se pretende que la presente invención esté limitada a algún mecanismo particular, se sugiere que la enzima puede estar involucrada en la síntesis/estructura de la pared celular o modificación de moléculas que se captan del ambiente. No hay homólogos de la perhidrolasa de la presente invención que hayan sido identificados en M. tuberculosis o M. leprae hasta ahora. No obstante, se determinó que algunos organismos tienen homólogos múltiples (por ejemplo S. meliloti) . Durante el desarrollo de la presente invención se realizaron diversas mutaciones en la perhidrolasa de M. smegmatis con el fin de determinar su actividad. Esta enzima contiene dos residuos cisteína, de los cuales se establece la hipótesis que potencialmente forman enlaces disulfuro, de los cuales, ambos se cambian a alanina con el fin de determinar si los residuos C o no tienen efecto alguno sobre la. actividad de la enzima. Los resultados de ensayo de actividad obtenidos utilizando el ensayo de transesterificación (en solución acuosa) descrito en la presente indica que C7A, así como C77A y un mutante doble (C7A y C77A) son del mismo tamaño y actividad específica. Muchas enzimas tienen el aminoácido serina como parte de su sitio activo y por lo tanto se les denomina, entre otras designaciones como "serina hidrolasas" . El sitio activo puede consistir de un triplete catalítico de S (serina) , D (ácido aspártico) y H (histidina) . Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan a subtilisina (D32-H64-S215) , quimiotripsina (H57-D102-S195) y lipasas en la familia de al ß hidrolasa (por ejemplo S126-D176-H206) . Un motivo típico para las lipasas es el motivo GDSL (Upton y Buckley, supra
[1995] ) en el cual la S es la serina en el sitio activo. Dado que la perhidrolasa de la presente invención se determina que tiene un motivo GDSL (aminoácidos 9-12) , Sil muta a una A con el fin de confirmar la relación de esta S del sitio activo. Como se indica en los ejemplos, el ensayo de actividad resulta indicado que SHA tiene sólo 1% de actividad de la enzima natural. La supresión de los 25 aminoácidos de la parte C terminal también resulta en supresión de la actividad, lo que sugiere que estos aminoácidos contienen un residuo involucrado directamente en el sitio activo y/o que la estructura de la proteína es alterada de manera tal que el sitio activo ya no es capaz de catalizar las reacciones. Además, los residuos del sitio activo predicho, D192 y H195 se mutan a A. Ninguno de los mutantes presenta actividad, lo que confirma que los residuos en el sitio activo de la perhidrolasa de la presente invención consiste de Sil, D192 y H195. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a algún mecanismo particular ni que la presente invención esté limitada a una o varias mutaciones a cualquier de los residuos en el sitio activo particular.
Clonación de la Perhidrolasa de M. parafortuitum Existen algunas diferencias entre la secuencia del péptido N terminal obtenido de la enzima de M. parafortuitum y la secuencia N terminal de la perhidrolasa de M. smegmatis. No obstante, existe una secuencia en la región C terminal de la perhidrolasa de M. smegmatis idéntica a la secuencia peptídica C terminal de la enzima de M. parafortui tum. Se diseñan dos cebadores para amplificar una secuencia parcial del gen para perhidrolasa de M. parafortuitum; la secuencia del cebador inverso es idéntica a la secuencia de la región correspondiente en el gen para perhidrolasa de M. smegmatis y la secuencia del cebador directo se basa en la utilización del codón de M. smegmatis. El cebador directo, MP5 : 5'-ATGGGTACCCGACGAATTCTGTCCTTCGGTGATTCCCTGACCT-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11) y el cebador inverso MPC-intR, 5'- GATTCCGTCGACGCCGTCGGTGCTGATCACCGAACCCGCGTCGAAGAACGG-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 12) . El gen parcial se amplifica del cromosoma de M. parafortui tum y se clona en pCR2.1TOPO (Invitro, Carlsbad, CA) . El análisis de secuencia muestra que la enzima es muy similar pero no idéntica a la perhidrolasa de M. smegmatis [ 11% de identidad) . En base en los pesos moleculares de los monómeros de las perhidrolasas determinados por SDS-PAGE (MP AT:26 kDa, MSAT: 24 kDa, MP clonado AT: -18 kDa) , el clon de los cebadores elaborado para el fragmento interno se determina que ha perdido aproximadamente 70 aminoácidos (~8 kDa) . La secuencia remanente en el extremo 5' del gen de M. parafortuitum se puede obtener por cualquiera de varios métodos adecuados y familiares para aquellos expertos en la técnica de biología molécula que incluyen pero que no se limitan a PCR inversa, son de bibliotecas de plásmido/cósmidos de ADN cromosómico de M. parafortui tum, secuenciado del gen directamente del ADN cromosómico (por ejemplo, como se realiza por Fidelity Systems, Bethesda Maryland) .
Expresión de la Perhidrolasa de M. smegmatis La perhidrolasa es una proteína intracelular en su hospedador nativo. La producción de la perhidrolasa en hospedadores no nativos también puede realizarse intracelularmente. No obstante, en algunas modalidades se agrega una secuencia de señal a la perhidrolasa la cual facilita la expresión de la perhidrolasa por secreción en el periplasma (por ejemplo en organismos gramnegativos tales como E. coli) o dentro del espacio extracelular (es decir, en organismos grampositivos tales como Bacillus y Actinomycetes) o en hospedadores eucarióticos (por ejemplo Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces y Pichia) . Por supuesto, estos son sólo algunos de los ejemplos de hospedadores procarióticos y eucarióticos posibles. No se pretende que la presente invención esté limitada a estos hospedadores específicos, dado que diversos organismos adicionales encuentran uso como hospedadores de expresión en la presente invención. Una diversidad de sistemas de expresión disponibles comercialmente, que incluyen pero que no se limitan a pBAD, plac, T7 encuentran uso en la expresión de la perhidrolasa en hospedadores gramnegativos- (por ejemplo E. coli) . En algunas modalidades, los mismos tipos de promotores encuentran uso en otro hospedador gramnegativo, Pantoea citrea. Para probar la expresión en E. coli se utilizan dos estragias: 1) agregar un sitio de unión de ribosoma (RBS, por sus siglas en inglés) al extremo 5' del gen phd y clonar el gen en pCRBLUNTIITOPO (Invitrogen) , y de esta manera permitir la expresión directamente del promotor pLac disponible en el vector; y 2) clonar el gen phd bajo el control del promotor T7 en el plásmido pET116b (Novagen) . En este último sistema, la expresión del gen es inducible por adición de IPTG al cultivo de crecimiento y uso de una célula hospedadora específica (por ejemplo BL21 (?DE3)pLysS (Novagen)) que contiene el lisogen ?DE3 que codifica para la ARN polimerasa T7. La primera estrategia produce un plásmido capaz de permitir la expresión de la proteína perhidrolasa en otros hospedadores gramnegativos (por ejemplo P. citrea) . Para expresar la proteína en E. coli o P. citrea utilizando la primera estrategia se hacen crecer cultivos a partir de colonias purificadas solas a 37°C durante la noche en caldo L más el antibiótico apropiado (por ejemplo, canamicina 50 µg/ml) . Se determina la expresión de la proteína por el ensayo pNB (véase ejemplo 1) después de la lisis de las células . La expresión de la perhidrolasa utilizando el sistema de expresión T7 requiere la inducción del cultivo con la adición de IPTG (por ejemplo 100 mmoles de IPTG agregadas hasta una DO5S0 de 0.4) . Los cultivos durante la noche, inoculados a partir de una sola colonia se utilizan para inocular el cultivo de expresión del volumen deseado (25 mm a varios litros) a una DOS50 de 0.1. Después el cultivo de expresión se hace crecer a la temperatura deseada (por ejemplo 25°C, 30°C, 37°C) hasta que se alcanza una DO550 de 0.4, después de lo cual se agrega IPTG. Se permite que la expresión continúe durante 3 horas durante la noche. Se monitorea la expresión de proteína por el ensayo de actividad de pNB, como se describe en el ejemplo 1. Habitualmente, la expresión del sistema T7 proporciona un título alto de proteína, suficiente para análisis adicional tal como cristalografía. Las especies de Bacillus son bien conocidas como hospedadores adecuados para la expresión de proteínas extracelulares (por ejemplo proteasas) . La expresión intracelular de proteínas es menos conocida. La expresión de la proteína perhidrolasa intracelularmente en Bacillus subtilis se puede realizar utilizando una diversidad de promotores que incluyen pero que no se limitan a pVeg, pSPAC, pAprE o pAmyE en ausencia de una secuencia de señal en el extremo 5' del gen. En algunas modalidades, la expresión se obtiene a partir de un plásmido replicante (con un número de copias alto o bajo) , mientras que en modalidades alternativas la expresión se obtiene al integrar la construcción deseada en el cromosoma. La integración se puede realizar en cualquie lugar, que incluye pero que no se limita los lugares arpE, amyE o pps. En algunas modalidades, la perhidrolasa se expresa a partir de una o más copias de la construcción integrada. En modalidades alternativas se obtienen copias integradas múltiples por integración de una construcción capaz de amplificación (por ejemplo unida a un cásete para antibiótico y flanqueada por secuencias repetidas directas) o por ligación de copias múltiples e integración subsecuente en el cromosoma. En algunas modalidades, la expresión de la perhidrolasa ya sea con el plásmido replicante o la construcción integrada se monitoriea utilizando el ensayo de actividad de pNB (descrito en la presente) en un cultivo apropiado . Al igual que con Bacillus, en algunas modalidades, la expresión de la perhidrolasa en hospedadores grampositivos de Streptomyces se realiza utilizando un plásmido replicante mientras que en otras modalidades, la expresión de la perhidrolasa se lleva a cabo vía integración del vector en el cromosoma de Streptomyces. Cualquier promotor capaz de ser reconocido en Streptomyces encuentra uso en activar la transcripción del gen para perhidrolasa (por ejemplo el promotor de glucosa isomerasa, el promotor A4) . Los plásmidos replicantes, ya sea vectores lanzadera o" únicamente Streptomyces , también encuentran uso en la presente invención para expresión (por ejemplo pSECGT) .
Estructura de la Perhidrolasa de M. smegmatis Se determina que la estructura cristalina de la pp de M. smegmatis hasta 2.2 Angstroms. La esctructura confirma los hallazgos con columnas de determinación de tamaño por filtración en gel que indican que esta enzima es un octámero. La estructura del monómero coloca a la enzima en la clase conocida como SGNH-hidrolasas (véase, por ejemplo, Molgaard et al . , Structure 8: 373-383
[2000]). Los residuos de sitio activo se identifican como S11-D192-H195 , en base en la homología, confirmando la identificación del la triada catalítica en base en la pérdida de actividad en las mutaciones SHA, D192A y H195A descritas en lo anterior. La figura 3 proporciona esquemas que muestran la estructura de la perhidrolasa de M. smegmatis así como de otras serina hidrolasas. Como se ha indicado, esta enzima tiene una estructura diferente en comparación con las enzimas que se muestran aquí (quimiotripsina, subtilisina y al ß hidrolasa) . En realidad, el análisis estructural de las perhidrolasas de la presente invención indica que este grupo de enzimas tienen una forma y un sitio activo diferentes que los de estas otras enzimas. En la figura 4 se ilustra un diagrama esquemático de la estructura del monómero. Las estructuras de las otras enzimas en la familia SGNH-hidrolasa se han resuelto, específicamente la ramnogalacturonano acetilesterasa de Aspergillus aculeatus (RGAE) , el factor activante de plaquetas de Bos taurus (PAF-AH (Ib) a) , la esterasa de Streptomyces scabies (SsEst) y la tioesterasa/proteasa i/fosfolipasa 1?X (TAP o Tes) de E. coli . En estas enzimas está presente muy poca secuencia de homología funcional . Básicamente, la identidad de secuencia se reserva para los residuos involucrados en el sitio activo y aquellos que definen la familia. Aunque el hallazgo total de las enzimas es similar (véase, por ejemplo, Molgaard et al . , supra
[2000] , para superposición de estructuras) , existen diferencias estructurales. Por ejemplo, existe un bucle que cubre al sitio activo en SsEst en comparación con RGAE y TAP los cuales tienen sitios activos que se exponen a la superficie. La perhidrolasa de M. smegmatis tiene un sitio activo que está un poco enterrado. Los sitios de unión de la perhidrolasa de M. smegmatis se identifican como Cys7, AsplO, Serll, Leul2, Thr13 , Trpl4, Trpl6, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Vall25, Prol38, Leul40, Prol46, Prol48, Trpl49, Phel50, Ilel53, Phel54, Thrl59, Thrl86, Ilel92, Ilel94 y Phel96. Estos sitios de derivan a partir de observación directa y por estudios de elaboración de modelos para elaborar modelos de sustrato que se unen a la enzima utilizando métodos conocidos en la técnica. Como se indica en lo anterior, se encuentra que la perhidrolasa de M. smegmatis es un octámero en el estado cristalino. No obstante, se contempla que sea un hexámero u octámero en solución. Se observa que el octámero es un tetrámero de dímeros, dos moléculas están interactuando de manera mucho más cercana y extensa y estas se denominan los dímeros de "transferasa act" . Se encontró que varios de los sitios conservados a lo largo de este límite de dímeros. Por ejemplo, se encontró que los residuos Trp 14, Arg 27, Arg 56, His 81 y Pro 83 están conservados en aislados naturales que tienen actividad perhidrolasa y se contempla que son críticos en la formación de la capa intermedia. Además otro residuo adicional, Glu 51, el cual está conservado en todos excepto uno de los aislados naturales (y en este caso es una enzima homologa) se identificó. Una característica adicional de interés es que en los aislados naturales que muestran actividad de perhidrolasa, todos comparten una inserción de residuos 69-81. Esta región forma un bucle que es una capa intermedia dimérica. Sin este bucle, se considera que mucho de la capa intermedia dimérica se perdería y es probable que los dímeros y la agregación subsecuente no se produzcan. Por lo tanto, existe una relación de la inserción con la agregación estructural de formaciones particularmente diméricas y la aparición de la actividad de perhidrolasa. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a algún mecanismo particular. Se encontró que los residuos claves están relacionados con la actividad deseada en homólogos seleccionados. En realidad, existen varios residuos conservados que se contemplan que tengan importancia para actividad de aciltransferasa. Estos incluyen a: Leu 6, Trp 14, Arg 27, Trp 34, Asp 62, Leu 74, Leu 78, His 81, Pro 83, Met 90, Lys 97 y Leu 114. En un análisis adicional, se investigó la asociación de la perhidrolasa con carbamato. Se determinó el octámero nativo en el grupo de espacio P4 con dimensiones de celda de unidad: a= 98.184 b= 98.184 y c= 230.119 a=90.00 /3=90.00 ?=90.00, este cristal genera una difracción a aproximadamente 2.0 Á. El crecimiento de cristal inhibido por carbamato en el grupo de espacio Pl con dimensiones de celda unitaria a=67.754, b=80.096 y c=85.974 Q!=104.10o, 3=112.10° y ?=97.40° y estos cristales producen difracción a una resolución que excede 1.0 Á. El carbamato está unido de una manera que aprovecha las interacciones entre el oxígeno ceto del carbamato y los residuos que forman el orificio de oxianión, los átomos N amida de Ser 11 y Ala 55 y Asn 94 ND2. La cadena lateral hidrofóbica se extiende a lo largo de la superficie hidrofóbica del sitio de unión fuera, dentro de la abertura de superficie entre pares de dímeros en la estructura octamérica. La dirección de la porción carbamato resalta el papel fundamental de la mutación S54V. La porción hidrofóbica pasa adyacente a la cadena lateral de Ser 54. Mutando la serina natural a valina se incrementa la hidrofobicidad y también sirve como un control de compuerta para evitar que los nucleófilos hidrofílicos (por ejemplo agua) compitan con los nucleófilos desacilantes deseados. Los residuos que rodean a la porción carbamato en la misma molécula o en moléculas vecinas que forman la entrada extendida se espera que alteren la selección del nucleófilo desacilante óptimo. La estructura muestra que cada monómero se inhibe con carbamato unido covalentemente. De esta manera, todos los sitios activos del octámero se encuentra que son activos y funcionales . La cadena lateral del carbamato recuerda a los grupos salientes de los sustratos probados. De esta manera, la porción carbamato indica la dirección de acceso para el sustrato.
Perhidrolasa de M. smegmatis es una SGNH-hidrolasa La perhidrolasa de la presente invención tiene ciertos componentes que indican que está en la familia de enzimas SGNH-hidrolasa. Esta familia se define por tener los cuatro aminoácidos SGN y H conservados en cuatro bloques, similar a los bloques que describen la familia lipolítica de enzimas (véase Upton y Buckley, supra) . En el caso de la perhidrolasa de M. smegmatis, estos corresponden a Sil, G52, N94 y H195, los cuales corresponden a los bloques I, II, III y V, de acuerdo con Upton y Buckely (Upton y Buckley, supra) y Molgaard et al . , (Molgaard et al . , supra) . Estos aminoácidos también están conservados dentro de los homólogos de secuencia cercana de la perhidrolasa. Como se indica en la presente, las secuencias se alinean utilizando el programa de alineación en Vector NTi (Informax, Invitrogen) . En la siguiente alineación se proporciona una comparación de secuencias homologas, el subrayado doble indica los residuos involucrados en el sitio activo. AR: Agrobacterium rhizogenes Q9KWA6; RR: Rhizobium rhizogenes NF006; SM: Sinorhizobium meliloti RSM02162; MS : Mycobacterium smegmatis Act; MP: secuencia parcial de Phd de Mycobacterium parafortuitum ; PD: Prosthecobacter dejongeii RVM04532. Los aminoácidos dentro de los bloques que definen la familia de SGNH-hidrolasas se indican con negrillas.
Bloque I Bloque II GDS o AR(1) HASSRSI CFGDS THGHIPVPESaP TTJRYPFEQRím3RMSAAWra?SIIEEaLe)VRITeVBD--P¡I tta.ll) MSBSRSItCFßDSIiTHGHIPVPBaSP TI?YPPBQMIT0W«AMßIMySI-SH3t£?RI^^ l^(l)OTOTSHSHRT HVEK SVLCFGDS TV(GMIFVKEeaP TI>RXPXSQRH«-AH?SBI^DOIHIXB8Z«AKITSI>DI>-FlI 5 SHdl VEWWVfcCFßDSLTHGWXPVKESSP TLRTFraQRH G?Í_?iJR?IX3yHIIEEaLS?RTTSU3D-?'N MS[1) MMJULC GDSLTWGW EDGA HP IjTTWUlSFßDSLTHGWISVBBaVí? BM'P8 RtTre L?DHßDRYjWIEEGLSAR I ^^ P? PD(1) --HCTI CFGDSNTKa-OP?S TAPFPRRHGPEV^^ Bloque lll sxMD AK (67) DPKI-^-?rlPH»I-^H P?i. XIL GOíOTl£r?T^ HM(78) Wtf-tt»aST??MAV_SHLPZ_3l-Vi:W^^ SM(67) 13»RLOTSTYLPMA?¡^PlMVIIMKTNBT^ MS{65) DPR^(3AST PSCIATH PLDLVIIMI¿p?roTKAYFRRTPLDlAI?MSV VM ]_Q MP(6d) DPia«GSQttPSClJ-SH-.P?L IIJM?-m?rKHJFGRTE PD(65) ipCRKSK0Y PACa_i_3HX LDlWII.^^ Bloque V DaiHP AR(1«7) HPDPHPMMlTGa-?Eratisp QYKAIAOTtK DPLW 14) HMtlSß) MPDPHFK34FG<KXlíTK3MLSQLYKA ADF^^ (SECUENCIA DE 16) SNU47) MPDPßPEßMEtaW?-ptSKíagSSbyi-K-^FÍISVEF (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17) MSU4S) MPaPHFC-.tFSG«WX- r-S WVyí3Aiai31 lKVP>^Ij^ (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 18) HF 14S) L HFWTOL ?-XWSJari?KjaVrSAIAS^^ (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 19) PD (144) SAMPDHJAXIPHGtf?RSAOTPRHY?QAVALKCEYFNSQ 15 Los cebadores utilizados para identificar homólogos para cada uno de los bloques indicados en lo anterior se proporcionan en lo siguiente : 0 Bloque I (directo 5' -3) le: acggtcctgtgctttggngaytcnyt (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 21) If: acggtcctgtgctttggngayagyyt (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22) 5 lg: gcggtcctgttctwnggngaytcnyt (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23) lh: gcggtcctgttctwnggngayagyyt (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24) li : gctcgaaccgtcctctgttttggngaytcnyt (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25) Ij : gctcgaaccgtcctctgttttggngayagyyt (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26) lk: gctcgaaccgtcctctgtttnggngaytc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 27) 11: gctcgaaccgtcctctgttttggngaytcnytn (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 28) lm.: gctcgaaccgtcctctgtttggngaytcnytg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 29) 1A: gccaagcgaattctgtgtttcggngaytcnyt (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 30) IB : gccaagcgaattctgtgtttcggngayagyyt (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 31) Bloque III (inverso 5' -3) 3c: attccgcgcttcagrtcrttnvtncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 32) 3d: attccgcgcttcagrtcrttn gncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 33) 3e: attccgcgcttcagrtcrttnscncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 34) 3f: attccgcgcttcagrtcrttnrancc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 35) 3k: attccgcgcttcagrtcrttnrtncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 36) 31: attccgcgcttcagrtcrrnytncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37) 3m: attccgcgcttcagrtcrttnsgncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38) 3n: attccgcgcttcagrtcrttn cncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39) 3o: attccgcgcttcagrtcrttnyancc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40) 3p: attccgcgcttgrsrtcrttnrtncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41) 3q: attccgcgcttgrsrtcrttnytncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42) 3r: attccgcgcttgrsrtcrttnsgncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43) s: attccgcgcttgrsrtcrttnwcnnn (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 44) t: attccgcgcttgrsrtcrttnyancc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 45) A: gcgccggaagtaggccttggtrtcrttnvtncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 46) 3B : gcgccggaagtaggccttggtrtcrttnwgncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 47) 3C : gcgccggaagtaggccttggtrtcrttnscncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 48) 3D: gcgccggaagtaggccttggtrtcrttnrancc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 49) Bloque III (directo 5' -3) 3g: cggaattatcatgctgggnabnaayga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 50) „3h: cggaattatcatgctgggncwnaayga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 51) 3i: cggaattatcatgctgggngsnaayga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 52) 3j : cggaattatcatgctgggntynaayga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 53) 3u: ccggaattatcatgctnggnabnaayga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 54) 3v: ccggaattatcatgctnggncwnaayga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 55) 3 : ccggaattatcatgctnggngsnaayga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 56) 3x: ccggaattatcatgctnggntynaayga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 57) Bloque V (inverso 5' -3) 5c: acccttagcgtttggrtgnrtnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 58) 5d: atccttagcgtttggrtgnavnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 59) 5e: aatcttagccgtgrrrtgrirtnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 60) 5f: aatcttagccgtgrrrtgnrcnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 61) 5g: aatcttagccgtgrrrtgntrnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 62) 5h : ccgetggtcctcatctggrtgnrtnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 63) 5i : ccgctggtcctcatctggrtgnrcnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 64) 5j : ccgetggtcctcatctggrtgntrnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 65) 5k: ccgctggtcctcatcraartgnrtncc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 66) 5A: cgattgttcgcctcgtgtgaartgnrtnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 67) 5B : cgattgttcgcctcgtgtgaartgnrcnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 68) 5C : cgattgttcgcctcgtgtgaartgntrnccrtc (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 69) Como se describe con mayor detalle en la presente, los resultados de secuencia y estructura están fundamentados por los datos de actividad que indican que las enzimas perhidrolasas de la presente invención difieren de las enzimas lipolíticas conocidas en la técnica.
Indicación de Homólogos Como es bien sabido en la técnica, las proteínas con una actividad deseada se pueden identificar de varias maneras, que incluyen pero que no se limitan a: 1) búsqueda de base de datos disponibles para proteínas con homología de secuencias (30-100%) ; 2) cribado de aislados ambientales por la actividad deseada; y 3) examen de tipo de cepas a partir de ATCC del género identificado que tiene actividades (por ejemplo Mycobacterium y Corynebacterium, como se describe en la presente en modalidades particulares) . Al realizar una búsqueda BLAST proteína-proteína estándar, se identifican varios homólogos de genomas secuenciados total o parcialmente. A partir de la secuencia de gen conocida, se amplifican varios homólogos por PCR a partir del cromosoma del organismo de origen y se clona en el vector de expresión pET esencialmente como se describe para la clonación de phd a partir de M. smegmatis en pET16b. Los homólogos identificados por esta búsqueda BLAST incluyen a: Q9K A6 de Agrobacterium rhizogenes, Q9KWB1 de A. rhizogenes, Q8UFG4 de A. tumefaciens, Q8UAC0 de A. tumefaciens (ahora AgrL, idéntico a 7-ACA arilesterasa) , Q9ZI09 de A. tumefaciens, ACÁ de A. tumefaciens (radiobacter), RVM04532 de Prosthecobacter . dej ongeii , Q98MY5 de Rhizobium. loti, Q92XZ1 de R. meliloti, Q9EV56 de R. meliloti, NF006 de R. rhizogenes, NF00602875 de R. rhizogenes , Q8XQI0 de R. solanacerarum , RSM02162 de Sinorhizobium meliloti , RSM05666 de S. meliloti , RMLO00301 de Mesorhizobium loti, Q9KWA6 de A. rhizogenes y Q9KWB1 de A. rhizogenes . En base en estos resultados se genera un árbol de homología de proteínas con homología de secuencia (20-80%) con la perhidrolasa de M. smegmatis . Como se muestra en la figura 2, una enzima en la familia de las enzimas lipolíticas descrita por Upton y Buckley {supra) es la de V. mimicus . Este árbol filogenético se genera utilizando el programa de alineación en Vector NTi (Informax, Invitrogen) . La flecha verde indica la perhidrolasa de M. smegmatis , la flecha roja indica la 7-ACA arilesterasa de A. radiobacter, la flecha azul indica la TAP de E. coli y la flecha negra indica la RGAE de A. aculeatus. Como se indica adicionalmente en la figura 2, la perhidrolasa no está relacionada estrechamente con esta enzima. La perhidrolasa y sus parientes más cercanos, RVM04532 de Prosthecobacter dejongeii , NF006 de R. rhizogenes, Q9KWA6 de A. rhizogenes, Q92XZ1 de R. meliloti, RSM02162 de S . meliloti , Q9KWB1 de A. rhizogenes y NF00602875 de R . rhizogenes quedan fuera de su propia rama (es decir, una rama que es diferente de las proteínas similares a 7-ACA arilesterasa y las proteínas similares a RGAE/TAP) . No obstante, se contempla que algunos homólogos adicionales, relacionados de manera más alejada encontrarán uso en la presente invención debido a la actividad de perhidrolasa o servirán como una estructura principal adecuada para modificación a la actividad de perhidrolasa deseada. Además de los análisis de secuencia y de homología, se hacen crecer aislados ambientales en un medio rico (N-MISO; en g/l: 10 g de glucosa, 10 g de extracto de levadura, KN03 1.5, KH2P04 3.4 g, NaH2P0 .H20 3.4 g, solución salina C 10 ml [solución salina C: en g/l: MgS07H20 25, FeS047H20 2.8, MnS04H20 1.7, NaCl 0.6, NaMoS04.2H20, ZnS04.7H20 0.06 en HCl 0.1N]) determinado y los que dieron resultado positivo para la reacción de transesterificación se purifican como se describe en los ejemplos. Este es uno de los métodos de cribado que puede ser utilizado para identificar perhidrolasa. Estos datos muestran que la presente invención encuentra uso en la identificación de enzimas adicionales con la actividad de perhidrolasa deseada.
Investigaciones adicionales de homólogos Además de los análisis anteriores, se generó una biblioteca de enzimas de las esterasas "tipo GDSL" novedosas, las cuales son homologas con el prototipo de perhidrolasa de M. smegmatis. Con el fin de identificar esterasas de tipo "GDSL" nuevas, se establece un procedimiento de cribado (detección sistemática) basado en homología de secuencia y se utiliza para cribar bibliotecas generadas de ADN metagenómico complejo (en BRAIN) . Se desarrolla una biblioteca enzimática que comprende las 19 esterasas de tipo "GDSL" (véase abajo) . Las secuencias en esta biblioteca son: S248_M2bBll (ADN) ATGTTCGCGCTTTGCACGGCCGCGTCAGCGGCCCCCGATCGCACCGTCGTCTT TTTTGGGGACAGCCTGACCGCGGGGTACGGCCTCGATGACCCGCAGACCCAG TCCTACCCGGCCAGGATCCAGGAGAAGGTCGACGCCGCGGGCCTGCGCTGGA AGGTCGTGAATGCCGGCCTCTCGGGCGAGACGAGCGCCGGCGGCCTGCGGCG GGTCGACTGGGTGCTCGGCCAGCACATCGACGCCTTTGTCCTGGCGCTTGGCG CCAACGATGGCCTGCGGGGGATCGACCCCCAGGTCACGAGGGCCAATCTCCA GGAGATCATCAACCGGGTCCGCTCCCGGTGGCCCCGCGCGGCGATCGTCATC GCCGGGATGAAAATGCCCCAGAGCATGGGACAGGACTACGCCGCGAATTTTG ACCGGATCTTCCCCGGTCTCGCCGCGAGGAATTCGGCCACGCTCATCCCCT G CTATTAGAAGGGGTCGCCGCCCATCCTAGCCTCAACCAAGGCGACGGCATCC ACCCGACGGCCGCCGGGGACGCACTCGTTGCAGGGACCGTGTGGACGTACCT GCTTCCGATCCTGCGGTCAGCACACTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:70) S248_M2bBll (Aminoácido) MFALCTAASAAPDRTWFFGDSLTAGYGLDDPQTQSYPARIQEKVDAAGLRWK Vv ÍAGLSGETSAGGLRRVDWVLGQHEJ vTA AlOTGLRG?PQVTRANLQEp I^VRSRWPRAAI ^GMKMPQSMGQDYAAOTDRJPPGIAARNSATLIPF^^ AAHPSLNQGDGIHPT GDALVAGTVWTYL PILRSAH (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:71 ) S248_M40cD4 (ADN) ATCK GC I GCTAAGCTCACTG^CGTCATCTTTGCCCTGATAGTCTTGCACAG CCCCCTTGCCGCCGCCGCGCCGCCCACCGTGATGGTGTGTGGCGACAGTCTGA CCGCCGGGTTGGGATTGCCGGCCGATGCTGCATTTCCGGCGCAGCTCCAGGC AAAGCTGCACGATATGGGTATCCTGCAGAAATCGCCGCGCGCGCCACCTCGG GGCAAACGACGGCCGGCGGGTTGGCGAGCCTTGCGGATGCGCTGGCCGCAA AGCCGGATTGGGTGATCCTCGAACTCGGCGCCAATGACATGCTGCGCGCGGT CGATCCGGCCAGCGTGCGCGCCAATCTCGATGCAATGATGACGAAAATCCAG GCGAGCGGCGCTAAACTGCTGCTGACCGGAATGCAGGCGGCGCCCAATTGGG GCGAGGACTAT GCACGATpCGACCGCCpTATCCCGAGCTTGCGAAGGC GCACGGGGTGACGCT TATCCAT^CTTTCTTGATGGGGTGGCGCTGGACCCGG CGCTGAACCAGGCGGATGGAATGCACCCGAACGCCAAGGGGGTCGCCGTGA TCGTCGACCGTATCGCGCCCGTCGTCGCCAAGATGCTGAGAGGCCAGTCATA A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:72) S248_M40cD4 (Aminoácido) MRFAKLTAVIFALIV HSPLAAAAPPTVMVFGDSLTAGLGLPADAAFPAQLQAKL HDMG-PAEIAARATSGQTTAGGIASLADALAAKPDLVTLELGANDMLRAVDPAS WANII?AM mQASGAKLLLTGMQAAPI^ LYPFFLDGVALDPALNQADGMHPNAKGVAVIVDRIAPv?AKMLRGQS (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:73) S248_M44aA5 (ADN) ATGATCGCATGGCTTACCGGATGCGGCAGCGCAAAGACGCAACCGCAGCCCG CAAGTTCCATCCCGCCATCCAGTATTCCAGCAACCGCAAAACCTGCGACAAC GGATATCAGACCGATCATCGTTGCTTTCGGCGACAGCCTGACTGCAGGATAC GGCGTCAGTAGTGAACAAAGCTATCCGGCCAATCTTCAACGCGATCTGGATG CGCGTGGATATCATGCCCACGTCATCAACGAAGGCATCAGCGGCAACACATC GAAAGACGGCGTTCTCAGGGCCCAGGCGATTGCGGCACTCCATCCGGCTGTC GTCATCGTTGCCTTCGGCGGCAACGACGGTCTGCGTGGCCTCCCCATCGGAG ACACGGAAATGAATCTGGCAACGATCATCTCAACCATGCAGCATGCCCATGC CAAGGTAATITTAGGCGGAATTACTTTGCCTCCCAACTATGGCAGCGAATAC ATCGCCAAATTCAATGCGATCTATAAAAAGCAGGCAGCCGCGTATCATGTGC CCCTGCTGCCCTTCATGCTGAAGGGGGTGTATGGCGTGCCCGGTTCCATGCAG AGCGACGGCATCCATCCGACCGCCAAGGGCTGCCAGCAAGTGGCCAGAAACT TCCTGCCCTTGTTATTGCCGCTCCTGCACAAATCAGGGAAGAAATCCATGGAG TCGAAAGCATTGTCTCGACGTCATTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:74) S248_M44aA5 (Aminoácido) MIAWLTGCGSAKTQPQPASSIPPSSIPATA ATGDIRPIIVAFGDSLTAGYGVSSEQ SYPANLQRDLDARGYHAHVTJ^EGISGTSGGSKDGVOIA.QAIAALHPAVV A^ DGLRGLPIGDTEMNIATIBTMQILAHA^ AAYHW LPFMLKGV?G GSMQSDGIHPTAKGCQQVARNFLPLLLPLLHKSGK KSMESKALSRRH (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:75) S261_M2aA12 (ADN) ATGAAAAACATCCITGCATTTGGCGACAGTCTGACCGGGGGTTTTGTGGCCGG ACAGGATGCGCGCCATCCGTTTGAAACCCGCTGGCCAAACGCATTGGCGGCC GGCCGTGGGGGCAAAGCCCGCGTAATTGAAGAGGGTCAGAACGGCCGCACT ACGGTGTTCGACGATGCCGCCACCTTCGAATCTCGAAATGGCTCGGTGGCATT GCCGCTGCTACTGATCAGCCACCAGCCGTTGGACCTGGTAATCATCATGCTCG GCACCAATGACATCAAGTITGCCGCCCGCTGCCGCG CTTTGATGCTTCAATG GGCATGGAACGGCTGATCCAGATCGTCAGAAGTGCCAACTACATGAAGGGCT ACAAGATACCTGAAATCCTCATCATATCGCCGCCCAGCCTCGTGCCGACGCA GGATGAATGGTTCAACGACCTCTGGGGCCATGCCATCGCCGAGTCAAAACTC TTCGCCAAGCACTACAAGCGCGTGGCCGAAGAACTGAAAGTGCATTTCTTTG ATGCAGGCACGGTGGCCGTCGCCGACAAGACCGACGGCGGACATCTCGATGC TGTGAATACTAAAGCCATTGGCGTCGCATTGGTGCCGGTGGTGAAATCAATA CTCGCTCTCTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:76) S261_M2aA12 (Aminoácido) MK ?LAFGDSLT VGFVAGQDARHPF?TRWPNALAAGLGGKARVBEGQNGRTT VFDDAATFESRNGSVALPLLLISHQPLDL TI LGT DIKFAARCPVAFDASMGMER LIQIVRS ANYMKGY?PEIL?SPPSLWTQDEWFNDLWGIXAIAESKLFAKHYK VA EE1J VHFFDAGTVAVA KTDGGHLDAVNTKAIGVA VPVVKSILAL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:77) S279_M70aE8 (ADN) ATGCCGAAAATAGCCAAACTCGCG€CGTCGGATGTGATCGTAGCTTTCGGCG ACAGTCTGACGTTCGGCACCGGCGCAACGGAAGCGGAGAGTTATCCCATCGT GCTCGCACAATTGATCGGTCGCACCGTGGTGCGCGCGGGTGTGCCGGGTGAG GTAACCGAAGGCGGGCTTGCGCGCCTGACCGACGTTATCGAAGAACACAAGC CGAAGCTGATTATTGTTTGCCTGGGCGGCAACGACATGCTGCGCAAGGTCCA GG GACCAGACCCGCGCCAA?TGCGCGCCATTATTAAAACCATCAAGGCG CAAGGCATCGCCGTGGTACTGGTCGGTGTGCCGAAGCCCGCGCTGGTGACCA GTGCGCCGCCGTTCTACGAGGAGATCGCCAAAGAGTTCGGTATCCCTTACGA AGGCAAGATTGTTACCGACGTGTTGTACCAACGCGATCAGAAATCCGATTCC ATACATCCCAATGCCAAAGGCTATCGGCGCATGGCCGAAGCGATAGCCACGC TGCTGAAAAAATCCGGAGCCATTTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:78) S279:M70aE8 (Aminoácido) MPKIAKX-APSDVIVAFGDSLTFGTGATEAESYPG?^AQUGRIVVI^GWGEVT?G GLARLTDVffiEHKPKLIIVCLGGND^ GVP]a»ALVTSAPPFYEEIAKEFGIPYEGKIVTDvXYQRDQKSDSIHPNAKGYRRMA EAIATLLKKSGAI (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:79) S279 M75bA2 (ADN) ATGGAACGGACCGGCCGCGCTGGCGATCGGTGTCGGCGTGGGGCTGGCGAGC CTGAGCCCGGTCGCGCTGGCGACGCCGCCGCGGGGCACCGTGCCGGTGTTCA CCCGATCGGGGACAGCCTGACGGACGAGTATTTTGAGCCGTTCTTCCAGTGG 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(Aminoácido) MKKSAFAKYSAIALMVGMCLHTAYAKEFSQV?FGDS SDTGRLKDMVARKDG TLGNTLQPSF?T^DPVWSSLFAQSYGKTASPNTPDNPTGTNYAVGGARSGSEVN NGFVIWPSTKTQITDHLTATGGKADPNTLYAG^GSNDLISASQATTTAEAQNA IKGAVTRTVTDETLNQAGATGILVPIWPDLSLTPRAIYGESLMAGVQDKAKLASS LYNSGI^EALNQSTANIIPANTFALLQEATTNKEAFGFKJ^QGVACQMPARTTGA DDVASTSL ^CTKANLFFINGANDTYAFADDIHPSGRTHRIIAQYYRSIMDAPTHMG KLSGELVKTGSAHDRHVYRQLDRI^GSQHSIWANVYASDRTDPTTQIGLDVAGS SSL^GAYLSHQNQDYVLDDTLSSDVK?GMGLYHRHDIGNVRLKGVAGIDRLSV DTffitHTOWEGTSRSHTADTrARRF-^GLQ^ NDMTESESTLSTAMRFGEQEQKSLQGEIGVT VAYPISPALTLTGGIAHAHEFNDD ERTlNATLTSIRríYTKGFNTSVSTDKSHATT^ SDTDVGGSLGVRLMF (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:99) Chromobacterium violaceum Cvi (Q7NRP5) (ADN) ATGCGCTCTATCGTCTGCAAAATGCTGTTCCCTTTGTTGCTGCTGTGGCAGCT GCCCGCCCTGGCCGCCACCGTGCTGGTGTTCGGCGACAGCCTGTCCGCCGGC TACGGCCTGGCCCCGGGCCAGGGATGGGCGGCGCTGCTGGCGCGCGACCTCT CGCCCCGGCACAAGGTGGTCAACGCCAGCGTGTCCGGCGAAACCAGCGCCGG CGGCCTGTCCAGGCTGCCCGACGCGCTCGCCCGCCACCAGCCCGACGTGCTG GTGCTGGAACTCGGCGCCAACGATGGCCTGCGCGGCCTGCCGATGGCTGACA TGAGGCGCAACCTGCAGCGGATGATAGACCTGGCCCAGGCGCGCAAGGCCA AGGTGCTGCTGGTGGGCATGGCGCTGCCACCCAACTATGGCCCCCGCTACGG CGCCGAGTTCCGCGCCGTTTATGACGATTTGGCCCGCCGCAACCGCCTGGCCT ACGTGCCGCTGCTGGTCGAGGGCTTCGCCGGCGACCTCGGCGCCTTCCAGCC CGACGGCCTGCATCCCCGCGCGGAGAAGCAGGCCACCATGATGCGCACGGTC AAGGCAAAACTGCCAGTGAAATAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:100) Chromobacterium violaceum Cvi (Q7NRP5) (Aminoácido) MRS C MLFPLLLLWQIJALAATVLWGDSLSAGYGLAPGQG AALLARDLSP RliKV ^ASVSGETSAGGLSRLPDALARHQPDVLVLELGANDGLRGLPMADMRR NLQRMTOLAQARKAKVLLVGMALPPNYGPRYGAEFRAVYDD ARRNRIAYVPL LVEGFAGDLGAFQPDGLHPP ^KQATMMRTVT AKLPVK (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:101) Vibrio vulnißcus Vvu (AA007232) (ADN) ATGTTTITCCG?,CTAGCGTCGCACACGC CCGAGAAAGTGTTAATTCTTGG CGACAGCCTAAGTGCAGGATACAACATGTCTGCAGAGCAGGCTTGGCCTAAT TTGTTACCAGAAGCATTGAATACATACGGAAAAAACGTAGAAGTGATCAACG CCAGTATCTCTGGAGACACAACCGGCAATGGACTATCTCGTCTGCCTGAGTTG TTAAAAACGCACTCACCAGACTGGGTGCTTATTGAGTTGGGTGCCAATGATG GCI GCGAGGTTTCCCGCATAAAGTGATCTC? CAAACCTTTCGCGAATGATT CAACTCAGTAAAGCCTCAGACGCTAAAGTCGCATTGATGCAAATTCGTGTAC CGCCGAACTATGGCAAGCGCTACACCGATGCATTTGTCGAACTCTACCCTACG CTTGCTGAACATCACCAAGTCCCGTTGCTCCCCITITTCTTAGAGGAAGTGAT CGTGAAACCGGAATGGATGATGCCTGATGGCTTACACCCAATGCCCGAAGCT CAGCC?TGGATCGCTCAATITGTTGCAAAAACGTTTTACAAACATCTCTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:102) Vibrio vulnificus Vvu (AA007232) (Aminoácido) Mr^LSSVAHATEKVL GDSLSAGYNMSAEQA PNLIJEAL TYGK ^v^VINASI SGDTTGNGLSRLPELLKTHSPD VLIELGAM5GLRGFPHKVISSNLSRMIQLSKAS DAKVA MQmWP?TroKRYTDAFVELYF^ PDGLHPMPEAQPWIAQFVAKTFYKHL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:103) Ralstonia eutropha Reu (ZP00166901) (ADN) ATGCCATTGACCGCGCCGTCTGAAGTCGATCCGCTGCAAATCCTGGTCTATGC CGATTCGCTTTCGTGGGGCATCGTGCCCGGCACCCGCCGGCGGCTTCCCTTCC CGGTTCGCTGGCCAGGCCGGCTCGAACTCGGCCTGAACGCCGACGGCGGCGC CCCGGTCCGCATCATCGAGGACTGCCTGAACGGCCGGCGCACCGTCTGGGAC GACCCATTCAAACCGGGCCGCAACGGCTTGCAAGGGCTGGCGCAGCGCATCG AGATCCATTCCCCGGTGGCGCTCGTGGTTTTGATGCTGGGCAACAACGATTTC CAGTCCATGCATCCGCACAACGCCTGGCATGCGGCACAGGGCGTCGGCGCGC TGGTCCACGCCATCCGGACGGCGCCGATCGAACCGGGAATGCCGGTGCCGCC GATCCTGGTGGTGGTGCCGCCGCCGATCCGCACGCCCTGCGGGCCGCTCGCG CCCAAGTTCGCCGGCGGCGAACACAAGTGGGCAGGCCTGCCCGAGGCGCTGC GCGAACTGTGCGCCACTGTCGACTGCTCGCTGTTCGATGCGGGTACCGTGATC CAGAGCAGTGCCGTCGACGGCGTACACCTTGACGCCGATGCCCATGTCGCCC TGGGCGATGCCCTGCAACCGGTCGTTCGTGCGCTGCTCGCCGAATCCTCGGG ACATCCCTCCTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:104) Ralstonia eutropha Rea (ZP00166901) (Aminoácido) MPLTAPSE? PLQILVYADSLSWGSWGTRRRLPFPVR PGRLELGLNADGGAPV Rp DCLNGRRTVWDDPF-O NGLQ^ -^AWHAAQGVGALVHARTAP-EPGMPWPILVVVPPPIRTPCGPLAPKFAGGEH KWAGLPEALRELCATVDCSLFDAGTVIQSSAVDGVHLDADAHVALGDALQPVV RALLAESSGHPS (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:105) Salmonella typhimurium Stm (AAC38796) (ADN) ATGACCCAAAAGCGTACCCTGCTAAAATACGGCATACTCTCGCTGGCGCTGG CCGCGCCATTATCTGCCTGTGCGTTTGACTCTCTTACGGTGATTGGCGATAGC CTTAGCGATACCGGTAATAACGGTCGCTGGACCTGGGATAGTGGTCAAAATA AGCTCTACGACGAACAGTTGGCCGAACGATATGGGCTGGAATTAAGCCCTTC CAGCAATGGCGGCTCTAATTATGCCGCCGGCGGCGCGACGGCGACCCCGGAA TTAAACCCGCAGGATAATACCGCGGATCAGGTACGGCAGTGGCTTGCCAAAA CGGGGGGAAAAGCCGACCACAACGGTTTGTATATTCACTGGGTCGGCGGAAA CGATCTGGCGGCGGCCATCGCGCAACCAACCATGGCACAGCAAATAGCCGGT AATAGCGCCACTAGCGCGGCGGCGCAGGTAGGGCTGTTACTGGATGCCGGCG CCGGGCTGGTCGTGGTGCCAAACGTACCGGATATTAGTGCGACGCCAATGCT TCTGGAGGCGGTAATCACCGCTGGGCTGGGCGCAGCGGCGCCCCCGGCGCTA AAAGCGGCGTTAGATGCGCTGGCGGAGGGCGCTACGCCCGATTTCGCCAGTC GGCAACAGGCGATCCGC AAGGCGCTGCTGGCGGCGGCTGCAACGGTAAGCA GCAATCCATTTATTCAGCAACTGCTCGTTGAACAACTGCTGGCGGGCTATGAA GCGGCGGCAGGGCAGGCGTCAGCTCTGACCGATTATTATAATCAGATGGAAG AGAAGGGGCTGGAGCAACACGGCGGCAATATAGCCCGTGCCGATATCAACG GCCTCTTTAAGGAAATTCTTGCCAACCCGCAGGCGTTTGGTCTGACAAATACC GTAGGTATGGCCTGCCCGCCTGGCGTATCCGCTTCGGCGTGCTCCTCGGCAAT GCCTGGATpAATGCGTCGCAGGACTATGTGTTTGCCGATCATTTACATCCCG GTCCGCAGGTCCATACCATTATTGCGCAATATATTCAGTCGATCATTGCCGCG CCGGTACAGGCGACATACCTGAACCAAAGCGTTCAGTCGATGGCGCAAGGCA GTCGTACCACGCTTGACAGCCGTTATCAGCAGCTTCGCCAGGGGGAAAATCC TGTTGGTTCGCTGGGCATGTTCGGCGGATACAGCGGGGGATATCAACGTTAT GATAATAATGAGGCCGACGGGAACGGTAATCATAATAATCTGACGGTTGGCG TCGATTATCAGCTTAACGAGCAGGTTCTGCTGGGAGGGCTGATAGCCGGTTCT CTGGATAAGCAACATCCTGACGATAATTATCGTTATGATGCCCGCGGTTTTCA GGCCGCCGTATTCAGCCATTTACGCGCCGGTCAGGCGTGGCTGGATAGCGAT TTACACTTTCTGTCCGCTAAATTCAGTAACATTCAGCGCAGTATAACGCTCGG TGCGCTAAGACGGGTGGAAGAGGGCGAAACCAACGGTCGGCTGTCGGGCGC GAGCTTAACCAGCGGTTATGATTTTGTCATGGTGCCGTGGTTAACGACCGGAC CGATGCTGCAATATGCATGGGATTACAGCCACGTTAATGGTTATAGCGAGAA GCTCAATACCAGTACATC TGCGTGGTGGTGACCAAAACGCCCATTCGCAG GTGGGTAGCGCGGGTTGGCGTCTGGATCTTCGCCACAGCATCATTCACTCCTG GGCGCAGATTAATTATCGCCGTCAGTTTGGCGATGATACGTATGTGGCGAAC GGCGGCCTTAAATCGACCGCGCTGACGTTTAGCCGCGACGGAAAAACGCAGG ATAAAAACTGGGTTGATATCGCGATGGGCGCAGATTTTCCGCTGTCGGCAAC GGTGTCCGCTTTCGCCGGGCTGTCGCAAACGGCAGGGTTAAGCGATGGCAAT CAAACCCGTTATAACGTTGGGTTTAGCGCCCGATTTTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:106) Salmonella typhimurium Sím (AAC38796) (Aminoácido) MTQKRTIiKYGILS ALAAPLSACAFDSLTVIGDSLSDTGNNGR TWDSGQNK YDEQLAERYGLEI5PSSNGGSNYAAGGATATPELWQDOTADQVRQ A TGG KADHNGLYIHWVGGlSroLAAAIAQPl AQQIAGNSATSAAAQVGLLLDAGAGLV VW1STV DISATPMLLEAV1TAGLGAAAPPALKAALDALAEGATPDFASRQQAIRK A LAAAATVSSNPFIQQLLVEQLLAGYEAAAGQASALTDYYNQMEEKGLEQHG G IARADINGLFKEI A3^QAFGLTNTVGMACPPGVSASACSSAMPGFNASQDYV FADHLHPGPQVH?TAQYIQS?AAPVQATYLNQSVQSMAQGSRTTLDSRYQQLRQ GENPVGSLGMFGGYSGGYQRYDISGNEADGNGNHN TVGVDYQLNEQVLLGGLI AGSI^KQHPDDNYRYDARGFQAAVFSHLRAGQAWLDSDLHFLSAKFSNIQRSGG LGALRRVEEGET GRLSGASLTSGYD??VMWWLTTGPMLQYAWDYSHVNGYSE K ISrrSTSMRFGDQNAHSQVGSAGWRLDLRHSimsWAQINYRRQFGDDtYVAN GGIJ STALTFSRDGKTQDK WV?IAIGADFPLSATVSAFAGLSQTAGLSDGNQTR YNVGFSARF (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:107) En total, se identifican nueve de las esterasas tipo "GDSL" nuevas en 6 bibliotecas metagenómicas en la biblioteca de esterasa/lipasa de BRAIN. Ocho de estos genes se expresan de manera heteróloga en E. coli y las enzimas resultantes se analizan para determinar actividad en los ensayos descritos en la presente. La caracterización de estas enzimas para actividad de perhidrolasa muestra que una presenta la actividad deseada. La segunda se predice que muestra esta actividad debido a la presencia de aminoácidos conservados entre este grupo de enzimas . La comparación de las secuencias de enzimas para los cuales la presencia o ausencia de la actividad de perhidrolasa deseada se determina llevó a la identificación de 19 posiciones de aminoácidos las cuales están conservadas entre las enzimas las cuales presentan la actividad de perhidrolasa deseada. Por lo tanto, se contempla que estos aminoácidos conservados sean esenciales para la reacción de perhidrolasa y/o sea una característica estructural de las enzimas de perhidrolasa. Uno de los motivos estructurales identificados ("G/ARTT") conservado entre las esterasas con la actividad de perhidrolasa deseada se utiliza para diseñar cebadores degenerados los cuales proporcionan el medio para enfocar el cribado en perhidrolasas verdaderas de entre las esterasas de tipo "GDSL" . En realidad, el uso de estos cebadores "G/ARTT" lleva a la identificación de enzimas con la actividad de perhidrolasa deseada a partir de metagenoma. No obstante, no se pretende que el uso del metagenoma esté limitado a algún método de ensayo particular. En realidad, se contempla que el metagenoma sea investigado al realizar ensayos para una actividad o actividades de enzima particular deseadas (por ejemplo, actividad de perhidrólisis y/o aciltransferasa (dependiente o independiente de cofactor) ) . Además, el cribado utilizando antisuero policlonal y/o monoclonal dirigido contra una proteína de interés encuentra uso en la presente invención. En modalidades adicionales, el metagenoma es investigado utilizando conjuntos de cebadores degenerados en base en la secuencia de la proteína de interés . Además , el conocimiento de las relaciones entre estructura y función de las perhidrolasas permite la investigación de estas enzimas en secuencias genómicas de microorganismos cultivables. De las 16 esterasas de tipo "GDSL" identificadas en diferentes aislados bacterianos, los genes correspondientes de las 10 enzimas se amplifican y se expresan de manera heteróloga, en E. coli . Las muestras de enzima resultantes de siete clones se analizan utilizando los ensayos descritos en la presente. De las cinco muestras caracterizadas hasta ahora, 4 enzimas en realidad muestran la actividad deseada y todos los resultados confirmaron la relación propuesta entre determinantes estructurales primarios y la función de las perhidrolasas. Por lo tanto, se establece una biblioteca de enzimas de 19 esterasas de tipo "GDSL" que comprende por lo menos 6 perhidrolasas con la actividad de perhidrolasa deseada. La relación identificada entre la estructura y función de las perhidrolasas proporciona una definición del espacio de secuencia utilizado por las enzimas con la actividad de perhidrolasa deseada. Se realizan comparaciones de las secuencias de proteína de las enzimas para las cuales la ausencia o presencia de la actividad de perhidrolasa deseada. Esto muestra una relación entre la presencia de ciertos aminoácidos y la capacidad de realizar reacciones de perhidrolasa. Este conocimiento se utiliza para identificar enzimas que contienen estos aminoácidos conservados en genomas secuenciados a partir de microorganismos cultivables . Se identifican las siguientes enzimas y se realizan experimentos para amplificar los genes a partir del ADN genómico de las cepas correspondientes utilizando cebadores específicos .
Tabla l. Esterasas tipo "GDSL" con un motivo "GRTT" a partir de aislados bacterianos Aislado Identificador Acrónimo Amplicón Vector de de proteína expresión Sinorhizobiu Smal993 Sme I si pLO_SmeI m meliloti Sinorhizobiu Q92XZ1 Sme II si pET26_SmeII m meliloti Sinorhizobiu Q9EV56 Sme III si pET26_SmeIII m melitoti Agrobacteriu Q9K2B1 Arh I no m rhizogenes Agrobacterium Q9 A6 Arh II no - rhizogenes Agrobacterium AAD02335 Atu III si pET26_AtuIII tumefaciens esorhizobium Q98MY5 Mío I si pET26_Mlo loti Mezorhizobium ZP_00197751 Mío II no loti Ralstonia Q8XQI0 Rso no solanacearum Ralstonia ZP_00166901 Reu si n.d. eutropha oraxella AAK53448 Mbo si pET26_Mbo bovis Burkholderia ZP_00216984 Bce no cepacia Chromobacteriu Q7NRP5 Cvi si pET26_Cvi m violaceum Pirellula sp. NP_865746 Psp n.d. n.d. Vibrio AA007232 Vvu si pET26 Vvu vulnificus Salmonella AAC38796 Sty si pET26 Sty typhimurium En los casos de A. rhizogenes , M. loti (enzima II) , R. solanacearum y B. cepacia no se pueden generar amplicón. Se considera que esto es debido probablemente a diferencias genéricas entre las cepas utilizadas en esta investigación y aquellas utilizadas para el secuenciado de los genes depositados en las bases de datos de dominio público. Una razón puede ser que los genes correspondientes se localizan sobre plásmidos los cuales no están presentes en las cepas utilizadas en esta investigación. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a algún mecanismo o teoría particulares . Los amplicones de todas las demás cepas se secuenciaron. En muchos casos existen diferencias entre la secuencia a partir de las bases de datos y la secuencia determinada durante el desarrollo de la presente invención. Mediante secuenciado, dos clones de amplificaciones independientes, las mutaciones introducidas por la polimerasa pueden ser casi excluidas . Las secuencias de los genes y las secuencias deducidas de aminoácidos de las esterasas tipo "GDSL" con un motivo "GRTT" o variaciones a partir de aislados bacterianos se proporcionan en lo siguiente: Sx a.1933 _Sinorhizobium meliloti (Sme I) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 88 y 89) Q32XZl_Sinorhizobium meliloti (Sme II) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 90 y 91) Q9EV56 _Sinorhizobium melitoti (Sme III) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 92 y 93) ?AD02335_Agrobacterium tumefaciens (Atu III) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 94 y 95) Q98MY5 _Mesorhizobium loti (Mío I) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 96 y 97) ZP_00166901_i?aI_?t?O a eutropha (Reu) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 104 y 105) AAK53448_-VO-ra.x-e.Z2a bovis (Mbo) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 98 y 99) Qll<¡R?>5_Chromobacterium violaceum (Cvi) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 100 y 101) ?A001232_Vibrio vulnificus (Vvu) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 102 y 103) AAC38796 _Salmonel la typhimurium (Stm) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 106 y 107) Q9KWBl_Agrobacterium rhizogenes (Arh I) MCHKGGEEMRSVLCYGDSNTHGQIPGGSPLDRYGPNERWPGVLRRELGSQWY VffiEGLSGRTTVRDDPEGTMKNGRTYLRPC PPSEVAMGIGC VYDIREL PGPGG PEIMV^APPPMI?DKEWEPIFSGAQEKS RIALEFE?ADSLEV?FFDAATVASCDPCDGFHINREAHEALGTALAREVEAIG R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:108) ATGATTTGCCATAAAGGTGGGGAGGAAATGCGGTCAGTCTTATGCTACGGCG ACTCGAATACGCACGGCCAGATTCCGGGGGGCTCACCGCTCGACCGATACGG GCCGAACGAGCGCTGGCCTGX?CGTTTTGAGACGGGAGCTTGGAAGCCAGTGG TATGTGATCGAGGAGGGCCTGAGTGGCCGCACGACGGTTCGCGACGATCCGA TCGAGGGCACGATGAAAAACGGCCGGACCTACCTGCGTCCGTGCCTCATGAG CCACGCGATCCTCGATCTCGTGATTATCATGCTCGGGACGAACGACCTGAAA GCGCGCTTCGGTCAACCGCCATCGGAAGTGGCGATGGGGATCGGCTGCCTCG TCTACGATATCAGGGAGCTGGCGCCCGGACCGGGCGGCAAGCCCCCCGAAAT CATGGTGGTTGCTCCGCCGCCGATGCTGGACGATATCAAGGAATGGGAACCC ATATITTCCGGCGCCCAGGAGA TCCCGGCGTCTCGCGCGTGAGTTTGAAAT TATTGCTGATTCGCTGGAAGTACACTTCTTTGACGCCGCGACCGTCGCATCGT GTGATCCTTGCGATGGTTTTCACATCAACCGGGAAGCGCATGAAGCCTTGGG AACAGCGCTTGCCAGGGAAGTGGAGGCGATCGGTTGGAGATGATGA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO.109) Q9KWA6_Agrobacteríum rhizogenes (Arh D) MAESRSILCFGDSLTWGWIPVPESSPTLRYPFEQR TGAMAAALGDGYS?EEGLS ARTTSVEDPNDPR NGSAYLPMAIASHLPLDLVTÍLLGTNDT SYFP?TPYEIA G MGI AGQVLTSAGGIGTPYPAPKLLIVSPPPLAPMPDPWFEGMFGGGYEKSLELA KQYKALANFXKVDFLDAGEFVKTDGCDG?HFSAETNRRLGHAIAAKVEAIFSQEA NAAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:110) ATGGCAGAGAGCCGCTCAATATTATGTTTTGGGGATTCACTCACATGGGGTTG GATTCCGGTACCGGAGTCGTCGCCGACGCTCAGATATCCCTTTGAGCAGCGCT GGACCGGTGCAATGGCTGCGGCACTCGGTGACGGCTATTCAATCATCGAGGA AGGCCTTTCCGCCCGCACGACCAGCGTCGAGGATCCGAACGATCCCAGGCTG AACGGCAGCGCCTACCTGCCGATGGCGCTCGCCAGCCATCTGCCGCTCGATC TCGTCATCATCCTTCTCGGCACCAACGACACCAAGTCCTATTTCCGCCGCACG CCCTATGAGATCGCCAACGGCATGGGCAAGCTTGCCGGACAGGTTCTGACCT CGGCCGGCGGGATCGGCACGCCCTACCCTGCCCCGAAGCTTCTGATCGTTTC GCCGCCGCCGCTCGCTCCCATGCCTGACCCGTGGTTCGAAGGCATGTTCGGTG GCGGTTACGAAAAGTCGCTCGAACTCGCAAAGCAGTACAAGGCGCTCGCCAA CTTCCTGAAGGTCGACTGCCTCGACGCCGGCGAGTTTGTAAAGACCGACGGC TGCGATGGAATCCATTTCTCCGCCGAGACGAACATCACGCTCGGCCATGCGA TCGCGGCG GGTCGAAGCGATTTTCTCACAAGAGGCGAAGAACGCTGCGGC TTAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N0:111) ZP_mi97751_Mesorhizobium loti (Mío H M TILCYGDSLTWGYDAVGPSRHAYEDRWPSVLQGRLGSSARVIAEGLCGRTTA FDDWVAGADRNGARIXPTLLATHSPLDLVT?^LGTNDME SFVCGRAIGAKQGME RIVQi GQPYSFNYK SILLVAPPPLCATENSDFAElFEGGMAESQ LAPLYAAL AQQTGCAFFDAGTVARTTPLDGIHI 5AENTRAIGAGLEPVVRQALGL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:112) ATGAAGACCATCCTTTGTTACGGTGACTCCCTCACTTGGGGCTATGATGCCGT CGGACCCATGAAGACCATCCITTGTTACGGTGACTCCCTCACTTGGGGCTATG ATGCCGTCGGACCCTCACGGCATGCTTATGAGGATCGATGGCCCTCCGTACTG CAAGGCCGCCTCGGTAGCAGTGCGCGGGTGATCGCCGAGGGGCTTTGCGGCC GCACAACTGCGTTTGACGACTGGGTCGCTGGTGCGGACCGGAACGGTGCGCG CATCCTGCCGACGCITCpTGCGACCCATTCACCGCriTGACCTCGTTATCGTCA TGCTCGGGACGAACGACATGAAATCGTTCGTTTGCGGGCGCGCTATCGGCGC CAAGCAGGGGATGGAGCGGATCGTCCAGATCATCCGCGGGCAGCCTTATTCC TTCAATTATAAGGTACCGTCGATTCTTCTCGTGGCGCCGCCGCCGCTGTGCGC TACCGAA CAGCGATTTCGCGGAAATTTTTGAAGGTGGCATGGCTGAATCG CAAAAGCTCGCGCCGCTTTATGCCGCGCTGGCCCAGCAAACCGGATGCGCCT TCTTCGATGCAGGCACTGTGGCCCGCACGACACCGCTCGACGGTATTCACCTC GATGCTGAAAACACGCGCGCCATTGGTGCCGGCCTGGAGCCGGTGGTCCGCC AAGCGCTTGGATTGTGA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:113) Q8XQ1 _Ralstonia solanacearum ( so) MQQILLYSDSLSWG?PGTRRRLPFAARWAGVMEHALQAQGHAVRGV?DCLNGR TTVLDDPARPGRNGUJGLAQRIEAHAPLALVT^^ VAQLVPVAIRQAPFFIPGMPWPVL WPAITAPAGAMADKFADAQPKCAGLAQAY PvATAOTLGCHWDANSVTPASRVDGfflLDADQHAQLGRAMAQVVGT LAQ (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:114) ATGCAACAGATCCTGCTCTATTCCGACTCGCTCTCCTGGGGCATCATCCCCGG CACCCGCCGGCGCCTGCCGTTCGCCGCCCGCTGGGCCGGGGTCATGGAACAC GCGCTGCAGGCGCAAGGGCACGCCGTGCGCATCGTCGAAGACTGCCTCAATG GACGCACCACGGTGCTCGACGATCCCGCGCGGCCGGGGCGCAACGGACTGCA GGGGCTCGCGCAGCGGATCGAAGCGCACGCCCCGCTTGCCCTGGTCATCCTG ATGCTCGGCACCAACGACTrCCAGGCGATCTTCCGGCACACCGCCCAGGACG CGGCGCAAGGCGTGGCGCAGCTGGTGCGGGCCATCCGCCAGGCGCCGATCGA ACCCGGCATGCCGGTGCCGCCCGTGCTGATCGTGGTGCCGCCGGCCATCACC GCGCCGGCCGGGGCGATGGCCGACAAGTTTGCCGACGCGCAGCCCAAGTGCG CCGGCCTTGCGCAGGCCTATCGGGCAACGGCGCAAACGCTAGGCTGCCACGT CTTCGATGCGAACAGCGTCACGCCGGCCAGCCGCGTGGACGGCATCCACCTC GATGCCGACCAGCATGCGCAGCTGGGCCGGGCGATGGCGCAGGTCGTCGGG ACGCTGCTTGCGCAATAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:115) ZP_00216984 Burkholderia cepacia (Bce) ATGACGATGACGCAGAAAACCGTGCTCTGCTACGGCGATTCGAACACGCATG GCACACGCCCGATGACGCATGCTGGCGGACTGGGGCGGTTTGCACGCGAAGA ACGCTGGACCGGCGTGCTGGCGCAAACGCTCGGTGCGAGCTGGCGGGTCATT GAAGAAGGGTTGCCCGCGCGTACGACCGTGCATGACGATCCGATCGAAGGCC GGCACAAGAATGGTTTGTCGTATCTGCGCGCGTGCGTCGAAAGCCACTTGCC CGTCGATGTCGTCGTGCTGATGCTCGGGACCAACGATCTGAAGACACGCTTCT CGGTCACGCCCGCCGACATCGCGACATCGGTCGGCGTATTGCTTGCCAAGAT CGCTGCGTGCGGCGCCGGTCCGTCCGGTGCGTCACCGAAGCTCGTGCTGATG GCGCCTGCGCCGATCGTCGAGGTCGGATTCCTCGGCGAGATCTTTGCGGGCG GCGCAGCGAAGTCGCGGCAGCTCGCGAAGCGGTACGAACAGGTGGCAAGCG ATGCCGGTGCGCACTTTCTCGATGCCGGCGCGATCGTCGAGGTGAGCCCGGT GGATGGCGTTCACTTCGCGGCCGATCAGCATCGTGTGCTCGGGCAGCGGGTC GCTGCCCTTCTGCAGCAGATTGCGTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N0:116) MT^QKTVTCYGDSNTHGTRPMT^ EEGLPARTTVTTODPFFIGRHKNGLSYLRACVESHLPVDVVVLMIXSTN^ TPADIATSVGVLLAKIAACGAGPSGASPKLVL APAPIVEVGFLGEIFAGGAAKSR QLAKRYEQVASDAGAHFLDAGAGV?VSPVDGVHFAADOHRVLGORVAALLQQI A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:117) P_865746 Pirellula sp (Psp) _vfflSIIIYGDSLSWGIffGTRR]^AFHQRWPGv7^]E^^ VI£DPKPGRNGIX^GLQQRIEINSPLSLv?LFLGTNDFQSv?EFHAEQSAQGLALL VDAmRSPFEPGMPTPKILLVAPPTVHHPKL^^ TEHSCEFFDAATVTT^SVVDGVHU->QEQHQALGTAILAST1AE]I \DC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:118) ATGCATTCAATCCTCATCTATGGCGATTCTCTCAGTTGGGGAATCATTCCCGG CACGCGTCGTCGCTTCGCGTTCCATCAGCGTTGGCCGGGCGTCATGGAGATTG AACTGCGACAAACTGGAATCGATGCCCGCGTCATCGAAGACTGCCTCAATGG CCGACGAACCGTCTTGGAAGATCCAATCAAACCCGGACGCAATGGCCTGGAT GGT TGCAGCAACGGATCGAAATCAATTCACCTCTGTCACTGGTCGTGCTCTT TCTGGGGACCAACGATTTCCAGTCCGTCCACGAATTCCATGCCGAGCAATCG GCACAAGGACTCGCACTGCTTGTCGACGCCATTCGTCGCTCCCCTTTCGAACC AGGAATGCCGACACCGAAAATCCTGCTTGTCGCACCACCGACGGTTCACCAC CCGAAACTTGATATGGCGGCGAAGTTCCAAAACGCGGAAACGAAATCGACG GGACTCGCAGATGCGATTCGCAAGGTCTCAACAGAACACTCCTGCGAATTCT TCGATGCGGCCACGGTCACCACAACAAGTGTCGTCGACGGAGTCCATCTCGA TCAAGAACAACATCAAGCACTCGGTACCGCACTGGCATCGACAATCGCTGAA ATACTAGCAGACTGTTGA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:119) Como se indica en lo anterior, las secuencias anteriores son las secuencias de proteína y las secuencias codificantes de las esterasas "tipo GDSL" con un motivo "GRTT" o motivos similares a partir de aislados bacterianos diferentes . Las secuencias de ADN representan el ADN obj etivo a partir del cual se deducen cebadores específicos. Todos los amplicones se ligan como fragmentos NdeX/XhoT a pET26 por lo que se elimina la secuencia líder pelB de este vector. La totalidad de las esterasas Ttipos GDSL" de los aislados se expresan en E. coli Rosetta (DE3) a 28 CC. La expresión se induce por adición de IPTG 100 µM a una D.O.SS0 = 1 y las células se cosechan durante 20 h después de inducción. Únicamente las células que expresan las enzimas de M. bovis y S. typhimurium se recolectan 4 h después de la inducción, dado que los experimentos previos han demostrado que la actividad más alta se puede obtener en este punto del tiempo. La Tabla 2 resume los experimentos de expresión.
