BR112015014396B1 - Composição, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, microorganismo recombinante, métodos de melhoria do valor nutricional de uma ração animal, aditivo de ração animal, e, uso de uma ou mais proteases - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO ISOLADO TENDO ATIVIDADE DE PROTEASE, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DO POLIPEPTÍDEO, DE MELHORIA DO VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO ANIMAL, E DE TRATAMENTO DE PROTEÍNAS, ADITIVO DE RAÇÃO ANIMAL, RAÇÃO ANIMAL, E, USO DE PELO MENOS UMA PROTEASE A presente invenção se refere a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease, e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos. A invenção se refere também a construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos.

Description

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease e sequências de ácidos nucleicos isoladas codificando as proteases. A invenção se refere também a construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras, incluindo células de planta e animal, compreendendo as sequências de ácido nucleico, bem como métodos para produção e uso das proteases, em particular o uso das proteases em ração animal, e detergentes.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[003] A presente invenção proporciona polipeptídeos tendo atividade de protease e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos.

[004] A indústria dos detergentes tem implementado por muitos anos diferentes enzimas em formulações de detergentes, as enzimas o mais comumente usadas incluem proteases, amilases e lipases, cada uma adaptada para remoção de vários tipos de nódoas. Adicionalmente às enzimas, as composições detergentes incluem tipicamente uma combinação complexa de ingredientes. Por exemplos, a maioria dos produtos de limpeza inclui sistema tensoativo, agentes de branqueamento ou adjuvantes. Apesar da complexidade dos detergentes correntes permanece uma necessidade de desenvolvimento de novas composições detergentes compreendendo novas enzimas e/ou combinações de enzimas.

[005] Tradicionalmente, a lavagem de roupa tem sido feita a temperaturas elevadas e foram selecionados detergentes bem conhecidos para ser usados a temperaturas mais elevadas.

[006] O foco aumentado na melhoria dos processos de lavagem de modo a os tornar mais amigos do ambiente tem resultado em uma tendência global de diminuição do tempo de lavagem, pH e temperatura e diminuição da quantidade de componentes de detergente que podem influenciar negativamente o ambiente. Existe, portanto, um desejo, p.ex., de lavar roupa a temperatura mais baixa e, portanto, uma necessidade de proteases para detergente tendo elevado desempenho a várias condições tais como a baixa temperatura.

[007] No uso de proteases em ração animal (in vivo), e/ou o uso de tais proteases para tratamento de proteínas vegetais (in vitro), se notou que as proteínas são fatores nutricionais essenciais para animais e humanos. A maioria do gado e muitos seres humanos adquirem as proteínas necessárias de fontes de proteínas vegetais. Fontes de proteínas vegetais importantes são, p.ex., culturas oleaginosas, leguminosas e cereais.

[008] Quando, p.ex., farinha de soja é incluída na ração de animais monogástricos tais como porcos e aves domésticas, uma proporção significativa dos sólidos da farinha de soja não é digerida eficazmente (a digestibilidade de proteína ileal aparente em leitões, porcos em crescimento e aves domésticas tais como frangos de corte, galinhas poedeiras e galos é somente em torno de 80 %).

[009] O trato gastrointestinal de animais consiste em uma série de segmentos representando, cada um, diferentes ambientes de pH. Em animais monogástricos tais como porcos e aves domésticas e muitos peixes, o estômago exibe pH fortemente ácido tão baixo quanto pH 1-2, enquanto o intestino exibe um pH mais neutro na área pH 6-7. As aves domésticas, adicionalmente ao estômago e intestino, têm também um papo precedendo o estômago, o pH no papo é maioritariamente determinado pela ração ingerida e consequentemente está tipicamente na gama pH 4-6. A digestão de proteínas por uma protease pode ocorrer ao longo do trato digestivo inteiro, dado que a protease está ativa e sobrevive às condições no trato digestivo. Consequentemente, proteases que sejam altamente estáveis em ácido quanto à sobrevivência no ambiente gástrico e ao mesmo tempo sejam eficazmente ativas a pH fisiológico amplo do animal alvo são especialmente desejáveis.

[0010] Igualmente, a ração animal é frequentemente formulada em forma peletizada, onde é aplicado vapor no processo de peletização. É também, portanto, desejável que as proteases usadas em ração animal sejam capazes de permanecer ativas após exposição a tratamento com vapor.

[0011] O uso de proteases em ração animal para melhorar a digestão de proteínas na ração é conhecido. WO 95/28850 divulga a combinação de uma fitase e uma ou mais enzimas proteolíticas microbianas para melhorar a solubilidade de proteínas vegetais. WO 01/58275 divulga o uso de proteases estáveis em ácido da família das subtilisinas em ração animal. WO 01/58276 divulga o uso em ração animal de proteases estáveis em ácido relacionadas com a protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (a protease 10R), bem como uma protease derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010. WO 04/072221, WO 04/111220, WO 04/111223, WO 05/035747, e WO 05/123911 divulgam proteases relacionadas com a protease 10R e seu uso em ração animal. Igualmente, WO 04/072279 divulga o uso de outras proteases. WO 04/034776 divulga o uso de uma subtilisina/queratinase, PWD-1, de B. licheniformis na alimentação de aves domésticas. WO 04/077960 divulga um método de aumento da digestibilidade de forragem ou grão em ruminantes por aplicação de uma protease bacteriana ou fúngica.

[0012] Produtos comerciais compreendendo uma protease e comercializados para uso em ração animal incluem RONOZYME® ProAct (DSM NP/Novozymes), Axtra® (Danisco), Avizyme® (Danisco), Porzyme® (Danisco), Allzyme™ (Alltech), Versazyme® (BioResources, Int.), Poultrygrow™ (Jefo) e Cibenza® DP100 (Novus).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] A presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease, selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 78 %, pelo menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 78 %, pelo menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (c) uma variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições; e (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de protease.

[0014] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácido nucleico, vetores de expressão recombinante; células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção dos polipeptídeos.

[0015] A presente invenção se refere também a o uso das proteases da invenção em ração animal e um processo de limpeza, métodos de produção de composições de ração animal e composições detergentes, e composições de ração animal e composições detergentes.

[0016] A presente invenção se refere também a um polinucleotídeo codificando um peptídeo sinal compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos -185 a -157 de SEQ ID NO: 2, um polinucleotídeo codificando um pró-peptídeo compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos -156 a -1 de SEQ ID NO: 2, um polinucleotídeo codificando um peptídeo sinal e um pró-peptídeo compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos -185 a -1 de SEQ ID NO: 2, cada um dos quais está operacionalmente ligado a um gene codificando uma proteína; construtos de ácido nucleico, vetores de expressão, e células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção de uma proteína. VISÃO GLOBAL DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 é a sequência de DNA da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos como deduzida a partir de SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos da protease madura de Dactylosporangium variesporum. SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos da protease 309 das Subtilisinas SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos da protease 10R (WO 05/035747, SEQ ID NO:2) SEQ ID NO: 6 é um sinal de secreção de Bacillus clausii.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0017] A Figura 1 mostra o perfil pH-atividade da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum no substrato Suc-AAPF-pNA a 37 °C.

[0018] A Figura 2 mostra o perfil pH-estabilidade da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum (atividade residual após 2 horas a 37 oC).

[0019] A Figura 3 mostra o perfil temperatura-atividade da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum em Protazyme AK a pH 7,0.

[0020] A Figura 4 mostra a especificidade quanto a P1 da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum nos 10 substratos Suc-AAPF-pNA a pH 9,0, 25 °C.

[0021] A Fig. 5 mostra a atividade em farinha de soja-milho da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum em comparação com a protease 10R.

DEFINIÇÕES

[0022] Os polipeptídeos tendo atividade de protease, ou proteases, são por vezes também designados peptidases, proteinases, peptídeo hidrolases, ou enzimas proteolíticas. As proteases podem ser do tipo exo que hidrolisam peptídeos começando em qualquer uma das suas extremidades, ou do tipo endo que atuam internamente em cadeias de polipeptídeos (endopeptidases). As endopeptidases mostram atividade em substratos de peptídeo bloqueados nos terminais N e C que são relevantes para a especificidade da protease em questão.

[0023] O termo "protease"é definido aqui como uma enzima que hidrolisa ligações de peptídeo. Esta definição de protease se aplica também à parte de protease dos termos "protease genitora" e "variante de protease", como usados aqui. O termo "protease" inclui qualquer enzima pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das suas treze subclasses). O número EC se refere a Enzyme Nomenclature 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1-5 publicados em Eur. J. Bio-chem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232,  1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; e Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. A nomenclatura é regularmente suplementada e atualizada; ver, p.ex., a World Wide Web (WWW) em http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

[0024] As proteases da invenção e as proteases para uso de acordo com a invenção são selecionadas do grupo consistindo em: (a) proteases pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4.21; e/ou (b) Serina proteases da família de peptidases S1; como descrito em Biochem.J. 290:205-218 (1993) e na base de dados de proteases MEROPS, lançamento 9.4 (www.merops.ac.uk). A base de dados é descrita em Rawlings, N.D., Barrett, A.J. & Bateman, A. (2010) MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res 38, D227-D233.

[0025] Para determinar se uma dada protease é uma Serina protease, e uma protease da família S1, é feita referência ao Handbook acima e aos princípios indicados nele. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.

[0026] As proteases da família S1 contêm a tríade catalítica na ordem His, Asp, Ser. A mutação de qualquer um dos aminoácidos da tríade catalítica resultará em mudança ou perda de atividade de enzima. Os aminoácidos da tríade catalítica da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum (SEQ ID NO: 2) são provavelmente as posições His-32, Asp-56 e Ser-136.

[0027] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeo relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH de ensaio e a temperatura de ensaio devem igualmente ser adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH de ensaio são pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12. Exemplos de temperaturas de ensaio são 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, ou 95 °C. Exemplos de substratos de protease são caseína, tal como Caseína Reticulada com Azurina (AZCL-caseína), ou suc-AAPF-pNA. Exemplos de ensaios de protease adequados são descritos na parte experimental.

[0028] O termo "atividade de protease" significa uma atividade proteolítica (EC 3.4.21.) que catalisa a hidrólise da ligação de amida ou uma protease por hidrólise da ligação de peptídeo que unem os aminoácidos em uma cadeia de polipeptídeo. Vários ensaios para determinação da atividade de protease estão disponíveis na técnica. Para propósitos da presente invenção, a atividade de protease pode ser determinada usando comprimido Protazyme AK (caseína reticulada e corada; da Megazyme) como descrito nos Exemplos do presente pedido. Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, p.ex., pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100 % da atividade de protease do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0029] O termo "variante alélica"significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0030] O termo "domínio catalítico"significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[0031] O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA maduro processado.