Tabla 2 ( continuación) 1 proteína autotransportadora localizada en la membrana exterior 2 nivel de expresión: + sobreexpresión moderada; ++ sobreexpresión fuerte; +++ expresión muy fuerte, a juzgar por el análisis en SDS-PAGE 3 determinado por análisis SDS-PAGE 4 hacia butirato de / nitrofenilo 6 no determinado Con la excepción de la enzima de S. typhimurium, todas las demás enzimas probadas mostraron la actividad de perhidrolasa deseada, confirmando la relación entre la presencia de ciertos aminoácidos conservados y la capacidad para realizar reacciones de perhidrolasa. Aunque la enzima de S. typhimurium contiene el motivo GRTT, es diferente de otras enzimas por la ubicación de este motivo hacia el extremo 3 ' del bloque V. En todas las demás enzimas, este motivo se localiza entre el bloque I y III, lo que indica que puede tener una función diferente en la enzima a partir de S. typhimurium. Por lo tanto, la ausencia de actividad de perhidrolasa en la enzima de S. typhimurium también fundamenta la relación identificada entre estructura y función de las perhidrolasas proporcionadas por la presente invención. Cribado de esterasas "tipo GDSL" nuevas en bibliotecas metagenómicas i) Biblioteca S279 La secuencia de longitud completa del gen a partir del clon M75bA2 se completa, como se proporciona en lo siguiente. 1 tgggcggttt cgcggagtcg agcagggaga gatgctcctg ggtcgtacga gttggtacgg g r f r g v e q g e m l l g r t s w y 61 aggcatcgtt gaagatctca cgcctgcttg aatgcgcgcg gatatggaac ggaccggccg g g i v e d l t p a - r a d e r t g 121 cgctggcgat cggtgtcggc gtggggctgg cgagcctgag cccggtcgsg ctggcgacgc r a g d r s r r g a g e p e p g r a g d 181 cgccgcgggg saccgtgcsg gtgttcaccc gatcggggac agcctgacgg acgagtattt a a a g h r a g v h p i a d s i t d e y 241 tgagccgtts ttccagtggg ggttctgcgg gaagtcgtgg gccgagattt tggtggagac f e p f f q w g f c g k s w a e i I v e 301 ggggcgggcg agcatgggcc cgacggcgca gcaggcgggg atcagcgagc cggagggatg t g r a s g p t a q q a g i s e p e g 361 gtcggatccg cggaacacgg ggtatcagca caactgggcg cggtactcgt ggagctcctc w a d p r n t g g h n w a r y s w s s 421 agacgcgstg accgaggagt cgccgggggc gacgctgagc gtgctgcttg gggcggagta s d a l t e e s p g a t l s v i l g a e 481 cgcggtggtg ttcattggga ccaacgactt caatccgtcg tggccggcgt atcagagcgt y a v v f i s t a d f n p s w p a y q s 541 gtatctgagc sagtggagcg asgagsagat cgacacgtac gtgaacgggg tggtgcagaa v y l s q s d e q i d t y v n g v v q 601 catcgsgcag atggtggast cgctgaagtc ggtcggggsg aaggtggtgc ttgcgccgsc n i a q m v d s 1 k s v g a k v v l a p 661 ggtggatttt cagttcgcgg ggttcctgcg gaactcatgs ccggatccga tgctgcgsga p v d f q f a g f l r n s c p d p m l r 721 gcaggcgggt attctgacac ggaagtgcca cgaccgggtg cggtsgatgg cgcggcagaa e q a g i t r k c h d r v r s m a r q 7B1 gcacgtggtg ttcgtggaca tgtggcggst gaaccgcgat ttgttcggca acgggttcgc k h v v f v d m w r l n r d l f g p g f 841 gatcagctac ggccttcgga acacggtgcg cgfcgggggas tcggagatcg ggctgcaact a i s y g l r n t v r v g d s e i g l q 901 ggccgggctg acgggatcgg cggggctggt tccggacggg atccatccgc agcgggtggt l a g l t g s a g í v p d s i h p q r v 961 gcaggggatc tgggcgaatg cgttcatcgt gggtctgaac gcgcatgggg cgaacatcgc v q g i w a n a f i g l a h g n i 1021 gcccatcggc gaggcggaga tgtgcgcgat ggggggggtc gtgtacgggg gaacggacac a p i g e a e m e a m g g v v y g g t 'd 1081 gctggcgaac ttcctgcsgc cggtcgcggg ctacgtggag gacttccgca acgcggggga t l a n f l p p v a g y v e d f r n a g 1141 cttcgtgtgc acggcggast tcaaccatga ccttggcgtg acgccgacgg acatcttcgc d f v s t a d f n h d l g v t p t d i f 1201 gtteatcaac gcgtggttca tgaatgatcc ctcggsgcgg atgagcaacc cggagcacac a f i n a f m n d p s a r ra s n p e h 1261 gcagatcgag gacatetteg tgtttctgaa tctgtggctg gtggggtgst gaggcagagt t q i e d i f v f l n 1 w 1 v g c - g r 1321 gggaaggggg tcagcccact tcgcgcgtct ggaagaggat gacggcgacg gagaggaaga v g r g s a h f a r l e e d d g d g e e En la secuencia de S279_M75bA2 proporcionada en lo anterior (ADN, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 80; y secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 81), la secuencia codificante corre desde la posición 104 a la 1312 y se muestra con un fondo gris. Los motivos estructurales conservados se muestran subrayados y en negrillas. La secuencia derivada de aminoácidos muestra la homología mas grande con una proteína hipotética (Y17D7A.2) de Caenorhabdi tis elegans (BlastP2; swiss'pir), aunque con un valor E muy elevado, de 2.5 (es decir, que indica un acierto no confiable) . El hecho de que no exista esterasa entre las proteínas homologas identificadas por el análisis BlastP2 indica que esta enzima es más bien una esterasa de "tipo GDSL" poco común. Además, la enzima está caracterizada por péptidos inusualmente largos entre la parte N terminal y el motivo "GDSL" así como el motivo "DXXH" del bloque V (que contiene el sitio activo ácido aspártico e histidina) y la parte C terminal. La secuencia que está muy en la parte C terminal muestra similitud con un sitio de unión de lípido y lipoproteína de membrana. No se identifica una secuencia de señal correspondiente de lipoproteínas . El gen que codifica para M75bA5 se amplifica pero no se realizan esfuerzos adicionales para esta enzima dado que no tiene los aminoácidos conservados típicos de la perhidrolasa de la presente invención. ii) Biblioteca S248 El clon que presenta la etiqueta de secuencia SP7_3j5h, el cual puede haber sido parte de un gen que codifica para una esterasa de tipo "GDSL" se identifica (M31bAll) y se alarga la secuencia. Esto facilita la determinación de que esta secuencia no codifica para una esterasa de "tipo GDSL", debido a que no se puede identificar el bloque V. La generación de este amplicón se puede explicar por una hibridación "inespecífica" , del cebador 5h con los primeros malos pareamientos en los nucleótidos 10, 14 y 15 de la parte 3' terminal del cebador. La secuencia muestra la homología más grande a una proteína hipotética (K03E5.5) a partir de Caenorhabditis elegans con un valor E de 1.6, lo que indica un acierto no confiable. Se proporciona en lo siguiente la etiqueta de secuencia del clon S248_M31bAll. 1 cggaattatc atgctgggtt ttaatgacca gcgcgagagg atsaacgaca acctcgatta r n y h a g f - -' p a r e d q r q p r l g i i m 1 s £ n d q r e r i' n d n l d e l s c w v l m t s a r g s t t t s i 61 ctgggasgcc taccactccg tcctgggcga gagacagttt tattccggca attccaagat l g r l p l r p g r e t v l f r q f q d y w d a y h s v l g e r q- f y s g n s k t g t p t t p s a r d s f i p a i p r 121 gttcgtcccc atcaccaaga tcgcggtgaa ggcgcgcaag acccggttca ccaatcagat v r p ' q d r g e g a q d p v h q s d m f v p i t k i a v k a r k t r f t n q c s s p s p r s r - r r a r p g s p i r •4 o— oc-c-a 181 ttttcctcag tccggccgca acgtcgatgt caccaccacg gacggcacac tsccccacgc f s s v r p q r r c h h g r h t p p r" i f p q s g r n v d v t t t d a t 1 p h f f l s p a a t s m s p p r t a h ' s 'p' t ooo_co_cco 241 caccatgtcc ctggtcgagc actacatscg ggcctgccgc ctgcgcaccc agatcgttcc h h v ' p g r a l p g l p p a p d r s a t m s l v e h y i r a e r l r t q i v p p c p s s t t s g p a a c a p r- s f 301 ggccctgatc gttaasggcg attgcgaagg catgtacagc atctatgtsg gctggtcgaa g p d r - r r l r r h v q h l c r l v e p a l i v n g d e e g m y s i y v g w s r p - s i t a i a k a s t a s s a g r 361 aaccascaag catgttgttt cacgtgaaac aaagccggtc gaaagcgacg gcatggaatt n h q a c c f t - n k a g r k r r h g i k t t k v v s r e t k p v e s d g m e k p p s m l f h v k q s r s k a t a n 421 tcccgaactg ggcgaagccg acgacatcao cgaagaaacg.cttgagtgtg gccttcccga s r t g r s r r h r r n a - v p s r f p e l g T a d d i t e e t l e e g l p f p n w a k p t t s p k k r l s v a f p 481 categaattg atctcggacg ccgatcttct cgtccttcca csagcgscga caacattcca h r i d l g r r s s r p s t s a d n i p d i e l i s d a d l l v l p p a p t t f t s n - s r t p i f s s f h q r r q s 541 aggcgcttga gatgggcggg ttcggtcacg atcttgcgcc gtggacaagg gcaaggtccg r r l r a g s v t i l r r g q- g q g p q g a - d g r v r s r s c a v d k g k v k a l e pi g g f g h d í a p w t r a r s 601 cagatgatcg acgaggcgcg ateacegaga tgccgcgacg atctgtcgac gctatgtcac q -m i d e a r s p r c r d d l s t l c h r r - s t r r d h r d a a t i c r r y v a d d r r g a i t e m p r r s v d a m s 661 cagcgcatgt ccgacggtgg aatgcaagac aggtnggntn gatcgggg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:I20) q r m s d g g ia q d r ? ? ? s gfsEcuENciA DE IDENTIFICACIÓN NO:121) S a C p V ß c k t g ? ? d r (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:122) p a h v r r w n a r q ? ? ? i g (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:123) En la secuencia-etiqueta anterior del clon S248_M31bAll, los cebadores 3j y 5h están indicados. La hibridación entre el cebador y la plantilla se indica por flechas, los malos pareamientos por círculos blancos. Los motivos estructurales conservados putativos están indicados en negrillas y subrayados. Se generan varias etiquetas de secuencia adicionales utilizando los pares de cebadores diferentes de los cebadores 2 y 5 pero ninguno cambia a codificar una esterasa de tipo "GDSL" . El cribado de esta biblioteca se completa. iii) Biblioteca M091 La elongación de amplicón SP3__lj5h el cual se identifica en el inserto-ADN del clon M24dG12 demuestra que la secuencia codificante correspondiente no codifica para una esterasa tipo "GDSL" . Aunque se encuentra una secuencia que codifica para un bloque putativo V (DGTHP; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 124), se pierde la secuencia correspondiente que codifica para el bloque I. El amplicón se genera debido a una hibridación "inespecífica" del cebador Ij con los primeros malos pareamientos en las posiciones 5, 10, 11 y 12 de la parte 3' terminal del cebador. La secuencia-etiqueta del clon M091_M24dG12 se muestra a continuación: 1 gcctgatggc ttcgagttcg tcgaattcac ctcgccccag cccggcgtgc tggaggcggt a - I r v r r i h l a p a r r a g g g p d g f e f v e f t s p q p g v l e a l m a s s s s n s p r p s p a c r r 61 gtttgaaaag ctgggtttca ccctggtcgc caagcaccgg tcsaaggatg tggtgctgta v - k a g f p g r q a p v q g c g a v v f e k l g f t l v a k r s k d .v v l c l k s w v s . p w s p s t g p r m w c c 121 ccgccagaas ggcatcaact tcatcctgaa ccgcgagccc cacagccagg ccgcctactt p p e r h q' l h p e p r a p q p g r l l y r q n g i n f i l n r e p h s q a a y t a r t a s t s s - t a s p t a r p p t 181 tggtgccgag catggcccct ccgcctgtgg cctggccttc cgtgtgaagg atgsgcataa w c r a p l r l w p g l p e e g c a - f g a e h g p s a c g l a f r v k d a h I v p s m a p p p v a p s v - r m r i 241 ggcttataac cgcgcgctgg aactgggcgc ccagcccatc gagatcccca ccggecccat g l - p r a g t g r p a h r d p r p h k a y n r a l e l g a q p i . e i p t g p r l i t a r w n a p s p s r s p p a p 301 ggaactgcgc ctgcccgcca tcaagggcat tggcggcgcc gcctctgtat ttgatcgacc g t a p a r q g h r r r l c i - s t m e l r l p a i k g i g g a a s v f d r n c a c p p s r a l a a p p l y l i d 361 gctttgaaga cggcaagtsc atetaegaca tegaettega gttcatcgaa ggcgtggacc a l k t a s p s t t s t s s s s k a w t p l - r r q v h l r "h r l r v h. r r r g r f e d g s i y d i d f e f i e g v d 421 gccgccccgc ggggcatggc ctgaacgaga tcgatcacct cacgcacaac gtgtacoggg a a p r g m a - t r s i t s r t t s t g p p p r g a w p e r -d r s p a q r v p r r p a g q 1 n a i d l t h n v y r 481 gccgcatggg cttctgggcc aacttctacg aaaagctgtt caacttccgc gaaatccgct a a w a s g p t s t k s c s t s a k s a g p g l l g q l l r k a v q l p r n p g r ra g f a n f y e k l f n f r e i r 541 acttcgacat ccagggcgaa tacacgggcc tgacctccaa ggccatgacc gcgcccgacg t s t s r a n t r a - p p r p - p r p t l l r h p g r i g p d l q g h d r a r y f d i q g e y t g l t s k a m t a p d 601 gcaagattcg catcccgctg aacgaagagt ccaagcaggg cggcggccag ategaagaat a r f a s r - t k s p s r a a a r s k n r q d s h p a ß r r v q a g r r p d r r g k i r i p l n e e s k q g g g q i e e 661 ttttgatgca attcaacggc gagggcattc agcacatcgc gctgatctgc gacaacctge f - c n s t a r a f s t s • r ~ s a t t c i f d a i q r r g s a r a d l r q f l m q f n g e g i q h i - a l i c . d n 'l ' 721 tggacgtggt ggacaagctg ggcatggccg gcgtgcagct ggccaccgcg cccaacgagg t .. t s w a p a c s w p p r p t r a g r g g q a g h g r r a a g h r a q r l d v v d k l g m a g v q l a t a p n e 781 tctattacga aatgctggae acccgcctgc ccggccacgg ccagccggtg cccgagctgc s i t k c t p a c p a t a s ' r c p s c g l l r n a g h p p -a r p r p a g a r a v y y e m l d t r l p g h g q p v p e í • o-co-o o-o 841 agtcgcgcgg catcttgctg gacggcacca cggccgacgg cacgcacccg cctgctagct s r a a s e w t a p r p t a r t r i l a a v a r l a g r h g r r h a p a c - q s r g i l í d g t t a d a fc h P p a s ooo-o 901 tsagatcttc tccacgccca tgctgggccc ggtgttcttc gaatteatec agcgcgaggg s d l l a a g p g v l r i h p a r g l q i f s t p m l g p v f f" e f i q re f r s s p r p c w a r e s s n s s s a r 961 cgactaccgc gasggctttg gcgaaggcaa cttcaaggcg ctgttcgagt cgctggaacg r l p r r l w r r q l q g a v g t g d y r d g f g e g n f k a l f e s l e a t t a t a l a k a t s r r s s s r w n 1021 cgaccagatc cgccgtggtg tgctgaacac ataagacatc agacatccag ggttaaccct r p d p p w c a e h i r h q t s r v n p r d q i r r g v l n t - d i r h p g l t a t r s a v v c - t h k t s d i q g - p 1081 gcacaggtgc ctatactgcg cgctccccgg aactcaaaag gatcccgatg tcgctccgta a q v p i l r a p r n s k g s r c r s v I h r c l y c a l p g t q k d p d v a p c t g a y t a r s p e l k r i p m s l r 1141 gcaccctgtt cagcaccctt ttggccggcg cagccactgt cgcgctggcg cagaacccgt a p c s a p f w p a q p l s r w r r t r - h p v q h p f g r r s c r a g a e p s t l f s t l l a g a a t v a l a q n p 1201 ctgcccgctc acatcg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:125) 1 p a h i (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:126) V c p 1 t s (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:127) s a r s h (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:128) La secuencia-etiqueta del clon M091_M24dG12. Los cebadores Ij y 5h se indican en la secuencia-etiqueta anterior del clon M091_M24dG12. La hibridación entre el cebador y la plantilla se indica por flechas, los malos-pareamientos por círculos blancos . Los motivos estructurales conservados putativos se muestran en negrilla y subrayados . Se genera una secuencia-etiqueta adicional (SPl_2b5h) con el par cebador 2b/5h. Un análisis BlastX de la secuencia de esta etiqueta presenta la homología más grande a una arilesterasa de Agrobacterium tumefaciens con 70% de identidad. Se identifica el clon único que presenta el gen correspondiente (M4aEll) y la secuencia de longitud completa se determina como se muestra en lo siguiente: 1 atgaagacca ttctcgccta tggcgacagc ctgacctatg gggccaaccc gatcccgggc m k t i 1 a y a d s 1 t y g a n p i p g 61 gggccgcggc atgcctatga ggatcgctgg cccacggcgc tggagcaggg gctgggcggc g p r h a y e d r p t a l e q g l g g 121 aaggcgcggg tgattgccga ggggctgggt ggtcgcacca cggtgcatga cgactggttt k a r v i a e g l g o- r . t v h d d w f 181 gcgaatgcgg acaggaacgg tgcgcgggtg ctgccgacgc tgctcgagag ccattcgccg a n a d r n g a r v l p t l i e s h s p 241 ctcgacctga tcgtcatcat gctcggcacc aacgacatca agccgcatca cgggcggacg l d l i v i m i q t n d i k p h h g r t 301 gccggcgagg ecgggcgggg catggcgcgg ctggtgcaga tcatccgcgg gcactatgcc a g e a g r g m a r l v q i i r g y a 361 ggccgcatgc aggacgagcc gcagatcatc ctcgtgtcgc cgccgscgat catcctcggc g r m q d e p q i i l v s P P P i i l g 421 gactgggcgg acatgatgga ccatttcggc ccgcacgaag cgatcgccac ctcggtggat d w a d m m d h f g p h e a i a t s v d 481 ttcgctcgcg agtacaagaa gcgggcsgac gagcagaagg tgcatttctt cgacgccggc f a r e y k k r a d e q k v h f f d a g 541 acggtggcga cgaccagcaa ggccgatggc atccacctcg acceggccaa tacgcgcgcc t v a t t s k a d i h 1 d p a n t r a 601 atcggggcag ggctggtgcc gctggtgaag caggtgctcg gcctgtaa (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:12Ü) j_ g a s l P l q l g l - (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:130) En la secuencia anterior, los motivos estructurales conservados se muestran en negrillas y subrayados. El análisis BlastP con la secuencia de longitud completa deducida de aminoácidos identificó el mismo acierto con una identidad de 48%. La estructura primaria de esta enzima muestra que el motivo "GRTT" demuestra la utilidad de los cebadores dirigidos hacia el bloque 2 para la identificación de las esterasas "GRTT" . El gen se amplifica para introducir sitios de reconocimiento de enzima de restricción únicos y la ausencia de segundas mutaciones de sitio se confirma por secuenciado. El gen se liga a pET26 y se expresa en E. coli Rosetta (DE3) . El mapa de vector se proporciona en la figura 5. Las cepas de expresión y control se cultivan en LB en presencia de 25 µg/ml de canamicina, 12.5 µg/ml de cloramfenicol y glucosa 1%. A una DOS80, la expresión se induce por adición de IPTG 100 µM. Se toman muestras a las 2, 4 y 20 horas y después de la inducción. Las células se separan del sobrenadante de cultivo por centrifugación y después de resuspender en un amortiguador de muestra, se incuban durante 10 minutos a 90 °C. Una cantidad de células que representan una DOS80 de 0.1 se aplica a un gel de gradiente de acrilamida 4-12%, el cual se tiñe con Coommassie Brilliant Blue. La sobreexpresión fuerte del gen se detecta de antemano 2 h después de la inducción con IPTG 100 µM, determinado por análisis SDS-PAGE de los extractos celulares crudos a partir de E. coli Rosetta (DE3) pET26_M4aEll . La cantidad de la proteína que representa M4aEll (tamaño calculado de 23.2 kDa) se incrementa adicionalmente con el tiempo . Se determina la actividad de esterasa de los extractos celulares crudos a partir de cepas que expresan la esterasa tipo "GDSL" M4aEll. Una cantidad de células que corresponde a una D.O.S80 = 2 se resuspende en 200 µl de Tris/HCl 5 mM, pH 8.0 y se lisa por ultrasonicado. Después se utilizan 20 µl de cada muestra para determinar la actividad de esterasa hacia butirato de p-nitrofenilo en un volumen de 200 µl . Se corrige la actividad para la actividad de fondo de la cepa control. La actividad hacia butirato de p-nitrofenilo alcanza aproximadamente 125 nmol/ml x min, 20 h después de la inducción. Además, se lleva a cabo el análisis SDS-PAGE de la fracción soluble e insoluble de extractos celulares crudos de E. coli Rosetta (DE3) pET26_M4aEll . Las células de un cultivo' inducido con IPTG 100 µM y cosechado 4 h y 20 h después de la inducción se lisa por ultrasonicado y se separa en una fracción soluble e insoluble por centrifugación. Se agrega el amortiguador de muestra y se aplican cantidades directamente comparables de fracciones soluble e insoluble a un gel en gradiente de acrilamida 4-12%, el cual se tiñe con Coommassie Brilliant Blue R250. Los resultados de este análisis de la solubilidad muestran que M4aEll es parcialmente soluble (calculado, 80%) . Se completa el cribado de la biblioteca M091. De esta manera, en total se identifican nueve esterasas diferentes tipo "GDSL" en 6 bibliotecas metagenómicas de insertos grandes diferentes y la biblioteca BRAIN de esterasas/lipasas que comprenden más de 4.3 Gbp. Ocho de estos genes se expresan de manera heteróloga en E. coli . Las muestras de enzimas resultantes de siete clones se caracterizan para determinar la actividad deseada de perhidrolasas. Dos de las enzimas presentan esta actividad. La Tabla 3 resume el cribado, expresión y caracterización de las esterasas tipo "GDSL" metagenómicas. 1 identidad con la enzima prototipo a partir de M. smegmatis calculado con el algoritmo dialign (Morgenstern et al . , 1996) 2 nivel de expresión: + sobreexpresión moderada; ++ sobreexpresión fuerte; +++ sobreexpresión muy fuerte determinada por análisis SDS-PAGE 3 determinado por análisis SDS-PAGE 4 hacia butirato de p-nitrofenilo; administrado como nmol/ml x min) 5 no determinado 6 actividad de perhidróisis 2x fondo 7 actividad de perhidrolasa mayor de 2x fondo Alteración de la perhidrolasa En base en la estructura de la perhidrolasa, se identifican residuos los cuales pueden alterar la especificidad de sustrato (por ejemplo Km, kcat, Vmax, longitud de cadena, etc.) o la naturaleza multimérica de la proteína. No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a algunos de los residuos particulares. No obstante, se construyen bibliotecas de saturación de sitio de los residuos DIO, L12, T13, W14, 16, S54, A55, N94, K97, Y99, P146, 149, F150, 1194, F196 así como bibliotecas de combinación de residuos: E51A, Y73A, H81D, T127Q y mutaciones sencillas de los residuos de sitios activos D192A, H195A y una biblioteca de saturación de sitio de la D95 conservada. Los métodos para producción de tales bibliotecas se conocen por aquellos expertos en la técnica e incluyen equipos disponibles comercialmente en el equipo de mutagénesis dirigida al sitio Stratagene Quikchange1^ y/o el equipo de mutagénesis dirigida a sitios múltiples Quikchange™1.
Actividad de perhidrolasa El uso de enzimas que se obtienen de microorganismos se ha realizado durante mucho tiempo. En realidad, existen numerosos biocatalizadores conocidos en la técnica. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,240,835 (incorporada en la presente como referencia) proporciona una descripción de la actividad transacilasa que se obtiene de C. oxydans y su producción. Además, la patente de E.U.A. No. 3,823,070 (incorporada en la presente como referencia) proporciona una descripción de una Corynebacteríum que produce ciertos ácidos grasos a partir de una n-parafina. La patente de E.U.A. No. 4,594,324 (incorporado en la presente como referencia) proporciona una descripción de Methylcoccus capsulatus que oxida alquenos . Se conocen en la técnica biocatalizadores adicionales (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,008,125 y 4,415,657; ambas incorporadas en la presente como referencia) . El documento EP 0 280 232 describe el uso de una enzima de C. oxydans en una reacción entre un diol y un éster de ácido acético para producir monoacetato. Las referencias adicionales describen el uso de una enzima de C. oxydans para producir un ácido hidrocarboxílico quiral a partir de un diol proquiral . Los detalles adicionales respecto a la actividad de la transacilasa de C. oxydans así como el cultivo de C. oxydans, la preparación y purificación de la enzima se proporcionan por la patente de E.U.A. No. 5,240,835 (incorporada como referencia como se indica en lo anterior) . Por lo tanto, se conocen las capacidades de transesterificación de esta enzima, utilizando principalmente esteres de ácido acético. No obstante, la determinación de que esta enzima pueda llevar a cabo una reacción de perhidrólisis resulta inesperada. Incluso ha sido más sorprendente que estas enzimas presenten eficiencias muy grandes en reacciones de perhidrólisis. Por ejemplo, en presencia de tributirina y agua, la enzima actúa para producir ácido butírico mientras que en presencia de tributirina, agua y peróxido de hidrógeno, la enzima actúa para producir en mayor parte ácido peracético y muy poco ácido butírico. Esta proporción alta de perhidrólisis respecto a hidrólisis es una propiedad única presentada por la clase perhidrolasa de enzimas de la presente invención y es una característica única ' que no se presenta por las lipasas, cutinásas o esterasas descritas previamente. La perhidrolasa de la presente invención es activa sobre un intervalo amplio de pH y temperatura acepta una gama amplia de sustratos para transferencia acilo. Los aceptores incluyen agua (hidrólisis) , peróxido de hidrógeno (perhidrólisis) y alcoholes (transferencia clásica de acilo) .
Para mediciones de perhidrólisis, la enzima se incuba en un amortiguador de elección a una temperatura especificada con un sustrato éster en presencia de peróxido de hidrógeno. Los sustratos típicos utilizados para medir perhidrólisis incluyen esteres tales como acetato de etilo, triacetina, tributirina, esteres de acetato de neodol etoxilado y otros. Además, la enzima natural hidroliza nitrofenilésteres de ácidos de cadena corta. Estos últimos son sustratos convenientes para medir la concentración de la enzima. El perácido y ácido acético se pueden medir por los ensayos que se describen en la presente. También se describe la hidrólisis de nitrofeniléste . Aunque el ejemplo primario utilizado durante el desarrollo de la presente invención es la perhidrolasa de M. smegmatis, cualquier perhidrolasa que se obtenga de cualquier fuente la cual convierta el éster en principalmente perácidos en presencia de peróxido de hidrógeno, encuentra uso en la presente invención.
Sustratos En algunas modalidades preferidas de la presente invención, los esteres que comprenden ácidos carboxílicos alifáticos y/o aromáticos y alcoholes, se utilizan con las enzimas perhidrolasa de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, los sustratos se seleccionan de uno o más de los siguientes: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. En modalidades adicionales, triacetina, tributirina, esteres de neodol y/o esteres de neodol etoxilados sirven como donadores acilo para formación de perácido.
Formulaciones limpiadoras y detergentes Las composiciones detergentes de la presente invención se proporcionan en cualquier forma adecuada que incluye, por ejemplo, como un diluyente líquido, en granulos, en emulsiones, en geles y en pastas. Cuando se utiliza una composición detergente sólida, el detergente preferiblemente se formula como granulos. Preferiblemente, los granulos se formulan para contener adicionalmente un agente protector (véase, por ejemplo, la solicitud de E.U.A. No. de Serie 07/642,669 presentada el 17 de enero de 1991, incorporada en la presente como referencia) . De igual manera, en algunas modalidades, los granulos se formulan de manera que contienen materiales para reducir la velocidad de disolución del granulo en el medio de lavado (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,254,283, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . Además, las enzimas perhidrolasa de la presente invención encuentran uso en formulaciones en las cuales el sustrato y la enzima están presentes en el mismo granulo.
Así, en algunas modalidades, se incrementa la eficacia de la enzima por el suministro de concentraciones locales elevadas de enzima y sustrato (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de E.U.A. US2003/0191033 , incorporada en la presente como referencia) . Muchas de las variantes de proteína de la presente invención son útiles para formular diversas composiciones detergentes . Muchos de los compuestos conocidos son tensioactivos adecuados útiles en composiciones que comprenden los mutantes de proteína de la invención. Estas incluyen detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, aniónicos o zwiteriónicos (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,404,128 y 4,261,868). Una formulación detergente adecuada es la que se describe en la patente de E.U.A. No. 5,204,015 (incorporada previamente como referencia) . Los expertos en la técnica están familiarizados con las diferentes formulaciones las cuales encuentran uso como composiciones limpiadoras. Como se indica en lo anterior, en algunas modalidades preferidas, las composiciones detergentes de la presente invención utilizan un agente con actividad de superficie (es decir, tensioactivos) que incluyen tensioactivos aniónicos, no iónicos y anfolíticos bien conocidos por su uso, en composiciones detergentes. Algunos tensioactivos adecuados para uso en la presente invención se describen en la solicitud de patente británica No. 2 094 826 A, incorporada en 'la presente como referencia. En algunas modalidades, se utilizan mezclas de tensioactivos en la presente invención. Los tensioactivos aniónicos adecuados para uso en la composición detergente de la presente invención incluyen alquilbencensulfonatos lineales o ramificados; alquil o alqueniléter sulfatos que tienen grupos alquilo o grupos alquenilo lineales o ramificados; sulfatos de alquilo o alquenilo; sulfonatos de olefina; sulfonatos de alcano y similares. Los contraiones adecuados para tensioactivos aniónicos incluyen iones de metal alcalino tal como sodio y potasio; iones de metal alcalinotérreo tal como calcio y magnesio; ion amonio y alcanolaminas que tienen 1 a 3 grupos alcanol de número de carbono 2 ó 3. Los tensioactivos anfolíticos que encuentran uso en la presente invención incluyen sulfonatos de sal de amonio cuaternario, tensioactivos anfolíticos de tipo betaína y similares. Tales tensioactivos anfolíticos tienen grupos cargados positivos y negativos en la misma molécula. Los tensioactivos no iónicos que encuentran uso en la presente invención generalmente comprenden polioxialquileno éteres así como alcanolamidas de ácido graso superior o un aducto de óxido de alquileno de los mismos, monoésteres de glicerina de ácido graso y similares. En algunas modalidades preferidas, el tensioactivo o mezcla tensioactiva incluida en las composiciones detergentes de la presente invención se proporcionan en una cantidad desde aproximadamente 1 por ciento en peso a aproximadamente 95 por ciento en peso de la composición detergente total y preferiblemente de aproximadamente 5 por ciento a aproximadamente 45 por ciento en " peso de la composición detergente total. En varias modalidades, se incluyen muchos otros componentes en las composiciones en la presente invención. Muchas de estas se describen en lo siguiente. No se pretende que la presente invención esté limitada a estos ejemplos específicos. En realidad, se contempla que los compuestos adicionales encontrarán uso en la presente invención. Las descripciones siguientes simplemente ilustran algunos componentes opcionales . Las proteínas, particularmente la perhidrolasa de la presente invención se pueden formular en detergentes conocidos pulverizados y líquidos que tienen un pH entre 3 y 12.0, a concentraciones de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 5% (de manera preferible 0.1% a 0.5%) en peso. En algunas modalidades, estas composiciones limpiadoras detergentes incluyen además otras enzimas tales como proteasas, amilasas, mananasas , peroxidasas, óxidorreductasas , celulasas, lipasas, cutinasas, pectinasas, pectina liasas, xilanasas y/o endoglicosidasas así como mejoradores de detergencia y estabilizantes.
Además de las composiciones limpiadoras típicas, se entiende fácilmente que las variantes de perhidrolasa de la presente invención encuentran uso en cualquier propósito en donde se utilice la enzima nativa o natural. De esta manera, dichas variantes se pueden utilizar, por ejemplo, en algunas aplicaciones de jabón en barra y líquido, formulaciones para el cuidado de trastes, aplicaciones limpiadoras de superficies, soluciones o productos limpiadores de lentes de contacto, tratamiento de desperdicios, aplicaciones textiles, blanqueadores de pulpa, desinfectantes, cuidado de la piel, cuidado bucal, cuidado del pelo, etc. En realidad, no se pretende que algunas de las variantes de la perhidrolasa de la presente invención esté limitada a algún uso particular. Por ejemplo, las perhidrolasas variantes de la presente invención pueden comprender, además de alergenicidad disminuida un desempeño mejorado en una composición detergente (en comparación con una perhidrolasa natural o no modificada) . La adición de proteínas a composiciones limpiadoras convencionales no genera una ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuado para detergente también es adecuado para las presentes composiciones en la medida en que el pH esté dentro del intervalo en el cual una o varias de las enzimas sean activas y la temperatura está por debajo de la temperatura de desnaturalización descrita para la proteína. Además, las proteínas de la invención encuentran uso en composiciones limpiadoras, blanqueadores y desinfectantes sin detergentes, nuevamente solas o combinadas con una fuente de peróxido de hidrógeno, un sustrato éster (ya sea agregado o inherente al sistema utilizado, por ejemplo con manchas que contienen esteres, pulpa que contiene esteres, etc.), otras enzimas, tensioactivos, mej oradores de detergencia, estabilizantes, etc. En realidad, no se pretende que la presente invención esté limitada a alguna formulación o aplicación particular.
Sustratos En algunas modalidades preferidas de la presente invención, se utilizan esteres que comprenden ácidos carboxílicos y alcoholes alifáticos y/o aromáticos con las enzimas perhidrolasa en formulaciones detergentes de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, los sustratos se seleccionan de uno o más de lo siguiente: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. Así, en algunas modalidades preferidas, se proporcionan detergentes que comprenden por lo menos una perhidrolasa, por lo menos una fuente de peróxido de hidrógeno y por lo menos un ácido éster. Hidrolasas Además de la perhidrolasa descrita en la presente, diversas hidrolasas encuentran uso en la presente invención que incluyen pero que no se limitan a carboxilato éster hidrolasa, tioéster hidrolasa, fosfato monoéster hidrolasa y fosfato diéster hidrolasa, los cuales actúan sobre enlaces éster; una tioéter hidrolasa la cual actúa sobre enlaces éter; y una V-amino-acil-péptido hidrolasa, peptidil-aminoácido hidrolasa, acil-aminoácido de hidrólasa, dipéptido hidrolasa y peptidil-péptido hidrolasa, los cuales actúan sobre enlaces peptídicos, todas estas enzimas tienen proporciones elevadas de perhidrólisis a hidrólisis (por ejemplo >1) . Preferibles entre estas son la carboxilato éster hidrolasa y la peptidil-péptido hidrolasa. Las hidrolasas adecuadas incluyen: (1) proteasas que pertenecen a la clase de peptidil-péptido hidrolasa (por ejemplo pepsina, pepsina B, renina, tripsina, quimiotripsina A, quimiotripsina B, elastasa, enterocinasa, catepsina C, papaína, quimiopapaína, ficina, trombina, fibrinolisina, renina, subtilisina, aspergilopeptidasa A, colagenasa, clostridiopeptidasa B, calicreína, gastrisina, catepsina D, bromelina, queratinasa, quimiotripsina C, pepsina C, aspergillopeptidasa B, urocinasa, carboxipeptidasa A y B y aminopeptidasa) ; (2) carboxilato éster hidrolasa que incluye carboxilo esterasa, lipasa, pectina esterasa y clorofilasa; y (3) enzimas que tienen proporciones elevadas de perhidrólisis a hidrólisis. Especialmente efectivas entre estas son las lipasas así como esterasas que presentan proporciones elevadas de perhidrólisis a hidrólisis, así como esterasas de proteínas alteradas, cutinasas y lipasas, utilizando las características estructurales primarias, secundarias, terciarias y/o cuaternarias de las perhidrolasas de la presente invención. La hidrolasa se incorpora en la composición detergente tanto como se requiera, de acuerdo con el propósito. Preferiblemente, debe incorporarse en una cantidad de 0.0001 a 5% en peso, y de manera más preferible 0.02 a 3 por ciento en peso. Esta enzima debe ser utilizada en forma de granulos elaborados de enzima cruda sola o combinada con otras enzimas y/o componentes en la composición detergente. Los granulos de la enzima cruda se utilizan en una cantidad total que la enzima purificada es 0.001 a 50 por ciento en peso en los granulos . Los granulos se utilizan en una cantidad de 0.002 a 20 y preferiblemente 0.1 a 10 por ciento en peso. En algunas modalidades, los granulos se formulan de manera que contienen un agente protector de enzima y un material retardante de disolución (es decir, un material que regula la disolución de los granulos durante su uso. Tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga Tales tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga incluyen sales de ácido saturada o graso, sales de ácido carboxílico alquilo o alquenilo éter, sales o esteres de ácido V-sulfograso, tensioactivos de tipo aminoácido, tensioactivos de fosfato éster, sales de amonio cuaternario que incluyen aquellas que tienen 3 a 4 sustituyentes alquilo y hasta 1 sustituyente alquilo, sustituido con fenilo. Los tensioactivos catiónicos adecuados y las sales de ácido graso de cadena larga incluyen aquellas descritas en la solicitud de patente británica No. 2 094 826 A, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. La composición puede contener de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento en peso de dichos tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga.
Me oradores de detergencia En algunas modalidades de la presente invención, la composición contiene desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 50 por ciento en peso de uno o más componentes mejoradores de detergencia que se seleccionan del grupo que consiste de sales de metal alcalino y sales de alcanolamina de los siguientes compuestos: fosfatos, fosfonatos, fosfonocarboxilatos , sales de aminoácidos, electrolitos de peso molecular alto de aminopoliacetatos, polímeros no disociantes, sales de ácidos dicarboxílicos y sales de aluminosilicato. Los ejemplos de agentes secuestrantes divalentes adecuados se describen en la solicitud de patente británica No. 2 094 82'6 A, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. En modalidades adicionales, las composiciones de la presente invención contiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 por ciento en peso, de manera preferible desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 30% en peso, en base en la composición de una o más sales de metal alcalino de los siguientes compuestos como las acciones alcalinas o los electrolitos inorgánicos: silicatos, carbonatos y sulfatos así como sustancias alcalinas orgánicas tales como trietanolamina, dietanolamina, monoetanolamina y triisopropanolamina .
Agentes anti-redeposición En modalidades adicionales de la presente invención, las composiciones contienen desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5% en peso de uno o más de los siguientes compuestos como agentes anti-redeposición: polietilenglicol, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y carboximetilcelulosa. En algunas modalidades preferidas, se utiliza una combinación de carboxilmetilcelulosa y/o polietilenglicol con la composición de la presente invención como composiciones útiles para eliminar manchas .
Agentes blanqueadores El uso de las perhidrolasas de la presente invención en combinación con uno o varios agentes blanqueadores adicionales tales como percarbonato de sodio, perborato de sodio, aducto de sulfato de sodio/peróxido de hidrógeno y aducto de cloruro de sodio/peróxido de hidrógeno y un tinte blanqueador fotosensible tal como zinc o sal de alurrtinio de ftalocianina sulf orada mejora adicionalmente en los efectos detergentes . En modalidades adicionales, las perhidrolasas de la presente invención se utilizan en combinación con refuerzos blanqueadores (por ejemplo TAED y/o NOBS) .
Agentes azulantes y tintes fluorescentes En algunas modalidades de la presente invención, se incorporan en la composición agentes azulantes y tintes fluorescentes. Los ejemplos de agentes azulantes y tintes fluorescentes se describen en la solicitud de patente británica No. 2 094 826 A, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia.
Inhibidores de formación de torta En algunas modalidades de la presente invención en las cuales la composición está pulverizada o es sólida, se incorporan en la composición inhibidores de formación de torta. Los ejemplos de inhibidores de formación de torta adecuados incluyen sales de ácido p-toluensulfónico, sales de ácido xilensulfónico, sales de ácido acético, sales de ácido sulfosuccínico, talco, sílice pulverizada finamente, arcilla, silicato de calcio (por ejemplo Micro-Cell por Johns Manville Co.), carbonato de calcio y óxido de magnesio.
Antioxidantes Los antioxidantes incluyen, por ejemplo, terbutilhidroxitolueno, 4,4 ' -butilidenbis (6-terbutil-3-metilfenol) , 2, 2 ' -butilidenbis (6-terbutil-4-metilfenol) , cresol monoestirenado, cresol diestirenado, fenol monoestirenado, fenol diestirenado y l,l-bis(4-hidroxifenil) ciciohexano .
Solubilizantes Algunas modalidades, las composiciones de la presente invención también incluyen solubilizantes que incluyen pero que no se limitan a alcoholes inferiores (por ejemplo etanol, sales de bencenosulfonato y sales de alquilbencenosulfonato inferiores tales como sales de p-toluensulfonato) , glicoles tales como propilenglicol, sales de acetilbencenosulfonato, acetamidas, amidas de ácido piridinodicarboxílico, sales de benzoato y urea.
En algunas modalidades, la composición detergente de la presente invención se utiliza en- un intervalo de pH amplio desde pH ácido hasta alcalino. En una modalidad preferida, la composición detergente de la presente invención se utiliza en un medio de lavado detergente moderadamente ácido, neutro o alcalino que tiene un pH desde más de 4 a no mayor de aproximadamente 12. Además de los ingredientes descritos en lo anterior, también encuentran uso en la presente invención perfumes, amortiguadores, conservadores, tintes y similares. Estos componentes se proporcionan en concentraciones y formas conocidas por aquellos expertos en la técnica. En algunas modalidades, las bases detergentes pulverizadas de la presente invención se preparan por cualquier método de preparación conocido que incluye el método de secado por aspersión y un método de granulación. Se prefiere a la base de detergente que se obtiene particularmente por el método de secado por aspersión y/o por el método de granulación y secado por aspersión. La base detergente obtenida por el método de secado por aspersión no se limita con respecto a las condiciones de preparación. La base de detergente obtenida por el método de secado por aspersión son granulos huecos los cuales se obtienen por aspersión en una suspensión acuosa de ingredientes resistentes al calor tales como agentes tensioactivos y mej oradores de detergencia, en un espacio caliente. Después del secado por aspersión, se pueden agregar perfumes, enzimas, agentes blanqueadores, mej oradores de detergencia alcalinos inorgánicos . Con una base de detergente granular altamente densa que se obtiene por ejemplo mediante el método de aspersión-secado-granulación, también se pueden agregar diversos ingredientes después de la preparación de la base . Cuando la base detergente es un líquido, puede ser una solución homogénea o una dispersión no homogénea. Las composiciones detergentes de esta invención se pueden incubar con tela, por ejemplo telas sucias, en usos industriales y caseros a temperaturas, tiempos de reacción y proporciones de licor utilizadas convencionalmente en estos ámbitos. Las condiciones de incubación (es decir, las condiciones eficaces para tratar materiales con composiciones detergentes de acuerdo con la presente invención) son determinables con facilidad por aquellos expertos en la técnica. En consecuencia, las condiciones apropiadas eficaces para el tratamiento con los presentes detergentes corresponden a aquellas que utilizan composiciones detergentes similares los cuales incluyen perhidrolasa natural . Como se indica en lo anterior, los detergentes de acuerdo con la presente invención adicionalmente se pueden formular como un prelavado en la solución apropiada a un pH intermedio cuando existe actividad suficiente para proporcionar mejoras deseadas de reblandecimiento, depilado, prevención de formación de pelusa, eliminación de fibras en la superficie o limpieza. Cuando la composición detergente es una composición de preenjuagado (por ejemplo prelavado o pretratamiento) ya sea como un líquido, aspersión, gel o composición en pasta, la enzima perhidrolasa generalmente se utiliza de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 5% en peso, en base en el peso total de la composición de preenjuagado o pretratamiento. En tales composiciones opcionalmente se puede utilizar un tensioactivo y, cuando se utiliza, generalmente está presente en una concentración desde aproximadamente 0.0005 a aproximadamente 1 por ciento en peso en base en el peso total del preenjuagado. El resto de la composición comprende componentes convencionales utilizados en el preenjuagado (por ejemplo diluyentes, amortiguadores, otras enzimas (proteasas), etc.) a sus concentraciones convencionales .
Composiciones limpiadoras que comprenden perhidrolasa Las composiciones limpiadoras de la presente invención se pueden utilizar ventajosamente, por ejemplo, en aplicaciones de lavandería, limpieza de superficies duras, aplicaciones de lavado de trastes automático así como aplicaciones cosméticas tales como dentaduras, dientes, pelo y piel. No obstante, debido a las ventajas únicas de la eficacia aumentada en soluciones a una temperatura menor y un perfil superior de conservación de colores, las enzimas de la presente invención son adecuadas idealmente para aplicaciones de lavandería tales como el blanqueado de telas. Además, las enzimas de la presente invención encuentran uso en composiciones tanto granulares como líquidas. Las enzimas de la presente invención también encuentran uso en productos aditivos limpiadores. Los productos aditivos limpiadores que incluyen en las enzimas de la presente invención idealmente son adecuados para inclusión en procedimientos de lavado en donde se desea una eficacia de blanqueado adicional. Tales casos incluyen, pero no se limitan a aplicaciones limpiadoras de solución a baja temperatura. El producto aditivo, en su forma más sencilla, puede ser una o más de las enzimas de la presente invención. Tal aditivo se puede empacar en forma de dosificación para adición a un procedimiento limpiador cuando se utiliza una fuente de peroxígeno y se desea una eficacia blanqueadora aumentada. Tal forma de dosificación única puede comprender una pildora, comprimido, cápsula de gelatina u otra unidad de dosificación única tal como polvos o líquidos medidos de antemano . Se puede incluir un material de relleno o portador para incrementar el volumen de dicha composición. Los materiales adecuados de relleno o portadores incluyen, pero no se limitan a diversas sales de sulfato, carbonato y silicato así como talco, arcilla y similares. Los materiales " de relleno o portadores para composiciones Líquidas pueden ser agua o alcoholes primarios y secundarios de peso molecular bajo que incluyen polioles y dioles. Los ejemplos de tales alcoholes incluyen, pero no se limitan a metanol, etanol, propanol e isopropanol. Las composiciones pueden contener de aproximadamente 5% a aproximadamente 90% de tales materiales. Sé pueden utilizar materiales de relleno ácidos para reducir el pH. Alternativamente, el aditivo limpiador puede incluir una fuente de peroxígeno activado definida en lo siguiente o ingredientes adyuvantes como se definen en lo siguiente . Las composiciones limpiadoras y los aditivos limpiadores de la presente invención requieren una cantidad eficaz de las enzimas proporcionadas por la presente invención. El nivel requerido de enzimas se puede obtener por la adición de una o más especies de la perhidrolasa de M. smegmatis, variantes, homólogos y/u otras enzimas o fragmentos de enzima que tengan la actividad de las enzimas de la presente invención. Típicamente, las composiciones limpiadoras de la presente invención comprenden por lo menos 0.0001 por ciento en peso, de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 1, de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.5, o incluso de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 por ciento en peso de por lo menos una enzima de la presente invención. En algunas modalidades, las composiciones limpiadoras de la presente invención comprenden un material que se selecciona del grupo que consiste de una fuente de peroxígeno, peróxido de hidrógeno y mezclas de los mismos, la fuente de peroxígeno se selecciona del grupo que consiste de: (i) de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 o incluso de aproximadamente 1 a 10 por ciento en peso de una persal, un peroxiácido orgánico, peróxido de hidrógeno y urea y mezclas de los mismos; (ii) de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20, o incluso de aproximadamente 1 a 10 por ciento en peso de un carbohidrato y de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 1, de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.5, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 por ciento en peso de carbohidrato oxidasa; y (iii) mezclas de los mismos. Las persales adecuadas incluyen aquellas que se seleccionan del grupo que consiste de perborato de metal alcalino, percarbonato de metal alcalino, perfosfatos de metal alcalino, persulfatos de metal alcalino y mezclas de los mismos .
El carbohidrato se puede seleccionar del grupo que consiste de monocarbohidratos, dicarbohidratos, tricarbohidratos , oligocarbohidratos y mezclas de los mismos. Los carbohidratos adecuados incluyen carbohidratos que se seleccionan del grupo que consiste de D-arabinosa, L-arabinosa, D-celobiosa, 2-desoxi-D-galactosa, 2-desoxi-D-ribosa, D-fructosa, L-fucosa, D-galactosa, D-glucosa, D-glicero-D-gulcoheptosa, D-lactosa, D-lixosa, L-lixosa, D-maltosa, D-manosa, melecitosa, L-melibiosa, Palatinosa, D-rafinosa, L-rhamnosa, D-ribosa, L-sorbosa, estaquiosa, sacarosa, D-trehalosa, D-xilosa, L-xilosa y mezclas de los mismos . Las carbohidrato oxidasas adecuadas incluyen carbohidrato oxidasas que se seleccionan del grupo que consiste de aldosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.9), galactosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.9), celobiosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.25), piranosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.10), sorbosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.11), y/o hexosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.5), glucosa oxidasa (clasificación IUPAC EC1.1.3.4) y mezclas de los mismos. En algunas modalidades preferidas, las composiciones limpiadoras de la presente invención también incluyen de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 99.9, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0.1 a 20, o incluso de aproximadamente 1 a aproximadamente 15% en peso de una molécula que comprende una. porción éster. Las moléculas_ adecuadas que comprenden una porción éster pueden tener la fórmula: en donde R1 es una porción que se selecciona del grupo que consiste de H o la forma sustituida o no sustituida de alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo/ alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; en un aspecto de la presente invención, R1 puede comprender de 1 a 50,000 átomos de carbono, de 1 a 10,000 átomos de carbono o incluso de 2 a 100 átomos de carbono; cada R2 es una porción alcoxilato, en un aspecto de la presente invención, cada R2 es independientemente una porción etoxilato, propoxilato o butoxilato; R3 es una porción formadora de éster que tiene la fórmula: RCO- en donde R4 puede ser H, la forma sustituida o no sustituida de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo, en un aspecto de la presente invención R4 puede ser la forma sustituida o no sustituida de alquilo, alquenilo, alquinilo, una porción que comprende de 1 a 22 átomos de carbono, una porción arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo que comprende de 4 a 22 átomos de carbono o R4 puede ser una porción alquilo de 1 a 22 átomos de carbono sustituido o no sustituido o R4 puede ser una porción alquilo de 1 a 12 átomos de carbono sustituida o no sustituida; x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un número entero que es igual a o menor que el número de carbonos en R1 p es un número entero que es igual a o menor que x m es un número entero de 0 a 50, un número entero de 0 a 18 o un número entero de 0 a 12, y n es por lo menos 1. En un aspecto de la presente invención, la molécula que comprende una porción éster es etoxilato o propoxilato de alquilo que tiene la fórmula R10x [ (R2) m (R3) p en donde: R1 es una porción alquilo o heteroalquilo sustituida o no sustituida, de 2 a 32 átomos de carbono; cada R2 es independientemente una porción etoxilato o propoxilato; R3 es una porción formador de éster que tiene la fórmula: R4C0-, en donde R4 puede ser H, las formas sustituida o no sustituida de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo, en un aspecto de la presente invención, R4 puede ser una porción alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o no sustituida que comprende de 1 a 22 átomos de carbono, una porción arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo, sustituida o no sustituida, que comprende de 4 a 22 átomos de carbono, o R4 puede ser una porción alquilo de 1 a 22 átomos de carbono sustituida o no sustituida, o R4 puede ser una porción alquilo de 1 a 12 átomos de carbono sustituida o no sustituida; x es un número entero que es igual o menor que el número de carbonos en R1 p es un número entero que es igual o menor que x m es un número entero de 1 a 12, y n es por lo menos 1. En un aspecto de la presente invención, la molécula que comprende la porción éster tiene la fórmula: R10x[(R2)m(R3) p en donde R1 es H, o una porción que comprende una porción de amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria, la porción R1 que comprende una porción amina se selecciona del grupo que consiste de las formas sustituida o no sustituida de alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; en un aspecto de la invención de los solicitantes, R1 puede comprender de 1 a 50,000 átomos de carbono, de 1 a 10,000 átomos de carbono o incluso de 2 a 100 átomos de carbono; cada R2 es una porción alcoxilato, en un aspecto de la presente invención, cada R2 es independientemente una porción etoxilato, propoxilato o butoxilato; R3 es una porción formadora de éster que tiene la fórmula : R4C0- en donde R4 puede ser H, la forma sustituida o no sustituida de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo, en un aspecto de la presente invención, R4 puede ser una porción alquilo, alquenilo o alquinilo sustituida o no sustituida que comprende 1 a 22 átomos de carbono, una porción arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo sustituida o no sustituida que comprende de 4 a 22 átomos de carbono o R4 puede ser una porción alquilo de 1 a 22 átomos de carbono sustituida o no sustituida, o R4 puede ser una porción alquilo de 1 a 12 átomos de carbono sustituida o no sustituida; x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un número entero que es igual o menor que el número de carbonos en R1 p es un número entero que es igual o menor que x m es un número entero de 0 a 12, o incluso 1 a 12, y n es por lo menos 1. En cualquiera de los aspectos mencionados antes de la presente invención, la molécula que comprende la porción éster puede tener un peso promedio de peso molecular menor de 600,000 Daltons, menor de 300,000 Daltons, menor de 100,000 Daltons o incluso menor de 60,000 Daltons. Las moléculas adecuadas que comprenden una porción éster incluyen policarbohidratos que comprenden una porción éster. Las composiciones limpiadoras que se proporcionan en la presente típicamente se formularán como tales, durante su uso en operaciones de limpieza acuosa, el agua de lavado tendrá un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5, o incluso de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 10.5. Las formulaciones de productos líquidos típicamente se formulan para tener un pH de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 9.0. Los productos de lavandería granulares típicamente se formulan para tener un pH de aproximadamente 9 a aproximadamente 11. Las técnicas para controlar el pH en los niveles de uso recomendados incluyen el uso de amortiguadores, sustancias alcalinas, ácidos, etc., y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Cuando una o varias de las enzimas de la presente invención se utilizan en una composición granular o líquida, puede ser deseable que una o varias de las enzimas estén en forma de una partícula encapsulada para proteger dicha enzima de otros componentes de la composición granular durante el almacenamiento. Además, la encapsulación también significa controlar la disponibilidad de una o varias de las enzimas durante el proceso de limpieza y pueden mejorar el funcionamiento de una o varias de las enzimas. A este respecto, una o varias de las enzimas pueden ser encapsuladas con cualquier material encapsulante conocido en la técnica. El material encapsulante típicamente encapsula por lo menos parte de una o varias de las enzimas. Típicamente, el material encapsulante es hidrosoluble y/o dispersable en agua. El material encapsulante puede tener una temperatura de transición vitrea (Tg) de 0°C o superior. La temperatura de transición vitrea se describe con mayor detalle en WO 97/11151, especialmente desde la página 6, línea 25 a la página 7, línea 2. El material encapsulante se puede seleccionar del grupo que consiste de carbohidratos, gomas naturales o sintéticas, quitina y quitosana, celulosa y derivados de celulosa, silicatos, fosfatos, boratos, alcohol polivinílico, polietilenglicol, ceras de parafina y combinaciones de los mismos. Cuando el material encapsulante es un carbohidrato, típicamente se puede seleccionar del grupo que consiste de monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y combinaciones de los mismos. Típicamente, el material encapsulante es un almidón. Los almidones adecuados se describen en EP 0 922 499; US 4,977,252; US 5,354,559 y US 5,935,826. El material encapsulante puede ser una microesfera elaborada de plástico tal como termoplástico, acrilonitrilo, metacrilonitrilo, poliacrilonitrilo, polimetacrilonitrilo y mezclas de los mismos; las microesferas disponibles comercialmente que se pueden utilizar son aquellas suministradas por Expancel de Stockviksverken, Suecia, bajo el nombre comercial EXPANCEL"11, y aquellas suministradas por PQ Corp. de Valley Forge, Pennsylvania E.U.A. bajo el nombre comercial PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES™, LUXSIL^, Q-CEL™1 y SPHERICEL*411.
Procedimientos para elaborar y utilizar las composiciones limpiadoras de la presente invención Las composiciones limpiadoras de la presente invención se pueden formular en cualquier forma adecuada y se pueden preparar por cualquier procedimiento seleccionado por quien realiza la formulación, los ejemplos no limitantes de las cuales se describen en los documentos de E.U.A. Nos. 5,879,584; 5,691,297; 5,574,005; 5,569,645; 5,565,422 Del Greco et al.; 5,516,448; 5,489,392; y 5,486,303; la totalidad de las cuales se incorpora en la presente como referencia.
Materiales adyuvantes además de las enzimas de la presente invención, peróxido de hidrógeno y/o una fuente de peróxido de hidrógeno y material que comprende la porción éster Aunque no es esencial para los propósitos de la presente invención, la lista de adyuvantes que se ilustra en lo siguiente son adecuados para uso en las composiciones limpiadoras actuales y de manera deseable se pueden incorporar en algunas modalidades de la invención, por ejemplo, para ayudar a mejorar el funcionamiento limpiador, para el tratamiento del sustrato que se va a limpiar o para modificar la estética de la composición limpiadora como en el caso de los perfumes, colorantes, tintes o similares. Debe entenderse que dichos adyuvantes se administran además de las enzimas de la presente invención, peróxido de hidrógeno y/o una fuente de peróxido de hidrógeno y un material que comprende una porción éster. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales así como las concentraciones de incorporación de los mismos dependerán de la forma física de la composición y la naturaleza de la operación limpiadora para la cual se va a utilizar. Los materiales adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a tensioactivos, mej oradores de detergencia, agentes quelantes, agentes inhibidores de transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas adicionales y estabilizantes de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueador, refuerzos de blanqueador, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes para la eliminación/antirredeposición de manchas de arcilla, abrillantadores, supresores de lodos, tintes, perfumes, agentes elastificantes de estructura, suavizantes de telas, portadores, hidrotropos, auxiliares de procesamiento y/o pigmentos. Además de lo descrito en lo siguiente, los ejemplos adecuados de otros adyuvantes similares así como las concentraciones de uso se encuentran en las patentes de E.U.A. Nos. 5,576,282, 6,306,812 y 6,326,348, incorporadas en la presente como referencia. Los ingredientes adyuvantes mencionados en lo anterior pueden constituir el resto de las composiciones limpiadoras de la presente invención. Tensioactivos - Las composiciones limpiadoras de acuerdo con la presente invención pueden comprender un tensioactivo o un sistema tensioactivo en donde el tensioactivo se puede seleccionar de tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos anfolíticos, tensioactivos switeriónicos, tensioactivos no iónicos semipolares y mezclas de los mismos. El tensioactivo típicamente está presente en una concentración de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, o incluso de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% en peso de la composición limpiadora objeto. Mej oradores de detergencia - Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden comprender uno o más mej oradores de detergencia o sistemas mejoradores de detergencia para detergentes. Cuando se utiliza un mejorador de detergencia, la composición limpiadora objeto típicamente comprenderá por lo menos aproximadamente 1%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 60%, o incluso de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% de mejorador de detergencia, con respecto al peso de la composición limpiadora objeto. Los mej oradores de detergencia incluyen, pero no se limitan a sales de metal alcalino, de amonio y de alcanolamonio de polifosfatos, silicatos de metal alcalino, carbonatos de metal alcalinotérreo y alcalino, mejoradores de detergencia de aluminosilicato de compuestos de policarboxilato, hidroxipolicarboxilatos de éter, copolímeros de anhídrido maleico con etileno o vinilmetiléter, ácido 1, 3, 5-trihidroxibencen-2,4, 6-trisulfónico y ácido carboximetiloxisuccínico, las diversas sales de metal alcalino, de amonio y de amonio sustituido de los ácidos poliacéticos tales como ácido etilendiaminotetraacético y ácido nitrilotriacético así como policarboxilatos tales como ácido melifico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, ácido bencen-1, 3 , 5- tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico y sales solubles de los mismos. Agentes quelantes - Las composiciones limpiadoras en la presente pueden contener un agente quelante . Los agentes quelantes adecuados incluyen cobre, hierro y/o agentes quelantes de manganeso y mezclas de los mismos . Cuando se utiliza un agente quelante, la composición limpiadora puede comprender de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15%, o incluso de aproximadamente 3.0% a aproximadamente 10% de agente quelante en peso de la composición limpiadora objeto. Auxiliar de deposición - Las composiciones limpiadoras en la presente pueden contener un auxiliar de deposición. Los auxiliares de deposición adecuados incluyen polietilenglicol, polipropilenglicol, policarboxilato, polímeros liberadores de mugre tales como ácido politereftálico, arcillas tales como caolinita, montmorillonita, atapulgita, ilita, bentonita, halosita y mezclas de las mismas. Agentes inhibidores de transferencia de tinte - Las composiciones limpiadoras de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes inhibidores de transferencia de tinte. Los agentes inhibidores de transferencia de tinte poliméricos adecuados incluyen, pero no se limitan a polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N- vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de los mismos . Cuando está presente en una composición limpiadora objeto, los agentes inhibidores de transferencia de tinte pueden estar presentes a concentraciones de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5%, o incluso de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3% en peso de la composición limpiadora. Dispersantes - Las composiciones limpiadoras de la presente invención también pueden contener dispersantes . Los materiales orgánicos hidrosolubles adecuados incluyen los ácidos homopoliméricos o' copoliméricos o sus sales, en los cuales el ácido policarboxílico comprenden por lo menos dos radicales carboxilo separados entre sí por un máximo de dos átomos de carbono . Enzimas - Las composiciones limpiadoras pueden comprender una o más enzimas detergentes las cuales proporcionan un funcionamiento limpiador y/o beneficios para el cuidado de las telas. Los ejemplos de enzimas adecuados incluyen, pero no se limitan a hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, 5-glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, lacasa y amilasas o mezclas de los mismos . Una combinación típica es una mezcla de enzimas aplicables convencionales como proteasa, lipasa, cutinasa y/o celulasa junto con amilasa. Estabilizadores de enzima - Las enzimas para uso en detergentes se pueden estabilizar por diversas técnicas . Las enzimas utilizadas en la presente se pueden estabilizar por la presencia de fuentes hidrosolubles de iones calcio y/o magnesio en las composiciones terminadas que proporcionen tales iones a las enzimas. Complejos de metal catalítico - Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden incluir complejos de metal catalítico. Un tipo de catalizador blanqueador que contiene metal es un sistema catalizador que comprende un catión de metal de transición de actividad catalítica blanca definida tal como cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno o cationes manganeso, un catión de metal auxiliar que tiene poca o nula actividad catalítica tal como cationes de zinc o aluminio y un secuestrado que tenga constantes de estabilidad definidas para los cationes metálicos catalíticos y auxiliares, particularmente ácido etilendiaminotetraacético, ácido etilendiaminotetra- (metilenfosfónico) y sales hidrosolubles de los mismos. Tales catalizadores se describen en el documento de E.U.A. 4,430,243.
Si se desea, las composiciones en la presente pueden ser catalizadas por medio de un compuesto de manganeso. Tales compuestos y las concentraciones de uso son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, catalizadores basados en manganeso descritos en el documento de E.U.A. 5,576,282. Los catalizadores de blanqueador de cobalto útiles en la presente se conocen y se describen, por ejemplo, en los documentos de E.U.A. 5,597,936; y 5,595,967. Tales catalizadores de cobalto se preparan fácilmente por procedimientos conocidos, tal como se describe, por ejemplo en los documentos de E.U.A. 5,597,936 y 5,595,967. Las composiciones en la presente también pueden incluir de manera adecuada un complejo de metal de transición de un ligando rígido macropolicíclico - abreviado como "MRL" . Como materia práctica, y de ninguna manera como limitación, las composiciones y procesos limpiadores en la presente se pueden ajustar para proporcionar del orden de por lo menos una parte por cien millones de especies MRL activas en el medio de lavado acuoso y preferiblemente proporcionarán desde aproximadamente 0.005 ppm a aproximadamente 25 ppm, de manera más preferible de aproximadamente 0.05 ppm a aproximadamente 10 ppm, y de manera mucho más preferible de aproximadamente 0.1 ppm a aproximadamente 5 ppm del MRL en el licor de lavado.
Los metales de transición preferidos en el catalizador blanqueador de metal de transición actual incluyen manganeso, hierro y cromo. Los MRL preferidos en la presente son un tipo especial de ligando ultrarrígido que forma puentes cruzados (retícula) tal como 5,12-dietil-1,5,8, 12-tetraazabiciclo [6.6.2] hexadecano. Los MRL de metal de transición adecuados se preparan fácilmente por procedimientos conocidos, tales como los descritos, por ejemplo, en WO 00/332601 y en el documento de E.U.A. 6,225,464.
Método de uso Las composiciones limpiadoras descritas en la presente se pueden utilizar para limpiar un lugar, por ejemplo una superficie o tela. Típicamente, por lo menos una porción del sitio se pone en contacto con una modalidad de la composición limpiadora de los solicitantes, en forma pura o diluida en un licor de lavado y después el sitio opcionalmente se lava y/o enjuaga. Para propósitos de la presente invención, el lavado incluye, pero no se limita a frotado y agitación mecánica. La tela puede comprender la mayor parte de cualquier tela capaz de ser sometida a lavado bajo condiciones de uso normales de consumidor. Las composiciones limpiadoras descritas típicamente se utilizan a concentraciones desde aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 15,000 ppm en solución. Cuando el solvente de lavado es agua, la temperatura del agua típicamente varía de aproximadamente 5°C a aproximadamente 90 °C y, cuando el lugar comprende una tela, la proporción en masa de agua respecto a tela típicamente es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 30:1.
PARTE EXPERIMENTAL Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente algunas modalidades preferidas y aspectos de la presente invención y no se consideran como limitantes del alcance de la misma. En la descripción experimental que sigue, se utilizan las siguientes abreviaturas: °C (grados centígrados) ; rpm (revoluciones por minuto) ; H20 (agua) ; HCl (ácido clorhídrico) ; aa (aminoácido) ; pb (pares de bases) ; kb (kilopares de bases) ; kD (kilodaltons) ; g (gramos) ; µg y ug (microgramos) ; mg (miligramos) ; ng (nanogramos) ; µl y ul (microlitros) ; ml (mililitros) ; mm (milímetros) ; nm (nanómetros) ; µm y um (micrómetro) ; M (molar) ; mM (milimolar) ; µM y uM (micromolar) ; U (unidades) ; V (voltios) ; MW (peso molecular) ,- seg (segundos) ; min (minutos) ; h (horas) ; MgCl2 (cloruro de magnesio) ; NaCl (cloruro de sodio) ; DO280 (densidad óptica a 280 nm) ; DO600 (densidad óptica a 600 nm) ; PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) ; EtOH (etanol) ; PBS (solución salina amortiguada con, fosfato [NaCl 150 mM, amortiguador de fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2]); SDS (dodeciisulfato de sodio); Tris (tris (hidroximetil) aminometano) ; TAED (N,N,N' ,N' -tetraacetiletilendiamina) ; p/v (peso respecto a volumen) ; v/v (volumen respecto a volumen) ; Per (perhidrolasa) ; per (gen para perhidrolasa; Ms (M. smegmatis) ; EM (espectroscopia de masas) ; BRAIN (BRAIN Biotechnology Research and Information Network, AG, Zwingenberg, Alemania) , TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD) ; AATCC (American Association of Textile and Coloring Chemists) ; WFK (wfk Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Alemania) , Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL) ; ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA) ; Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ; Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA) ; ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ; Amersham (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ) ; Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) ; BioRad (BioRad, Richmond, CA) ; Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) ; Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI) ; GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) ; Novagen (Novagen, Inc., Madison, Wl) ; Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA) ; Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) ; Genaissance (Genaissance Pharmaceuticals, Inc., New Haven, CT) ; DNA 2.0 (DNA 2.0, Menlo Park, CA) ; MIDI (MIDI Labs, Newark, DE) InvivoGen (InvivoGen, San Diego, CA) ; Sigma (Sigma Chemical Co . , St . Louis, . MO) ; Sorvall (Sorvall Instruments, un subsidiario de DuPont Co., Biotechnology Systems, Wilmington, DE) ; Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) ; Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ) ; Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ; Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ) ; y Zeiss (Cari Zeiss, Inc., Thornwood, NY) . En los siguientes Ejemplos, se utilizan diversos medios. Se prepara el medio "TS" (por litro) utilizando 16 g de triptona (Difco) , 4 g de Soytone (Difco) , 20 g de hidrolizado de caseína (Sigma) , 10 g de K2HP04 y H20 hasta 1 1. El medio se esteriliza en la autoclave. Después, se agrega glucosa estéril a una concentración final de 1.5%. Se prepara el medio de producción de Streptomyces (por litro) utilizando 2.4 g de ácido cítrico (H20) , 6 g de extracto de levadura Biospringer, 2.4 g de (NH4)2S04, 2.4 g de MgS04 • 7H20, 5 ml de Mazu DF204, 5 ml de elementos en traza. Se ajusta el pH a 6.9 con NaOH. Posteriormente el medio se somete a autoclave para esterilizar. Después de la esterilización se agrega en el medio CaCl2 • 2 H20 (2 ml de una solución 100 mg/ml) , KH2P04 (200 ml de una solución 13% (p/v) a pH 6.9) y 20 ml de una solución de glucosa 50%. En estos experimentos, se utiliza un espectrofotómetro para medir la absorbancia de los productos formados después de finalizar las reacciones. Se utiliza un reflectómetro para medir la reflectancia de los recortes. A menos que se indique de otra manera, las concentraciones de proteína se calculan por Coomassie Plus (Pierce) , utilizando BSA como el estándar.
EJEMPLO 1 Análisis de enzimas En este Ejemplo, se describen métodos para determinar la pureza de enzima y la actividad utilizada en los Ejemplos subsecuentes y en toda la presente especificación.
Ensayo de actividad de enzima (Ensayo PNB) . Se mide la actividad de hidrólisis de butirato de p-nitrofenilo. La mezcla de reacción se prepara al agregar 10 µl de butirato de p-nitrofenilo 100 mM en sulfóxido de dimetilo a 990 ml de amortiguador Tris-HCl 100 mM, pH 8.0 que contiene Tritón X-100 0.1%. La velocidad de fondo de hidrólisis se mide antes de la adición de enzima a 410 nm. La reacción se inicia por la adición de 10 µl de enzima a 990 ml de reacción y el cambio de absorbancia a 410 nm se mide a temperatura ambiente (~23°C). Los resultados corregidos con fondo se presentan como dA410/min/ml o dA410/min/mg de proteína.
Transesterificación La transesterificación se mide por separación de productos por GC en reacciones acuosas amortiguadas . Las reacciones para medir la transesterificación de acetato de etilo con propanol que está contenido en 1 ml de KP04 50 mM, pH 7.0; acetato de metilo 200 mM, 1-propanol 200 mM y enzima. Las reacciones para medir la transesterificación de acetato de etilo con neopentilglicol (NPG, por sus siglas en inglés) , contenido en 1 ml de KP04 50 mM, pH 7.0; acetato de etilo 303 mM, NPG 100 mM y enzima. Las reacciones se incuban a las temperaturas indicadas y por los tiempos indicados . Se realizan las separaciones utilizando una columna FFAP 30M (Phenomenex) . La proporción de división de entrada es de aproximadamente 1:25, el inyector está a 250 °C, la presión superior de 69 kPa (10 psi) de He y la detección es por FID a 250 °C. El programa de cromatografía es 40 °C iniciales durante 4 min, seguido por un gradiente de 15°C/min a 180 °C. Los componentes se eluyeron en el siguiente orden y no se cuantificaron; acetato de etilo, alcohol etílico, acetato de propilo, alcohol propílico, ácido acético, diacetato de NPG, monoacetato de NPG y NPG.
Perhidrolasa utilizada en estudios de cristalografía Se utiliza esta preparación de perhidrolasa para estudios de cristalografía. Además, la proteína sin marcar se hace crecer y se purifica de una manera similar. Se hace crecer un precultivo de 500 ml de E. coli, BL21 (DE3) /pLysS/pMSATNcol-1 en un matraz Fernbach de 2.8 1, con deflectores, en LB que contiene 100 µg/ml de carbenicilina. Después de cultivo durante la noche a 37 °C y 200 rpm en un agitador giratorio, las células se cosechan por centrifugación y se resuspenden en medio M9 que contiene : 2 g/l de glucosa; 6 g/l de Na2HP04; 3 g/l de KH2P04; 1 g/l de NH4C1; 0.5 g/l de NaCl; 5 mg/1 de tiamina; MgS04 2 mM; CaCl2 100 µM; 40 mg/1 de ácido cítrico • H20; 30 mg/1 de MnS04 • H20; 10 mg/1 de NaCl; 1 mg/1 de FeS04 • 7H20; 1 mg/1 de CoCl2 • 6H20; 1 mg/1 de ZnS04 • 7H20; 100 µg/1 de CuS04 • 5H20; 100 µg/ml de H3B03 • 5H20 y 100 µg/1 de NaMo04 • 2H20; y complementado con 100 mg/1 de carbenicilina. Las células resuspendidas se .utilizan para inocular seis matraces Fernbach que contienen 500 ml cada uno de medio M9 suplementado con 100 mg/1 de carbenicilina. Los cultivos se incuban a 20°C y 200 rpm en un agitador giratorio hasta que la DO600 alcanza aproximadamente 0.7, momento en el cual se agregan 100 mg/1 de lisina, treonina y fenilalanina y 50 mg/1 de leucina, isoleucina, valina y seleñómetionina. Después de incubación adicional durante 30 min, se agrega IPTG a una concentración final de 50 µM. Los cultivos después se incuban durante la noche (-15 h) y se cosechan por centrifugación. El sedimento celular se lava dos veces con amortiguador KP04 50 mM, pH 6.8. El rendimiento es de 28.5 g de peso húmedo de células al cual se le agregan 114 ml de amortiguador KP04 100 nM, pH 8.2 y 5 mg de desoxirribonucleasa. Esta mezcla se congela a -80°C y se recalienta dos veces. La suspensión de células recalentadas se lisa por ruptura en una celda de presión French a 138 MPa (20K psi) . Las células que no se rompieron y el material de membrana celular se sedimenta por centrifugación a 100,000 g durante 1 hora. El extracto crudo de sobrenadante, 128 ml (CE) se coloca después en un vaso de precipitados de 600 ml y se agita durante 10 minutos en un baño maría a 55 °C para precipitar las proteínas inestables. Después de 10 min, el vaso de precipitados se agita en agua con hielo durante 1 min seguido por centrifugación a 15,000 g durante 15 min. El sobrenadante de este procedimiento, HT, contiene 118 ml. El extracto de HT después se satura a 20% en (NH4)2S04 por la adición lenta de 12.7 g de (NH4)2S04. Esto se carga en una columna de 10 cm x 11.6 cm Fast Flow Phenil Sepharose (Pharmacia) equilibrada con amortiguador KP04 100 mM, pH 6.8, que contiene 20% de saturación de (NH4)2S04 (109 g/l). Después de cargar el extracto, la columna se lava con 1700 ml de amortiguador de inicio y se eluye en un gradiente de dos etapas. La primera etapa es un gradiente lineal de 1900 ml a partir del amortiguador de inicio para el mismo amortiguador sin (NH4)2S04, el segundo es una elución de 500 ml con KP04 100 mM, pH 6.8 que contiene EtOH 5%. Las fracciones activas, 241 ml, se acumulan, se diluyen 100% con agua y se cargan en una columna de intercambio aniónico fuerte Poros HQ de 1.6 mm x 16 mm equilibrada con Tris-HCl 100 mM, pH 7.6. Después de cargar el extracto, la columna se lava con 5 volúmenes de columna de amortiguador de inicio. La proteína se eluye con un gradiente de 15 volúmenes de columna del amortiguador de inicio hasta amortiguador de inicio que contiene KCl 175 mM. Las fracciones activas se acumulan y concentran utilizando Centriprep 30 (Millipore) a 740 µl . La figura 6 proporciona una tabla de purificación que muestra la actividad de enzima de la enzima de la presente invención a través de las diversas etapas en los procedimientos de purificación. La presente solicitud debe ser utilizada para determinar los valores respectivos de los parámetros de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, todas las concentraciones de componentes o composiciones son con referencia a la concentración activa de dicho componente o composición y se excluyen las impurezas, por ejemplo, solventes o productos secundarios residuales, los cuales puedan estar presentes en fuentes disponibles comercialmente. Los pesos de los componentes de enzima que se proporcionan en la presente se basan en la proteína activa total. Todos los porcentajes y proporciones se calculan en peso, a menos que se indique de otra manera. Todos los porcentajes y proporciones se calculan en base en la composición total, a menos que se indique de otra manera.
EJEMPLO 2 Determinación de la proporción entre la formación de perácido y ácido " En este Ejemplo se describen métodos para determinar la proporción de perhidrólisis a hidrólisis. En particular, este Ejemplo proporciona métodos para determinar la proporción entre formación de perácido (es decir, perhidrólisis) y formación de ácido (es decir, hidrólisis) que resulta de la actividad de enzima en un sustrato éster en presencia de peróxido en un sistema acuoso .
A. Determinación de la proporción de perhidrólisis a hidrólisis Preparación del sustrato Los sustratos se preparan como se describe en la presente. Se diluyen acetato de etilo (EtOAc, por sus siglas en inglés) y otros esteres hidrosolubles en un amortiguador deseado a una concentración de 10 mM de éster. Se preparan tributirina y otros sustratos insolubles en agua al producir parches de sustrato. Se cortan parches de poliéster a partir de una tela de poliéster no teñida (Polycotton, PCW 22) utilizando un troquelador de 16 mm (5/8 pulgadas) y se colocan en placas de microtitulación de 24 pozos (Costar, Cell Culture Píate) . El éster insoluble se diluye en 1.03 M en hexano. Después, 10 µl de la solución de éster insoluble se adsorbe posteriormente sobre el parche de poliéster.
Determinación de hidrólisis (Ensayo GC) El ensayo hidrolítico descrito a continuación se utiliza para determinar la cantidad de hidrólisis de sustrato. En este ensayo, la solución de ensayo está constituida de fosfato de potasio 50 mM, pH 7.5, sustrato éster 10 mM, peróxido de hidrógeno 29 mM y cloruro de potasio 20 mM en un volumen total de 0.99 ml y una cantidad de enzima que puede generar 20 nmoles de ácido acético por minuto a 25°C. Para medir la hidrólisis del éster insoluble en agua, la mezcla de reacción se agrega al parche de tela de éster insoluble. El parche se prepara como se describe en lo anterior ("Preparación de sustrato"). Todas las demás condiciones para el ensayo son las mismas, excepto por exclusión de los otros sustratos éster. Se mide la actividad hidrolítica al determinar el incremento de ácidos generados por la enzima a partir de sustratos donadores de acilo utilizando cromatografía de gases acoplado con detección de ionización por flama. Se lleva a cabo el ensayo al pipetear primero 50 µl de solución de ensayo que contiene todos los componentes excepto la enzima en 200 ml de metanol (grado CLAR) para determinar la cantidad de ácido en la solución de ensayo en el tiempo 0. Después se agregan 10 µl de enzima a la solución de ensayo hasta una concentración final deseada la cual produce aproximadamente 20 nanomoles de ácido por minuto. Se inicia un cronómetro y se toman alícuotas de 50 µl de la solución de ensayo y se agregan a 200 µl de metanol en momentos diferentes, típicamente 2, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos, después de la adición de la enzima. Estas muestras suspendidas con metanol después se inyectan en un cromatógrafo de gases acoplado con un detector de ionización de flama (Agilent 6890N) y se analiza en búsqueda de componentes hidrolíticos, ácidos acético y butírico. Se lleva a cabo cromatografía de gases utilizando una columna de polietilenglicol modificada con ácido nitrotereftálico (Zebron FFAP; con dimensiones: 30 m de largo, 250 µm de diámetro, 250 nm de espesor de película) . Se aplica a la columna una alícuota de muestra de 3 µl por inyección sin división, bajo un flujo de helio constante de 1.0 ml/minuto. La entrada se mantiene a una temperatura de 250 °C y se purga de cualquier componente de muestras remanentes después de 2 minutos . Cuando se analiza el ácido acético, la temperatura de la columna se mantiene a 75 °C durante 1 minuto después de la inyección, se incrementa a 25°C/minuto hasta 100 °C y después se incrementa a 15°C/minuto hasta los 200 °C. Cuando se analiza ácido butírico, se controla la temperatura de la columna como se describe en lo anterior, excepto que la temperatura se incrementa adicionalmente 25°C/minuto a 225 °C y se mantiene a 225 °C durante 1 minuto. El detector de ionización de flama se mantiene durante la cromatografía a 250°C y bajo un flujo constante de hidrógeno de 25 ml/minuto, un flujo de aire de 200 ml/minuto y una columna combinada y un flujo de helio constitutivo de 30 ml/minuto. La cantidad de ácido hidrolizado en la muestra después se determina al integrar el pico de ácido del cromatograma para las cuentas de iones totales calcular el ácido de la cuenta de iones utilizando una curva estándar generada bajo las condiciones anteriores para los ácidos acético butírico a concentraciones variables en la solución de ensayo (sin enzima) .
Determinación de perhidrólisis (Ensayo OPD) El ensayo de actividad perhidrolítica descrito en lo siguiente se utiliza para determinar la cantidad de perácido formado en la reacción. En estos ensayos la solución comprende fosfato de potasio 50 mM, pH 7.5, sustrato éster 10 mM, peróxido de hidrógeno 29 mM, cloruro de potasio 20 mM y O-fenilendiamina 10 mM.
Cuando se utiliza un éster insoluble en agua como el donador acilo, se usa un parche de tela adsorbido en éster como el sustrato, preparado como se describe en lo anterior ("Preparación del sustrato"). Se mide la actividad perhidrolítica al determinar el incremento de absorbancia a 458 nm de O-fenilendiamina (OPD, por sus siglas en inglés) oxidada por perácido generado con la enzima. Se prepara la solución de ensayo de actividad perhidrolítica de la misma manera que la solución de ensayo de actividad hidrolítica, excepto que se agrega OPD a la solución de ensayo, excepto que se agrega OPD a la solución de ensayo a una concentración final de 10 mM, la solución OPD se prepara inmediatamente antes de llevar a cabo el ensayo al disolver 72 mg de OPD (Sigma-Aldrich, diclorhidrato) en 19.94 ml del mismo amortiguador y se ajusta el pH al agregar lentamente 60 µl de hidróxido de potasio 13.5 M. Se mide el pH y, si se necesita, se agregan cantidades pequeñas de hidróxido de potasio para regresar el pH al pH original del amortiguador. Después 495 µl de esta solución de OPD se agregan con los otros componentes del ensayo a un volumen de ensayo final de 0.990 ml . También se prepara una solución de extinción o suspensión de ensayo al disolver 36 mg de OPD en 20 ml de ácido cítrico 100 mM y etanol 70%. El ensayo típicamente se lleva a cabo a 25 °C. El ensayo se inicia al pipetear 100 µl de solución de ensayo antes de la adición de la enzima en 200 µl de solución de extinción para determinar la cantidad de componentes perhidrolíticos y la absorbancia de fondo en la solución de ensayo en un tiempo 0. Después se agregan 10 µl de la enzima a la solución de ensayo hasta una concentración final deseada la cual produce aproximadamente 10 nanomoles de perácido por minuto. Se inicia un cronómetro y se toman alícuotas de 100 µl de la solución de ensayo y se agregan a 200 µl de solución de extinción en diversos tiempos, típicamente a los 2, 5, 10, 15, 25, 40 y 60 minutos después d.e agregar la enzima. Las soluciones de ensayo suspendidas se incuban durante 30 minutos para permitir que cualquier perácido remanente se oxide el OPD. Después 100 µl de cada solución de ensayo suspendida se transfieren a una placa de microtitulación de 96 pozos (Costar) y se mide la absorbancia de la solución a 458 nm por un lector de placa espectrofotométrico (Molecular Devices, SpectraMAX 250) . Se calcula la cantidad de perácido en cada muestra suspendida utilizando una curva estándar generada bajo las condiciones anteriores con ácido peracético a concentraciones variables en la solución de ensayo (sin enzima) .
Proporción de perhidrólisis/Hidrólisis Proporción de perhidrólisis/hidróliss = perhidrólisis medida en el ensayo de perhidrólisis/ (Ácido total detectado en el ensayo de hidrólisis - Perhidrólisis medida en el ensayo de perhidrólisis) Los resultados ' de estos experimentos se proporcionan en las figuras 7, 10 y en la figura 11. La figura 7 proporciona una gráfica la cual muestra la proporción de ácido perbutírico respecto a ácido butírico generada por diversas enzimas a partir de tributirina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM en 40 minutos. La figura 10 muestra la proporción de ácido perbutírico y ácido butírico generada por diversas enzimas a partir de tributirina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM en 4, 10 y 30 minutos. La figura 11 muestra la proporción de ácido peracético a ácido acético generada por diversas enzimas a partir de triacetina 10 mM y peróxido de hidrógeno 29 mM a los 4 y 10 minutos. Los resultados que se obtienen en estos experimentos indican que los homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis presentan una proporción superior a 1 en los ensayos de OPD/GC descritos antes, mientras que otras clases de enzimas presentan proporciones significativamente por debajo de 1. La Tabla 2-1 proporcionan datos que muestran la actividad de perhidrólisis dé diversos homólogos descritos en la presente sobre triacetina en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. Los resultados que se proporcionan en la Tabla 2-2 indican que la perhidrolasa tiene actividad sobre una amplia gama de sustratos. Además de los resultados proporcionados en estas tablas, las figuras 8 y 9 proporcionan datos que muestran que la perhidrolasa de la presente invención tiene actividades en un intervalo de pH y temperatura amplios .
B. Ensayo de generación de perácido de perhidrolasa típico: La perhidrolasa es activa sobre un intervalo amplio de pH y temperatura y acepta una amplia gama de sustratos para transferencia de acilo. Los aceptores incluyen agua (hidrólisis) , peróxido de hidrógeno (perhidrólisis) y alcoholes (transferencia clásica de acilo) . Para las mediciones de perhidrólisis se incuba la enzima en un amortiguador de elección a una temperatura especificada con un éster sustrato en presencia de peróxido de hidrógeno . Los sustratos típicos utilizados para medir perhidrólisis incluyen acetato de etilo, triacetina, tributirina, esteres de acetato de neodol etoxilado y otros . Además , se encontró que la enzima natural es capaz de hidrolizar nitrofenilésteres de ácidos de cadena corta. Estos últimos son sustratos convenientes para medir la concentración de enzima. En algunas modalidades el perácido ácido y el ácido acético se mide por los ensayos ABTS o CLAR como se describe en lo siguiente. La hidrólisis de nitrofeniléster también se describe en lo siguiente. C. Ensayo ABTS (un mililitro) : Este ensayo proporciona una determinación del ácido peracético producido por la perhidrolasa.- Este protocolo se adapta de Karst et al . , Analyst, 122:567-571
[1997]). Brevemente, se agrega una alícuota de 100 µl a una solución que va a ser analizada a 1 ml de citrato de K+ 125 mM, pH 5, ABTS 1 mM, Kl 50 µM. Se mide la absorbancia a 420 nm para mayor sensibilidad. No obstante, algunas veces se utilizan longitudes de onda adicionales múltiples sobre el espectro de absorción amplio de ABTS . Se construyen curvas de calibración en base en series de concentración de perácido conocidas .
D_. CLAR (Modelo - Agilent 1100) Determinación de los productos de reacción de perhidrolasa: Para la determinación de la proporción de perhidrólisis a hidrólisis de la reacción de perhidrolasa, las muestras de reacción de perhidrolasa se extinguen por acidificación hasta una concentración final de ácido metansulfónico 0.24% y los productos se separan por CLAR en fase inversa sobre una columna Dionex OA (catálogo #062903; Dionex Corporation, Sunnyvale, CA) . La fase móvil es NaP04 100 mM, pH 3.9 (el amortiguador se prepara al titular Na2P04 100 mM con ácido metansulfónico a pH 3.9) que se corre bajo condiciones isocráticas a 30 °C. La detección es a 210 nm. Se calculan las concentraciones de productos por comparación de las áreas pico integradas contra los estándares de calibración. E. Ensayo cinético de hidrólisis de nitrofeniléster Se incuban la enzima y el sustrato en Tris/HCl 100 mM, pH 8.0 (o B(0H)3 50 mM, pH 9.5 u otro amortiguador). Se determina la absorbancia a 402 nm. En algunos experimentos el ensayo se lleva a cabo en cubetas estándar de 1 ml mientras que en otros experimentos se utilizan pozos de placa de microtitulación. Se utiliza este último método para el cribado de bibliotecas' mutantes . Se determina la concentración de enzima por comparación con curvas estándar que se obtienen bajo las mismas condiciones de reacción. F. Ensayo de hidrólisis de caproato de para-nitrofenilo Se prepara una solución de sustrato pNC6 al mezclar pNC6 1 mM (solución concentrada 100 mM) , 1 ml de DMSO, 19 ml de fosfato 100 mM (pH 8) y glicerol hasta una concentración final de 10%. Para ensayar las muestras se agregan 10 µl del Usado celular a 190 µl de la solución de sustrato y se realiza el ensayo a 405 nm durante 15 minutos en un espectrofotómetro. Los resultados se presentan como el promedio de dos experimentos . G. Ensayo de hidrólisis de acetato de para-nitrofenilo (pNA) Las alícuotas del sobrenadante de células Usadas se diluye 1-100 en amortiguador de fosfato 100 mM (pH 8) . Para ensayar las muestras, se colocan 5 µl del sobrenadante de células diluido 1-100 dentro de cada pozo de una placa de microtitulación. Después se agregan 195 µl de la mezcla de amortiguador de reacción/sustrato (pNA 1 mM, fosfato 100 mM, pH 8, glicerol 10%) y se mide la velocidad de absorbancia a 405 nm durante 3 minutos (programa de cinética, lector de placa de microtitulación) . Los resultados se presentan como el promedio de dos experimentos .
EJEMPLO 3 Ensayos que incluyen Composiciones Detergentes En este ejemplo se proporcionan sistemas de ensayo que se utilizan para el cribado para detectar actividad de perhidrolasa superior en _ detergentes con sustratos particulares. Estos ensayos incluyen aquellos que miden la degradación de perácido por perhidrolasa así como la actividad de síntesis de perácido de la enzima. Materiales y Métodos para la formación de Ácido Peracético (PAF) y Degradación de Ácido Peracético (PAD) Esta sección proporciona los materiales y métodos utilizados para el cribado en búsqueda de perhidrolasas superiores en Ariel con sustrato de éster C9E20AC Materiales Ariel Futur, sin blanqueador, perfume o enzimas (P & G, Ariel "C") C9E20AC (P & G) Peróxido de hidrógeno 30% (Sigma) Ácido peroxiacético 32% ("perácido", PAA) (Sigma, catálogo #) MW = 76.05; 4.208 M Ácido cítrico anhidro MW = 192.12 Hidróxido de potasio MW = 56.11 ABTS (Sigma catálogo # A1888) MW = 548.68 Yoduro de potasio MW = 166.0 Fosfato de potasio, monobásico y dibásico Soluciones concentradas Concentrado de detergente Ariel: Se disuelve Ariel Futur sin blanqueador, perfume o enzimas ("Ariel C") en agua, a 6.72 g/l. Se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos, después se permite que sedimente. Posteriormente se divide en alícuotas convenientes y se almacena a 4°C hasta que se utiliza. Cuando se elabora y se utiliza fresco, la solución se filtra, en vez de que sedimente. C9E20Ac 100 mM en concentrado de detergente Ariel: primero se agregan 30 µl de C9E20Ac a 970 µl de concentrado de detergente Ariel, utilizando una pipeta de desplazamiento positivo. Se somete a sonicado en un baño de sonicador hasta que se forma una dispersión lechosa (15-60 segundos) . La dispersión es estable durante aproximadamente dos horas. Cuando se utiliza, se usan 10 µl de la dispersión por ml de mezcla de reacción. Concentrado de ácido peroxiacético 42 mM: justo antes del uso, la solución PAA Sigma 32% se diluye 1:100 en agua. Después se agregan 5.7 µl de concentrado 42 mM por ml de mezcla de reacción. Peróxido de hidrógeno 2 M: Se agrega 1 ml de peróxido de hidrógeno Sigma 30% a 3.41 ml de agua. Esta solución se prepara fresca, justo antes de su uso. Se utiliza a 10 µl por ml de mezcla de reacción. Amortiguador de Citrato 125 mM, pH 5.0: Esto se prepara a 24.0 gramos por litro. Se elabora en 800 ml y se tritura hasta pH 5.0 con KOH 50%.~Se ajusta el volumen a 1 litro y se almacena a temperatura ambiente. Concentrado de ABTS 100 mM: Esto se prepara utilizando 549 mg .de ABTS en 10 ml de agua. Se congela a '- 80 °C, en alícuotas convenientes en tubos Eppendor opacos. El concentrado es estable indefinidamente cuando se mantiene congelado en la oscuridad. ABTS precipitará cuando se caliente de -80 °C pero regresará a solución cuando se mezcle. Cuando se utilice, se usan 10 µl de concentrado de ABTS por ml de reactivo ABTS. Kl 250 mM: esto se prepara como 415 mg en 10 ml de agua. Se mantiene a 4°C. Se diluye a 25 mM de concentrado de trabajo y se utilizan 2 µl de concentrado de trabajo por ml de reactivo ABTS. Amortiguador de fosfato de potasio 25 mM, pH 8.0: Método : La noche antes de la realización de los ensayos las placas que contienen células usadas y que contienen perhidrolasa se verifican para asegurarse que se han congelado dos veces. En el día del ensayo, se permite que las placas se recalienten durante 30 a 45 minutos. Se prepara el reactivo ABTS y el equipo Multidrop (instrumento Multidrop 384, ThermoElectron) para rellenar las placas de detección con 200 µl por pozo. Se almacenan las placas rellenadas cubiertas a temperatura ambiente en la oscuridad, hasta que se necesitan. Las diluciones de los estándares se preparan de manera que cuando se agregan 20 µl del estándar diluido a la mezcla de reacción de 180 µl, la concentración en el pozo es de 1 ppm. Se preparan 4 diluciones seriadas dobles a un conjunto de seis estándares, con una concentración final de 1, 0.5, 0.25, 0.125 y 0.0625 ppm en los pozos. Para probar, se agregan 20 µl de los estándares a la placa de dilución 1:10 recalentada. Las mezclas de reacción se preparan y se utiliza Multidrop para llenar una placa de reacción para cada placa que se va a ensayar (180 µl/pozo) . Debe hacerse notar que las mezclas de reacción son diferentes para los ensayos PAF y PAD.
Ensayo de hidrólisis de perácido (degradación de perácido, PAD) : Este ensayo mide la cantidad de ácido peracético remanente después de incubación durante 100 minutos con enzima en un fondo de detergente Ariel. La cantidad de perácido remanente se detecta al hacer reaccionar una alícuota de la mezcla de reacción con el reactivo de detección ABTS . En este ensayo se transfieren muestras de enzimas de 20 µl de la placa de dilución 1:10 recalentada, una columna a la vez con un pipeteador de 8 canales, dentro de la columna correspondiente de la placa de reacción PAD prerrellenada. Se inicia un cronómetro tanto pronto como se produce la transferencia desde la primera columna; las columnas subsecuentes se transfieren a intervalos de 15 segundos (es decir, la última columna se termina con 2 min, 45 seg después de inicio de la primera) . La placa se mezcla durante 30 segundos en el ther omixer (750 rpm, para evitar salpicado) . La placa después se transfiere a una cámara humidificada a 25°C. La placa se incuba durante un total de 100 minutos a partir del momento en que se agrega a la primera columna la enzima. A los 100 minutos de incubación se retira la placa de reacción del incubador. Después se transfieren alícuotas de la mezcla de reacción a una placa de reactivo ABTS en el mismo orden y con el mismo intervalo de tiempo de 15 segundos en que fueron agregados las muestras se enzimas originalmente a la placa de reacción. Se permite que la placa ABTS sedimente a temperatura ambiente durante 3 minutos después de que se ha agregado la última columna de mezcla de reacción. La placa después se lee en un lector de placa espectrofotométrico a 420 y 740 nm.
Ensayo de perhidrólisis (formación de perácido, PAF) Protocolo Optimizado de Multidro : cribado para una perhidrólisis superior en Ariel con el sustrato de éster de C9E20AC Los mismos materiales y soluciones concentradas descritas en lo anterior para PAD se utilizaron en estos experimentos, como se indica en lo siguiente.
Método : Los métodos se diseñan para ensayar alícuotas de 20 µl a partir de una placa de dilución 1:100. Las placas de 20 µl de ensayo de dilución 1:100 se producen durante el procedimiento de obtención de las concentraciones de proteína y se almacenan a -80 °C. Las placas se recalientan durante aproximadamente 30 a 45 minutos antes de su uso. Se preparan diluciones de los estándares S54V, de manera que cuando se agregan 2 µl del estándar diluido a los 20 µl del lisado de células diluidas 1:100, la concentración del pozo es de 0.1 ppm. Se preparan cuatro diluciones seriadas dobles para producir un conjunto de seis estándares: 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 y 0.00625 ppm de concentración final en los pozos. Después, se agregan 2 µl de los estándares a las placas de 20 µl de ensayo de dilución 1:100 recalentadas en los pozos indicados .
Ensayo de perhidrólisis (formación de perácido, PAF) : Este ensayo mide la cantidad de ácido peroxiacético que se produce durante 10 minutos a partir del sustrato C9E20Ac en un fondo de detergente Ariel. La cantidad de perácido que se forma se detecta después de 10 minutos por reacción de una alícuota de la mezcla de reacción con el reactivo de detección ABTS . Se utiliza el equipo Multidrop para suministrar 180 µl/pozo de la mezcla de reacción PAF a la placa de dilución preparada 1:100. El cronómetro se inicia y la placa de reacción se coloca sobre el equipo thermomixer, con la temperatura ajustada a 25°C. La placa se cubre y las soluciones se mezclan durante 30 segundos a 750 rpm. Después se permite que la placa repose en el equipo thermomixer sin mezclado, durante un total de 10 minutos a partir del momento en que se agregó la mezcla de reacción. A los 10 minutos, se utiliza el equipo Multidrop para agregar 20 µl/pozo del reactivo ABTS lOx. El reactivo lOx es una suspensión lechosa. Se utiliza el equipo thermomixer para agitar brevemente la placa. El reactivo ABTS entra en solución con rapidez. Se permite que la placa repose a temperatura ambiente durante 3 minutos después de lo cual se agrega el reactivo ABTS. Después se lee la placa en un lector de placa espectrofoto ét rico a 420 n .
EJEMPLO 4 Clonación de perhidrolasa de Mycobacteritun smegmatis En este ejemplo se describe la clonación de perhidrolasa de M. smegmatis . Una enzima con actividad de aciltransferasa se purifica a partir de Corynebacterium oxydans (ahora, Miycobacterium parafortuitum ATCC19686) . Se obtienen dos secuencias peptídicas a partir de la proteína purificada. Un péptido se determina por degradación de Edman por el método de separación con bromuro de cianógeno de la enzima purificada utilizando los métodos conocidos en la técnica. La secuencia de este péptido se determina que es KVPFFDAGSVISTDGVDGI (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3) . El segundo péptido se analiza utilizando el secuenciado N terminal y se encuentra que tiene la secuencia GTRRILSFGDSLTWGWIPV (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4) . Una búsqueda BLAST contra la base de datos de genoma no terminada TIGR identifica una secuencia de interés potencial en Mycobacterium smegma tis, la cual se muestra lo siguiente: MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGLSARTTNID DPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVIIMLGTNDTKAYFRRTPLDIALGMSVLVTQVLTSA GGVGTTYPAPKVLVVSPPPLAPMPPHPWFQLIFEGGEQKTTELARVTSALASFMKVPFFDA GSVISTDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) . La secuencia correspondiente de ADN del gen es: 5*- ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATGCCCTGACCTGGGGCTGGGTCCC CGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCGCTGGACC GGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGAC TGAGCGCGCGCACCACCAACATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCAACGG CGCGAGCTACCTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTCGACCTGGTG ATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACCCCGC TCGACATCGCGCTGGGCATGTCGGTGCTCGTCACGCAGGTGCTCACCAGCGC GGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTGGTGGTCTCGCCG CCACCGCTGGCGCCCATGCCGCACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAGGGCG GCGAGCAGAAGACCACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCGTCGTT CATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCACCGACGGCGTC GACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGGCCCTCG CGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTAA-3' I , , „ „ . (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 1 ) Se diseñan los cebadores sobre la secuencia de gen para amplificar y clonar el gen . Los cebadores utilizados para amplificación son : MsRBSF : 5 ' -CT?ACAGGAGGAATTAACCATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCT-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 5 ) MspetBamR: 5' -GCGCGCGGATCCGCGCGCTTACAGCAGGCTCCGCACCTGTTCCGCGAGGGCCACCCCGA-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6) La amplificación del gen se realiza por PCR utilizando ADN polimerasa Taq (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante, con aproximadamente 500 ng de ADN cromosómico de Mycobacterium smegmatis como el ADN plantilla y la adición de DMSO 1% a la mezcla de reacción de PCR. Se agregan a la mezcla treinta picomoles de cada uno de los cebadores MsRBSF y MspetBamR. El ciclo de amplificación es: 30 ciclos de (95°C durante 1 min, 55 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min) . Los fragmentos obtenidos a partir de la reacción de PCR se separan en un gel de agarosa 1.2% y se identifica una banda única del tamaño esperado de 651 pares de bases (secuencia codificante y codón de detención) . Esta banda se clona directamente en el vector de clonación pCR2.1 TOPO (Invitrogen) y se transforma en células E. coli Top 10 (Invitrogen) con selección en agar L (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 20 g/l de agar) que contiene 100 µg/ml de carbenicilina y X-gal (20 µg/ml, Sigma-Aldrich) para selección azul/blanco y se incuba durante la noche a 37 °C. Se analizan cinco colonias blancas para determinar la presencia del fragmento de PCR. Se utiliza cada colonia para inocular 5 ml de caldo L (agar L sin la adición de agar) que contiene 100 µg/ml de carbenicilina y los cultivos se hacen crecer durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm. El ADN plasmídico se purifica a partir de los cultivos utilizando el equipo Quikspin (Qiagen) . La presencia del fragmento correcto se determina por digestión con enzima de restricción con EcoRl para liberar el fragmento y se secuencia utilizando cebadores suministrados por el fabricante de pCR2.1 (Invitrogen). El plásmido correcto se denomina pMSATNcoI (véase la figura 12, para el mapa de este plásmido) . La secuencia de este plásmido se proporciona en lo siguiente: agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaag cgggcagtgagcgcaacgc^ttaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtetgtt gtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctatttaggtgacactatagaat actcaagctatgcatcaagcttggtaccgagctcggatccactagtaacggccgccagtgtgctggaattcgcccttctaacagga ggaattaaccatggccaagcgaattctgtgtttcggtgattccctgacctggggctgggtcccc^ gagcggttcgccc?ccgacgtgcgctggaTCggtgtgctggajcagcagctcggagcggacttcgaggtgatcgagga tgagcgcgcgcaccaccaacatcgacgaccccaccgatccgcggctcaacggcgcgagctacctgccgtcgtgcctcgcgac gcacctgccgctcgacctggtgatcatcatgctgggcaccaacgacaccaaggcctacttccggcgcaccccgctcgacatcgc gctgggcatgtcggtgctcgícacgcaggtgctcaccagcgcgggcggcgtcggcaccacgtacccggcacccaaggtgctg gtggtctcgccgccaccgctggcgcccatgccg?^ gctcgcccgcgtgtacagcgcgctcgcgtcgttcatgaaggtgccgttcttcgacgcgggttcggtgatcagcaccgacggcgtc gacggaatccacttcaccgaggccaacaatcgcgatctcggggtggccctcgcggaacaggtgcagagcctgctgtaaaaggg cgaattctgcagatatccatcacactggcggccgctcgagcatgcatctagagggcccaattcgccctatagtgagtcgtattaca attcactggccgtcgtt tacaacgtcg^gactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccltgc^^ cagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgc8ttcccaacagttgcgcagí^atacgtacggcagtttaaggtttac acctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgccggggcgacggatggtgatccc cctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatga tgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaa cgccattaacctgatgttctggggaatataaatg caggcatgagattatcaaaaaggatcttcacctaga^ ga;agtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctecígggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaaga gaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgategclagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgc^ ctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaa ggatggctttctcgccgccaaggatctgatggcgcaggg gatcaagctctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgg gtggagaggctattcggctatgac?gggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttct tgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggcca cgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctottgggcgaagtgccggggc aggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccgg ctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatg atctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatct cgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctggg tgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctac8gtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctc gtgctttacggtatcgccgctc^cgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatt tc??gatgcggtattttctccttacgcatctg^^ cctatttgtttatttttcíaaatacattcaaatatgtatccgctcatg^ gggccaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgac cggctcgggttctcccgggac tcgtggaggacgacttcgccggígtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtc caggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggagg tcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggQgagcagccgtgggggcgggagttcgccct gcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtgctaaaacttcatttttaatttaaaagg atctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaa gatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgc?gcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggmgttt g8ggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgt8ttctagtgtagcc gtagttagg8accactt8agaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtgg cgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg cacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaartgag aagggagaaaggcggacaggtatccggíaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttocagggggaaac gcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc^ gaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggg gtggataa^cgtettaccgcctttgagtgagctgata^ ggaagcggaag (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 13) Construcción del Plásmido de Expresión de Perhidrolasa T7 El par cebador utilizado para crear pMSATNcol también se utiliza para crear el sitio Ncol (CCATGG) en el cual el ATG es el codón de inicio del gen para aciltransferasa y BamRl (GGATCC) justo después del codón de detención TAA. El plásmido se pMSATNcoI se digiere con NcoI/BamHl como lo ha recomendado el fabricante (Roche) y se purifica un fragmento de 658 pares de bases que contiene el gen para perhidrolasa utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo Sambroo et al.). El fragmento se liga utilizando procedimientos estándar conocidos en el arte (por ejemplo Sambrook et al.) en el plásmido de expresión de promotor T7, pETl6b (Novagen), también digerido con NcoI/BamHl. La reacción de ligación se transforma por procedimientos estándar en células E. coli Top 10 (Invitrogen) y se selecciona en agar L que contiene 100 µg/ml de carbenicilina, durante la noche, a 37 °C. Se toman 10 colonias de varios transformantes y se utilizan para inocular 5 ml de LB que contiene 100 µg/ml de carbenicilina. Los cultivos se hacen crecer durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm. El ADN plasmídico se purifica de los cultivos utilizando el equipo Qiagen Quikspin (Qiagen) . La presencia del fragmento correcto se determina por digestión con enzima de restricción con NcoI/BamHl como lo indica el fabricante. El plásmido correcto se denomina pMSATNcoI-1 (véase la figura 13 para un mapa de este plásmido) . En esta figura, los siguientes elementos están indicados Lacl: gen que codifica para la proteína represora Lacl, que se localiza en los pares de bases 1455-2534, ori : plásmido origen de replicación en los pares de bases 4471, bla: el gen para ß-lactamasa que se localiza en los pares de bases 6089-5232; promotor T7: que se localiza en los pares de bases 1068-1052; terminador T7 : que se localiza en los pares de bases 259-213, per: gen de perhidrolasa de M. smegmatis que se localiza en 981-334. La secuencia de este plásmido se proporciona en lo siguiente : ttctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatga^ atctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcct cttgcgggatatccggatatagttcctcctttcagcaaaa^ gctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatccgcgcgcttacagcaggctccgcacct gttccgcgagggaaccccgagatcgcgattgttggcctcggtgaagtggattccgtcgacgccgtcggígctgatcaccgaac ccgcgtcgaagaacggcaccttcatgaacgacgcgagcgcgctgtacacgcgggcgagctcagtggtcttctgctcgccgccc tcgaagatcaactggaaccaggggígcggcatgggcgccagcggtggcggcgagaccaccagcaa?gggtgccgggtac gtggtgccgacgccgcccgcgctggtgagcacctgcgtgacgagcaccgacatgcccagcgcgatgtcgagcgggg^cgc cggaagíaggccttggtgtcgttggtgcccagcatgatgatcaccaggtcgagcggcaggtgcgtcgcgaggcacgacggcag gtagctcgcgccgttgagccgcggatcggtggggtcgtcgatgtt^ tccgctccgagctgctgggccagcacaccgg ccagcgcacgtcgggggcgaaccgctcggtgggtgccccgtcttcgacgg ggacccagccccaggícagggaatcaccgaaacacagaattcgcttggccatggtatatctcc^cttaaagttaaacaaaattattt 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ccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgctcgcggctcttaccagcctaacttcgatcac tggaccgctgatcgtcacggcgatttatgccgcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctatac c^gtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaagccggcggcacctcgctaacg gattcaccactccaagaattggagccaatcaattcttgcggagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatc gcgtccgccatctccagcagccgcacgcggcgcatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcct gtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcga ctgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcgg^ccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtc agcgcartgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgrt^^ ctggcattgaccctgagtgatttttctctggtccc^^ tgttcat8tcagtaacx;cgtatcgtgagcatcctct(?cgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacgga ggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttc ggagaaactc aacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcg 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Las células se hacen crecer durante la noche a 37 °C. Se selecciona un transformante y la • cepa se denomina MSATNcol.
Producción de perhidrolasa en MSATNcol La producción de perhidrolasa se realiza en cultivo celular. Por ejemplo, se inoculan 5 ml de LB con carbenicilina a una concentración de 100 µg/ml con una colonia única de MSATNcol y se hace crecer durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm. Este cultivo se utiliza para inocular 100 ml de LB con carbenicilina a una concentración de 100 µg/ml (en un matraz de 250 ml con reflectores) hasta una DOeoo de 0.1. Los cultivos se hacen crecer a 30 °C con agitación a 200 rpm hasta que alcanzan una DOeoo de 0.4. La expresión del gen para hidrolasa después se induce por la adición de IPTG 100 µM y la incubación continúa durante la noche. Los cultivos se cosechan por centrifugación (10 min a 7000 rpm, rotor Sorvall SS34), se separa el sobrenadante y los sedimentos se lavan con KP04 50 mM, pH 6.8. Las células se centrifugan nuevamente, los sobrenadantes se separan y se determina el peso húmedo de las células. Las células se resuspenden en KP04 100 mM en un volumen que es 4x el peso húmedo. Las células resuspendidas se congelan a -70 °C. Las células después se recalientan y lisan en una prensa French de células utilizando procedimientos estándar conocidos en el arte. Las etapas de purificación y los métodos de determinación se proporcionan en el ejemplo 1. La figura 6 proporciona una tabla de purificación que muestra la actividad enzimática de la perhidrolasa de la presente invención a través de diversas etapas en el procedimiento de purificación.
La perhidrolasa de M. smegmatis está en un Operón En experimentos adicionales se determina que la perhidrolasa de M. smegmatis es parte de un operón. El gen [phd) es el primer gen en un operón que contiene por lo menos dos genes, que incluyen phd, que están separados por 10 pares de bases (GGCTGGGGGC [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7]) y que no incluyen el codón de detención TA? de phd. También es posible que existan tres genes en el operón, en donde el tercer gen es de 48 pares de bases o 61 pares de bases respecto al siguiente ORF (marco de lectura abierto) . Los últimos dos genes candidatos no tienen homología significativa con las proteínas en la base de datos . Se identifica un promotor putativo para el operón phd de M. smegma tis, TTGGGC (-35) SP (18) CCAGAT mediante análisis de secuencia y comparación con los promotores conocidos de M. smegmatis (véase, por ejemplo, Salazar et al., Microbiol., 149:773-784
[2003]). No se pretende que la • presente invención este limitada a algún promotor y/o diseño de construcción particulares, en la medida en que se contempla que otros diseños de promotores y construcciones encontrarán uso en la presente invención. El segundo gen en el operón phd codifica para una proteína (PBP-3 putativa) con la secuencia: mhl-faltwllwg-fisvvgcssspdpadi afa^^ La secuencia de ADN correspondiente del gen que codifica para PBP-3 putativa: atgcacttacgtcccgctetgacgtggctcc^ accggttctcggcgttcgccgaggcgctgggccg?aggatgcggccgcggcggccgcccagaccagcgatcc^ gcggaggcggccatcaccgcgatgctggccgggatgggcgacg^^ cgacgacgcgggcgcgacgctgaagtacacgtggacctggggtgagggccgcgacttcggctacgacaccaccgcgacggc ggccaaatccgg gacgactggctgatcacctggtcccccaccgtgttgcaccgcgacctcaccccggatctgcgcttccagtac agcgaggacagcgaattgcagaccccggtgctcgaccgcaccggccagccgttgatgacatggcagaccgtcggtgtcatcac tgtcgaacgcgcacatccggagtcggccgcaccgctcgccgccctgctggcgcccítcgatccgaccaccaccaccgaatcgg tcaccgcacaactcaattcgacgaccgatgaccgcgtgacggtgatgaagcígcgcgaggacgatctgggtcaggtgcgcgat cagctcgcgcagatccccggcgtgaccgtg^ cagcggcctggacgagctgtggcacgaccggatcaccg8^^ c gcacaacagctcacgtccacgccgcccaaggacaccgggcccgtgcgcaccacgctggaccígcgcatgcaactgctcg cgcagcaggccgtggccaaggagacccgcccggccgtggt^^ cacagaacccggccgccgatccgcaaggtgcgatcgcgttttcgggcctgtacccgccggggtcgacgttcaagaccatcacc acggcggcagccctcgacgcgggartggccacc8^^ acgatccccaacgacgacaacttcgacctgggcaccgtgccgttgtcgtcggcgttctcgcactcctgcaacaccagcatggcc gccctgtccgacgagctgccgcccaacgcactgaccgacatggcaaaggacttcgggatcggcgtcgacttcatggtgcccgg cctgaccaccgtgaccggccgtgtccccaacgccgacaacgccgcccagcgtgtcgagaacggcatcggccagggcaccgt gaccgtcagcccgttcggcctcgccgtcgccgaggccagcctggcgcacggttcgacgatcctgccgacgctggtcgacggc gagaagaccacggccgacaccccgtcggtgccgttgccgccc^acatcaccgacgcgctgcgcgcgatgatgcgcggaacg gtcaccgagggcacggccaccgcgttgagcgacatccccgaatgggcggcaagaccggcacggcggaattcggcgacaac acgcactcgcacgg ggttcgcgggcatcgcgggcgacatcgcgttcgcgacgctggtggtcggcggcga^ cggccgtcgcgatctcaggagacttcctgcgccccgcgctcgccggctag (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8) Una investigación BLAST estándar contra la base de datos de proteínas identifica homología con varias proteínas que unen penicilina, clase 3 (PBP-3) . Mediante alineación de secuencia y comparación con la literatura (por ejemplo, Goffin y Ghysen, Micfobiol. Mol. ' Biol. Rev., 66:702-38
[2002] ) , se encuentra que PBP contiene los códigos de barra requeridos (secuencias proteínicas conservadas que definen una clase de proteínas) para colorearla en la superfamilia SxxK de las acil transferasas con un dominio C terminal de acil transferasa y un dominio N terminal de función desconocida, pero con homología a las fusiones de proteína Penr (es decir, resistente a penicilina) de la case II y III similares a B. Este dominio de acil transferasa de la proteína de unión de penicilina no comparte homología significativa con la perhidrolasa de la presente invención, aunque comparte homología con las acil transferasas dependientes de Co-A conocidas en la técnica. La secuencia de aminoácidos se proporciona en lo siguiente.
MHULPALTWLLV?G FISV GCSSSPDPADL^SAFAEALGRIFAAAAAAQTSDP AAAEAAITAMIAGMGDAANVSVAAEPEBGDDAGATLKYTWTWGEGRDFGYDT TATAAKSGDDWL?,WSPT ^E-RDLTPDLRPQYSEDSEI 2TP\TLDRTGQPLMGWQ WGV-TVERAHPESAAPIAALI^FDPTTTTESWAQ LGQVRDQLAQIPGV V EQGELLTADRQLSSPAISGLDELWHDRITANAGWSVYL VDADGAPAQQLTSTPPKDTGPVRTTLDLRMQLLAQQAVAKETRPAVWAISGS TGGILAAAQNPAADPQGAIAFSGLYPPGSTFKT?TAAALDAGLATPDTPVACPG ELTIENRTLPL^DNFDLGTWLSSAFSHSC 'SMAAI^DELPPNALTDMAKDFGIG VOFN4 FGLTTV GRVPNADNAAQRVENGIGQGTVTVSPFGLAVAEASLAHGS? LPTLVOGEKTTADTPSWLPPNTROALRAMMRGTVTEGTATALSDIPDLGGKTGT AEFGDNTHSHGWFAGIAGDIAFAT WGGDSSAPAVAISGDF RPALAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10) El código de barras que identifica a la familia se proporciona en la revisión anterior es: (19) V (20) G/A (140) PVxDRTG (142) TxDx3Q (22) TGGxLAx4PaxDP 813) SxxK (51) SCN (131 KTG (50) marcado en negrillas en la secuencia anterior.
Las letras representan la secuencia de aminoácidos que define el código de barras; los números entre paréntesis son el número intermedio de aminoácidos entre los códigos de barras particulares; ??x" representa cualquier aminoácidos (es decir, los aminoácidos que no están conservados dentro del código de barras pero el número de aminoácidos (por ejemplo x3, que corresponde a 3 aminoácidos intermedios) se conserva) . En base en estos resultados y en otros datos, como se describe en la presente, es evidente que la perhidrolasa de la presente invención representa una clase de enzima única.
EJEMPLO 5 Expresión de la perhidrolasa en P. citrea En este ejemplo se describen métodos utilizados para expresar la perhidrolasa en P. citrea . El plásmido pMSATNcoI se transforma en P. citrea por electroporación utilizando el método esencialmente como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra) excepto que todos los cultivos y la recuperación se realizan a 30 °C. Los transformantes se siembran en placas sobre agar L + carbenicilina (200 µg/ml) y se incuban durante la noche a 30 °C. Se toman para análisis tres transformantes. Cada colonia se utiliza para inocular un cultivo de 30 ml de LB + carbenicilina (200 µg/ml) y se hacen crecer durante la noche a 30 °C, con agitación a 200 rpm. Las células se sedimentan por centrifugación, se lavan una vez en amortiguador de fosfato 50 mM, pH 7.2 y finalmente se resuspenden en 4x de peso de célula húmeda de amortiguador de fosfato 100 mM, pH 8.0. Las células se lisan por tratamiento con lisosoma (2 µl de una solución de 10 mg/ml por uno ml de cultivo de P. citrea ) a 37 °C durante una hora. El residuo celular se sedimenta a 13,000 rpm en una microcentrifuga durante 5 min. El sobrenadante resultante se utiliza para análisis adicional en SDS-PAGE y transferencia Western, así como ensayos para determinar actividad enzimática. El análisis por SDS-PAGE se lleva a cabo como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra) sobre los sobrenadantes. La detección de la proteína perhidrolasa por transferencia Western se realiza utilizando un antisuero policlonal antiperhidrolasa (preparado a partir de proteína perhidrolasa purificada por Covance) . La transferencia se revela como lo sugiere el fabricante utilizando el equipo ECL plus (Amersham) . La actividad enzimática de la perhidrolasa expresada se detecta por el ensayo pNB ( butirato de para nitrofenilo) como se describe en el ejemplo 1, en la presente. Los resultados se proporcionan en la Tabla 5-1. Actividad enzimática de Perhidrolasa expresada por P. citrea Clon DO405 Velocidad Concentración (mgA) P.citrea/pMSATNcoI 3.1129 0.47948 7.1922 Control (P. citrea ) 2.6187 -9.8312 0 Los resultados de SDS-PAGE y transferencia Western, así como los resultados de ensayos indican que la perhidrolasa se expresa por P. citrea y está activa.
EJEMPLO 6 Expresión de la perhidrolasa en Bacillus súbtilis La perhidrolasa se expresa intracelularmente en B. subtilis . Una diversidad de promotores encuentran uso en esta modalidad e incluyen, pero no se limitan a pSPAC, pAprE, pAmyE, pVeg, pHpalI. En algunas modalidades la construcción está presente en un plásmido replicante (por ejemplo pBHl) mientras que en otras modalidades se integra en el cromosoma en una o más copias. Los ejemplos de sitios para integración incluyen, pero no se limitan a las regiones aprE, amyE, veg o pps . En realidad, se contempla que otros sitios conocidos por aquellos expertos en la técnica encontrarán uso en la presente invención.
A. Expresión Intracelular de la Perhidrolasa en Bac±llus subtilis a partir de un plásmido replicante B. subtilis expresa una lipasa/esterasa codificada por el gen pnbA que hidroliza el sustrato pNB utilizado para detectar actividad de la perhidrolasa. Para identificar cepas de B. subtilis que expresan la perhidrolasa después de transformación con plásmidos replicantes o integrantes, el gen pnbA (la secuencia codificante completa) primero se suprime del hospedador deseado utilizando el método de supresión de cásete loxP < descrito en WO 03/083125, incorporado en la presente como referencia. También se hace notar que otras cepas de Bacillus puedan contener una o más lipasas/esterasas capaces de hidrolizar el pNB u otro sustrato utilizado como un indicador para actividad de perhidrolasa. En algunas modalidades, para expresión óptima y/o detección de actividad, es necesario suprimir una o más de las lipasas/esterasas de los hospedadores. La cepa de Bacillus subtilis utilizada en este ejemplo tiene el genotipo Bacillus subtilis comKpnbA {KpnbAloxP-spec, aprE, nprE, degUHy32, oppA, spoIIE3501 y se denominará como "B . subtilis pnbA" (véase, por ejemplo WO 03/083125, supra) . En estos experimentos, se utiliza el sitio de unión de ribosoma (RBS) de Bacillus de consenso. No se pretende que el RBS de consenso sea la única secuencia utilizada para expresión, dado que los RBS que no son de consenso también encuentran uso en la presente invención. El RBS de pMSATNcoI (véase ejemplo 4) se cambia al RBS de consenso de Bacillus a partir del ARNr 16S (5' -ATAAGGAGGTGATC-3' [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 132]) de B. subtilis y el sitio üindlll se agrega al extremo 5' del RBS por medio de PCR utilizando un cebador (cebador 502rbsfor ard) que contiene los cambios deseados. La reacción se lleva a cabo utilizando una máquina de PCR Mj Research con 30 ciclos de (1 min a 95°C, 1 min a 55°C y 1 min a 72°C) . Se agrega ADN plantilla (pMSATrbs) a 50 µl de una reacción (10 ng) y se utilizan 10 pM de cada cebador. El cásete phd generado por PCR se clona en el vector de clonación de PCR, pCR-Script CM (Stratagene) y se transforma en células E. coli ToplO (Invitrogen) para producir pAH502R. La secuencia completa de este plásmido se proporciona en lo siguiente. ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatimg aaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttcjcagtttggaacaagagtcca ctattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacc ctaatcaagtíttttggggtcgaggtgccgtaaagcacrtaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgac ggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgc taatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcg caactgttgggaagggcgatcggígcgggcctcttcgctattacgccagc ggcgaaagggggatgtgctgcaaggcga^ taagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgtt^ 5 tagggcgaattgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcctgcagcccggggg atccgc8aagcttaaggaggtgatclagaattccatggccaagcgaattctgtgtttcggtgattccctgacctggggc tgggtccccgtcgaagacggggcacccaccgagcggttcgcccccgacgtgcgctggaccggtgtgctggcccagcagct cggagcggacttcgaggtgatcgaggagggactgagcgcgcgcaccaccaacatcgacgaccccaccgatccgcggctca acggcgcgagctacctgccgtcgtgcctcgcgacgcacctgccgctcgacctggtgatcatcatgctgggcaccaacgac accaaggcctacttccggcgcaccccgctcgacatcgcgctgggcatgtcggtgctcgtcacgcaggtgctcaccagcgc gggcggcgtcggcaccacgtacccggcacccaaggtgctggtggtctcgccgccaccgctggcgcccatgccgcacccct ggttccagttgatcttcgagggcggcgagcagaagaccactgagctcgcccgcgtgtacagcgcgctcgcgtcgttcatg aagg^gccgttcttcgacgcgggttcggtgatcagcaccgacggcgtcgacggaatccacttcaccgaggccaacaatcg i o cgatctcggggtggccctcgcggaacaggtgcggagcctgctgtaaaaggatccccgggaagcttgcatgggctagagcg gccgccaccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagc tgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggt gcctaatgagtgagctaactcacatiaattgcgttgcgctcacrtgca;gctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagct gcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgc tgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggat aacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttcca taggctccgcajccrtgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagat accaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgccttt _ 5 ctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagrtcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagct gggctgtgtgcacgaacc8ccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaa gacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttc ttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagta^ aaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagatta cgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgt taagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttcgaccgaataaatacctgtgacggaag atcacttcgcagaataaataaatcctggtgtccctgttgataccgggaagccctgggccaacttttggcgaaaatgagac gttgatcggcacgtaagaggttccaactttraccateatga^ 0 attttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgta aagaacat ttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggccttttta aagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccgga attacgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaa ctgaaacgttttcatcgctctg^gtgaatac?cgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcg 5 tgttacggtgaaaacctggcctatttc£ctaaagg tttcaecagttttgatttaaacgtggccaatat^ aggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgctta atgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaattttttt^ ggttgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttca gggcagggtcgttaaatagccgcttatgtctattgctggtttaccggtttattgactaccggaagcagtgtgaccgtgtg cttctca^tgcctgaggccagtttgctcaggctctc^^ caaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatg taacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggca aaatgccgraaaaaagggaataagggcgacacgga^tgttgaa tttatcaagggttattgtctcatgagcggatac tatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccg^ atttccccgaaaagtgccac (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN ÚMERO: 133) Los transformantes se seleccionan en agar L que contiene 100 µg/ml de carbenicilina. Se confirma la construcción por secuenciado y ensayos bioquímicos (por ejemplo ensayo de actividad pNB) . Cebador establecido para construcción de pAH502R: Cebador 502rbsForward: 5' -ccaagcttaaggaggtgatctagaattccatggccaagcgaattctgtgtttcg-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 134) Cebador 502Reverse: 5' -ggggatccttttacagcaggctccgcacct-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 135) El fragmento de ADN HidlII-RBS-phd-BamH-I de pAH502R se clona en el vector que contiene pSPAC , pMUTIN4 (véase Vagner et al., Microbiol., 144, 3097-3104
[1998]) lo que genera la construcción pAH503. La secuencia completa de pAH503 se proporciona a continuación: ataattctacacagcccagtccagacrtattcggcactgaaattatgggtgaagtggtcaagacctcactaggcaccttaa aaatagcgcaccctgaagaagatttatttgaggtagcccttgcctacctagcttccaagaaaga cctaacagcacaa gagcggaaagatgt gttctacatccagaacaacctctgctaaaa tatctacaaggtgtggcataatgtgtggaattgígagcgcícacaattaagcttaaggag^gatctagaattccatggc cccccgacgtgcgctggaccggtgtgctggcccagcagctcggagcggacttcgaggtgatcgaggagggactgagcgcg cgcaccaccaacatcgacgacc8accgatccgcggctcaacggcgcgagctacctgccgtcgtgc jtcgc^cgcacct gccgctcgacctggtgatcatcatgctgggcaccaacgacaccaaggcctacttccggcgcaccccgctcgacatcgcgc tgggcatgtcggtgctcgtcacgcaggtgctcaccagcgcgggcggcgtcggcaccacgtacccggctcccaaggtgctg gtggtctcgccgccaccgctggcgcccatgccgcacccctggttccagttgatcttcgagggcggcgagcagaagaccac tgagctcgcccgcgtgtacagcgcgctcgcgtcgttcatgaaggtgccgttcttcgacgcgggttcggtgatcagcaccg acggcgtcgacggaatccacttcaccgaggccaacaatcgcgatctcggggtggccctcgcggaacaggtgcggagcctg ctgtaaaaggatccccagcttgttgatacactaatgcttttatatagggaaaaggtggtgaactactgtggaa acgtaagattacgggtcgaccgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagc tggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctg gtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaa actggcagatgcacggtocgatgcgcccatcta8ccaacgtaacx cc?ttacggtcaatccgccgtttgttccc acggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattat ttttgatggcgttaactcggcgWcatctgíg^ ctgaatttga(^gagcgcatttttacgcgccggagaaaaccgcctcgcggtgatggtgctgcgttggagtgacggcagt tat ggaagatcaggatatgtggcggatgagcggcattttccgtgacgtctcgttgctgcataaaccgactacacaaat cagcgatttwatgttgccai?cgctttaatgatgatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcg agttgcgtgactacctecgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcctttcggc ggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggag cgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcagaagcctgcg atgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaac cgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcagacgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaa caactttaacgccgtgcgctgttcgcattatccgaaccat8gctgtgg^cacgctgtgcgaccgctacggcctgtatg tggtggatgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatgaatcgtctgaccgatgatccgcgctggctaccggcg atgagcgaacgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacccgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatc aggccacggcgctaatcacgacgcgctgtatcgctggatcaaatctgtcgatccttcccgcccggtgcagtatgaaggcg gcggagccgacaccacggccaccgatatta ttgcccgatgtacgcgcgcgtggatgaagaccagcccttcccggctgtg ccgaaatggtccatcaaaaaatggctttcgctacctggagagacgcgcccgctgatcctttgcgaatacgcccacgcgat gggtaacagtcttggcggtttcgctaaal^tggcaggcgtttcgtcagtatccccgtttacagggcggcttcgtrt actgggtggatcagtcgctgattaaatatgatgaaaacggcaacccgtggtcggcttacggcggtgattttggcgatacg ccgaacgatcgccagttctgtatgaacggtctggtctttgccgaccgcacgccgcatccagcgctgacggaagcaaaaca ccag^gcagtttttccagttccgtttatccgggcaaaccatcgaagtgaccagcgaatacctgttccgtcatagcgata acgagctcctgcactggatggtggcgctggatggtaagccgctggcaagcggtgaagtgcctctggatgtcgctccacaa ggtaaacagttgattgaactgcctgaactaccgcagccggagagcgccgggcaactctggctcacagtacgcgtagtgca accgaacgcgaccgcatggtcagaagccgggcacatcagcgcctggcagcagtggcgtctggcggaaaacctcagtgtga cgctccccgccgcgtcccacgccatcc?gcatctgaccaccagcgaaatggatttttgcatcgagctgggtaataagcgt tgg?atttaaccgccagtcaggctttctttcacagatgtggattggcgataaaaaacaactgctgacgccgctgcgcga tcagttcacccgtgcaccgctggataacgacattggcgtaagtgaagcgacccgcattgaccctaacgcctgggtcgaac gctggaaggcggcgggccattaccaggccgaagcagcgttgttgcagtgcacggcagatacacttgctgatgcggtgctg attacgaccgc cacgcgtggcagcatcaggggaaaaccttatttatcagccggaaaacctaccggattgatggtagtgg tcaaatggcga taccgttgatgttgaagtggcgagcgatacaocgcatccggcgcggattggcctgaactgccagctgg cgcaggtagcagagcgggtaaactggctcggattagggccgcaagaaaactatcccgaccgccttactgccgcctgtttt gaccgctgggatctgccattgtcagacatgtataccccgtacgtcttcccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcg cgaattgaattatggcccacac agtggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatgg aaaccagccatcgccatctgctgcacgcggaagaaggwcatggctgaatatcgacggtttccatatggggattggtggc gacgactcctggagcccgtcagtatcggcggaattacagctgagcgccggtcgctaccattaccagttggtctggtgtca aaaataataataaccgggcaggccatg^ctgcrogtafficgcgtaaggaaata;attatgtactatttcaagctaatto - ~ cggtggaaacgaggtcatcatttcctt8gaaaaaacggttgcatttaaatcttacatatgtaatactttca? 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El cásete de ADN pSPAC-RBS-phd se aisla como un digerido de Bglll/Smal y después se subclona en el plásmido replicante pBHl, digerido con Ba ñllEcoRV (véase, por ejemplo, EP 0275509) para crear pAH505 (véase la figura 14) . La secuencia completa del plásmido se proporciona en lo siguiente. gatcttc ;aagatatcctaacagcacaagagcggaaagatgttttgttctacatccagaacaacctctgctaaaattcctgaaaaattt tgcaaaaagttgttgacmatctacaaggtgtggcataatgtgtggaattgtgagcgc?cacaattaagcttaag^^ aattccatggccaagcgaattctgtgtttcggte^^ ggttcgcccccgacgtgcgctgga8ggtgtgct^^ cgcgcgcaccaccaacatcgacgaccccaccgatccgcggctcaacggcgcgagctacctgccgtcgtgcctcgcgacgcac ctgccgctcgacctggtgatcatcatgctgggcaccaacgacaccaaggcctacttccggcgcaccccgctcgacatcgcgctg ggcatgtcggtgctcgtcacgcaggtgctcaccagcg^ 5 ctcgccgccaccgctggcgcccatgccgca sccctggttccagttgatcttcgagggcggcgagcagaagaccactgagctcg cccgcgtgtacagcgcgctcgcgtcgttcatgaaggtgccgttcttcgacgcgggttcggtgatcagcaccgacggcgtcgacg gaatccacttcaccgaggc?aac;aatcgcgatctcggggtggccctcgcggaacaggtgcggagcctgctgtaaaaggatccc atcgcatgcggtacctctagaagaagcttggaga ^aggtaaaggataaaacagcacaattccaagaaaaacacgatttagaac ctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtttataaaataa aaaaagcactfgaaaaggtgtctttttttgatgg tttg ^ gctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaa8cttaaaattggtt aaagttataagtgactaaacaaataactaaatagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagc^ tcaagggttttagtggacaaga aaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgattactttgaact l o tctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgctgaaatatt agaaagttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggcto^ caaaaggttgttgctgaagttattaaac«aaagccaacagte^ ga^ttaaataagag ttg cagatatggcto- ggatt cgccgaatgatgcaatataaaaaaattaataa cgtgc^acggaagtgacaataaataataaagataattcttataatragcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttat.^^ gaatacagaaaactacgtgaatcaaaaacaatggattc?iatt tggaaaaaggcaatgaaa tagactatgatcca^ tcaaatgattcgaccgaaaaataaatateaatcggatatacaatcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacgga ttt atgaccgatgatgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaagg tacaccgtaaa^ gtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgattcatacagatgatgacgaaaaagccg 5 atgaagatggattttctattattgcaatgtggaattgggaacggaaaa^ tgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctc caaatottcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaag aaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttg gtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggaca accggtgagtggaaggíggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcagattggccgctt acacatggtcaatttttctctattttgccgattta^^ caaacgttccacgatgcgatttgtg8cttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaagga ccgacaacatttctaccatc ttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgac gagcgct cggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatct ccttcaggttatgaccatctgtgccagttcg aatgtctggtcaac 0 tttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtg gatgtgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgtíaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtattagta attatcatggctgtcatggcgcattaacggaataaagggtgtgcttaaatcgggccattttgcgtaataagaaaaaggattaattatg agcgaattgaauOataataaggtaatagatttacattagaaaatgaaaggggattttatgcgtgagaatgttacagtctatcccggca ttgccagtcggggatatt-iaaaagagtataggtttttat^ 5 ctaatgtgtaatgaggttcggattcatctatgggaggcaagtgatgaaggctggcgctctcgtagtaatgattcaccggt^ gtgcggagtcgtttattgctggtactgctagttgccgca^ attttgcaccccaatacatcattaaaagatcagtggtgggatgaacgagactttgcagtaattgatcccgawiaca^ ttttcaa<^aataaaaagctaaaatctattattaatctg#^ gtatcttttttattttgagtggttttgtccgttacactagaaaaccgaaaga?ataaaaatttta ctagacaaaacggacaaaataaaaattggcaagggtttaaaggtg^ tgctgattffiaaacgagcacgagagcaaaaccccc^gc^^ aagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggca^^ ttatactttacttggaagtggttgccggaaagagcgaaaatg^^ gcagtttgtagaatgcaaaaagtgaaatcagggg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 137) La mezcla de ligación para pAH505 se transforma en Bacillus subtilis pnbA. Los transformantes correctos se verifican por RFLP y secuenciado del ADN plasmídico aislado. Se selecciona para análisis un transformante (B . subtilis pnbA pAH505) . Se realizan ensayos para determinar la expresión de perhidrolasa en Bacillus utilizando el ensayo de actividad pNB descrito en la presente, después de crecimiento de la cepa deseada en matraces de agitación. Los datos muestran que la perhidrolasa se expresa en B . subtilis pnbA.
B. Expresión Intracelular de la Perhidrolasa en B. subtilís pnbA por integración en el cromosoma Una construcción adicional útil para determinar la expresión del gen para perhidrolasa (act) integrado en el cromosoma de B. subtilis pnbA involucra el uso del promotor spoVG, el cual se encuentra que impulsa la expresión del gen para perhidrolasa en un no replicante (es decir, un plásmido de integración) . En algunas modalidades, un sitio de integración es la región aprE de B . subtilis, aunque se pretende que la integración se produzca en cualquier sitio adecuado. En realidad, no se pretende que la presente invención esté limitada a este sitio específico ni a este promotor específico, dado que otros sitios adecuados y promotores encuentran uso en la presente invención. La configuración del promotor/gen en el locus aprE en el cromosoma de Bacillus subtilis es como sigue: pAprE-aprE primeros 7 codones-detención de traducción-pSpoVG-ATG-gen para perhidrolsa del segundo codón El clon se construye como se describe en lo siguiente. Los cebadores utilizados son: Up5'F caggctgcgcaactgttgggaag (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 138) FuaprEAct34R agtagttcaccaccttttccctatataaaagcattagtgtatcaatttcagatccacaatt ttttgcttctcactctttac (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 139) FuaprEAct4F Aattgatacactaatgcttttatatagggaaaaggtggtgaactactatggccaagcgaat tctgtgtgtttcggtg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 140) BsíOl-DnAct504R gtgagaggcattcggatccttttacagcaggctccg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 141) La fusión por PCR es una técnica bien conocida en el arte, en la cual dos o más fragmentos de ADN se generan ya sea por digerido de restricción o por amplificación por PCR. Los fragmentos tienen segmentos superpuestos, habitualmente de por lo menos 18 bases de larga. En el caso se utilizan dos fragmentos, el extremo 3' del fragmento # 1 tiene una secuencia de superposición con el extremo 5' del fragmento # 2 . Los dos fragmentos se utilizan como plantilla en una reacción de PCR en la cual el conjunto cebador utilizado hibridiza hacia el extremo 5' del fragmento # 1 (cebador directo) y el extremo 3' del fragmento # 2 (cebador inverso) . Durante la amplificación, las dos regiones de superposición hibridizan formando una plantilla única desde la cual los dos cebadores pueden amplificar un fragmento de longitud completa, una "fusión" o los fragmentos # 1 y # 2. Se pueden utilizar en dicha reacción fragmentos múltiples de cualquier longitud, limitados únicamente por la capacidad de seleccionar polimerasa para amplificar piezas largas de ADN. En el ejemplo actual,, la construcción anterior se realiza por fusión por PCR de dos productos de PCR, la construcción anterior se realiza por fusión de PCR de dos productos de PCR. La primera es una construcción con el promotor spoVG agregado hacia el extremo 5' del gen phd. La segunda es el promotor aprE y los primeros 7 codones de aprE, seguido por un codón de detención. Se agregan las regiones de superposición de 20 pares de bases en los extremos 5' y 3' de los productos, respectivamente, para permitir la reacción de fusión por PCR. El conjunto cebador FuaprEAct4F/BsmI- DnAct504R se utiliza para amplificar el gen para perhidrolasa a partir de pAH505 como se describe en lo anterior, el cual se agrega a la secuencia promotora spoVG (contenida dentro del cebador) hacia el extremo 5' del gen y se cambia el codón de inicio de ATG a GTG. Para crear el segundo producto (pAprE más los primeros 7 codones de aprE) para la fusión, el conjunto cebador Up5' F/FuaprEAct34R se utiliza para amplificar un fragmento de pBSFNASally. La figura 15 proporciona un mapa de este plásmido. La secuencia completa de pBSFNASally se proporciona en lo siguiente. cteaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaa^ cccttataaatcaaaagaatagaccgagaiagggttgagtgttgte^ caacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtg^ tg8gtaaagcactaaateggeracctfaaagggagcccccga aggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacaccc gwgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgc^ ctcttcgctattacgceagctggcg gggggatgtgctgc^ gttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattggagctccaccgcggtggcgg8gctcta gaactagtggatcccccgggcrtgcaggaattctc ttttcttctgctat^ aaaagcctctgccccttgcaaatcggatgcctgtc^ atgtctttgctóggcgaatgttcatcttattt^ ttatcatcatgctttgaa íaaatatcacgataatatccatt^ aatttgccgggactcaggagcatttaaccteaaaaagcatgacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgtt atgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtcta ctaaaatattattccatctottacaataaattcacagaatagtctto^ gtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatc^ 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El producto de fusión resultante después se clona en PCR2.1TOPO para producir pCP609 (véase la figura 16) y secuencia siguientes) . caggctgcgcaacrtgttgggaagggcgatcggtgcgggcxjtcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaa ggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcact atagggcgaattggagctccaccgcggtggcggccgctcte grtatcaaaataacagactcgtgattttccaaacgagctttcaaaaaagc tctgccccttgcaaatcggatgcctgtctataaaattc ccgatattggttaaacagcggcgcaatggcggccgcatctga^ attttttcattctatcccttttctgtaaagttta cggaagcacacgcaggtc^t tgaacgaattttttcgacaggaatttgccgggactcaggagcatttaac taaaaaag tttcagrataatgaacatttactcatgtctattto^ tatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctatta(-aataaattcacagaatag^^ aagtaagtcrtactctgaatttttttaaaaggagagggte^ ttatatagggaaaaggtggtgaactartatggccaagcgaattctgígtttcggtgattccctgacctggggctgggíccccgtcg agacggggcacccaccgagcggttcgcccccgacgtgcgctggaccggtgtgctggcccagcagctcggagcggacttcga ggtgatcgaggagggactgagcgcgcgcaccaccaacatcgacgaccccaccgatccgcggctcaacggcgcgagctacct g8gtcgtg( tcgcgacgca8tgccgctcgacctggtgatcatcatgctgggcarcaacgacaccaaggcctacttccggcg cac( cgctcgacatcgcgctgggcatgtcggtgctcgtcacgcaggtgctcaccagcgcgggcggcgtcggcaccacgtacc 5 cggctc8aaggtgctggtggtctcgccgcc^ccgctggcgcccatgccgc^ ^ctggttccagttgatcttcgagggcggcg agcagaagaccactgagctcgcccgcgtgtacagcgcgctcgcgtcgttcatgaaggtgccgttcttcgacgcgggttcggtgat cagcaccgacggcgtcgacggaat<?jacttcaccgaggc«aacaatcgcgatctcggggtggccctcgcggaacaggtgcgg agcctgctgtaaaaggatccgaatgcctctcacaagggcgaattctgcagatatccatcacactggcggccgctcgagcatgcat cfogagggcccaattcgccctatag?gagtcgtattacaatt^ ttac8aacttaatcgccttgcagcacatccccctttc^^ cagttgcgcagcctgaatggcgaatggacgcgc8tgtagc^^ accgc acacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttccct cctttctcgccacgtt tcíaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttflcg^ l o ag£gggccatcgccctgatagacggtttttcgcccttt^^ a^cactoaacwtatctcggtctattcttttgatttata^ aatttaacgcgaattttaacaaaattcagggcgcaagggctgc^^ gtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggácaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgca gtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggta aggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaaga gacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggct atgactgggcacaaragacaatcggctgctctgatgccgccgt^^ accgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcag^ 5 agctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatccca ccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgacc accaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatc aggggctcgcgccagccgaa?tgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcga tgcctgcttg8gaatatcatggíggaaaatggccgciTO^ ggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttc^cgtgctttacggtatcgccg ctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttcc gtgtcgcccttattcccttttttgcggcatto^ agttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcg8ccgaagaacgttttccaa tgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtat^ 0 attctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctg ccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctttt tgcacaac atgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatg 5 gaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggwct tggg ctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccglatcgtagttatctacacgacggggagtcaggca actatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatata tactt agaügatttaaaacttcattt taatttaaaaggatc aggtgaagatcctM agttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaat rt^ aaacaaaaaaacca8gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagcíai?aactctttttwgaaggtaa?ggc?cagca gagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcg ctctgctaata(?gttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttac5Cggata aggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacct acagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaac aggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatc?ttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgt cgatttttgtgatgctcgt8ggggggcggagcctatggaaaa^^ ccttttgctcacatgftctttcctgcgttatccc^^^ gccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgtt ggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagct cactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacag^^ acagctatgaccatgattacgwaagcttggtaccgagctcggata^ctegtaacggccgccagtgtgctggaat cgccctt (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 143) El plásmido PCP609 se digiere con Bamñl/Xmal para liberar el fragmento que contiene la construcción pAprE-aprE-stop-pSpoVG- ?d y se liga a pBSFNASally digerido con XmaX/BclI para proporcionar el plásmido pCP649. La figura 17 proporciona un mapa de pCP649. La secuencia completa de pCP649 se proporciona en lo siguiente. tagaaetagtggatcccccggg gcaggaattctccatto^^ aaaaaagc tctgccccttgcaaatcggatgcctgtctataaaattcccgatattggttaaacagcggcgcaatggcggccgcatc tgatgtctttgcttggcgaatgttcatcttatttcttcctccctctcaataattttttc^attctatccct ttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataata^^ gaatttgccgggactcaggagcatttaaccteaaaaagratgacattt^^ gtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtc tactaaaatattattccatctattacaataaattcac gaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaa^ agtgagaagcaaaaaattgtggatctgaaattgatacactaatgcttttatatagggaaaaggtggtgaactactatggccaagcga attctgtgtttcggtgattccctgacctggggct^^ gctggaccggtgtgctgg8cagcagctcggagcggacttcgaggtgatcgaggagggactgagcgcgcgcaccaccaacat cgacgaccccaccgatccgcggctcaacggcgcgagctacctgccgtcgtgcctcgcgacgcacctgccgctcgacctggtga tcatcatgctgggcaccaacgacaccaaggcctacttccggcgcaccccgctcgacatcgcgctgggcatgtcggtgctcgtca cgcaggtgctcaccagcgcgggcggcg cggcaccacgtacccggctcccaaggtgctggtggtctcgccgccaccgctggc gcccatgccgcacccctggttccagttgatcttcgagggcggcgagcagaagaccactgagctcgcccgcgtgtacagcgcgc tcgcgtcgttcatgaaggtgccgttcttcgacgcgggttcggtgatcagcaccgacggcgtcgacggaatccacttcaccgaggc caacaatcgcgatctcggggtggcc tcgcggaacaggtgcggagcctgctgtaacggaatgcctctcacaaggatccaagcc gaattctgcaga ccatcacactggcggccgctcgagcatgcatctagagtcgatttttacaagaattagctttatetaattto ttctaaagt tiatcagctacaaaagacagaaatgtattgcaat(^caac aaatccatttg ctgaaatacttgafóctttgttttttctcagta^ aaagttgctttttcccctttctatgtatgttttttactagtcatttaaaacgatacattaatag^ aaccagtcataccaataacttaagggtaactagcctcgccggcaatagttacc ctacgctcaaatcctttaaaaaaacacaaaagaccacatttlitaatgtggtctt a cgaaaattggataaagtgggatatttttaaaatatatattta^^ cagacaagtaagcctwtaaattcactttagataaaaatttaggaggcatatc-iaatgaactttaataaaattgattt^ agagaaaagagatatttaatcattatttgaa8aacaaacgact^ taaaacaagaaggatataaat ttacccrtgcatttattttcttagtgacaagggtgataaactcaaatacagc atagcgacggagagttaggttattgggataagttagagccactttatacaat^ ctcc gtaaagaatgacttcaaagagtt tatgatttatacct tctgatg agagaaate accftatacctgaaaatgctttttctctttctatt^^ tacccattattacagcaggaaaattcattaataaaggtaattcaatatatttaccgctatctttacaggtacatcattdgtttg^ atcatgcaggattgtttatgaactctattcaggaattgfcagataggctf tttttacagtcggttttctaatgtcactaacc^^ aaccga i tctcctttttcgcttctttattccaattgct tattgacgttgagcctcggaacccttaacaatcccaa? 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Las reacciones de PCR se realizan utilizando polimerasa Hércules (Roche) siguiendo las instrucciones del 20 fabricante. Se transforma pCP649 en B. subtilis comK pnbA y los integrantes se seleccionan en agar L que contiene cloramfenicol (5 µg/ml) . Se determina la actividad de la perhidrolasa expresada por el ensayo de actividad pNB, como 25 se describe en la presente. Los resultados indican que la perhidrolasa se expresa y está activa.
EJEMPLO 7 Expresión de la Perhidrolasa en Streptomyces En este ejemplo se describen experimentos que se llevaron a cabo para determinar la expresión de la perhidrolasa en Streptomyces. Para probar la expresión de la perhidrolasa en Streptomyces , se construye un plásmido replicante con el gen phd el cual se expresa ya sea de glucosa isomerasa (GIT) o del promotor A4 (véase, por ejemplo, US/PCT / , presentado el 18 de noviembre del 2004, incorporado a la presente como referencia). No obstante, no se pretende que la presente invención esté limitada a estos promotores específicos, dado que cualquier promotor adecuado encontrará uso con la presente invención. Además, aunque la cepa utilizada para expresión de perhidrolasa en este ejemplo es Streptomyces lividans TK-23, se contempla que cualquier Streptomyces encontrará uso en la presente invención. Las cepas de Streptomyces se transforman y manipulan utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Kieser et el., Practical Streptomyces Genetics , John Innes
[2000] ) .
Construcción de pSECGT-MSAT y pSECA4-MSAT Utilizando métodos estándar conocidos en el arte, se clona la secuencia codificante phd (véase ejemplo 4) en pSECGT para colocar al gen bajo el control del promotor Gl . De manera similar, el gen se clona en el mismo plásmido con el promotor A4 utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, US/PCT / , presentado el 18 de noviembre del 2004, incorporado a la presente como referencia) . Los transformantes primero se seleccionan en E. coli, se verifican por análisis de secuencia y después se transforman en S. lividans TK-23 utilizando métodos conocidos en el arte' (véase, por ejemplo, Kieser et al.,
[2000], supra) . Los clones correctos expresados a partir del promotor Gl y el promotor A4 se les denomina "pSECGT-MSAT" y "pSECA4-phd" . La secuencia de pSECGT-MSAT se proporciona en lo siguiente, mientras que en la figura 18 se proporciona un mapa del plásmido. ctagagtcgaccacgcaggccgccaggtagtcgacgttgatctcgcagccgagcccggccg gaccggcggcgctgagcgcgaggccgacggcgggacggccggcaccggtacgcggtggcgg gtcgagttcggtgagcagcccaccggcgatcaggtcgtcg acgagcgcggagacggtggcccgggtgagcccggtgacggcggcaactcccgcgcgggagagccgatctgtgctgtttgcc acggtatgcagcaccagcgcgagattatgggctcgcacgctcgactgtcggacgggggcactggaacgagaagtcaggcgag • ccgtcacgcccttgacaatgc acatcctgagcaaataattcaaccactaaacaaatcaaccgcgtttcccggaggtaaccatggc eaagcgaattctgtgtttcggtgatta^gacctggggc^^ cgacgtgcgctggaccggtgígctggcccagcag<?cggagcggacttcgaggtgatcgaggagggactgagcgcgcgcac caccaacatcgacgaccccaccgatccgcggctcaacggcgcgagctacctgccgtcgtgcctcgcgacgcacctgccgctcg a8tggtgatcatcatgctgggcaccaacgacaccaaggcctacttccggcgcaccccgctcgacatcgcgctgggcatgtcgg tgctcgtcacgcaggtgctcaccagcgcgggcggcgtcggcaccacgtacccggcacccaaggtgctggtggtctcgccgcca 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Se utilizan 3 ml de caldo para inocular 50 ml de medio 1 de producción de Streptomyces y el cultivo se incuba durante 4 días a 37°C con agitación a 200 rpm. Se toma una muestra para medición del ensayo de actividad de perhidrolasa, como sigue: se agregan a 200 µl de muestra 10 µl de 20 mg/ml de lisozima. Después de 1 hora de incubación a 37°C se centrifugan las muestras y se mide la actividad utilizando el ensayo de actividad pNB descrito en la presente. También se preparan SDS-PAGE y transferencias Western utilizando ambos clones (pSECA4-phd y pSECGT-MSAT) , como se conoce en la técnica. Brevemente, después de SDS-PAGE, las proteínas se transfieren a la membrana PVDF y se lleva a cabo el análisis de transferencia Western. Se detecta la perhidrolasa utilizando antisuero policlonal anti-perhidrolasa (dilución 1:500) preparado contra proteína de perhidrolasa purificada por Covance . La transferencia se revela utilizando el equipo ECL de Amersham. Los resultados indican que las cepas de Streptomyces livídahs- son capaces de expresar perhidrolasa activa.