[0032] Os termos "composições de limpeza" e "formulações de limpeza" se referem a composições que encontram uso na remoção de compostos indesejados de itens a serem limpos, tais como tecido, tapetes, louças incluindo objetos de vidro, lentes de contato, superfícies duras tais como azulejos, zincos, pisos, e superfícies de mesas, cabelo (xampus), pele (sabões e cremes), dentes (desinfetantes bucais, pasta de dentes), etc. Os termos englobam quaisquer materiais/compostos selecionados quanto ao tipo particular de composição de limpeza desejado e à forma do produto (p.ex., composições líquidas, em gel, em grânulos, ou de pulverização), desde que a composição seja compatível com a protease e outra(s) enzima(s) usadas na composição. A seleção específica de materiais de composição de limpeza é prontamente feita por consideração da superfície, item ou tecido a ser limpo, e da forma desejada da composição para as condições de limpeza durante uso. Estes termos se referem adicionalmente a qualquer composição que seja adequada para limpeza, branqueamento, desinfeção, e/ou esterilização de qualquer objeto e/ou superfície. É pretendido que os termos incluam, entre outros, composição detergente (p.ex., detergentes de lavagem de roupa líquidos e/ou sólidos e detergentes de tecidos finos; formulações de limpeza de superfícies duras, tais como para bancadas e janelas de vidro, madeira, cerâmica e metal; produtos de limpeza de tapetes; produtos de limpeza de fornos; purificadores de tecidos; amaciantes de tecidos; e pré-detetores de têxteis e roupa, bem como detergentes de louça).

[0033] O termo "sequência codificante" significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[0034] O termo "sequências de controle" significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa do (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, entre outros, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sequências de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo.

[0035] O termo "composição detergente" inclui, a não ser que indicado de outro modo, agentes de lavagem universais ou reforçados em forma granular ou pó, especialmente detergentes de limpeza; agentes de lavagem universais em forma líquida, gel ou pasta, especialmente os assim chamados tipos líquidos reforçados (HDL); detergentes líquidos de tecidos finos; agentes de lavagem de louça ou agentes de lavagem de louça de pequena potência manuais, especialmente aqueles do tipo de elevada formação de espuma; agentes de lavagem de louça à máquina, incluindo os vários tipos de comprimidos, granulares, líquidos e auxiliares do enxaguamento para uso doméstico ou institucional; agentes de limpeza e desinfeção líquidos, incluindo tipos de lavagem manual antibacterianos, barras de limpeza, desinfetantes bucais, produtos de limpeza de dentaduras, xampus para carros ou tapetes, produtos de limpeza de banheiros; xampus para cabelos e enxaguantes de cabelos; géis de banho, banhos de espuma; produtos de limpeza de metais; bem como auxiliares de limpeza tais como aditivos de branqueamento e tipos "adesão de nódoas"ou pré-tratamento. Os termos "composição detergente" e "formulação de detergente"são usados em referência a misturas que são destinadas a uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em algumas modalidades, o termo é usado em referência a tecidos e/ou peças de vestuário em lavagem (p.ex., "detergentes de lavagem de roupa"). Em modalidades alternativas, o termo se refere a outros detergentes, tais como aqueles usados para limpar pratos, talheres, etc. (p.ex., "detergentes de lavagem de louça"). Não se pretende que a presente invenção esteja limitada a qualquer formulação ou composição detergente particular. É pretendido que, adicionalmente à protease de acordo com a invenção, o termo englobe detergentes que contenham, p.ex., tensoativos, adjuvantes, quelantes ou agentes de quelação, sistema branqueador ou componentes branqueadores, polímeros, condicionantes de tecido, reforçadores de espuma, supressores de solução saponífera, corantes, perfume, inibidores do embaçamento, abrilhantadores óticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão da sujidade, agentes anticorrosão, inibidores ou estabilizantes de enzimas, ativadores de enzimas, transferase(s), enzimas hidrolíticas, oxidorreductases, agentes para colorir de azul e corantes fluorescentes, antioxidantes, polímeros e solubilizantes.

[0036] O termo "composição de lavagem de louça"se refere a todas as formas de composições para lavagem de superfícies duras. A presente invenção não está restringida a qualquer tipo particular de composição de lavagem de louça ou qualquer detergente particular.

[0037] O termo "benefício de detergência de enzima" ou "detergência" é definido aqui como o efeito vantajoso que uma enzima pode adicionar a um detergente em comparação com o mesmo detergente sem a enzima. Benefícios de detergência importantes que podem ser proporcionados por enzimas são remoção de nódoas com nenhumas ou muito poucas sujidades visíveis após lavagem e/ou limpeza, prevenção ou redução da redeposição de sujidades liberadas no processo de lavagem, um efeito que é também denominado antirredeposição, restauração total ou parcial da brancura de têxteis, que originalmente eram brancos mas, após uso e lavagem repetidos, obtiveram uma aparência acinzentada ou amarelada, um efeito que é também denominado branqueamento. Benefícios de cuidados de têxteis, que não estão diretamente relacionados com remoção catalítica de nódoas ou prevenção da redeposição de sujidades, são também importantes para benefícios de detergência de enzima. Exemplos de tais prestações de cuidados de têxteis são prevenção ou redução da transferência de corantes de um tecido para outro tecido ou outra parte do mesmo tecido, um efeito que é também denominado inibição de transferência de corantes ou anticontracoloração, remoção de fibras soltas ou quebradas da superfície de um tecido para diminuir a tendência de formação de borbotos ou remover os borbotos ou felpo já existentes, um efeito que é também denominado antiformação de borbotos, melhoria da suavidade do tecido, clarificação da cor do tecido e remoção de sujidades particuladas que estão presas nas fibras do tecido ou peças de vestuário. O branqueamento enzimático é um benefício adicional de detergência de enzima onde a atividade catalítica é geralmente usada para catalisar a formação de componente de branqueamento tal como peróxido de hidrogênio ou outros peróxidos.

[0038] O termo "expressão"inclui qualquer passo envolvido na produção do polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacional, e secreção.

[0039] O termo "vetor de expressão"significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0040] O termo "tecido" engloba qualquer material têxtil. Assim se pretende que o termo englobe vestuário, bem como tecidos, fios, fibras, materiais não urdidos, materiais naturais, materiais sintéticos, e qualquer outro material têxtil.

[0041] O termo "fragmento" significa um polipeptídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de protease.

[0042] O termo "Limpeza de superfícies duras"é definido aqui como limpeza de superfícies duras em que as superfícies duras podem incluir pisos, mesas, paredes, tetos, etc., bem como superfícies de objetos duros tais como carros (lavagem de carros) e louça (lavagem de louça). Lavagem de louça inclui, entre outros, limpeza de pratos, taças, copos, tijelas, e cutelaria tal como colheres, facas, garfos, talheres de cozinha, cerâmicas, plásticos, metais, porcelana, vidro e acrílicos.

[0043] O termo "condições de elevada estringência"significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 65°C.

[0044] O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução, ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0045] O termo "desempenho de lavagem melhorado" é definido aqui como uma enzima tal como uma protease (também uma combinação de enzimas, não necessariamente apenas variantes, mas também estruturas principais, e em combinação com certas composições de limpeza, etc.) exibindo uma alteração do desempenho de lavagem da, p.ex., referida protease em relação ao desempenho de lavagem da outra protease ou protease genitora, p.ex., por remoção de nódoas aumentada. O termo "desempenho de lavagem" inclui desempenho na lavagem de roupa, mas também, p.ex., na lavagem de louça.

[0046] O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0047] O termo "condições de baixa estringência"significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 50°C.

[0048] O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspeto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 187 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO 3 com base na sequenciação de aminoácidos usando química de degradação de Edman. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

[0049] O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de protease. Em um aspeto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 656 a 1216 de SEQ ID NO: 1.

[0050] O termo "condições de média estringência"significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 55°C.

[0051] O termo "condições de média-elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 60°C.

[0052] O termo "construto de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outra maneira não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0053] O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[0054] A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".

[0055] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0056] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0057] O termo "subsequência" significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro, em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de protease.

[0058] O termo "polinucleotídeo substancialmente puro" significa uma preparação de polinucleotídeos isenta de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma adequada para uso dentro de sistemas de produção de polipeptídeos geneticamente manipulados. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10 %, no máximo 8 %, no máximo 6 %, no máximo 5 %, no máximo 4 %, no máximo 3 %, no máximo 2 %, no máximo 1 %, e no máximo 0,5 % por peso de outro material de polinucleotídeo com o qual está nativa ou recombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões 5' e 3' não traduzidas que ocorrem naturalmente, tais como promotores e terminadores. Preferencialmente, o polinucleotídeo é pelo menos 90 % puro, p.ex., pelo menos 92 % puro, pelo menos 94 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 96 % puro, pelo menos 97 % puro, pelo menos 98 % puro, pelo menos 99 % puro, e pelo menos 99,5 % puro por peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura.

[0059] O termo "polipeptídeo substancialmente puro" significa uma preparação que contém no máximo 10 %, no máximo 8 %, no máximo 6 %, no máximo 5 %, no máximo 4 %, no máximo 3 %, no máximo 2 %, no máximo 1 %, e no máximo 0,5 % por peso de outro material de polipeptídeo com o qual está nativamente ou recombinantemente associado. Preferencialmente, o polipeptídeo é pelo menos 92 % puro, p.ex., pelo menos 94 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 96 % puro, pelo menos 97 % puro, pelo menos 98 % puro, pelo menos 99 % puro, pelo menos 99,5 % puro, e 100 % puro por peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

[0060] O termo "têxtil"significa qualquer material têxtil incluindo fios, intermediários de fios, fibras, materiais não urdidos, materiais naturais, materiais sintéticos, e qualquer outro material têxtil, tecidos feitos destes materiais e produtos feitos a partir de tecidos (p.ex., peças de vestuário e outros artigos). O têxtil ou tecido pode estar na forma de malhas, tecidos, sarja, não-tecidos, feltros, fios e turco. O têxtil pode ser à base de celulose tal como produtos celulósicos naturais, incluindo algodão, linho, juta, rami, sisal ou cairo ou celulósicos feitos pelo homem (p.ex., provenientes de polpa de madeira) incluindo viscose/raiom, rami, fibras de acetato de celulose (Tricell), liocel ou suas combinações. O têxtil ou tecido pode ser também não à base de celulose tal como poliamidas naturais incluindo lã, camelo, caxemira, mohair, coelho e seda ou um polímero sintético, tal como náilon, aramida, poliéster, acrílico, polipropileno e spandex/elastano, ou suas combinações bem como combinação de fibras à base de celulose e não à base de celulose. Exemplos de combinações são combinações de algodão e/ou raiom/viscose com um ou mais materiais de companhia tais como lã, fibras sintéticas (p.ex., fibras de poliamida, fibras de acrílico, fibras de poliéster, fibras de álcool de polivinila, fibras de cloreto de polivinila, fibras de poliuretano, fibras de poliureia, fibras  de aramida), e fibras contendo celulose (p.ex., raiom/viscose, rami, linho, juta, fibras de acetato de celulose, liocel). O tecido pode ser roupa lavável convencional, por exemplo roupa de uso doméstico enodoada. Quando o termo tecido ou peças de vestuário é usado pretende incluir também o termo mais amplo têxteis.

[0061] O termo "benefícios de cuidados de têxteis", que não está diretamente relacionado com remoção catalítica de nódoas ou prevenção da redeposição de sujidades, é também importante para benefícios de detergência de enzima. Exemplos de tais benefícios de cuidados de têxteis são prevenção ou redução da transferência de corantes de um têxtil para outro têxtil ou outra parte do mesmo têxtil, um efeito que é também denominado inibição de transferência de corantes ou anticontracoloração, remoção de fibras soltas ou quebradas da superfície de um têxtil para diminuir a tendência de formação de borbotos ou remover os borbotos ou felpo já existentes, um efeito que é também denominado antiformação de borbotos, melhoria da suavidade do têxtil, clarificação da cor do têxtil e remoção de sujidades particuladas que estão presas nas fibras do têxtil. O branqueamento enzimático é um benefício adicional de detergência de enzima onde a atividade catalítica é geralmente usada para catalisar a formação de componente de branqueamento tal como peróxido de hidrogênio ou outros peróxidos.

[0062] O termo "variante" significa um polipeptídeo tendo atividade de protease compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos, p.ex., 1-5 aminoácidos adjacentes e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição.

[0063] O termo "condições de muito elevada estringência"significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 70°C.

[0064] O termo "condições de muito baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 45°C.

[0065] O termo "desempenho de lavagem" é usado como a capacidade de uma enzima de remover nódoas presentes no objeto a ser limpo durante, p.ex., lavagem ou limpeza de superfícies duras.

[0066] O termo "brancura" definido aqui como um termo amplo com diferentes significados em diferentes regiões e para diferentes clientes. A perda de brancura pode, p.ex., ser devida a acinzentamento, amarelecimento, ou remoção de abrilhantadores óticos/agentes de coloração. O acinzentado e amarelecimento podem ser devidos a redeposição de sujidade, sujidades corporais, coloração de, p.ex., íons de ferro e cobre ou transferência de corantes. Brancura pode incluir uma ou várias questões da lista em baixo: Efeitos do corante ou tintura; Remoção de nódoas incompleta (p.ex., sujidades corporais, sebo, etc.); Redeposição (acinzentamento, amarelecimento ou outras descolorações do objeto) (as sujidades removidas se reassociam com outra parte do têxtil, suja ou não suja); Mudanças químicas no têxtil durante aplicação; e Clarificação ou abrilhantamento das cores.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0067] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 78 %, pelo menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease. Em um aspeto, os polipeptídeos diferem por não mais do que 20 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0068] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80 % que têm atividade de protease.

[0069] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 81 % que têm atividade de protease.

[0070] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 82 % que têm atividade de protease.

[0071] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 83 % que têm atividade de protease.

[0072] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 84 % que têm atividade de protease.

[0073] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85 % que têm atividade de protease.

[0074] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 86 % que têm atividade de protease.

[0075] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 87 % que têm atividade de protease.

[0076] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 88 % que têm atividade de protease.

[0077] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 89 % que têm atividade de protease.

[0078] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 90 % que têm atividade de protease.

[0079] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 91 % que têm atividade de protease.

[0080] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 92 % que têm atividade de protease.

[0081] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 93 % que têm atividade de protease.

[0082] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 94 % que têm atividade de protease.

[0083] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 95 % que têm atividade de protease.

[0084] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 96 % que têm atividade de protease.

[0085] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 97 % que têm atividade de protease.

[0086] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 98 % que têm atividade de protease.

[0087] Em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 99 % que têm atividade de protease.

[0088] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de protease. Em outro aspeto, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspeto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 187 de SEQ ID NO: 2.

[0089] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou o seu complemento de comprimento total (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0090] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, ou uma sua subsequência, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de protease a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p.ex., pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p.ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0091] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 1 ou uma sua subsequência, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[0092] Para propósitos da presente invenção, hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo a (i) SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (iii) ao seu complemento de comprimento total; ou (iv) a uma sua subsequência; sob condições de muito baixa a muito elevada estringência. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0093] Em um aspeto, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 101 a 1405, nucleotídeos 188 a 1222, nucleotídeos 665 a 1222, ou nucleotídeos 800 a 1200 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1.

[0094] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 78 %, pelo menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %.

[0095] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é não mais do que 20, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19. Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 está entre 1 e 20, tal como 1-15, 1-10 ou 1-5 posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é não mais do que 10, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra modalidade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é não mais do que 10, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade adicional, o número de substituições no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é não mais do que 10, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é não mais do que 10, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0096] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[0097] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físicoquímicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.

[0098] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado. No polipeptídeo da presente invenção, aminoácidos essenciais formando a tríade catalítica foram identificados como aminoácidos correspondendo a His-32, Asp-56 e Ser-136 em SEQ ID NO: 2 por alinhamento com a sequência de aminoácidos da protease 10R (SEQ ID NO:5)

[0099] Substituições, deleções, e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreio relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 1083210837; Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204), e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00100] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de rastreio automatizados, de elevado rendimento, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[00101] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[00102] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando um outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00103] Um polipeptídeo de fusão pode adicionalmente compreender um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Modalidades

[00104] Em certas modalidades da invenção, a protease da invenção exibe propriedades térmicas benéficas tais como termoestabilidade, estabilidade ao vapor, propriedades de pH, tais como estabilidade em ácido, etc.

Propriedades de acidez/alcalinidade

[00105] Em certas modalidades da invenção, a protease da invenção exibe propriedades benéficas no que respeita ao pH, tais como estabilidade em ácido, etc. A estabilidade da protease a um baixo pH é benéfica uma vez que a protease pode ter atividade no intestino após passagem através do estômago. A estabilidade da protease a um elevado pH é benéfica para limpeza e lavagem uma vez que as composições detergentes têm frequentemente um pH alcalino. Em uma modalidade da invenção, a protease retém >90 % de atividade após 2 horas a pH 4 como determinado usando o método descrito no Exemplo 4. Em outra modalidade da invenção, a protease retém >90 % de atividade após 2 horas a pH 10 como determinado usando o método descrito no Exemplo 4.

[00106] A presente invenção proporciona polipeptídeos tendo atividade de protease e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos. As proteases da invenção são serina proteases da família das peptidases S1. As proteases da invenção exibem propriedades de pH surpreendentes, especialmente propriedades de estabilidade ao pH, o que as torna candidatos interessantes para uso em ração animal e/ou detergentes.

Desempenho de Lavagem

[00107] Em certas modalidades da invenção, a protease da invenção exibe desempenho de lavagem benéfico. Assim, a protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum é mais eficaz na remoção de nódoas em comparação com detergente sem qualquer protease. A protease de S1 de Dactylosporangium variesporum é eficaz na remoção de nódoas de sangue e ovo mesmo a 20 °C.

Aplicação em rações

[00108] A protease da invenção é ativa em Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA dentro de uma ampla gama de pH 4-11 e exibe atividade especialmente elevada na gama pH 6-11, é ativa em um substrato de farinha de soja-farinha de milho relevante de ração a valores de pH relevantes para o intestino delgado bem como o papo de aves domésticas e retém mais do que 70 % de atividade após ser sujeita durante 2 horas a pH tão baixo quanto 3. Assim, a protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum da invenção é adequada para várias aplicações em rações.

Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de protease

[00109] Um polipeptídeo tendo atividade de protease da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspeto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[00110] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram-positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Saccharothrix ou Streptomyces tendo atividade de protease, ou um polipeptídeo bacteriano Gram-negativo tal como um polipeptídeo de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella ou Ureaplasma.

[00111] Em um aspeto, o polipeptídeo é uma protease de uma bactéria da classe Actinobacteria, tal como da ordem Actinomycetales, ou da subordem Micromonosporineae, ou da família Micromonosporineae, ou do gênero Dactylosporangium. Em outro aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Dactylosporangium variesporum.

[00112] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). A estirpe usada está publicamente disponível sob o número de acesso ATCC 31203 ou DSM 43911.

[00113] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreio similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de um outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles com perícia ordinária na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Polinucleotídeos

[00114] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo da presente invenção, como descrito aqui.

[00115] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA, ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, p.ex., usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreio com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais partilhadas. Ver, p.ex., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma estirpe de Dactylosporangium, ou um organismo relacionado, e, assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécies da região codificante do polipeptídeo do polinucleotídeo.

[00116] A modificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo "substancialmente similar" ao polipeptídeo se refere a formas do polipeptídeo não ocorrendo naturalmente. Estes polipeptídeos podem diferir de algum modo manipulado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, p.ex., variantes que diferem na atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo, ou similares. As variantes podem ser construídas com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, p.ex., uma sua subsequência, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeos que não resultam em uma mudança da sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso de códons do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituições de nucleotídeos ver, p.ex., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Construtos de Ácido Nucleico

[00117] A presente invenção se refere também a construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[00118] Um polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[00119] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[00120] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos construtos de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa- amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.

[00121] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.

[00122] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[00123] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Na presente invenção pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[00124] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[00125] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00126] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[00127] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizadora de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00128] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[00129] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

[00130] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00131] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[00132] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação; uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina a mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[00133] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00134] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[00135] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo e que dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de um peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira.

[00136] Sequências codificantes de peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes de peptídeo sinal obtidas a partir dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[00137] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00138] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[00139] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante de pró-peptídeos que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[00140] Onde estiverem presentes sequências do peptídeo sinal e pró- peptídeo, a região do pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[00141] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da diidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em estes casos, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.

Vetores de Expressão

[00142] A presente invenção se refere também a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor de modo que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[00143] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00144] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(ais) foi(ram) integrado(s). Além disso pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.

[00145] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitem seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[00146] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoíltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidina-5’- fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferenciais para uso em uma célula de Aspergillussão genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[00147] O vetor contém preferencialmente um(ns) elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[00148] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um(ns) local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00149] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo "origem da replicação"ou "replicador de plasmídeo"significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00150] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl permitindo replicação em Bacillus.

[00151] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00152] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

[00153] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00154] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na arte (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

[00155] A presente invenção se refere também a células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando o polipeptídeo e da sua fonte.

[00156] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, p.ex., um procariota ou um eucariota.

[00157] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.