EJEMPLO 8 Mutagénesis de exploración de sitio del gen para perhidrolasa de M. smegmatis En este ejemplo se describen experimentos que involucran la mutagénesis de exploración de sitio del gen para perhidrolasa de M. smegmatis. En estos experimentos, se utiliza el equipo de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange" (QC; Stratagene) o el equipo de mutagénesis dirigida a sitios múltiples QuikChangem (QCMS; Stratagene) para crear bibliotecas de saturación de sitio en cada codón en la totalidad del gen para perhidrolasa de M. smegmatis contenido en el plásmido pMSAT-NcoI . Cada codón de perhidrolasa se mutageniza por sustitución con el codón degenerado NNG/C (NNS; 32 combinaciones) el cual codifica para la totalidad de los 20 aminoácidos en un codón de detección. En el caso del método QC, se diseñan cebadores de superposición complementarios para cada codón de interés con 18 bases flanqueando el codón NNS (véanse las tablas 8-1 y 8- 2) . Una comparación del cartucho purificado versus cebadores no purificados (únicamente sin sal) reveló una mejor presentación de aminoácidos en las bibliotecas elaboradas con cebadores purificados (15-19 aminoácidos versus 11-16 con cebadores no purificados) . De este modo, la mayor parte de las bibliotecas fueron creadas con el método QC y cebadores purificados. Se elabora un número pequeño de bibliotecas utilizando el método QCMS y un cebador directo fosforilado 5' único que contiene 18 bases que flanquean ambos lados del codón NNS (véase, tabla 8-1) , no obstante, este método resulta en un fondo natural mayor y menor en sustituciones aminoácidos por sitio en comparación con los métodos QC. Se elaboran las bibliotecas "nsa301" y "nsa302" utilizando el método QCMS, pero se incorpora dentro de cebadores en los sitios de interés una mezcla trinucleotídica constituida de un codón único para cada uno de los 20 aminoácidos (es decir, más de 32 posibilidades codificadas por NNS para los 20 aminoácidos) . ns k?a36?F bctgagctcgcccgcgtgnnsagcgcgctcgcgtcgtc e B169 hsa370F gagCtCgCCCeC t taCnflS C CtC CgtC ttC tg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 315) to nsa371F Ictcgcccgcgtgtacagcitn-sctcgcgtcgttcatgaag 2L osa372F gcccgcgtgtacagcgcgnpsecetcgttcatgaaggtg ¡SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓ U E O 3i? 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NCIA DE mi. nsa388F gaC C g ttCggí-atC KaCC C C tCgaCgga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 333 m. josa 2 tecgggttcggtgatcagcnnsgacggcgtcgacggaato OW- hsa390F kgttcggtgatcagcaccnnsggcgtcgacggaatccac ¥3190 bsa391F Itcggtgatcagcaccgacnpsgcgacggaatccacttc _ W hsa392F gtgatcagcaccgacggcnnsgacggaatccactcacc ¡ECUENCI DE 122- fasa393F atcagcaccgacggcgtcnnsggaatccacttcaccgag ¡SECUE CIA DE i. nsa394F agcaccgacggcgtcgacnpsatccacttcaccgaggcc (SECUE CIA D iDETiFicAaoN NUME O 39] 1194 t?sa!81F accgacggcgtcgacggannscacttcaccgaggccaac P19S hsa396F gacggcetceacggaatcnnsttcaccgaggccaacaat (SECUENCIA DE E126. hsal82F ggcetcgaceeaatccacnnsaccgaggccaacaatcecc tQ2L nsa398F {gtcgacggaatccacttcnnsgaggccaacaatcgcgat ¡SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 331 mS nsa399F jeacggaatccacttcaccnnsgccaacaatcgcgatctc ¡SECUEN IA DE iDEuriFicAaoN UMERO 34] \199 ínsa400F iggaatccacttcaccgagnnsaacaatcgcgatctcggg ¡ ECUE CIA DE IDE TIFICACIÓN U E O 35) ÍN200 lnsa401F btccactcaccgaggccnnsaatcgcgatctcggggg ¡S CUE CIA DE Tabla 8-2 Secuencias de cebador inverso de saturación de sitio I esiduol Cebador Secuencia del cebador ACACAGAATTCGCTGGGCSM^GGTT K ?'CX GGTTA ML fnsa202R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 363) GAAACACAGAATTCGCTGSNNCATGGTTAATGCCTCCTG ( 2. |nsa203R SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 364) ACCGAAACACAGAATTCGS NGGCCATGGTGAATTOCTC K3 hsa204R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 365) ATCACCGAAACACAGAATSNN?TGGCCATGGTTAATTC R4 sa205R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 366) GGAATCACCGAAACACAGS NTCGCTTGGCCATGGTTAA fó hsa206R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 367) CAG K>AATCACCGAAACAS1WAATTCGCTTGGCCATGGT ¡ . lnsa207R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 368) GGTCAGGGAATCACCGAASNNCAGAATTCGCTTGGCCAT CL hsa208R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 369) CCAGGTCAGGGAATCACCSNNACACAGAATTCGCTTGGC E8 !t sa209R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 370) GGTCCAGCGCACGTCGGGSNNGAACCGCTCGGTGGGTGC m. bsa230R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 391) ACCGG CCAGCGCACGTCSNNGGCGAACCOCTCGGTGGG P30 bsa231R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 392) CACA(TGGTOOAG ?:ACSNNGGGGGC»AA(XX?CTCXK3T JD31 hsa232R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 393) CAGCACACCGGTCCAGCGSNNGCGGGGGCGAACCGCC B22. hsa233R SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 394) G CAG?ACACCGGTCX;ASNNCAC»TCGGGGGCGAACCG ¡R31 bsa234R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO:395) CTGGGCCAGCACACCGGTSNNGCGCACGTCGGGGGCGAA W34 frsa23SR (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 396) CGGCGGGGCCAGCACACCSNNCCAGCGCACGTCGGGGGC toi. bsa236R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO :397) GAGCTGCTGGG8AGCACSNNGGTCCAGCGCACGTCGGG . fo 7 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO:398) ÍKX3GAGCTGCKK KX^GSlWACCC 5TOCAGCGC^CGTC WZL frsa238R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 399) CGCTCCGAGCTGCTGGGCS NCACACCGGTCCAGCGCAC m. bsa239R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 400) GTCCGX^CCGAGCTG p'GS NCAGCACACCGGTCCAGCG ^39 ínsa240R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NOMBRO . 4011 GAAGTCCGCTCCGAGCTGSl^GGCCAGCACACCGGTCCA £40. lasa241R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 4Q2) CTCGAAGTCCGCTCCGAGSNNCTGGGCCAGCACACCGGT P41 bsa242R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMF.ttO 4 f) "3 ) JCACCGCGAAGTCCGCTCCSNNCGGCTGGGCCAGCACACC íáL bsa243R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 4041 GATCACCTCGAAGTCCGCSl^GAGCTGCTGGGCCAGCAC K343 bsa244R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 405) CrCGATCACCrs3AAGTCSNNrCCGAGCrGCTGGGCCAG ^44 ipsa245R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 406) CrrCCTCGATCACCTCGAASl NCGCTCCGAGCtGCTGGGC P45 bsa246R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 407) GCCCTCCTCGATCACCTCSNNGTCCGCTCCGAGCTGCTG E46 bsa247R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 408) CAGTCCCTCCTCGATCACSNNGAAGTCCGCtCCsAGCTG E47 lnsa248R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 409) GCTCAGTCCCTCCTCGATSNNCTCGAAGTCCGCTCCGAG 1V48 bsa249R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 410) CGCGCTCAGTCCCGCC??SIWCACCTCGAAGTCCGCTCC hsa250R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11) GCGCGCGCTCAGTCO JTCSl^GATCACCl GAAGTCCGC teso. insa251R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 412) GGTGCG??:GClCAGTXXSlWCTCGATCACCTCGAAGTC m. 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(SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 415) GATGTTCK TGGTGCGCGCSNNCAGTCCCTC^rcGATCAC B54 bsa!73R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 416) GTCGATGTTGGTGGl K;GS NGC^CAGTCO r^CCTCGAT IA55 a 74 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 417) G r'TCGTCGATGTTGGTGGTSlWCGCGCpCAGTCCCrCCTC RS6 fasa257R í (iSECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 418) GXK 3TCX?TCsATGTTGGTSl^GCCK:GCGCTCAGTC XpO fr57 |asa258R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO :4?9) GGTGC XiTCGTCGATGTrSlWGGTGCGCX?^CTCAGTCC !TS8 b=a259R_ (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 420) ATCGGTGGGGTCGTCGATSNNGGTGGTGCGCGCGCTCAG Eá5 tasa260R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 421) CGGATCGGTGGGGTCGTCSNNGTGGGTGGXGCGCGCGCT t o. (nsa261R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 422) CGCGGATCGGGGGGTCSNNGATGTTGGTGGTGCGCGC fc>61 hsa262R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 423) GA AGCCGCGGATCGGTGGGSNNGTCGATGTTGGTGGTGCG 62 hsa263R ( S SEECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 424) QF T. 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GCACCGACATGCCCAGS NGATGTCGAGCGGGGTGCG IA108 bsa309R i (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 470) CTCGAAGATCAACTGGAASNNGGGGTGCGGCATGGGCGC W149 hsal79R (SECUENCIA DE IDENTTFTC?PTÓW NÚMERO - U GCCCTCGAAGATCAACTGSNNCCAGGGGTGCGGCATGGG E150 bsa!80R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 512) G( GCCCTCGAAGATCAASNNGAACCAGGGGTGCGGCAT lSl hsa3S2R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 513) |CTCG<XX?:CCrr SAAGATSlWCrGGAACCAGXK }TG03G B 1S2 fasa353R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 514) ICTGCTCGCCGCCCTCGAASNNCAACTGGAACCAGGGGTG E153 hsa200R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 515) C?TCGGCTOK CGCXX?,CSI ?NGATCAACTGGAACCAGGG P1S4 hsa201R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 516) IGGTCGGCTGCTCGCCGCCSN GAAGATCAACTGGAACCA E155 insa356R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 517) AGTGGTCITCTGCTCGCCS NCTCGAAGATCAACTGGAA msL lpsa357R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 518)- CTCAGTGGTC? CTGCTCSNNGCCCTCGAAGATCAACTG m?L hsa358R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 519) GAGCTCAGTGGTCTGCTGSNNGCCGCCCTCGAAGATCAA E158 }nsa359R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 520) GGC :CGAGCGGCAGTGGTCITSNNCTCGCCGCCCTCGAAGAT . bsa360R | ¡((SSEECCUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 521) GCGGGCGAGCTCAGTGGTSNNCTGCTCGCCGCCCTCGAA K160 tnsa361R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 522) CACGCGGGCGAGX^TCAGTSlWCrrcrGCp KXGCCCrC mL bsa362R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 523) GTACACGCGGGCGAGC ^CS WGGTCI CTGCTCGCCGCC rti62 bsa363R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 524) GCTGTACACGCGGGCGAGSNNAGTGGTC GCGGCTCGCC E163 tasa364R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 525) CGCGCTGTACACGCGGGCSNNCTCAGTGGTCTTCTGCTC L164. bsa365R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 526) GAGCGCGCTGTACACGCGSNNGAGCTCAGTGGTCTGCTG A165 insa366R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 527) CGCGAGCGCX3CIGTAC?CSN GGCGAGCTCAGTGGTCTT R166 bsa367R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO:528) CGACGCGAGCGCGCTGTASNNGCGGGCGAGCTCAGTGGT Y167 bsa368R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 529) GAACGACGCGAGCGCGCTSNNCACGCGGGCGAGCTCAGT IY168 bsa369R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 530) CATGAACGACGCGAGCGCS NGTACACGCGGGCGAGCTC i. bsa370R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 531) CTTCATGAACGACGCX5AGSN GCTGTACACGCGGGCGAG ta. bsa371R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 32) CACCITCATGAACGAC KJSNNCKKJGCTGTACACGCGGGC fclZL bsa372R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 533) CGGCACCTTCATGAACGAS NGAGCGCGCTGTACACGCG W bsa373R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 534) GAACGGCACCTTCATGAASNNCGCGAGCGCGCTGTACAC B173 sa374R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 535) GAAGAACGGCACCGTCATSNNCGACGCGAGCGCGCTGTA F174 hsa375R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 536) GTCGAAGAACGGCACCTTSNNGAACGACGCGAGCGCGCT M175 bsa376R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 537 ) fcGCGTCGAAGAACGGCACSNNCATGAACGACGCGAGCGC K176 hsa377R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 538 ) AC CGCG CGAAGAAO SSNNCG CATGAACGACGCGAG W\77 1nsa378R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 539) CGAACCCGCGTCGAAGAASNNCACCTTCATGAACGACGC IP178 bsa379R ( SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 540 ) CACCGAACCCGCGTCGAASNNCGGCACCTTCATGAACGA P179 hsa380R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 541) GATCACCGAAOCCGCGTCSNNGAACGGCACCTTCATGAA ÍF180 bsa381R ( SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 542 ) GCTGATCACCGAACCCGCSNNGAAGAACGGCACCTTCAT D181 sa382R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 543 ) GGTGCTGATCACCGAACCSNNGTCGAAGAACGGCACCTT A182 insa383R ( SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 544) GTCGGTGCTGATCACCGAS NCGCGTjCGAAGAACGGCAC G183 bsa384R ( SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 545) GCCGTCGGTGCTGATCACSNNACCCGCGTCGAAGAACGG S184 bsa385R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 546) GACGCCGTCGGTGCTGATSNNCGAACCCGCGTCGAAGAA IV?8S bsa386R ( SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 547) GTCGACGCCGTCGGTGCTSNNCACCGAACCCGCGTCGAA ÍI186 hsa387R ( SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 548 ) TCCGTCGACGCCGTCGGTS NGATCACCGAACCCGCGTC SI87 hsa388R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 549) GATTCCGTCGACGCCGTCSNNGCTGATCACCGAACCCGC fr!88 hsa389R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 550) GTGGATTCCGTCGACGCCSNNGGTGCTGATCACCGAACC P189 bsa390R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 551) GAAGTGGATTCCGTCGACSNNGTCGGTGCTGATCACCGA K3190 fasa391R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 552) GGTGAAGTGGATTCCGTCSNNGCCGTCGGTGCTGATCAC K12 bsa392R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 553) CTCGGTGAAGTGGATTCCSNNGACGCCGTCGGTGCTGAT tD192 bsa393R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 554) GGCCTCGGTGAAGTGGATSNNGTCGACGCCGTCGGTGCT ?193 bsa394R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 555) IGTTGGCCTCGGTGAAGTGSNNTCCGTCGACGCCGTCGGT P194 tasal81R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 556) ATTGTGGGCCTCGGTGAASNNGATTCCGTCGACGCCGTC H19S fasa396R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 557) GCGATTGTTGGCXn íGGTSNNGTGGATTCCGTCGACGCC w . bsa!82R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 558) ATCGCGATTGTTGGCCTGSNNGAAGTGGATGCCGTCGAC [T197 hsa398R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 559) GAGATCGCGATrGTTGGCSNNGGTGAAGTGGAtTCCGTC E198 tasa399R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 560) CCX GAGATCGCGATGGTTSNNCTCGGTGAAGTGGATTCC bsa400R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 561) CACCCCGAGATCGCGATTSNNGGCCTCGGTGAAGTGGAT 1N200 bsa401R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 562) GGCCACCCCGAGATCGCGSNNGTTGGCCTCGGTGAAGTG 1N201 bsa402R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 563) GAGGGCCACC( ;GAGATCS ^ATTGTTGGCCTCGGTGA R202 bsa403R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN -NÚMERO- ? CGCGAGGGCCACCCCGAGSNNGCGATTGTTGGCCTCGGT tD221 fasa404R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMER : fi5) TTCCGCGAGGGCCACCCCS NATCGCGATTGTTGGCCTC L204 lnsa405R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 566) CTGTTCCGCGAGGGCCACSNNGAGATCGCGATTGTTGGC O205 insa406R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 567 CACCTGTTCCGCGAGGGCSNNCCCGAGATCGCGATTGTT IV206 bsa407R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 568) CTGCACCTGTTCCGCGAGS NCACCCCGAGATCGCGATT 1A207 bsa408R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 569) GCT r(CTGCACCTGTTCCGCSNNGGCCACCCCGAGATCGCG IL208 hsa409R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 70 ) ICAGGC CTGCACCTGTTCS NGAGGGCCACCCCGAGATC ?202_ bsa410R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 571) CAGCAGGOTCK5CACCTGSNNCGCGAGGGCCACCCCGAG [R210. k?sa411R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 572) ^ACAG?AGGCTCTG?ACSN TTCCGCGAGGGCCACCCC k i hsa412R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 573) JCIT1 ACAGOAGX3CTCTGSNNCTGTGCCGCGAGCK3CCAC IV212 hsa413R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 574) GCCC?TGTACAGCAGGCTSNNCACCTGTTCCGCGAGGGC W bsa414R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 575) IITCGCCCTTTTACAGCAGSNNCTGCACCTGTTCCGCGAG S214 bsa415R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO:576) GAATTCGCCC?TGTACAGSNNGCTCTGCACCTGTTCCGC L215 bsa416R (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 577) iGCAGAATTCGCCCITITASNNCAGGCTCrrGCACC GTrc 1 |nsa4|7R. (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 578) Método QC para crear bibliotecas de saturación de sitio La reacción QC consiste de 40.25 µl de H20 destilada estéril, 5 µl de amortiguador lOx Pfu Turbo del equipo, 1 µl de los dNTP del equipo, 1.25 µl de cebador directo (100 ng/µl) , 1.25 µl de cebador inverso (100 ng/µl) , 0.25 µl de ADN de minipreparación pMSAT-NcoI como plantilla (~ 50 ng) y 1 µl de Pfu Turbo del equipo, para un total de 50 µl . Las condiciones de ciclado son de 95 °c durante 1 min, una vez, seguido por 19-20 ciclos de 95°C durante 30 a 45 segundos, 55 °C durante 1 min y 68 °C durante 5 a 8 min. Para analizar la reacción, se corren 5 µl de la reacción en E-gel 0.8% (Invitrogen) hasta finalización. Después, se lleva a cabo la digestión con Dpnl secuencialmente, con 1 µl y 0.5 µl de enzima a 37°C durante 2 a 8 horas. Se lleva a cabo un control negativo bajo condiciones - similares, pero sin ningún cebador. Después, 1 µl del producto de reacción digerido con Dpnl se transforma en 50 µl de células electrocompetentes TOP10 de una carga (Invitrogen) utilizando un equipo de electroporación BioRad. Después, se agregan 300 µl de SOC que se proporcionan con células TOP10 (Invitrogen) a las células sometidas a electroporación y se incuban con agitación durante 1 hora antes de sentar en placa, sobre placas LA que contienen 10 ppm de canamicina. Las placas se incuban a 37°C durante la noche. Después de esta incubación, 96 colonias de cada una de las bibliotecas (es decir, cada sitio) se inoculan en 200 µl en LB que contiene 10-50 ppm de canamicina en placas de microtitulación de 96 pozos. Las placas se congelan a -80°C después de la adición de glicerol hasta 20% de concentración final y se utilizan para secuenciado de alto rendimiento en Genaissance con los cebadores M13F y M13R.
Método QCMS para crear bibliotecas de saturación de sitio La reacción QCMS consiste de 19.25 µl de H20 destilada estéril, 2.5 µl de amortiguador lOx del equipo, 1 µl de los dNTPs del equipo, 1 µl de cebador directo fosforilado 5' (100 ng/µl), 0.25 µl de ADN de minipreparado pMSAT-NcoI como plantilla (~ 50 ng) y 1 µl de la combinación de enzima del equipo, para un total de 25 µl . Las condiciones del tratamiento cíclico son de 95°C durante 1 min, una vez, seguido por 30 ciclos de 95 °C durante 1 min, 55 °C durante 1 min y 68 °C durante 8 min. Para analizar el producto de reacción, se corren 5 µl de la reacción en un E-gel 0.8% (Invitrogen) hasta finalización. Posteriormente, se lleva a cabo la digestión coh Dpnl dos veces, secuencialmente, con 0.5 µl de enzimas a 37°C durante 2 a 8 horas. Los controles, la transformación y el secuenciado se realizan al igual que el método QC descrito antes .
Detalles de la preparación de placa de cribado Utilizando una herramienta de estampado esterilizada con 96 puntas, los clones congelados de cada placa de biblioteca secuenciada se estampan sobre una placa LA grande que contiene 10 ppm de canamicina. La placa después se incuba durante la noche a 37°C. Los clones mutantes individuales, cada uno representando a cada una de las 19 sustituciones (o tantas como se obtengan) se inoculan en una placa de 96 pozos Costar que tiene 195 µl de LB elaborado con 2 veces más extracto de levadura y 10 ppm de canamicina. Cada clon mutante para un sitio dado se inocula por cuadruplicado. La placa se hace crecer a 37°C y 225 rpm de agitación durante 18 h en una cámara humidificada. En una placa de 96 pozos separada, se agregan a cada pozo 26 µl de BugBuster (Novagen) con desoxirribonucleasa, Después se agregan 125 µl de los cultivos de clon de biblioteca a la placa que contiene BugBuster en pozos correspondientes y la placa se congela a -80°C. La placa se recalienta, se congela y se vuelve a calentar nuevamente antes del uso de los lisados en los ensayos de formación de perácido e hidrólisis de perácido descritos en la presente.
Bibliotecas combinacionales y mutantes A partir del cribado de las bibliotecas de saturación de un solo sitio, se identifican los sitios importantes y las sustituciones, y se combinan en bibliotecas combinatoriales diferentes. Por ejemplo, se generan las bibliotecas descritas en la tabla 8-3 utilizando los siguientes sitios y sustituciones: L12C, Q, G T25S, G, P L53H, Q, G, S S54V, L, A, P, T, R A55G, T R67T, Q, N, G, E, L, F K97R V125S, G, R, A, P F154Y F196G TABLA 8-3. Bibliotecas Biblioteca Descripción Plantilla de Método origen NSAA1 L12G S54 (NNS) L12G QC NSAA2 S54V L12 (NNS) S54V QC NSAA3 L12 (NNS)S54 (NNS) T QCMS NSAB1 S54V T25(NNS) S54V QC NSAB2 S54V R67 (NNS) S54V QC NSAB3 S54V V125 (NNS) S54V QC NSAB4 L12I S54V T25(NNS) L12IS54V QC NSAB5 L12I S54V R67 (NNS) L12IS54V QC NSAB6 L12I S54V V125 (NNS) L12IS54V QC NSAC1 S54(NNS) R67(NNS) WT QCMS V125 (NNS) NSAC2 biblioteca de 43 S54V QCMS cebadores: 10 sitios (100 ng de cebadores totales NSAC3 igual que nsaC2 pero 300 S54V QCMS ng de cebadores totales NSAC biblioteca de 32 S54V QCMS cebadores, 8 sitios (100 ng de cebadores totales) NSAC5 igual que nsaC4, pero 300 S54V QCMS ng de cebadores totales NSAC6 8 cebadores, 7 S54V QCMS sustituciones, 5 sitios (100 ng de cebadores totales) NSAC7 igual que nsaCß pero 300 S54V QCMS ng de cebadores totales *NNS indica biblioteca de saturación de sitio **Todas las plantillas de origen se derivan del plásmido pMSAT-NcoI y contienen mutaciones en los codones indicados dentro del gen para perhidrolasa de M. smegmatis . Se utilizan los métodos QC y QCMS para crear las combinaciones . La reacción QC se lleva a cabo como se describe en lo anterior con la excepción de que el plásmido plantilla, el cual consiste de 0.25 µl de ADN de minipreparado del mutante L12G, el mutante S54V o el plásmido mutante doble L12IS54V derivado de pMSAT-NcoI . La reacción QCMS también se lleva a cabo como se describe en lo anterior, con la excepción de la plantilla y los cebadores . En este caso se utilizan 0.25 µl de la plantilla pMSAT-NcoI para NSAC1 y la plantilla NSAA3 o S54V para las bibliotecas NSAC2-C7. Las bibliotecas NSAA3 y NSAC1 se elaboran utilizando 100 ng de cada uno de los cebadores que se muestran en la tabla 8-4. Las bibliotecas NSAC2, NSAC4 y NSAC6 se elaboran con un total de 100 ng de todos los cebadores (todos los cebadores son equimolares) y se elaboran bibliotecas NSAC3 , NSAC5, NSAC7 con un total de 300 ng de todos los cebadores (todos los cebadores son aproximadamente equimolares) k?SAC2-C5L\55T atcgaggagggactgagcACGcgcaccaccaacatcgac pEcusNciA NSAC2-C5 A55GS54V atcgaggagggactgGTGGGCcgcaccaccaacatcgac ^^^ 8 lo-rnipc acm w?«mo-mí NSAC2-C5 A55TS54V atcgaegagggactgGTGACGcgcaccaccaacatceac NSAC2-C5 R67T aC aCCCCaCC atCC ACGctCaaCg CgCga CteC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO eoai NSAC2-C5 R67O 'gacgaccccaccgatccgCAGctcaacggcgcgagc ac (SECUENCIA NSAC2-C7 R67N gacgaccccacpgatccgAACctcaacggcgcgagctac (SECUE CIA DE IDENTIFICACIÓ UMERO ^ frSAC2-C5 K97R ctgggcaccaacgacaccCGCgcctacttccggcgcacc (SECUENCIA NgACKayiffg ctcaccagcgcgggcggcAGCggcaccacctacccggcatsEcuENciA NSAC2-C7 V125G ctcacca cgcgggcggcGGCggcaccacgtacccpgca SECUEWAD NSAC2-C5 V125R ctcaccagcgcgggcggcCGCggcaccapgtacccggca NSAC2-C5 Y*2?A CtcaccagcgcgggcggcGCGggcaccacgtacccggcatsEcuENciA NSAC2-CS V125P ctcaccagcgcgggcggcCCGggcaccacgtacccggcaisEcuENciA tSAC2-C3 F154Y ccctgg tccagttgatcTACgagggcggcgagcagaag NSAC2-C3 F196G ggcg cgacggaatccacGGCaccgaggccaacaatcgo NSAC2-C7 R67G-re gacgaccccaccgatccgGGCctoaacpgcgcgagctac NSAC2-C5 R67E-M gacgaccccaccgatccgGAGc caacggcgcgagctac ( ECUENCI NSAC2-C5 R67F-re gaCgaCCCCaCpgatCCgTTCctcaaCggC CgagCtaC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 61T) NSAC2-CS R67L-re gacgaccccaccgatccgCTGctcaapggpgcgagc ac (SECUE CIA DE IDENTIFIC CIÓN NUME O M.) NSAC2-CS S54P gtgatcgaggagggacteCCGgcgcgca,ggaoqaa?atc NSAC2-C5 S¿4R, g gatcgaggagggactgCGCgcgcgcaccaccaacatc NSAC2-C5 SS4G gtgatcgaggagggactgGGCgcgcgcaccaccaacatc NSAC2-C5 S= L gtgatcgaggagggactgACGgcgcgcaccaccaacatc tSEaiE>lí:IA NSAC2-C7 SS4I gtgatcgaggagggactgATCgcgcgcaccaccaacatc (SECUENCIA 1NSAC2-C51 S54K gtgatcgaggagggactgAAGgcgcgcaccaccaacato Cribado de bibliotecas combinacionales y mutantes Para cada una de las bibliotecas NSAB1-B6, se secuencia primero una placa de 96 pozos llena de clones. Una vez que se analizan los resultados del secuenciado, los imitantes obtenidos de cada biblioteca se inoculan por cuadriplicado, similar a las bibliotecas de saturación de sitio descritas en lo anterior. Para las bibliotecas NSAC1- C7, inicialmente se inoculan 96 colonias por/placa/biblioteca, y cada placa se criba sin secuenciado. Después del cribado, algunas bibliotecas tienen una mejor apariencia que otras, Se criban varias placas de cada una de las bibliotecas NSAC1, C2, C4 , C6. Los "ganadores" de estas placas de cribado aisladas únicas después se separan por estriado para formar colonias únicas o se criban directamente por cuadruplicado al igual que las bibliotecas de saturación de sitio (es decir, como se describe en lo anterior) . Únicamente se secuencian los "ganadores" identificados.
EJEMPLO 9 Propiedades mejoradas de las variantes de perhidrolasa utadas de manera múltiple En este ejemplo se describen experimentos realizados para determinar las propiedades de variantes de perhidrolasa mutadas de manera múltiple. En estos experimentos los mutantes combinacionales obtenidos de bibliotecas combinacionales se prueban para determinar su funcionamiento en perhidrólisis, hidrólisis de perácido y su proporción de perhidrólisis a hidrólisis . Estos parámetros se miden en los ensayos CLAR o ABTS descritos en el ejemplo 2 anterior. Las variantes combinacionales probadas son: L12I S54V, L12M S54T, L12T S54V, L12Q T25S S54V, L53H S54V, S54P V125R, S54V V125G, S54V F196G, S54V K97R V125G, y A55G R67T K97R V125G Como se indica en la tabla 9-1 siguiente, la totalidad de estas variantes son mejores de la enzima natural en por lo menos una de las propiedades de interés .
EJEMPLO 10 Ensayos PAF y PAD de variantes de perhidrolasa En este ejemplo se proporcionan los resultados de ensayo para las pruebas PAF y PAD de las variantes de perhidrolasa. Las pruebas se llevan a cabo como se describen en el ejemplo 1 anterior. Además, se proporcionan tablas en las cuales la expresión de proteína de la variante es mayor que la natural bajo las mismas condiciones de cultivo (descritas en la presente) . Estos resultados se indican como el "Índice de desempeño de proteína". Por lo tanto, un número mayor de "1" en el índice de desempeño de proteína indica que se produce más proteína para una variante particular que para la natural. En las siguientes tablas, "WT" indica un residuo aminoácido natural; "Pos" indica la posición en la secuencia de aminoácidos; "Mut" y "Var" indican un residuo aminoácidos sustituido en la posición particular; "prot" indica proteína; y "Perf. Ind" indica el índice de funcionamiento.
[Tabla 10-1. Resultados de ensayo PAF PAF Posición I WT/Pos Variante Perf. Mutación 67 R067O ,ww -67. R067W JSL 1 0660281 JL R067E JS_ 1.044676 JSL R067P 1-012761 JL L068E . 1.435218 68_ L068W w 1-209193 JL 068I ,12589? 68 ±mo. G jl,Q9?454l 68. 068V -088042 68 L068H L J1 JL2 JL L068T -032331 69 N069V 1 -989028 JL N069K JL 1.71908 N069R JR_ 1.493163 J N069I .469946 JL N069H ü. 1.357968 JL. N069T [.351305 JL N069L 1-299547 69 N069S ll .20517 111 JL N069G G_ 1.1965 li -6?_ NÓ69O 1.074622 69, N069W J 1.049602 JL N069C 1.048373 71 A071S 1.751794 71 A071T 1.700442 71 A071H JL 1.697558 71 A071G G 1.58881 71 A071I 1.507841 J2L A071E E 1.445699 71 A071 ll .441146 La siguiente tabla proporciona variantes con resultados de PAF que son mejores que los observados con la perhidrolasa de M. smegmatis natural. En esta tabla, la columna en la parte media indica el residuo aminoácido en la perhidrolasa natural (WT) , seguido por el número de posición y el aminoácido variante en dicha posición (Var) .
Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 2A002W 1.75 8F008G 1.09 2A002D 1.30 8F008H 1.02 2A002F 1.24 10D010L 3.97 2A002I 1.18 10D010W 3.18 2A002G 1.15 10D010 2.13 2A002S 1.01 10D010Y 1.51 3K003Y 1.06 10D01OT 1.47 3K003I 1.05 10D010I 1.28 3K003L 1.04 12L012Q 2.65 3K003T 1.01 12L012C 2.29 3K003H 1.01 12L012A 1.10 4R004Q 1.03 15G015A 1.54 5I005T 1.12 15G015S 1.05 5I005S 1.02 17V017G 1.17 6L006V 1.07 17V017R 1.10 6L006I 1.07 17V017A 1.01 6L006T 1.06 18P018Y 1.33 7C007K 2.69 18P018N 1.33 7C007Y 2.09 18P018C 1.26 7C007I 1.76 18P018E 1.22 7C007H 1.73 18P018V 1.19 7C007A 1.42 18P018R 1.16 7C007G 1.39 18P018Q 1.12 7C007M 1.13 18P018H 1.12 8F008R 1.43 18P018G 1.07 8F008V 1.18 19V019G 1.32 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF ue los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 19V019S 1.24 26E026K 1.46 19V019R 1.03 26E026T 1.44 19V019L 1.00 26E026C 1.40 20E020W 2.94 26E026V 1.39 20E020G 2.36 26E026N 137 20E020T 2.22 26E026H 1.33 20E020L 2.20 26E026L 1.30 20E020H 2.17 26E026G .1.28 20E020V 2.11 26E026S 1.27 20E020S 2.01 26E026W 1.25 20E020C 1.57 27R027K 1.22 20E020 1.40 28F028M 133 20E020A" 1.29 28F028A 127 20E020Q 1.27 28F028W 1.16 21D021K 1.58 28F028L 1.09 21 D021W 1.55 28F028S 1.05 21D021L 1.46 29A029W 1.91 21D021A 1.46 29A029V 1.80 21D021G 1.37 2 A029R 1.76 21D021Y 1.30 2 A029Y 1.70 21D021F 1.30 29A029G 1.60 21D021S 1 4 29A029S 1.49 22G022A 1.55 29A029T 1.42 22G022T 1.03 29A029E 1.12 22G022S 1.02 29A029C 1.08 25T025G 1.86 30P030K 1.21 25T025S 1.60 30P030R 1.16 25T025A 1.33 30P030V 1.06 25T025I 1.02 30P030T 1.05 26E026M 2.00 30P030A 1.05 26E026A 1.93 30P030S 1.03 26E026R 1.48 30P030Q 1.01 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 30P030H 1.01 39A039W 1.23 30P030E 1.01 3 A039V 1.21 31D031W 1.83 3 A039G 1.17 31D031L 1.81 39A039R 1.17 31D031T 1.45 39A039E 1.09 31D031G 1.44 40Q040K 2.61 31D031F 1.44 40Q040I 2.58 31D031N 1.34 40Q040W 2.39 31 D031V 1.28 40Q040L 2.14 31D031A 1.24 40Q040T 2.01 31D031R 122 40Q040R 1.89 31D031S 1.15 40Q040Y 1.83 31D031E 1.13 40Q040G. 1.79 31D031Q 1.07 40Q040S 1.57 32V032 1.09 40Q040N 1.53 3 V032R 1.05 40Q040D 1.16 33R033S 1.00 40Q040E 1.08 36G036I 1.32 41 Q041K 1.38 36G036 1.27 41 Q041R 1.19 36G036L 124 41 Q041W 1.14 37V037S 1.40 41 Q041H 1.12 37V037I 1.26 41Q041S 1.11 37V037A 1.25 41 Q041Y 1.09 37V037H 1.21 41Q041V 1.07 37V037L 1.16 41Q041A 1.03 37V037C 1.09 41Q041L 1.00 37V037T 1.05 42L042K 2.46 39A039L 1.43 42L042W 2.06 39A039 1.36 42L042H 1.92 39A039Y 1.36 42 042R 1.38 3 A039I 1.26 42L042G 1.17 39A039T 1.26 42L042T 1.08 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 42L042F 1.07 46F046G 1.02 43G043A 1.49 46F046K 1.00 43G043C 1.48 47E047R, 2.45 43G043K 1.42 47E047T 1.96 43G043M 137 47E047P 1.36 43G043Y 1.26 47E047S 1.28 43G043E 1.25 47E047H 1.27 43G043L 1.22 47E047G 1.20 43G043R 1.22 47E047K 1.19 43G043S 1.18 47E047F 1.09 43G043H 1.17 47E047I 1.Ó3 43G043P 1.08 49I049G 1.34 44A044F 2.84 49I049H 1.27 44A044V 2.13 49I049S 1.24 44A044C 1.80 49I049K 1.23 44A044L 1.61 49I049V 1.20 44A044W 1.40 49I049L 1.14 44A044M 1.20 49I049Y 1.07 45D045K 1.34 49I049R 1.05 45D045T 1.27 49I049B 1.02 45D045R 1.16 49I049M 1.01 45D045W 1.15 50E050L 1.19 45D045S 1.13 50E050M 1.18 45D045G 1.13 50E050A 1.12 45D045H 1.13 51 E051V 1.47 45D045F 1.11 51E051A 1.28 45D045L 1.05 51E051G 1.22 45D045V 1.05 51E051T 1.18 45D045Q 1.04 51E051L 1.11 45D045A 1.04 51E051I 1.07 46F046E 1.25 53L053H 5.05 46F046D 1.17 53 053Q 1.48 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 53 Q53G 132 62D062E 1.02 53 053S 1.16 63P063G 1.71 53 053T 1.02 63P063T 1.50 54S054P 5.20 63P063M 1.46 54S054I 4.78 63P063S 1.42 54S054V 4.72 63P063K 1.40 54S054A 3.46 63P063A 135 54S054R 338 63P063Y 135 54S054L 2.02 63P063W 135 54S054T 1.46 63P063V 131 54S054K 1.44 63P063R 131 54S054G 1.43 63P063F 1.25 54S054C 126 63P063L 1.15 54S054Q 1.03 63P063Q 1.09 55A055G 1.69 64T064G 123 55A055T 1.69 64T064S Ul 57T057S 1.63 65D065A 131 57T057R 1.61 65D065S 1.17 57T057V 1.28 65 065H 1.10 57T057I 1.19 66P066R 1.85 59N059W 1.13 66P066V 1.83 59N059R 1.09 66P066H 1.59 59N059T 1.07 66P066I 1.59 59N059S 1.06 66P066G 1.50 59N059Q 1.02 66P066Q 1.46 60I060H 1.02 66P066T 1.41 60I060R LOO 66P066S 139 61D061H 1.44 66P066Y 133 61D061S 1.26 66P066L 1.14 61 D061R 1.11 66P066N 1.12 61 D061I 1.08 67R067N 1.58 61 D061F 1.01 67R067G 139 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 67R067T 1.28 71A071K 1.44 67R067F 1.26 71A071R 1.40 67R067L O 71A071N 123 67R067Q 1.16 71 A071L 1.23 67R067W 1.07 71A071F 1.13 67R067E 1.04 71 A071C 1.01 67R067P 1.01 72S072L 126 68L068E 1.44 72S072H 121 68L068W 1,21 72S072G 120 68L068I 1.13 72S072T 1.10 68L068G 1.09 72S072V 1.08 68L068V 1.09 72S072Y 1.07 68L068H 1.05 73Y073R 1.26 68 068T 1.03 73Y073Q 123 69N069V 1.99 73Y073S 1.17 69N069K 1.72 73Y073K 1.07 69N069R 1.49 74 074S 2.72 69N069I 1.47 74 074G 1.95 69N069H 136 74L074W 138 69N069T 135 75P075R 1.60 69N069L 130 75P075S 139 69N069S 1.21 75P075T 1.28 69N069G 1.20 75P075Q 1.21 69N069Q 1.07 75P075G 1.16 69N069W 1.05 7 P075H 1.05 69N069C 1.05 75P075W 1.04 71A071S 1.75 76S076P 123 71A071T 1.70 77C077T 1.12 71 A071H 1.70 77C077V 1.05 71A071G 1.59 77C077G 1.01 71A071I 1.51 78L078G 4.98 71 A071E 1.45 78L078H 4.82 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 78L078E 3.01 82L082G 138 78L078N 2.68 82L082R V Í34 78L078T 1.87 82L082H 1.33 78L078Q 1.73 82L082K 1.19 78L078V 1.53 82L082T 1.18 78 078I 1.43 82L082I 1.17 78L078Y 139 82L082S 1.15 79A079H 1.93 82L082V 1.02 79A079L 1.80 83P083K 137 79 A079I 1.59 83PQ83G 131 79A079M 1.50 83P083H 127 79A079N 1.48 83P083R 1.19 79A079Q 1.47 83P083S 1.17 79A079R 1.47 84 084K 1.10 79A079W 1.27 84L084H 1.01 79A079T 1.17 85D085Q 3.09 79A079E 1.12 85D085R 2.38 80T080C 131 85D085S . 228 80T080V 123 85D085H 1.55 80T080G 1.16 85D085N 1.54 80T080A 1.00 85D085G 1.41 81 H081 1.52 85D085T 1.33 81H081L 1.23 85D085E 1.12 81H081N 1.17 85D085F 1.01 81H081G 1.17 86L086A 138 81H081A 1.15 86L086C 1.16 81H081C 1.13 86L086G 1.15 81H081W 1.13 88I088H 1.20 81H081V 1.10 88I088T 1.03 81H081F 1.10 88I088G 1.01 81H081S 1.04 90M090T 1.2 t7 82 082P 1.46 90M090I . 1-13 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT" Pos Var relación a WT 90M090V 1.08 103T103K 1.09 90M090S 1.06 103 TI 031 1.08 90 090L 1.02 103T103L 1.05 91L091G 121 104P104H 2.84 91L091T 1.06 104P104T 2.70 92G092V 1.49 104P104G 2.67 92G092S 1.26 104P104V 2.59 93T093Y 526 104P104S 2.48 93T093F 3.52 104P104I 2.43 93T093A 138 104P104W 2.05 93T093C 1.08 104P104C 1.95 95D095E 2.04 104P104E 1.84 96T096S 1.04 104P104F 1.79 97K097R 2.80 104P104N 1.62 97K097Q 1.14 104P104R 1.62 98A098L 2.22 104P104Q 1.34 98A098H 2.09 104P104M 1.09 98A098I 2.05 105L105P 1.71 98A098Y 2.02 105L105C 1.56 98A098S 1.73 105 105F 1.30 98A098T 1.72 105L105W 128 98A098G 1.57 105 105G 1.08 98A098C 130 106D106K 1.28 98A098N 1.24 106D106L 1.20 98A098D 1.11 106D106G 1.18 98A098P 1.10 106D106H 1.09 100F100W 1.08 106D106E 1.08 100F100E 1.01 106D106T 1.06 101R101K 1.24 106D106I 1.04 103T103W 1.26 106D106F 1.02 103T103Y 1.19 106D106C 1.01 103T103G 1.11 107I107E 2.55 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 107I107S 2.04 115V115G 1.09 107I107N 1.81 115 VI 151 1.05 107I107G 1.76 115V115Y 1.03 107I107V 1.00 116T116G 1.10 108A108L 1.41 116T116A 1.01 108A108T 1.05 117Q117H 233 109L109N 1.52 117Q117T 2.23 109L109W 1.30 117Q117Y 223 109T?09Q 1.18 117Q117W 2.16 109L109Y 1.16 117Q117V 2.15 109L109I 1.05 U7Q117G 2.08 109L109D 1.00 117Q117A 2.05 111M111K 1.98 117Q117S 1.95 111 M111I 1.95 117Q117F 1.57 111M111 1.55 117Q117R 1.56 111M111T 1.49 117Q117M 1.54 111M111F 1.47 117Q117E 1.15 111M111V 1.47 118V118Y 1.25 111 M111Y 1.43 118V118K 1.13 111M111S 1.03 118V118G 1.08 U2S112L 1.03 120T120S 1.09 112S112H 1.00 121 S121L 135 113V113L 1.50 121 S121W 133 113V113H 134 121 S121R 1.26 113V113K 1.19 121 S121K 1.24 113V113R 1.13 121 S121G 120 113VU3Y 1.11 121 S121C 1.18 113V113F 1.05 121S121N 1.14 U3V113Q 1.03 121 S121T 1.13 115V115W 123 121 S121A 1.12 115V115T 1.15 121 S121V 1.12 115V115L 1.12 122A122H 1.14 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 122A122I 1.13 127T127H 1.57 122A122T 1.08 127T127V 1.07 122A122K 1.08 127T127I 1.06 122A122V 1.04 127T127S 1.05 122A122S 1.03 128T128L 1.06 123G123D 1.73 128T128K 1.06 123G123V 1.40 130P130T 1.19 123G123P 132 130P130H 1.17 123G123E 1.13 130P130K 1.16 123G123T 1.06 130P130G 1.16 123G123H 1.00 130P130S 1.16 124G124L 1.92 130P130V 1.15 124G124I 1.85 130P130W 1.15 124G124T 1.64 13OP130I 1.12 124G124H 1.59 130P130L 1.12 124G124V 1.44 130P130R 1.11 124G124F 132 130P130F 1.08 124G124S 127 130P130E 1.00 124G124Y 123 131A131L 1.83 124G124R 1.14 131A131R 1.76 124G124Q 1.12 131 A131H 1.72 125V125G 2.95 131A131G 1.66 125V125S 1.94 131A131W 1.61 125V125A 1.69 131A131V 1.59 125V125P 1.50 131A131P 1.52 125V125R 1.30 131A131Y 1.50 125V125D 124 131A131S 1.48 125V125Y 1.08 131A131E 1.36 125V125I 1.01 131A131D 1.31 126G126T 1.58 131A131Q 129 126G126P 1.17 132P132Y 1.57 126G126I 1.17 132P132S 1.13 Tabla 10-2. Variantes con valores de i PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 133K133Y 1.12 142L142K 1.60 133K133L 1.05 142L142F 1.05 133K133H 1.02 143A143K 3.16 134V134G 1.71 143A143H 2.90 134V134T 1.25 143A143L 2.51 134V134N 1.18 143A143V 2.45 134V134S 1.16 143A143W 227 134V134L 1.13 143A143T 2.18 134 VI 341 1.12 143A143R 2.15 136V136T 1.13 143A143S 1.77 137V137M 122 143A143Q 1.74 137V137L 1.09 143A143F 1.56 137V137T 1.08 143A143P 1.53 137V137A 1.07 143A143G 1.48 137V137G 1.02 143A143D 1.45 138 S 1381 1.15 143A143E 1.43 138S138G 1.05 143A143C 139 140P140A 90 143A143N 1.30 140P140T 1.74 144P144Y 234 140P140S 1.31 144P144K 2.09 141P141L 232 144P144H 1.94 141P141I 229 144P144F 1.82 141P141H 2.07 144P144R 1.76 141P141V 1.96 144P144S 1.69 141P141T 1.84 144P144T 1.46 141P141S 1.70 144P144G 1.45 141P141R 1.65 144P144D 1.45 141P141G 1.64 144P144N 1.44 141P141Q 139. 144P144L 1.43 141P141N 1.32 144P144Q 1.37 141P141A 1.10 144P144M 1.24 142L142W 2.41 144P144A 1.09 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 145M145L 1.72 151Q151K 1.07 145M145F 1.49 151Q151H 1.06 145M145R 1.15 151 Q151S 1.05 145M145W 1.15 151Q151C 1.05 145M145C 1.02 151 Q151Y 1.01 145M145T 1.01 152L152V 122 147H147A 1.28 152L152K 121 147H147S 126 152L152R 1.20 147H147T 120 152L152W M8 147H147P 1.12 152L152T 1.12 147H147E 1.11 152L152S 1.12 148P148V 2.43 152L152Y 1.09 148P148 1.79 152L152H 1.09 148P148L 1.64 152L152G 1.08 148P148A 1.64 152L152E 1.08 148P148R 1.51 152L152Q 1.07 148P148T 1.50 152L152D 1.07 148P148Y 1.46 152L152I 1.04 148P148S 1.46 152L152C 1.00 148P148E 1.42 153I153K 1.62 148P148F 137 153I153H 1.46 148P148Q 133 1531153T 127 148P148D 1.03 153I153L 127 150F150L 129 153I153F 123 150F150E 1.23 153I153A 1.19 151 Q151D 1.47 154F154Y 1.32 151 Q151R 136 155E155T 1.49 151Q151P 1.35 155E155R 1.47 151Q151A 129 155E155L 131 151 Q151T 1.24 155E155Y 127 151 Q151M 124 155E155K 1.23 151 Q151E 1.14 155E155G 1.17 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 155E155S 1.08 158E158T 1.45 155E155D 1.08 158E158P 1.41 155E155F 1.07 158E158N 1.41 156G156P 1.44 158E158M 139 156G156T 1.15 158E158I 138 156G156K 1.10 158E158D 1.35 156G156M 1.09 159Q159R 1.15 156G156C 1.07 159Q159C 1.13 156G156N 1.07 159Q159S 1.10 156G156R 1.05 159Q159D 1.09 156G156H 1.04 159Q159A 1.08 156G156S 1.02 159Q159M 1.07 157G157T 1.74 159Q159P 1.06 157G157R 1.51 159Q159L 1.02 157G157S 1.30 161T161R 3.61 157G157K 1.28 161T161Y 2.40 157G157F 127 161T161H 1.82 157G157V 123 161T161W 1.41 157G157H 1.14 161T161I 1.40 157G157I 1.11 161T161V 127 158E158H 2.40 161T161L 125 158E158K 2.08 161T161Q 1.04 158E158F 2.06 162T162K 122 158E158R 1.99 162T162R 1.17 158E158Y 1.77 162T162W 1.15 158E158W 1.77 162T162Y 1.03 158E158L 1.59 162T162H 1.02 158E158S 1.57 163E163 1.50 158E158V 1.52 163E163Y 1.41 158E158Q 1.49 163E163H 132 158E158C Í.46 163E163G 125 158E158A 1.45 163E163W 1.21 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 163E163V 1.13 167V167H 1.03 163E163R 1.12 168Y168G 1.89 163E163S 1.12 168Y168T 1.51 163E163A 1.11 168Y168V 1.19 163E163C 1.11 169S169Y 126 163E163F 1.07 169S169R 1.24 165A165R 1.70 169S169K 1.21 165A165K 135 169S169I 1.16 165 165F 123 169S169T 1.15 165A165Q 121 169S169L 1.08 165A165V 121 169S169C 1.03 165A1 5Y 120 169S169Q 1.02 165A165T 1.18 170A170K 1.71 165A165I 1.17 170A170G 1.59 165A165P 1.14 170 Al 701 1.59 165A165L 1.08 170A170S 1.47 165A165G 1.05 170A170F 1.44 165A165N 1.01 170A170T 1.40 165A165S 1.00 170A170E 128 166R166Y 129 170A170D 127 166R166L 127 170A170N 1.21 166R166I 1.26 170A170V 1.20 166R166W 125 170A170C 1.15 166R166H 1.20 170A170Q 1.15 166R166T 1.19 170A170L 1.05 166R166V 1.17 170A170W 1.04 166R166K 1.17 170A170M 1.03 166R166S 1.16 171L171K 2.05 166R166G 1.15 171L171H 1.67 167V167T 1.13 171 L171T 1.54 167V167I 1.08 171L171I 1.53 167V167Y 1.07 171 L171S 1.43 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 171 171F 1.30 175 175W 1.25 171L171G 126 176K176W 1.19 171L171Y 1.20 176K176T 1.04 171L171V 1.02 176K176Y 1.04 172A172I 1.70 176 176V 1.04 172A172S 1.59 176K176G 1.01 172A172W 1.43 178P178L 1.82 172A172G 1.41 178P178Y 138 172A172V 1.40 178P178K 134 172A172T 1.25 178P178W 1.14 172A172L 1.20 178P178G 1.09 172A172C 120 179F179 1.15 173S173Y 1.19 179F179Y 1.05 173 S173K 1.17 180F180L 130 173 S173W 1.16 180F180I 120 173 S173L 1.15 180F180V 1.14 173S173R 1.09 180F180Y 1.12 173S173H 1.07 180F180W 1.11 173 S173T 1.06 180F180K 1.08 174F174G 1.60 180F180T 1.01 174F174P 1.54 181 D181A 135 174F174Q 1.42 181D181K 1.33 174F174C 1.32 181D181Y 129 174F174S 1.16 181D181W 126 174F174L 1.05 181D181L 125 175M175T 2.21 181 D181R 123 175M175G 2.04 181D181S 1.21 175M175V 1.93 181D181Q 1.14 175M175L 1.61 181D181E 1.10 175M175Q 1.56 181D181G 1.09 175 175R 1.55 181D181C 1.09 175M175N 1.39 181 D181P 1.03 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 181D181T 1.02 187S187R 1.04 182A182T 1.14 187S187G 1.03 184S184Y 1.06 187S187F 1.02 184S184F 1.05 188T188Y 1.48 184S184T 1.04 188T188V 1.22 184S184H 1.02 188T188S 1.16 185V185K 137 188T188I U3 185V185Y 137 188T188H 1.11 185V185W 136 188T188R 1.01 185V185H 130 189D189L 1.30 185V185L 123 189D189H 125 185V185R 1.15 189D189W 1.09 185V185G 1.12 190G190W 1.88 185V185T 1.11 190G190K 1.01 185V185S 1.09 191V191Y 132 185V185I 1.07 191V191H 1.30 185V185F 1.02 191V191W 120 186I186G 1.86 191V191S 120 186I186T 1.51 191V191K 1.17 186I186A 1.46 191V1911 1.14 186I186S 1.39 191V191F 1.13 186I186V 1.28 191V191R 1.05 186I186L 1.17 191 V191L 1.04 186I186F 1.01 196F196H 1.77 187S187K 1.45 196F196L 1.77 187S187Y 1.43 196F196C 1.74 187S187I 138 196F196M 1.65 187S187L 1.37 196F196G 1.59 187S187W 1.30 196F196S 1.58 187S187H 1.29 196F196Y 1.41 187S187V 123 196F196V 1.40 187S187T 1.12 196F196I 132 Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF Tabla 10-2. Variantes con valores de PAF mejores que los naturales mejores que los naturales formación de formación de WT/Pos./ perácido en WT/Pos./ perácido en Pos Var relación a WT Pos Var relación a WT 196F196W 1.01 201N201G 1.08 197T197L 121 202R202W 1.97 198E198R 1.82 202R202F 1.89 198E198? 1.80 202R202E 1.69 198E198V 1.60 202R202H 1.64 198E198W 1.59 202R202T 1.55 198E198L 1.57 202R202S 1.49 198E198P 1.52 202R202A 1.48 198E198Y 1.48 202R202C 1.44 198E198C 138 202R202M 1.43 198E198F 137 202R202L 1.43 198E198Q 128 202R202G 139 198E198T 1.25 202R202I 1.33 198E198N 1.24 203D203L 2.42 198E198M 1.18 203D203R 2.23 198E198S 1.06 203D203I 1.99 199A199C 1.77 203D203W 1.99 199A199K 1.72 203D203F 1.92 199A199E 1.56 203D203H 1.84 199A199L 138 203D203C 1.78 199A199T 1.33 203D203S 1.66 199A199R 133 203D203V 1.66 199A199V 1.32 203D203G 1.63 199A199D 1.31 203D203Q 1.60 199A199H 127 203D203A 1.53 199A199Y 1.24 203D203E 134 199A199F 1.23 203D203N 1.05 199A199S 120 199A199G 1.14 199A199M 1.07 201N201Y 1.29 201N201F 1.16 La siguiente tabla proporciona variantes con un PI PAF mayor de 1.5 10 15 20 La tabla 10-4 proporciona variantes con valores de PI de PAF mayores de 2.0 25 10 15 20 25 La siguiente tabla proporciona resultados de ensayo PAD para diversas variantes . Tabla 10-5. Resultados de ensayo PAD Posición WT/Pos/ PAD Perf. variante Mutación Ind.
La siguiente tabla proporciona variantes que son mejores que las naturales para degradar perácidos (es decir, el índice de funcionamiento para la variante es mejor que para la forma natural) .
Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT Pos/Var. PAD Pl Pos. WT/Pos Var.PAD PI 1M001I 1.19 5I005M 1.09 1M001L 2.11 5I005E 1.59 2A002D 1.05 5I005L 1.63 2A002R 1.17 5I005A 1.88 2A002W 1.17 5I005C 2.47 2A002P 1.17 5I005D 3.11 2A002Q 1.29 6L006C 1.22 2A002E 1.38 6L006M 1.44 3K003T 1.03 6L006A 1.99 3K003S 1.17 7C007A 1.03 3K003Q 1.19 7C007H 1.37 3K003R 1.29 7C007I 1.48 3K003Y 1.39 7CO07E 1.63 3K003M 1.44 7C007K 2.95 3 003P 1.45 8F008M 1.11 3K003C 1.52 8F008L 1.31 3K003L 1.84 8F008A 1.33 3K003H 1.89 8F008C 4.01 3K003A 2.14 10D010L 2.04 3K003I 2.44 13T013I 1.05 3K003E- 3.51 13T013E 1.09 3K003G 3.74 13T013L 1.47 4R004D 1.18 13T013M 1.47 4R004C 1.34 13T013C 1.55 4R004P 1.44 13T013A 1.88 4R004A 1.64 13T013N 2.61 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT/Pos./Var. PAD Pl Pos. WT Pos^Var.PAD Pl 13T013P 2.73 21D021K 1.80 16W016K 1.03 21D021 2.01 16W016I 1.06 22G022I 1.03 16W016Y 1.09 22G022T 1.16 16W016L 1.16 22G022E 1.19 17V017S 1.04 22G022 1.35 18P018N 1.42 22G022P 1.36 18P018Q 3.26 22G022Q 1.44 18P018R 3.97 22G022A 1.66 18P018C 4.16 23A023H 1.04 18P018Y 4.17 23A023L 1.30 18P018V 4.85 24P024C 1.04 18P018E 4.87 24P024K 1.36 18P018G 4.96 24P024L 1.51 18P018H 6.05 26E026M 1.10 18P018L 7.40 26E026H 1.19 20E020D 1.14 26E026D 1.39 20E020S 1.18 26E026A 1.45 20E020H 1.20 26E026K 1.47 20E020T 1.25 26E026L 1.71 20E020V 1.27 27R027I 1.41 20E020A 1.28 27R027K 1.55 20E020W 1.30 27R027L 2.60 20E020N 1.34 27R027A 2.78 20E020P 1.43 28F028E 1.04 20E020Q 1.56 28F028W 1.17 20E020C 1.76 28F028C 1.21 21 D021S 1.11 28F028Y 1.36 21D021E 1.39 28F028M 1.37 21 D021F 1.41 28F028A 1.48 21D021W 1.44 28F028 2.02 21D021L 1.57 28F028D 2.07 21D021A 1.75 29A029C 1.15 21 D021G 1.76 30P030H 1.08 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT PosJVar.PAD Pl Pos. WT/Pos Var.PAD PI 30P030G 1.09 33R033N 1.30 30P03OR 1.14 33R033A 1.32 30P030L 1.17 33R033C 1.73 30PO30E 1.24 33 033G 2.63 30P030Y 1.31 33R033K 2.72 30P030I 1.38 33R033L 2.90 30PO3OK 1.39 34W034P 1.21 30P030S 1.49 34W034M 1.22 30P030T 1.64 34W034C 1.49 30P030V 1.74 34W034A 2.29 31D031V 1.08 35T035M 2.72 31D031T 1.11 35T035A 3.85 31 D031Q 1.13 35T035C 4.72 31D031W , 1-14 35T035I 5.38 31 D031G 1.16 35T035E 5.73 31D031A 1.18 36G036C 1.06 31D031S 1.23 36G036A 1.07 31 D031F 1.39 36G036H 1.10 31D031R 1.49 36G036K 1.71 31D031N 1.55 36G036T 1.81 31D031L 1.61 36G036L 2.49 32V032S 1.09 36G036D 2.50 32V032N 1.61 - 37V037I 1.04 32V032W 1.71 37V037L 1.16 32V032Q 1.74 37V037S 1.49 32V032G 2.65 37V037N 1.52 32V032M 3.41 37V037C 1.63 32V032I 3.51 37V037A 2.00 32V032A 3.64 37V037P 2.10 32V032E 3.92 38L038V 1.12 32V032D 4.19 39A039W 1.02 32V032L 4.72 39A039Y 1.13 32V032K 4.73 40Q040N 1.00 33R033S 1.01 40Q040I 1.10 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT/Pos./Var. PAD Pl Pos. WT Pos Var.PAD PI 40Q040E 1.28 47E047K „ - 1.06 40Q040R 1.48 47E047G " .- - • 1.10 40Q040L 1.49 47E047I 1.15 40Q040D 1.59 48V048Q 1.39 40Q040S 1.65 ' 48V048F 1.42 40Q040T 1.81 48V048A 1.63 40Q040Y 2.02 48V048M 1.79 40Q040G 2.17 48V048C 2.25 40Q040W 2.59 48V048L 2.29 40Q040K 3.64 48V048P 3.08 41Q041G 1.09 49I049Y 1.02 41Q041H 1.14 49I049M 1.02 41Q041R 1.27 49I049L 1.03 41Q041K 1.61 49I049G 1.12 41 Q041L 1.92 49I049K 1.26 41Q041A 2.58 49I049A 1.87 42L042F 1.02 50E050P 1.02 42 042P 1.34 50E050M 1.04 42L042K 1.41 50B05QG 1.11 42L042C 1.43 50E050D 1.22 43G043A 1.07 50E050A 1.23 43G043L 1.82 51E051T 1.17 43 043E 1.88 51E051M 1.20 44A044C 1.92 51E051D 1.28 45D045F 1.04 51E051G 1.34 46F046C 1.16 51E051K 2.00 46F046A 1.25 51E051A 2.72 46F046E 1.31 . 52G052W 2.47 46F046D 1.39 53L053H 1.70 46F046M 1.42 54S054N 129 46F046K 1.46 54S054P 1.30 46F046P 1.50 54S054A 1.41 46F046L 1.54 55 A055N 1.05 47E047L 1.02 55A055K 1.08 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT/Pos/Var. PAD Pl Pos. WT/PosJVar. PAD Pl 55A055C 1.26 63P063Q 1.05 57T057S • 1.01 6 P063W 1.11 57T057G 1.05 63P063G 1.22 58T058L 1.12 63P063L 1.23 58T058H 1.49 63P063T 1.32 59N059Q 1.86 64T064G 1.08 59N059T 5.63 64T064M 1.09 59N059S 7.32 64T064A 1.20 59N059K 8.21 64T064L 1.22 59N059E 9.88 66P066S 1.02 . 59N059V 9.97 66P066T 1.10 59N059G 10.00 69N069D 1.11 59N059F 10.23 69N069A 1.13 59N059A 10.44 69N069Q 1.14 59N059Y 11.14 69N069C 1.20 59N059C 11.23 69N069L 1.20 59N059D 11.72 69N069S 1.42 59N059W 12.80 69N069T 1.43 59N059L 14.74 69N069H 1.52 60I060G 1.04 69N069K 1.59 60IO60V 1.06 69N069V 1.73 60I060H 1.07 69N069I 1.75 60I060Y 1.19 70G070L 1.01 61D061P 1.13 70G070A 1.41 61 D061Q 1.16 70G070H 1.90 61D061L 1.20 71A071K 1.01 61D061G 1.25 71A071M 1.11 61D061S 1.35 72S072F 1.15 61D061R 1.59 72S072G 1.76 61D061I • 1.66 72S072M 2.13 61D061H 1.67 72S072C 2.18 61D061K 1.72 72S072H 2.48 63P063K 1.02 72S072N 2.85 63P063V 1.04 72S072A 3.52 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT PosJVar, PAD Pl Pos. WT/PosJVar.PAD Pl 55A055C 1.26 6 P063Q 1.05 57T057S • 1.01 63P063 1.11 57T057G 1.05 63P063G 1.22 58T058L 1.12 63P063L 1.23 58T058H L49 63P063T 1.32 59N059Q 1.86 64T064G 1.08 59N059T 5,63 64T064M 1.09 59N059S 7.32 64T064A 1.20 59N059K 8.21 64T064L 1.22 59N059E 9.88 66P066S 1.02 . S9N059V 9.97 66P066T 1.10 59N059G 10.00 69N069D 1.11 59N059F 10.23 69N069A 1.13 59N059A 10.44 69N069Q 1.14 59N059Y 11.14 69K069C 1.20 59N059C 11.23 69N069L 1.20 59N059D 11.72 69N069S 1.42 59N059W 12.80 69N069T 1.43 59N059 14.74 69N069H 1.52 60I060G 1.04 69N069K 1.59 60I060V 1.06 69N069V 1.73 60I060H 1.07 69N069I 1.75 60I060Y 1.19 70G070L 1.01 61D061P 1.13 70G070A 1.41 61 D061Q 1.16 70G070H 1.90 61D061L 1.20 71A071K 1.01 61D061G 1.25 71A071M 1.11 61D061S 1.35 72S072F 1.15 61 D061R 1.59 72S072G 1.76 61 D061I • 1.66 72S072M 2.13 61D061H 1.67 72S072C 2.18 61D061K 1.72 72S072H 2.48 63P063K 1.02 72S072N 2.85 63P063V 1.04 72S072A 3.52 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT Pos^Var. PAD Pl Pos. WT/Pos./Var.PAD PI 73Y073M 1.13 80T080C 1.15 73Y073C 1.20 80T080S 1.40 73Y073A 1.40 80T080G 1.50 74L074F 1.13 81H081N 1.00 74L074M 1.21 81H081L 1.03 74L074A 2.90 81H081W 1.09 75P075E 1.19 81H081C 1.09 75P075 1.19 81H081A 1.45 75P075W 1.31 81H081M 1.54 75P075Y 1.32 82L082M 1.06 75P075V 1.39 83P083C 1.01 75P075C 1.42 83P083R 1.09 75P075D 2.09 83P083N 1.10 76S076C 1.06 83P083K 1.16 76S076T 1.11 83P083E 1.26 76S076A 1.11 83P083M 1.88 76S076H 1.11 83P083A 2.36 76S076P 1.20 84L084F 1.01 76S076V 1.35 84L084G 1.01 76S076K 1.53 85D085R 1.03 76S076M 1.61 85D085 1.09 • 76S076D 1.94 85D085H 1.24 76S076E 2.09 85D085E 1.25 76S076G 2.15 85D085C 1.50 76S076L 4.70 85D085G 1.60 77C077T 1.03 85D085F 1.98 77C077D 1.05 86L086C 2.44 78L078T 1.10 86L086A 3.32 78L078I 1.11 87V087P 1.64 78L078G 1.38 87V087C 2.22 78L078H 1.57 87V087L 4.30 80T080V 1.01 88I088M 1.09 80T080Q 1.07 88I088P 3.51 80T080A 1.11 89I089L 1.22 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT Pos^Var. PAD Pl Pos. WT/Pos Var.PA PI 89I089A 1.83 104P104V 1.02 89I089P 1.91 104P104H 1.03 90M090C 1.09 104P104N 1.44 90M090E 1.15 104P104C 1.83 90M090A - 1.41 104P104E 1.97 90M090D 2.88 104P104I 2.05 91 L091I 1.05 104P104M 2.24 91L091C 1.27 105 105Q 1.04 91 L091A 1.45 105L105H 1.23 91 L091D 1.47 * 105L105R 1.25 92G092C 2.05 105L105G 1.40 93T093A 1.05 105L105W 1.71 96T096F 1.24 105L105F 1.73 96T096G 1.28 105L105C 1.92 96T096L 1.93 1O6D106S 1.02 96T096M 2.53 106D106W 1.07 96T096C 3.76 106D106? 1.09 96T096A 4.20 106D106C 1.10 98A098Y 1.15 106D106A 1.13 98A098P 1.26 106D106H 1.18 98A098N 1.40 106D106K 1,24 98A098C 1.42 106D106T 1.38 98A098L 1.47 106D106F 1.45 98A098D 2.19 106D106G 1.45 100F100C 1.28 106D106V 1.68 100F100T 1.42 107I107L 1.04 100F100N 1.45 107I107S ?.33 100F100A 2.02 107I107C 1.41 100F100M 2.19 107I107T 1.53 101R101L 1.12 108A108S 1.00 102R102Q 1.19 108A108G 1.13 102R102Y 1.29 108A108L 2.56 102R102L 1.64 108A108K 2.97 102R102A 1.79 110GI10A 1.01 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT/Pos. Var. PAD Pl Pos. WT/PosJVar.PAD PI 110G110D 1.40 115V115Y 2.07 110G110C 1.43 115V115D 2.21 Í10G110E 1.76 115V115P 2.21 ?10G110F 2.29 115V115 2.48 111M111C 1.01 116T116N 1.05 111M111A 1.02 116T116C 1.05 111 M111I 1.03 116T116H 1.08 111M111Y 1.06 116T116M 139 . 111M111W 1.23 117Q117F 1.02 1UM111N 1.31 117Q117R 1.05 112S1 I2L 1.00 117Q1Í7T LIO 112S1Í2E 1.16 117Q117H 1.12 113V113M 1.06 117Q117Y 1.13 113V113Q 1.11 117Q117P 1.13 113V113R 1.11 117Q117E 1.21 113V113P 1.14 117Q117A 1.73 113V113N 1.22 117Q117M 1.89 113V113A 1.31 118VÍ18L 1.05 114L114T 1.05 118V118C 1.14 114L114A 1.07 118V118Y 1.34 114L114G 1.14 118VU8Q 1.50 114L114C 1.14 119L119A 1.02 114 114I 1.17 120T120V 1.07 114L114M 1.28 120T120S 1.07 115V115C 1.08 120T120K 1.09 115V115S 1.14 120T120M 1.22 115V115Q 1.15 120T120L 1.26 115V115A 1.19 120T120N 1.42 115VU5T 1.28 120T120E 1.53 115V115L 1.30 120T120I 1.56 115V115M 1.32 120T120Y 1.61 115V115R 1.63 121 S121E 1.04 115V115F 1.69 121 S121N 1.06 115V115G 1.76 121 S121Q 1.09 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT Pos^Var.PAD Pl Pos. WT/Pos./Var.PAD PI 121 S121T 1.26 132P132Y 4.78 121 S121L 1.49 132P132G 4.98 121 S121A 1.55 132P132S 5.05 121 S121V 1.59 132P132C 5.68 121 S121C 1.64 132P132A 6.08 122A122L 1.02 132P132Q 6.15 123G123K 1.12 133K133Y 1.44 123G123A 1.19 133K133L 1.92 123G123Y 1.24 134V134C 1.37 123G123M 1.38 134V134G 1.42 123G123L 1.38 134V134S 1.44 123G123W 1.39 134V134 1.45 125V125G 1.09 134V134A 1.64 126G126M 1.17 134V134P 1.71 126G126D 1.22 134V134M 1.89. 127T127A 1.10 134V134N 2.80 128T128M 1.06 135L135D 2.90 128T128H 1.08 136V136T 1.13 128T128V 1.15 136V136L 1.13 128T128P 1.16 136V136C 1.23 128T128W 1.23 136V136A 1.60 128T128S 1.27 137V137M Í.13 128T128A 131 137V137L 1.27 128T128Q 1.34 137V137C 1.42 128T128N 1.36 137VI37A 1.46 128T128K 1.57 138S138G 1.11 128T128R 1.70 138S138C 1.18 128T128F 1.71 138S138A 1.28 128T128L 1.72 138S138N Í.31 128T128Y 1.81 138S138P 1.39 131A131R 1.04 140P140C 1.07 132P132N 1.05 140P140A 1.83 132P132L 2.24 140P140H 2.25 132P132E 3.02 140P140F 2.89 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT Pos^Var. PAD Pl Pos. WT/Pos- Var.PAD Pl 140P140G 3.11 147H147D 1.18 141P141A 1.08 147H147P 1.21 143A143C 1.07 147H147N 1.25 143A143E 1.13 147H147L 1.29 143A143D 1.22 147H147M 1.44 143A143L 1.28 148P148V 1.04 143A143H 1.36 148P148A 1.06 143A143K 1.37 148P148T 1.09 144P144M 1.01 148P148E 1.19 144P144F 1.08 148P148G 1.20 144P144Q 1.08 148P148S 1.21 144P144K 1.09 148P148R 1.25 144P144R 1.14 148P148K 1.30 144P144L 1.15 148P148D 1.34 144P144D 1.38 148P148Y 1.37 144P144N 1.49 148P148L 1.39 144P144H 1.60 148P148F 1.50 144P144Y 1.65 149 149H 1.01 146P146N 1.00 150F150Y 1.07 146P146G 1.04 150F150H 1.18 146P146R 1.06 150F150L 1.30 146P146M 1.23 151 Q151P 1.91 146P146A 1.36 151 Q151E 2.07 146P146Y 1.44 151 Q151K 2.19 146P146F 1.53 151Q151H 2.19 146P146H 1.57 151 Q151S 2.25 146P146C 1.69 151 Q151R 2.32 146P146L 2.00 151 Q151T 2.37 147H147Q 1.03 151 Q151C 2.55 147H147W 1.05 151Q151Y 2.75 Í47H147K 1.06 151Q151D 2.81 147H147E 1.10 151 Q151A 2.93 147H147Y 1.12 151 Q151M 6.36 147H147C 1.17 152L152M 1.10 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT Pos Var. PAD Pl Pos. WT/PosJVar.PAD I 152L152C 1.14 156G156H 1.40 152L152E - 1.23 156G156Y 1.40 152L152A 1.29 156G156T 1.53 152L152Y 1.37 156G156M 1.62 152L152W - 1.55 156G156D 1.62 153I153V 1.15 157G157I 1.33 153I153A - 1.49 157G157F 1.42 153I153L 1.50 157G157K 1.47 153I153T 1.62 157G157H 1.57 153I153S 1.66 158E158H 1.01 153I153F 1.75 158E158P 1.19 153I153P 1.87 158E158Q 1.24 153I153H 2.00 158E158S 1.27 153I153K 2.44 158E158A 1.28 154F154Y 4.96 158E158R 1.29 155E155S 1.12 158E158 1.31 155E155G 1.12 158E158C 1.37 155E155T 1.19 158E158N 1.58 155E155D 1.24 158E158M 1.73 155E155K 1.33 158E158F 1.77 155E155N 1.79 158E158K 1.88 155E155L 2.07 158E158L 1.96 155E155A 2.59 158E158Y 2.48 155E155P 2.60 159Q159H 1.48 155E155Y 2.65 160K160N 1.12 155E155M 2.91 160K160A 1.14 156G156S 1.04 160 160R 1.15 156G156K 1.11 160K160D 1.19 156G156E 1.14 160K160C 1.29 156G156R 1.21 I60K160Q 1.41 156G156A 1.21 160K160M 1.47 156G156P 1.29 160K160P 1.66 156G156C 1.37 161T161L 1.16 156G156N 1.38 161 T161V 1.24 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT Pos JVar. PAD Pl Pos. WT/Pos/Var.PAD PI 161T161Q 1.50 165A165R 1.29 161T161M 1.72 165A165Q 1.32 161T161Y 2.62 165A165T 1.32 162T162R 1.23 165A165P 1.34 162T162G 1.82 165A165C 1.42 162T162S 2.01 165A165 1.55 162T162W 2.04 165A165M 1.56 162T162I 2.21 165A165D 1.69 162T162Q 2.45 166R166W 1.08 162T162Y 2.89 166R166F 1.10 162T162K 3.13 • 166R166K 1.20 162T162F 3.23 166R166N 1.21 162T162M 3.49 166R166Y 1.22 162T162C 3.57 166R166M 1.29 162T162L 3.59 166R166I 1.39 162T162N 3.84 166R166P 1.5Q 162T162H 3.91 166R166L 1.50 162T162P 4.37 166R166A 1.51 163E163N 1.00 166R166D 1.55, 163E163C 1.08 166R166H 1.56' 163E163D 1.08 167V167I 1.00 16 E163A 1.79 167V167S 1.86 163E163Y 1.89 167V167H 2.11 163E163L 1.94 167V167Y 2.15 164L164Q 1.01 167V167R 2.25 164L164V 1.02 167V167Q 2.41 164L164S 1.11 1Ó7V167T 2.47 164L164M 1.26 167V167L 2.56 164L164N 1.31 167V167G 2.83 164L164R 1.61 167V167M 3.84 164L164P 2.41 167V167A 4.99 165A165G 1.07 167V167C 5.37 165A165V 1.13 167V167D 5.54 165A165N 1.20 167V167P 6.08 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT Pos/Var.PADPI Pos. WT/Pos/Var.PADPI - 168Y168F 5.17 172A172D 1.42 168Y168L 5.39 172A172Y 1.76 169S169Y 1.10 173S173T 1.29 169S169A V13 173S173H 1.49 169S169R 1.19 173S1731 2.22 169S169K 1.27 173S173F 230 169S169Q 137 173S173R 2.47 169S169C 138 173S173V 2.54 169S169M 1.40 173 173E 2.65 169S169L 1.47 173S173P 2.66 169S169I 1.53 , 173 S173A 2.72 170A170C 1.06 173 S173M 3.01 170A170E 1.17 173S173K 3.01 170A170F L17 173S173C 3.07 170A170N 1.17 173 173Y 3.54 170A170M 1.28 173 S173W 3.67 170A170D 1.32 173 S173L 3.86 170A170P 133 174F174H 1.05 171L171H 1.07 174F174 1.17 171L171G 133 174F174P 1.46 171L171Y 1.35 174F174? 1.66 171L171T 136 174F174L 1.83 171L171V 1.39 174F174A 2.09 171L171I 1.42 174F174M 2.20 171 171K 1.53 175M175N 1.02 171L171A 1.66 175M175E 1.43 171L171C 1.73 176 176C 1.01 171 171S 1.76 176K176R 1.03 171L171Q 1.93 176K176E 1.08 171L171F 1.97 176K176W 1.16 171 L171M 2.22 176K176D 1.18 171 171N 2.79 176K176A 1.19 172A172M 1.06 176K176F 1.28 172A172L 1.22 176K176V 133 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT/Pos/Var.PAD Pl Pos. WT Pos/Var. PAD Pl 176 176M 1.33 184S184Q" 1.16 178P178K 1.70 184S184I 1.21 178P178T 228 184S184V 1.25 178P178V 2.70 184S184F 1.27 178P178G 2.95 ~ 184S184 1.61 178P178S 3.06 184S184A 1.69 178P178Q 3.64 184S184M 1.77 178P178M 3.87 184S184E 1.86 178P178E 4.15 184S184N 1.93 178P178A 439 • I84S184L 2.00 178P178D 6.44 18 S184D 2.24 178P178Y 6.91 184S184C 2.39 178P178L 7.15 185V185F 120 179F179G 1.16 185V185Q 1.41 179F179V 1.17 185V185M • 1.46 179F179Y 1.47 186I186L 1.14 179F179E 1.80 1861186M 1.38 179F179L 1.89 186I186A 1.79 . 180F180W 1.81 186I186D 4.29 180F180C 1.94 187S187K 1.16 180F18OI 2.11 187S187D 1.40 180F180 2.13 187S187G 1.46 180F180A 2.70 187S187L 1.46 180F180Y 2.99 187S187H 1.51 180F180N 3.05 187 SI 871 1.58 180F180V 3.24 187S187N 1.59 180F180M 436 187S187C 1.67 181D181A 1.23 187S187A 1.72 183 G183P 1.02 187S187M 1.87 183G183R 1.09 I88T188N 1.69 183G183Y 1.45 188T188E 1.97 183G183L 1.50 189D189A 1.18 183G183C 1.99 189D189T 1.21 184S184Y 1.09 189D189I 1.27 Tabla 10-6. Variantes con una Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mejor degradación de perácido mayor que la natural que la natural Pos. WT/Pos Var, PAD Pl Pos. WT PoSc Var.PAD PI 189D189L 1.30 197T197A 1.42 190G190C 1.17 197T197M 2.38 190G190Y 1.39 198E198T 1.16 190G190P 1.86 198E198S 1.18 190G190D 2.02 198E198F 1.21 190G190H 2.92 198E198V 1.44 190G190A 3.42 198E198Q 1.46 190G190M 5.54 198E198A 1.46 191V191T 1.03 198E198I 1.48 191 V191R 1.91 198E198L 1.54 191V191K 2.17 198E198N 1.67 191V191F 2.75 198E198P 1.72 191V191C 2.81 198E198Y 1.77 191V191Y 4.34 198E198W 1.78 191V191L 4.69 198E198C 1.83 191V191A 5.06 198E198M 1.86 191 V191E 5.46 198E198R 1.88 I91V191Q 5.83 199A199F 1.15 191V191D 6.03 199A199H 1.15 191V191M 7.34 199A199R 1.17 193G193S 1.60 199A199T 1.22 193G193E 3.15 199A199E 1.31 193G193Q 4.29 199A199D 1.33 193G193V 5.21 199A199V 1.45 195H195P 1.16 199A199K 1.53 195H195M 1.28 199A199Y 1.59 195H195K 1.33 199A199 1.65 195H195Y 1.49 199A199C 2.45 195H195E 1.70 201N201D 1.64 195H195D 1.93 202 202M 1.76 196F196I 1.12. 202R202G 1.82 196F196L 1.17 202R202S 1.84 196F196C 1.18 202R202C 1.93 197T197H 1.24 202R202A 1.97 Tabla 10-6. Variantes con una degradación de perácido mayor que la natural ¡. T Pos./Var.PAD PI 202R202I 1.99 202R202E. 2.05 202 202L 2.05 202R202T 2.06 202R202H 2.09 202R202F 2.16 202R202W 2.52 203D203Q 1.03 203D203S 1.13 203D203I 1.19 203D2O3N 1.28 203D203G 1.33 203D203F 1.34 203D203H 1.54 203D2O3P 1.71 203D203R 1.77 203D2O3A 1.96 203D2O3L 2.08 203D2O3C 2.09 La siguiente tabla proporciona variantes que presentan degradación de perácido que es menor que la de la forma natural.