[00158] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus,  Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[00159] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00160] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não se limitando a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[00161] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação com células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p.ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742751), ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação com protoplastos, eletroporação (ver, p.ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p.ex., Choi et al.,  2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação com protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[00162] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, de inseto, de planta, ou fúngica.

[00163] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. "Fungos" como usado aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8aedição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[00164] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. "Levedura" como usado aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[00165] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[00166] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiaeé por floração de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[00167] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

[00168] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides,  Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[00169] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformações dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichodermasão descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção

[00170] A presente invenção se refere também a métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula, a qual na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo. Em um aspeto preferencial, a célula é uma célula de Bacillus. Em um aspeto mais preferencial, a célula é uma célula de Bacillus licheniformis. Em outro aspeto, a célula é uma célula de Dactylosporangium. Em um aspeto mais preferencial, a célula é uma célula de Dactylosporangium variesporum.

[00171] A presente invenção se refere também a métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.

[00172] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado de lisatos de células.

[00173] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, entre outros, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzimas para determinar a atividade do polipeptídeo.

[00174] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

[00175] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

[00176] Em um aspeto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

Plantas

[00177] A presente invenção se refere também a plantas isoladas, p.ex., uma planta, parte de planta, ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressarem e produzirem um polipeptídeo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo ou domínio pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo ou domínio pode ser usada como tal para melhoria da qualidade de um alimento ou ração, p.ex., melhoria do valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

[00178] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como gramíneas dos prados (poácea, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, p.ex., trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e maís (milho).

[00179] Exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba-sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza, e o organismo modelo relacionado de perto Arabidopsis thaliana.

[00180] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes, e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, p.ex., epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos específicos de células de plantas, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são também considerados uma parte de planta. Além do mais, qualquer célula de planta, independentemente da origem do tecido, é considerada como sendo uma parte de planta. De igual modo, partes de plantas tais como tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes de plantas, p.ex., embriões, endospérmios, aleurona e revestimentos de sementes.

[00181] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a descendência de tais plantas, partes de plantas, e células de plantas.

[00182] A planta ou célula de planta transgênica expressando o polipeptídeo ou domínio pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de um ou mais construtos de expressão codificando o polipeptídeo ou domínio no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto e propagação da planta ou célula de planta modificada resultante em uma planta ou célula de planta transgênica.

[00183] O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo ou domínio operacionalmente ligado a sequências reguladoras apropriadas requeridas para expressão do polinucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além do mais, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificação de células de plantas nas quais foi integrada o construto de expressão e sequências de DNA necessárias para introdução do construto na planta em questão (estas últimas dependem do método de introdução de DNA a ser usado).

[00184] A escolha de sequências reguladoras, tais como sequências promotoras e terminadoras e opcionalmente sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde, e como é desejado que o polipeptídeo ou domínio seja expresso. Por exemplo, a expressão do gene codificando um polipeptídeo ou domínio pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser específica quanto ao desenvolvimento, etapa ou tecido, e o produto de gene pode ser dirigido para um tecido ou parte de planta específico tal como sementes ou folhas. Sequências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[00185] Para expressão constitutiva pode ser usado o promotor de 35S- CaMV, ubiquitina 1 do milho, ou actina 1 do arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores específicos quanto a órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de dreno de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata, e frutos (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de dreno metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico quanto a sementes tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de sementes desconhecida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína do corpo oleaginoso de sementes (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor da proteína de reserva napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico quanto a sementes conhecido na técnica, p.ex., como descrito em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico quanto a folhas tal como o promotor rbcs do arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene de adenina metiltransferase do gene promotor (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP do arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor induzível por ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). De igual modo, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos tais como temperatura, seca, ou alterações na salinidade ou induzido por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, p.ex., etanol, estrogênios, hormônios de plantas tais como etileno, ácido abscísico, e ácido giberélico, e metais pesados.

[00186] Um elemento intensificador de promotores pode ser também usado para alcançar expressão mais elevada de um polipeptídeo ou domínio na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotores pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo codificando um polipeptídeo ou domínio. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulgam o uso do primeiro íntron do gene da actina 1 do arroz para intensificar a expressão.

[00187] O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

[00188] O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na área, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partículas, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[00189] A transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciensé um método para geração de dicots transgênicas (para uma revisão ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e para transformação de monocots, embora outros métodos de transformação possam ser usados para estas plantas. Um método para geração de monocots transgênicas é o bombardeamento com partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocots é baseado em transformação com protoplastos como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos adicionais de transformação incluem aqueles descritos nas Patentes dos E.U.A. Nos. 6,395,966 e 7,151,204 (ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade).

[00190] Após transformação, os transformantes tendo incorporado o construto de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente, o procedimento de transformação é desenhado para a eliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nas gerações seguintes por uso, por exemplo, de cotransformação com dois construtos separados de T-DNA ou excisão sítio-específica do gene de seleção por uma recombinase específica.

[00191] Adicionalmente à transformação direta de um genótipo particular de planta com um construto da presente invenção podem ser feitas plantas transgênicas por cruzamento de uma planta tendo o construto com uma segunda planta à qual falta o construto. Por exemplo, um construto codificando um polipeptídeo ou domínio pode ser introduzido em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem a necessidade de transformar diretamente uma planta dessa dada variedade. Portanto, a presente invenção engloba não só uma planta diretamente regenerada a partir de células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a descendência de tais plantas. Como usado aqui, descendência pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta genitora preparada de acordo com a presente invenção. Tal descendência pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. O cruzamento resulta em introdução de um transgene em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora. Exemplos não limitantes de tais passos são descritos na Patente dos E.U.A. No. 7,151,204.

[00192] Podem ser geradas plantas através de um processo de conversão por retrocruzamento. Por exemplo, plantas incluem plantas referidas como um genótipo, linhagem, planta endogâmica, ou híbrido convertido de modo retrocruzado.

[00193] Podem ser usados marcadores genéticos para auxiliar a ingressão de um ou mais transgenes da invenção de um fundo genético para outro. A seleção auxiliada por marcadores oferece vantagens em relação ao melhoramento convencional na medida em que pode ser usada para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, marcadores genéticos podem proporcionar dados dizendo respeito ao grau relativo de plasma germinativo de elite na descendência individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com um traço desejado que de outro modo tem um fundo genético agronomicamente não desejável é cruzada com uma genitora de elite, podem ser usados marcadores genéticos para selecionar descendência que não só possui o traço de interesse, mas tem também uma proporção relativamente grande do plasma germinativo desejado. Deste modo, o número de gerações requerido para ingressar um ou mais traços em um fundo genético particular é minimizado.

[00194] A presente invenção se refere também a métodos de produção de um polipeptídeo ou domínio da presente invenção compreendendo (a) cultivo de uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou domínio sob condições conducentes à produção do polipeptídeo ou domínio; e (b) recuperação do polipeptídeo ou domínio.

Peptídeo Sinal e Pró-peptídeo

[00195] A presente invenção se refere também a um polinucleotídeo isolado codificando um peptídeo sinal compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos -185 a -157 de SEQ ID NO: 2. A presente invenção se refere também a um polinucleotídeo isolado codificando um pró-peptídeo compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos -156 a -1 de SEQ ID NO: 2. A presente invenção se refere também a um polinucleotídeo isolado codificando um peptídeo sinal e um pró-peptídeo compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos -185 a -1 de SEQ ID NO: 2. Os polinucleotídeos podem compreender adicionalmente um gene codificando uma proteína, que está operacionalmente ligado ao peptídeo sinal e/ou pró-peptídeo. A proteína é preferencialmente estranha ao peptídeo sinal e/ou pró-peptídeo. Em um aspeto, o polinucleotídeo codificando o peptídeo sinal é os nucleotídeos 101 a 187 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspeto, o polinucleotídeo codificando o pró- peptídeo é os nucleotídeos 188 a 655 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspeto, o polinucleotídeo codificando o peptídeo sinal e o pró-peptídeo é os nucleotídeos 101 a 655 de SEQ ID NO: 1.

[00196] A presente invenção se refere também a construtos de ácido nucleico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes compreendendo tais polinucleotídeos.

Composições detergentes

[00197] Em uma modalidade, a invenção está dirigida a composições detergentes compreendendo um polipeptídeo da presente invenção em combinação com um ou mais componentes de composição de limpeza adicionais. Assim, uma modalidade, a presente invenção se refere a uma composição detergente compreendendo um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 60 %, pelo menos 61 %, pelo menos 62 %, pelo menos 63 %, pelo menos 64 %, pelo menos 65 %, pelo menos 66 %, pelo menos 67 %, pelo menos 68 %, pelo menos 69 %, pelo menos 70 %, pelo menos 71 %, pelo menos 72 %, pelo menos 73 %, pelo menos 74 %, pelo menos 75 %, pelo menos 76 %, pelo menos 77 %, pelo menos 78 %, pelo menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease.

[00198] A escolha de componentes adicionais está dentro da perícia do especialista e inclui ingredientes convencionais, incluindo os componentes não limitantes exemplares apresentados em baixo. A escolha de componentes pode incluir, para cuidado dos tecidos, a consideração do tipo de tecido a ser limpo, do tipo e/ou grau de sujidade, da temperatura à qual a limpeza é para ter lugar, e da formulação do produto detergente. Embora os componentes mencionados em baixo estejam categorizados por cabeçalho geral de acordo com uma funcionalidade particular, isto não é para ser interpretado como uma limitação, pois um componente pode compreender funcionalidades adicionais como será apreciado pelo especialista perito.

Enzima da presente invenção

[00199] Em uma modalidade da presente invenção, o um polipeptídeo da presente invenção pode ser adicionado a uma composição detergente em uma quantidade correspondendo a 0,001-200 mg de proteína, tal como 0,005100 mg de proteína, preferencialmente 0,01-50 mg de proteína, mais preferencialmente 0,05-20 mg de proteína, ainda mais preferencialmente 0,110 mg de proteína por litro de licor de lavagem.

[00200] A(s) enzima(s) da composição detergente da invenção pode(m) ser estabilizada(s) usando agentes estabilizantes convencionais, p.ex., um poliol tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, p.ex., um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico tal como ácido 4- formilfenil borônico, e a composição pode ser formulada como descrito em, por exemplo, WO92/19709 e WO92/19708 ou os polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser estabilizados usando aldeídos ou cetonas de peptídeo tais como descritos em WO 2005/105826 e WO 2009/118375.

[00201] Um polipeptídeo da presente invenção pode ser também incorporado nas formulações de detergentes divulgadas em WO97/07202, que é deste modo incorporada por referência.