Tabla 10-7. Variantes con resulTabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT Pos./Var. PAD Pl Pos WT Pos. Var. PAD Pl 1M001V 0.94 2A002S 0.66 2A002Y 0.46 2A002G 0.84 2A002N 0.59 2A002F 0.93 2A002V 0.60 3K003V 0.84 2A002I 0.61 4R004L 0.01 2A002T 0.61 4R004V 0.08 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos/Var.PAD PI Pos WT Pos ./Var. PAD Pí 4R004I 0.15 8F008S 0.01 4R004W 0.48 8F008R 0.46 4R004G 0.79 8F008H 0.64 4R004S 0.91 8F008G 0.65 4R004E 0.97 8F008T 0.77 4R004Y 0.98 8F008K 0.83 4R004H 0.99 8F008P 0.83 4R004Q 0.99 8F008V 0.85 4R004T 1.00 8F008Y 0.90 5IQ05G 0.01 8F008N 0.96 5I005N 0.01 9G009H 0.01 5I005P 0.01 9G009T 0.01 5I005R 0.01 10D010W 0.01 5I005F 0.15 10D010K 0.01 5I005S 0.37 10D010Y 0.01 5I005H 0.63 10D010T 0.01 5I005T 0.72 10D010I 0.01 51005 V 0.92 10D010V 0.01 6L006S 0.01 10D010S 0.01 6L006K 0.01 10D010G 0.01 6L006G 0.01 10D0I0R 0.01 6L006H 0.01 10D010A 0.01 6L006R 0.01 10D010M 0.01 6L006W 0.01 10D010N 0.01 6L006E 0.01 10D010P 0.01 6L006Q 0.01 10D010E 0.15 6L006V 0.35 11 S011T 0.01 6L006T 0.35 11 S011V 0.01 6L006I 0.82 11 S011D 0.01 7C007S 0.01 11 S011E 0.01 7C007R 0.01 11 S011F 0.01 7C007Y 0.54 11 S011G 0.01 7C007M 0.68 11 S011L 0.01 7C007G 0.69 11 S011Q 0.01 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT Pos. Var.PAD PI Pos WT/Pos./Var.PAD Pl 11 SOI IR 0.01 14W014E 0.15 11S011H 0.33 14 014F 0.22 11 S011K 0.40 14W014A 0.27 11 S011A 0.53 14W014Y 0.66 11 SOI 11 0.56 15G015C 0.01 12L012V 0.01 15G015N 0.01 12L012S 0.01 15G015D 0.01 12L012G 0.01 15G015E 0.01 12L012R 0.01 15 0Í5P 0.01 12L012D 0.01 15G015A 0.61 12L012P 0.01 15G015S 0.63 12L012W 0.02 16W016S 0.01 12L012T 0.06 16 016G 0.01 12L012A 0.07 16 016H 0.01 12L012K 0.13 16 016T 0.01 12L012H 0.16 16W016R 0.01 12L012F 0.17 16W016N 0.01 12L012Q 0.22 16W016P 0.15 12L012C 0.22 16W016Q 0.31 12L012N 0.66 16W016M 0.37 13T013Q 0.51 16 016A 0.55 13T013V 0.63 16W016D 0.57 13T013S 0.68 16W016E 0.65 13T013G 0.77 16 016V 0.88 14 014I 0.01 17V017A 0.68 14 014S 0.01 17V017E 0.75 14 014G 0.01 17V017G 0.84 14W014K 0.01 17V017K 0.84 14 014V 0.01 17V017F 0.85 14W014L 0.01 17V017T 0.86 14W014T 0.01 17V017Y 0.88 14 014R 0.01 17V017R 0.94 14W014N 0.01 17V017P 0.96 14W014P 0.01 17V017I 0.99 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos. Var. PAD Pl Pos WT/Pos Var.PAD Pl 17V017 1.00 24P024T 0.66 18P018S 0.07 24P024A 0.68 19V019P 0.01 24P024G 0.76 19V019M 0.12 24P024I 0.85 19V019R 0.34 24P024R 0.91 19V019Q 0.40 24P024H 0.97 19V019A 0.55 25T025P 0.01 19V019G 0.56 25T025H 0.01 19V019S 0.57 25T025L 0,01 19V019E 0.62 25T025R 0.01 19V019Y 0.70 25T025M 0.01 19V019D 0.79 25T025E 0.01 19V019L 0.91 25T025D 0.01 19V019K 0.97 25T025K 0.13 20E020L 0.73 25T025W 0.14 20E020G 0.78 25T025I 0.35 21D021P 0.86 25T025G 0.43 22G022K 0.01 25T025C 0.51 22G022 0.23 25T025V 0.51 22G022R 0.56 25T025S 0.58 22G022V 0.85 25T025A 0.86 22G022S 0.98 26E026S 0.28 23A023R 0.28 26E026T 0.40 23A023S 0.34 2 E026W 0.47 23A023G 0.35 26E026N 0.48 23A023F 0.44 2 E026R 0.81 23A023V 0.60 26E026G 0.87 23A023Q 0.73 26E026C 0.94 23A023P 0.73 26E026V 0.97 23A023W 0.80 2 E026P 0.99 23A023M 0.95 27R027W 0.01 23A023Y 0.96 27R027T 0.01 24P024S 0.61 27 027P 0.48 24P024Q 0.65 27R027C 0.58 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos , Var.PAD PI Pos WT Pos. Var.PA PI 27R027S 0.69 35T035Q 0.01 27R027G 0.84 35T035N 0.01 27R027E 0.93 35T035R 0.01 27R027V 0.94 35T035V 0.34 28F028G 0.01 36G036S 0.26 28F028P 0.39 36G036T 0.33 28F028V 0.53 36G036V 0.38 28F028S 0.70 36G036M 0.54 29A029V 0.44 36G036N 0.56 29A029T 0.47 36G036W 0.68 29A029S 0.55 36G036Q 0.71 29A029Y 0.59 36G036R 0.90 29A029P 0.62 37V037T 0.81 29A029R 0.73 37V037H 0.96 29A029W 0.74 37V037W 0.98 2 A029M 0.77 38L038K 0.01 29A029G 0.80 38L038G 0.01 29A029E 0.84 38L038E 0.01 29A029D 1.00 38L038P 0.01 30P030M 0.79 38 038Q 0.01 30P030Q 0.91 38L038R 0.01 30P030A 0.92 38L038D 0.12 31D031E 0.88 38 038S 0.29 32V032P 0.01 38 038A 0.63 32V032R 0.72 38L038C 0.72 33R033V 0.94 39A039S 0.01 34W034R 0.01 39A039G 0.30 34W034E 0.01 39A039N 0.43 34W034Q 0.04 39 039R 0.64 34W034S 0.08 39A039I 0.71 34 034T 0.15 39 039P 0.74 34W034V 0.73 39A039T 0.79 34W034G 0.88 39A039M 0.81 34W034I 0.94 39 039E 0.83 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural ! WT/Pos/Var.PAD PI Pos WT/PosJVar.PAD Pl 39A039C 0.92 44A044R 0.01 39A039K 0.96 44A044E 0.03 39A039L 0.97 44A044V 0.50 39A039V 0.98 44A044F 0.80 40Q040P 0.01 44A044W 0.85 41 Q041V 0.01 44A044M 0.98 41 Q041S 0.22 44A044L 0.99 41 Q041P 0.66 45D045S 0.38 41 Q041Y 0.70 45D045T 0.44 41Q041 0.88 45D045R 0.49 42L042W 0.01 45D045V 0.50 42L042H 0.01 45D045P 0.53 42L042T 0.01 45D045Q 0.57 42L042Q 0.28 45D045W 0.58 42L042S 0.45 45D045H 0.78 42L042R 0.64 45D045L 0.78 42L042I 0.66 45D045M 0.78 42L042V 0.73 45D045G 0.84 42 042M 0.74 45D045A 0.84 42L042G 0.76 45D045C 0.84 43G043S 0.23 45D045K 0.87 43G043P 0.31 46F046T 0.43 43G043V 0.33 46F046W 0.63 43G043Q 0.48 46F046S 0.66 43 G043R 0.59 46F046V 0.79 43G043C 0.73 46F046I 0.88 - 43 G043I 0.77 46F046G 0.94 43G043K 0.86 47E047P 0.36 43G043M 0.88 47E047R 0.62 43G043Y 0.94 47E047N 0.63 43 G043H 0.96 47E047S 0.63 44A044S 0.01 47E047M 0.70 44A044Y 0.01 47E047A 0.76 44A044T 0.01 47E047F 0.76 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural WT Pos Var.PAD I Pos WT Pos Var.PAD Pl 47E047C 0.77 52G052F 0.01 47E047T 0.84 52G052I 0.07 47E047D 0.98 52G052P 0.24 47E047H 0.99 52G052L 0.24 48V048R 0.01 52G052Q 0.28 48V048S 0.42 52G052R 0.35 48V048G 0.87 52G052E 0.55 48V048N 0.98 52G052A 0.79 48V048E 0.99 53L053R 0.01 49I049P 0.16 53L053W 0.01 49I049R 0.29 53L053P 0.01 49I049W 0.68 53L053D 0.01 49I049H 0.74 53L053E 0.19 49I049S 0.79 53L053K 0.24 49I049E 0.88 5 L053S 0.26 49I049V 0.97 53L053G 0.33 50E050R 0.01 53L053V 0.65 50E050 0.14 53L053I 0.66 50E050V 0.43 53L053Q 0.72 50E050Í 0.58 53L053T 0.84 50E050S 0.65 54S054F 0.01 50E050Q 0.91 54S054W 0.01 50E050L 0.97 54S054H aoi 51 E051R 0.01 54S054K 0.08 51E051I 0.04 54S054I 0.12 51E051W 0.17 54S054Y 0.12 51 E051V 0.37 54S054G 0.17 51 E051Q 0.76 54S054L 0.26 51 E051L 0.93 54S054V 0.29 52G052H 0.01 54S054E 0.30 52 052S 0.01 54S054T 0.33 52G052V 0.01 54S054R 0.35 52G052T 0.01 54S054M 0.48 52G052M 0.01 54S054Q 0.53 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos. Var.PAD PI Pos WT/PosiVar.PAD Pl 54S054D 0.65 58T058V 0.96 54S054C 0.88 58T058S 0.96 55A055V 0.01 59N059 0.01 55A055I 0.01 59N059M 0.01 55A055P 0.01 59N059P 0.01 55A055W 0.01 60I060P 0.32 55A055Y 0.18 60I060D 0.66 55A055R 0.25 60I060C 0.67 55A055T 0.42 60I060M 0.68 55A055G 0.73 60I060A 0.79 55A055L 0.87 60I060R 0.81 55A055S 0.87 60I060L 0.91 55A055H 0.92 60I060E 0.92 56R056C 0.01 60I060K 0.96 56R056G 0.01 60I060S 1.00 56R056T 0.01 61D061F 0.70 56R056E 0.01 61D061A 0.71 56R056Q 0.01 61D061C 0.85 56R056S 0;12 61D061Y 0.95 56R056L 0.24 61D061V 0.97 56R056N 0.27 61D061N 1.00 56R056A 0.69 62D062T 0.01 57T057R 0.01 62D062I 0.01 57T057P 0.01 62D062V 0.01 57T057N 0.25 62D062H 0.01 57T057C 0.40 62D062W 0.01 57T057Y 0.55 62D062S 0.01 57T057H 0.61 62D062 0.01 57T057A 0.65 62D062G 0.O1 57T057L 0.76 62D062R 0.01 57T057V 0.87 62D062M 0.01 57T057I 0.87 62D062P 0.01 58T058M 0.03 62D062Q 0.01 58T058A 0.36 62D062A 0.11 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos. Var.PAD Pl Pos WT/Pos7Var.PAD PI 62D062C 0.49 66P066F 0.67 62D062E 0.60 66P066Y 0.70 63P063A 0.60 66P066D 0.72 63P063R 0.80 66P066I 0.84 63P063S 0.90 66P066V 0.89 63P063M 0.91 66P066H 0.95 63P063F 0.93 66 P066L 0.99 6 P063Y 0.95 67R067F 0.01 64T064R 0.11 67R067W 0.02 64T064D 0.64 67R067P 0.04 64T064W 0.69 67R067E 0.11 64T064Q 0,87 67R067V 0.12 64T064C 0.88 67R067Q 0.13 64T064P 0.94 67R067L 0.16 64T064H 0.96 67R067A 0.22 64T064N 0.98 67R067T 0.32 6 T064S 0.99 67R067N 0.33 65D065V 0.20 67R067G 0.41 65D065R 0.22 67R067K 0.99 65D065H 0.40 68 068G 0.01 65D065Y 0.42 68L068A 0.01 65D065P 0.42 68L068M 0.03 65D065S 0.47 68L068C 0.06 65D065W 0.50 68L068S 0.07 65D065T 0.50 68L068N 0.10 65D065G 0.52 68L068E 0.13 65D065I 0.62 68 068H 0.22 65D065A 0.72 68L068Q 0.25 66P066N 0.38 68L068F 0.25 66P066Q 0.42 68L068T 0.32 66P066G 0.44 68L068P 0.35 66P066R 0.51 68L068D 0.44 66P066C 0.52 68L068Y 0.45 66P066A 0.56 68L068R 0.47 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos Var.PAD PI Pos WT Pos/Var.PAD Pl 68 068V 0.51 71A071C 0.99 68L068 0.56 72S072Y 0.07 68L068I 0.73 72S072W 0.34 69N069Y 0.17 72S072P 0.56 69N069 0,55 72S072Q 0.66 69N069P 0.59 72S072L 0.70 69N069R 0.83 72S072R 0.74 69N069G 0.98 72S072D 0.80 70G070M 0.01 72S072V 0.83 70G070T 0.01 72S072E 0.93 70G070P 0.01 72S072T 0.97 70G070V 0.01 73Y073P 0.01 70G070C 0.01 73Y073R 0.26 70G070R 0.01 73Y073L 0.50 70G070Y . 0.01 73Y073G 0.51 70G070K 0.01 73Y073H 0.52 70G070N 0.01 73Y073I 0.64 70G070Q 0.01 73Y073S 0.68 70G070F 0.01 73Y073V 0.74 70G070I 0.27 73Y073N 0.76 70G070E 0.33 73Y073D O.80 70G070S 0.64 73Y073Q 0.87 71A071P 0.01 73Y073K 0.94 71A071N 0.61 74L074S 0.01 71A071D 0.65 74 074G 0.57 71A071G 0.68 74 074V 0.61 71 A071S 0.69 74L074I 0.64 71A071R 0.77 74L074W 0.67 71A071H 0.78 74L074Y 0.86 71A071I 0.79 75P075M 0.30 71A071T 0.79 75P075R 0.46 71A071E 0.81 75P075Q 0.61 71A071L 0.84 75P075S 0.63 71A071F 0.99 75P075T 0.69 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/PosJVar.PAD Pl Pos WT/Pos/Var.PAD PI 75P075I 0.74 79A079I 0.67 75P075H 0.86 79A079S 0.78 75P075K 0.88 79A079G 0.92 75P075G 0.93 79A079P 0.94 76S076W 0.01 79A079L 0.96 76S076Y 0.18 80T080W 0.01 76S076F 0.46 80T080L 0.01 76S076Q 0.90 80T080K 0.01 77C077Y 0.01 80T08OR 0.01 77C077R 0.01 80T080E 0.01 77C077W 0.01 80T080P 0.01 77C077F 0.01 80T080H 0.05 77C077G 0.18 80T080Y 0.11 77C077L 0.73 80T080I 0.15 77C077S 0.76 80T080N 0.53 77C077V 0.80 81H081R 0.01 77C077A 0.91 81H081Y 0.14 78L078E 0.01 81H081K 0.56 78L078N 0.01 81H081S 0.69 78L078M 0.48 81H081V 0.71 78L078Q 0.52 81 H081P 0.72 78L078C 0.78 81H081Q 0.75 78L078Y 0.81 81H081G 0.80 78L078V 0.83 81 H081F 0.90 79A079H 0.01 82L082R 0.01 79A079F 0.01 82L082S 0.01 7 A079C 0.03 82L082W 0.01 79A079Q 0.27 82L082V 0.19 79A079E 0.27 82L082G 0.31 79A079N 0.28 82L082T 0.38 79A079M 0.28 82L082H 0.47 79A079R 0.32 82 082I 0.51 79A079W 0.53 82L082K 0.51 79A079T 0.60 " 82L082P 0.52 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/PosJVar.PAD PI Pos WT PosJVar.PAD Pl 82L082A 0.98 86L086H 0.01 83P083T 0.01 86L086S 0.01 83P083V 0.19 86L086R 0.01 83P083L 0.21 86L086E 0.01 83P083H 0.61 86L086Q 0.01 83P083W 0.62 86L086W 0.08 83P083G 0.68 86 086V 0.12 83P083S 0.79 86L086T 0.28 83P083Q 0.82 86L086G 0.70 83P083D 0.83 86 086Y 0.82 83P083F 0.99 86L086P 0.99 84L084W 0.01 87V087S 0.01 84L084V 0.42 87V087G 0.01 84L084P 0.43 87V087Y 0.01 84 084T 0.44 87V087R 0.01 84 084A 0.45 87V087K 0.01 84L084Q 0.52 87V087D 0.01 84L084S 0.55 87V087F 0.10 84L084R 0.57 87V087T 0.15 84L084N 0.67 87V087A 0.17 84L084K 0.79 87V087M 0.75 84L084D 0.85 88I088H 0.01 84L084I 0.87 88I088T 0.01 84L084H 0.99 88I088G 0.01 85D085I 0.10 88I088N 0.01 85D085L 0.24 88I088Q 0.01 85D085V 0.25 89I089H 0.01 85D085W 0.34 89I089S 0.01 85D085P 0.54 89I089G 0.01 85D085Y 0.55 89I089W 0.01 85D085S 0.68 89I089Q 0.01 85D085T 0.71 89I089E 0.01 85D085N 0.78 89I089F 0.75 85D085Q 0.99 89I089V 0.82 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos^Var.PAD PI Pos WT PosJVar.PAD Pl 89I089T 0.90 94N094M 0.03 90M090S 0.01 94N094C 0.07 90M090W 0.01 94N094Y 0.12 90M090G 0.01 94N094G 0.53 90M090P 0.01 94N094A 0.74 90M090V 0.08 94N094P 0.79 90M090T 0.15 94N094S 0.88 90M090R 0.36 95D095E 0.75 90M090I 0.66 96T096I 0.01 90M090Q 0.77 9 T096W 0.01 90M090L 0.98 96T096Y 0.01 91 L091G 0.01 96T096R 0.14 91 L091T 0.01 96T096V 0.59 91L091Q 0.01 96T096S 0.79 91 091E 0.01 96T096P 0.89 91 091S 0.43 97K097Q 0.01 91 L091V 0.79 97K097G 0.01 91 L091M 0.88 97K097I 0.01 92G092V 0.01 97K097W 0.01 92G092S 0.01 97K097L 0.01 92G092E 0.01 97K097V 0.01 92G092F 0.01 97K097Y 0.01 93T093Q 0.01 97K097S 0.01 93T093Y 0.03 97K097T 0.01 93T093D 0.23 97K097M 0.22 93T093S 0.49 97K097A 0.23 93T093F 0.54 97K097P 0.27 93T093C 0.95 97K097R 0.59 94N094L 0.01 98A098T 0.27 94N094T 0.01 98A098G 0.56 94N094V 0.01 98A098S 0.65 94N094H 0.01 98A098I 0.65 94N094R 0.01 98A098H 0.92 94N094W 0.01 99Y099R 0.29 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT Pos/Var.PAD PI Pos WT Pos7Var.PAD Pl 99Y099V 0.31 103T103Y 0.01 99Y099S 0.37 103T103G 0.01 99Y099W 0.57 103T103K 0.01 99Y099H 0.59 103T103I 0.01 99Y099I 0.61 103T103L 0.01 99Y099G 0.70 103T103H 0.01 99Y099P 0.81 103T103A 0.01 99Y099A 0.82 103T103V 0.01 9 Y099L 0.86 103T103S 0.01 100F100W 0.01 103T103C 0.01 100F100K 0.01 103T103R 0.01 100F100D 0.01 103T103N 0.01 100F100E 0.15 103T103F 0.01 100F100S 0.85 103T103P 0.01 101R101 0.01 104P104R 0.01 101R101K 0.07 104P104W 0.23 101R101Q 0.11 104P104T -0.33 101R101V 0.44 104P1 4S 0.53 101R101D 0.80 104P104Q 0.85 101R101Y 0.80 104P104F 0.86 101 R101P 0.86 104P104G 0.98 101R101N 0.92 105 105V 0.01 101R101C 0.95 105L105E 0.53 101 101I 0.96 105L105S 0.61 101 R101F 0.97 105L105Y 0.62 102RI02 0.01 105 105T 0.64 102R102F 0.23 105L105P 0,90 102R102G 0.27 106D106R 0.56 102R102C 0.36 106D106Q 0.62 102R102V 0.61 106D106P 0.63 102R102D 0.68 106D106N 0.64 102R102P 0.89 106D106M 0.86 102R102S 0.96 106D106I 0.92 103T103W 0.01 106D106L 1.00 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos/Var.PA PI Pos WT/PosJVar.PAD PI 107I107E 0.01 110G110P 0.22 10 I107G 0.01 110G110I 0.23 107I107F 0.01 110G110S 0.30 107I107Q 0.01 110G110Q 0.34 107I107R 0.01 110G110R 0.48 1071107P 0.32 110G110H 0.73 107I107Y 0.52 110G110N 0.77 107I107A 0.80 110G110M 0.82 107I107N 0.93 111M111R 0.01 107I107V 0.97 111M111S 0.14 108A108E 0.61 111M111H 0.19 108A108Q 0.73 111M111G 0.32 108A108T 0.87 111M111P 0.57 108A108V 0.95 111M111E 0.67 109L109W 0.01 111M111L 0.67 109L109D 0.11 111M111K 0.71 10 L109I 0.14 111M111T 0.76 109L109E 0.19 111M111F 0.78 109L109R 0.21 111M111D 0.79 109L109H 0.22 111M111V 0.93 109L109Q 0.22 112S112Y 0.01 109L1O9F 0.32 112SU2R 0.01 109L109A 0.32 112S112P 0.01 109L109S 0.38 112S112H 0.38 109L109P 0.43 112S112V 0.48 109L109G 0.51 112S112M 0.56 109L109V 0.54 112SU2W 0.58 109L109M 0.63 112SU2K 0.68 109L109N 0.66 112S112T 0.72 109L109T 0.79 112S112N 0.85 109L109Y 0.83 112S112F 0.88 110G110T 0.01 112S112A 0.94 110G110W 0.01 113V113S 0.57 110G110Y 0.01 113V113G 0.58 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/PosJVar.PAD PI Pos WT/Pos Var.PAD PI 113V113K 0.72 U8V118K 0.01 113V113H 0.76 118VU8W 0.01 113V113W 0.80 118V118E 0.01 113V113L 0.85 118V118R 0.07 113V113T 0.86 118V118P 0.22 113V113D 0.87 118V118D 0.40 113V113E 0.94 118V118I 0.55 113V113C 0.94 118V118G 0.56 113V113F 0.96 118V118S 0.82 113V113Y 0.98 118V118A 0.85 114L114H 0.01 118V118T 0.92 114L114E 0.01 118V118M 0.93 114L114Q 0.12 H8V118F 1.00 114L114P 0.28 119L119G 0.01 114LI14S 0.55 119 119S 0.01 114L114V 0.60 119L119F 0.01 114L114N 0.77 119L119R 0.01 115 VI 151 0.99 119L119P 0.01 Í16T116Y 0.47 119L119T 0.10 116T116V 0.57 119L119N 0.11 116T116R 0.62 119L119V 0.15 1Í6T116L 0.68 119L119W 0.20 116T116W 0.75 119L119C 0.24 116T116I 0.76 119L119D 0.28 116T116Q 0.77 119LU9E 0.32 116T116P 0.84 119L119I 0.43 116T116G 0.90 119L119H 0.46 116T116E 0.91 119L119Y 0.56 116T116A 0.95 120T120P 0.01 116T116S 0.96 120T120H 0.50 117Q117W 0.71 120T120R 0.60 117Q117V 0.76 120T120A 0.66 117Q117G 0.79 120T120Q 0.78 117Q117S 0.87 120T120C 0.92 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos. Var. PAD Pl Pos WT Pos. Var.PAD PI 121 S121P 0.38 124G124M 0.01 121 S121R 0.70 124G124W 0.01 121 S121W 0.77 124G124P 0.01 121 S121K 0.78 124G124A 0.03 121 S121G 0.99 124G124Q 0.21 122A122G 0.01 124G124T 0.32 122A122D 0.06 124G124V 0.33 122A122F 0.15 124G124R 0.41 122A122H 0.17 124G124L 0.54 122A122R 0.40 124G124S 0.56 122AÍ22S 0.43 124G124Y 0.56 122A122K 0.45 124G124N 0.60 122A122E 0.47 124G124D 0.64 122A122T 0.52 124G124C 0.67 122A122P 0.55 124G124F 0.95 122A122I 0.65 125V125W 0.25 122A122N 0.70 125V125E 0.39 122A122Q 0.74 125V125R 0.47 122A122W 0.86 125V125C 0.54 122A122V 0.89 125V125D 0.54 122A122M - 0.94 125V125P 0.62 123G123C 0.30 125V125F 0.63 123G123Q 0.31 125V125S 0.79 123G123T 0.54 125V125Y 0.81 123G123E 0.56 125V125A 0.93 123G123V 0.59 125V125I 0.94 123G123R 0.60 126G126I 0.01 123G123N 0.71 126G126V 0.18 123G123H 0.74 126G126Y 0.23 123G123F 0.80 126G126L 0.54 123G123P 0.81 126G126A 0.55 123G123D 0.84 126G126E 0.60 124G124I 0.01 126G126P 0.67 124G124H 0.01 126G126T 0.74 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos./Var.PAD PI Pos WT Pos/Var.PAD Pl 126G126R 0.76 130P130G 0.01 126G126N 0.85 130P130S 0.01 126G126S 0.90 130P130L 0.09 126G126C 0.98 130P130E 0.22 127T127L 0.01 130P130W 0.28 127T127E 0.01 130P130V 037 127T127Q 0.15 130P13OI 0.41 127T127I 0.20 130P130A 0.44 I27T127H 0.60 130P130F 0.48 127T127D 0.62 130P130R 0.53 127T127M 0.64 130P130K 0.55 127T127C 0.65. 130P130C 0.64 127T127V 0.68 130P130M 0.76 127T127G 0.71 131A131W 0.01 127T127P 0.77 131A131D 0.40 127T127S 0.83 131A131Y 0.48 128T128D 0.66 131A131L 0.59 129Y129W 0.01 131 A131S 0.68 129Y129G 0.01 131A131P 0.71 129Y129 0.01 131A131Q 0.74 129Y129V 0.01 131A13IV 0.78 129Y129T 0.14 131A131H 0.82 129Y129A 0.17 131A131G 0.87 129 129R 0.18 131 A131E 0.97 129Y129M 0.21 132P132V 0.01 129Y129D 0.23 132P132T 0.01 129Y129L 0.27 132P132 0.01 129Y129N 0.53 132P132F 0.01 129Y129P 0.59 132P132I 0.01 129Y129C 0.61 132P132H 0.01 129Y129S 0.69 132P132R 0.01 129Y129F 0.71 132P132D 0.01 130P130T 0.01 133K133C 0.01 130P130H 0.01 133K133A 0.10 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natura] 1 ácido menor que i la natural Pos WT/Pos/Var.PAD Pl Pos WT Pos/Var.PAD PI 133K133V 0.23 137V137I 0.70 133K133G 0.31 137V137T 0.93 133K133H 0.31 138S138I 0.35 133K133M 0.33 138S138V 0.69 133K133T 0.39 139P139S 0.01 133KI33I 0.45 139P139G 0.01 133K133Q 0.52 139P139R 0.01 133K133S 0.58 139P139C 0.01 133K133F 0.59 139P139D 0.01 133K133P 0.71 139P139E 0.01 133K133E 0.76 139P139F 0.01 133K133R 0.83 139P139H 0.01 133K133W 0.99 139P139I 0.01 134V134Q 0.79 139P139K 0.01 134V134T 0.86 139P139N 0.01 134V134I 0.89 139P139Q 0.01 135L135T 0.01 139P139T 0.01 135L135W 0.01 139P139V 0.01 135 135K 0.01 140P140T 0.01 135L135S 0.01 140P140S 0.01 135L135F 0.01 140P140V 0.01 135L135G 0.01 140P140 0.01 135L135R 0.01 140P140I 0.01 135L135P 0.01 140P140Y 0.01 135L135Q 0.17 140P140Q 0.01 135L135V 0.43 140P140R 0.01 135L135E 0.63 141P141R 0.01 135L135M 0.78 141P141G 0.01 136V136P 0.01 141P141S 0.02 136V136E 0.20 141 141T 0.12 136V136N 0.40 141P141V 0.16 137V137N 0.01 141P141Q 0.37 137V137G 0.26 141 P141I 0.38 137V137S 0.29 141P141L 0.65 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos Var.PAD PI Pos WT/Pos/Var.PAD PI 141P141H 0.79 145M145F 0.77 141P141N 0.97 145M145P 0.78 142L142W 0.01 145M145S 0.78 142L142I 0.28 145M145T 0.79 142L142S 0.31 145M145A 0.79 142L142Q 0.33 145M145Y 0.82 142L142V 0.33 145M145C 0.93 142 142P 0.44 146P146W 0.68 142L142F 0.54 146P146T 0.76 142L142A 0.56 146P146V 0.77 142 142K 0.66 146P146S 0.96 142L142C 0.70 147H147S 0.75 143A143W 0.01 147H147T 0.84 143A143P 0.39 147H147I 0.92 143A143G 0.42 147H147V 0.92 143A143S 0.63 147H147R 0.94 143A143F 0.68 147H147A 0.98 143A143Q 0.81 148P148Q 0.98 143A143N 0.82 149W149R 0.01 143A143T 0.97 149W149E 0.01 143A143R 0.99 149W149P 0.01 143A143V 0.99 149W149C 0.12 144P144G 0.62 149W149I 0.24 144F144A 0.79 149 149A 0.31 144P144T 0.81 149W149S 0.33 144P144S 0.92 149 149Q 0.40 145M145W 0.01 149W149T 0.44 145M145G 0.26 149W149G 0.45 145M145E 0.48 149W149M 0.49 145M145I 0.53 149W149F 0.50 145M145Q 0.57 149W149L 0.64 145M145L 0.61 149W149Y 0.75 145M145V 0.63 150F150P 0.32 145M145R 0.69 150F150N 0.36 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT Pos^Var. PAD Pl Pos WT/Pos^Var.PAD Pl 150F150G 0.46 155E155V 0.47 150F150V 0.51 155E155I 0.65 150F150A 0.54 155E155Q 0.69 150F150T 0.58 156G156I 0.01 150F150W 0.62 156G156F 0.73 150F150M 0.63 156G156W 0.90 150F150E 0.73 156G156L 0.94 150F150C 0.78 156G156V 0.97 150F150I 0.78 157G157R 0.01 150F150K 0.85 157G157P 0.01 151Q151L 0.01 157Q157S 0.19 151Q151V 0.01 157G157V 0.40 151Q151F 0.01 157G157C 0.61 151Q151I 0.01 157G157E 0.84 151Q151W 0.32 157G157M 0.85 152L152I 0.61 157G157A 0.87 152L152P 0.61 157G157D 0.94 152L152T 0.69 157G157T 0.99 152L152Q 0.76 158E158V 0.89 152L152G 0.77 158E158D 0.89 152L152S 0.84 158E158T 0.91 152L152D 0.86 158E158I 0.94 152L152V 0.88 159Q159A 0.28 152 152R 0.91 159Q159C 0.31 152L152K 0.91 159Q159P 0.49 152L152H 0.92 159Q159D 0.63 153I153N 0.89 159Q159L 0.70 154F154T 0.01 159Q159G 0.72 154F154G 0.01 159Q159S 0.73 154F154V 0.01 159Q159R 0.74 154F154S 0.29 159Q159M 0.84 154F154Q 0,97 159Q159E 0.97 155E155R 0.01 160K160W 0.01 155E155F 0.23 160K160G 0.30 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos Var.PAD Pl Pos WT/Pos/Var.PAD Pl 160K160H 0.57 Í66R166T 0.74 160K160S 0.70 166R166V 0.76 160K160L 0.95 166R166G 0.91 160K160I 1.00 166R166S 0.95 161T161R 0.01 168Y168G 0.01 161T161H 0.01 168Y168T 0.01 161T161W 0.01 168Y168V 0.01 161T161N 0.01 168Y168I 0.01 161T161G 0.43 168Y168C 0.01 161T161C 0.56 168Y168Q 0.01 161T161S 0.57 169S169P 0.89 161T161I 0.98 169S169T 0.97 163E163F 0.27 170A170I 0.44 163E163R 0.49 170A170S 0.47 163E163V 0.55 170A170G 0.62 163E163P 0.77 170A170T 0.72 163E163G 0.80 170A170V 0.74 163E163H 0.82 170A170K 0.83 163E163S 0.85 170A170W 0.83 163E163W 0.98 170A170L 0.85 164L164Y 0.01 .170A170Q 0.89 164L164A 0.01 170 170Y 0.89 164L164D 0.01 171L171R 0.01 164L164E 0.01 172A172K 0.01 164L164G 0.01 172A172R 0.01 164L164H 0.12 172A172E 0.01 164L164F 0.86 172A172Q 0.18 164L164C 0.91 172A172V 0.39 164L164T 0.99 172A172W 0.45 165A165I 0.59 172A172P 0.58 165A165K 0.82 172A172I 0.58 165A165Y 0.84 172A172T 0.71 165A165S 0.94 172A172N 0.76 165A165F 1.00 172A172G 0.84 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural ¡ WT Pos^Var.PAD PI Pos WT/Pos/Var.PAD Pl 172A172S 0.85 180F180 0.01 172A172C 0.86 180F180T 0.01 174F174W 0.01 180F180R 0.01 174F174Q 0.46 180F180S 0.01 174F174C 0.48 180F180G 0.01 174F174R 0.52 180F180Q 0.01 174F174S 0.61 181D181Y 0.01 174F174T 0.64 181 D181 0.01 174F174V 0.67 181D181L 0.01 174F174G 0.91 181D181T 0.01 175M175P 0.08 181D181V 0.01 175M175A 0.66 181D181R 0.22 175M175Y 0.72 181D181K 0.47 175M175G 0.75 181D181G 0.52 175M175W 0.76 181D181S 0.55 175M175V 0.81 181D181Q 0.60 175M175Q 0.83 181 D181P 0.66 175M175L 0.86 181D181E 0.72 175M175R 0.86 18? D181C 0.85 175M175T 0 90 182A182? 0.01 176K176S 0.72 182A182R 0.01 176K176G 0.73 182A182Q 0.01 176 176P 0.78 182A182P 0.01 176K176L 0.92 182A182T 0.11 176K176Y 0.93 182A182N 0.53 176K176N 0.94 182A182S 0.85 176K176T 0.97 182A182G 0.94 176K176Q 0.97 182A182C 0.99 178P178W 0.02 183G183S 0.01 179F179Q 0.01 183G183Q 0.01 179F179S 0.34 183G183V 0.01 179F179W 0.86 183G183F 0.19 179F179H 0.93 183 G183H 0.95 179F179N 0.95 183 G183D 0.99 Tabla 10-7. Variantes con resulTabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT/Pos^Var. PAD Pl Pos WT/Pos/Var.PAD PI 184S184T 0.60 188T188F 0.01 184S184H 0.74 188T188Y 0.09 184S184G 0.82 188T188I 0.10 184S184P 0.85 188T188V 0.15 185V185W 0.01 188T188L 0.42 185V185H 0.01 188T188M 0.75 185V185G 0.01 188T188G 0.79 185V185D 0.01 188T188C 0.87 185V185S 0.53 188T188S 0.91 185V185Y 0.58 188T188A 0.95 185V185I 0.63 189D189F 0.37 185V185R 0.79 189D189R 0.39 185V185K 0.79 189D189N 0.57 185V185C 0.83 189D189V 0.71 185V185E 0.88 189D189W 0.76 185V185T 0.91 189D189E 0.77 185V185 0.93 189D189G 0.80 186I186G 0.01 189D189S 0.81 1861186S 0.01 189D189M 0.88 186I186R 0.01 189D189C 0.94 186I186P 0.01 189D189H 0.95 186I186T 0.23 189D189P 0.97 186I186V 0.48 190G190V 0.01 186I186F 0.76 190G190S 0.01 187S187P 0.01 190G190Q 0.29 Í87S187T 0.23 190G190 0.41 187S187Q 0.35 190G190R 0.51 187S187W 0.52 190G190K 0.57 187S187R 0.55 190G190L 0.82 187S187V 0.58 191V191H 0.01 187S187F 0.65 191 V191 0.01 187S187Y 0.80 191V191S 0.01 188T188H 0.01 191V191G 0.01 188T188R 0.01 191V191N 0.01 Tabla 10-7. Variantes con resul- Tabla 10-7. Variantes con resultados de degradación de per- tados de degradación de per-ácido menor que la natural ácido menor que la natural Pos WT PosiVar.PAD PI Pos WT Pos^Var.PAD Pl 191V191I 0.02 195H195V 0.60 192D192S 0.01 195H195Q 0.96 192D192P 0.01 195H195A 0.98 192D192F 0.01 196F196H 0.01 192D192H 0.01 196F196G 0.01 192D192I 0.01 196F196S 0.01 192D192Q 0.01 196F196Q 0.01 192D192R 0.01 196F196 0.38 192D192T 0.01 196F196P 0.39 192D192V 0.01 196F196V 0.68 192D192W 0.01 196F196M 0.71 192D192N 0.15 196F196Y 0.97 192D192C 0.56 197T197R 0.01 193GI93H 0.01 197T197L 0.65 193 G193C 0.01 197T197S 0>75 193 G193T 0.01 197T197G 0.81 193G193N 0.01 197T197I 0.84 194I194S 0.01 197T197C 0.86 194I194A 0.01 197T197V 0.89 194I194C 0.01 197T197N 0.91 194I194P 0.01 199A199M 0.93 194I194F 0.01 199A199S 0.99 194I194W 0.01 199A199G 0.99 194I194R 0.01 201N201Y 0.01 194I194Y 0.01 201N201T 0.01 194I194G 0.04 201N201V 0.01 194I194L 0.58 201N201R 0.01 194I194V 0.78 201N201S 0.06 195H195S 0.08 201N201H 0.10 195H195C 0.10 201 N201G 0.30 195H195L 0.18 201N201L 0.35 195H195N 0.22 201N201F 0.67 195H195R 0.24 201N201E 0.72 195H195F 0.40 203D203V 0.50 Tabla 10-7. Variantes con Resultados de Degradación de Perácido Menores que la forma natural Pos WT/Pos. /Var. PAD Pl 203 D203 0.52 203 D203E 0.90 La siguiente tabla proporciona variantes que tienen índices de funcionamiento de proteína ("Prot.PI") mejores que la forma natural . Tabla 10-8. Sitios con valores Tabla 10-8. Sitios con valores Pl de proteína mejores que el Pl de proteína mejores que el tipo natural tipo natural Pos WT/Pos^Var. Prot. Pl Pos WT Pos JVtur. Prot. Pl 2A002Y 1.61 17V017A 1.21 2A002N 1.30 17V017E 1.11 2A002I 1.25 17V017F 1.09 2A002V 1.18 17V0.17I 1.08 2A002T 1.17 17V017K 1.06 2A002S 1.15 17V017T 1.03 5I005M 1.29 18P018C 2.56 7C007A 1.22 18P018H 2.50 7C007G 1.07 18P018L 2.50 7C007M 1.03 18P018E 2.47 8F008N 1.23 18P018G 2.47 '8F008M 1.05 18P018N 2.35 8F008G 1.03 18P018V 2.30 8F008P 1.01 18P018Q 2.13 11 S011H 1.06 18P018R 2.01 11 S011 A 1.04 18P018Y 1.68 11 S01 ID 1.03 18P018S 1.05 11 S011E 1.01 19V019G 1.39 11 S011Q 1.01 19V019A 1.23 12L012N 1.06 19V019E 1.10 12L012Q 1.05 19V019Q 1.07 13T013V 1.17 19V019K 1.03 14W014Y 1.02 19V019M 1.00 16W016Y 1.02 20E020G 1.11 Tabla 10-8. Sitios con valores Tabla 10-8. Sitios con valores Pl de proteína mejores que el Pl de proteína mejores que el tipo natural tipo natural Pos WT/PosJVar.Prot PI Pos WT/Pos Var.Prot PI 20E020P 1.08 30P030H 1.05 20E020A 1.08 30P030Y 1.04 20E020N 1.01 32V032M 1.11 20E020V 1.01 32V032A 1.10 22G022A 1.07 32V032I 1.08 22G022I 1.03 32V032Q 1.03 23A023F 1.03 32V032L 1.01 24P024T 1.43 35T035C 1.16 24P024G 134 36G036C 1.09 24P024S 1.31 36G036N 1.08 24P024H 1.15 36G036Q 1.07 24P024I 1.11 36G036S 1.06 24P024L 1.06 36G036A 1.00 25T025C 1.37 37V037N 1.09 25T025V 1.30 39A039V 1.18 25T025G 1.27 39A039E 1.03 25T025A 1.23 46F046A 1.05 25T025I 1.19 46F046C 1.01 25T025P 1.10 47E047I 1.02 25T025M 1.04 54S054A 1.33 29A029G 1.22 54S054C 1.21 29A029P 1.07 54S054E 1.16 29A029M 1.06 54S054D 1.08 29A029D 1.06 54S054H 1.06 2 A029V 1.05 54S054N 1.01 29A029S 1.05 54S054M 1.01 2 A029T 1.02 55A055N 1.12 29A029E 1.02 55A055S 1.08 30P030E 1.20 56R056Q 1.02 30P030A 1.15 58T058V 1.13 30P030S 1.12 60I060A 1.20 30P030L 1.07 60I060M 1.14 30P030Q 1.06 60I060V 1.06 30P030K 1.06 60I06OL 1.02 Tabla 10-8. Sitios con valores Tabla 10-8. Sitios con valores Pl de proteína mejores que el Pl de pro teína mejores que el tipo natural tipo natural Pos WT/Pos./Var.Prot. PI Pos WT Pos Var.Prot Pl 61D061A 1.41 67R067A 1.39 61D061N 1.12 67R067V 1.24 61D061V 1.10 67R067P 1.04 61D061Y 1.03 67R067F 1.01 61D061Q 1.02 68 068A 1.07 61D061L 1.00 68L068V 1.01 62D062A 1.06 68L068G 1.00 62D062M 1.06 69N069C 1.18 63P063S 1.17 69N069G 1.06 63P063Y 1.12 69N069D 1.05 63P063M 1.09 69N069S 1.03 63P063Q 1.08 70G070A 1.08 63P063A 1.06 72S072L 1.07 63P063V 1.06 72S072A 1.06 63P063R 1.02 72S072Y 1.03 63P063T 1.02 73Y073N 1.25 64T064Q 1.13 73Y073Q 1.20 64T064M 1.07 73Y073C 1.18 64T064R 1.05 73Y073D 1.09 64T064C 1.05 73Y073V 1.08 64T064S 1.03 73Y073M 1.05 66P066Q 1.91 73Y073L 1.03 66P066G 1.78 74L074I 1.45 66T066N 1.62 74L074Y 1.19 66P066C 1.51 74L074V 1.18 66P066I 1.51 74L074A 1.01 66P066R 1.26 75P075M 1.22 66P066H 1.23 75P075S 1.18 66P066V 1.12 75P075T 1.10 66P066Y 1.08 75P075Y 1.08 66P066A 1.03 75P075C 1.06 66P066F 1.02 75P075Q 1.04 67R067Q 1.60 75P075L 1.02 67R067L 1.46 75P075E 1.00 Tabla 10-8. Sitios con valores Tabla 10-8. Sitios con valores Pl de proteína mejores que el Pl de proteína mejores que el tipo natural ~ tipo natural Pos WT/Pos/Var.Prot. Pl Pos WT/PosJVar.rProt. Pl 76S076W 1.06 96T096G 1.03 _ 77C077L 1.44 97K097A 1.11 77C077V 1.33 97K097R 1.02 77C077A 120 98A098S 1.17 77C077S 1.19 98A098T 1.03 77C077T 1.18 98A098N 1.01 78L078I 1.06 99 099S 1.45 78 078V 1.04 99Y099L 1.39 79A079C 1.16 99Y099H 1.30 79A079E 1.12 99 099A 1.29 79A079S 1.09 99Y099V 1.28 79A079Q 1.05 99Y099G 1.23 79A079M 1.04 99 099W 1.20 79A079R 1.02 99Y099I 1.11 80T080S 1.12 100F100M 1.20 80T080E 1.02 100F100N 1.12 80T080Q 1.02 100F100W 1.06 82L082G 1.24 100F100S 1.02 82 082R 1.15 101 101 1.33 82L082V 1.14 101R101N 1.11 82L082S 1.13 101 101Q 1.03 82L082P 1.1.1 101R101D 1.02 82L082M 1.07 102R102Q 1.09 82L082K 1.03 103T103G 1.20 82L082A 1.00 103T103S 1.14 83P083G 1.01 103 103H 1.14 84L084V 1.23 103T103N 1.07 86L086Q 3.66 103T103K 1.05 89I089V 1.09 103T103P 1.01 89I089L 1.07 104P104S 1.44 93T093Q 2.03 104P104V 1.40 96T096A 1.32 104P104E 1.37 96T096V 1.12 104P104C 1.34 96T096S 1.05 104P104N 1.32 Tabla 10-8. Sitios con valores Tabla 10-8. Sitios con valores Pl de proteína mejores que el Pl de proteína mejores que el tipo natural tipo natural Pos WT/PosJVar.Prot. Pl Pos WT/Pos Var.Prot. P? 104P104T 1.29 113V113N 1.01 104P104G 1.25 114L114C LIO 104P104Q 1.24 114L114A 1.03 104P104H 1.11 114L114M LOO 104P104I 1.07 115 VI 151 1.14 104P104M 1.01 115V115C 1.14 105L105Y 1.18 115V115A 1.11 105L105H 1.07 115V115M 1.05 105L105G 1.07 115V115L 1.02 105L105C 1.05 116T116N 1.68 105L105Q 1.03 116T116H 1.48 105L105T 1.00 116T116G 1.44 105L105P LOO 116T116C 1.30 106D106E 1.02 116T116E 1.29 107I107S 1.05 116T116Q 1.29 107I107V 1.04 116T116M 1.28 107I107C LOO 116T116S 1.24 108A108G 1.15 116T116Y 1.09 108A108S 1.14 116TI16A 1.08 108A108T. 1.08 116T116R 1.03 109L109E 1.24 116T116L 1.03 109L109I 1.21 117Q117S 1.13 109L109D 1.15 117Q117H 1.12 109L109N 1.13 117Q117E LIO 109L109F Lll 117Q117T 1.06 109L109Q 1.08 117QU7A 1.03 109L109A 1.07 118V118C 1.28 109L109H 1.06 118V118A 1.20 109L109V 1.06 118V118I 1.01 109L109M LOO 119L119C 1.18 110G110S 1.01 119L119A 1.18 112S112N 1.09 119L119N 1.14 112S112E 1.05 119L119I 1.06 113V113C 1.06 119L119S 1.05 Tabla 10-8. Sitios con valores Tabla 10-8. Sitios con valores Pl de proteína mejores que el Pl de proteína mejores que el tipo natural tipo natural Pos WT/Pos-/Var. Prot. Pl Pos WT/Pos^Var.Profc Pl 119L119V 1.04 124G124C 1.07 119L119E 1.04 124G124Q 1.02 119L119R LOO 125V125I 1.05 120T120S 1.35 126G126N 1.04 120T120E 1.19 126G126E 1.02 120T120C 1.14 126G126A . 1.02 120T120K 1.12 127T127A 1.10 120T120N 1.10 127T127S 1.08 120T120A 1.09 127T127V 1.06 120T120H 1.07 127T127C 1.04 120T120Q .1.05 127T127G 1.04 120T120Y 1.01 127T127D 1.03 120T120L LOO 127T127E 1.03 121 S121N 1.17 127T127M 1.02 121 S121L 1.12 128T128N 1.29 121 S121A 1.10 128T128M 1.28 121 S121C 1.09 128T128Q 1.24 121 S121G 1.07 128T128A 1.23 121 S121R 1.06 128T128H 1.19 121 S121K. 1.04 128T128P 1.18 121 S121E 1.01 128T128D 1.14 121 S121Q 1.01 128T128K 1.10 122A122N 1.11 128T128S 1.07 122A122L 1.07 128T128V 1.05 122A122P 1.07 128T128R 1.03 122A122M 1.06 128T128F 1.01 122A122V 1.05 129Y129F 1.44 122A122S 1.05 129Y129C 1.42 122A122E 1.04 129Y129A L39 122A122I 1.04 129Y129D 1.35 122A122Q 1.02 129Y129M 1.28 124G124M 1.36 129Y129N 1.24 124G1-24A 1.20 129Y129L 1.22 124G124N 1.18 129Y129P 1.11 Tabla 10-8. Sitios con valores Tabla 10-8. Sitios con valores Pl de proteína mejores que el Pl de proteína mejores que el tipo natural tipo natural Pos WT/Pos V*ar.Prot Pl Pos WT/Pos/Var.Prot. PI 129Y129G 1.10 149W149L 1.06 129Y129S 1.08 150F150A 1.70 129Y129W 1.01 150F150M 1.69 129Y129V LOO 150F150N 1.52 130P130G 1.11 150F150C 1.41 130P130E 1.08 150F150P 1.38 130P130K 1.05 150F150K 1.33 130P130A 1.03 150F150E 1.32 130P130M 1.03 150F150T 1.27 133K133Q 1.13 150F150V 1.26 133 133S 1.02 150F150W 126 133K133A 1.01 150F150Y 1.24 133K133R 1.01 150F150I 1.19 133K133E 1.01 150F150L 1.14 135L135M 1.01 150F150G 1.13 136V136L L03 150F150H 1.09 138S138A 1.44 151 Q151K 1.04 138S138C 1.17 153I153N 1.04 138S138G 1.09 157G157A LOO 141P141A 1.13 159Q159E 1.14 141P141G 1.02 159Q159A 1.13 142L142I 1.05 159Q159G 1.03 143A143G 1.17 161T161C 1.01 145M145I 1.16 162T162C 1.17 145M145L 1.07 162T162I 1.16 147H147L 1.09 162T162H 1.08 147H147C 1.04 162T162L 1.05 149W149G 1.39 162T162F 1.05 149W149A 1.35 162T162Y 1.03 149W149M 1.32 164L164M 1.09 149W149S 1.28 164L164V 1.08 149 149F 1.27 165A165G 1.14 149W149Y 1.15 165A165Q 1.05 149W149Q 1.10 165A165S 1.05 Tabla 10-8. Sitios con valores Tabla 10-8. Sitios con valores Pl de proteína mejores que el Pl de proteína mejores que el tipo natural tipo natural Pos WT/Pos/Var. Prot. Pl Pos WT Pos^Var.Prot Pl 166R166M 126 184S184G 1.15 166R166K 1.19 184S184D 1.15 166R166G 1.19 184S184C 1.14 166R166N 1.16 184S184Q 1.09 166R166D 1.16 184S184H 1.07 166R166A 1.12 184S184N 1.03 166R166L 1.08 184S184V 1.03 166 166T 1.04 184S184K 1.02 167V167L 1.13 185V185I 1.03 167V167H 1.12 186I186M Lll 167V167G 1.08 188T188C 2.04 167V167M 1.04 188T188I 1.85 167V167I 1.04 188T188L 1.76 167V167S 1.04 188T188M 1.60 167V167C 1.01 188T188V 1.53 168Y168F 1.28 188T188S 1.52 168Y168L 1.27 188T188R 1.41 170A170C 1.02 188T188A 1.40 171L171I 1.16 188T188G 1.32 172A172C 1.09 188T188N 1.24 172A172G 1.07 191V191C 1.04 175M175Y 1.35 194I194L 1.32 175M175L 1.19 194I194C 1.17 175M175W 1.14 194I194A 1.15 175M175N Lll 194I194W 1.12 175M175R 1.02 194I194V 1.03 176K176R 1.06 194I194Y 1.01 176K176Q 1.02 196F196L 1.09 178P178E 1.05 201N201H 1.49 182A182C 1.03 183G183S 1.08 184S184E 1.39 184S184A 1.31 184S184M 1.25 La siguiente tabla proporciona variantes que tienen Pl de PAD que es mayor de 1.5, un PAF que es mayor que o igual a 0.1 y una proteína Pl que es mayor que o igual a 0.1 20 25 La siguiente tabla proporciona variantes con un Pl de PAD que es menor de 0.5, un PAF que es mayor que o igual a 0.1 y una proteína Pl que es mayor que o igual a 0.1. 10 15 20 25 Además de los resultados de ensayo descritos en lo anterior se encontraron diversas mutaciones lo que resulta en una proteína inestable de manera tal que la proteína perhidrolasa no se expresa. De esta manera, en contraste con las sustituciones que resultan en una expresión mejorada en comparación con la forma natural, existen algunas sustituciones que no son tan favorables, por lo menos bajo las condiciones que se utilizan en la presente. No obstante, no se pretende que la presente invención excluye estas sustituciones, dado que se contemplan que estas sustituciones, tomadas solas o combinadas encontrarán uso en modalidades alternativas de la presente invención.
La siguiente tabla proporciona índices de funcionamiento obtenidos en ensayos PAF y PAD de diversas variantes así como el índice de funcionamiento de proteína.
EJEMPLO 11 Clonación y expresión de un homologo de perhidrolasa de M. smegmatis en Sinorhizdbívm meliloti RSM02162 En este ejemplo se describe la clonación y expresión de un homólogo de perhidrolasa de S. meliloti. Las secuencias utilizadas en la clonación y expresión se proporcionan en lo siguiente. Se sintetiza el gen RSM02162 (SECUENCIA DE IDEiSITIFICACIÓN NÚMERO: 625) por DNA2.0. Al gen se le proporciona la designación "G00355" y se proporciona clonado en el vector disponible comercialmente pDRTVE (InvivoGen) . El gen se amplifica por PCR a partir de este clon utilizando el cebador establecido G00355rbsF/G00355R, ADN polimerasa Taq (Roche) bajo las instrucciones del fabricante con G00355 como plantilla (10 ng/50 µl de reacción) y 10 picomoles (por 50 µl de reacción) de cada cebador. La amplificación se lleva a cabo en una máquina MJ Research PCR utilizando 30 ciclos de (1 minuto a 95°C; 1 minuto a 55°C y 1 minuto a 72°C) . La amplificación del fragmento de tamaño correcto se confirma por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento se clona directamente en pCR2.10P0 (Invitrogen) y se transforma en células E. coli ToplO (Invitrogen) . Los transformantes se seleccionan en agar L que contiene carbenicilina (100 µg/ml) a 37°C. La construcción correcta se confirma por análisis de secuencia y se designa "pMC355rbs" . La figura 20 proporciona un mapa de este plásmido. Secuencias cebadoras: G00355rbsF 5 ' -ggcctaacaggaggaattaaccatggtggaaaaacgttccgttctgtgc-3 ' (SECUENCIA DE ID?NTIFICACIÓN NÚMERO: 626) G00355R 5-Gcgcgcttagaacagagccgctactttgtcagc-3' (SECUENCIA DE IDENIFICACICN NÚMERO: 627) Secuencia de gen (que incluye codón de detención) de RSM02162: 5'- atggtggaaaaacgttccgttctgtgctttgg g^ acccatacgaacagcgttggaccggtgctatgg gcacgtctgggtgatggttac ^catcattgaagaaggcctgtccgctcg^ actacíagcctggacgac( aaacgacg(?cgtctgaacggctctacctacctgc^gatggctctggcttctca8tgccactgga tctggtaatcattatgctgggtoccaacgacaccaaaagc^^ ggtaggtcaggícctgacctgtgcaggtggtgttggtacgccttatccagcaccgaaagtccrtggtggttgcacctc^ caccaatgccagat8gtggttcgaaggtatgttcgg^ gtfgatttcatgaaagtggagttcttcgcagcgggtgattg^ aac tccgcctgggtcatgctatt ctgacaaagtagcggctctgttctaa-3, (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 625) Secuencia de proteína G00355: MVEKRSVLCFGDSLTWGW VKESSPTLRYPYEQ WTGAMAARLGDGYH?EEG LSARTTSLDDP^ARLNGSTYIJP ^ NGMGK VGQVLTCAGGVGTPYPAPKVLVVAPPPLAPMPDPWFEGMFGGGYEKS. KEI^GLYKALADFMKVEFFAAGDCISTDGROGIHLSAETI^R GHAJADKVA^ (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 628) Secuencia completa de pDRIVEG00355 : gcgcc^aatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattrattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagc gggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggcíc tgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagc^ aaagctcgg^cacgcatgctgcagacgcgttacgtatcgg atagcatgacccaggcggatgttggtttcagcgctcaggtggateccgtcgataccgtcggtggagatacaatcacccgctgcga agaactccactttcatgaaatcagccagtgctttgtacagaccggacagttccttagatttctcgtaaccaccgccgaacate gaac acggatctggcattggtgci^gtggtggaggtgcaa8accaggactttcggtgctggataaggcgtaccaacaccacc tgcaciaggtcaggacctgacctaccagtt^cccatgccgttggcaatctcgtatggggtacgatgaaagtagcttttggtgtcgttg gtacccagcataatgattaccagatccagtggcaggtgagaagccagagccatcggcaggtaggtagagccgttcagacgagc gtcgtttgggtcgtccaggctagtagtacgagcggacaggccttcttcaatgatgtggtaaccatcacccagacgtgcagccatag caccggta^acgctgttcgtatgggíaacgcagagttggggagctctctttcaccggaatccagccccaagtcagagaatcacc aaagcacagaacggaacgtttttccaccataatctgaattcgtcgacaagcttctcgagcctaggctagctctagaccacacgígtg ggggcccgagctcgcggccgctgtattctatagtgtcacctaaatggccgcacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgact gggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcac cgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaat^ •aaatcagctcattltttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagaíagggttgagtgttg ttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggccc actacgtgaacratcaccctaatcaagttttttggggt^ ttagagcttgacggggaaag8ggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctg gcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgctt^tgcgccgctacagggcgcgtcaggtggcactttt cggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttattW^ cttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgc gctcacccagaaacgptggtgaaagtaaaagatgctga^ gcggtaagata&gagagttttcgccccgaagaacgtttt^^ cgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaa gcatcttacggatggcatgacag^gagaattatgcagtgrtgcc^taaccatgagtgataaca gcggccaacttacttctgac aacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttt gcaraacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggag ctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggc gaactacttactctagcttcc«gg??acaattaatagactggatggaggcggataaag^gcaggaccacttctgcgctcggc<x? ccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaa gccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcc tcartgattaagcattggtaactgtcagaccaagíttact^ gígaagatcctttttgataatetcatgaacaataa^ gggaaacgtcttgcfataggccgcgattaaattccaa^ aatcaggtgcga?^atctatcgattgtatgggaagc<?;gatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaat gatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcírtcttccgaccatcaagcatttíat8 tgcatgg^ctcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgat gcgrtggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtattt^ caatcacgaatgaataacggtttgg#gátgcgagtgat^ atgeataaacttttgccattctea8ggattcagte^ aggttgtattgatgttggacgagteggaatcgcagaccgataccaggate^^ tcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatátgaataaattgcagtttca?^ gaattaattcatgaccaaaatc8ttaaegtgagttttc^ gatccttt^ctgcgcgtaatctgctgcttgcaaac caactctttttccgaaggtaactggcttragcagagcg^ caagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttacc gggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttgga gcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggac aggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcc tgtcgggtttcgrcacctc?tgacttgagcgtcgat^ cggcctttttacgg#cctggccttttg^^ cctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 629) Secuencia completa pMC355rbs agcgca^atacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaag cgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcatoggcaccccaggctttacactttatgcttwggrt^ gtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacagga^ ctagtaacggccgccagtgtgctggaattcgc<^ tttggtgattctctgacttggggctggatt8ggtgaaagagagctccccaactctgcgttacccatacgaacagcg^ gctatggctgracgtctgggígatggttaccacat^ cgctcgtctgaacggctctacctacctgccgatggctctggcttctcacctgccactggatctggtaatcattatgctgggtacc^ gaca8aaaagctact tca cgtaccccatacgag^ttgccaacggcatgggtaaactggtag gtggtgttggtacgccttatccagcaccgaaagtcctggtggttgcacctccaccartggcaccaatgccagat8 ggtaig^cggcggtggttacgagaaatctaaggaact#^ gcagcgggtgattgtatctcca8gacggtatcgacgg^ tgacaaagtagcggctctgítcíaagcgcgcaagggcgaattcígcagatatccatcacactggcggccgctcgagcatgcatct agagggcccaattcgccctatagtgagtcgtat&caa^ acccaa^aatcgccttgcagcacatcccca^cgccagctggc^ agttgcgcag^gaatggcgaatggacgcgccctgt^^^ o ccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctá^ ctaaalcgggggctccctttagggttccgattta^ gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgtt^ acactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggccl ttggtta^^ atttaacgcgaattttaacaaaattcagggcgcaagggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagc8 gtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgca gtgggcttac»tggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaa;ggaattgccagctggggcgccctctgg^ aggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaaga gacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggct atgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgc^ 5 - a8gacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgc agctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggacrtggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatccca ccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgacc accaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatc aggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcg cgtgacccatggcga tgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatca ggacatagcgttggctacccgtgatattgrtgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgctt8tcgtgctttacggtatcgccg ctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttcc gtgícgc8ttattccctttiftgcggratt^^ o agttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgW tgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacact attctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctg ccataaccatgagígataacactgcggccaactíacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaac atgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatg gaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcgga^ tgggtctcgcggtatwttgcagcartggggc8gatggtaagccctcccgtatcgtagttatcta8 actatggatgaacgaaatagácagatcgctgagataggtgcctc-ictgattaagcattggtaactgtcagaccaagíttactc^tate tactttagattgattteaaacttcatttttaatttaaaaggatcrtaggtgaagatcctt gataatctcat^ agttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaa^ 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Los lisados se preparan al sedimentar las células de 1 ml de un cultivo durante la noche por centrifugación y lisar con BugBuster (Novagen) . Los sobrenadantes se determinan utilizando ensayo de actividad de pNA, ensayo de perhidrólisis y un ensayo pNC6 (para probar su capacidad para hidrolizar cadenas de carbono más largas de C4) como se describe en la presente.
Resultados de ensayo La siguiente tabla (tabla 11-1) proporciona una comparación de la actividad de hidrólisis de pNA por G00355 en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis .
*La velocidad son unidades de absorbancia/min leídas a 405 nm en un espectrofotómetro La siguiente tabla (tabla 11-2) proporciona una comparación de la perhidrólisis de triacetina por G00355 en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis .
La siguiente tabla (tabla 11-3) proporciona una comparación de la perhidrólisis de pNC6 por G00355 en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis.
*La velocidad son unidades de absorbancia/min leídas a 405 nm en un espectrofotómetro . Como lo indican estos resultados, el homólogo RSM2162 de S. meli l o ti identificado por homología de secuencia de aminoácidos con la perhidrolasa de M. smegma tis demuestra una actividad de perhidrólisis similar aunque menor en comparación con la perhidrolasa de M. smegma tis . No obstante, esta enzima presentó especificidad de sustrato diferente, dado que fue capaz de hidrolizar pNC6 mientras que la perhidrolasa de M. smegma tis natural no. Los resultados del ensayo de hidrólisis de pNC6 indican que ciertas posiciones/sustituciones proporcionan una mejoría en la capacidad de la enzima para utilizar sustratos de cadena más largos. Las posiciones y sustituciones identificadas en cribados prel iminares se proporcionan en la siguiente tabla . No se pretende que la presente invención esté limitada a estas posiciones específicas y sustituciones , dado que se contempla que las posiciones y/o sustituciones adicionales también pueden proporcionar actividad mejorada sobre sustratos de cadena más larga .
EJEMPLO 12 Amplificación de genes que codifican para homólogos de perhidrolasa de M. smegma tis de aislados ambientales En este ejemplo se describen métodos utilizados para amplificar genes que codifican para homólogos de perhidrolasa de M. .smegma tis de aislados ambientales . Los organismos de muestras de suelo que fueron positivos para la reacción de transesterificación se purificaron hasta colonias solas. Para amplificar los genes por -PCR, se utilizaron conjuntos de cebador degenerado 1AF/5AR y leF/5iR en una reacción de PCR que contiene ADN cromosómico aislado de 8 cepas ambientales que presentan la reacción de transesterificación. La reacción de PCR se lleva a cabo utilizando ADN polimerasa Taq (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante, con 1 µg de ADN cromosómico agregado como plantilla y 10 picomoles de cada cebador en 50 µl de reacción. La reacción se lleva a cabo durante 30 ciclos de (1 minuto a 95°C; 1 minuto a 50°C y 1 minuto a 72°C) . Dado que la secuencia codificante parcial del gen para perhidrolasa de Mycoba cteri um parafortui t um ya se ha aislado, se utiliza la misma cepa como un control positivo. Las cepas se denominan como: 2G, 2D, 9B, 14B, 18D, 19C, 20A. Como se indica en lo siguiente, 20A se tipifica como Mycobacteri um parafortui tum , y 9B como Mycobacteri um gil vum . En base en la homología de proteína, se infiere que 2D también es M. parafortui tum y 14B es M. gil vum . Secuencias de cebador 1AF : 5 ' -gccaagcgaattctgtgtttcggngaytcnyt-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 631) 5AR : 5 ' - cgattgttcgc c tcgtgtgaartgnrtnc crtc - 3 ' ( SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 632 ) leF : 5 ' -acggtcctgtgctttggngaytcnyt-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 633 ) 5ÍR : 5 ' -ccgctggtcctcatctggrtgntcnccrtc-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 634) La amplificación con los conjuntos de cebadores anteriores se espera que proporcione bandas de aproximadamente 500 pares de bases. En todos los casos excepto 2G, el conjunto cebador 1AF/5AR produce una banda del tamaño esperado. En el caso de 19C, ambos conjuntos de cebadores producen bandas del tamaño esperado. Las bandas de -500 pares de bases se purifican a partir de geles de agarosa utilizando un equipo de purificación de gel (Qiagen) y se analizan por secuenciado. Aunque las cepas 2G y 19C proporcionan bandas del tamaño esperado tanto con los conjuntos de cebador, no son fragmentos que codifican para el homólogo de perhidrolasa de M. smegmatis . Las secuencias parciales del homólogo de perhidrolasa 2D y la proteína: Gen: 5'- attctgtgtttcggggattccttgacgtggggatggatccctgtcgaagaaggtgtgcc<accgagcgg^ cgtccggtggaccggcgtgctggccgacctgctgggcgaccgctacgaggtgatcgaggaaggcctgtcggcgcgcacca cca8gccgacgac8ggccga8cccggct(^acggttcgcag^tctgccgtcgtgt^ggccagcc^ gacctggtgatcctgatgctcggcatcaacgacacxj-wggcgaat ttggccgcaccccgttcgacatcgccaccggtat gggagtgcttgccacgcaggtgctcaccagcgccggtggcgtggggaccagctatcccgcgccgcaggtgctgatcgtgg cgccgccgccg«?gggcgagctgccccacccctggttcga( tggtgttctccggcggccgtgagaagaccgccgagttg gcccgcgtgtacagcgcgctggcgtcg^catgaaggtgccgttcttcgacgccggctcggtgatcagcaccgacggcgt ggacggcacccacttcacacgaggcgaaacaatcga (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 635) Proteína ILCFGDSLT GWIPVEEG TERi?RDVR TGVLADLLGDRYEVIEEGI^ARTTT ADDPADPRLNGSQYII»SCLASHLP--X1LVIJ VM^ ATQVLTSAGGVGTSYPAPQVIJVAPPP JEl^HPWFDLVFSGGREKTAELARVYS ALASF I VPFFDAGSVISTDGVDGTHFTRGEp (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 636) Secuencias Parciales de Homólogo de Perhidrolasa 9B y Proteína Gen: 5'-ta8gtcgatgtgtggcctcgtgtgaagtgggígcc^ ctggatcccggtcgaggaaggtgtacccacccaacgttttccgaagcgggtgcgctggaccggggtgctggccgacgaac tgggtgctggctatgaggttgtcgaggaggggftgagcgcgcgraccac^ aacggctcggactacctccccgcatgcctggccagccacctgccgctggacctggtgatcctgatgctcgggaccaacga caccaaggcgaatctgaatcgcacacccgtcgacatcgccagcggaatgggcgtcctggccacccaggtgctcaccagcg cgggcggggtcggcaccagctacccggccccgcaggtgttgatcgtggcaccgccgccgctggccgagatgccgcacccg tggttcgagctggtcttcgacggcggccgggagaaga8gcccaactggcccgggtgtacagcgcgctggcgtcgttcat gaaggígccgttcttcgacgccggatcggtgatcagca^ tcgaccgg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 637) Proteína: GGRCVASCEVGAVAKRIT^FGDSLT^G IPVEEGWTQRFP CRVRWTGVI-ADEL GAGYEVVEEGI^ARTT ADDPTDPRLNGSDYLPACI?SHLPUJLVILM ?proTK Al^NRTP? iASGMGVLATQVLTSAGGVGTSYPAPQVLIVAPPPLAEMPHPWFEL DC 3ílEKTAQLARVYSAT^SFMKWFFDAGSVISTDGVDGT?FTRGETIDR (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 638) Secuencias parciales de homólogo de perhidrolasa de 14B y proteína Gen S'- attctgtg cggagattcgttgacgtggggetgga ggtgcgctggaccggggtgctggccgacgaacrtgggtgctggctatgaggttgtcgaggaggggttgagcgcgcgcacca a_accgctgacgaccctaccgatccccggctgaacgg(rtcggactacctccccgcatgccrtgg ga8tggtgatcctgatgctcgggac ^acgaca?xaaggcgaat<^gaategcacacccgto gggcgtcctggccacccaggtg(rfcaccagcgcgggcggggtcggcacc»gctacccgg( ccgcaggtgtt^ caccgccgccgctggccgagatgccgcaa^gtggttcgagctggtcttcgacggcggccgggagaagaccgcccaactg gíx^gggtgtacagcgcgctggcgtcgttcatgaaggtgccgttcttcgacgccggatcggtgatcagcaccgacggtgt Cgacggcacccacttcacacgagg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 639) Proteína: IIX FGDSLTWGWIPVEEGVPtQRFPKRVR TGVIADELGAGYEVVEEGI^ARTT TADDPTOPR NGSDYLPACIASHIJl^L M^ IATQVLTSAGGVGTSYPAPQVIJVAPPPIAEMPHPWFE VFDGGREKTAQ ARV YSALASFM VPFFDAGSVISTDGVDGT?FTR (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 640) Secuencias parciales de homólogo de perhidrolasa 20A y proteína: Gen: 5'- ttgcwagcggaattctgtgtttcggggattcWgacgtggggatggatc( tgtcgaagaaggtgtgccraccgagcg gttcccgcgtgacgtccggtggaccggcgtgctggccgacctgctgggcgaccgctacgaggtgatcgaggaaggcctgt cggcgcgcaccaccaccgccgacgac8ggccgacccccggctcaacggttcgcagtatctgccgtcgtgtctggccagc tctgccgctgga8tggtgat8tgatgcteggcatcaacgara^ cgcca8gg^tgggagtgcttgccacgcaggtgctcaccagcgccggtggcgtggggaccagctatcccgcgccgcagg tgctgatcgtggcgccgc»gccgctgggcgagcígccccaccTOtggttcgaccrtggtgttctccggcggccgtgagaag accgccgagttggcccgcgtgtacagcgcgctggcgtcgttcatgaaggtgccgttcttcgacgccggctcggtgatcag caccgacggcgtggacggcacccacttcacacgaggcgaaacaatcga-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 641) Proteína : IJSG CTGDS T G IPVEEGVPTORFPRDVRWTGVT ^TXGDRYEVIEEGLSA RT^ ADDPADPRLNGSQYLPSCIASHU»LDLVEJVÍLGIM>? AOTGRTPFD-ATGM GVIATQVLTSAGGVGTOYPAPQVIJVAPPPIX5EI HPWFD SGGREKTAEI-AR VYSAIASFN^ FFDAGSVIS?XJVi??THFTRGE? (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 642) Identificación de los aislados naturales Para tipificar aislados ambientales utilizados en este ej emplo, las placas de las cepas purificadas se envían a MIDI para tipificación por ARNr 16S. 20A es Mycobacterium parafortuitum 9B es Mycobacterium gilvum. Por homología de proteínas se infiere que 2D también es M. parafortuitum y 134B es M. gilvum. EJEMPLO 13 Secuencia y análisis taxonómico de homólogos de perhidrolasa En este ejemplo se proporcionan la secuencia y los análisis taxonómicos de los homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis. Asignación taxonómica La "lista de 60" proteínas de secuencia básicas a las que se tiene acceso a partir de bases de datos públicas y utilizadas para construcción de conjuntos de cebadores para cribado de bibliotecas metagenómicas (BRAIN, por sus siglas en inglés) se convierte en un documento que ilustra los orígenes taxonómicos microbianos de las proteínas, como se describen en lo siguiente. Esta información se utiliza para producir la siguiente alineación : MSAT { 1 ) ^MAKRILCFGDSLD G VPVEDGAFO-EREAPDVRWÜS 14B aislado natural ( 1 > II?H«DSLTHGHI- B(-V??T--QEl M RVRWTG 20A j i) PSGILCFGDS TWCWtPVEEGVeT-ERFPRDVTOITG 2D aislado natural { 1) IlXFGDSLT GHIBVEEGVPT-ERFPRDVRtíTG 9B aislado natural ( 1 ) -GGRCVj?SCEVGAVJUCRII? GDSLTWGSf IFVEEGVPT-QRFPKRVRWTG M. para for i tum COI (1) MRKRII?reDSLTHGHIPVEEGTOT-ERFPRDVRHTG Sra-RSH05666 ( 1 ) MK VLC?GDS THG?EftTGSG RHALBDRHPS At-Q8UftC0 MKTVIAFGDSLTHGADPATß L— RHFVEHRHPD At-Q8D??G4 ^MVKSV CFGDSLTOGSNABTGG RHSKDDIHPS M091_M4aEll MKTIIA?GDS T?GaNPIPGGP RHAYEDRHPT M1-RMLO00301 MAGOTl^DECTGERbiKTVlC?GDSLTWG?KftEGG RHALEDRBP3 P.dejongßil RVM04532 MKTIWFGDSHWG?DEASMTAPFP^GPEVKHTG Q92X21 Sinorhizoblua pßlilotl ^MEETWARTVLCFGDSNTHGÍÍVPGRGPLDR YRREflRWGG Q98MY5 Mesorhizobiura lotl MCTVLCYGDSMWGYNAEGG RHALEDRWPS RSM02162_Sra MVEKRSV CPGDS-.WGHIPVKE8SPT-tB?P?EQRm:G S261_M2aA12 MKHIIA GDe WGFVAGQIfflS HPFETRWPH S al993 Sinorhizobiua meliloti MTINSHSHRTLMVEKRSVLC GDSLTHGSIPVKESSPT-LSYPYEQRHTG consenso KTILCGGDSLTVCTIPV EG P RHP E m G 51 100 MSAI (37) V1A0QW-MFEVIE--EGLSARUUNIDDPUDPRL-NGAS?LPSCIAOH P KB aislado natural (33) VIADELGAGYEWE— EGL?ARTTTADDPTDERL-NGSD? PACIASB P 20A (37) VUU}L GDRYEW-:E--Eei-3ftHTTTADDPADPRL-HGSQnPSCIA8BtP 2D aislado natural (33) VIAD-isDRYEVIE--EGLSARTTTADDPADERL-HGSQYj-PSCIA3HiP 9B aislado natural (49) VLADE GAGYEi?VE--EGLSARiriTADDPTDPia.-HGSDYlPACIASHLP M, parafortuitum COI (37) VIADLLGDRYEVIE— EGLSARTTTAEDPADPRL-NGSQ?ÍPSCLASHLP Sra-RSH05666 (32) VLQK¡ GSDAHV-A--EG?GRTTft?DDHI^^ At-CßOACO (32) VLE?EIA<ra^HP~EGK^-TC?DDHAGPAC^^ At-QßOFG4 . (33) VMKñI,GSDVHWFTHEGI?GRTTAYDDHTGDCDRNGARtiPTt HSHAP M091_M4aEll (33) ALEQGLGG MVIA--EGI?GRTTVHDD«FANADRNGASV1,ETLL?SHSP HI-RML000301 (45) VLO?SI?GGVQVIA--DGU!GRT AFDDHIAGADIWGHRlLPTALrr?^ P.dejongeil RVM04532 (37) VI?KRE -ftGPRVIE--EEK^GRTTVHEDP?i(m-KGKDYI,PAClESHKP Q92XZ1 Sinarhiüobiua meliloti (39) VIÍ^IßPiW0VIE--EG--3GRT-WD PIEGSL?™G IYI?PCIßSHAP Q9BMY5 Mßsorhizoblum lotl ' (31)^VI?ASLGGGVCVIA--DGI-SGRTtA-T)DHIAGADÍ«GAíUJJP A HAP RSM02162_Sn (39) AMAñRLGDGYHip¡--EGLa?RrieLDDPHr?ARL-HGSTY PHALASELP S261_M2aA12 (32) AU?GLGGKARVIE--EGQNGHTTVFD-lAí TFESRRGSVi P LLISHQP Smal993 Slnorhizobiura meliloti . (50) AMíV?RI -XK»HIIE--EGI-3ARTTSLDDPNI-RRI.-NGSTYLEMAIASH P consenso (51) VIA LGG Y VIE EGSGRTT DDP D L NGS YLPT IASH P 101 150 MSAT (84) LD VIIMIJ3IlNr>UKAYFRRUPLDIA--LGMSVLVUQVLUSAGGVGaUYPA 1 B aislado natural (B0> D VIU-U?ri rKAmtra?PVDIA--SGMGV^ 20A (84 ) t0LVII-4MIOTrKANFGRTP-T-A--TíMGVLArQVLTSAGGVGrSYPA 2D aislado natural (80) LDLVIU-lJGINDTKMJ-^ffiTPFDIA--TGMGVIATaVLTSAGGVCTSYPA 9B aislado natural (96) I.DI.VI^p£T^roTKfiNL?plTFTOIA--SGMGV^ M. parafortuitum COI (8 ) DLVIU-I?TNDTKAIJFGRTPFDIA--TGMGVIA,TQVLTSAGGVGTSYPA Sm-RSH05666 (80) I?LW?7MLGSOTMKPIIHGTA?Tl-AV--KGIERLVm.VRRKDWPTEIE-EG At-Q8aaC0 (80) IJ)LVIIMWTiroiKPVHGGRAÉaAV--SGMRR AQIVErj?IYK-'RBA— V M091_H4aEll 181) LD IVIM GTHDIKPHHGRIAGEAG--RGMAR-.VQIIRGMYAGRMQD--E M1-RMI?00301 ( 3 ) IDLIVIMLGASDMKPHIHGNPVARK- WIQRI-IOITOGHDYPFDWP--A P.dejongeii RVM04532 (84) l^I.VII14LG_OTI*ST??NVPPGEIA--AGAsVLGRiaiM^ Q92XZ1 Sinorhizobium meliloti (87) I?LII13-IBTHDI.K F IMPPSE A--MGIGC VHDIRE^SPG TG1^--D Q98MY5 Mesorhiioblum lotl (79) IDI?VIMSUJDMKraiHGNPVAAK--0^QR IDIVRGHDYPE?7HP~A RSM021d2_SB (86) lDtVlIWJGTm¡TKSrFKRTPYEm--N-SKKLVGO^TC?GGVGTPYPA S261_M2aA12 (80) LDLVlIHI?INDIKERARCEA nñS--HaffiRLIOIVRSaHYtKGYK--I Smal993 Sinorhizobiun meliloti (97) lDLVIj-HLGnrotKSYFHRTPYEIA--N(2ffiKLVGQVLTC3«3GVGTFYPA consenso (101) LDLVXIMLGTNDMt» RTP DÍA GMGRLV VLT AGSVG A 151 200 MSAt (132) PKVLWSPPPI?PM-PHPHFQUF-EGGEQKOtiEIARVYSAIASEliKVPF HB aislado natural (128) PQVlIVMPPIAO1-PHFWFELVF-DGGREK AQIARVYe*IASEMKVPF 20A (132) POVlIVAPPeMEt-PHl?HFOI,VF-SGGPEK-'AlOJUlVYa«ASEMKVPF 2D aislado patural- " (128) PO p;IVAPPPI?El,-PHPHFDLVF-SGGREKTAE?RV?SAIASFHKVPF 9B aislado natural (144 ) PgV IVAPPPlAm-PHraF?jVVF-DGGREK AQURVYSAI-UeHE(VPF H. paraf ortuitun COI (132) PQV IVMPPLGEL-PHPKFQ VF-SGGRE TilELMiV?SALASElíKVPF SK-RSH05666 (127) At-OSUACO (126) PKLUVAPEFCTAG PGGEPAG-GRDIEQSHRLAPLYRKLMELGHHF At-Q8ÜFG4 (132). PDVLIVSPPQI?ET?NPFMGAIFRnAIDEaMLASVFTYSDIADEj^ H091_H4aEll (127) PQIIWSPPPIILGWAtMMDHFGPHEArAtSVÜF?REY KRADEQKVHF M1-RMLO00301 (139) PQII.rVSEPWSRT--EKADFRiE FAGGDE?SKaLaPüYMIAOEVGCGF P.dejongßli RVH04532 (130) EQ L?CPPKTODLSAMPDLDñKr-PHG¡ AMAEFPRHYK«AVM.KCE? Q92XZ1 Sinorhtzoblum melilotl (133) PE8IVAPP??Hj^D--I-<EHES?F-Sta?EKSP a?I,EFEIMADSLEAHF Q98HY5 Mßoorhi-obiu» lotl U2S) PQl rVSPPWSRT--E MFREM-?GOTEASKQI-l«QY< A MEVGCGF RSM02162_Sa (134) PKVlVVAPPPLftíM-PDPHFEXMF-GGGYmSKS SGLYKAIAIlFMKVEF S261_M2aA12 (126) PEI IISPPSLVPT--QDE E?JD GaAIAESK FAKKYKRVAEE KVHF Saal993 Sinorhizobium meliloti (145) PKV VVAPPPl-!ira-PDPWFeGMF-GGGYE SKEI-3GWKfiIADFM VEF consenso (151) PQVLIVAPPPL EM P FE VF GG EKS IARVY ALAD HKV F 201 241 MSft?" (180) Ft?GSOTSODGVDGIHFOERNNRDI?nmiAEQVRSL (SEQ ID KO: 643) 14B aislado natural (176) FD?GSVISIDGVDSTHFTR (SEQ ID NO: 644 ) 20A (180) FDAGSVISTDGVDGXHFTRGBII : (SEQ ID HO; 645) 2D aislado natural (176) FMGSVISTDGVDGTHFTRGETI (SEQ ID NO: 646) 9B aislado natural (192) FOAGSVISTOGVDGTHFTRGETIDR (SEQ ID NO: 647) M. parafortuitum CO (180) FtßißSVISTDGVDGIHFIRGEQSI — — (SEQ ID NO: 648) SB-RSH05666 (175) FDGG-W«I PIIXn'H n?BNIRAVGR-aEPVVR?£M-?ß-.~ {SEQ ID HO! 649) At-QBUACO (172) FDftGSVASASFVDG DRSMAMGRAIA?PVRDILG (SEQ ID NO: 650) At-Q8ÜFG4 (182) FDAGSVARTTPVIK^iVHLSAemRAIGRG?PVVRH?lXGL~- (SEQ ID NO: 651) M091_M4BE11 (177) FDAG iTTSKAIWIHLDPANTRAXGRGLVPLVKaVLGL-- (SEQ ID NO: 652) M1-RMLM0301 (187) FDWSTV?Q TPIJXSVH -ftEiraRNIGKRLTSVVRVM (SEQ ID NO: 653) P.dejongeil RVH04S32 (179) FNSQEIVETSPmiHLEASEHLfa-SEALREKVKVLLG (SEQ ID NO: 654 ) Q92XZ1 ?inorhl?obium meliloti (180) FDAGTVCQ^PAp6FHIDEn¡ LLG-B- AQEVLAIGWPDA(SEQ ID NO: 655) Q98MY5 Hesorhlzobiui» loti (173) F-AOTV»QTTPLDGVHLDftENTRNIGKALTSVVRVMLEL — ( SEQ ID NO: 656) RSM02152_Sp (182) FASG-raST8I8IHLS?-OTNIRLGHAIADIW»ALF 1 SEQ ID NO: 657) S261_M2aA12 (174) P8GTVAVADKTDGGHLl»vmBtAIGVALVPVVKSIIA -- (SEQ ID NO: 65B) Smal993 Sinorhizobium meliloti (193) EAMiXISTDGItXSIK SAETMIR GHAIADKVARLF (SEQ ID NO: 6591 consenso (201) FDftGSVISTD VDGIHLDA T IG AL VR LL (SEQ ID NO: 660) El árbol de alineación de la alineación CLUSTALW (el cual se aproxima a un árbol filogenético) sugiere 3 o 4 agrupamientos . A partir de esta alineación se construye una secuencia de proteína hipotética a partir de la secuencia de consenso. Cuando no existe consenso, el sitio se llena con el aminoácido Per; se ignoran las separaciones. Esto proporciona una secuencia de consenso Per: 1 TILCFGDSLT G IPVEEGAPTERHPPEVRWTGVAQQLGGDYEVIEEGL 51 SGTTNIDDPTDPRLNGSSYLPTCLASHLP DLVÜMLGT ? KAYFRRT 101 PLDIAGMGR VTQVLTSAGGVGTTYPAPQVUVAPPPLAEMPHPWFELV 151 FEGGEEKSTELARVYSALADFM VPFDAGSVISTDGVDGIHIJAANTRD 201 IGVAAEQVRSL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 661) Esta secuencia de consenso se utiliza para una búsqueda BLASTP contra una base de datos no redundante. Esta búsqueda identifica 55 aciertos . La mayor parte de los "aciertos" son moléculas del tipo GDSL o GDSI que cubren una amplia gama de diversidad microbiana. No obstante, únicamente los primeros 14 "aciertos" tienen valores e y valores de bitio en el intervalo confiable. A primea vista, esto parece proporcionar moléculas adicionales con un motivo GDSL/N-G/ARTT, pero esto se encuentra que se debe a diferencias en la codificación (Swiss Prot versus GenBank) El cribado de 3 bibliotecas ambientales (en BRAIN) resulta en 10 clones con un motivo GDSL. Se derivan 2 clones adicionales de la biblioteca BRAIN. La siguiente tabla (tabla 13-1) incluye los clones e indica su actividad.
M40CD4 El acierto más fuerte : arilesterasa de Brucella meli tensis (46% idéntica) . Motivos: GDSL-GAND; CQTT en vez de GRTT. La alineación de secuencia contra la lista de núcleo de los organismos la coloca cercana a Caulobacter vibrioides y Brucella melitensis en las alfa- Proteobacteria.
M44aA5 El acierto más fuerte: acil-CoA tioesterasa de Pseudomonas aeruginosa (43% idéntica). Motivos: GDSL-GGND; sin GRTT o equivalente. La alineación de secuencia contra la lista de núcleo de los organismos la coloca cercana al género Pseudomonas en las gamma- Proteobacteria .
M2bBll El acierto más fuerte: arilesterasa de Brucella meli tensis. Motivos: GDSL-GAND; sin GRTT o equivalente. La alineación de secuencia contra la lista de núcleo de los organismos no muestra una asociación fuerte colocada entre las alfa- y gamma- Pro teobacteri a .
M2aA12 Acierto más fuerte: arilesterasa de Agrobacterium tumefaciens (42% idéntico) Motivos: GDSL-GRTT-GTND.
Alineación de secuencia contra la lista de núcleos de organismos lo coloca cercano a Agrobacterium tumefaciens en las alfa- Proteobacteria .
M75bA2 Acierto más fuerte: incompleto. La búsqueda BLAST mostró que no hay nada significativo. Motivos: GDSL-GTND; sin GRTT o equivalente. La alineación de secuencia contra la lista de núcleos de los organismos no muestra asociaciones convincentes . Los vecinos más cercanos parecen ser los grupos Vibrio -Aeromonas de las gamma.- Proteobacteria .
- M.smegmafe ACT (0.4020) -M75bA2_prei¡m (0.4499) -Vibrio choleraejecflhipase (0.1816) -Vibrio harveyi (0.0751) -Vibrio parahaemoiyticus (0.0780) -Vibró vuinrffcus (0.1362) Legionelía pn?umophila (0.3459) Aeromonas hydrophüa (0.0330) Aßramonassalr nicída (0.0017) Aeromonas salmonlcIdajGPLCACT (0.0013) Salmonete typhimurium SeeJ (0.3861) M70aE8 Acierto más fuerte: acil-CoA tioesterasa de E. coli (30% idéntico) y arilesterasa hidrolasa de Vibrio mimicus (27% idéntica) . En base en la secuencia incompleta de la esterasa tipo GDSL (BRAIN) de Neisseria meningi tidis (50% idéntica). Motivos: GDSL-GGND; no hay GRTT - sustituido con GRTV. La alineación de secuencias contra la lista de núcleo de organismos muestra la asociación más cercana con Neisseria meningi tidis, un miembro de las beta- Proteobacteria .
M4aEll Acierto más fuerte: arilesterasa de Agrobacterium tumefaciens (59% de identidad) Motivos: GDSL-GRTT-GTND. La alineación de secuencia contra la lista de núcleo de organismos muestra la asociación más cercana con miembros de las alfa- Proteobacteria tales como Agrobacterium.
Estll4 Acierto más fuerte: fosfatidilcolina esterol aciltransferasa de Aeromonas hidrophyla (gamma- Proteobacteria) (30% idéntica) . Motivos: GDSL-GPND; sin GRTT pero GATT puede ser un equivalente. La alineación de secuencia contra la lista de núcleo de organismos muestra la asociación más estrecha con el género Acidophilium y Aeromonas /Vibrio dentro de las gamma- Pro teobacteri a .
Estl05 Acierto más fuerte: esterasa de la membrana exterior de Pseudomonas aeruginosa, y proteína hipotética de Pseudomonas' putida (27% idéntica). Motivos: GDSL-GAND, sin GRTT o equivalente. La alineación de secuencia contra la lista de núcleo de organismos muestra la asociación más estrecha con miembros de la gamma- Pro teobacteri a .
Una alineación general de estos clones/secuencias (que se muestran aquí subrayados) indica que están dispersados a través del árbol de alineación de las cepas lo que indica que se ha proporcionado un cribado metagenómico de una diversidad de secuencias y no de una diversidad limitada.
Minado de genes para esterasas tipo GRTT (clones con actividad de perhidrolasa) Sinorhizobium meliloti Sma " 1993-hypothetical protein_Sme Motivos: GDSL-ARTT-GNTD Sinorhizobium meliloti Q92XZl-hypothetical proteín_Sme Motivos: GDSN-GRTT-GNTD Mesorhizobium loti Q98MY5-arylesterase_Mlo Motivos: GDSL-GRTT-GAND Moraxella bovis AAK53448 (lipasa) Motivos: GDSL-GSND, sin GRTT o equivalente en este orden de secuencia (actividad baja de perhidrolasa, secuencia cuestionable) Agrobacterium tumefaciens Q8UACO Motivos: GDSL-GRTT-GTND Agrobacterium tumefaciens Q8UFG4 Motivos : GDSL-GRTT-GTND Mesorhizobium loti RMLO00301 Motivos : GDSL-GRTT-GAND Sinorhizobium meliloti RMS05666 Motivos: GDSL-GRTT-GSND (este clon es inactivo para actividad de perhidrolasa y probablemente representa un resultado negativo falso) Sinorhizobium meliloti RSM02162 Motivos: GDSL-ARTT-GNTD Prosthecobacter dejongeii RVM05432 Motivos : GDSN-GRTT -GTND Un motivo GDSxl-x2RTT-Gx3ND caracteriza los clones/secuencias activas, en donde: X? = L o N X2 = A o G X3 = T o A O S La secuencia de AA 53448 de Moraxella bovis no se ajusta a este patrón y se excluye del análisis de alineación que se proporciona en lo siguiente: Alineación de secuencias múltiples de clones activos/secuencias -~ 50 ACT MSMES (1) MA LCEGDSLOWGSTrevBDGAPU'-EREAPDVIWUs Q98MY5 Meaorhizobiu» loti (1) . — ^MKTVLC?QOS THG?NXEGGR HA1EDRWPS Sma.1993 Sinor izoblum raelilotl (1) HTINSHSÍ1RTIWVBKRSVI?reD3 THG1irPVKESSPT-LRYPYEQH»(TG Q92XZ1 Sinorhiiobtum nellloti (1) MEBTVAROT CFGD3NTHGa7PGRGPI 3R YRHEQRWGG P.dßjongeii HVM0Í532 (1) W TUZeGOSmiGm?liSim&EBmiGeBnmß RSH05666_Sr« (1) H KHrGDSLTWG?IíATGSG RHBLEDRWPS RSM02162_Sn (1) ^MVEKRSVI^^GDSLTWGWIPITKESSW-IRYP?EQROTG At-Q8URC0 <1) MKTVLAFGDSLTWGADEATGLR HPVEHRßPD At-Q8DFG4 (1) MVKSVLCK3DSLTHGSHAETGG RHSHDDMIPS . M1-RMLO00301 (1) Ü!^l3GTH^DBCTGEHliKI I?TODSiTWG?NB-;GGa HAI-BDBWPS S261_M2aA12 (1) MKNI-AFGDS TWGFVAGQDA RHPFETRtfPH M091_H4aBH (1) MKTILA?GDS TYGRNPIEGG-PR— —H?XEDRWPT consenso U) MKGVLCITGDS TOGY P G RHA B RWP 51 100 ACT MSMEG (37) ?ajI?ADFjWIE—EGI-HMrpjKIDDPDD IU^ BtíYlPSaAtílP Q98MY5 Mesorhl.obiura loti (31) VXQASWGGVOV-?--DGI?GRTIAFDDHlAGñDRNGñRLLPTALTTHñP Snal993 Sinox izobiup neliloti (50) AHñARI?KYHIIE--EGI?MI7SLDr)PNnARL-NGSTYll?HAIASHLP Q92XZ1 Sinoxbizobitta meliloti (39) VMGI_.GPIWO ?CB--KGLSGRTTVHDDPIEGS BMGRIXI-SPCLQSHAP P.dejongeii RVM04532 (37) VUIKA GAGFRVIE--EGQNGRTIVRADPUJICR-KGKD?I,PACIJ3SHKP RSM05666_Sm (32) VLQKALGSDAKVlA--EGLtK^TTAYDDpiADCDRNGARVI,PTVI-pHAP RSM02162_S?a (39) AMñWU,GDGYHIIE--EGI^^TTS DDPNDlAR -HGST?I,P«ñlA?RLP At-Q8ÜAC0 (32) VUMIAGKAKVHP--EGLGGRTTCYDDHAGPACRNGARALCTAWCHMP At-Q8UFG4 (33) VLQKAMSDVirVI-taEstGGRTTA«)DHTG?XDRK(ll?RIJ,PTLLHSHAP M1-RMLO00301 (45) Vl?ASLGGGV rV-A--DG?GRTTAFODHI?GADRNGARl.LPTAt,TTHfiP S261_M2aA12 (32) AIAAGLGGKARVI?--EGQMGRTTVPDQAATE?SRHGSVALPU.LISHQP M091_M4aEíll (33) A?QGI£GK7»?VIA--EGI?GRTTVHDIMPANftDRNG»RV PTLLESHSP consenso (51) VL A LGG VIE EGL GRTAHDD A R GAR LPT L SHAP 101 150 Q98M?5 Mesorhizobius loti (79) IDLIVIMI?-AlíDMKPWIHGHPVAl«--g5IQRLIDI^ Smal993 Sinor i-obium mellloti (97) LDLVIIlO .TKDT S?FHRTPYEIA--NGMGKLVGaVLTCAsGVGTPYPA Q92XZ1 Sinorhizobiura neliloti (87) LDLIlnUiGTHDLKRRF PPSEVA--MGIGCLV?DrREr.SFGRTGH P.dejongßii RVM04532 (84) LDLVIIMLGTHDI-«STFWPPGEIA--AGñrJVLGRMIl-^DAGPENR-PP RSM05666_Sm (80) IJ3LWElftG?fpj1«PIIHGTAFGAV--KGIERLVNLVRMDHPTEIEEG- RSM02162_Sm (86) LDLVJIMLGraDTOSY HRtErEIA--NGMG LVGQVLTCAGGVGrPYPA At-QßOACO (80) LDLVIBO?TNDIKFVHGGRAEMV3--GMRRIAQIVETFI?KPREAVP- At-QBOFG* (83) 0 iM-?3THDMKFMHG-S-?IAFTMKG LV?^^ . M1-RMLO00301 (93) ?DLIVIM-?ANDMKPWIHGNPVSAK--QGIQRLIDIVRGHDYPFIJSPAP- S261_M2aA12 (80) LDLVIIMIjGTNDIKFAARCRAFDAS--MGMEr?LIQIVRSANYMKG?KIP- M091_H4aEll (81) I.DLIV1MLGTHDIKPHHGRTAGEAG--RGMARLVQIIRGH?AGRH2DEE- consenso (101) LDLVIIMLGTNDMKP H P EAA GH RLV IVR YG P 151 200 ACT MSMEG (132) PKVL SPPPIAPMPHEB?OLIFE-- 5GEQK0OELARVYSALASEMKVPF Q98KY5 Hesochizobium loti (126) -QILIVSPPVVSRTE!«?FREMKVG--<»EASKQ--«Q?AAI-M5EVGCGF Smal993 Sinorhizobiisn, aßlilotl (145) PKVLVVAPPP APMPDPHFEGMFG--GGYEKSKELSGLYKñIADEWKVEF Q92XZ1 Sinorhizobiun ßßlilotl (132) DPEIMIVAPPEMI-SDIJ-?lreSira—r?QEKSR LALEE?IMADSLeAHF P.dejongeii RVH04532 (131) QLLlMCPE1 VRDLSAMPDUjAKIP--HGAñRSAEPPRHYKAQAVALKCEY RSM05666J5» (127) PEILIVSPPPUXTANSAFA?FAG--GVEÍ!SAMIAPLYRDIADELDCGF RSH02162_Sm (134) PKVLVVAPPP¡^APMPDPNFEK-Mii--H3GYEKSKEI GLYraU^ At-Q8DAC0 (127) -KLLIVAPPPCVAGPGGEPAGGRD IEQ3HRLAPL?RKLSAELGHHF At-Q8UFG4 (133) -DVLIVAPPQLC£TANPFMG?I?T!U-AIDESAHIA£rV M1-HHO00301 (140) -QILIVSPPVVSRTBHADFRBMEAG--GDEASKQIJ-PQYAALAOEVGCGF S261_H2aA12 (127) -EILIISPPSLVPTQDÉHiT?fDLKG--aA-AeSKLE3Uffl?KRVAE~!-r?iWHF M091_H4aEll (128) -QXILVSPPPtILGOTADMMDHPGPHEAIATSVDFARE?KKRADEQKVHF consenso (151) ILIVSPPPL T DF AMFG G E SK LA. YKALADELK F 201 241 ACT MSMEG (180) FI-?G-nrtSÜWSVDGIHFOE-RmriOU-VALAEO?IRSL-i (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 662) Q98MY5 Mesorhizobium loti (173) Fl?GTVAQTTP?CTHLDAElOTROTGÍOALTSVVRVMIiE — (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 663) Smal993 Sinorhizobium aßliloti (1931 EAAGMISTMIiWIHLSAETHIRLGHAIADKVAALF — — (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 664) Q92XZ1 Slnorhlzobium meliloti (180) FnAGTVCQCSPADGFHIDEnAHRIJ-GEAI^EVIAIGHPIlA(SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN HÚMERO 665) P.dejongeii RVM04532 (179) ENSQElVETSPVDGIHI£ASEl?ja?-3--AEKVKVLLG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 66¡S) RSM0S6€6_Sm (175) FW8S ^TTPIW3VHLDAEHTRAVGRGLE?? RMMLGL-- (SECUENC1A DE IDENTIFlcAC,?N NUHER0667) RSM02162_Sm (182) EAAGMISTDGIIM3IHLS?ETHIRU5HA?ADKVAALF (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 668) At-Q8OAC0 (172) FDAGSVASASPVDGVHIJDASATAAIGR?IAAPVRDILG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 669) At-Q80FG4 (182) FQAGS?ÍARTTFVDGTOLBAEHTRAIGRGLEPVVRMMLIG — (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 670) H1-BMLO00301 (187) FDAIjTTVAQTTPLDGVHLDAEOTRHIGKALTSVVRVML- (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 671) S261_M2aA12 (174) ETlAGTVAVADKTDGGHLnAVíroKAis\raLVPVVKSIlA — (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 672) M091_M4aEll (177) FDAGTVATTSKA!WIHLDPANT AIGMLVPLVKO fT.G — (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 673) consenso (201) FDAGTVA TSPVDGIHLriAEHTR IG ALA WR LLG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN ÚMERO 674) Se proporciona a continuación un árbol guía (es decir, una aproximación a un árbol filogenético) de la alineación CLUSTALW de clones activos/secuencias.
En base en los resultados, se encuentra que los clones activos tienen una identidad total con la perhidrolasa de M. smegmatis de 38.7-58.3%. Se encuentra que AAK53448 de Moraxella bovis es una excepción y que la secuencia de aminoácidos (traducida) es cuestionable.
Redundancia De los análisis anteriores, es evidente que existe cierta redundancia en la alineación proporcionada al inicio de este ejemplo que tendrá una ponderación indebida sobre la secuencia de consenso. Además, se agregan secuencias adicionales ~ GDSL-GRTT. Por lo tanto, en la alineación revisada en lo siguiente, se realizan los siguientes cambios: Retirados : Aislado natural 14B Aislado natural 2D RSM02162_Sm Q98MY5 Mesorhizobium loti Agregados : BAB16197 (Arh II) BAB16192 (Arh I) NP 00197751 (Mío II) NP 00216894 (Bce) NP 522806 (Rso) Alineación no redundante: 1 50 2OA (i) -LPSGILCTODSLT GWIPVEBGVPTERFP-RDVSWGG 9B Aislado natural (i) -GGRCVASCEVGAVAKRIIXÍ?DSLT GWIPVEEGVPTCRFP-KKTOHTG M. parafortuitUtt COI (1) — ^MAIO?IWFGDSLTWGWIPVEEGVPTERFP-RDVRHTG MSAT (1) ' HAKRIKFGDSr.TWG»VPVEDG!lP3'ERH---PsVRHTG Sm-RSM05666 (1) MKTVLC?GDSLTWGYnATG SGRHAEDRWPS At-Q8OAC0 (1) MKTVLAFGDSLTWGADPAT GLRHPVEHRWPD At-Q8tTFS4 (1) MvX-rVWSGDSI?WßSNAET GGRHSHDDWPS M091_H4aEll (1) MKTILAYGDSKYGANPIE GGPRHAYEDRNPT M1-RMLO00301 (1) MAGGIR DECOsERMKTVl^XGDSLTW-afHAB GGRHALEDRHPS P.dßjongßii RVW04532 (1) HKTII?R-8NTWGYDPAS!-TAPFPRRHGPBVR»TG Q92XZ1 Sinorhizobium mßliloti (1) MEETVSRTVXCFGKHTKGQVTG--RGPI.DRYR-REQRHGG S261_M2aA12 (1) MK^IAPGDSI/GHGFVAG QDARHPFETRHPM Smal993 Sinorhizobivm meliloti *1) MTIKSKSHRTLMVE RSVXCFGI)eL-1íGWin«BSSPTLRyP-?EQS»rG ÍP_00197751 <1) ^HOTILC?GD3 WGY11AVG PSRHAYEDRKPS ZP_00216984 (1) KTMTQKTVI?YGDSOTHGTRPWrHAGGr?REA-REBROT BAB16192 (1) MICHKGGEE-FSVLCYGIIS ?HGQIPG— GSPLDRYG-PNERHPG BAB16197 ( 1 ) ^MAESRSILCFGDSI.CTGHIi?VPESSPTLRYP-FEQRHTG HP_522806 ( l ) MQQ.IL YSDS SKGIIPG TRRR PFAARWAG consenso (1) MKTItCFGDSIiTHGHIPV P RR E Rtf G SI 100 20A {37} V ADLLGDRYEVIE EGLSARTtrAODPADPR H-GSQpPSCIASKL 9B Aislado natural .(49) V ADE GAG?EWE EGLSARTGGADDPTDPR N-GSDY PACIASH M. parafortuitum COI (37) V1-^ LGDRYEVIE---EGLSMTTTAEDPADPRI_H-GSQYLPSCIASHL MSAT (37) VLAQQ GADFEVIE EGL9ARTTH?DDPTDPRLN-GASYLPSC1ATHL Sra-RSH05666 (32) VLQ ft GSDAHVXA EGI?GRTTñYDDHLADCDRNGARVLPTVWÍTHA At-Q8UAC0 (32) V EAE AGKAKVHP EG GGRTTCYDDHAGPACOTGARA EVALSCHM At-Q8UFG4 (33) VIÍKAJßSDVWIFt-HEGLGGRTTAYDDl?GIlCDRNGARL PTLI.HSHA M091_M4aEll (33) A EQGLGGKARVXA EGLGGRTTVHDDHiTANADRNGARV PTL ESHS M1-RMLO003O1 (45) VLQASLGGGVQVTA DGLNGRTTAFDDHLAGADRNGAR 1PTALTTHA P.dejongßii RVM04532 (37) VXAKA GAGFRVIE EGQNGRTTVl-E-DPIWICRK-Gf?Y PACXBSHK Q92XZ1 Sinorhizobiua neliloti (39) VLOGLGPNWQVTE EGSGRTrVHDDPIEGST-KNGRIY RPCLQSHA S261_M2aA12 (32) A AAGLGG ARVIE EGQHGRTTVF0GAATFE3RNGSVA1.PI- .ISHQ Snal993 Sinorhizobiun mßliloti (50) AHAAR GDGYHIIE EGI^ARTTSLDDPNIJAR H-GSTYLPMA ASHL ZP_00197751 (32) VLQGR GSSARVTA EGCGRTTAFDDHVñGADRNGARrLPTIiLATH3 ZP_002169B4 (40) V AQTLGAS RVTE EGLPAKTTVH0DPIEGRB KGUYI-3ACVESH BAB16192 (43) V RRELGSQWYVIE EGLSGRTTVRDDPIEGIMKNGRTY RPCI-HSHA BAB16197 (39) AMAAALGDGYSIIE EGLSARTTSVEDPNDPR H-GSAYLFKñ ASHI. NP_S22806 (32) VMEHAI^QGHAVRrTODCI_^GRTTVI_DDPñREGRN-GWGLñQRIEAHA consenso ( 51) V A GA Y VIE EGL GRTT DDP D RNGA Y P L SH 101 150 20A ( 83 ) PLDLVIIMMIlIWKANFGRTPFD---?TGMGVIAT?yLTSAGG-VGTSY 9B Aislado natural ( 95 ) P D Vi?W5TmpKAN HRTPVD----ASGMGV?TCVl"TSAGG-VGTSY tí. parafortuitum COI ( 83 ) PLDLVIUILGTNDTKANFGRTPFD--IATGMGVIATQVLTSAGG-VGTSY HSAT (83) PLD VIIMI -TNDTKAYFÍWTPLD---M -MSVLVTQVI.TSAGG-VGTTY S?-RSM05666 (79) PLD GV?HKSKDMKPIIHGTAFG--AVKGIERLV VRRHDWPT--ETB At-Q8UAC0 (79) PLDLVIIMLGTMDIK??VHGGRAEA--AVSGMRRLAQIVB,??FIYK PBE At-Q80FG4 (82) PL»?VIIMI ?TNI»KPAIHGSAIVAETMKGV?R VKLTRKHV QV--SDW M091_M4aBll (80) P DLIVITK¿5TITOIKPHHGRTAGE--AGRGMAR VQIIRGHYAG RMQ M1-RMI?003Q1 (92) PID WLMIV35?«»OCPKIHGNPVA--AKQGIQRLIDIVRGHDYP FDH P.dßjongeU KVH04532 (83) PLDLVllHL<pOTI?STFNTOl?SE--IAAGAGVIÍl flIAG-A GPBH Q92XZ1 Sinorhizobium aßliloti (86) PLDI?IIHLGTlTDIJ RRFHMPPSE---W GIGC VHDIReLSE GRTG SZ6._K2.A22 (79) PlDm»p«T¡ro-2CFAftí?CTAFn--AS KGY Smal993 Sinorhizobiura mßliloti (96) P DLVIlKICTTOnKSY HRTP?E--j GMG3aVGÜV I-RG<3-Vt3TPY ZP_00197751 (79) PI*r.VT«MLGINM-KSFVCGRAIG~AKDjalERj^QI FNY ZP_00216984 !87) PTOVVVU-LGT¡rol-Wr<FeOTPAD-- tATSVGVL^^ SPSQ BAB16192 (90) l?i.Vin£ J3TODIJffi?X^Pl?SE--VSMGIGCLWBIRBLRP GPGG BAB16197 (85) P DLVH LGTHOTKS?FRRTP?E— U-SGMSKLAGO?rWSAGG-IGTPY NP_522806 (81) PI^^VIU«?TOD QMFRHTAQ? ~W^GVAQ VBAIR(jAPXEP GM consenso (101) PLD-.VlIHLGrNDtKA E t( D li GKGR V VR. G ' G Y 151 200 20A (130) PAPQjV IVAPPPLGH.PHFHFD-^VFSGGREKrAEU^^ 9B Aislado natural (142) PAPf/IJVAPPPLAtMPHEHFEI — VFDGGREKIAQIA^ H. parafortuitum COI (130) PAPO?TLIVAPPPU^PHEim> --VFSGGRpKTAEIA^^ MSA? (130) PA KVLWSPPPLAPMPHPH?QL--IFEG5EQKTIEI?KV?SñLASFHKV- Sm-RSM05666 (125) EGPEII.IVEPPPXEIANSAFABMF -S3ViOSíMIAP--L?RDI?Ml^ At-QBDACO (124) AVPK1?IVAPPPCVAGP— G<KPAdGRDIEQS1ffiLAP--LYR ?AE GH At-Q80FG4 (130) H091_M4aGll (125) DEPQIIWSPPEIIIßßRS»ÜFHrePHiA-AT?VDFARE?KKRMlEQKV MI-BHLO00301 (137) PAPQ?LrVSPPVVSRTEHMFREMEAGGDEAaKQLAP--QYAM?DeVGC P.-tojongeli RVM0 532 (128) REPQI?UÍCPSKTOIJ SAMPDI,MKIPHGAAR-SAEFPRHYiaM»V¡VLKC Q92X21 Slnßrhizobiuia Bßliloti (131) NDPEIMIViVPPEHLED EWES IFSGAQEKSRKLA ?PEIHñl S EA S261_H2aA12 (124) Kl PEILIISPPSLVPTQDEHFNDLKat_MaES LFAK--K?KRV?ffiELKV 5 al993 Sinorhizobi? melilotl (143) PA KVLVVAPPPLMMPDP FEa--HF».J3YEKSKELSGl?KALMIEl-W ZP_00197751 (124) K BSIlhV?Bee ?iemDF?EieEGStl?SSQKIJi -- YM ?QQTGC ZP J0216984 (132) ASP LVLMAPAPIVEVGFLGEI FAGGAAK-SRQLAIO??EaVASIjAGA BAB16192 (135) KPPElMWAPPPMtDDIKEWSP IFSG?QE SRRI? EEElIñDS EV BAB16197 (132) EAPCT,LIV3PP L?jOtfDPH-EB--M??13<»j?BraK ATO NP_522806 (126) PVPPV IWPPAITAPAGSHftDK EW?QBKCAlHAC«KraA5a?TlGC consenso (151) AP ILGVAPPP e VF IFGGA KS LA YKMA V 201 248 20A (178) PFFnAGSVXSTDGVDG?HFTRGETI — - 9B Aislado natural (190) PFFDAGEVISTDGVDGTHFTRGETIDR H. parafortuitua COI (178) PPFDRESVISTDGVDGIHPTRGEQS HSAT (178) PFBTlBGSVISTDGVTCIH.T-ajiWRDI^-VALREOVRSIi)- ?m-RSM0566S (173) GFFaSGOTARTTPID-nratnABOTRAVGRGia?PVVRHHICI. At-QßOACO (170) HFFMGSVASAStVDI-VHLnASATAMGRAIAAPVRDI G At-Qßpro4 (1B0) GPFnAGSVARTIPTOGVHlWffiOTRAIGRGLEPVVRí-ÍLGI. MD91_M4aEll (175) BFFMGTVATTSKft8IHI?PAOTRAIGAG VPliVKQVj-GL M1-RML000301 (185) GF-T«GT«AO^PLDGiVHt-A-jOTRHIG?aa,TSVVRVMI? P.dejongeii RVM04582 (177) EYF8SQEDreTSPVTX5IHIí-\SEHLKLGEA ?a3KVKVLLG Q92XZ1 Sinorhizobium melilotl (178) HFF-lAGTVC0ÍSPADGFHIDEDAHRtW3E-ttAQi!V AIGWPnA S261_M2aA12 (172) BFFDAGIVAVADiríTDGGHU AVOTWUGVALVPVVKSIIAL 5nal993 Sinorhizobium melilotl (191) EFFA!i)-8rSIDGIWIHl,SAETNIRLGHAIAD!(VAM?F ZP 00197751 (172) AETOAGr«ARTTPtK.IHLDftlOJTRAIGAGIBPVVROAlGl 2P_00216984 (178) HF DAGAIVBVSFVDGVHlOiADQHSV GQHVAA LQQIA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 689) BAB16192 (182) HFPDi^SVMCDPCDGFHlNREAHJSaliGTJUAR?W?-W — (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 690) E?B16197 (180) DFLB^EFVraDGCDGXHFSRETNITt?HA^^ (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 691) NP_522806 (173) HVFBBNSVTP?RTOGIH DADQHA^^ (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 692) consenso (201) FEDAGSV TSPVTCimilAEireR 1G «A VR II, (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 693) El árbol gula para la alineación CLUSTALW (el cual se aproxima a un árbol filogenético) indica claramente 3 agrupamientos ; 1) Grupo GDSL-ARTT que incluye Act 2) Grupo GDSL-GRTT constituido de miembros de Rhizobiales y el metagenoma; y 3) Grupo intermediario de motivos mixtos. También se contempla que los resultados sugieren alguna forma de duplicación de genes y eventos de mutación en Rhizobiales y en la transferencia de gen lateral a My coba cteri Um Utilizando una alineación no redundante se construye un consenso Act nuevo denominado "Act quimera" 1 KTILCFGDS TWGWIPVEDG .APTERRAPEV R TGV AQQL GADYEVIEEG 51 LSGRTTNIDD PTDPRLRNGA SYLPSCLASH P D VIIML GTNDLKAYFR 101 RTPLDIALGM GR VTQVRTS AGGVGTTYPA PKILIVAPPP AEMPHPWFQ 151 IFGGAEQKS TELARVYKAL ASFLKVPFFD AGSVISTSPV DGIHLDAENT 201 RDLGVALAEQ VRSIL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 694) Una alineación de Act-quimera con Ms Act (alineación quimera) indica 91.6% de similitud y 86.0% de identidad, como se indica en lo siguiente. 1 50 MSAT (1) MAKR1 CFGDS T GWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGV AQQLGADE?VIB Act-quimera (1) --KTILCFGDSLT GWIPVEDGAPTERRAPEVRWTGV AQQ GADYEVIE consenso (D K ILCFGDS T G IPVEDGAPTER APDVRWTGVLAQQGADFEVIE 51 100 MSAT (51) EGLSARTTNIDDPTDPR N-GASYLPSC ATHLPLD VIIMIíGTNDTKAY Act-quimera (49) EG SGRTTNIDDPTDPRLIUJGASYLPSCLASHLP D VIIMLGTNDLKAY consenso (51) EGLSARTTNIDDPTDPR GASYLPSCLASHLPLD VIIM GTND KAY 101 150 MSAT (100) FRRTPLDIAIiGMSV VTQVLTSAGGVGTTYPAPKV VVSPPPI-APMPHPW Act-quimera (99) FRRTPLDIA GMGRLVTQVRTSAGGVGTTYPAPKILIVAPPPLAEMPHP consenso (10D FRRTP DIA GM LVTQV TSAGGVGTTYPAPK1 IVAPPPLA MPHPW 151 200 SAT (150) FQLIFEGGEQKTTE ARVYSALASGMKVPFFDAGSVISTDGVDGIHFTEA Act-quimera (149) FQ IFGGAEQKSTEIARVYKAIASFLKVPFFDAGSVISTSPVDGIHLr-?E consenso (151) FQLIF GAEQKSTE ARVY ALASFLKVPFFDAGSVIST VDG1H 201 217 MSAT (200) NNRDLGVALAEQVRSL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 695) Act-quimera (199) NTRDLGVAIAEQVRSI (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 696) consenso (201) N RD GVALAEQVRSIL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 697) Una búsqueda BLASTP con Act-quimera no revela ninguna secuencia adicional. Act-quimera es "forzado" sobre la secuencia Per a las posiciones en donde no existe consenso. No obstante, una secuencia de consenso "no forzada" básica no proporciona ninguna información adicional a partir de una búsqueda blastp del análisis de alineación. Por lo tanto, la comparación con los homólogos más distantes en la lista de "aciertos" blastp se considera más útil para definir los residuos/posiciones importantes en el espacio de secuencia Act. Este es un ejercicio útil, dado que estas secuencias no se utilizan en una alineación no redundante . Por ejemplo, se compara Rhodopirellula bál tica (NP_865748; pSP; un Planctomycetes y muy diferente de Mycobacterium o Rhizobiales) , como se muestra abajo. 1 50 MSAT (1) MAKRILCFGDSLTWG VPVEDGAPTERFAPDVRWTGV A QQLGADFE NP_8657 6 (1) -MHSI IYGDS SWGIIPGTR RRFAFHQRHPGVMEIELRQTGIDAR consenso (1) IL FGDSLS G IP RFA RW GVL Q G D 51 100 MSAT (48) VIEEGLSARTTNIDDPTDPPiNGASYLPSCIATHLPLDLVIIMLGTNDTK NP_865746 (46) VIEDCLNGRRTVLEDPIKPGRNGLDGLQQRIEINSP SLWLFLGTNDFQ consenso (51) VIED L AR T IDDP P NG L I PL LVII LGTND 101 150 MSAT (98) AYFRRTPLDIALGMSVLVTQVI.TSAGGVGTTYPAPKVLWSPPPLAPMPH NP_8657 6 (96) SVHEFHAEQSAQGLALLV—DAIRRSPFEPGMPTPKILLVAPPTVHH-PK consenso (101) A A GLALLV P PKILLVAPF L P 151 200 MSAT (148) PWFQLIFEGGEQKTTEI?B.VYS2U.ASFMKVPFFDAGSVISTDGVDGIHFT NP_865746 {143) LDMAAKFQNAETKSTGLADAIRKVSTEHSCEFFDAATVTTTSVVDGVHLD consenso (151} F . AE KST LA LAS FFDAASV ST VDGIH 201 222 MSAT (198 ) EANNRDLGVALAEQVRSL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 695) NP_865746 (193) QEQHQALGTALASTIAEILADC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 697) consenso (201) N LG ALA I IL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 698) Lo siguiente es una alineación con Ralstonia eutropha (Reu) : 1 50 MSAT ( 1 ) MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLA-- ZP_00166901 ( 1 ) MPLTAPSEVDPLQILVYADSLS GIVPGTR RRLPFPVRWPGRLELG consenso (1) I FADSLS G VP R VR G L 51 100 MSAT (40) --QQLGADFEVIEEGLSARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLV ZP_00166901 ( 47 ) LNADGGAPVRIIEDCLNGRRTVWDDPFKPGRNGLQGLAQRIEIHSPVALV consenso (51) GA IIED L AR T DDP P NG L I H PL LV . 101 150 MSAT ( 88 ) IIMLGTNDT AYFRRTPLDIALGMSVLVTQVLTSAGGVGTTYPAPKVLW ZP_00166901 ( 97 ) VLMLGNNDFQSMHPHNAWHAAQGVGAL — HAIRTAPIEPGMPVPPILW consenso (101) IIMLG ND A A GM LV I P P ILW 151 200 MSAT (138 ) SPPPIJAPMPHP FQLIFEGGEQKTTEIARVYSÁLASFMKVPFFDAGSVIS ZP_00166901 (145) VPPPIRT-PCGPLAPKFAGGEHKWAGLPEñLRELCATVDCSLFDAGTVIQ consenso (151) PPPI P F GGE K L L A M FDAGSVI 201 237 MSAT ( 188 ) TDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 695) ZP_00166901 (194 ) SSAVDGVHLDADAHVALGDALQPWRALLAESSGHPS (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 699) consenso (201) S AVDGIH LG AL VRALL (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 700) En base en estos resultados se realizan las siguientes conclusiones. Una búsqueda de nr-base de datos BLASTp con una secuencia de consenso de perhidrolasa presenta lipasas/esterasas GDSL o GDSI de una amplia diversidad de organismos. No obstante, solo 12 ó 14 de estos son homólogos confiables de Per. Casi la totalidad de estos se derivan de un grupo pequeño de bacterias, específicamente de Rhizobiales (es decir, una bacteria gramnegativa del suelo que pertenece a las ce- Proteobacteria) . Se encontraron algunas cantidades de ß- Proteobacteria, pero no del género Mycobacterium. Esto proporciona una indicación de que el gen/proteína para perhidrolasas (Per) no está distribuido ampliamente en la naturaleza.
La proteina de Mycobacterium está caracterizada por el motivo GDSL-ARTT, mientras que la mayor parte de Rhizobiales está caracterizada por un motivo GDSL-GRTT. Existe también cierto mezclado de motivos de intermediario (por ejemplo GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT) . Esto puede indicar duplicación de genes y un evento de mutación en una transferencia de gen lateral. Los residuos de consenso identificados en estos experimentos son L6, 14 , R27, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, GllO, L114, L135, P180 y G205. Utilizando la alineación no redundante y la comparación con homólogos distantes, se pueden definir los siguientes espacios de secuencia en la posición 5 de la perhidrolasa de M. smegmatis y que terminan en la posición 195, con la perhidrolasa mostrada en los residuos en negrillas .
{T, VM , Y][G, S][ft][Sj[T,, N][T, S][W, Y, H][G][X] 2[P, A][X] ulTR, L][W] pq 7? ][x] 5[v, q[i, v, H]pq[E. D][G, qpL, QMG TOfflffltxj *[»> E]p>] pq 7[G][X] 3pL]pq 6[H]rxp, GH , I, V][D, A][V, rjpq 2|M, L][L][G][X]GN][?>] [X] 3d[P][X] 6[P][P, A]p | 31ÍA][X] 19tD][G][X][-rI] (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 701) En suma, es evidente del análisis anterior que los clones/secuencias activos con un motivo GDSxl-x2RTT-Gx3ND se han encontrado todos entre las bacterias .- Proteobacteria gramnegativas asociadas con Rhizosfera del suelo. Esto contrasta notablemente con el prototipo perhidrolasa de M. smegmatis-una. bacteria grampositiva con un elevado contenido GC asignado a la clase Actinobacteria . Esta división se ilustra en la figura 2 , la cual proporciona un árbol filogenético que muestra las ramas principales de las bacterias y el origen de los clones activos/secuencias en comparación con M. smegmatis.
EJEMPLO 14 Cálculo de peso molecular nativo de homólogos de la perhidrolasa En este ejemplo se describen experimentos realizados para calcular los pesos moleculares nativos de homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis. Preparación de muestras para purificación (determinación de tamaño) Se inocula una colonia única de las cepas deseadas en 50 ml de caldo Terrific y se incuba durante la noche a 37°C, con agitación a 200 rpm. Las células se sedimentan por centrifugación durante 10 min a 7000 rpm en una centrífuga Sorvall SuperSpeed. Los sedimentos se resuspenden después en 10 ml de Bis-Tris 25 mM (pH 6.5) y se lisan por pasaje a través de una celda de presión French dos veces . Los lisados después se centrifugan a 15,000 pm en una centrífuga Sorvall SuperSpeed y las fracciones solubles se utilizan para purificación adicional o ensayo. Columnas de determinación de tamaño Los sobrenadantes (preparados como se describe en lo anterior) se corren en una columna Sephadex 200 de determinación de tamaño en fosfato 20 mM (pH 8.0) con un caudal de 0.5 ml/min. Se calibra la columna antes de corrimiento de las muestras con los estándares MW (que se incluyen en lo siguiente) y proteína purificada de perhidrolasa de M. smegma tis . Los volúmenes de elusión de muestra cruda se determinan al recolectar fracciones de 0.5 ml y al analizar las fracciones para determinar actividad de pNB. Pesos moleculares y volúmenes de elusión de los estándares : Tiroglobulina, MW 669 kDa: volumen de elusión, 16 ml Aldolasa, MW 158 kDa: volumen de elusión, 24 ml, Ovalbumina MW 43 Kda: volumen de elusión 26 ml, Ribonucleasa MW 14 kDa; volumen de elusión 32 ml Perhidrolasa, volumen de elusión 24 ml Resultados La siguiente tabla (tabla 14-1) proporciona el volumen de elusión de algunos de los homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis identificados en la presente.
Los datos en la tabla anterior y los resultados de los ensayos obtenidos para estos homólogos indican que estas enzimas tienen una secuencia de aminoácidos similar a la de perhidrolasa de M. smegmatis . Al igual que con la perhidrolasa de M. smegmatis, estos homólogos presentan actividad de perhidrólisis como multímeros . Como se describe en la presente, la perhidrolasa es un octámero, mientras que los homólogos, aunque eluyen en un volumen similar, se contempla que sean dímeros, trímeros, tetrámeros, hexámeros y/u octámeros .
EJEMPLO 15 Estructura cristalina de la perhidrolasa En este ejemplo se describe el análisis cristalográfico de la perhidrolasa. Se obtienen cristales de ,5 perhidrolasa bajo dos condiciones: [NH 2S04 2.0M, PEG400 2%, Tris 0.1 M, pH 7.1 (lo que proporciona cristales Pl triclínicos) y fosfato diácido de amonio y citrato de sodio 0.1, pH 5.6 (lo que proporciona cristales P4 tetragonales) . Ambas formas de cristales proporcionan una difracción 0 adecuada que sobrepasa la resolución de 2.0Á. La proteína derivada de la determinación en fase MAD utilizando selenio que sustituye a azufre que contiene metionina resulta en una molécula de proteína que tiene cuatro selenometioninas, la metionina N terminal se separa proteolíticamente . De las dos 5 formas, la triclínica Pl a = 83.77Á b = 90.07Á c = 112.115Á = 73.32° ß = 73.30°, ? = 88.07° y PA a = b = 98.18Á c = 230.12 A el cristal P4 proporcionan datos que es posible utilizar para determinación de estructura. Se recolectan tres conjuntos de datos MAD de longitud de onda a las longitudes 0 de onda que corresponden al borde de absorción de Se, cerca del punto de inflexión y un tercero, alejado del borde de absorción. Se recolectan 333 marcos (oscilaciones de 0.3 grados por marco) para cada longitud de onda con un tiempo de 5 exposición de 1 seg, a partir de un cristal P4 de grupo de espacio tetragonal único. La estructura se puede resolver con los programas de computadora SOLVE o SHELX lo que proporciona soluciones similares para los 32 posibles posiciones de Se. El mapa se ajusta utilizando el programa "O". Es posible trazar densidad de electrones para los residuos 3-216 en cada una de las ocho moléculas independientes . La estructura final de estas ocho moléculas se refina utilizando CNS. El factor R cristalográfico actual es 21%. Las coordenadas se proporcionan a continuación: CRYST1 98. 184 98. 184 230.: L19 90.00 90,00 90.00 SCALE1 0.010185 0.000000 0.000000 0.000000 • SCALE2 0.000000 0.010185 .0.000000 0.000000 SCALE3 0.000000 0.000000- 0.004346 0.000000 ATOM 1 CB LYS 3 •_ -8.167 -61.964 18.588 1.000 40.95 ATOM 2 CG LYS 3 - . -8.685 -63.192 19.323 1.000 22-95 ATOM 3 CD LYS 3 -8.635 -64.400 18.399 1.000 14.97 ATOM 4 CE LYS 3 -7.963 -65.575 19.090 1.000 19.83 ATOM 5 HZ LYS 3 -7.359 -66.511 18.099 1.000 44.28 ATOM . 6 C LYS 3 -9.684 -^60.377 17.426 1.000 13.89 ATOM 7 0 LYS 3 -9.087 -59.356 17.767 1.000 12.50 ATOM 8 N LYS 3 -8.000 -61.626 16.153 1.000 15.57 ATOM 9 CA LYS 3 -8.919 -61.686 17.284 1.000 20.71 ATOM 10 N ARG 4 -10.987 -60.381 17.166 1.000 24.56 ATOM 11 CA ARG 4 -11.695 -59.097 17.204 1.000 22.65 ATOM 12 CB ARG 4 -12.299 -58.822 15.822 1.000 21.44 ATOM .13 CG ARG 4 -11.232 -58.465 14.792 1.000 21.56 ATOM 14 CD ARG 4 -11.845 -58.181 13.431 1.000 29.29 ATOM 15 NE ARG 4 -11.660 -56.790 13.020 1.000 32.87 ATOM 16 CZ ARG 4 -12.643 -56.013 12.585 1.000 30.24 ATOM 17 NH1 ARG 4 -13.879 -56.487 12.494 1.000 17.82 ATOM 18 NH2 ARG 4 -12.399 -54.760 12.229 1.000 44.53 ATOM 19 C ARG 4 -12.735 -59.054 18.308 1.000 14.59 ATOM 20 0 ARG 4 -13.604 -59.909 18.456 1.000 18.72 ATOM 21 N ILE 5 -12.639 -58.012 19.131 1.000 13.45 ATOM 22 CA IL? 5 -13.549 -57.882 20.263 1.000 12.08 ATOM 23 CB ILE 5 -12.747 -57.835 21.578 1.000 15.40 ATOM 24 CG2 ILE 5 --13.678 -57.677 22.765 1.000 5.80 ATOM 25 CG1 ILE 5 -11.811 -59.034 21.741 1.000 11.66 ATOM 26 CD1 ILE 5 -10.437 -58.632 22.232 1.000 19.35 ATOM 27 C ILE 5 -14.420 -56.640 20.142 1.000 8.96 ATOM 28 0 IL? 5 -13.905 -55.529 20.021 1.000 13.31 ATOM 29 N LEU 6 -15.736 -56.833 20.169 1.000 13.04 ATOM 30 CA LEO 6 -16.675 -55.728 20.059 1.000 8.54 ATOM 31 CB LEU 6 -17.879 -56.087 19.178 1.000 7.42 ATOM 32 CG LEU 6 -18.959 -54.996 19.120 1.000 14.12 ATOM 33 CD1 LED 6 -18.446 -53.783 18.359 1.000 12.19 ATOM 34 CD2 LEO 6 -20.245 -55.512 18.494 1.000 27.94 ATOM 3 355 C LEO 6 -17.170 -55.293 21.436 1.000 2.72 ATOM 3 366 0 LEU 6 -17.719 -56.101 22.179 1.000 13.36 ATOM 3 377 N CYS 7 -16.978 -54.020 21.756 1.000 1.38 ATOM 38 CA CYS 7 -17.472 -53.469 23.011 1.000 3.17 ATOM 39 CB CYS 7 -16.411 -52.582 23.667 1.000 7. 01 ATOM 40 SG CYS 7 -14.867 -53.471 23.992 1.000 11.21 ATOM 4411 C CCYYSS 7 -18.755 -52.685 22.776 1.000 0.65 ATOM 4422 o CCYYSS 7 -18.756 -51.627 22.145 1.000 4.76 ATOM 4433 N P PHHEE 8 -19.859 -53.228 23.281 1.000 0.00 ATOM 44 CA PHE 8 -21.147 -52.568 23.053 1.000 1.14 ATOM 45 CB PHE 8 -22.115 -53.578 22.443 1.000 5.54 ATOM 46 CG PHE 8 -23.421 -53.000 21.937 1.000 3.36 ATOM 47 CD1 PH? 8 -23.456 -52.212 20.800 1.000 0.89 ATOM 48 CD2 PHE 8 -24.602 -53.262 22.614 1.000 1.39 ATOM 49 CE1 PH? 8 -24.644 -51.683 20.333 1.000 0.00 ATOM 50 CE2 PHE 8 -25.793 -52.733 22.148 1.000 4.42 ATOM" 5 511 CCZZ PHE 8 -25.818 -51.944 21.012 1.000 2.71 ATOM 5 522 CC PHE 8 -21.677 -51.978 24.346 1.000 .4.46 ATOM 5 533 o0 PHE 8 -21.873 -52.672 25.348 1.000 6.98 ATOM 5 544 NN GLY 9 -21.923 -50.666 24.384 1.000 5.61 ATOM 55 CA GLY 9 -22.396 -50.109 25.646 1.000 5.44 ATOM 5 566 C G GLLYY 9 -22.860 -48.673 25.522 1.000 5.66 ATOM 5577 o GGLLYY 9 -23.229 -48.222 24.440 1.000 14.54 ATOM 5588 N A ASSPP 10 -22.837 -47.964 26.641 000 3.89 ATOM 59 CA ASP 10 -23.322 -46.596 26.734 000 5.17 ATOM 60 CB ASP 10 -24.331 -46.467 27.880 000 2.99 ATOM 61 CG ASP 10 -23.807 -47.052 29.175 000 7.05 ATOM 62 0D1 ASP 10 -22.617 -46.829 29.494 000 17 93 ATOM 63 OD2 ASP 10 -24.564 -47.738 29.895 1.000 10. 9988 ATOM 6 644 C ASP 10 -22.154 -45.642 26.939 1.000 5. 1155 ATOM 6 655 o A ASSPP 10 -21.022 -45.940 26.556 1.000 5 5.. 6622 ATOM 66 N SSEERR 11 -22.423 -44.497 27.554 1.000 9 9.. 0022 ATOM 67 CA SER 11 -21.394 -43.493 27.802 1.000 3 3.. 4433 ATOM 6 688 CCBB SER 11 -22.014 -42.331 28.585 1.000 7.25 ATOM 69 OG SER 11 -22.640 -42.813 29.763 1.000 18.93 ATOM 70 C SER 11 -20.199 -44.046 28.561 1.000 7.58 ATOM 71 O SER 11 -19.089 -43.508 28.501 1.000 16.71 ATOM 72 N LEU 12 -20.393 -45.133 29.308 1.000 6.56 ATOM 73 CA LEO 12 -19.264 -45.696 30.046 1.000 16.41 ATOM 74 CB LEO 12 -19.711 -46.759 31.042 1.000 17.05 ATOM 75 CG LEU 12 -20.598 -46.336 32.210 1.000 18.22 ATOM 76 CD1 LEO 12 -20.866 -47.527 33.123 1.000 7.48 ATOM 77 CD2 LEO 12 -19.973 -45.184 32.988 1.000 10.83 ATOM 78 C LEO 12 -18.269 -46.285 29.048 1.000 14.99 ATOM 79 0 LEO 12 -17.065 -46.307 29.267 1.000 6.10 ATOM 80 N THR 13 -18.828 -46.764 27.940 1.000 14.77 ATOM 81 CA THR 13 -18.014 -47.347 26.876 1.000 8.83 ATOM 82 CB THR 13 -18.828 -48.381 26.080 1.000 6.87 ATOM 83 OG1 THR 13 -19.109 -49.487 26.949 1.000 10.08 ATOM 84 CG2 THR 13 -18.033 -48.940 24.914 1.000 16.85 ATOM 85 C THR 13 -17.490 -46.245 25.970 1.000 4.56 ATOM 86 0 THR 13 -16.315 -46.220 25.616 1.000 11.71 ATOM 87 N TRP 14 -18.376 -45.317 25.612 1.000 5.57 ATOM 88 CA . TRP 14 -17.992 -44.210 24.742 1.000 7.21 ATOM 89 CB ' TRP 14 -19.208 -43.329 24.453 1.000 6.90 ATOM 90 CG TRP 14 -18.917 -42.183 23.537 1.000 11.88 ATOM 91 CD2 TRP 14 -18.731 -40.813 23.924 1.000 13.72 ATOM 92 CE2 TRP 14 -18.483 -40.081 22.745 1.000 11.95 ATOM 93 CE3 TRP 14 -18.752 -40.147 25.152 1.000 10.63 ATOM 94 COI TRP 14 -18.779 -42.222 22.181 1.000 8.28 ATOM 95 NE1 TRP 14 -18.517 -40.963 21.694 1.000 7.16 ATOM 96 CZ2 TRP 14 -18.255' -38.705 22.763 1.000 5.39 ATOM 97 CZ3 TRP 14 -18.526 -38.783 25.168 1.000 12.55 ATOM 98 CH2 TRP 14 -18.282 -38.084 23.981 1.000 12.81 ATOM 99 C TRP 14 -16.880 -43.353 25.327 1.000 5.41 ATOM 100 0' TRP 14 -16.107 -42.745 24.582 1.000 4.90 ATOM 101 N GLY 15 -16.794 -43.283 26.652 1.000 8.94 ATOM 102 CA GLY 15 -15.794 -42.475 27.318 1.000 4.51 ATOM • 103 C GLY 15 -16.249 -41.098 27.755 1.000 10.98 ATOM 104 0 GLY 15 -15.480 -40.136 27.646 1.000 15.11 ATOM 105 N TRP 16 -17.471 -40.952 28.255 1.000 23.34 ATOM 106 CA TRP 16 -17.988 -39.691 28.792 1.000 15.10 ATOM 107 CB TRP 16 -19.408 -39.890 29.327 1.000 6.11 ATOM 108 CG TRP 16 -20.139 -38.694 29.846 1.000 1 1..7788 ATOM 109 CD2 TRP 16 -21.229 -38.008 29.213 1.000 88..9988 ATOM 110 CE2 TRP 16 -21.613 -36.942 30.051 1.000 77..7766 ATOM 111 CE3 TRP 16 -21.923 -38.186 28.009 1.000 15.66 ATOM 112 CD1 TRP 16 -19.927 -38.021 31.016 1.000 0.35 ATOM 113 NEl TRP 16 -20.798 -36.973 31.154 1.000 8 8..3355 ATOM 114 CZ2 TRP 16 -22.649 -36.063 29.734 1.000 55..1166 ATOM 115 CZ3 TRP 16 -22.952 -37.317 27.692 1.000 55..3344 ATOM 116 CH2 TRP 16 -23.306 -36.269 28.551 1.000 44..7722 ATOM 117 C TRP 16 -17.059 -39.154 29.881 1.000 77..8855 ATOM 118 0 TRP 16 -16.846 -39.815 30.899 1.000 33..9977 ATOM 119 N VAL 17 -16.533 -37.952 29.685 1.000 55..4455 ATOM 120 CA VAL 17 -15.750 -37.256 30.695 1.000 12.08 ATOM 121 CB VAL 17 -14.822 -36.191 30.082 1.000 17.55 ATOM 122 CG1 VAL 17 -14.084 -35.443 31.185 1.000 11.59 ATOM 123 CG2 VAL 17 -13.841 -36.807 29.099 1.000 7.77 ATOM 124 C VAL 17 -16.673 -36.565 31.696 1.000 13.86 ATOM 125 O VAL 17 -17.390 -35.618 31.351 1.000 1.02 ATOM 126 N PRO 18 -16.660 -37.034 32.936 1.000 8.38 ATOM 127 CD PRO 18 -15.770 -38.071 33.476 1.000 8.64 ATOM 128 CA PRO 18 -17.572 -36.501 33.948 1.000 9.99 ATOM 129 CB PRO 18 -17.201 -37.294 35.208 1.000 12.31 ATOM 130 CG PRO 18 -15.817 -37.789 34.954 1.000 7.46 ATOM 131 C PRO 18 -17.327 -35.017 34.191 1.000 13.05 ATOM 132 O PRO 18 -16.163 -34.619 34.306 1.000 18.63 ATOM 133 N VAL 19 -18.381 -34.211 34.266 1.000 6.92 ATOM 134 CA VAL 19 -18.214 -32.793 34.585 1.000 9.29 ATOM 135 CB VAL 19 -18.482 -31.856 33.388 1.000 5.33 ATOM 136 CG1 VAL 19 -17.377 -31.995 32.354 1.000 6.78 ATOM 137 CG2 VAL 19 -19.850 -32.150 32.796 1.000 3.72 ATOM 138 C VAL 19 -19.151 -32.380 35.710 1.000 12.02 ATOM 139 O VAL 19 -20.217 -32.962 35.913 1.000 14.52 ATOM 140 N GLU 20 -18.771 -31.351 36.467 1.000 17.17 ATOM 141 CA GLU 20 -19.662 -30.994 37.575 1.000 13.30 ATOM 142 CB GLO 20 -18.918 -30.130 38.595 1.000 25.34 ATOM 143 CG GLO 20 -18.276 -30.968 39.702 1.000 31.46 ATOM 144 CD GLO 20 -16.871 -30.487 40.017 1.000 35.91 ATOM 145 OE1 GLO 20 -16.143 -30.157 39.055 1.000 40.11 ATOM 146 OE2 GLU 20 -16.507 -30.431 41.210 1.000 45.47 ATOM 147 C GLÜ 20 -20.913 -30.294 37.080 1.000 7.56 ATOM 148 O GLÜ 20 -21.964 -30.361 37.723 1.000 11.30 ATOM 149 N ASP 21 -20.852 -29.610 35.936 1.000 19.38 ATOM- 150 CA ASP 21 -22.099 -28.983 35.471 1.000 23.47 ATOM 151 CB ASP 21 -21.815 -27.740 34.640 1.000 17.53 ATOM 152 CG ASP 21 -21.114 -27.991 33.326 1.000 14.93 ATOM 153 OD1 ASP 21 -20.984 -29.159 32.908 1.000 26.78 ATOM 154 OD2 ASP 21 -20.685 -26.996 32.694 1.000 8.74 ATOM 155 C ASP 21 -22.959 -29.988 34.707 1.000 19.54 ATOM 156 O ASP 21 -23.988 -29.627 34.131 1.000 22.49 ATOM 157 N GLY 22 -22.550 -31.250 34.697 1.000 13.19 ATOM 158 CA GLY 22 -23.279 -32.377 34.166 1.000 15.71 ATOM 159 C GLY 22 -23.507 -32.377 32.659 1.000 20.02 ATOM 160 O GLY 22 -23.370 -33.431 32.036 1.000 23.32 ATOM 161 N ALA 23 -23.846 -31.235 32.138 1.000 26.40 ATOM 162 CA ALA 23 -24.265 -30.672 30.873 1.000 28.79 ATOM 163 CB ALA 23 -24.483 -29.192 31.152 1.000 32.86 ATOM 164 C ALA 23 -23.309 -30.988 29.745 1.000 22.68 ATOM 165 O ALA 23 -22.922 -32.189 29.753 1.000 40.02 ATOM 166 N PRO 24 -22.847 -30.255 28.748 1.000 12.97 ATOM 167 CD PRO 24 -22.892 -28.855 28.309 1.000 15.92 ATOM 168 CA PRO 24 -22.051 -31.028 27.767 1.000 5.31 ATOM 169 CB PRO 24 -22.024 -30.134 26.5201.000 4.03 ATOM 170 CG PRO 24 -22.002 -28.762 27.105 1.000 6.80 ATOM 171 C PRO 24 -20.622 -31.273 28.222 1.000 14.45 ATOM 172 O PRO 24 -20.034 -30.591 29.056 1.000 19.65 ATOM 173 N THR 25 -20.062 -32.310 27.600 1.000 13.21 ATOM 174 CA THR 25 -18.685 -32.690 27.894 1.000 11.82 ATOM 175 CB THR 25 -18.691 -33.772 28.987 1.000 12.19 ATOM 176 OG1 THR 25 -17.348 -34.104 29.355 1.000 19.38 ATOM 177 CG2 THR 25 -19.372 -35.027 28.454 1.000 0.00 ATOM 178 C THR 25 -18.009 -33.160 26.620 1.000 14.10 ATOM 179 O THR 25 -18.555 -33.019 25.518 1.000 16.46 ATOM 180 N GLO 26 -16.818 -33.724 26.762 1.000 12.30 ATOM 181 CA GLU 26 -16.157 -34.314 25.598 1.000 13.24 ATOM 182 CB GLO 26 -14.909 -33.518 25.225 1.000 15.75 ATOM 183 CG GLO 26 -15.211 -32.066 24.873 1.000 25.45 ATOM 18 CD GLO 26 -15.451 -31.152 26.056 1.000 27.41 ATOM 185 OE1 GLO 26 -14. 687 -31.210 27.048 1.000 22.86 ATOM 186 OE2 GLU 26 -16.416 -30.347 26.012 1.000 17.32 ATOM 187 C GLO 26 -15.850 -35.775 25.891 1.000 8.80 ATOM - 188 O GLU 26 -16.279 -36.316 26.909 1.000 2.55 ATOM 189 N ARG 27 -15.121 -36.421 25.001 1.000 13.28 ATOM 190 CA ARG 27 -14.783 -37.838 25.124 1.000 12.71 ATOM 191 CB ARG 27 -14.857 -38.447 23.726 1.000 6.07 ATOM "192 CG ARG 27 -14.491 -39.908 23.585 1.000 4.38 ATOM 193 CD ARG 27 -14.879 -40.387 22.186 1.000 11.29 ATOM 194 NE ARG 27 -14.974 -41.840 22.110 1.000 13.10 ATOM 195 CZ ARG 27 -15.191 -42.517 20.992 1.000 9.74 ATOM 196 NH1 ARG 27 -15.337 -41.868 19.842 1.000 11.38 ATOM 197 NH2 ARG 27 -15.262 -43.839 21.029 1.000 0.00 ATOM 198 C ARG 27 -13.413 -38.031 25.746 1.000 8.79 ATOM 199 O ARG 27 -12.534 -37.181 25.579 1.000 17.59 ATOM 200 N PHE 28 -13.183 -39.133 26.461 1.000 12.29 ATOM 201 CA PH? 28 -11.826 -39.379 26.955 1.000 9.91 ATOM 202 CB PHE 28 -11.783 -40.575 27.900 1.000 10.13 ATOM 203 CG PHE 28 -12.084 -40.263 29.355 1.000 11.54 ATOM 204 CD1 PHE 28 -11.250 -39.431 30.084 1.000 8.88 ATOM 205 CD2 FHE 28 -13.194 -40.802 29.979 1.000 11.27 ATOM 206 CE1 PHE 28 -11.535 -39.156 31.408 1.000 8.90 ATOM 207 CE2 PHE 28 -13.486 -40.533 3 311.. .330055 1.000 5.41 ATOM 208 CZ PHE 28 -12.647 -39.703 3 322.. .002200 1.000 0.61 ATOM 209 C PH? 28 -10.901 -39.635 2 255.. .777700 1.000 11.56 ATOM 210 O PH? 28 -11.370 -40.112 24, .736 1.000 13.14 ATOM 211 N ALA 29 -9.612 -39.349 25, ,896 1.000 13.02 ATOM 212 CA ALA 29 -8.674 -39.656 24, .818 1.000 13.91 ATOM 213 CB ALA 29 -7.275 -39.163 25, .151 1.000 6.49 ATOM 214 C ALA 29 -8.662 -41.157 24. .545 1.000 15.68 ATOM 215 O ALA 29 -8.937 -41.954 25, .446 1.000 31.74 ATOM 216 N PRO 30 -8.345 -41.537 23.314 1.000 11.44 ATOM 217 CD PRO 30 -7.982 -40.660 22.192 1.000 12.10 ATOM 218 CA PRO 30 -8.326 -42.955 22.936 1.000 18.85 ATOM 219 CB PRO 30 -7 ,822 -42.956 21.494 1.000 16.38 ATOM 220 CG PRO 30 -7.283 -41.593 21.244 1.000 14.74 ATOM 221 C PRO 30 -7.386' -43.767 23.826 1.000 13.40 ATOM 222 0 PRO 30 -7.570 -44.969 23.979 1.000 8.18 ATOM 223 N ASP 31 -6.396 -43.115 24.412 1.000 22.50 ATOM 224 CA ASP 31 -5.426 -43.715 25.312 1.000 26.63 ATOM 225 CB ASP 31 -4.170 -42.841 25.398 1.000 30.41 ATOM 226 CG ASP 31 -3.792 -42.143 24.108 1.000 39.21 ATOM 227 OD1 ASP 31 -2.577 -42.086 23.802 1.000 39.00 ATOM 228 OD2 ASP 31 -4.673 -41.634 23.375 1.000 37.50 ATOM 229 C ASP 31 -5.985 -43.926 26.721 1.000 17.49 ATOM 230 0 ASP 31 -5.482 -44.784 27.450 1.000 25.27 ATOM 231 N VAL 32 -6.989 -43.150 27.092 1.000 14.45 ATOM 232 CA VAL 32 -7.592 -43.125 28.421 1.000 12.64 ATOM 233 CB VAL 32 -7.966 -41.683 28.814 1.000 10.68 ATOM 234 CG1 VAL 32 -8.580 -41.609 30.199 1.000 13.66 ATOM 235 CG2 VAL 32 -6.742 -40.774 28.752 1.000 20.51 ATOM 236 C VAL 32 -8.808 -44.042 28.507 1.000 9.73 ATOM 237 0 VAL 32 -8.890 -44.834 29.452 1.000 2.23 ATOM 238 N ARG 33 -9.722 -43.964 27.553 1.000 10.63 ATOM 239 CA ARG 33 -10.888 -44 .824 27.410 1.000 6.85 ATOM 240 CB ARG 33 -11.369 -44.833 25.961 1.000 16.41 ATOM 241 CG ARG 33 -12.281 -43.727 25.488 1.000 21.19 ATOM 242 CD ARG 33 -12.464 -43.806 23.974 1.000 26.66 ATOM 243 NE ARG 33 -11.862 -42.659 23.309 1.000 30.35 ATOM 244 CZ ARG 33 -11.493 -42.567 22.044 1.000 31.60 ATOM 245 NH1 ARG 33 -11.658 -43.585 21.214 1.000 34.85 ATOM 246 NH2 ARG 33 -10. 952 -41.433 21.610 1.000 52.70 ATOM 247 C ARG 33 -10.600 -46.279 27.775 1.000 9.71 ATOM 248 0 ARG 33 -9.603 -46.830 27.300 1.000 16.85 ATOM 249 N TRP 34 -11.450 -46.924 28.577 1.000 10.64 ATOM 250 CA TRP 34 -11.166 -48.311 28.952 1.000 6.46 ATOM 251 CB TRP 34 -12.149 -48.855 29.979 1.000 12.45 ATOM 252 CG TRP 34 -13.561 -49.106 29.583 1.000 6.95 ATOM 253 CD2 TRP 34 -14 .104 -50.199 28.835 1.000 9.27 ATOM 254 CE2 TRP 34 -15.493 -49.986 28.723 1.000 5.43 ATOM 255 CE3 TRP 34 -13.571 -51.345 28.240 1.000 14.72 ATOM 256 CD1 TRP 34 -14. 622 -48 .298 29.888 l.OÓO 4.49 ATOM 257 NE1 TRP 34 -15.786 -48.820 29.374 1.000 4.03 ATOM 258 CZ2 TRP 34 -16.337 -50.864 28.050 1.000 8.19 ATOM 259 CZ3 TRP 34 -14.405 -52.216 27.572 1.000 12.73 ATOM 260 CH2 TRP 34 -15.778 -51.976 27.479 1.000 8.32 ATOM 261 C TRP 34 -11.111 -49.214 27.723 1.000 7.27 ATOM 262 0 TRP 34 -10. 393 -50.222 27.767 1.000 11.53 ATOM 263 N THR 35 -11.839 -48.887 26.659 1.000 1.15 ATOM 264 CA THR 35 -11.730 -49.673 25.431 1.000 5.29 ATOM 265 CB THR 35 -12.708 -49.239 24.331 1.000 3.10 ATOM 266 OG1 THR 35 -12.629 -47.820 24.163 1.000 15.85 ATOM 267 CG2 THR 35 -14.146 -49.549 24.726 1.000 5.16 ATOM 2 26688 C THR 35 -10.307 -49.555 24.882 1.000 14.32 ATOM 2 26699 O T THHRR 35 -9.738 -50.494 24.333 1.000 12.77 ATOM 270 N G GLLYY 36 -9.756 -48.361 25.060 1.000 15.72 ATOM 271 CA GLY 36 -8.392 -48.056 24.689 1.000 15,87 ATOM 272 C GLY 36 -7.407 -48.785 25.583 1.000 14.86 ATOM 227733 O GGLLYY 36 -6.374 -49.252 25.101: 1.000 22.97 ATOM 227744 N VVAALL 37 -7.686 -48.905 26.884 1.000 12.48 ATOM 275 CA VAL 37 -6.696 -49.577 27.728 1.000 11.76 ATOM 276 CB VAL 37 -6.921 -49.365 29.229 1.000 10.95 ATOM 277 CG1 VAL 37 -6.092 -50.382 30.009 1.000 0.00 ATOM 278 CG2 VAL 37 -6.577 -47.940 29.630 1.000 10.31 ATOM 2 27799 C VAL 37 -6.707 -51.081 27.471 1.000 16.75 ATOM 2 28800 O VAL 37 -5.669 -51.735 27.494 1.000 14.29 ATOM 281 N LEO 38 -7.911 -51.586 27.238 1.000 14.60 ATOM 282 CA LEO 38 -8.094 -52.999 26.917 1.000 11.25 ATOM 283 CB LEO 38 -9.573 -53.266 26.660 1.000 12.92 ATOM 284 CG LEU 38 -9.975 -54.663 26.198 1.000 15.77 ATOM 285 CD1 LEU 38 -9.747 -55.691 27.293 1.000 0.00 ATOM 286 CD2 LEO 38 -11.425 -54.677 25.733 1.000 24.28 ATOM 2 28877 C LEO 38 -7.224 -53.347 25.720 1.000 7.67 ATOM 2 28888 O LEU 38 -6.408 -54.262 25.740 1.000 13.04 ATOM 289 N ALA 39. -7.404 -52.568 24.659 1.000 9.64 ATOM 290 CA' ALA 39 -6.603 -52.667 23.451 1.000 3.53 ATOM 291 CB ALA 39 -6.894 -51.487 22.530 1.000 6.32 ATOM 2 29922 C ALA 39 -5.112 -52.704 23.761 1.Q00 9.32 ATOM 2 29933 O ALA 39 -4.411 -53.632 23.367 1.000 28.59 ATOM 2 29944 N GLN 40 -4.653 -51.665 24.456 1.000 21.51 ATOM 295 CA GLN 40 -3.251 -51.553 24.833 1.000 18.93 ATOM 296 CB GLN 40 -2.974 -50.365 25.744 1.000 28.00 ATOM 297 CG GLN 40 -3.597 -49.034 25.378 1.000 37.51 ATOM 298 CD GLN 40 -3.070 -47.877 26.214 1.000 40.85 ATOM 299 OE1 GLN 40 -1.998 -47.335 25.933 1.000 61.34 ATOM 300 NE2 GLN 40 -3.809 -47.475 27.248 1.000 9.83 ATOM 3 30011 C GLN 40 -2.822 -52.851 25.525 1.000 10.96 ATOM 3 30022 O GLN 40 -1.856 -53.475 25.106 .000 18.66 ATOM 303 N GLN 41 -3.563 -53.239 26.552 .000 15.02 ATOM 304 CA GLN 41 -3.253 -54.423 27.337 .000 22.27 ATOM 305 CB GLN 41 -4.258 -54.582 28.484 , 000 16.69 ATOM 306 CG GLN 41 -4.064 -53.605 29.624 ,000 14.55 ATOM 307 CD GLN 41 -2.788 -53.852 30.406 1.000 16.86 ATOM 308 OE1 GLN 41 -2.759 -54.650 31.344 1.000 13.75 ATOM 309 NE2 GLN 41 -1.731 -53.158 30.008 1.000 21.79 ATOM 310 C GLN 41 -3.261 -55 , 694 26.493 1.000 28.40 ATOM 311 0 GLN 41 -2.442 -56.589 26.703 1.000 26.71 ATOM 312 N LEU 42 -4.190 -55.776 25.546 1.000 28.62 ATOM 313 CA LEU 42 -4.373 -57.007 24.780 1.000 26.50 ATOM 314 CB LEU 42 -5.707 -56.920 24.012 1.000 19.31 ATOM 315 CG LEU 42 -6.934 -57.122 24.914 1.000 16.32 ATOM 316 CD1 LEU 42 -8.226 -57.077 24.119 1.000 10.94 ATOM 317 CD2 LEU 42 -6.810 -58.438 25.673 1.000 15.03 ATOM 318 C LEU 42 -3.217 -57.312 23.846 1.000 23.29 ATOM 319 0 LEU 42 -2.770 -58.457 23.728 1.000 20.82 ATOM 320 N GLY 43 -2.693 -56.312 23.141 1.000 22.18 ATOM 321 CA GLY 43 -1. 605 -56.590 22.215 1.000 18.95 ATOM 322 C GLY 43 -2.086 -56.793 20.791 1.000 23.97 ATOM 323 0 GLY 43 -3.284 -56.838 20.514 1.000 27.50 ATOM 324 N ALA 44 -1. 136 -56.927 19.879 1.000 22.72 ATOM 325 CA ALA 44 -1.317 -57.012 18.448 1.000 24.25 ATOM 326 CB ALA 44 0.048 -56.939 17.755 1.000 13.44 ATOM 327 C ALA 44 -2.034 -58.272 17.990 1.000 23.83 ATOM • 328 0 ALA 44 -2.146 -58.520 16.787 1.000 17.77 ATOM 329 N ASP 45 -2.524 -59.086 18.917 1.000 21.59 ATOM 330 CA ASP 45 -3.230 -60 , 298 18.495 1.000 17.80 ATOM • 331 CB ASP 45 -2.705 -61.491 19.296 1.000 18.22 ATOM 332 CG ASP 45 -1.201 -61. 625 19.113 1.000 24.69 ATOM 333 OD1 ASP 45 -0.710 -61.174 18.053 1.000 34.10 ATOM 334 OD2 ASP 45 -0.517 -62.159 20.007 1.000 33.14 ATOM 335 C ASP 45 --4.732 -60.107 18. 647 1.000 11.82 ATOM 336 0 ASP 45 -5.535 -60.992 18.364 1.000 23.89 ATOM 337 N ' PHE 46 -5.097 -58.914 19.097 1.000 9.27 ATOM 338 CA PHE 46 -6.485 -58.519 19.253 1.000 12.25 ATOM 339 CB PHE 46 -6.909 -58.479 20.722 1.000 14.52 ATOM 340 CG PHE 46 -6.474 -59.693 21.529 1.000 11.99 ATOM 341 CD1 PHE 46 -5.160 -59.814 21.956 1.000 12.17 ATOM 342 CD2 PHE 46 -7.383 -60.690 21.846 1.000 8.34 ATOM 343 CE1 PHE 46 -4.760 -60.917 22.683 1.000 13.46 ATOM 344 CE2 PHE 46 -6.990 -61.794 22.575 1.000 6.30 ATOM 345 CZ PHE 46 -5. 680 -61. 904 22.998 1.000 8. 44 ATOM 346 C PHE 46 -6.725 -57.149 18.615 1.000 13.30 ATOM 347 0 PHE 46 -5.816 -56.366 18.366 1. 000 27.22 ATOM 348 N GLO 47 -7.992 -56.883 18.349 1.000 12.78 ATOM 349 CA GLU 47 -8.469 -55.616 17.833 1.000 9.15 ATOM 350 CB GLO 47 -8. 667 -55.644 16.325 1.000 11.20 ATOM 351 CG GLU 47 -8.791 -54.276 15. 670 1.000 21.84 ATOM 352 CD GLU 47 -9.726 -54.293 14.474 1.000 25.88 ATOM 353 O?1 GLU 47 -9.575 -55.205 13.632 1.000 30.74 ATOM 354 OE2 GLU 47 -10.602 -53.408 14.388 1.000 7.59 ATOM 355 C GLU 47 -9.781 -55.280 18.550 1.000 11.37 ATOM 356 0 GLU 47 -10.722 -56.071 18.545 1.000 11.73 ATOM 357 N VAL 48 -9.775 -54.103 19.160 1.000 10.53 ATOM 358 CA VAL 48 -10.954 -53.604 19.843 1.000 8.11 ATOM 359 CB VAL 48 -10.595 -52.826 21.115 1.000 9.71 ATOM 360 CG1 VAL 48 -11.842 -52.251 21.773 1.000 15.31 ATOM 361 CG2 VAL 48 -9.849 -53.732 22.085 1.000 7.41 ATOM 362 C VAL 48 -11.745 -52.714 18.882 1.000 12.72 ATOM 363 O VAL 48 -11.147 -51.879 18.203 1.000 10.16 ATOM 364 N ILE • 49 -13.046 -52.943 18.862 1.000 13.04 ATOM 365 CA ILE 49 -14.031 -52.170 18.122 1.000 14.10 ATOM 366 CB 1LE 49 -14.879 -53.068 17.203 1.000 16.77 ATOM 367 CG2 ILE 49 -15.735 -52.214 16.285 1.000 1.57 ATOM 368 CG1 ILE 49 -14.049 -54.081 16.415 1.000 18.10' ATOM 369 CD1 ILE 49 -14.687 -54.559 15.133 1.000 14.33 ATOM 370 C ILE 49 -14.930 -51.406 19.091 1.000 9.02 ATOM 371 O IL? 49 -15.531 -52.013 19.983 .000 15.82 ATOM 372 N GLU 50 -15.000 -50.085 18. 932 1.000 5.34 ATOM 373 CA GLU 50 -15.730 -49.277 19.911 1.000 12.03 ATOM 374 CB GLU 50 -14.967 -47.984 20.222 1.000 10.36 ATOM 375 CG GLU 50 -13.623 -48.203 20.889 1.000 7.32 ATOM 376 CD GLU • 50 -12.768 -46.966 21.056 1.000 7.06 ATOM 377 OE1 GLU 50 -12.744 -46.077 20.177 1.000 5.78 ATOM 378 OE2 GLU 50 -12.079 -46.870 22.101 1.000 25.19 ATOM 379 C GLU 50 -17.145 -48.962 19.446 1.000 6.79 ATOM 380 O GLU 50 -17.358 -48.318 18.423 1.000 8 .80 ATOM 381 N GLU 51' -18.118 -49.429 20.225 1.000 9.34 ATOM 382 CA GLU 51 -19.524 -49.179 19.924 1.000 16.23 ATOM 383 CB GLU 51 -20.173 -50.400 19.270 1.000 15.22 ATOM 384 CG GLU 51 -19.757 -50.596 17.820 1.000 18.39 ATOM 385 CD GLU 51 -20.348 -49.531 16.917 1.000 17.99 ATOM 386 OE1 GLU 51 -21.352 -48.912 17.332 1.000 26.29 ATOM 387 OE2 GLÜ 51 -19.820 -49.309 15.809 1.000 15.93 ATOM 388 C GLU 51 -20.295 -48.788 21.184 1.000 10.51 ATOM 389 O GLU 51 -21.202 -49. 495 21.623 1.000 7.29 ATOM 390 N GLY 52 -19.906 -47.655 21.751 1.000 5.90 ATOM 391 CA GLY 52 -20.533 -47.140 22.961 1.000 3.93 ATOM 392 C GLY 52 -21.329 -45.887 22.635 1.000 6.21 ATOM 393 O GLY 52 -20.785 -44.950 22.057 1.000 16.40 ATOM 394 N LEU 53 -22.607 -45.890 22.989 1.000 11.68 ATOM 395 CA LEU 53 -23.498 -44.764 22.710 1.000 7.60 ATOM 396 CB LEU 53 -24.627 -45.195 21.792 1.000 4.45 ATOM 397 CG LEU 53 -25.576 -44.164 21.185 1.000 3.84 ATOM 398 CD1 LEU 53 -26.721 -43.872 22.141 1.000 15.09 ATOM 399 CD2 LEU 53 -24.856 -42.874 20.817 1.000 3.41 ATOM 400 C LEU 53 -24.035 -44.204 24.023 1.000 5.05 ATOM 401 O LEU 53 -24.664 -44. 920 24.801 1.000 5.74 ATOM 402 N SER 54 -23.771 -42.918 24.251 1.000 9.85 ATOM 403 CA SER 54 -24.192 -42.296 25.502 1.000 10.24 ATOM 404 CB SER 54 -23.797 -40.819 25.524 1.000 7..63 ATOM 405 OG SER 54 -22.395 -40. 683 25.640 1.000 4. ,65 ATOM 406 C SER 54 -25.695 -42.448 25.691 1.000 7. .74 ATOM 407 O SER 54 -26.438 -42.326 24.717 1.000 10. .39 ATOM 408 N ALA' 55 -26.127 -42.713 26.920 1.000 0, .00 ATOM 409 CA ALA 55 -27.554 -42.749 27.218 1.000 0 0.. ,0000 ATOM 410 CB ALA 55 -28.209 -41.474 26.713 1.000 00.. ,0000 ATOM 411 C ALA 55 -28.235 -43.982 26.640 1.000 66.. ,1111 ATOM 412 0 ALA 55 -29.442 -44.179 26.816 1.000 22,. ,5577 ATOM 413 N ARG 56 -27.474 -44.843 25.971 1.000 88,. .5500 ATOM 414 CA ARG 56 -27.997 -46.084 25.433 1.000 55,. .9944 ATOM 415 CB ARG 56 -26.919 -46.868 24.672 1.000 00.. .0000 ATOM 416 CG .ARG 56 -27.420 -48.244 2 244..224477 1.000 22...7733 ATOM 417 CD ARG - 56 -26.467 -48.951 23.307 1.000 0.00 ATOM 418 NE ARG ' 56 -26.552 -48.440 21.935 1.000 6.44 ATOM 419 CZ ARG 56 -25.465 -48.325 21.170 1.000 11.18 ATOM 420 NH1 ARG 56 -24.283 -48. 678 21.666 1.000 0.00 ATOM 421 NH2 ARG- 56 -25.549 -47.861 19.928 1.000 1.13 ATOM 422 C ARG 56 -28.539 -47.009 26.526 1.000 12.43 ATOM 423 0 ARG 56 -27.886 -47.179 27.556 1.000 10.16 ATOM 424 N . THR 57 -29.697 -47.592 26.262 1.000 9.24 ATOM 425 CA THR 57 -30.376 -48.548 27.120 1.000 9.36 ATOM 426 CB THR 57 -31.855 -48.161 27.315 1.000 4.78 ATOM 427 OGl THR 57 -32. 608 -48.509 26.146 1.000 3.70 ATOM 428 CG2 THR 57 -31.992 -46. 656 27.484 1.0Q0 0.00 ATOM 429 C THR 57 -30.284 -49.953 26.532 1.000 10.18 ATOM 430 0 THR 57 -29.873 -50.099 25.378 1.000 12.60 ATOM 431 N THR 58 -30. 648 -50.987 27.286 1.000 5.87 ATOM' 432 CA THR 58 -30.574 -52.349 26.769 1.000 1.65 ATOM 433- CB THR 58 -30.850 -53.410 27.853 1.000 5.35 ATOM 434 OG1 THR 58 -32.151 -53.196 28.413 1.000 12.48 ATOM 435 CG2 THR 58 -29.859 -53.311 29.002 1.000 11.47 ATOM 436 C THR 58 -31.556 -52.569 25.624 1.000 1.31 ATOM 437 0 THR 58 -31.162 -52.902 24.506 1.000 7.78 ATOM 438 N ASN 59 -32.856 -52.404 25.867 1.000 4.91 ATOM 439 CA ASN 59 -33.810 -52.604 24.772 1.000 11.25 ATOM 440 CB ASN 59 -34.150 -54.090 2 244..662244 1.000 9.19 ATOM 441 CG ASN 59 -35 , 186 -54.548 25.629 1.000 9.50 ATOM 442 OD1 ASN 59 -35.293 -54.000 26.725 1.000 13.36 ATOM 443 ND2 ASN 59 -35. 965 -55.556 25.263 1.000 4.31 ATOM 444 C ASN 59 -35.070 -51.775 24.960 1.000 8.67 ATOM 445 0 ASN 59 -36.172 -52.160 24.574 1.000 12.75 ATOM 446 N ILE 60 -34. 938 -50.587 25.548 1.000 10.46 ATOM 447 CA ILE 60 -36.128 -49.752 25.722 1.000 10.70 ATOM 448 CB ILE 60 -36.572 -49.721 27.198 1.000 11.36 ATOM 449 CG2 ILE 60 -35.465 -49.223 28.112 1.000 0.00 ATOM 450 CG1 ILE 60 -37.872 -48.940 27.417 1.000 8.05 ATOM 451 CD1 ILE 60 -38.291 -48.800 28.860 1.000 27.90 ATOM 452 C ILE 60 -35.879 -48.350 25.177 1.000 16.37 ATOM 453 O ILE 60 -34.813 -47.773 25.374 1.000 28.53 ATOM 454 N ASP 61 -36.861 -47.811 24.4701.000 18.37 ATOM 455 CA ASP 61 -36.838 -46.520 23.8211.000 12.62 ATOM 456 CB ASP 61 -38.110 -46.353 22.977 1.000 12.58 ATOM 457 CG ASP 61 -38.111 -47.199 21.725 1.000 12.09 ATOM 458 OD1 ASP 61 -37.044 -47.723 21.349 1.000 16.37 ATOM 459 OD2 ASP 61 -39.197 -47.332 21.122 1.000 23.20 ATOM 460 C ASP 61 -36.796 -45.350 24.794 1.000 11.54 ATOM 461 0 ASP 61 -37.626 -45.279 25.7021.000 8.66 ATOM 462 N ASP 62 -35.860 -44.428 24.603 1.000 8.03 ATOM 463 CA ASP 62 -35.844 -43.228 25.431 1.000 14.39 ATOM 464 CB ASP 62 -34.430 -42.656 25.565 1.000 13.94 ATOM 465 CG ASP 62 -34.384 -41.598 26.6561.000 18.06 ATOM 466 OD1 ASP 62 -33.609 -41.768 27.622 1.000 13.05 ATOM 467 OD2 ASP 62 -35.129 -40.604 26.5361.000 20.19 ATOM 468 C ASP 62 -36.759 -42.162 24.T44 1.000 13.14 ATOM 469 0 ASP . • 62 -36.506 -41.698 23.731 1.000 14.36 ATOM 470 N PRO 63 -37.800 -41.751 25.5531.000 8.49 ATOM 471 CD PRO 63 -38.102 -42.088 26.9511.000 4.73 ATOM 472 CA PRO 63 -38.805 -40.853 24.9721.000 16.60 ATOM 473 CB PRO 63 -39.802 -40.646 26.1231.000 11.61 ATOM 474 CG PRO 63 -39.020 -40.960 27.352 1.000 8.04 ATOM 475 C PRO 63 -38.251 -39.504 24.531 1.000 19.70 ATOM 476 0 PRO 63 -38.924 -38.738 23.8351.000 10.26 ATOM 477 N THR 64 -37.024 -39.180 24.9221.000 22.29 ATOM - 478 CA THR 64 -36.429 -37.908 24.534 1.000 19.30 ATOM " 479 CB THR 64 -35.852 -37.191 25.769 1.000 20.62 ATOM 480 OG1 THR 64 -34.550 -37.713 26.045 1.000 30.42 ATOM 481 CG2 THR 64 -36.718 -37.467 26.9921.000 7.89 ATOM 482 C THR 64 -35.329 -38.087 23.497 1.000 19.22 ATOM 483 O THR 64 -34.609 -37.132 23.183 1.000 11.15 ATOM 484 N ASP 65 -35.189 -39.301 22.965 1.000 15.61 ATOM 485 CA ASP 65 -34.139 -39.542 21.967 1.000 18.78 ATOM 486 CB ASP 65 -32.777 -39.286 22.605 1.000 20.50 ATOM 487 CG ASP 65 -31.613 -39.348 21.638 1.000 17.33 ATOM 488 OD1 ASP 65 -31.767 -39.935 20.550 1.000 19.33 ATOM 489 OD2 ASP 65 -30.538 -38.810 21.983 1.000 15.26 ATOM 490 C ASP 65 -34.241 -40.945 21.382 1.000 14.84 ATOM 491 O ASP 65 -33.982 -41.936 22.060 1.000 8.38 ATOM 492 N PRO 66 -34.638 -41.026 20.115 1.000 15.75 ATOM 493 CD PRO 66 -34.896 -39.870 19.235 1.000 23.61 ATOM 494 CA PRO 66 -34.882 -42.301 19.441 1.000 9.14 ATOM 495 CB PRO 66 -35.693 -41.871 18.206 1.000 14.38 ATOM 496 CG PRO 66 -35.210 -40.494 17.902 1.000 16.45 ATOM 497 C PRO 66 -33.621 -43.029 18.995 1.000 8.15 ATOM 498 O PRO 66 -33.695 -44.041 18.283 1.000 12.38 ATOM 499 N ARG 67 -32.446 -42.557 19.404 1.000 11.98 ATOM 500 CA ARG 67 -31.209 -43.225 19.020 1.000 7.77 ATOM 501 CB ARG 67 -30.081 -42.211 18.831 1.000 8.16 ATOM 502 CG ARG 67 -30.162 -41.308 17.614 1.000 7.27 ATOM 503 CD ARG 67 -29.078 -40.228 17.713 1.000 11.05 ATOM 504 N? ARG 67 -29.378 -39.266 18.769 1.000 11.17 ATOM 505 CZ ARG 67 -28.768 -38.115 19.001 1.000 13.35 ATOM 506 NH1 ARG 67 -27.756 -37.708 18.245 1.000 3.80 ATOM 507 NH2 ARG 67 -29.168 -37.347 20.010 1.000 9.93 ATOM 508 C ARG 67 . -30.728 -44.239 20.048 1.000 8.92 ATOM 509 0 ARG 67 -29.714 -44.887 19.774 1.000 13.65 ATOM 510 N LEU 68 -31.389 -44.365 21.191 1.000 9.14 ATOM 511 CA LEU 68 -30.805 -45.057 22.335 1.000 13.92 ATOM 512 CB LEU 68 -31.052 -44.223 23.608 1.000 7.80 ATOM 513 CG LEU 68 -30.899 -42.707 23.481 1.000 8.78 ATOM 514 CD1 LEU 68 -31.285 -41.987 24.770 1.000 13.12 ATOM 515 CD2 LEU 68 -29.477 -42.333 23.090 1.000 3.77 ATOM 516 C LEU 68 -31.299 -46.478 22.571 1.000 16.19 ATOM 517 0 LEU 68 -30.895 -47.092 23.574 1.000 5.21 ATOM 518 N ASN 69 -32.139 -47.056 21.716 1.000 7.75 ATOM 519 CA ASN 69 -32.520 -48.457 21.927 1.000 6.53 ATOM 520 CB ASN 69 -33.807 -48.842 21.198 1.000 6.25 ATOM 521 CG ASN 69 -34.377 -50.172 21.658 1.000 11.70 ATOM 522 OD1 ASN 69 -33.732 -51.219 21.664 1.000 2.64 ATOM 523 ND2 ASN 69 -35.646 -50.164 22.057 1.000 10.84 ATOM 524 C ASN 69 -31.406 -49.404 21.480 1.000 8.62 ATOM 525 0 ASN 69 -31.204 -49.617 20.287 1.000 14.61 ATOM . 526 N GLY 70 -30.697 -49.972 22.452 1.000 8.79 ATOM 527 CA GLY 70 -29.582 -50.854 22.212 1.000 1.64 ATOM 528 C GLY 70 -29.911 -52.031 21.316 1.000 6.17 ATOM 529 0 GLY 70 -29.189 -52.293 20.355 1.000 12.06 ATOM 530 N ALA 71 -30.982 -52.744 21.622 1.000 1.39 ATOM 531 CA ALA 71 -31.442 -53.885 20.843 1.000 5.92 ATOM 532 CB ALA 71 -32.688 -54.457 21.529 1.000 3.81 ATOM 533 C ALA 71 -31.766 -53.565 19.392 1.000 4.67 ATOM 534 0 ALA 71 -31.565 -54.391 18.490 1.000 0.00 ATOM 535 N SER 72 -32.295 -52.371 19.121 1.000 3.88 ATOM 536 CA SER 72 -32.687 -52.033 17.752 1.000 6.33 ATOM 537 CB SER 72 -33.678 -50.870 17.759 1.000 4.05 ATOM 538 OG SER 72 -33.023 -49.637 18.004 1.000 25.62 ATOM 539 C SER 72 -31.468 -51.730 16.884 1.000 7.90 ATOM 540 0 SER 72 -31.568 -51.720 15.658 1.000 12.06 ATOM 541 N TYR 73 -30.315 -51.505 17.498 1.000 8.51 ATOM 542 CA TYR 73 -29.070 -51.210 16.789 1.000 8.77 ATOM 543 CB TYR 73 -28.394 -50.029 17.478 1.000 10.31 ATOM 544 CG TYR 73 -27.124 -49.453 16.913 1.000 11.92 ATOM 545 CD1 TYR 73 -27.113 -48.329 16.090 1.000 8.49 ATOM 546 CE1 TYR 73 -25.931 -47.812 15.586 1.000 1.47 ATOM 547 CD2 TYR 73 -25.888 -50.018 17.201 1.000 10.36 ATOM 548 C?2 TYR 73 -24 ,704 -49.512 16.703 1.000 9.07 ATOM 549 CZ TYR 73 -24.727 -48.398 15.890 1.000 5.36 ATOM 550 OH TYR 73 -23.544 -47.902 15.391 1.000 10.80 ATOM 551 C TYR 73 -28.148 -52.419 16.730 1.000 13.31 ATOM 552 O TYR 73 -27.404 -52.630 15.764 1.000 10.40 ATOM 553 N LEU 74 -28.172 -53.261 17.759 1.000 8.99 ATOM 554 CA LEO 74 -27.204 -54.342 17.9011.000 7.76 ATOM 555 CB LEO 74 -27.554 -55.155 19.155 1.000 9.47 ATOM 556 CG LEO 74 -26.402 -55.532 20.0801.000 10.36 ATOM 557 CD1 LEU 74 -26.786 -56.729 20.9391.000 25.33 ATOM 558 CD2 LEO 74 -25.137 -55.819 19.2881.000 13.92 ATOM 559 C LEU 74 -27.088 - -55.253 16.687 1.000 5.72 ATOM 560 0 LEU 74 -25.980 -55.383 16.141 1.000 7.01 ATOM 561 N PRO 75 -28.141 -55.907 16.219 1.000 6.99 ATOM 562 CD PRO 75 -29.553 -55.794 16.615 1.000 1.55 ATOM 563 CA PRO 75 -27. 965 -56.896 15.140 1.000 7.57 ATOM 564 CB PRO 75 -29.384 -57.401 14.855 1.000 5.01 ATOM 565 CG PRO 75 -30.158 -57.063 16.086 1.000 6.27 ATOM 566 C PRO 75 -27.364 -56.285 13.882 1.000 4.16 ATOM 567 0 PRO 75 -26.651 -56.971 13.158 1.000 4.35 ATOM 568 N SER 76 -27.640 -55.014 13.615 1.000 6.22 ATOM 569 CA SER 76 -27.050 -54.322 12.473 1.000 0.00 ATOM 570 CB SER 76 -27.758 -52.978 12.261 1.000 0.00 ATOM 571 OG SER 76 -29.120 -53.249 11.920 1.000 0.00 ATOM 572 C • SER 76 -25.554 -54.127 12.674 1.000 0.69 ATOM 573 0 SER 76 -24.767 -54.280 11.740- 1.000 4.06 ATOM 574 N CYS 77 -25.202 -53.802 13.911 1.000 2.82 ATOM 575 CA CYS 77 -23.851 -53.599 14.384 1.000 2.99 ATOM 576 CB CYS 77 -23.878 -53.202 15.868 1.000 0.00 ATOM 577 SG CYS 77 -22.325 -52.508 16.451 1.000 8.78 ATOM 578 C CYS 77 -22. 962 -54.831 14,225 1.000 13.77 ATOM 579 0 CYS 77 -21.828 -54.700 13.755 1.000 12.12 ATOM 580 N LEU 78 -23.455 -55.996 14.621 1.000 15.71 ATOM 581 CA LEU 78 -22.751 -57.268 14.538 1.000 10.13 ATOM 582 CB LEO 78 -23.617 -58.387 15.129 1.000 2.73 ATOM 583 CG LEU 78 -23.777 -58.354 16.651 1.000 7.98 ATOM 584 CD1 LEU 78 -24.866 -59.319 17.085 1.000 3.36 ATOM 585 CD2 LEU 78 -22.451 -58.676 17.330 1.000 8.53 ATOM 586 C LEU 78 -22.385 -57.650 13.106 1.000 9.88 ATOM 587 0 LEU 78 -21.222 -57.855 12,761 1.000 12.55 ATOM 588 N ALA 79 -23.407 -57.748 12.271 1.000 11.93 ATOM 589 CA ALA 79 -23.297 -58.022 10.848 1.000 2.98 ATOM 590 CB ALA 79 -24.699 -58.042 10.255 1.000 0.32 ATOM 591 C ALA 79 -22.393 -57.026 10.127 1.000 7.73 ATOM 592 O ALA 79 -^21.724 -57.408 9.163 1.000 13.15 ATOM 593 N THR 80 -22.337 -55.774 10.560 1.000 10.93 ATOM 594 CA THR 80 -21.427 -54.757 10.044 1.000 6.56 ATOM 595 CB THR 80 -21.703 -53.373 10.669 1.000 9.10 ATOM 596 OG1 THR 80 -23.013 -52.897 10.320 1.000 4.47 ATOM 597 CG2 THR 80 -20.722 -52.328 10.148 1.000 8.02 ATOM 598 C THR 80 -19.970 -55.117 10.317 1.000 10.87 ATOM 599 O THR 80 -19.103 -55.052 9.450 1.000 12.66 ATOM 600 N HIS 81 -19.659 -55.512 11.548 1.0Q0 13.90 ATOM 601 CA HIS 81 -18.282 -55.720 11.978 1.000 13.04 ATOM 602 CB HIS 81 -18.119 -55.195 13.418 1.000 15.15 ATOM 603 CG HIS 81 -18.279 -53.704 13.502 1.000 10.10 ATOM 604 CD2 HIS 81 -19.202 -52.927 14.111 1.000 6.25 ATOM 605 ND1 HIS 81 -17.404 -52.833 12.889 1.000 7.20 ATOM 606 CE1 HIS 81 -17.775 -51.589 13.117 1.000 7.73 ATOM 607 N?2 HIS 81 -18.867 -51.616 13, 863 1.000 6.24 ATOM 608 C HIS 81 -17.827 -57.166 11.896 1.000 9.61 ATOM 609 0 HIS 81 -16. 674 -57.460 12.216 1.000 10.35 ATOM 610 N LEO 82 -18.689 -58.081 11.470 1.000 4.74.