Tensoativos

[00202] A composição detergente pode compreender um ou mais tensoativos, que podem ser aniônicos e/ou catiônicos e/ou não iônicos e/ou semipolares e/ou zwitteriônicos, ou uma sua mistura. Em uma modalidade particular, a composição detergente inclui uma mistura de um ou mais tensoativos não iônicos e um ou mais tensoativos aniônicos. O(s) tensoativo(s) está(ão) tipicamente presente(s) a um nível de cerca de 0,1% a 60% por peso, tal como cerca de 1% a cerca de 40%, ou cerca de 3% a cerca de 20%, ou cerca de 3% a cerca de 10%. O(s) tensoativo(s) é(são) escolhido(s) com base na aplicação de limpeza desejada, e inclui(em) qualquer(quaisquer) tensoativo(s) convencional(ais) conhecido(s) na técnica.  Pode ser utilizado qualquer tensoativo conhecido na técnica para uso em detergentes.

[00203] Quando incluído aí, o detergente irá usualmente conter de cerca de 1 % a cerca de 40 % por peso, tal como de cerca de 5 % a cerca de 30 %, incluindo de cerca de 5 % a cerca de 15 %, ou de cerca de 20 % a cerca de 25 % de um tensoativo aniônico. Exemplos não limitantes de tensoativos aniônicos incluem sulfatos e sulfonatos, em particular, alquilbenzenossulfonatos lineares (LAS), isômeros de LAS, alquilbenzenossulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanossulfonatos, alfa- olefinossulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-diilbis(sulfatos), hidroxialcanossulfonatos e dissulfonatos, sulfatos de alquila (AS) tais como dodecil sulfato de sódio (SDS), sulfatos de álcool graxo (FAS), sulfatos de álcool primário (PAS), etersulfatos de álcool (AES ou AEOS ou FES, também conhecidos como etoxissulfatos de álcool ou éter sulfatos de álcool graxo), alcanossulfonatos secundários (SAS), sulfonatos de parafina (PS), éster sulfonatos, glicerol ésteres de ácido graxo sulfonados, ésteres de metila de ácido graxo alfa-sulfo (alfa-SFMe ou SES) incluindo éster sulfonato de metila (MES), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, ácido succínico de dodecenila/tetradecenila (DTSA), derivados de ácido graxo de aminoácidos, diésteres e monoésteres de ácido sulfo-succínico ou sabão, e suas combinações.

[00204] Quando incluído aí, o detergente irá usualmente conter de cerca de 1 % a cerca de 40 % por peso de um tensoativo catiônico. Exemplos não limitantes de tensoativos catiônicos incluem alquildimetiletanolamina quat (ADMEAQ), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), cloreto de dimetildistearilamônio (DSDMAC) e alquilbenzildimetilamônio, compostos de amônio quaternário de alquila, compostos de amônio quaternário alcoxilado (AQA), e suas combinações.

[00205] Quando incluído aí, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0,2% a cerca de 40% por peso de um tensoativo não iônico, por exemplo, de cerca de 0,5% a cerca de 30%, em particular de cerca de 1% a cerca de 20%, de cerca de 3% a cerca de 10%, tal como de cerca de 3% a cerca de 5%, ou de cerca de 8% a cerca de 12%. Exemplos não limitantes de tensoativos não iônicos incluem etoxilatos de álcool (AE ou AEO), propoxilatos de álcool, álcoois graxos propoxilados (PFA), ésteres de alquila de ácido graxo alcoxilado, tais como ésteres de alquila de ácido graxo etoxilados e/ou propoxilados, etoxilados de alquilfenol (APE), etoxilados de nonilfenol (NPE), alquilpoliglicosídeos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graxo (FAM), dietanolamidas de ácido graxo (FADA), monoetanolamidas de ácido graxo etoxiladas (EFAM), monoetanolamidas de ácido graxo propoxiladas (PFAM), amidas poliidroxi alquila de ácido graxo, ou derivados de glucosamina de N-acila e N-alquila (glucamidas, GA, ou glucamida de ácido graxo, FAGA), bem como produtos disponíveis sob os nomes comerciais SPAN e TWEEN, e suas combinações.

[00206] Quando incluído aí, o detergente irá usualmente conter de cerca de 1 % a cerca de 40 % por peso de um tensoativo semipolar. Exemplos não limitantes de tensoativos semipolares incluem óxidos de amina (AO) tais como óxido de alquildimetilamina, óxido de N-(coco alquila)-N,N- dimetilamina e óxido de amina N-(sebo-alquila)-N,N-bis(2-hidroxietila), alcanolamidas de ácido graxo e alcanolamidas de ácido graxo etoxiladas, e suas combinações.

[00207] Quando incluído aí, o detergente irá usualmente conter de cerca de 1% a cerca de 40% por peso de um tensoativo zwitteriônico. Exemplos não limitantes de tensoativos zwitteriônicos incluem betaína, alquildimetilbetaína e sulfobetaína, e suas combinações.

Hidrótopos

[00208] Um hidrótopo é um composto que solubiliza compostos hidrofóbicos em soluções aquosas (ou de forma oposta, substâncias polares em um ambiente não polar). Tipicamente, os hidrótopos têm caráter hidrofílico e hidrofóbico (assim chamadas propriedades anfifílicas como conhecidas dos tensoativos); no entanto, a estrutura molecular dos hidrótopos não favorece geralmente a autoagregação espontânea, ver p.ex. revisão por Hodgdon e Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Os hidrótopos não exibem uma concentração crítica acima da qual a autoagregação ocorre como encontrado em tensoativos e lípidos formando mesofases micelares, lamelares e outras bem conhecidas. Em vez disso, muitos hidrótopos mostram um processo de agregação do tipo contínuo onde os tamanhos dos agregados crescem à medida que a concentração aumenta. No entanto, muitos hidrótopos alteram o comportamento de fase, estabilidade, e propriedades coloidais de sistemas contendo substâncias de carácter polar e não polar, incluindo misturas de água, óleo, tensoativos e polímeros. Os hidrótopos são classicamente usados em várias indústrias desde indústrias farmacêutica, de higiene pessoal, alimentar, a aplicações técnicas. O uso de hidrótopos em composições detergentes permite, por exemplo, formulações de tensoativos mais concentradas (como no processo de compactação de detergentes líquidos por remoção de água) sem induzir fenômenos indesejados tais como separação de fases ou elevada viscosidade.

[00209] O detergente pode conter 0-5 % por peso, tal como cerca de 0,5 a cerca de 5 %, ou cerca de 3% a cerca de 5 % de um hidrótopo. Pode ser usado qualquer hidrótopo conhecido na técnica para uso em detergentes. Exemplos não limitantes de hidrótopos incluem benzenossulfonato de sódio, p-toluenossulfonatos de sódio (STS), xilenossulfonatos de sódio (SXS), cumenossulfonatos de sódio (SCS), cimenosulfonato de sódio, óxidos de amina, álcoois e poliglicoléteres, hidroxinaftoato de sódio, hidroxinaftalenossulfonato de sódio, etilhexilssulfato de sódio, e suas combinações.

Adjuvantes e Coadjuvantes

[00210] A composição detergente pode conter cerca de 0-65% por peso, tal como cerca de 5% a cerca de 50%, de um adjuvante ou coadjuvante de detergente, ou uma sua mistura. Em um detergente de lavagem de louça, o nível de adjuvante é tipicamente 40-65%, particularmente 50-65%. O adjuvante e/ou coadjuvante pode ser particularmente um agente quelante que forma complexos solúveis em água com Ca e Mg. Pode ser utilizado qualquer adjuvante e/ou coadjuvante conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Exemplos não limitantes de adjuvantes incluem zeólitos, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos tais como trifosfato de sódio (STP ou STPP), carbonatos tais como carbonato de sódio, silicatos solúveis tais como metassilicato de sódio, silicatos em camadas (p.ex., SKS-6 da Hoechst), etanolaminas tais como 2-aminoetan-1-ol (MEA), dietanolamina (DEA, também conhecido como iminodietanol), trietanolamina (TEA, também conhecida como 2,2’,2”-nitrilotrietanol), e inulina de carboximetila (CMI), e suas combinações.

[00211] A composição detergente pode conter também 0-65% por peso, tal como cerca de 5% a cerca de 40% de um coadjuvante de detergente, ou uma sua mistura. A composição detergente pode incluir um coadjuvante sozinho, ou em combinação com um adjuvante, por exemplo um adjuvante de zeólito. Exemplos não limitantes de coadjuvantes incluem homopolímeros de poliacrilatos ou seus copolímeros, tais como poli(ácido acrílico) (PAA) ou copoli(ácido acrílico/ácido maleico) (PAA/PMA). Outros exemplos não limitantes incluem citrato, quelantes tais como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos e fosfonatos, e ácido alquil- ou alquenilsuccínico. Exemplos específicos adicionais incluem ácido 2,2’,2”-nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido  dietilenotriaminapentaacético (DTPA), ácido iminodissuccínico (IDS), ácido etilenodiamina-N,N’-dissuccínico (EDDS), ácido metilglicinadiacético (MGDA), ácido glutâmico-ácido N,N-diacético (GLDA), etilenodiaminatetra(ácido metilenofosfônico) (HEDP), etilenodiaminatetra(ácido metilenofosfônico) (EDTMPA), dietilenotriaminapenta(ácido metileno-fosfônico) (DTPMPA), ácido N-(2- hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico-ácido N-monoacético (ASMA), ácido aspártico-ácido N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico-ácido N-monopropiônico (ASMP), ácido iminodissuccínico (IDA), ácido N-(2- sulfometil)aspártico (SMAS), ácido N-(2-sulfoetil)aspártico (SEAS), ácido N- (2-sulfometil)glutâmico (SMGL), ácido N-(2-sulfoetil)glutâmico (SEGL), ácido N-metiliminodiacético (MIDA), ácido α-alanina-N,N-diacético (α- ALDA), ácido serina-N,N-diacético (SEDA), ácido isoserina-N,N-diacético (ISDA), ácido fenilalanina-N,N-diacético (PHDA), ácido antranílico-ácido N,N-diacético (ANDA), ácido sulfanílico-ácido N,N-diacético (SLDA), ácido taurina-N,N-diacético (TUDA) e ácido sulfometil-N,N-diacético (SMDA), N- (2-hidroxietil)-etilidenodiamina-N,N’,N’-triacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), penta(ácido metilenofosfônico) de dietilenotriamina (DTPMP), aminotris(ácido metilenofosfônico) (ATMP), e suas combinações e sais. Adjuvantes e/ou coadjuvantes exemplares adicionais são descritos em, p.ex., WO 09/102854, US 5977053.

Sistemas de Branqueamento

[00212] O detergente pode conter 0-10 % por peso, tal como cerca de 1 % a cerca de 5 %, de um sistema de branqueamento. Pode ser utilizado qualquer sistema de branqueamento conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Componentes de sistema de branqueamento adequados incluem catalisadores de branqueamento, ativadores de branqueamento, fontes de peróxido de hidrogênio tais como percarbonato de sódio e perboratos de sódio, perácidos pré-formados e suas misturas.  Perácidos pré-formados adequados incluem, entre outros, ácidos e sais peroxicarboxílicos, ácidos e sais percarbónicos, ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroximonossulfúricos, por exemplo, Oxone®, e suas misturas. Exemplos não limitantes de sistemas de branqueamento incluem sistemas de branqueamento à base de peróxido, que podem compreender, por exemplo, um sal inorgânico, incluindo sais de metal alcalino tais como sais de sódio de perborato (usualmente mono- ou tetraidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sais de persilicato, em combinação com um ativador de branqueamento formando perácido. O termo ativador de branqueamento se entende aqui como um composto que reage com lixívia de peroxigênio como peróxido de hidrogênio para formar um perácido. O perácido assim formado constitui a lixívia ativada. Ativadores de branqueamento adequados para serem usados aqui incluem aqueles pertencendo à classe dos ésteres amidas, imidas ou anidridas. Exemplos adequados são tetracetiletileno diamina (TAED), sulfonato de [(3,5,5-trimetilhexanoíl)oxi]benzeno de sódio, ácido dodecanoico de diperoxi, 4-(dodecanoíloxi)benzenossulfonato (LOBS), 4- (decanoíloxi)benzenossulfonato, 4-(decanoíloxi)benzoato (DOBS), 4- (nonanoíloxi)benzenossulfonato (NOBS), e/ou aqueles divulgados em WO98/17767. Uma família particular de ativadores de branqueamento de interesse foi divulgada em EP624154 e particularmente preferencial em essa família é citrato de acetila e tributila (ATC). ATC ou um triglicérido de cadeia curta como Triacina tem a vantagem de que é amigo do ambiente pois acaba por se degradar em ácido cítrico e álcool. Além disso, o citrato de acetila e tributila e a triacetina têm uma boa estabilidade hidrolítica no produto após armazenamento e são ativadores de branqueamento eficazes. Finalmente, ATC proporciona uma boa capacidade adjuvante ao aditivo de lavagem de roupa. Alternativamente, o sistema de branqueamento pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona. O sistema de branqueamento pode compreender também perácidos tais como ácido 6-  (ftalimido)peroxihexanoico (PAP). O sistema de branqueamento pode incluir também um catalisador de branqueamento. Em algumas modalidades, o componente de branqueamento pode ser um catalisador orgânico selecionado do grupo consistindo em catalisadores orgânicos tendo as seguintes fórmulas:

(iii) e suas misturas; em que cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificado contendo de 9 a 24 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 24 carbonos, preferencialmente cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificado contendo de 9 a 18 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 18 carbonos, mais preferencialmente cada R1 é independentemente selecionado do grupo consistindo em 2-propilheptila, 2-butiloctila, 2-pentilnonila, 2-hexildecila, n- dodecila, n-tetradecila, n-hexadecila, n-octadecila, iso-nonila, iso-decila, isotridecila e iso-pentadecila. Outros sistemas de branqueamento exemplares são descritos, p.ex., em WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259, WO2007/087242. Fotobranqueamentos adequados podem, por exemplo, ser ftalocianina de zinco sulfonatada.

Polímeros

[00213] O detergente pode conter 0-10 % por peso, tal como 0,5-5 %, 2-5 %, 0,5-2 % ou 0,2-1 % de um polímero. Pode ser utilizado qualquer polímero conhecido na técnica para uso em detergentes. O polímero pode funcionar como um coadjuvante como mencionado acima, ou pode proporcionar propriedades antirredeposição, proteção das fibras, liberação de sujidade, inibição de transferência de corantes, limpeza de gorduras e/ou antiespumantes. Alguns polímeros podem ter mais do que uma das propriedades acima mencionadas e/ou mais do que um dos motivos mencionados em baixo. Polímeros exemplares incluem (carboximetil)celulose (CMC), poli(álcool de vinila) (PVA), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) ou poli(óxido de etileno) (PEG), poli(etilenoimina) etoxilada, inulina de carboximetila (CMI), e policarboxilatos tais como PAA, PAA/PMA, ácido poli-aspártico, e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico, CMC hidrofobicamente modificada (HM-CMC) e silicones, copolímeros de ácido tereftálico e glicóis oligomêricos, copolímeros de poli(tereftalato de etileno) e poli(tereftalato de oxieteno) (PET-POET), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI), poli(vinilpiridina-N-óxido) (PVPO ou PVPNO) e polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI). Polímeros exemplares adicionais incluem policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno e óxido de polipropileno (PEO-PPO) e sulfato de etoxi diquaternário. Outros polímeros exemplares são divulgados em, p.ex., WO 2006/130575. Sais dos polímeros acima mencionados estão também contemplados.

Agentes de coloração de tecido

[00214] As composições detergentes da presente invenção podem também incluir agentes de coloração de tecido tais como corantes ou pigmentos os quais, quando formulados em composições detergentes, se podem depositar em um tecido quando o referido tecido é contatado com um licor de lavagem compreendendo as referidas composições detergentes, alterando deste modo a tonalidade do referido tecido através de absorção/reflexão da luz visível. Agentes de branqueamento fluorescente emitem pelo menos alguma luz visível. Em contraste, os agentes de coloração de tecido alteram a tonalidade de uma superfície pois absorvem pelo menos uma porção do espectro de luz visível. Agentes de coloração de tecido adequados incluem corantes e conjugados de corante-argila, e podem incluir também pigmentos. Corantes adequados incluem corantes de molécula pequena e corantes poliméricos. Corantes de molécula pequena adequados incluem corantes de molécula pequena selecionados do grupo consistindo em corantes se enquadrando nas classificações do Índice de Cor (C.I.) de Azul  Direto, Vermelho Direto, Violeta Direto, Azul Ácido, Vermelho Ácido, Violeta Ácido, Azul Básico, Violeta Básico e Vermelho Básico, ou suas misturas, por exemplo, como descrito em WO2005/03274, WO2005/03275, WO2005/03276 e EP1876226 (deste modo incorporadas por referência). A composição detergente compreende preferencialmente de cerca de 0,00003 % por peso a cerca de 0,2 % por peso, de cerca de 0,00008 % por peso a cerca de 0,05 % por peso, ou mesmo de cerca de 0,0001 % por peso a cerca de 0,04 % por peso de agente de coloração de tecido. A composição pode compreender de 0,0001 % por peso a 0,2 % por peso de agente de coloração de tecido, isto pode ser especialmente preferencial quando a composição está na forma de uma bolsa de dose unitária. Agentes de coloração adequados são também divulgados em, p.ex., WO 2007/087257 e WO2007/087243.

Enzimas (Adicionais)

[00215] O aditivo de detergente bem como a composição detergente podem compreender uma ou mais enzimas [adicionais] tais como uma protease, lipase, cutinase, uma amilase, carboidrase, celulase, pectinase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, p.ex., uma lacase, e/ou peroxidase.

[00216] Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) selecionada(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (i.e., pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes.

[00217] Celulases: Celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p.ex., as celulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum divulgadas em US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 e WO 89/09259.

[00218] Celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidados da cor. Exemplos de tais celulases são celulases descritas em EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulase tais como aquelas descritas em WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.

[00219] Celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme™, e Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, e Puradax HA™ (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

[00220] Proteases: Proteases adequadas a serem usadas com a protease da invenção incluem aquelas de origem bacteriana, fúngica, vegetal, viral ou animal, p.ex., origem vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferencial. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Pode ser uma protease alcalina, tal como uma serina protease ou uma metaloprotease. Uma serina protease pode por exemplo ser da família S1, tal como tripsina, ou da família S8 tal como subtilisina. Uma protease das metaloproteases pode por exemplo ser uma termolisina da, p.ex., família M4 ou outra metaloprotease tal como aquelas das famílias M5, M7 ou M8.

[00221] O termo "subtilases" se refere a um subgrupo de serina proteases acordo com Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 e Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. As serina proteases são um subgrupo de proteases caracterizadas por terem uma serina no local ativo, que forma um aducto covalente com o substrato. As subtilases podem ser divididas em 6 subdivisões, i.e., a família das Subtilisinas, a família das Termitases, a família da Proteinase K, a família das Peptidades lantibióticas, a família das Quexinas e a família das Pirolisinas.

[00222] Exemplos de subtilases são aquelas derivadas de Bacillus tais como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens,  Bacillus pumilus e Bacillus gibsonii descritas em US7262042 e WO09/021867, e subtilisina lentus, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisina BPN’, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 descritas em WO89/06279 e protease PD138 descrita em (WO93/18140). Outras proteases úteis podem ser aquelas descritas em WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 e WO02/016547. Exemplos de proteases tipo tripsina são tripsina (p.ex., de origem suína ou bovina) e a protease de Fusarium descrita em WO89/06270, WO94/25583 e WO05/040372, e as quimiotripsina proteases derivadas de Cellumonas descritas em WO05/052161 e WO05/052146.

[00223] Uma protease preferencial adicional é a protease alcalina de Bacillus lentus DSM 5483, como descrito por exemplo em WO 95/23221, e suas variantes que são descritas em WO 92/21760, WO 95/23221, EP 1921147 e EP 1921148.

[00224] Exemplos de metaloproteases são a metaloprotease neutra como descrita em WO07/044993 (Genencor Int.) tais como aquelas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens.

[00225] Exemplos de proteases úteis são as variantes descritas em: WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 61, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e 274 usando a numeração BPN’. Mais preferencial, as variantes de subtilase podem compreender as mutações: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, G61E,D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (usando a numeração BPN’).

[00226] Enzimas proteases comercialmente disponíveis adequadas incluem aquelas vendidas sob os nomes registrados Alcalase®, DuralaseTm, DurazymTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® e Esperase® (Novozymes A/S), aquelas vendidos sob o nome registrado Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Ultimase®, Opticlean® e Optimase® (Danisco/DuPont), AxapemTM (Gist- Brocases N.V.), BLAP (sequência mostrada na Figura 29 de US5352604) e suas variantes (Henkel AG) e KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus) da Kao.

[00227] Lipases e Cutinases: Lipases e cutinases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Exemplos incluem lipase de Thermomyces, p.ex., de T. lanuginosus (previamente nomeada Humicola lanuginosa) como descrito em EP258068 e EP305216, cutinase de Humicola, p.ex., H. insolens (WO96/13580), lipase de estirpes de Pseudomonas (algumas destas agora renomeadas Burkholderia), p.ex., P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), estirpe de P. sp. SD705 (WO95/06720 & WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), lipases do tipo GDSL de Streptomyces (WO10/065455), cutinase de Magnaporthe grisea (WO10/107560), cutinase de Pseudomonas mendocina (US5,389,536), lipase de Thermobifida fusca (WO11/084412), lipase de Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417), lipase de Bacillus subtilis (WO11/084599), e lipase de Streptomyces griseus (WO11/150157) e S. pristinaespiralis (WO12/137147).