ATOM 611 CA LEO 82 -18.257 -59.461 11.247 1.000 6.06 ATOM 612 CB LEO 82 -19.399 -60.263 10.631 1.000 6.-90 ATOM 613 CG LEO 82 -20.535 -60.716 11.541 1.000 6.83 ATOM 614 CD1 LEO 82 -21.388 -61.774 10.851 1.000 11.79 ATOM 615 CD2 LEU 82 -19.987 -61.246 12.856 1.000 23.45 ATOM 616 C LEO 82 -17.042 -59.500 10.337 1.000 6.51 ATOM 617 0 LEO 82 -16.972 -58.722 9.375 1.000 1.45 ATOM 618 N PRO 83 -16.056 -60.360 10.556 1.000 7.15 ATOM 619 CD PRO 83 -14.823 -60.374 9.731 1.000- 0.00 ATOM 620 CA PRO 83 -16.043 -61.394 11.583 1.000 5.44 ATOM 621 CB PRO 83 -14.941 -62.341 11.067 1.000 9.33 ATOM 622 CG PRO 83 -13.968 -61.405 10.415 1.000 7.09 ATOM 623 C PRO 83 -15. 638 -60.922 12. 973 1.000 10.31 ATOM 624 0 PRO 83 -14.716 -60.125 13.110 1.000 16.21 ATOM 625 N LEO 84 -16.319 -61.434 13.994 1.000 14.34 ATOM 626 CA LEO 84 -16.009 -61.132 15.382 1.000 10.66 ATOM 627 CB LEO 84 -17.165 -60.373 16.049 1.000 7.23 ATOM 628 CG LEO 84 -17.485 -59.010 15.434 1.000 2.01 ATOM 629 CD1 LEU 84 -18.843 -58.518 15. 902 1.000 8.19 ATOM 630 CD2 LEU 84 -16.382 -58.019 15.766 1.000 5.93 ATOM 631 C LEU 84 -15.734 -62.386 16.203 1.000 7.34 ATOM 632 0 LEU 84 -16.299 -63.447 15.945 1.000 8.40 ATOM 633 N ASP 85 -14.879 -62.247 17.208 1.000 8.68 ATOM 634 CA ASP 85 -14.607 -63.332 18.146 1.000 10.21 ATOM 635 CB ASP 85 -13.093 -63.433 18.382 1.000 15.96 ATOM 636 CG ASP 85 -12.338 -63.789 17.117 1.000 11.01 ATOM 637 OD1 ASP 85 -12.343 -64.975 16.727 1.000 9.49 ATOM 638 OD2 ASP 85 -11.739 -62.878 16.518 1.000 28.18 ATOM 639 C ASP 85 -15.313 -63.142 19.477 1.000 0.00 ATOM 640 0 ASP 85 -15.778 -64.067 20.137 1.000 5.48 ATOM 641 N LEU 86 -15.414 -61.907 19.958 1.000 7.62 ATOM 642 CA LEU 86 -16.080 -61.695 21.243 1.000 8.84 ATOM 643 CB LEU 86 -15.085 -61.690 22.403 1.000 12.15 ATOM 644 CG LEU 86 -15.655 -61.580 23.822 1.000 13.98 ATOM 645 CD1 LEU 86 -16.562 -62.757 24.151 1.000 7.12 ATOM 646 CD2 LEU 86 -14.535 -61.477 24.850 1.000 10.28 ATOM 6 64477 C LEU 86 -16.841 -60.374 21.221 1.000 6.69 ATOM 664488 0 LEU 86 -16.327 -59.409 20.649 1.000 8 8..0055 ATOM 664499 N VAL 87 -18.013 -60.361 21.842 1.000 44..2266 ATOM 650 CA VAL 87 -18.752 -59.127 22.049 1.000 22..2211 ATOM- 651 CB VAL 87 -20.150 -59.126 21.413 1.000 88..4444 ATOM 652 CG1 VAL 87 -20.848 -57.808 21.722 1.000 22..5511 ATOM 653 CG2 VAL 87 -20.104 -59.352 1 199..991111 11..000000 0 00...000000 ATOM 654 C VAL 87 -18.893 -58.869 23.551 1.000 77..0055 ATOM 655 0 V VAALL 87 -19,472 -59.660 24.2891.000 55..7766 ATOM 656 N 1LE 88 -18.351 -57.746 24.010 1.000 77..2244 ATOM 657 CA 1LE 88 -18.499 -57.336 25.400 1.000 66..1188 ATOM 658 CB I ILLEE 88 -17.233 -56.652 25.938 1.000 66..5544 ATOM 659 CG2 ILE 88 -17.458 -56.098 27.333 1.000 11.40 ATOM 660 CG1 ILE 88 -16.001 -57.559 25.902 1.000 6.21 ATOM 661 CD1 ILE 88 -14.734 -56.856 26.339 1.000 7.20 ATOM 662 C 1LE 88 -19.693 -56.394 25.5061.000 4.68 ATOM 663 0 ILE 88 -19.817 -55.458 24.716 1.000 10.14 ATOM 664 N ILE 89 -20.574 -56.672 2 266., .445577 1.000 7 7..7744 ATOM 665 CA ILE 89 -21.765 -55.857 2 266., .664455 1.000 12.20 ATOM 666 CB ILE 89 -23.052 -56.635 26, ,306 1.000 12.51 , ATOM 667 CG2 ILE 89 -24.253 -55.703 26, .339 1.000 11.52 ATOM 668 CG1 ILE 89 -22.981 -57.390 2 244.,.997799 1.000 6 6..4477 ÁTOM 669 CD1 ILE 89 -24.250 -58.111 2244.,.559977 1.000 88..7711 ATOM 670 C ILE 89 -21.861 -55.340 28, .078 1.000 11.05 ATOM 671 0 ILE 89 -22.169 -56.106 28. .989 1.000 3.02 ATOM 672 N MET 90 -21.590 -54.049 28, .236 1.000 7.01 ATOM 673 CA MET 90 -21.808 -53.359 29. .492 1.000 11.48 ATOM 674 CB MET 90 -20.535 -52.721 30, .043 1.000 9.27 ATOM 675 CG MET 90 -20.756 -52.097 31. .415 1.000 10.33 ATOM 676 XD M MEETT 90 -19.202 -51.706 32, .246 1.000 17.92 ATOM 677 CE MMEETT 90 -18.544 -50.475 31, .124 1.000 12.70 ATOM 678 C MMEETT 90 -22.872 -52.262 29.325 1, 000 12.90 ATOM 679 0 M MEETT 90 -22.524 -51.143 28.954 1, 000 0.00 ATOM 680 N LLEEUU 91 -24.108 -52.639 29.604 l, 000 8.70 ATOM 681 CA LEU 91 -25.292 -51.802 29.511 1. 000 10.58 ATOM 682 CB LEU 91 -26.114 -52.105 28.254 1.000 9.42 ATOM- 683 CG LEU 91 -25.573 -51.564 26.932 1.000 4.10 ATOM 684 CD1 LEU 91 -26.427 -52.046 25.772 1, 000 0.00 ATOM 685 CD2 LEU 91 -25.506 -50.044 26.961 1 000 2.02 ATOM 686 C LEU 91 -26.169 -52.031 30.734 1.000 2.21 ATOM 687 0 LEU 91 -25.989 -53.066 31.388 1.000 10.59 ATOM 688 N GLY 92 -27.087 -51.117 31.025 1.000 4.69 ATOM 689 CA GLY 92 -27.963 -51.321 32.172 1.000 7.16 ATOM 690 C - 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765 CZ ARG 101 -43.797 -43.583 36.373 1.000 33.97 ATOM 766 NH1 ARG 101 -43.355 -43.839 3 377..559999 1.000 43.49 ATOM 767 NH2 ARG 101 -44.206 -42.361 3366..006677 1.000 44.85 ATOM 768 C ARG 101 -39.472 -48.955 3355..770044 1.000 12.20 ATOM 769 O ARG 101 -40.376 -49.782 35.878 1.000 12.48 ATOM 770 N ARG 102 -38.238 -49.319 35.378 1.000 8.86 ATOM 771 CA ARG 102 -37.887 -50.733 35.264 1.000 11.00 ATOM 772 CB ARG 102 -36.899 -50.962 34.115 1.000 6.96 ATOM 773 CG ARG 102 -37.497 -50.805 32.720 1.000 9.64 ATOM 774 CD ARG 102 -36.518 -51.198 31.624 1.000 8.07 ATOM 775 N? ARG 102 -37.140 -51.842 30.474 1.000 4.64 ATOM 776 CZ ARG 102 -36.540 -52.606 29.571 1.000 7.34 ATOM 777 NH1 ARG 102 -35.240 -52.877 29.628 1.000 1.45 ATOM 778 NH2 ARG 102 -37.232 -53.131 28.567 1.000 6.11 ATOM 779 C ARG 102 -37.320 -51.275 36.577 1.000 11.09 ATOM 780 O ARG 102 -36.734 -50.567 37.394 1.000 10.02 ATOM 781 N THR 103 -37.497 -52.573 36.785 1.000 11.01 ATOM 782 CA THR 103 -36.898 -53.307 37.893 1.000 12. 65 ATOM 783 CB THR 103 -37.844 -54.376 38.462 1.000 7.64 ATOM 784 OG1 THR 103 -38.083 -55.384 37.468 1.000 11.29 ATOM 785 CG2 THR 103 -39.199 -53.771 38.790 1.000 15.33 ATOM 786 C THR 103 -35.618 -53.966 37.390 1.000 10.55 ATOM 787 O THR 103 -35.409 -53.986 36.173 1.000 9.17 ATOM 788 N PRO 104 -34.765 -54.474 38.264 1.000 10.17 ATOM 789 CD PRO 104 -34.799 -54.363 39.731 1.000 14.03 ATOM 790 CA PRO 104 -33.598 -55.230 37.803 1.000 6.81 ATOM 791 CB PRO 104 -32._968 -55.748 39.094 1.000 5.25 ATOM 792 CG PRO 104 -33.402 -54.759 40.129 1.000 8.07 ATOM 793 C PRO- 104 -34.010 -56.400 36.911 1.000 5.89 ATOM 794 O PRO 104 -33.251 -56.728 35.998 1.000 5.49 ATOM 795 N LEU 105 -35.164 -56.994 37.173 1.000 2.55 ATOM 796 CA LEU 105 -35.690 -58.071 36.341 1.000 10.27 ATOM 797 CB LEU 105 -36.989 -58.642 36.890 1.000 11.51 ATOM 798 CG LEU 105 -37.304 -60.122 36.695 1.000 16.39 ATOM 799 CD1 LEU 105 -38.804 -60.319 36.480 1.000 4.05 ATOM 800 CD2 LEU 105 -36.533 -60.744 35.542 1.000 15.49 ATOM 801 C LEU 105 -35.923 -57.566 34.915 1.000 14.30 ATOM 802 O •LEU 105 -35.415 -58.168 33.969 1.000 14.22 ATOM 803 N ASP 106 -36.686 -56.484 34.791 1.000 11.11 ATOM 804 CA ASP 106 -36.922 -55.878 33.482 1.000 8 .08 ATOM 805 CB ASP 106 -37.636 -54.538 33.621 1.000 14.02 ATOM 806 Cff ASP 106 -39.046 -54.638 34.152 1.000 13.88 ATOM 807 OD1 ASP 106 -39.726 -55.653 33.875 1.000 19.94 ATOM' 808 OD2 ASP 106 -39.479 -53.686 34.843 1.000 4.29 ATOM 809 C ASP 106 -35.607 -55.668 32.734 1.000 7.79 ATOM 810 O ASP 106 -35.504 -55.987 31.554 1.000 10.52 ATOM 811 N ILE 107 -34.614 -55.131 33.438 1.000 5.00 ATOM 812 CA ILE 107 -33.321 -54.814 32.845 1.000 6.63 ATOM 813 CB IL? 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ÓOO 6. 21 ATOM 883 CD GLN 117 -30.699 -57. 933 19.390 1.000 7 .09 ATOM 884 OE1 GLN 117 -29.801 -57.260 19.896 1.000 12.85 ATOM 885 NE2 GLN 117 -3.1.811 -57.376 18.914 1.000 7.39 ATOM 686 C GLN 117 -27 . 499 -61.761 18 .847 1.000 11. 60 ATOM 887 O GLN 117 -27 .105 -62.023 17.706 1.000 9.03 ATOM 888 N VAL 118 -26. 652 -61.751 19.879 1.000 11.77 ATOM 889 CA VAL 118 -25.258 -62.146 19. 659 1.000 8.34 ATOM 890 CB VAL 118 -24.340 -61.768 20.831 1.000 0.49 ATOM 891 CG1 VAL 118 -22.892 -62. 118 20.499 1.000 21.94 ATOM 892 CG2 VAL 118 -24.452 -60.291 21.169 1.000 3." 31 ATOM 893 C VAL 118 -25.166 -63.652 19.417 1.000 10. 48 ATOM 894 O VAL 118 -24.354 -64 .107 18. 607 1.000 10. 54 ATOM 895 N LEU 119 -25. 993 -64 .431 20.112 1.000 7 .97 ATOM 896 CA LEU 119 -25. 916 -65.885 19.993 1.000 8.73 ATOM 897 CB LEU 119 -26.679 -66. 572 21. 135 1. 000 8.06 ATOM 898 CG LEU 119 -25.981 -66.556 22.498 1.000 21.06 ATOM 899 CD1 LEU 119 -26.800 -67.296 23.548 1.000 5.53 ATOM 900 CD2 LEU 119 -24.580 -67 .150 22. 403 1.000 21. 96 ATOM 901 "C LEU 119 -26. 446 -66.362 18.649 1.000 5.78 ATOM 902 O LEU 119 -26.022 -67.409 18.153 1.000 14.06 ATOM 903 N THR 120 -27.364 -65. 608 18.053 1.000 8.82 ATOM 904 CA THR 120 -27.964 -65. 985 16.780 1.000 0.00 ATOM 905 CB THR 120 -29.497 -65.798 16.815 1.000 6.15 ATOM 906 OG1 THR 120 -29.805 -64.405 16.969 1.000 10.14 ATOM 907 CG2 THR 120 -30.121 -66.535 17.994 1.000 0.76 ATOM 908 C THR 120 -27.419 -65.198 15.594 1.000 10.30 ATOM 909 O THR' 120 -28 . 061 -65. 190 14.537 1.000 13.46 ATOM 910 N SER 121 -26.272 -64. 533 15.700 1.000 11.26 ATOM 911 CA SER 121 -25.774 -63.675 14.636 1.000 7.70 ATOM 912 CB SER 121 -25.000 -62.487 15.240 1.000 5.36 ATOM 913 OG SER 121 -23.826 -62.954 15.886 1.000 3.70 ATOM 914 C SER 121 -24 .852 -64.353 13.629 1.000 7.89 ATOM 915 O SER 121 -24.360 -63. 660 12.730 1.000 13.24 ATOM 916 N ALA 122 -24 . 603 -65. 645 13.755 1.000 11.50 ATOM 917 CA ALA 122 -23.748 -66.370 12.820 1.000 12.48 ATOM 918 CB ALA 122 -23.820 -67. 868 13.098 1.000 3.73 ATOM 919 C ALA 122 -24.124 -66. 083 11.370 1.000 7.92 ATOM 920 O ALA 122 -25.311 -66.050 11.042 1.000 8.42 ATOM 921 N GLY 123 -23.125 -65.859 10.529 1.000 7.14 ATOM 922 CA GLY 123 -23.316 -65.625 9.115 1.000 3.98 ATOM 923 C GLY 123 -23.643 -64.196 8.735 1.000 12.34 ATOM 924 0 GLY 123 -23.445 -63.822 7.571 1.000 1.55 ATOM 925 N GLY 124 -24,132 -63.404 9.683 1.000 19.09 ATOM 926 CA GLY 124 -24.506 -62.016 9.471 1.000 13.26 ATOM 927 C GLY 124 -25.277 -61.809 8.186 1.000 10.25 ATOM 928 0 GLY 124 -26.403 -62.278 8.018 1.000 10.97 ATOM 929 N VAL 125 -24.684 -61.110 7.217 1.000 12.50 ATOM 930 CA VAL 125 -25.365 -60.956 5.930 1.000 9.40 ATOM 931 CB VAL 125 -25.557 -59.477 5.559 1.000 14.11 ATOM 932 CG1 VAL 125 -26.156 -59.326 4.168 1.000 13.51 ATOM 933 CG2 VAL 125 -26.455 -58.78-6 6.578 1.000 22.31 ATOM 934 C VAL 125 -24.588 -61.675 4.833 1.000 6.71 ATOM 935 0 VAL 125 -23.580 -61.151 4.368 1.000 4.54 ATOM 936 N GLY 126 -25.047 -62.850 4.427 1.000 14.20 ATOM 937 CA GLY 126 -24.466 -63.654 3.377 1.000 9.15 ATOM 938 C GLY 126 -23.012 -64.018 3.580 1.000 10.06 ATOM ' 939 0 GLY 126 -22.225 -64.068 2.629 1.000 4.29 ATOM 940 N THR 127 -22.595 -64.295 4.811 1.000 6.29 ATOM 941 CA THR 127 -21.214 -64.701 5.050 1.000 3.83 ATOM 942 CB THR 127 -20.470 -63.707 5.957 1.000 8.35 ATOM 943 OGl THR 127 -20.719 -64.001 7.339 1.000 16.55 ATOM 944 CG2 THR 127 -20.987 -62.295 5.716 1.000 11.34 ATOM 945 C THR 127 -21.143 -66.099 5.663 1.000 1.10 ATOM 946 0 THR 127 -22.159 -66.699 6.001 1.000 4.52 ATOM 947 N THR 128 -19.921 -66.590 5.790 1.000 9.21 ATOM 948 CA THR 128 -19.546 -67.893 6.299 1.000 8.72 ATOM 949 CB THR 128 -18.451 -68.505 5.397 1.000 10.99 ATOM 950 OG1 THR 128 -17.447 -67.497 5.236 1.000 7.85 ATOM 951 CG2 THR 128 -18.976 -68.853 4.015 1.000 3.45 ATOM 952 C THR 128 -18.995 -67.821 7.718 1.000 13,03 ATOM 953 0 THR 128 -18.450 -68.788 8.255 1.000 8.50 ATOM 954 N TYR 129 -19.127 -66.646 8.315 1.000 10.20 ATOM 955 CA TYR 129 -18.542 -66.357 9.615 1.000 7.58 ATOM 956 CB TYR 129 -18.323 -64.853 9.722 1.000 8.22 ATOM 957 CG TYR 129 -17.246 -64.280 8.835 1.000 11.97 ATOM 958 CD1 TYR 129 -17.514 -63.176 8.031 1.000 8.62 ATOM 959 CE1 TYR 129 -16.547 -62.636 7.211 1.000 7.23 ATOM 960 CD2 TYR 129 -15.970 -64.827 8.799 1.000 12.10 ATOM 961 CE2 TYR 129 -14.991 -64.290 7.982 1.000 16.92 ATOM 962 CZ TYR 129 -15.288 -63.196 7.193 1.000 16.10 ATOM 963 OH TYR 129 -14.315 -62.655 6.383 1.000 11.56 ATOM 964 C TYR 129 -19.416 -66.840 10.765 1.000 9.63 ATOM 965 0 TYR 129 -20.644 -66.723 10.714 1.000 13.75 ATOM 966 N PRO 130 -18.789 -67.380 11.804 1.000 8.51 ATOM 967 CD PRO 130 -17.336 -67.523 12.004 1.000 10.11 ATOM 968 CA PRO 130 -19.549 -67.914 12.938 1.000 5.53 ATOM 969 CB PRO 130 -18.522 -68.804 13.647 1.000 8.51 ATOM 970 CG PRO 130 -17.227 -68.097 13.3971.000 11.17 ATOM 971 C PRO 130 -19.983 -66.791 13.8721.000 7.77 ATOM 972 O PRO 130 -19.500 -65.667 13.7301.000 2.72 ATOM 973 N ALA 131 -20.873 -67.117 14.7991.000 7.61 ATOM 974 CA ALA 131 -21.305 -66.205 15.844 1.000 2.73 ATOM 975 CB ALA 131 -22.537 -66.747 16.554 1.000 0.00 ATOM 976 C ALA 131 -20.174 -65.984 16.8421.000 8.30 ATOM 977 O ALA 131 -19.502 -66.942 17.2231.000 12.18 ATOM 978 N PRO 132 -19.937 -64.752 17.2731.000 14.28 ATOM 979 CD PRO 132 -20.610 -63.516 16.842 1.000 11.04 ATOM 980 CA PRO 132 -18.901 -64.505 18.284 1.000 12.37 ATOM 981. CB PRO 132 -18.696 -62.992 18.181 1.000 14.35 ATOM 982 CG PRO 132 -20.032 -62.472 17.7531.000 12.70 ATOM 983 C PRO 132 -19.395 -64.884 19.6751.000 12.80 ATOM 984 O PRO 132 -20.608 -65.027 19.8561.000 21.24 ATOM 985 N LYS 133 -18.497 -65.051 20.6411.000 14.17 ATOM 986 CA LYS 133 -18.903 -65.337 22.017 1.000 14.31 ATOM 987 CB LYS 133 -17.760 -65.881 22.8691.000 14.22 ATOM 988 CG LYS 133 -17.050 -67.101 22.317 1.000 13.51 ATOM 989 CD LYS 133 -15.746 -67.358 23.057 1.000 18.76 ATOM 990 CE LYS 133 -15.463 -68.849 23.174 1.000 21.23 ATOM 991 NZ LYS 133 -15.154 -69.237 24.580 1.000 37.08 ATOM 992 C LYS 133 -19.441 -64.066 22.667 1.000 10.23 ATOM 993 O LYS 133 -19.319 -62.982 22.0911.000 4.45 ATOM 994 N VAL 134 -20.032 -64.194 23.853 1.000 4.74 ATOM 995 CA VAL 134 -20.562 -63.000 24.507 1.000 10.55 ATOM 996 CB VAL 134 -22.106 -62.964 24.4901.000 11.86 ATOM 997 CG1 VAL 134 -22.586 -61.523 24.423 1.000 0.00 ATOM 998 CG2 VAL 134 -22,659 -63.778 23.334 1.000 29.88 ATOM 999 C VAL 134 -20.129 -62.885 25.963 1.000 12.01 ATOM 1000 O VAL 134 -20.215 -63.837 26.7361.000 27.94 ATOM 1001 N LEU 135 -19.676 -61.703 26.357 1.000 12.21 ATOM 1002. CA LEO 135 -19.364 -61.443 27.757 1.000 14.41 ATOM 1003 CB LEU 135 -17.975 -60.835 27.898 1.000 17.37 ATOM 1004 CG LEU 135 -17.123 -61.223 29.105 1.000 18.57 ATOM 1005 CD1 LEO 135 -15.993 -60.213 29.2641.000 4.42 ATOM 1006 CD2 LEU 135 -17.932 -61.341 30.387 1.000 6.01 ATOM 1007 C LEU 135 -20.397 -60.497 28.360 1.000 17 .03 ATOM 1008 O LEU 135 -20.485 -59.326 27.984 1.000 14.19 ATOM 1009 N VAL 136 -21.196 -60.988 29.303 1.000 19.10 ATOM 1010 CA VAL 136 -22.167 -60.110 29.954 1.000 14.45 ATOM 1011 CB VAL 136 -23.344 -60.925 30.5111.000 13.65 ATOM 1012 CG1 VAL 136 -24.272 -60.045 31.335 1.000 8.06 ATOM 1013 CG2 VAL 136 -24.080 -61.596 29.362 1.000 0.00 ATOM 1014 C VAL 136 -21.498 -59.327 31.073 1.000 10.63 ATOM 1015 O VAL 136 -20.929 -59.948 31.971 1.000 •7.12 ATOM 1016 N VAL 137 -21.556 -57.997 31.027 1.000 7.93 ATOM 1017 CA VAL 137 -20.882 -57.215 32.056 1.000 6.63 ATOM 1018 CB VAL 137 -19.699 -56.397 31.497 1.000 6.08 ATOM 1019 CG1 VAL 137. -19.115 -55.512 32.595 1.000 6.59 ATOM 1020 CG2 VAL 137 -18.609 -57.291 30.936 1.000 10.34 ATOM 1021 C VAL 137 -21.828 -56.255 32.775 1.000 6.02 ATOM 1022 O VAL 137 -22.319 -55.273 32.219 1.000 11.10 ATOM 1023 N SER 138 • -22.061 -56.558 34.040 1.000 6.05 ATOM 1024 CA SER 138 -22.800 -55.715 34.972 1.000 9.77 ATOM 1025 CB SER 138 -23.139 -56.523 36.223 1.000 16.98 ATOM 1026 OG . SER 138 -23.850 -55.804 37.202 1.000 19.18 ATOM 1027 C SER 138 -21.944 -54.496 35.276 1.000 8.41 ATOM 1028 O SER 138 -20.779 -54.646 35.652 1.000 13.52 ATOM 1029 N PRO 139 -22.459 -53.287 35.096 1.000 12.22 ATOM 1030 CD PRO 139 -23.803 -52.952 34.599 1.000 11.54 ATOM 1031 CA PRO 139 -21.657 -52.087 35.389 1.000 6.14 ATOM 1Q32 CB PRO 139 -22.422 -51.015 34.608 1.000 7.78 ATOM 1033 CG PRO 139 -23.848 -51.455. 34.731 1.000 3.74 ATOM 1034 C PRO 139 -21.620 -51.775 36.875 1.000 3.92 ATOM 1035 O PRO 139 -22.460 -52.217 37.664 1.000 10.47 ATOM 1036 N PRO 140 -20.636 -51.014 37.347 1.000 8.52 ATOM 1037 CD PRO 140 -19.524 -50.412 36.611 1.000 3.33 ATOM 1038 CA PRO 140 -20.591 -50.724 38.788 1.000 13.50 ATOM 1039 CB PRO 140 -19.251 -50.012 38.971 1.000 12.27 ATOM 1040 CG PRO 140 -18.843 -49.543 37.623 1.000 6.73 ATOM 1041 C PRO 140 -21.748 -49.832 39.228 1.000 15.77 ATOM 1042 O PRO 140 -22.321 -49.073 38.445 1.000 21.96 ATOM 1043 N PRO 141 -22.103 -49.939 40.505 1.000 4.93 ATOM 1044 CD PRO 141 -21.487 -50.799 41.528 1.000 0.26 ATOM 1045 CA PRO 141 -23.230 -49.172 41.036 1.000 3.17 ATOM 1046 CB PRO 141 -23.254 -49.560 42.521 1.000 4.18 ATOM 1047 CG PRO 141 -22.591 -5O.897 42.556 1.000 0.00 ATOM 1048 C PRO 141 -23.014 -47.671 40.890 1.000 10.32 ATOM 1049 O PRO 141 -21.876 -47.203 40.900 1.000 17.58 ATOM 1050 ti LEU 142 -24.120 -46.942 40.760 1.000 9.20 ATOM 1051 CA LEU 142 -24.079 -45.490 40.729 1.000 7.44 ATOM 1052 CB LEU 142 -25.421 -44.900 40.288 1.000 7.55 ATOM 1053 CG LEU 142 -25.775 -45.119 38.812 1.000 13.23 ATOM 1054 CD1 LEU 142 -27.262 -44.901 38.566 1.000 0.00 ATOM 1055 CD2 LEU 142 -24.932 -44.218 37,921 1.000 1.85 ATOM 1056 C LEU 142 -23.711 -44.945 42.109 1.000 13.38 ATOM 1057 O EU 142 -23.764 -45.680 43.099 1.000 20.55 ATOM 1058 N ALA 143 -23.363 -43.670 42.126 1.000 15.81 ATOM 1059 CA ALA 143 -22.960 -42.941 43.322 1.000 13.69 ATOM 1060 CB ALA 143 -21.461 -42.676 43.239 1.000 3.16 ATOM 1061 C ALA 143 -23.762 -41.656 43.475 1.000 16.69 ATOM 1062 O ALA 143 -24.500 -41.280 42.552 1.000 10.61 ATOM 1063 N PRO 144 -23.668 -40.968 44.609 1.000 19.19 ATOM 1064 CD PRO 144 -22.997 -41.377 45.852 1.000 16.93 ATOM 1065 CA PRO 144 -24.315 -39.659 44.745 1.000 19.29 ATOM 1066 CB PRO 144 -23.730 -39.076 46.031 1.000 17.13 ATOM 1067 CG PRO 144 -22.904 -40.130 46.664 1.000 12.97 ATOM 1068 C PRO 144 -24.009 -38.723 43.578 1.000 17.14 ATOM 1069 O PRO 144 -22.902 -38.626 43.048 1.000 12.89 ATOM 1070 N MET 145- -25.049 -38.002 43.161 1.000 18.09 ATOM 1071 CA MET 145 -2 .925 -37.064 42.052 1.000 14.70 ATOM 1072 .CB MET 145 -25.912 -37.398 40.942 1.000 21.06 ATOM 1073 CG MET 145 -25.7?1 -38.740 40.263 1.000 24.88 ATOM 1074 XD MET 145 -27.259 -39.577 39.860 1.000 18.47 ATOM 1075 CE MET 145 -27.956 -39.804 41.495 1.000 34.91 ATOM 1076 C MET 145 -25.155 -35.645 42.559 1.000 11.49 ATOM 1077 O MET 145 -26.205 -35.342 43.116 1.000 18.46 ATOM 1078 PRO 146 -24.182 -34.763 42.367 1.000 6.41 ATOM 1079 CD PRO 146 -22.909 -34.993 41.683 1.000 8.S2 ATOM 1080 CA PRO 146 -24.325 -33.388 42.851 1.000 10.88 ATOM .1081 CB PRO 146 -22.916 -32.814 42.759 1.000 10.59 ATOM 1082 CG PRO 146 -22.064 -33.819 42.072 1.000 12.17 ATOM 1083 C PRO 146 " -25.292 -32.588 41.972 1.000 13.13 ATOM 1084 O PRO 146 -25.999 -31.712 42.484 1.000 17.39 ATOM 1085 N HIS 147 -25.311 -32.901 40.677 1.000 10.50 ATOM 1086 CA HIS 147 -26.203 -32.215 39.758 1.000 9.69 ATOM 1087 CB HIS 147- -25.865 -32.480 38.279 1.000 14.24 ATOM 1088 CG HIS 147 -26.441 -31.373 37.431 1.000 6.69 ATOM 1089 CD2 HIS 147 -25.875 -30.297 36.850 1.000 5.99 ATOM 1090 ND1 HIS 147 -27.780 -31.296 37,134 1.000' 11.40 ATOM 1091 CE1 HIS 147 -28.018 -30.226 36.391 1.000 11.68 ATOM 1092 NE2 HIS 147 -26.871 -29.600 .36.201 1.000 12.68 ATOM 1093 C HIS 147 -27.658 -32.596 40.013 1.000 5.47 ATOM 1094 O HIS 147 -28.052 -33.761 39.960 1.000 11.15 ATOM 1095 N PRO 148 -28.463 -31.575 40.291 1.000 12.88 ATOM 1096 CD PRO 148 -28.098 -30.148 40.322 1.000 12.98 ATOM 1097 CA PRO 148 -29.877 -31.806 40.602 1.000 13.30 ATOM 1098 CB PRO 148 -30.440 -30.401 40.811 1.000 14.82 ATOM 1099 CG PRO 148 -29.426 -29.455 40.267 1.000 16.64 ATOM 1100 C PRO 148 -30.600 -32.508 39.456 1.000 15.39 ATOM 1101 O PRO 148 -31.525 -33.290 39.689 1.000 15.71 ATOM 1102 N TRP 149 -30.218 -32.263 38.201 1.000 21.29 ATOM 1103 CA TRP 149 -30.909 -32.947 37.109 1.000 15.64 ATOM 1104 CB TRP 149 -30.571 -32.328 35,750 1.000 17.31 ATOM 1105 CG TRP 149 -31.296 -33.043 34.639 1.000 10.06 ATOM 1106 CD2 TRP 149 -32.715 -33.086 34.444 1.000 4.30 ATOM 1107 CE2 TRP 149 -32.952 -33.862 33.295 1.000 8.55 ATOM 1108 CE3 TRP 149 -33.805 -32.541 35.129 1.000 4.24 ATOM 1109 CD1 TRP 149 -30.748 -33.774 33.6291.000 11.09 ATOM 1110 N?1 TRP 149 -31.736 -34.272 32.813 1.000 5.61 ATOM 1111 CZ2 TRP 149 -34.240 -34.107 32.815 1.000 12.36 ATOM 1112 CZ3 TRP 149 -35.076 -32.785 34.654 1.000 13.41 ATOM 1113 CH2 TRP 149 -35.286 -33.563 33.505 1.000 14.13 ATOM 1114 C TRP 149 -30.566 -34.432 37.101 1.000 12.85 ATOM 1115 O TRP 149 -31.447 -35.290 37.033 1.000 7.92 ATOM 1116 N PHE 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154 -32.138 -40.069 37.797 1.000 12.41 ATOM 1153 CA PHE 154 -31.645 -41.349 38.301 1.000 8.75 ATOM 1154 CB PHE 154 -30.113 -41.372 38.348 1.000 8.88 ATOM 1155 CG PHE 154 -29.456 -41.758 37.031 1.000 8.38 ATOM 1156 CD1 PHE 154 -28.597 -40.887 36.384 1.000 9.10 ATOM 1157 CD2 PHE 154 -29.703 -42.990 36.458 1.000- 0.00 ATOM 1158 CE1 PHE 154 -28.000 -41.232 35.188 1.000 9.85 ATOM 1159 CE2 PHE 154 -29.119 -43.344 35.260 1.000 5.02 ATOM 1160 CZ PHE 154 -28.258 -42.468 34.624 1.000 8.39 ATOM 1161 C PHE 154 -32.199 -41.648 39.690 1.000 11.55 ATOM 1162 O PHE 154 -31.683. -42.515 40.400 1.000 10.77 ATOM 1163 N GLU 155 -33.246 -40.936 40.093 1.000 15.11 ATOM 1164 CA GLU 155 -33.898 -41.221 41.367 1.000 19.95 ATOM 1165 CB GLU 155 -35.134 -40.343 41.542 1.000 26.08 ATOM 1166 CG GLU 155 . -35.558 -40.107 42.980 1.000 33.00 ATOM 1167 CD GLU 155 -36.339 -41.267 43.568 1.000 44.51 ATOM 1168 OE1 GLU 155 -37.432 -41.585 43.051 1.000 49.47 ATOM 1169 O?2 GLU 155 -35.862 -41.867 44.558 1.000 61.39 ATOM 1170 C GLÜ 155 -34.270 -42.702 41.449 1.000 18.82 ATOM 1171 O GLU 155 -34.978 -43.212 40.582 1.000 14.49 ATOM 1172 N GLY 156 -33.779 -43.376 42.481 1.000 12-.58 ATOM 1173 CA GLY 156 -33.993 -44.787 42.696 1.000 6.50 ATOM 1174 C GLY 156 -33.061 -45.684 41.914 1.000 12.22 ATOM 1175 O GLY 156 -33.205 -46.914 41.914 1.000 27.90 ATOM 1176 N - GLY 157 -32.082 -45.107 41.224 1.000 9.19 ATOM 1177 CA GLY 157 -31.216 -45.877 40.358 1.000 8.21 ATOM 1178 C GLY 157 -30.007 -46.514 40.991 1.000 8.61 ATOM 1179 O GLY 157 -29.563 -47.579 40.549 1.000 17.22 ATOM 1180 N GLU 158 -29.442 -45.887 42.018 1.000 7.58 ATOM 1181 CA GLU 158 • -28.299 -46.453 42.721 1.000 7.50 ATOM • 1182 CB GLU 158 -27.807 -45.505 43.814 1.000 9.84 ATOM 1183 CG GLÜ 158 -26.756 -46.097 44.739 1.000 11.00 ATOM- 1184 CD GLU 158 -26.031 -45.053 45.564 1.000 24.40 ATOM 1185 OE1 GLU 158 -26.158 -43.845 45.267 1.000 33.57 ATOM 1186 OE2 GLU 158 -25.325 -45.439 46.523 1.000 39.11 ATOM 1187 C GLU 158 -28.696 -47.807 43.302 1,000 13.34 ATOM 1188 O GLU 158 -27.956 -48.787 43.225 1.000 29.78 ATOM 1189 N GLN 159 -29.895 -47.840 43.875 1.000 10.17 ATOM 1190 CA GLN 159 -30.481 -49.058 44.406 1.000 15.50 ATOM 1191 CB GLN 159 -31.856 -48.764 45.017 1.000 19.57 ATOM 1192 CG GLN 159 -32.548 -49.952 45.647 1.000 24.93 ATOM 1193 CD GLN 159 -31.737 -50.676 46.704 1.000 30.24 ATOM 1194 OE1 GLN 159 -31.940 -50.499 47.909 1.000 40.80 ATOM 1195 NE2 GLN 159 -30.800 -51.510 46.265 1.000 20.75 ATOM 1196 C GLN 159 -30.605 -50.132 43.336 1.000 17.89 ATOM 1197 O GLN 159 -30.218 -51.285 43.544 1.000 21.71 ATOM 1198 N L?S 160 -31.154 -49.791 42.168 1.000 15.99 ATOM 1199 CA LYS 160 -31.361 -50.855 41.176 1.000 6.75 ATOM 1200 CB LYS 160 -32.314 -50.369 40.090 1.000 10.24 ATOM 1201 CG LYS 160 -33.666 -49.907 40.607 1.000 6.13 ATOM 1202 CD LYS 160 -34.386 -49.041 39.581 1.000 11.21 ATOM 1203 CE LYS 160 -35.897 -49.190 39.702 1.000 9.55 ATOM 1204 NZ LYS 160 -36.616 -48.235 38.811 1.000 20.37 ATOM 1205 C LYS 160 -30.029 -51.305 40.591 1.000 14.32 ATOM 1206 O LYS 160 -29.842 -52.475 40.257 1.000 14.42 ATOM 1207 N THR 161 -29.082 -50.375 40.465 1.000 10.29 ATOM 1208 CA THR 161 -27.771 -50.734 39.933 1.000 13.43 ATOM 1209 CB THR 161 -26.878 -49.508 39.672 1.000 10.03 ATOM 1210 OG1 THR 161 -27.070 -48.557 40.730 1.000 30.01 ATOM 1211 CG2 THR 161 -27.263 -48.788 38.389 1.000 13.57 ATOM 1212 C THR 161 -27.057 -51.683 40.896 1.000 12.06 ATOM 1213 O THR 161 . -26.160 -52.415 40.481 1.000 6.51 ATOM 1214 N THR 162 -27.457 -51.664 42.165 1.000 8.39 ATOM 1215 CA THR. 162 -26.894 -52.551 43.177 1.000 9.75 ATOM 1216 CB THR 162 -27.286 -52.130 44.604 1.000 12.96 ATOM 1217 OG1 THR 162 -26.705 -50.863 44.941 1.000 11.98 ATOM 1218 CG2 THR 162 -26.735 -53.132 45.605 1.000 20.35 ATOM 1219 C THR 162 -27.349 -53.991 42.956 1.000 10.87 ATOM 1220 O THR 162 -26.764 -54.942 43.471 1.000 12.87 ATOM 1221 ti GLU 163 -28.410 -54.170 42.174 1.000 16.58 ATOM 1222 CA •GLU 163 -28.949 -55.496 41.905 1.000 20.69 ATOM 1223 CB GLU 163 -30.486 -55.450 41.861 1.000 21.36 ATOM 1224 CG GLÜ 163 -31.136 -54.918 43.122 1.000 19.81 ATOM 1225 CD GLU 163 -30.918 -55.799 44.332 1.000 20.57 ATOM 1226 OE1 GLU 163 -30.336 -56.894 44.181 1.000 13.38 ATOM 1227 OE2 GLÜ 163 -31.340 -55.394 45.441 1.000 37.36 ATOM 1228 C GLU 163 -28.455 -56.101 40.596 1.000 12.31 ATOM 1229 O GLU 163" -28.614 • -57.306 40.384 1.000 8.17 ATOM 1230 N LEU 164 -27.880 -55.296 39.710 1.000 14.12 ATOM 1231 CA LEU 164 -27.561 -55.746 38.356 1.000 8.92 ATOM 1232 CB LEU 164 -26.960 -54.602 37.541 1.000 5.54 ATOM 1233 CG LEU 164 -27.903 -53.857 36.593 1.000 10.39 ATOM 1234 CD1 LEU 164 -29.295 -53.740 37.197 1.000 23.43 ATOM 1235 CD2 LEU 164 -27.352 -52.485 36.240 1.000 2.48 ATOM 1236 C LEU 164 -26.621 -56.943 38.361 1.000 6.54 ATOM 1237 O LEU 164 -26.847 -57.925 37.653 1.000 4.26 ATOM 1238 N ALA 165 -25.562 -56.865 39.159 1.000 7.24 ATOM 1239 CA ALA 165 -24.609 -57.965 39.239 1.000 11.41 ATOM 1240 CB ALA 165 -23.542 -57.659 40.276 1.000 11.40 ATOM 1241 C ALA 165 -25.312 -59.284 39.551 1.000 16.26 ATOM 1242 O ALA 165 -24.980 -60.302 38.947 1.000 18.13 ATOM 1243 N ARG 166 -26.266 -59.245 40.469 1.000 20.04 ATOM 1244 CA ARG 166 -27.014 -60.397 40.947 1.000 10.10 ATOM 1245 CB ARG 166 -27.875 -59.992 42.145 1.000 15.40 ATOM 1246 CG ARG 166 -28.600 -61.127 42.843 1.000 15.67 ATOM 1247 CD ARG 166 -29.286 -60.640 44.115 1.000 20.34 ATOM 1248 N? ARG 166 -30.097 -59.453 43.851 1.000 31.99 ATOM 1249 CZ ARG 166 -31.261 -59.505 43.202 1.000 37.46 ATOM 1250 NH1 ARG 166 -31.718 -60.673 42.770 1.000 41.26 ATOM 1251 NH2 ARG 166 -31.974 -58.410 42.979 1.000 44.85 ATOM 1252 C ARG 166 -27.899 -60.991 39.862 1.000 10.33 ATOM 1253 0 ARG 166 -27.862 -62.186 39.569 1.000 11.28 ATOM 1254 N VAL 167 -28.724 -60.143 39.253 1.000 10.14 ATOM 1255 CA VAL 167 -29.647 -60.637 38.231 1.000 8.08 ATOM 1256 CB VAL 167 -30.800 -59.642 '38.007 1.000 12.63 ATOM 1257 CG1 VAL 167 -31.873 -60.262 37.129 1.000 23.15 ATOM 1258 CG2 VAL 167 -31.423 -59.212 39.331 1.000 16.49 ATOM 125.9 C VAL- 167 -28.941 -60.943 36.916 1.000 8.93 ATOM 1260 0 VAL 167 . -29.342 -61.889 36.230 1.000 11.00 ATOM 1261 N TYR 168 -27.906 -60.209 36.507 1.000 6.53 ATOM 1262 CA TYR 168 -27.225 -60.549 35.262 1.000 5.82 ATOM 1263 CB TYR 168 -26.220 -59.494 34.815 1.000 12.35 ATOM 1264 CG TYR 168 -26.746 -58.249 34.148 1.000 10.53 ATOM 1265 CD1 TYR 168 -25.898 -57.415 33.429 1.000 4.25 ATOM 1266 CE1 TYR 168 -26.377 -56.273 32.816 1.000 3.59 ATOM 1267 CD2 TYR 168 -28.085 -57.889 34.230 1.000 9.22 ATOM • 1268 CE2 TYR 168 -28.565 -56.750 33.624 1,000 11.67 ATOM 1269 CZ TYR 168 -27.708 -55.940 32.912 1.000 8.76 ATOM 1270 OH TYR 168 -28.194 -54.801 32.308 1.000 13.56 ATOM 1271 C TYR 168 -26.466 -61.863 35.444 1.000 9.45 ATOM 1272 0 TYR 168 -26.398 -62.696 34.544 1.000 5.20 ATOM 1273 N SER 169 -25.896 -61.972 36.648 1.000 5.94 ATOM 1274 CA SER 169 . -25.145 -63.174 36.999 1.000 11.65 ATOM 1275 CB SER 169 -24.663 -63.109 38.445 1.000 12.52 ATOM 1276 OG SER 169 -23.611 -64.024 38.688 1.000 13.86 ATOM 1277 C SER 169 -26.034 -64.389 36.740 1.000 14.93 ATÓM 1278 0 SER 169 -25.709 -65.240 35.912 1.000 25.35 ATOM 1279 N ALA 170 -27.161 -64.434 37.448 1.000 9.54 ATOM 1280 CA ALA 170 -28.154 -65.483 37.259 1.000 7.33 ATOM 1281 CB ALA 170 -29.397 -65.155 38.069 1.000 3.12 ATOM 1282 C ALA 170 -28.495 -65; 659 35.785 1.000 12.27 ATOM 1283 0 ALA 170 -28.526 -66.772 35.262 1.000 20.56 ATOM 1284 N LEU 171 -28.753 -64.558 35.081 1.000 15.11 ATOM 1285 CA LEU 171 -29.115 -64.661 33.665 1.000 17.04 ATOM 1286 CB LEU 171 -29.329 -63.272 33.076 1.000 13.64 ATOM 1287 CG LEO 171 -29.846 -63.164 31.645 1.000 21.08 ATOM 1288 CD1 LEU 171 -28.692 -63.043 30.658 1.000 45.18 ATOM 1289 CD2 LEU 171 -30.734 -64.340 31.270 1.000 17.34 ATOM 1290 C LEU 171 -28.052 -65.404 32.868 1.000 18.57 ATOM 1291 0 LEO 171 -28.328 -66.409 32.219 1.000 17.64 ATOM 1292 N ALA 172 -26.825 -64.890 32.920 1.000 22.46 ATOM 1293 CA ALA 172 -25.735 -65.489 32.157 1.000 17.47 ATOM 1294 CB ALA 172 -24.454 -64.699 32.377 1.000 10.29 ATOM 1295 C ALA 172 -25.549 -66.953 32.536 1.000 13.15 ATOM 1296 0 ALA 172 -25.192 -67.797 31.713 1.000 17.25 ATOM 1297 N SER 173 -25.802 -67.242 33.809 1.000 11.55 ATOM 1298 CA SER 173 -25.653 -68.595 34.337 1.000 15.80 ATOM 1299 CB SER 173 -25.837 -68.578 35.856 1.000 15.14 ATOM 1300 OG SER .173 -26.298 .-69.837 36.293 1.000 15.66 ATOM 1301 C SER 173 -26.640 -69.565 33.691 1.000 10.39 ATOM" 1302 O SER 173 -26.263 -70.667 33.284 1.000 5.06 ATOM 1303 N PHE 174 -27.882 -69.119 33.601 1.000 6.57 ATOM 1304 CA- PHE 174 -28.970 -69.778 32.908 1.000 4.04 ATOM 1305 CB PHE 174 -30.288 -69.024 33.114 1.000 4.43 ATOM 1306 CG PHE 174 -31.524 -69.765 32.626 1.000 3.57 ATOM 1307 CD1 PHE 174 -32.219 -70.606 33.475 1.000 0.40 ATOM 1308 CD2 PHE 174 -31.988 -69.615 31.331 1.000 11.71 ATOM 1309 CE1 PHE 174 -33.343 -71.281 33.051 1.000 1.63 ATOM 1310 CE2 PHE 174 -33.114 -70.285 30.886 1.000 10.57 ATOM 1311 CZ PHE 174 -33.795 -71.119 31.756 1.000 10.59 ATOM 1312 C PHE 174 -28.701 -69.872 31.408 1.000 8.80 ATOM 1313 O PH? 174 -28.846 -70.949 30.834 1.000 0.14 ATOM 1314 N MET 175 -28.328 -68.751 30.793 1.000 7.91 .ATOM. 1315 CA .MET 175 -28.058 -68.739 29.356 1.000 '5.97 ATOM 1316 CB MET 175 -28.103 -67.321 28.780 1.000 0.00 ATOM 1317 CG MET 175 -29.492 -66.712 28.751 1.000 7.42 ATOM 1318 XD MET 175 -29.573 -65.056 .28.023 1.000 16.37 ATOM 1319 CE MET 175 -30.064 -65.488 26.348 1.000 21.02 ATOM 1320 C MET. 175 -26.715 -69.399 29.045 1.000 6.31 ATOM 1321 O MET 175 -26.332 -69.479 27.880 1.000 8.17 ATOM 1322 N LYS 176 -26.020 -69.872 30.070 1.000 8.77 ATOM 1323 CA LYS 176 -24.762 -70.598 29.939 1.000 10.68 ATOM 1324 CB YS 176 -24.970 -71.945 29.239 1.000 10.45 ATOM 1325 CG LYS 176 -25.907 -72.900 29.971 1.000 3.74 ATOM 1326 CD LYS 176 -25.133 -73.755 30.964 1.000 5.05 ATOM 1327 CE LYS 176 -26.084 -74.568 31.833 1.000 6.09 ATOM 1328 NZ LYS 176 -26.739 -73.721 32.861 1.000 24.38 ATOM 1329 C LYS 176 -23.733 -69.760 29.190 1.000 12.34 ATOM 1330 O LYS 176 -23.084 -70.178 28.231 1.000 24.85 ATOM 1331 N VAL 177 -23.601 -68.520 29.648 1.000 12.09 ATOM 1332 CA VAL 177 -22.709 -67.581 28.953 1.000 12.10 ATOM 1333 CB VAL 177 -23.569 -66.629 28.106 1.000 9.74 ATOM 1334 CG1 VAL 177 -23.831 -65.319 28.835 1.000 18.59 ATOM 1335 CG2 VAL 177 -22.921 -66.372 26.753 1.000 20.30 ATOM 1336 C VAL 177 -21.848 -66.876 29.982 1.000 13.62 ATOM 1337 O VAL 177 -22.292 -66.730 31.126 1.000 20.25 ATOM 1338 K PRO 178 -20.635 -66.454 29.637 1.000 10.56 ATOM 1339 CD PRO 178 -20.019 -66.530 28.312 1.000 2.11 ATOM 1340 CA PRO 178 -19.760 -65.842 30.642 1.000 10.32 ATOM 1341 CB PRO 178 -18.433 -65.656 29.913 1.000 6.70 ATOM 1342 CG PRO 178 -18.623 -66.026 28.499 1.000 0.81 ATOM 1343 C PRO 178 -20.281 -64.483 31.119 1.000 20.65 ATOM 1344 0 PRO 178 -20.796 -63.674 30.351 1.000 22.70 ATOM 1345 N PHE 179 -20.124 -64.253 32.412 1.000 22.55 ATOM 1346 CA PHE 179 -20.474 -63.025 33.107 1.000 19.13 ATOM 1347 CB PHE 179 -21.518 -63.283 34.194 1.000 8.91 ATOM 1348 CG PHE 179 -21.661 -62.215 35.268 1.000 8.12 ATOM 1349 CD1 PHE 179 -22.433 -61.087 35.044 1.000 10.36 ATOM 1350 CD2 PH? 179 -21.031 -62.337 36.499 1.000 2.04 ATOM 1351 CE1 PHE 179 -22.590 -60.103 36.004 1.000 2.43 ATOM 1352 CE2 PHE 179 -21.183 -61.367 37.470 1.000 0.76 ATOM 1353 CZ PHE 179 -21.963 -60.248 37.228 1.000 2.96 ATOM 1354 C PHE 179 -19.231 -62.400 33.736 1.000 13.74 ATOM 1355 0 PHE 179 -18.309 -63.110 34.128 1.000 15.60 ATOM 1356 N PH? 180 -19.214 -61.080 33.838 1.000 14.28 ATOM 1357 CA PHE 180 -18.178 -60.371 34.573 1.000 13.03 ATOM 1358 CB PHE 180 -17.004 -59.952 33.686 1.000 17.94 ATOM 1359 CG PH? 180 -15.933 -59.164 34.433 1.000 21.76 ATOM 1360 CD1 PHE 180 -14.960 -59.807 35.176 1.000 21.38 ATOM 1361 CD2 PHE 180 -15.904 -57.780 34.391 1.000 19.62 ATOM 1362 CE1 PH? 180 -13.979 -59.108 35.859 1.000' 15.07 ATOM 1363 CE2 PHE 180 . -14.941 -57.064 35.075 1.000 21.73 ATOM 1364 CZ PHE 180 -13.979 -57.727 35.816 1.000 21.65 ATOM 1365 C PHE 180 -18.822 -59.164 35.256 1.000 12.16 ATOM 1366 0 PH? 180 -19.594 -58.423 34.648 1.000 11.01 ATOM 1367 N ASP 181 - -18.504 -58.988 36.536 1.000 7.72 ATOM 1368 CA ASP 181 -19.062 -57.864 37.286 1.000 10.61 ATOM 1369 CB ASP 181 -19.521 -58.346 38.659 1.000 5.77 ATOM 1370 CG ASP 181 -19.986 -57.225 39.559 1.000 4.11 ATOM 1371 OD1 ASP 181 -20.116 -56.076 39.092 1.000 8.61 ATOM 1372 OD2 ASP 181 -20.217 -57.508 40.750 1.000 11.49 ATOM 1373 C ASP 181 -18.037 -56.743 37.378 1.000 15.44 ATOM 1374 0 ASP 181 . -17.023 -56.872 38.060 1.000 16.84 ATOM 1375 N ALA 182 -18.293 -55.639 36.672 1.000 18.65 ATOM 1376 CA ALA 182 -17.359 -54.517 36.678 1.000 18.00 ATOM 1377 CB ALA 182 -17.778 -53.459 35.668 1.000 7.66 ATOM 1378 C ALA 182 -17.240 -53.911 38.075 1.000 18.92 ATOM 1379 0 ALA 182 -16.198 -53.340 38.400 1.000 8.61 ATOM 1380 N GLY 183 -18.296 -54.044 38.872 1.000 15.67 ATOM 1381 CA GLY 183 -18.374 -53.516 40.219 1.000 13.53 ATOM 1382 C GLY 183 -17.444 -54.230 41.176 1.000 14.96 ATOM 1383 0 GLY 183 -17.268 -53.846 42.330 1.000 25.31 ATOM 1384 N SER 184 -16.830 -55.306 40.696 1.000 16.38 ATOM 1385 CA SER 184 -15.940 -56.105 41.525 1.000 12.32 ATOM 1386 CB SER 184 -16.009 -57.574 41.116 1.000 14.55 ATOM 1387 OG SER 184 -15.237 -57.867 39.967 1.000 12.36 ATOM 1388 C SER 184 -14.516 -55.572 41.439 1.000 13.33 ATOM 1389 0 SER 184 -13.644 -55.986 42.204 1.000 12.05 ATOM 1390 N VAL 185 -14.276 -54.640 40.515 1.000 9.89 ATOM 1391 CA VAL 185 -12.902 -54.156 40.358 1.00014.54 ATOM 1392 CB VAL 185 -12.320 -54.649 39.021 1.000 16.34 ATOM 1393 CG1 VAL 185 -12.034 -56.141 39.1001.000 13.09 ATOM 1394 CG2 VAL 185 -13.274 -54.346 37,877 1.000 20.34 ATOM 1395 C VAL 185 -12.802 -52.642 40.445 1.000 20.13 ATOM 1396 O VAL 185 -11.718 -52.101 40.6821.000 11.67 ATOM 1397 ti ILE 186 -13.912 -51.929 40.260 1.000 19.83 ATOM 1398 CA IL? 186 -13.905 -50.479 40.381 1.000 13.97 ATOM 1399 CB IL? 186 -13.716 -49.752 39.031 1.000 8.30 ATOM 1400 CG2 XL? 186 -12.362 -50.070 38.428 1.000 12.39 ATOM 1401 CG1 ILE 186 -14.830 -50.005 38.014 1.000 10.45 ATOM 1402 CD1 ILE 186 -14.956 -48.929 36.957 1.000 3.60 ATOM 1403 C ILE 186 -15.209 -49.957 40.979 1.000 13.38 ATOM 1404 0 ILE 186 -16.256 -50.583 40.857 1.000 12.90 ATOM 1405 N SER 187 -15.120 -48.788 41.596 1.000 11.99 ATOM 1406 CA SER 187 -16.287 -48.046 42.052 1.000 9.16 ATOM 1407 CB SER 187 -16.110 -47.594 43.498 1.000 10.88 ATOM. 1408 OG SER 187 -14.889 -46.879 43.658 1.000 16.58 ATOM 1409 C ER 187 -16.517 -46.839 41.1451,000 11.87 ATOM 1410 O SER 187 -15.567 -46.304 40.563 1.000 16.73 ATOM 1411 N THR 188 -17.767 -46.410 41.015 1.00015.17 ATOM 1412 CA THR 188 -18.077 -45.244 40.1891.000 13.51 ATOM 1413 CB THR 188 -19.571 -45.151 39.848 1.000 12.88 ATOM 1414 OG1 THR 188 -19.969 -46.308 39.1011.000 16.33 ATOM 1415 CG2 THR 188 -19.843 -43.943 38.961 1.000 8 .08 ATOM 1416 C THR 188 -17.639 -43.978 40.916 1.000 14.09 ATOM 1417 O THR 188 -18.293 -43.535 41.860 1.000 10.72 ATOM 1418 N ASP 189 -16.518 -43.414 40.474 1.000 15.51 ATOM 1419 CA •ASP 189 -15.911 -42.313 41.210 1.000 11.58 ATOM . 1420 CB ASP 189 -14.407 -42.594 41.362 1.000 12.86 ATOM 1421 CG ASP 189 -14.158 -43.791 42.261 1.000 4.55 ATOM 1422 OD1 ASP 189 -14.915 -43.960 43.2391.000 13.27 ATOM 1423 OD2 ASP 189 -13.208 -44.549 41.989 1.000 6.91 ATOM 1424 C ASP 189 -16.120 -40.949 40.567 1.000 15.34 ATOM 1425 O ASP 189 -15.910 -39.948 41.263 1.000 18.48 ATOM 1426 N GLY 190 -16.510 -40.918 39.303 1.000 19.39 ATOM 1427 CA GLY 190 -16.710 -39.718 38.515 1.000 15.08 ATOM 1428 C GLY 190 -17.385 -38.613 39.303 1.000 18.57 ATOM 1429 O GLY 190 -18.263 -38.908 40.119 1.000 20.64 ATOM 1430 N VAL 191 -16.952 -37.381 39.057 1.000 13.86 ATOM 1431 CA VAL 191 -17.428 -36.226 39.806 1.000 10.59 ATOM 1432 CB VL 191 -16.825 -34.905 39.286 1.000 17.05 ATOM 1433 CG1 VAL 191 -15.324 -34.875 39.559 1.000 30.84 ATOM 1434 CG2 VAL 191 -17.092 -34.701 37.803 1.000 8.10 ATOM 1435 C VAL 191 -18.950 -36.129 39.774 1.000 10.47 ATOM 1436 O VAL 191 -19.542 -35.686 40.761 1.000 13.60 ATOM 1437 N ASP 192 -19.571 -36.534 38.668 1.000 1.46 ATOM 1438 CA ASP 192 -21.018 -36.447 38.540 1.000 0.70 ATOM 1439 CB ASP 192 -21.387 -36.356 37.056 1.000 2.10 ATOM 1440 CG ASP 192 -20.918 -37.566 36.268 1.000 9.82 ATOM 1441 OD1 ASP 192 -20.296 -38.478 36.857 1.000 8.20 ATOM 1442 OD2 ASP 192 -21.182 -37.597 35.047 1.000 6.78 ATOM 1443 C ASP 192 -21.754 -37.622 39.173 1.000 7.73 ATOM 1444 0 ASP 192 -22.988 -37.674 39.136 1.000 7.10 ATOM 1445 N GLY 193 -21.027 -38.572 39.753 1.000 15.10 ATOM 1446 CA GLY 193 -21.631 -39.747 40.351 1.000 17.83 ATOM 1447 C GLY 193 -22.153 -40.758 39.352 1.000 18.93 ATOM 1448 0 GLY 193 . -22.820 -41.732 39.718 1.000 10.12 ATOM 1449 ' N ILE 194 -21.867 -40.565 38.062 1.000 11.77 ATOM 1450 CA IL? 194 -22.330 -41.546 37.081 1.000 7.87 ATOM 1451 CB IL? 194 -23.401 -40.945 36.154 1.000 9.95 ATOM 1452 CG2 IL? 194 -23.790 -41.927 35.063 1.000 0.00 ATOM 1453 CG1 IL? 194 -24.643 -40.441 36.896 1.000 9.90 ATOM 1454 CD1 ILE 194 -25.248 -39.237 36.206 1.000 8.85 ATOM 1455 C ILE 194- -21.191 -42.068 36.225 1.000 2.97 ATOM . 1456 0 ILE 194 -21.086 -43.251 35.924 1.000 6.72 ATOM 1457 N HIS 195 -20.277. -41.195 35.792 1.000 6.33 ATOM 1458 CA HIS 195 -19.256 -41.719 34.884 1.000 10.76 ATOM 1459 CB HIS 195 -19.089 -40.790 33.673 1.000 11.36 ATOM. 1460 CG HIS 195 -20.402 -40.647 32.958 1.000 11.50 ATOM 1461 CD2 HIS 195 -20.981 -41.395 31.989 1.000 5.43 ATOM 1462 ND1 HIS 195 -21.283 -39.633 33.253 1.000 7.30 ATOM 1463 CE1 HIS 195 -22.351 -39.753 32.485 1.000 9.11 ATOM 1464 N?2 HIS 195 -22.192 -40.814 31.711 1.000 8.18 ATOM 1465 C HIS 195 -17.918 -41.941 35.577 1.000 8.63 ATOM 1466 O HIS 195 -17.762 -41.602 36.743 1.000 13.71 ATOM 1467 N PH? 196 -17.010 -42.529 34.812 1.000 6.37 ATOM ' 1468 CA PHE 196 -15.725 -43.017 • 35.249 1.000 9.06 ATOM 1469' CB PHE 196 -15.233 -44.136 34.320 1.000 5.38 ATOM 1470 CG PHE 196 -16.048 -45.412 34.451 1.000 10.20 ATOM 1471 CD1 PHE 196 -15.822 -46.481 33.602 1.000 8.01 ATOM 1472 CD2 PHE 196 -17.027 -45.509 35.427 1.000 6.21 ATOM 1473 CE1 PHE 196 -16.571 -47.637 33.722 1.000 11.17 ATOM 1474 CE2 PHE 196 -17.779 -46.662 35.546 1.000 14.06 ATOM 1475 CZ PHE 196 -17.549 -47.727 34.694 1.000 13.03 ATOM 1476 C PHE 196 -14.663 -41.925 35.273 1.000 12.92 ATOM 1477 O PHE 196 -14.757 -40.983 34.494 1.000 15.16 ATOM 1478 N THR 197 -13.694 -42.112 36.158 1.000 13.17 ATOM 1479 CA THR 197 -12.477 -41.318 36.183 1.000 17.95 ATOM 1480 CB THR 197 -11.886 -41.168 37.593 1.000 20.94 ATOM 1481 OG1 THR 197 -11.650 -42.458 38.173 1.000 20.14 ATOM 1482 CG2 THR 197 -12.882 -40.454 38.499 1.000 31.55 ATOM 1483 C THR 197 -11.443 -41.978 35.269 1.000 10.26 ATOM 1484 O THR 197 -11.713 -43.037 34.705 1.000 14.53 ATOM 1485 N GLU 198 -10.283 -41.362 35.133 1.000 9.05 ATOM 1486 CA GLÜ 198 -9.192 -41.943 34.362 1.000 12.89 ATOM 1487 CB GLÜ 198 -8.023 -40.960 34.314 1.000 20.40 ATOM 1488 CG GLU 198 -6.903 -41.349 33.362 1.000 32-.30 ATOM 1489 CD GLÜ 198 -5.764 -40.346 33.328 1.000 35.77 ATOM 1490 OE1 GLU 198 -5.127 -40.141 34.385 1.000 42.59 ATOM 1491 O?2 GLU 198 -5.498 -39.761 32.256 1.000 25.40 ATOM 1492 GLU 198 -8.779 -43.279 34.970 1.000 16.23 ATOM 1493 O GLU 198 -8.636 -44.296 34.2&2 1.000 14.85 ATOM 1494 N ALA 199 -8.596 -43.284 36.291 1.000 11.36 ATOM 1495 CA ALA 199 -8.233 -44.489 37.022 1.000 5.99 ATOM 1496 CB ALA 199 -8.047 -44.154 38.499 1.000 2.34 ATOM 1497 C ALA 199 -9.273 -45.594 36.873 1.000 7.89 ATOM 1498 O ALA 199 -8.922 -46.767 36.748 1.000 16.70 ATOM 1499 N ASN 200 -10.548 -45.210 36.897 1.000 13.48 ATOM 1500 CA ASN 200 -11.644 -46.155 36.715 1.000 11.59 ATOM 1501 CB ASN 200 -13.007 -45.474 36.805 1.000 4.12 ATOM 1502 CG ASN 200 -13.492 -45.192 38.209 1.000 11.67 ATOM 1503 OD1 ASN 200 -13.045 -45.767 39.2001.000 6.19 ATOM 1504 ND2 ASN 200 -14.455 -44.276 38.330 1.000 13.74 ATOM 1505 C ASN 200 -11.505 -46.869 35.366 1.000 8.88 ATOM 1506 O ASN 200 -11.667 -48.084 35.305 1.000 9.08 ATOM 1507 N ASN 201 -11.208 -46.111 34.315 1.000 14.48 ATOM 1508 CA ASN 201 -11.074 -46.639 32.963 1.000 14.27 ATOM 1509 CB ASN 201 -10.903 -45.495 31.960 1.000 16.17 ATOM 1510 CG ASN 201 -12.221 -44.853 31.570 1.000 14.25 ATOM 1511 OD1 ASN 201 -13.050 -45.436 30.871 1.000 13.77 ATOM 1512 ND2 ASN 201 -12.441 -43.624 32.021 1.000 16.01 ATOM 1513 C ASN 201 -9.908 -47.620 32.870 1.000 12. 95 ATOM 1514 O ASN 201 -10.050 -48.720 32.334 1.000 11.02 ATOM 1515 N ARG 202 -8.775 -47.207 33.412 1.000 15.80 ATOM 1516 CA ARG 202 -7.571 -48.020 33.532 1.000 14.85 ATOM 1517 CB ARG 202 -6.491 -47.250 34.294 1.000 17.85 ATOM 1518 CG ARG 202 -5.109 -47.874 34.325 1.000 17.66 ATOM 1519 CD ARG 202 -4.141 -47.026 35.143 1.000 19. 69 ATOM 1520 N? ARG 202 -3.646 -45.881 34.388 1.000 30.64 ATOM 1521 CZ ARG 202 -2.410 -45.407 34.412 1.000 36.54 ATOM 1522 NH1 ARG 202 -1.470 -45.972 35.164 1.000 35.38 ATOM 1523 NH2 ARG 202 -2.093 -44.353 33.669 1.000 23.31 ATOM 1524 C ARG 202 -7.862 -49.344 34.229 1.000 6.52 ATOM 1525 O ARG 202 -7.636 -50.401 33.644 1.000 9.98 ATOM 1526 N ASP 203 -8.365 -49.285 35.464 1.000 3.83 ATOM 1527 CA ASP 203 -8.597 -50.500 36.237 1.000 12.72 ATOM 1528 CB ASP 203 -9.148 -50.181 37.631 1.000 9.96 ATOM 1529 CG ASP 203 -8.170 -49.370 38.458 1.000 16.04 ATOM 1530 OD1 ASP 203 -6.980 -49.324 38.086 1.000 18. 66 ATOM 1531 OD2 ASP 203 -8.584 -48.772 39.474 1.000 22.09 ATOM 1532 C ASP 203 -9.548 -51.455 35.524 1.00018.07 ATOM 1533 0 ASP 203 -9.383 -52.674 35.579 1.000 12.38 ATOM 1534 N LEU 204 -10.550 -50.890 34.859 1.000 23.73 ATOM 1535 CA LEU 204 -11.541 -51.706 34.169 1.000 21.34 ATOM 1536 CB LEU 204 -12.745 -50.872 33.727 1.000 26.39 ATOM 1537 CG LEU 204 -14.123 -51.510 33.908 1.000 26.92 ATOM 1538 CD1 LEU 204 -15.079 -51.066 32.809 1.000 10.26 ATOM 1539 CD2 LEU 204 -14.019 -53.027 33.942 1.000 35.07 ATOM 1540 C LEU 204 -10.938 -52.392 32.948 1.000 10.64 ATOM 1541 0 LEU 204 -11.212 -53.567 32.707 1.000 16.23 ATOM 1542 N GLY 205 . -10.143 -51.649 ~32.189 1.000 8.26 ATOM 1543 CA GLY 205 -9.534 -52.173 30.984 1.000 6.27 ATOM 1544 C GLY -205 -8.472 -53.215 31.265 1.000 8.34 ATOM 1545 O GLY 205 -8.228 -54.094 30.436 1.000 9.21 ATOM 1546 N VAL 206 -7.829 -53.130 32.425 1.000 • 8.74 ATOM 1547 CA VAL 206 -6.833 -54.135 32.796 1.000 9.33 ATOM 1548 CB VAL 206 -5.942 -53.653 33.957 1.000 16.14 ATOM 1549 CG1 VAL 206 .-5.020 -54.754 34.457 1.000 6.58 ATOM 1550 CG2 VAL 206 -5.124 -52.445 33.514 1.000 6.33 ATOM 1551 C VAL 206 -7.526 -55.447 33.154 1.000 5.34 ATOM 1552 0 VAL 206 -7.118 -56.498 32.664 1.000 5.68 ATOM 1553 N ALA 207 -8.564 -55.384 33.982 1.000 4.56 ATOM 1554 CA ALA 207 -9.349 -56.547 34.369 1.000 6.39 ATOM 1555 CB ALA 207 -10.323 -56.180 35.490 1.000 0.79 ATOM 1556 C • ALA 207 -10.144 -57.160 33.219 1.000 10.03 ATOM 1557 0 ALA 207 -10.485 -58.346 33.261 1.000 13.69 ATOM 1558 N LEU 208 -10.471 -56.382 32.193 1.000 14.72 ATOM 1559 CA LEU 208 -11.278 -56.888 31.082 1.000 11.49 ATOM- 1560 CB LEU 208 -12.065 -55.755 30.422 1.000 12.04 ATOM 1561 CG LEU 208 -13.325 -55.317 31.175 1.000 10.97 ATOM 1562 CD1 LEU 208 -13.985 -54.127 30.497 1.000 18.17 ATOM 1563 CD2 LEU 208 -14.302 -56.477 31.290 1.000 17.03 ATOM 1564 C LEU 208 -10.391 -57.604 30.067 1.000 6.10 ATOM 1565 0 LEU 208 -10.857 -58.502 29.369 1.000 15.12 ATOM 1566 N ALA 209 -9.132 -57.191 30.019 1.000 10.78 ATOM 1567 CA ALA 209 -8.103 -57.815 29.203 1.000 16.00 ATOM 1568 CB ALA 209 -6.827 -56.992 29.220 1.000 18.55 ATOM 1569 C ALA 209 -7.829 -59.238 29.694 1.000 19.15 ATOM 1570 0 ALA 209 -7.639 -60.143 28.882 1.000 13.89 ATOM 1571 N GLÜ 210 -7.822 -59.396 31.015 1.000 9.97 ATOM 1572 CA GLU 210 -7.645 -60.692 31.653 1.000 11.15 ATOM 1573 CB GLU 210 -7.535 -60.520 33.168 1.000 •21.07 ATOM 1574 CG GLÜ 210 -6.097 -60.365 33.647 1.000 39.63 ATOM 1575 CD GLÜ 210 -5.696 -58.921 33.860 1.000 47.94 ATOM 1576 OE1 GLÜ 210 -5.958 -58.391 34.960 1.000 64.71 ATOM 1577 OE2 GLU 210 -5.097 -58.319 32.949 1.000 43.70 ATOM 1578 C GLU 210 -8.791 -61.634 31.308 1.000 10.80 ATOM 1579 O GLU 210 -8.589 -62.787 30.927 1.000 10.93 ATOM 1580 N GLN 211 -10.007 -61.120 31.441 1.000 10.29 ATOM 1581 CA GLN 211 -11.190 -61.871 31.035 1.000 17.12 ATOM 1582 CB GLN 211 -12.443 -61.052 31.363 1.000 15.73 ATOM 1583 CG GLN 211 -12.542 -60.709 32.844 1.000 19.97 ATOM 1584 CD GLN 211 -12.936 -61.923 33.671 1.000 20.12 ATOM 1585 OE1 GLN 211 -13.886 -62.628 33.331 1.000 17.44 ATOM •1586 N?2 GLN 211 -12.218 -62.166 34.759 1.000 12.84 ATOM 1587 C GLN 211 -11.146 -62.237 29.556 1.000 19.66 ATOM 1588 O GLN 211 -11.399 -63.384 29.170 1.000 12.73 ATOM 1589 N VAL 212 -10.822 -61.287 28.679 1.000 17.48 ATOM 1590 CA VAL 212 -10.785 -61.612 27.249 1.000 19.02 ATOM 1591 CB VAL 212 -10.426 -60.369 26.415 1.000 14.47 ATOM 1592 CG1 VAL 212 -10.189 -60.744 24.958 1.000 15.00 ATOM 1593 CG2 VAL 212 -11.527 -59.320. 26.523 1.000 8.88 ATOM 1594 C VAL 212 -9.816 -62.745 26.936 1.000 23.29 ATOM 1595 O VAL 212 -10.192 -63.735 26.294 1.000 25.62 ATOM 1596 N ARG 213 -8.557 -62.645 .27.361 1.000 21.16 -ATOM 1597 CA ARG 213 -7.617 -63.740 27.126 1.000 22.08 ATOM 1598 CB ARG ' 213 -6.251 -63.462 27.752 1.000 19.45 ATOM 1599 CG ARG 213 -5.577 -62.178 27.300 1.000 20.41 ATOM 1600 CD ARG 213 -4.621 -61.690 28.380 1.000 26.40 ATOM 1601 NE ARG 213 -3.847 -60.527 27.952 1.000 29.86 ATOM" 1602 CZ ARG 213 -3.556 -59.504 28.745 1.000 26.00 ATOM 1603 NH1 ARG 213 -3.968 -59.485 30.007 1.000 15.34 ATOM 1604 NH2 ARG 213 -2.847 -58.491 28.268 1.000 17.74 ATOM 1605 C ARG 213 -8.157 -65.052 27.695 1.000 21.76 ATOM 1606 O ARG 213 -7.893 -66.138 27.182 1.000 28.34 ATOM 1607 N SER 214 -8.924 -64.952 28.780 1.000 15.76 ATOM 1608 CA SER 214 -9.486 -66.151 29.389 1.000 15.09 ATOM 1609 CB SER 214 -10.043 -65.824 30,781 1.000 19.35 ATOM 1610 OG SER 214 -11.053 -66.745 31.144 1.000 46.77 ATOM 1611 C SER 214 -10.561 -66.790 28.529 1.000 15.48 ATOM 1612 O SER 214 -10.692 -68.016 28.535 1.000 24.87 ATOM 1613 N LED 215 -11.355 -66.030 27.772 1.000 21.40 ATOM 1614 CA LEO 215 -12.367 -66.673 26.938 1.000 21.52 ATOM 1615 CB LEU 215 -13..655 -65.855 26.860 1.000 22.40 ATOM 1616 CG LEU 215 -14.176 -65.153 28.103 1.000 20.48 ATOM 1617 CD1 LEU 215 -15.071 -63.990 27.697 1.000 27.15 ATOM 1618 CD2 L?U 215 -14.931 -66.118 29.006 1.000 13.10 ATOM 1619 C LEU 215 -11.884 -66.920 25.510 1.000 20.60 ATOM 1620 O LEU 215 -12.536 -67.682 24.789 1.000 31.41 ATOM 1621 N LEU 216 -10.790 -66.303 25.077 1.000 21.43 ATOM 1622 CA LEU 216 -10.291 -66.503 23.718 1.000 19.55 ATOM 1623 CB LEU 216 -10.114 -65.148 23.021 1.000 19.47 ATOM 1624 CG LED 216 -11.385 -64.305 22.870 1.000 16.11 ATOM 1625 CD1 LEU 216 -11.095 -63.042 22.076 1.000 17.60 ATOM 1626 CD2 LEU 216 -12.495 -65.108 22.211 1.000 4.00 ATOM 1627 C LEU 216 -8.983 -67.283 23.688 1.000 24.37 ATOM 1628 OT1 LEU 216 -8.472 -67.525 22.571 1.000 29.22 ATOM 1629 OT2 LEU 216 -8.463 -67.655 24.758 1.000 19.02 Además de las determinaciones descritas en lo anterior, también se produce y analiza un cristal de perhidrolasa inhibido con carbamato. En estos experimentos se utiliza un derivado de N-hexilcarbamato de perhidrolasa natural. Se titula la perhidrolasa natural (14.5 mg en 1 ml de amortiguador NaP04 67 mM, pH 7) a temperatura ambiente con alícuotas de 1.25 µl de N-hexilcarbamato de p-nitrofenilo 400 mM disuelto en DMSO. Se mide la actividad de perhidrolasa con el ensayo de butirato de p-nitrofenilo (véase ejemplo 2) como una función del tiempo después de cada adición del inhibidor. Se requieren varias adiciones durante varias horas para completar la inhibición de la enzima. Después de que se completa la inhibición, el amortiguador de la solución de enzima inhibida se cambia por HEPES 10 mM, pH 8.3. Esta solución se almacena a -80 °C hasta que se utiliza para llevar a cabo experimentos de cribado por cristalización como se describe en lo anterior. Se prepara el inhibidor N-hexilcarbamato de p-nitrofenilo por métodos conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Hosie et al . , J. Biol, Chem., 262:260-264
[1987]). Brevemente, la perhidrolasa inhibida por carbamatos se cristaliza por difusión de vapor utilizando un método de goteo colgante conocido en la técnica. Una solución de ml de la perhidrolasa inhibida (15 mg/ml en HEPES 10 mM, pH 8.2) se mezcla con 4 µl de una solución de depósito (PEG- 4000 30%, con sulfato de litio 0.2 M y Tris 0.1 M, pH 8.5) en un cubreobjetos de plástico, después se invierte y sella para - un pozo de una placa 6x4 Limbro que contiene 0.5 ml de la solución de depósito y se permite que se equilibre. Los cristales se forman en los siguientes días . Los cristales se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido y se analizan como se describe en lo anterior. Aunque el octámero nativo se determina en el grupo de espacio P4 con dimensiones de celda unitaria: a = 98.184 b = 98.184 y c = 230.119 = 90.00 ß = 90.00, ? = 90.00, este cristal difracta a aproximadamente 2.0Á. El cristal inhibido por carbamato crece en el grupo de espacio Pl con dimensiones de celda unitaria a = 67.754, b = 80.096 y c = 85.974 = 104.10°, ß = 112.10° y ? = 97.40° y estos cristales difractan a una resolución que excede de 1.0Á. El carbamato se une de una manera que aprovecha las interacciones entre el oxígeno ceto del carbamato y los residuos que forman el orificio del oxianión, los átomos de N amida de Ser 11 y Ala 55 y Asn 94 ND2. La cadena lateral hidrofóbica se extiende a lo largo de la superficie hidrofóbica del sitio de unión hacia fuera, dentro de la abertura de superficie entre los pares de dímeros en la estructura octamérica. La dirección de la porción carbamato aclara el papel pivotal de la mutación S54V. La porción hidrofóbica pasa adyacente a la cadena lateral de ser 54. La mutación del lado serina a valina incrementa la hidrofobicidad y también sirve como un mantenedor de compuerta para evitar que los nucleófilos hidrofílicos (por ejemplo agua) compitan con los nucleófilos desacilantes deseados. Los residuos T que rodean a la porción carbamato en la misma molécula o en moléculas vecinas forman una entrada extendida y se espera que altere la selección del nucleófilo desacilante óptimo. Además, los residuos con átomos de cadena lateral accesibles a la superficie se identifican utilizando el programa "AreaMol" dentro del paquete de programa CCP4. La tabla 15-1 incluye estos residuos. En esta tabla, el número de residuo, nombre de residuo, número de átomos de la cadena lateral accesibles a la superficie que tienen por lo menos 10.0 átomos cuadrados de área superficial accesible y el área superficial máxima (ángstrom cuadrados) para cualquier átomo de cadena lateral dentro de dicho residuo (o los residuos CA para GLY) en la estructura octamérica de perhidrolasa se proporcionan.
EJEMPLO 16 Eliminación de manchas En este ejemplo se describen experimentos realizados para determinar las capacidades de eliminación de manchas de la perhidrolasa. Se utilizan pozos individuales de placas de cultivo de 24 pozos para imitar las condiciones que se encuentran en las lavadoras comunes . Cada pozo se llena con detergente disponible comercialmente (por ejemplo Ariel [Procter & Gamble] , WOB [AATCC] y WFK [WFK] ) y se agregan discos de tela ensuciados previamente, los cuales se colocan dentro de cada pozo. La temperatura y agitación se llevan a cabo al colocar la placa en el interior de un incubador/agitador de laboratorio común. Para medir la eficacia de blanqueado de la perhidrolasa, se utiliza tela manchada con té (EMPA #167, disponible comercialmente de Test Fabrics) . En cada pozo se coloca un único disco de tela y se agrega 1 ml de detergente líquido que contiene enzima, sustrato de éster y peróxido. Después de agitación a 100-300 rpm, aproximadamente a 20-60°C, se retiran los discos de tela, se enjuagan con agua corriente y se permite que sequen durante la noche. Se mide la reflectancia de cada disco de tela individual y se gráfica como un valor "L" . En la figura 21 se proporcionan estos resultados los cuales muestran que la adición de la perhidrolasa de la presente invención al detergente proporciona de manera consistente un mayor grado de blanqueado en comparación con los detergentes solos. En esta figura, el término "E" indica los resultados para cada uno de los detergentes probados combinados con la perhidrolasa de la presente invención. EJEMPLO 17 Blanqueado de algpdón En este ejemplo se describen experimentos para determinar el uso de la perhidrolasa de la presente invención para blanqueado de telas de algodón. En estos experimentos se tratan seis recortes de algodón por_ recipiente a 55 °C durante 60 minutos en un equipo Launder-O-meter. Los sustratos utilizados en estos experimentos son 3 7.6 cm x 7.6 cm (3"X3") 428U y 3 7.6 cm x 7.6 cm (3"X3" ) 400U para experimentos. Se prueban dos tipos diferentes de tela de algodón no blanqueadas 100% a partir de Testfabrics (estilo 428U (satín de algodón cargado armado sin apresto pero sin blanquearse) ; y estilo 400U (prenda impresa de algodón sin apresto pero sin blanquear) . La proporción de licores es de aproximadamente 26 a 1 (-7.7 g de tela/~200 ml de volumen de licor) . La resina perhidrolasa se prueba a 12.7 mgP/ml, con acetato de etilo (3% (v/v) ) , peróxido de hidrógeno (1500 ppm) y Tritón X-100 (0.001%) en un amortiguador de fosfato de sodio 100 mM para pH 7 y pH 8; así como amortiguador de carbonato de sodio 100 mM para pH 9 y pH 10. Los efectos blanqueadores se cuantifican con una diferencia total de color al tomar cuatro valores CIÉ" L*a*b* por cada recorte antes y después de los tratamientos utilizando el equipo Chroma Meter CR-200 (Monolta) y se calcula la diferencia de color total de los recortes después de los tratamientos, de acuerdo con lo siguiente: Diferencia de color total ( E) = (?L + Aa + Ab ) en donde L, a y b son las diferencias en los valores CIÉ L* , CIEa* y CIEb*, respectivamente, antes y después de los tratamientos) . Valores más grandes de E indican efectos blanqueadores mayores. Los resultados (véase la figura 22) indican que la perhidrolasa muestra efectos blanqueadores mejorados de manera significativa en ambos tipos de telas de algodón 100% a pH 7 y pH 8 bajo las condiciones probadas. También se observó que desaparecen grandes cantidades de manchas (por ejemplo puntos pigmentados) en los sustratos tratados con enzima. EJEMPLO 18 Comppsicipnes de Detergentes En este ejemplo se describen los experimentos realizados para determinar la capacidad de blanqueado de lino de la perhidrolasa de la presente invención. Se utilizan los mismos métodos y condiciones a las descritas en lo anterior en ls pruebas de algodón (en el ejemplo 17) para probar recortes de lino. Como se indica en lo anterior, se llevaron a cabo experimentos en un equipo Launder-O-meter utilizando tela de lino (lino preparado, estilo L-53; Testfabrics) . En este experimento se tratan 3 recortes de lino 10 cm x 10 cm (4"x4") con 12.7 mgP/ml de la enzima perhidrolasa con acetato de etilo (3% v/v) , peróxido de hidrógeno (1200 ppm) y Tritón X-100 (0.001%) en un amortiguador de fosfato de sodio 100 mM para pH 7 y pH 8. Se calcularon los efectos de blanqueado como se describe en lo anterior, en el ejemplo 17. La figura 23 proporciona una gráfica que muestra los efectos blanqueadores de la perhidrolasa de la presente invención, probada a pH 7 y pH 8 sobre lino. EJEMPLO 19 Composiciones Detergentes En el siguiente ejemplo se presentan ejemplos de diversas composiciones detergentes. En estas formulaciones, las concentraciones de enzimas se expresan como enzima pura por peso de la composición total y, a menos que se especifique de otro modo, los ingredientes detergentes se expresan en peso respecto a las composiciones totales. Las identificaciones abreviadas de los componentes en la presente tienen los siguientes significados : LAS : Alquilbencensulfonato lineal de 11 a 13 átomos de carbono, de sodio. TAS : Seboalquil sulfato de sodio. CxyAS : Sulfato de alquilo de Clx - Cly de sodio. CxyEz : Alcohol primario predominantemente lineal de Clx - Cly condensado con un promedio de z moles de óxido de etileno. CxyAEzS : Alquilsulfato de sodio de Clx - Cly condensado con un promedio de z moles de óxido de etileno. El nombre de molécula agregado en los ej emplos . o iónico : Alcohol graso mixto etoxilado/propoxilado, por ejemplo Plurafac LF404 que es un alcohol con un grado promedio de etoxilación de 3.8 y un grado promedio de propoxilación de 4.5 QAS R2 . N+ (CH3) 2 (C2H40H) con R2 = C12-C14. Silicato Silicato de sodio amorfo (proporción de SÍ02 : Na20 = 1 . 6-3 . 2 : 1) . Metasilicato Metasilicato de sodio . (proporción de Si02:Na20 = 1.0) . Zeolita A Aluminosilicato hidratado de fórmula Na12 (A102Si02)12.27H20. SKS-6 Silicato estratificado cristalino de fórmula d-Na2Si205. Sulfato Sulfato de sodio anhidro. STPP Tripolifosfato de sodio. MA/AA Copolímero aleatorio de 4:1 de acrilato/maleato, peso molecular promedio de aproximadamente 70,000-80,000. AA Polímero de poliacrilato de sodio de peso molecular promedio de 4,500. Policarboxilato Copolímero que comprende una mezcla de monoméros carboxilados tales como acrilato, maleato y acrilato de metilo con un MW que varía entre 2,000-80,000 tales como Sokolan disponible comercialmente de BASF, que es un copolímero de ácido acrílico, MW 4,500.
BB1 Sulfonato de 3- (3 , 4-dihidroisoquinolinio) propano . BB2 1- (3 ,4-dihidroisoquinolinio) -decano-2- sulfato PB1 Perborato de sodio monohidratado. PB4 Perborato de sodio tetrahidratado de fórmula nominal NaB03.4H20. Percarbonato Percarbonato de sodio de fórmula nominal 2Na2C03.3H202. TAED Tetraacetiletilendiamina. NOBS Sulfonato de nonanoiloxibenceno en forma de sal de sodio. DTPA Ácido dietilentriamino pentaacético. HEDP Ácido 1, 1-hidroxietandifosfónico. DETPMP Fosfonato de dietiltriaminapent (metileno) comercializado por Monsanto bajo el nombre comercial de Dequest 2060. EDDS Ácido etilendiamino-N,N' -disuccínico, isómero (S,S) en forma de su sal de sodio. Diamina Dimetilaminopropilamina; 1,6- hexanodiamina; 1, 3-propanodiamina; 2- metil-1, 5-pentanodiamina; 1,3- pentanodiamina; 1-metildiaminopropano .