[00228] Outros exemplos são variantes de lipase tais como aquelas descritas em EP407225, WO92/05249, WO94/01541, WO94/25578, WO95/14783, WO95/30744, WO95/35381, WO95/22615, WO96/00292, WO97/04079, WO97/07202, WO00/34450, WO00/60063, WO01/92502, WO07/87508 e WO09/109500.

[00229] Produtos de lipase comerciais preferenciais incluem LipolaseTM, Lipex™; LipolexTM e LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente da Genencor) e Lipomax (originalmente da Gist-Brocades).

[00230] Outros exemplos ainda são lipases por vezes referidas como acil transferases ou perhidrolases, p.ex., aciltransferases com homologia com lipase A de Candida antarctica (WO10/111143), aciltransferase de Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), perhidrolases da família CE 7 (WO09/67279), e variantes da perhidrolase de M. smegmatis, em particular a variante S54V usada no produto comercial Gentle Power Bleach da Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO10/100028).

[00231] Amilases: Amilases adequadas que podem ser usadas em conjunto com a protease da invenção podem ser uma alfa-amilase ou uma glucoamilase e podem ser de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Amilases incluem, por exemplo, alfa-amilases obtidas de Bacillus, p.ex., uma estirpe especial de Bacillus licheniformis, descrita em mais detalhe em GB 1,296,839.

[00232] Amilases adequadas incluem amilases tendo SEQ ID NO: 2 em WO 95/10603 ou variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. Variantes preferenciais são descritas em WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 e SEQ ID NO: 4 de WO 99/019467, tais como variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, e 444.

[00233] Diferentes amilases adicionais incluem amilases tendo SEQ ID NO: 6 em WO 02/010355 ou suas variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 6 são aquelas tendo uma deleção nas posições 181 e 182 e uma substituição na posição 193.

[00234] Outras amilases que são adequadas são alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 6 de WO 2006/066594 e resíduos 36-483 da alfa-amilase de B. licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 em WO 2006/066594 ou variantes tendo 90 % da sua identidade de sequência. Variantes preferenciais desta alfa-amilase híbrida são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 e Q264. Variantes mais preferenciais da alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 6 de WO 2006/066594 e resíduos 36-483 de SEQ ID NO: 4 são aquelas tendo as substituições: M197T; H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; ou G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V +Q264S.

[00235] Amilases adicionais que são adequadas são amilases tendo SEQ ID NO: 6 em WO 99/019467 ou suas variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 6 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 e K269. Amilases particularmente preferenciais são aquelas tendo deleção nas posições R181 e G182, ou posições H183 e G184.

[00236] Amilases adicionais que podem ser usadas são aquelas tendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 de WO 96/023873 ou suas variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 e 476, usando SEQ ID 2 de WO 96/023873 para numeração. Variantes mais preferenciais são aquelas tendo uma deleção em duas posições selecionadas de 181, 182, 183 e 184, tal como 181 e 182, 182 e 183, ou posições 183 e 184. Variantes de amilases o mais preferenciais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas tendo uma deleção nas posições 183 e 184 e uma substituição em uma ou mais das posições 140, 195, 206, 243, 260, 304 e 476.

[00237] Outras amilases que podem ser usadas são amilases tendo SEQ ID NO: 2 de WO 08/153815, SEQ ID NO: 10 em WO 01/66712 ou suas variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 de WO 08/153815 ou 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10 em WO 01/66712. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 10 em WO 01/66712 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 e 264.

[00238] Amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 2 de WO 09/061380 ou variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas tendo uma truncação do terminal C e/ou uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 e G475. Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas tendo uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E e G475K e/ou deleção na posição R180 e/ou S181 ou de T182 e/ou G183. Variantes de amilases o mais preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas tendo as substituições: N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K; S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; ou S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475 K em que as variantes são truncadas C-terminalmente e compreendem opcionalmente adicionalmente uma substituição na posição 243 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181.

[00239] Outras amilases adequadas são a alfa-amilase tendo SEQ ID NO: 12 em WO01/66712 ou uma variante tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12. Variantes de amilases preferenciais são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições de SEQ ID NO: 12 em WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Amilases preferenciais particulares incluem variantes tendo uma deleção de D183 e G184 e tendo as substituições R118K, N195F, R320K e R458K, e uma variante tendo adicionalmente substituições em uma ou mais posições selecionadas do grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 e A339, o mais preferencial uma variante que tem adicionalmente substituições em todas estas posições.

[00240] Outros exemplos são variantes de amilase tais como aquelas descritas em WO2011/098531, WO2013/001078 e WO2013/001087.

[00241] Amilases comercialmente disponíveis são DuramylTM, TermamylTM, FungamylTM, Stainzyme TM, Stainzyme PlusTM, NatalaseTM, Liquozyme X e BANTM (da Novozymes A/S), e RapidaseTM, PurastarTM/EffectenzTM, Powerase e Preferenz S100 (da Genencor International Inc./DuPont).

[00242] Peroxidases/Oxidases: Peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, p.ex., de C. cinereus, e suas variantes como aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257.

[00243] Peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme™ (Novozymes A/S).

[00244] A(s) enzima(s) de detergente pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente por adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou por adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo de detergente da invenção, i.e., um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, líquido, pasta, etc. Formulações de aditivo de detergente preferenciais são granulados, em particular granulados sem formação de poeiras, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou pastas.

[00245] Podem ser produzidos granulados sem formação de poeiras, p.ex., como divulgado em US 4,106,991 e 4,661,452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonolfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados em GB 1483591. Preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Podem ser preparadas enzimas protegidas de acordo com o método divulgado em EP 238,216.

Materiais adjuntos

[00246] Podem ser usados quaisquer componentes de detergente conhecidos na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Outros componentes de detergente opcionais incluem agentes anticorrosão, agentes antiencolhimento, agentes antirredeposição de sujidades, agentes antipregueamento, bactericidas, ligantes, inibidores de corrosão, agentes desintegrantes/de desintegração, corantes, estabilizantes de enzimas (incluindo ácido bórico, boratos, CMC, e/ou polióis tais como propileno glicol), condicionadores de tecido incluindo argilas, agentes de enchimento/auxiliares de processamento, agentes de branqueamento fluorescentes/branqueadores óticos, propulsores de espuma, reguladores de espuma (solução saponífera), perfumes, agentes de suspensão de sujidade, amaciadores, supressores de solução saponífera, inibidores de embaciamento, e agentes de migração, ou sozinhos ou em combinação. Pode ser usado qualquer ingrediente conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. A escolha de tais ingredientes está bem no âmbito da perícia do especialista.

[00247] Dispersantes - As composições detergentes da presente invenção podem também conter dispersantes. Em particular, os detergentes pulverulentos podem compreender dispersantes. Materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem os ácidos homo- ou co-poliméricos ou seus sais, nos quais o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais do que dois átomos de carbono. Dispersantes adequados são por exemplo descritos em Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

[00248] Agentes de Inibição de Transferência de Corantes - As composições detergentes da presente invenção podem também incluir um ou mais agentes de inibição de transferência de corantes. Agentes de inibição de transferência de corantes adequados incluem, entre outros, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxidos de poliamina, copolímeros de N- vinilpirrolidona e N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou suas misturas. Quando presentes em uma presente composição, os agentes de inibição de transferência de corantes podem estar presentes a níveis de cerca de 0,0001 % a cerca de 10 %, de cerca de 0,01 % a cerca de 5 % ou mesmo de cerca de 0,1 % a cerca de 3 % por peso da composição.

[00249] Agente de branqueamento fluorescente - As composições detergentes da presente invenção conterão também preferencialmente componentes adicionais que poderão tingir os artigos sendo limpos, tais como agente de branqueamento fluorescente ou abrilhantadores óticos. Onde presente, o branqueador está preferencialmente a um nível de cerca de 0,01 % a cerca de 0,5 %. Qualquer agente de branqueamento fluorescente adequado para uso em uma composição de detergente de lavagem de roupa pode ser usado na composição da presente invenção. Os agentes de branqueamento fluorescente o mais comumente usados são aqueles pertencendo às classes de derivados de ácido diaminoestilbenossulfônico, derivados de diarilpirazolina e derivados de bisfenil-diestirila. Exemplos do tipo derivado de ácido diaminoestilbenossulfônico de agentes de branqueamento fluorescente incluem os sais de sódio de: 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6- ilamino) estilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6- ilamino) estilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-metil-N-2- hidroxi-etilamino)-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2,2'-dissulfonato, 4,4'-bis-(4- fenil-2,1,3-triazol-2-il)estilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(1- metil-2-hidroxi-etilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato e 5- (2H-nafto[1,2-d][1,2,3]triazol-2-il)-2-[(E)-2-fenilvinil]benzenossulfonato de sódio. Agentes de branqueamento fluorescente preferenciais são Tinopal DMS e Tinopal CBS disponíveis da Ciba-Geigy AG, Basileia, Suíça. Tinopal DMS é o sal dissódico de dissulfonato de 4,4'-bis-(2-morfolino-4 anilino-s- triazin-6-ilamino)estilbeno. Tinopal CBS é o sal dissódico de dissulfonato de 2,2'-bis-(fenil-estiril). São também preferenciais agentes de branqueamento fluorescente é o Parawhite KX comercialmente disponível, fornecido pela Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, Índia. Outros fluorescentes adequados para uso na invenção incluem as pirazolinas de 1-3-diarila e as 7- alquilaminocoumarinas. Níveis de branqueador fluorescente adequados incluem níveis inferiores de cerca de 0,01 a 0,05, de cerca de 0,1 ou mesmo de cerca de 0,2 % por peso a níveis superiores de 0,5 ou mesmo 0,75 % por peso.