DETBCHD Diclorhidrato de 5 , 12-dietil-l, 5 , 8 , 12- tetraazabiciclo [6,6,2] hexadecano, sal de. Mn(II) . PAAC Sal de- cobalto (III) de acetato de pentaamina Parafina Aceite de parafina vendido bajo el nombre comercial Winog 70 por Wintershall. Sulfonato de Un aceite o cera de parafina en el cual parafina parte de los átomos de hidrógeno han sido sustituidos por grupos sulfonato. Aldosa Enzima oxidasa vendida bajo el nombre oxidasa comercial Aldose Oxidase por Novozymes A/S Galactosa Galactosa oxidasa de Sigma. oxidasa Proteasa Enzima proteolítica vendida bajo el nombre comercial Savinase, Alcalase, Everlase por Novo Nordisk A/S y lo siguiente a partir de Genencor International, Inc.: "Protease A" descrita en US RE 34,606 en las figuras 1A, IB y 7, y en la columna 11, líneas 11- 37; "Protease B" descrita en E.U.A. 5,955,340 y E.U.A. 5,700,676 en las figuras 1A, IB y 5 así como la tabla 1; y la "protease C" descrita en el documento de E.U.A. 6,312,936 y E.U.A. 6,482,628 en las figuras 1-3 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3] y en la columna 25, línea 12, "la protease D" es la variante 101G/103A/104I/159D/232V/236H/245R/248D/252K (numeración BPN' ) descrita en WO 99/20723.
Amilasa Enzima amilolítica vendida bajo el nombre comercial Purafact^ Ox AM descrita en WO 94/18314, WO 96/05295 vendida por Genencor; Natalase", Termamyl^, Fungamyl101 y Duramyl101, todas disponibles de Novozymes A/S . Lipasa Enzima lipolítica vendida bajo el nombre comercial Lipolase Lipolase Ultra por Novozymes A/S y Lipomax por Gist-Brocades.
Celulasa Enzima celulítica vendida bajo el nombre comercial Carezyme, Celluzyme y/o Endolase por Novozymes A/S . Pectina Pectaway1'11 y Pectawashm disponible de liasa Novozyme A/S . PVP Polivinilpirrolidona con un peso molecular promedio de 60,000. PVNO N-óxido de polivinilpiridina, con un peso molecular promedio de 50,000.
PVPVI Copolímero de vinilimidazol y vinilpirrolidona, con un peso molecular promedio de 20,000. Abrillantador 4,4' -bis (2-sulfostiril)bifenil disódico.
Silicona Controlador de espuma de antiespumante polidimetilsiloxano con un copolímero de siloxano-oxialquileno como agente dispersante con una proporción del controlador de espuma respecto al agente dispersante de 10:1 a 100:1. Supresor de Silicona 12%/sílice, alcohol estearílico lodos 18%, almidón 70% en forma granular. SRP 1 Poliésteres rematados en los extremos aniónicamente . PEG X Polietilenglicol de un peso molecular de x.
PVP Keo" Homopolímero de vinilpirrolidona (MW promedio 160,000. Jeffaminem Polietilenglicol rematado de Huntsman. ED-2001 Isachem1 AS Un sulfato de alquilo de alcohol ramificado de Enichem. MME PEG Monometiléterpolietilenglicol (MW 2000) de (2000) Fluka Chemie AG.
DC3225C : Supresor de lodos de silicona, mezcla de aceite de silicona y sílice de Dow Corning. TEPAE : Etoxilato de tetraetilenpentamina. BTA : Benzotriazol. Betaína : (CH3)3N+CH2COO~. Azúcar : D-glucosa de grado industrial o azúcar de grado alimenticio. CFAA : Alquil-N-metilglucamida de 12 a 14 átomos de carbono . TPKFA : Ácidos grasos cortados en su totalidad y rematados, de 12 a 14 átomos de carbono.
Arcilla : Un silicato de aluminio hidratado en una fórmula general Al203Si02.xH20. Tipos; caolinita, montmorillonita, atapulgita, ilita, bentonita y haloisita. MCAEN Esteres en la fórmula de R1Ox [ (R2) m(Rr3) p pH : Medido como una solución 1% en agua destilada a 20°C.
EJEMPLO 20 Detergentes líquidos de lavandería Se preparan las siguientes composiciones detergentes líquidas de lavandería de la presente invención.
EJEMPLO 21 Comppsiciones detergentes líquidas para lavado manual de trastes Se preparan las siguientes composiciones detergentes líquidas para lavado manual de trastes, de la presente invención.
El pH de las composiciones (I) - (V) es de aproximadamente 8 a aproximadamente 11.
EJEMPLO 22 Detergente líquido para lavatrastes automáticp Se preparan las siguientes composiciones de detergentes líquidas para trastes automático: EJEMPLO 23 Composicipnes de lavandería Se preparan las siguientes composiciones de lavandería de la presente invención, las cuales se pueden preparar en forma de granulos o comprimidos .
* Perfume/colorante, abrillantador/SRPl/Carboximetilcelulosa de Na/fotoblanqueador/MgS04/PVPVl/supresor de lodos/PEG de peso molecular alto/arcilla. **MCAEM se selecciona del grupo que consiste de E25 Acetato de C ^-9 - C l ' [C12H2SN (CH3) (CH2CH2OAc) 2] + cr ( CH3) 2NCH2CH,OCH2CH,OAc mezclas de los mismos.
EJEMPLO 24 Detergentes líquidos de lavandería Se preparan las siguientes formulaciones de detergente líquido para lavandería de la presente invención.
EJEMPLO 25 Detergentes compactos de alta densidad para lavatrastes Se preparan los siguientes detergentes para lavado de trastes de alta densidad, compactos, de la presente invención *Abrillantador/colorante/SRPl/Carboximetilcelulosa de Na/Fotoblanqueador/MgS04/PVPVl/Supresor de lodos/PEG de peso molecular alto/Arcilla.
El pH de las composiciones (I) a (VI) es de aproximadamente 9.6 a aproximadamente 11.3. EJEMPLO 26 Comppsicipnes detergentes en cpmprimidps Se preparan las siguientes composiciones de detergentes en comprimidos de la presente invención, por compresión de una composición detergente granular para lavado de -trastes a una presión de 13 KN/cm2 utilizando una prensa giratoria de 12 cabezas, estándar.
* Abrillantador/Colorante/SRPl/Carboximetilcelulosa de Na/Fotoblangueador/MgS04/pVPVI/Supresor de lodos/PEG de peso molecular alto/Arcilla El pH de las composiciones (I) a 7 (VIII) es de aproximadamente 10 a aproximadamente 11.5. El peso del comprimido de las composiciones 7(1) a 7 (VIII) es de aproximadamente 20 gramos a aproximadamente 30 gramos .
EJEMPLO 27 Detergentes líquidos limpiadores de superficies duras Se preparan las siguientes composiciones detergentes limpiadoras líquidas para superficies duras de la presente invención. 10 El pH de estas composiciones (I) a (VII) es de aproximadamente -j_5 7.4 a aproximadamente 9.5.
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas de los niveles de aquellos 20 expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Todas las patentes y publicaciones se incorporan en la presente como referencia en la misma medida en que si cada publicación individual fuera indicada específica e individualmente como incorporada como referencia. 5 Habiendo descrito las modalidades preferidas de la presente invención, será evidente para aquellos habitualmente expertos en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones a las modalidades descritas y que dichas modificaciones se pretende que estén dentro del alcance de la 5..- presente invención. Aquellos expertos en la técnica apreciarán fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionadas, así como aquellas inherentes a la misma. Las 0 composiciones y métodos descritos en la presente son representativos de las modalidades preferidas, son ejemplares y no se pretende que sean limitaciones del alcance de la invención. Esto es evidente con facilidad para una persona experta en la técnica en donde se pueden realizar diversas sustituciones y modificaciones de la invención descrita en la presente sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. La invención descrita de manera ilustrativa en la presente de manera adecuada se puede llevar a la práctica en ausencia de algún elemento o elementos, limitación o limitaciones las cuales no estén descritas específicamente en la presente . Los términos y expresiones los cuales se han empleado, se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención de que el uso de dichos términos y expresiones o la exclusión de cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, sino que se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención que se reclama. Por lo tanto, debe entenderse que aunque la presente invención se ha descrito específicamente por modalidades preferidas y características opcionales, la modificación y variación de los conceptos descritos en la presente se puede clasificar de otra manera por aquellos expertos en la técnica y que dichas modificaciones y variaciones se considera que están dentro del alcance de esta invención, como se define por las reivindicaciones anexas. La invención se ha descrito de manera general y genérica en la presente. Cada una de las especies más definidas y los agrupamientos subgenéricos se encuentran dentro de la descripción genérica también forman parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa de remover cualquier materia objeto del género, sin importar o no si el material separado se menciona específicamente en la presente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (144)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito- la invención como antecede, se reclama como propieadd lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una perhidrolasa aislada, caracterizada porque la perhidrolasa presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de 1.
2. La perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la perhidrolasa es perhidrolasa de M. smegmatis .
3 . Una perhidrolasa aislada, caracterizada porque la perhidrolasa es por lo menos aproximadamente 35% homologa a la perhidrolasa de M. smegmatis de conformidad con la reivindicación 2.
4. La perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizada porque la perhidrolasa comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2.
5. Una perhidrolasa aislada, caracterizada porque tiene reactividad cruzada inmunológica con la perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 2.
6. La perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la perhidrolasa es por lo menos una porción de la perhidrolasa de M. smegma tis, en donde la perhidrolasa tiene una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor que 1.
7. La perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la perhidrolasa es un homólogo estructural de la perhidrolasa de M. smegmatis, en la cual el sitio activo es homólogo a por lo menos un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Sil, D192 y H195 de la perhidrolasa de M. smegmatis .
8. Una variante de perhidrolasa aislada, caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácidos que compreden por lo menos una modificación de un aminoácido realizada en una posición equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2.
9. La variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque por lo menos una modificación se realiza en la posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en donde el aminoácido modificado se selecciona del grupo que consiste de Cys7, AsplO, Serll, Leul2, Thrl3, Trpl4, Trplß, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thrß4, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Vall25, Prol38, Leul40, Prol46, Prol48, Trpl49, Phel50, Ilel53, Phel54, Thrl59, Thrl86, Ilel92, Ilel94 y Phel96.
10. La variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 8, --caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de: Ml, K3, R4, 15, L6, C7, DIO, Sil, L12, T13, W14, W16, G15, V17, P18, V19, D21, G22, A23, P24, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, V32, R33, W34, T35, G36, L38, Q40, Q41, D45, L42, G43, A44, F46, E47, V48, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, 160, D61, D62, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, G70, A71, S72, Y73, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, D85, L86, V87, N94, D95, T96, K97, Y99F100, R101, R102, P104, L105, D106, 1107, A108, L109, GllO, Mili, S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P146, P148, W149, F150, 1153, F154, 1194 y F196.
11. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio de hidrólisis de perácido en comparación con la perhidrolasa natural.
12. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el cambio en hidrólisis de perácido es una disminución.
13. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el cambio en hidrólisis de perácido es un incremento.
14. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.1 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural.
15. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste dé R4, L12, G15, P18, R27, W34L38, A44, E51, G52, L53, S54, T58, R67, L68, S72, A79, T80, D85, L86, V87, N94, K97, R101, V118, L119, G124, G126 e 1194.
16. La variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.2 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural.
17. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en la posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de R4, 15, DIO, L12, W14, G15, P18, V19, T25, R27, 34, L38, A44, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T58, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S72, S76, C77, A79, T80, D85, L86, V87, N94, K97, R101, L82, P83, L86, V87, N94, T96, FlOO, R101, L109, Mili, L114, V118, L119, A122, G124, G126, T127, Y129, 149 e 1194.
18. La variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.3 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural.
19. La variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en la posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de R4, 15, DIO, L12, W14, G15, L12, P18, V19, G22, A23, T25, E26, 34, G36, L38, Q41, L42, G43, A44, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, N59, T58, D62, T64, D65, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94, T96, K97, Y99, FlOO, R101, R102, P104, L109, GllO, Mili, L114, V118, L119, A122, G124, V125, G126, T127, Y129, W149, F154 e 1194.
20. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.4 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural.
21. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de R4, 15, L6, DIO, Sil, L12, W14, G15, W16, P18, V19, G22, A23, T25, E26, R27, F28, W34, T35, G36, L38, Q41, L42, G43, A44, D45, E47, 149, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, T58, 160, D62, T64, D65, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, S76, C77, A79, T80, L82, P83, D85, L86, V87, N94,_P66, T96, K97, Y99, FlOO, R101, R102, P104, 1107, L109, GllO,"" Mili, S112, L114, V118, L119, S121, A122, G124, V125, G126, T127, Y129, W149, F150, F154, 1194 y F196.
22. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.5 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural.
23. La variante de perhidrolasa, de conformidad - con la reivindicación 22, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN. NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, GllO, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, R51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, FlOO, R101, L109, Mili, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, GllO, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, 14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, GllO, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.
24. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0 . 6 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural.
25. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, GllO, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, R51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, FlOO, R101, L109, Mili, L114, L119, 149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, GllO, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, GllO, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, 1107, 1194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, Mili, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, Sil, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, V125, V19, W16, Y129, Y73, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.
26. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.7 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural.
27. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, GllO, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, 34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, FlOO, R101, L109, Mili, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, GllO, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, - 14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, -E51, F150, F196, F28, GllO, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, 1107, 1194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, Mili, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, Sil, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, 149, 15, 160, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y73, Y99, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.
28. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.8 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural.
29. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, GllO, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, 149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, FlOO, R101, L109, Mili, L114, L119, 149, Yld29, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, GllO, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, 14, 149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, GllO, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, 149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7 , D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, 1107, 1194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, Mili, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, Sil, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, 149, 15, 160, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, Wl_6, Y129, Y99, A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C77, D45, D61, D65, D85, D95, E47, E51, F150, F196, F46, GllO, G126, G36, G43, G52, 1107, 1194, 149, 15, 160, 189, L114, L42, L53, L68, L78, L84, Mili, N59, N94, P146, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, R101, R4, S112, S121, S72, T116, T120, T127, T13, T57, T96, V113, V125, V17, V19, V32, V87, W149, Y129, Y73, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 y L216.
30. La variante de perhídrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido de aproximadamente 1.5 o mayor, en comparación con la perhidrolasa natural.
31. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A122, A23," A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, GllO, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, 1194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, 15, LIO, L12, W14, V19, T25, W34, 149, E50, R51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, FlOO, R101, L109, Mili, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, GllO, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, 149, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, GllO, G124, G36, G43, G52, G70, 1107, 15, 160, L109, L119, L53, L6, L68, L82, Mili, P104, P66, R102, R67, Sil, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, 1107, 1194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, Mili, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, Sil, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, 149, 15, 160, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, 16, Y129, Y99, A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C77, D45, D61, D65, D85, D95, E47, E51, F150, F196, F46, GllO, G126, G36, G43, G52, 1107, 1194, 149, 15, 160, 189, L114, L42, L53, L68, L78, L84, Mili, N59, N94, P146, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, R101, R4, S112, S121, S72, T116, T120, T127, T13, T57, T96, V113, V125, V17, V19, V32, V87, 149, Y129 e Y73, Y99, A108, A44, C7, DIO, D106, D61, D85, E26, E51, FlOO, F28, F46, GllO, G22, G36, G43, G52, G70, 1107, 1153, 149, 15, 189, K3, L105, L53, L6, L78, L86, Ml, N69, P104, P146, P18, P24, P30, P83, Q117, Q40, Q41, R102, R27, R33, R4, S121, S72, S76, T120, T128, T13, T35, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, 34, G190, V191, G193, T197, E198, A199, R202, D203, G205, V206, A209, E210, Q211, S214 y L215.
32. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta una proporción de hidrólisis de perácido entre aproximadamente 1.2 y aproximadamente 1.5, en comparación con la perhidrolasa natural.
33. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, C7, D106, D31, D61, D85, E26, E50, E51, FlOO, F150, F28, f46, GllO, G126, G22, G70, 1107, K3, L105, L42, L6, L78, Mili, N59, N69, P104, P146, P148, P18, P30, P63, Q117, Q40, Q41, R102, R27, R33, R4, S54, S76, T116,T120, T128, T64, T80, T96, V113, V115, V118, W34 e Y73.
34. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en la perhidrólisis, de manera que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de por lo menos aproximadamente 1.2.
35. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de C7, DIO, L12, G15, P18, V19, G22, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, G36, Q40, Q41, L42, G43, A44, D45, F46, E47, 149, E51, L53, S54, A55, T57, D61, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, A71, S72, Y73, S76, L78, A79, T80, L82, P83, D85, L86, D95, K97, R101, T103, P104, L105, D106, 1107, L109, Mili, V113, A117, V118, S121, G124, V125, G126, T127, P148, F150, 1153, F154 y F196.
36. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.8 o menos.
37. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C7, C77, DIO, D106, D21, D45, D61, D62, D65, D85, E26, E47, E50, E51, FlOO, F150, F154, F196, F28, F46, GllO, G124, G126, G15, G22, G36, G52, G70, 1107, 1153, 1194, 149, 15, 160, 189, K3, K97, L105, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L6, L68, L78, L82, L84, K86, Ml, Mili, N59, N94, P146, P18, P24, P30," P66, P83, Q40, Q41, R101, R102, R27, R33, R4, R56, R67, Sil, S112, S54, S72, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T25, T35, T57, T64, T80, T96, V113, V115, V118, 125, V17, V19, V32, V48, V87, W13, W149, W16, W34, Y129, Y73 e Y99.
38. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C7 , C77, DIO, D106, D21, D31, D45, D61, D62, D65, D85, E26, E47, E50, E51, FlOO, F150, F154 , F196, F28, F46, GllO, G124, G126, G15, G22, G36, G43, G52; G70, 1107, 1153, 1194, 149, 15, 160, 189, K3, K97, L105, L109, L114 , L119, L12, L38, L42, L53, L6, L68, L78, L82, L84, L86, Ml, Mili, N59, N69, N94, P104, P146, P148, P18, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, Q40, Q41, R101, R102, R27, R33, R4 , R56, R67, Sil, S112 , S121, S54 , S72, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T25, T35, T57, T58, T64, T80, T96, V113, V115, V118, V125, V17, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, 34, Y129, Y73 y Y99.
39. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en la perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural está entre aproximadamente 1.2 y aproximadamente 2.
40. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución .en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que. consiste de C7, DIO, L12, G15, P18, V19, G22, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, G36, Q40, Q41, L42, G43, A44, D45, F46, E47, 149, E51, L53 , S54, A55, T57, D61, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, A71, S72, Y73, S76, L78, A79, T80, L82, P83, D85, L86, D95, K97, R101, T103, P104, L105, D106, 1107, L109, Mili, V113 , Q117, V118, S121, G124, V125, G126, T127, P148, F150, 1153, F15 , F196, G190, E198, A199, R202, D203, V206, A209, E210, Q211 y V212.
41. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural está entre aproximadamente 2- y aproximadamente 2.5.
42. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis "que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A44, C7, DIO, D85, D95, E26, E47, 1107, L12, L42, P104, P148, S54, Q40, Q117, Q203, V206, E210.
43. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal-que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural está entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 3.
44. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegma tis que comprende la secuencia de aminoácidos . que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A44, C7, 1107, K97, L12,.L78, P104, Q40 y V125-.
45. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural está entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 5.
46. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a _una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de DIO, D85, L53, L78 y S54.
47. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en la perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.1 o menos.
48. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en - la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, S149, W16 y W34.
49. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.2 o menos .
50. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4 , R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, 1 , 149, 16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4 , R56, S112, S54, T127, T13 , T35, T64, T80, T96, V118, V48, 149, 16, W34, Y129 y Y73.
51. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.3 o menos .
52. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4 , R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, 1 , 149, 16, 34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3 , K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94 , P146, P18, R102, R33, R , R56, S112, S54; T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, 34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, 149, W16, W34 y Y129.
53. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.4 o menos.
54. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, 14, 149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, 149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, 14, 149, 16, W34, Y129, A55, C77, E51, FlOO, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97," L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R5"6, S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19 y V87.
55. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.5 o menos.
56. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, ' 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, 14, W149, W16, W34, A108, Á23; A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, 16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L-114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, RS6, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, 14, W149, W16, W34, Y129, A55, C77, E51, FlOO, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56,S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, DIO, D23, E26, E50, E51, F150, GllO, G126, G15, G36, 1107, 149, 15, K97, L109 ,L119, L12, L38, L6, L68, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, 34 e Y129.
57. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.6 o menos.
58. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en "donde por - lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, 34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, RS6, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, 149, W16, 34, Y129, A55, C77, E51, FlOO, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56,S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, DIO, D23, E26, E50, E51, F150, GllO, G126, G15, G36, 1107, 149, 15, K97, L109 ,L119, L12, L38, L6, L68, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34, Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, G126, G36, G52, 1107, 15, 189, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, W149 y Y73.
59. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa natural es de aproximadamente 0.7 o menos.
60. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, W34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, RS6, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, 16, W34, Y129, A55, C77, E51, FlOO, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56,S112, S54, S72, S76-, T120, T127", " T13, T25, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, DIO, D23, E26, E50, E51, F150, GllO, G126, G15, G36, 1107, 149, 15, K97, L109 ,L119, L12, L38, L6, L68, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4, R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, W34 y Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, gl26, G36, G52, 1107, 15, 189, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, W149, Y73, A122, A23, A29, A71, A79, C7, D61, D62, D85, E26, E51, FlOO, F28, F46, GllO, G126, G52, G70, 1107, 149, 15, 160, 189, L109, L114, L12, L38, L68, L82, L86, Mili, N59, N94, P83, R102, R33, R4, 8112, S72, S76, T103, T116, T128, T25, T35, T57, T58, T64, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73 e Y99.
61. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un cambio en perhidrólisis, de manera tal que la proporción de perhidrólisis de la perhidrolasa variante con respecto a la perhidrólisis de la perhidrolasa de tipo silvestre es de aproximadamente 0.8 o menos.
62. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A23, A55, DIO, D62, F150, F196, F28, GllO, G52, G70, 1107, 1194, 15, K97, L12, L53, L6, L86, N94, P83, R102, R4, R56, Sil, S54, T120, T13, T25, T80, V115, V19, V32, V48, V87, W14, W149, W16, W34, A108, A23, A55, D62, F150, F154, GllO, G22, G52, G70, 1194, K3, "K97, L105, L12, L38, L53, L68, L84, N59, N94, P146, P18, R102, R33, R4, R56, S112, S54, T127, T13, T35, T64, T80, T96, V118, V48, W149, W16, 34, Y129, Y73, A122, A23, A44, C7, DIO, D62, F150, GllO, G22, G70, 1153, 1194, 160, 189, K97, L114, L119, L12, L38, L6, L68, L82, Mili, N94, P146, Q41, R102, R27, R4, RS6, Sil, S54, T120, T13, T25, T35, T80, V48, W14, W149, 16, W34, Y129, A55, C77, E51, FlOO, F150, F154, GllO, G126, G22, 1194, 189, K97, L114, L84, N59, P146, P83, R102, R27, R33, R4, R56,S112, S54, S72, S76, T120, T127, T13, T2S, T57, T96, V118, V125, V19, V87, A23, A55, DIO, D23, E26, E50, E51, F150, GllO, G126, G15, G36, 1107, 149, 15, K97, L109 ,L119, L12, L38, L6, L68, L84, L86, Mili, N59, P146, P24, Q40, R101, R102, R27, R33, R4 , R56, S112, S72, S76, T127, T25, T35, T80, T96, V115, V32, V87, 34 y Y129, A108, A44, A55, D21, D62, F150, gl26, G36, G52, 1107, 15, 189, L109, L114, L119, L12, L42, L53, L6, L68, L78, L84, P146, P24, P66, P83, R27, S112, S72, S76, T120, T127, T13, T35, T57, T58, T80, T96, V115, V118, V32, V48, V87, W149, Y73, A122, A23, A29, A71, A79, C7, D61, D62, D85, E26, E51, FlOO, F28, F46, GllO, G126, G52, G70, 1107, 149, 15, 160, 189, L109, L114, L12, L38, L68, L82, L86, Mili, N59, N94, P83, R102, R33, R4, S112, S72, S76, T103, T116, T128, T25, T35, T57, T58, T64, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73, Y99, A108, A122, A29, A55, C77, DIO, D106, D45, D61, D62, D65, D85, E47, E50, FlOO, F150, F28, F46, GllO, G124, G126, G15, G36, 1153, 1194, 15, 160, 189, K3, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L42, L68, L84, L86, Ml, N59, P24, P30, P38, R101, R27, R4, R56, S112, S54, S76, T103, T116, T120, T127, T128, T13, T35, T64, V113, V17, V19, V32, V48, V87, Y129, Y73 y Y99.
63. Una variante de perhidrolasa caracterizada porque la variante presenta una actividad de perhidrólisis mayor y una actividad de hidrólisis de perácido disminuida en comparación con la perhidrolasa natural.
64. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa presenta una proporción de actividad de perhidrólisis de por lo menos aproximadamente 1.2 y una proporción de actividad de de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.8 o menos, en comparación con la perhidrolasa natural.
65. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A29, A44, A55, A71, A79, C7, DIO, D106, D31, D85, E26, E47, F150, F154, F196, F28, G124, G126, G36, G43, 1153, L109, L42, L53, L109, L42, L53, L109, L42, L53, L68, L82, L86, Mili, N69, P104, P148, P18, P63, P66, P83, Q117, Q40, R101, R67, S54, S121, S72, S76, T25, T64, V115 y V19.
66. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la perhidrolasa presenta una proporción de actividad de perhidrólisis de por lo menos aproximadamente 1.2, una proporción de actividad de hidrólisis de perácido de aproximadamente 0.8 o menos y una proporción de proteína de por lo menos 0.5, en comparación con la perhidrolasa natural.
67. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A29, A44, A55, A71, A79, C7, D85, E26, E47, E51, F150, F154, F196, F28, G124, G126, G36, 1153, L109, L12, L53, L68, L82, Mili, N69, P104, P148, P18, P63, P66, P83, Q117, Q40, R101, R67, S121, S54, S72, S76, T25, T64, V125 y V19.
68. Una variante de perhidrolasa caracterizada porque la perhidrolasa variante presenta un incremento en la expresión de dicha variante de perhidrolasa, en comparación con la expresión de una perhidrolasa natural.
69. La variante de perhidrolasa, de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la modificación comprende por lo menos una sustitución en una posición de aminoácido equivalente a una posición en la perhidrolasa de M. smegmatis que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en donde por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de A2, 15, C7, F8, Sil, L12, T13, W14, W16, V17, P18, V19, E20, 022, A23, P24, T25, A29, P30, V32, T35, G36, V37, A39, F46, E47, S54, A55, R56, T58, 160, D61, D62, P63, T64, P66, R67, L68, N69, G70, S72, Y73, L74, P75, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, L86, 189, T93, T96, K97, A98, Y99, FlOO, RlOl, R102, T103, P104, L105, D106, 1107, A108, L109, GllO, S112, V113, Lll4, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P130, P132, K133, L135, V136, S138, P141, L142, A143, M145, H147, W149, F150, Q151, 1153, G157, Q159, T161, T162, L164, A165, R166, V167, Y168, A170, L171, A172, M175, K176, P178, A182, G183, S184, V185, 1186, T188, 1194, F196, V191, N201, L208, A209, Q211, Q213, S214, L215 y L216.
70. Una proteína aislada,- caracterizada porque comprende un homólogo de perhidrolasa de M. smegmatis , en donde el homólogo es una proteína dentro de la familia de proteínas de SGNH-hidrolasa.
71. Una proteína aislada caracterizada porque tiene por lo menos aproximadamente 35% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la perhidrolasa de M. smegmatis, en la cual la proteína comprende por lo menos tres ácidos que se seleccionan del grupo que consiste de L6, W14 , 34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, GllO, L114 , L135, F180, G205, Sil, D192 y H195.
72. Una proteína aislada caracterizada porque tiene por lo menos aproximadamente 38% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la perhidrolasa de M. smegmatis, en donde la proteína presenta actividad de perhhidrólisis .
73. Un homólogo de perhidrolasa de M. smegmatis , caracterizado porque el homólogo es una perhidrolasa que comprenden por lo menos un motivo que se selecciona del grupo que consiste de GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT.
74. El homólogo de conformidad con la reivindiación 72, caracterizado porque el homólogo presenta perhidrólisis .
75. El homólogo de conformidad con la reivindiación 72, caracterizado porque el homólogo presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 1.
76. El homólogo de conformidad con la reivindiación 72, caracterizado porque el homólogo da reacción cruzada inmunológica con los anticuerpos generados contra la perhidrolasa de M. smegmatis .
77. El homólogo de conformidad con la reivindiación 72, caracterizado porque los anticuerpos generados contra el homólogo dan reacción cruzada con la perhidrolasa de M. smegmatis.
78. Una proteína aislada, caracterizada porque tiene por lo menos aproximadamente 35% de identidad con la secuencia de aminoácidos de por lo menos un homólogo de perhidrolasa de M. smegmatis , en donde la proteína presenta actividad de perhidrólisis.
79. Una proteína aislada, caracterizada porque tiene actividad de perhidrolasa, en donde la proteína está en forma de un multímero en solución.
80. La proteína aislada de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque la proteína es una perhidrolasa que comprende un dímero.
81. La proteína aislada de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque la proteína es una perhidrolasa que comprende un octámero .
82. Una proteína aislada caracterizada porque tiene actividad de perhidrolasa, en donde la proteína está en forma de una solución y la proteína se selecciona del grupo que consiste de _ perhidrolasa de M. smegmatis, homólogos de perhidrolasa de M. smegmatis y variantes de perhidrolasa de M. smegmatis.
83. La proteína aislada de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de serina hidrolasas modificadas o cisteína hidrolasas modificadas en donde las serina hidrolasas modificadas o las cisteína hidrolasas modificadas comprenden actividad aumentada de perhidrolasa en comparación con las serina hidrolasas no modificadas o las cisteína hidrolasas no modificadas.
84. Una proteína aislada, caracterizada porque tiene actividad de perhidrolasa en donde la proteína comprende por lo menos un motivo que se selecciona del grupo que consiste de GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT.
85. La proteína aislada de conformidad con la reivindicación 84, caracterizada porque la proteína se obtiene de un miembro de Rhizobiales.
86. La proteína aislada de conformidad con la reivindicación 84, caracterizada porque la proteína se obtiene de un miembro del género Mycobacterium.
87. Un gen aislado caracterizado porque se identifica utilizando por lo menos un cebador que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 21-69.
88. Un método para identificar una perhidrolasa, caracterizado porque comprende las etapas de: a) identificar una fuente de la perhidrolasa; b) analizar la fuente para identificar secuencias que comprenden por lo menos un motivo que se selecciona del grupo que consiste de GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT; c) expresar las secuencias identificadas en la etapa b) para producir la perhidrolasa; y d) probar la perhidrolasa para determinar actividad de perhidrólisis .
89. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la etapa de análisis es una etapa de amplificación en donde se utilizan las secuencias cebadoras establecidas en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 21-69 para amplificar dichas secuencias que comprenden por lo menos un motivo que se selecciona del grupo que consiste de GDSL-GRTT, GDSL-ARTT, GDSN-GRTT, GDSN-ARTT y SDSL-GRTT.
90. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la fuente se selecciona del grupo que consiste de fuentes ambientales y fuentes metagenómicas .
91. La proteína, caracterizada porque se identifica utilizando el método de conformidad con la reivindicación 88.
92. Una secuencia aislada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para la proteína de conformidad con la reivindicación 91.
93. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la proteína presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 1.
94. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la proteína presenta una actividad de perhidrólisis que es por lo menos aproximadamente 0.2, en comparación con la actividad de perhidrólisis presentada por la perhidrolasa de M. smegmatis.
95. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la proteína comprende por lo menos tres residuos que se seleccionan del grupo que consiste de L6, 14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, GllO, L114, L135, F180, G205, Sil, D192 y H195.
96. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la etapa de análisis comprende investigar por lo menos una base de datos de aminoácidos.
97. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la etapa de análisis comprende investigar por lo menos una base de datos de ácido nucleico para identificar secuencias de ácido nucleico que codifiquen para las secuencias de aminoácidos de la perhidrolasa.
98. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la fuente se selecciona del grupo que consiste de fuentes ambientales y fuentes metagenómicas.
99. Una secuencia aislada de ácido nucleico, caracterizada porque está codificada por las proteínas de conformidad con la reivindicación 96.
100. Una secuencia aislada de ácido nucleico caracterizada porque se identifica utilizando el método de conformidad con la reivindicación 96,
101. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la proteína presenta una proporción de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 1.
102. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la proteína presenta una actividad de perhidrólisis que es por lo menos aproximadamente 0.2 en comparación con la actividad de perhidrólisis presentada por la perhidrolasa de M. smegmatis .
103. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la proteína comprende por lo menos tres residuos que se seleccionan del grupo que consiste de L6, 14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, GllO, L114, L135, F180, G205, Sil, D192 y H195, como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2.
104. Una perhidrolasa variante, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la perhidrolasa variante tiene una especificidad de sustrato alterada en comparación con la perhidrolasa de M. smegma tis natural.
105. La perhidrolasa variante de conformidad con la reivindicación 104, caracterizada porque la variante tiene una actividad alterada de caproato de para nitrofenilo (PNC) en comparación con la perhidrolasa de M. smegma tis natural.
106. La perhidrolasa variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la perhidrolasa variante tiene un pl alterado en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural.
107. La perhidrolasa variante de conformidad con la reivindicación 106, caracterizada porque la perhidrolasa variante comprende por lo menos una mutación cargada positivamente .
108. La perhidrolasa variante de conformidad con la reivindicación 106, caracterizada porque la perhidrolasa variante comprende por lo menos una mutación cargada negativamente .
109. La perhidrolasa variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante tiene una estabilidad aumentada, en comparación con la perhidrolasa de M. smegmatis natural.
110. La perhidrolasa variante de conformidad con la reivindicación 109, caracterizada porque la estabilidad se selecciona del grupo que consiste de termoestabilidad, estabilidad enzimática y estabilidad química.
111. La perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante presenta por lo menos una propiedad de superficie alterada.
112. La perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 111, caracterizada porque la variante comprende mutaciones en por lo menos una sustitución en los sitios que se seleccionan del grupo que consiste de los residuos que se establecen en la tabla 15-1.
113. La perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la perhidrolasa es una perhidrolasa variante que tiene por lo menos una propiedad mejorada en comparación con la perhidrolasa natural.
114. Un vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia polinucleotídica que codifica para la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 113.
115. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 114.
116. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque el hospedador se selecciona del grupo que consiste del género Bacillus, género Streptomyces, género Escherichia y género Pantoea .
117. Una perhidrolasa, caracterizada porque se produce por la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 116.
118. Una composición caracterizada porque comprende por lo menos una porción de la perhidrolasa aislada de conformidad con la reivindicación 1.
119. La composición de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la perhidrolasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2.
120. La composición de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la perhidrolasa es codificada por la secuencia polinucleotídica que se estable en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1.
121. La secuencia polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la secuencia comprende por lo menos una porción de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1.
122. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 121.
123. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 122.
124. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 123, caracterizada porque el hospedador se selecciona del grupo que consiste del género Bacillus, género Streptomyces, género Escherichia y género Pantoea .
125. Una perhidrolasa, caracterizada porque se produce por la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 124.
126. Una perhidrolasa variante, caracterizada porque la perhidrolasa comprende por lo menos una sustitución que corresponde a las posiciones de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, y en donde la perhidrolasa variante tiene un mejor funcionamiento en por lo menos una propiedad, en comparación con la perhidrolasa de M. smegma tis natural.
127. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica que: (i) tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, o (ii) es capaz de hibridizar con una sonda derivada de la secuencia nucleotídica que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, bajo condiciones de rigurosidad intermedia a elevada, o (iii) es complementario a la secuencia nucleotídica que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1.
128. Un vector, caracterizado porque comprende al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 127.
129. Una célula hospedadora caracterizada porque está transformada con el vector de conformidad con la reivindicación 128.
130. Un polinucleótido caracterizado porque comprende una secuencia complementaria a por lo menos una porción de la secuencia que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1.
131. Un método para producir una enzima que tiene actividad de perhidrolasa, caracterizado porque comprende: (a) transformar una célula hospedadora en un vector de expresión que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1; (b) cultivar la célula hospedadora transformada bajo condiciones adecuadas para que la célula hospedadora produzca la perhidrolasa; y (c) recuperar la perhidrolasa.
132. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste de las especies Streptomyces, Pantoea , Escherichia y Bacillus .
133. Una sonda, caracterizada porque comprende una secuencia de 4 a 150 polinucleótidos, sustancialmente idéntica a un fragmento correspondiente de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, en donde la sonda se utiliza para detectar una secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima que tiene actividad de perhidrolasa.
134. Una composición limpiadora, caracterizada porque comprende : a) por lo menos 0.0001 por ciento en peso de la perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 1; b) una molécula que comprende una porción éster; y c) opcionalmente, un ingrediente adyuvante.
135. Una composición limpiadora, caracterizada porque comprende : a) por lo menos 0.0001 por ciento en peso de la perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 1; b) un material que se selecciona del grupo que consiste de una fuente de peroxígeno, peróxido de hidrógeno y mezclas de los mismos, la fuente de peroxígeno se selecciona del grupo que consiste de: i. una persal; ii. un peroxiácido orgánico; iii. un peróxido de hidrógeno y urea; iv. una mezcla de carbohidrato y carbohidrato oxidasa; y v. mezclas de los mismos; c) de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50 por ciento en peso de una molécula que comprende una porción éster; y d) opcionalmente, un ingrediente adyuvante.
136. Una composición limpiadora, caracterizada porque comprende : a) de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 1 por ciento en peso de la perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 8; b) un material que se selecciona del grupo que consiste de una fuente de peroxígeno, peróxido de hidrógeno y mezclas de los mismos, en donde la fuente de peroxígeno se selecciona del grupo que consiste de: vi. una persal; vii. un peroxiácido orgánico; viii. un peróxido de hidrógeno y urea; ix. una mezcla de carbohidrato y carbohidrato oxidasa; y x. mezclas de los mismos; c) de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50 por ciento en peso de una molécula que comprende una porción éster; d) opcionalmente, un ingrediente adyuvante.
137. La composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 136, caracterizada porque la composición comprende un ingrediente adyuvante.
138. La composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque el ingrediente adyuvante se selecciona del grupo que consiste de tensioactivos, mej oradores de detergencia, agentes quelantes, agentes que inhiben la transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas y estabilizantes de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueador, refuerzos de blanqueador, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de eliminación/antirredeposición de suciedad o arcilla, abrillantadores, supresores de lodos, tintes, perfumes, agentes elastificantes de estructura, suavizante de telas, portadores, hidrotropos, auxiliares de procesamiento, pigmentos y mezclas de los mismos.
139. La composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque: a) la perhidrolasa presenta una proporción molar de perhidrólisis a hidrólisis que es mayor de aproximadamente 0.1; b) la persal se selecciona del grupo que consiste de perborato de metal alcalino, percarbonato de metal alcalino, perfosfatos de metal alcalino, persulfatos de metal alcalino y mezclas de los mismos; c) el carbohidrato se selecciona del grupo que consiste de monocarbohidratos, dicarbohidratos, tricarbohidratos, oligocarbohidratos y mezclas de los mismos; d) la carbohidrato oxidasa se selecciona del grupo que consiste de aldosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.9), galactosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.9), celobiosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.25), piranosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.10), sorbosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.11) hexosa oxidasa (IUPAC clasificación EC.1.1.3.5), glucosa oxidasa (IUPAC clasificación EC1.1.3.4) y mezclas de las mismas; y e) la molécula comprende una porción éster que tiene la fórmula: R1Ox[R)R2)m)R3)n]p (i) en donde R1 es una porción que se selecciona del grupo que consiste de H, las formas sustituida o no sustituida de alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; (ii) cada R2 es una porción alcoxilato; (iii) R3 es una porción formadora de éster que tiene la fórmula: R4CO- en donde R4 es H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; (iv) x es 1 cuando R1 es H; cuando R1 no es H, x es un número entero que es igual o menor que el número de carbonos en R1; (v) p es un número entero que es igual o menor que x; (vi) m es un número entero de 0 a 50; y (vii) n es por lo menos 1.
140. La composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 139, caracterizada porque: a) R1 es una porción alquilo o heteroalquilo sustituida o no sustituida de 2 a 32 átomos de carbono; b) cada R2 es independientemente una porción etoxilato o propoxilato; y c) m es un número entero de 1 a 12.
141. La composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 140, caracterizada porque R3 es una porción formadora de éster que tiene la fórmula: R4CO- en donde R4 es: a) una porción alquilo, alquenilo o alquinilo sustituida o no sustituida que comprende de 1 a 22 átomos de carbono; o b) una porción arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo o heteroarilo sustituida o no sustituida que comprende de 4 a 22 átomos de carbono.
142. La composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque la molécula comprende la porción éster que tiene la fórmula: en donde : a) R1 es H o una porción que comprende una porción amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria, la porción R1 que comprende una porción amina se selecciona del grupo que consiste de las formas sustituida o no sustituida de alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; b) cada R2 es una porción alcoxilato; c) R3 es una porción formadora de éster que tiene la fórmula: R4C0- en donde R4 puede ser H, la forma sustituida o no sustituida de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo y heteroarilo; d) x es 1 cuando R1 es H, cuando R1 no es H, x es un número entero que es igual o menor que el número de carbonos en R1; e) p es un número entero que es igual o menor que x; f) m es un número entero de 0 a 12; y g) n es por lo menos 1.
143. La composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 136, caracterizada porque la molécula que comprende una porción éster tiene un peso promedio de peso molecular menor de 600,000 Daltons.
144. La composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 143, caracterizada porque el ingrediente adyuvante se selecciona del grupo que consiste de tensioactivos, mej oradores de detergencia, agentes quelantes, agentes que inhiben la transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas y estabilizantes de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueador, refuerzos de blanqueador, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de eli inación/antirredeposición de suciedad de arcilla, abrillantadores, supresores de lodos, tintes, perfumes, agentes elastificantes de estructura, suavizante de telas, portadores, hidrotropos, auxiliares de procesamiento, pigmentos y mezclas de los mismos. 145'. Un método para limpiar, el método está caracterizado porque comprende las etapas de: a) poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende- una tela, con la composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 136 y/o una composición que comprende la composición limpiadora de conformidad con la reivindicación -136; y b) opcionalmente lavar y/o enjuagar la superficie del material. 146. Un método de limpieza, el método está caracterizado porque comprende las etapas de: a) poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende una tela, con la composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 137 y/o una composición que comprende la composición limpiadora de conformidad con la reivindicación 137; y b) opcionalmente lavar y/o enjuagar la superficie del material . 147. Una composición blanqueadora, caracterizada porque comprende la perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 1. 148. La composición blanqueadora de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque comprende además por lo menos enzimas adicionales o derivados de enzimas que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, hemicelulasas y celulasas. 149. Una composición blanqueadora, caracterizada porque comprende la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 8. 150. La composición blanqueadora de conformidad con la reivindicación 149, caracterizada porque comprende además por lo menos una enzima adicional o 'derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas , lisozima, enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la ' pared celular micótica, hemicelulasas y celulasas. 151. Una composición blanqueadora, caracterizada porque comprende la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 113. 152. La composición blanqueadora de conformidad con la eivindicación 151, caracterizada porque comprende además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzimas que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas, lisozima> enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la pared celular micótica, hemicelulasas y celulasas. 153. Una composición blanqueadora, caracterizada porque comprende la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 132. 154. La composición blanqueadora de conformidad con la reivindicación 153, caracterizada porque comprende además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas, lísozima, enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la pared celular micótica, hemicelulasas y celulasas. 155. Una composición blanqueadora, caracterizada porque comprende la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 3. 156. La composición blanqueadora de conformidad con la reivindicación 155, caracterizada porque comprende además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas, lisozima, enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la pared celular micótica, hemicelulasas y celulasas. 157. _Una composición desinfectante, caracterizada porque comprende la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 1. 158. La composición desinfectante de conformidad con la reivindicación 157, caracterizada porque comprende además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas, lisozima, enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la pared celular micótica, hemicelulasas y celulasas. 159. Una composición desinfectante, caracterizada porque comprende la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 8. 160. La composición desinfectante de conformidad con la reivindicación 159, caracterizada porque comprende además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas, lisozima, enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la pared celular micótica, hemicelulasas y celulasas. 161. Una composición desinfectante, caracterizada porque comprende la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 113. 162. La composición desinfectante de conformidad con la reivindicación 161, ca acterizada porque comprende además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas, lisozima, enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la pared celular micótica, hemicelulasas y celulasas. 163. Una composición desinfectante, caracterizada porque comprende la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 132. 164. La composición desinfectante de conformidad con la reivindicación 163, caracterizada porque comprende además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas, lisozima, enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la pared celular micótica, hemicelulasas y celulasas . 165. Una composición desinfectante, caracterizada porque comprende la variante de perhidrolasa de conformidad con la reivindicación 3. 166. La composición desinfectante de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque comprende además por lo menos una enzima adicional o derivados de enzima que se seleccionan del grupo que consiste de proteasas, amilasas, lipasas, mananasas, pectinasas, cutinasas, oxidorreductasas, endoglucosidasas, lisozima, enzimas degradantes de la pared celular bacteriana, enzimas degradantes de la pared celular micótica, hemicelulasas y celulasas .
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