[00250] Polímeros de liberação de sujidade - As composições detergentes da presente invenção podem também incluir um ou mais polímeros de liberação de sujidade que auxiliam a remoção de sujidades de tecidos tais como tecidos à base de algodão e poliéster, em particular a remoção de sujidades hidrofóbicas de tecidos à base de poliéster. Os polímeros de liberação de sujidade podem, por exemplo, ser polímeros à base de tereftalato não iônicos ou aniônicos, caprolactama de polivinila e copolímeros relacionados, copolímeros de enxerto de vinila, poliamidas de poliéster, ver, por exemplo, Capítulo 7 em Powdered Detergents, Surfactant science series, volume 71, Marcel Dekker, Inc. Outro tipo de polímeros de liberação de sujidade são polímeros de limpeza de gordura alcoxilados anfifílicos compreendendo uma estrutura nuclear e uma pluralidade de grupos alcoxilato anexados a essa estrutura nuclear. A estrutura nuclear pode compreender uma estrutura de polialquilenimina ou uma estrutura de polialcanolamina como descrita em detalhe em WO 2009/087523 (deste modo incorporada por referência). Além disso, copolímeros de enxerto aleatórios são polímeros de liberação de sujidade adequados. Copolímeros de enxerto adequados são descritos em mais detalhe em WO 2007/138054, WO 2006/108856 e WO 2006/113314 (deste modo incorporadas por referência). Outros polímeros de liberação de sujidade são estruturas de polissacarídeos substituídos, especialmente estruturas celulósicas substituídas tais como derivados de celulose modificados tais como aqueles descritos em EP 1867808 ou WO 2003/040279 (ambas são deste modo incorporadas por referência). Polímeros celulósicos adequados incluem celulose, éteres de celulose, ésteres de celulose, amidas de celulose e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem celulose anionicamente modificada, celulose não anionicamente modificada, celulose cationicamente modificada, celulose zwitterionicamente modificada, e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem celulose de metila, celulose de carboxi e metila, celulose de etila, celulose de hidroxila e etila, celulose de hidroxila, propila e metila, celulose de éster, carboxi e metila, e suas misturas.

[00251] Agentes antirredeposição - As composições detergentes da presente invenção podem também incluir um ou mais agentes antirredeposição tais como carboximetilcelulose (CMC), álcool de polivinila (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno e/ou polietilenoglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico e ácido maleico, e polietilenoiminas etoxiladas. Os polímeros à base de celulose descritos sob polímeros de liberação de sujidade acima podem também funcionar como agentes antirredeposição.

[00252] Outros materiais adjuntos adequados incluem, entre outros, agentes antiencolhimento, agentes antipregueamento, bactericidas, ligantes, transportadores, corantes, estabilizantes de enzima, amaciadores de tecido, enchimentos, reguladores de espuma, hidrótopos, perfumes, pigmentos, supressores de solução saponífera, solventes, estruturantes para detergentes líquidos e/ou agentes de elastização da estrutura.

Formulação de produtos detergentes

[00253] A composição detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, p.ex., uma barra, um comprimido homogêneo, um comprimido tendo duas ou mais camadas, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, um pó normal ou compacto, um grânulo, uma pasta, um gel, ou um líquido regular, compacto ou concentrado.

[00254] Formas de formulação do detergente: Camadas (fases iguais ou diferentes), Bolsas, versus formas para Unidade de dosagem por máquina.

[00255] As bolsas podem ser configuradas como compartimentos simples ou múltiplos. Podem apresentar qualquer forma, formato e material adequados para conter a composição, p.ex., sem permitir a liberação da composição da bolsa antes do contato com a água. A bolsa é feita de filme solúvel em água que encerra um volume interior. O referido volume interior pode ser dividido em compartimentos da bolsa. Filmes preferenciais são materiais poliméricos, preferencialmente polímeros que são formados em um filme ou folha. Polímeros, copolímeros ou seus derivados preferenciais são poliacrilatos selecionados, e copolímeros de acrilato solúveis em água, celulose de metila, celulose de carboxi e metila, dextrina de sódio, celulose de etila, celulose de hidroxietila, celulose de hidropropila e metila, maltodextrina, polimetacrilatos, o mais preferencialmente copolímeros de álcool de polivinila, e celulose de hidroxipropila e metila (HPMC). Preferencialmente, o nível de polímeros no filme, por exemplo PVA, é pelo menos cerca de 60 %. O peso molecular médio preferencial será tipicamente cerca de 20.000 a cerca de 150.000. Os filmes podem ser também de composições combinadas compreendendo combinações de polímeros hidroliticamente degradáveis e solúveis em águas tais como polilactídeo e álcool de polivinila (conhecido sob a Referência comercial M8630 como vendido pela MonoSol LLC, Indiana, EUA) mais plastificantes como glicerol, etileno glicerol, propileno glicol, sorbitol e suas misturas. As bolsas podem compreender uma composição sólida de limpeza de roupa ou componentes parciais e/ou uma composição líquida de limpeza ou componentes parciais separados pelo filme solúvel em água. O compartimento para componentes líquidos pode ser diferente na composição do que os compartimentos contendo sólidos. Ref: (US2009/0011970 A1)

[00256] Os ingredientes de detergentes podem estar separados fisicamente uns dos outros por compartimentos em bolsas dissolvíveis em água ou em diferentes camadas de comprimidos. Desta forma pode ser evitada interação de armazenamento negativa entre componentes. Diferentes perfis de dissolução de cada um dos compartimentos podem dar origem a dissolução retardada de componentes selecionados na solução de lavagem.

Definição/características das formas:

[00257] Um detergente líquido ou em gel, que não seja doseado à unidade, pode ser aquoso, contendo tipicamente pelo menos 20 % por peso e até 95 % de água, tal como até cerca de 70 % de água, até cerca de 65 % de água, até cerca de 55 % de água, até cerca de 45 % de água, até cerca de 35 % de água. Outros tipos de líquidos, incluindo, sem limitação, alcanóis, aminas, dióis, éteres e polióis podem ser incluídos em um líquido ou gel aquoso. Um detergente líquido ou em gel aquoso pode conter de 0-30 % de solvente orgânico.

[00258] Um detergente líquido ou em gel pode ser não aquoso.

Barras de sabão para lavagem de roupa

[00259] Os polipeptídeos da invenção podem ser adicionados a barras de sabão para lavagem da roupa e usados para lavagem de roupa, tecidos e/ou têxteis manual. O termo barra de sabão para lavagem de roupa inclui barras para lavagem de roupa, barras de sabão, barras combinadas, barras syndet e barras de detergente. Os tipos de barra diferem usualmente no tipo de tensoativo que contêm, e o termo barra de sabão para lavagem de roupa inclui aquelas contendo sabões de ácidos graxos e/ou sabões sintéticos. A barra de sabão para lavagem de roupa tem uma forma física que é sólida e não um líquido, gel ou um pó à temperatura ambiente. O termo sólido é definido como uma forma física que não muda significativamente ao longo do tempo, i.e., se um objeto sólido (p.ex., barra de sabão para lavagem de roupa) é colocado dentro de um recipiente, o objeto sólido não muda para encher o recipiente em que está colocado. A barra é um sólido tipicamente na forma de barra mas pode estar em outras formas sólidas tais como redonda ou oval.

[00260] A barra de sabão para lavagem de roupa pode conter uma ou mais enzimas adicionais, inibidores de protease tais como aldeídos de peptídeo (ou aducto de hidrossulfito ou aducto de hemiacetal), ácido bórico, borato, bórax e/ou derivados do ácido fenilborônico tais como ácido 4- formilfenilborônico, um ou mais sabões ou tensoativos sintéticos, polióis tais como glicerina, compostos de controle do pH tais como ácidos graxos, ácido cítrico, ácido acético e/ou ácido fórmico, e/ou um sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico em que o cátion monovalente pode ser, por exemplo, Na+, K+ ou NH4+ e to ânion orgânico pode ser, por exemplo, formato, acetato, citrato ou lactato tal que o sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico possam ser, por exemplo, formato de sódio.

[00261] A barra de sabão para lavagem de roupa contém agentes complexantes como EDTA e HEDP, perfumes e/ou diferentes tipos de enchimentos, tensoativos, p.ex., tensoativos sintéticos aniônicos, adjuvantes, agentes de liberação de sujidade poliméricos, quelantes de detergente, agentes estabilizantes, enchimentos, tintas, corantes, inibidores da transferência de corantes, policarbonatos alcoxilados, supressores de solução saponífera, estruturantes, ligantes, agentes lixiviantes, ativadores de branqueamento, agentes de remoção de solo argiloso, agentes antirredeposição, agentes  dispersantes poliméricos, branqueadores, amaciadores de tecido, perfumes e/ou outros compostos conhecidos na técnica.

[00262] A barra de sabão para lavagem de roupa pode ser processada em equipamento fabricante de barras de sabão para lavagem de roupa convencional tal como, entre outros: misturadores, extrusoras, p.ex., uma extrusora a vácuo de duas etapas, extrusoras, cortadores, estampagem de logo, túneis de resfriamento e empacotadores. A invenção não está limitada à preparação das barras de sabão para lavagem de roupa por qualquer método único. A pré-mistura da invenção pode ser adicionada ao sabão em diferentes etapas do processo. Por exemplo, a pré-mistura contendo um sabão, uma enzima, opcionalmente uma ou mais enzimas adicionais, um inibidor de protease, e um sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico pode ser preparada e a mistura é depois extrusada. A enzima e as enzimas adicionais opcionais podem ser adicionadas ao mesmo tempo do inibidor de protease, por exemplo na forma líquida. Para além do passo de mistura e do passo de extrusão, o processo pode compreender adicionalmente os passos de moagem, extrusão, corte, estampagem, resfriamento e/ou empacotamento.

Formulações de detergente granular

[00263] Um detergente granular pode ser formulado como descrito em WO09/092699, EP1705241, EP1382668, WO07/001262, US6472364, WO04/074419 ou WO09/102854. Outras formulações de detergente úteis são descritas em WO09/124162, WO09/124163, WO09/117340, WO09/117341, WO09/117342, WO09/072069, WO09/063355, WO09/132870, WO09/121757, WO09/112296, WO09/112298, WO09/103822, WO09/087033, WO09/050026, WO09/047125, WO09/047126, WO09/047127, WO09/047128, WO09/021784, WO09/010375, WO09/000605, WO09/122125, WO09/095645, WO09/040544, WO09/040545, WO09/024780, WO09/004295, WO09/004294, WO09/121725, WO09/115391, WO09/115392, WO09/074398, WO09/074403, WO09/068501, WO09/065770, WO09/021813, WO09/030632 e WO09/015951. WO2011025615, WO2011016958, WO2011005803, WO2011005623, WO2011005730, WO2011005844, WO2011005904, WO2011005630, WO2011005830, WO2011005912, WO2011005905, WO2011005910, WO2011005813, WO2010135238, WO2010120863, WO2010108002, WO2010111365, WO2010108000, WO2010107635, WO2010090915, WO2010033976, WO2010033746, WO2010033747, WO2010033897, WO2010033979, WO2010030540, WO2010030541, WO2010030539, WO2010024467, WO2010024469, WO2010024470, WO2010025161, WO2010014395, WO2010044905, WO2010145887, WO2010142503, WO2010122051, WO2010102861, WO2010099997, WO2010084039, WO2010076292, WO2010069742, WO2010069718, WO2010069957, WO2010057784, WO2010054986, WO2010018043, WO2010003783, WO2010003792, WO2011023716, WO2010142539, WO2010118959, WO2010115813, WO2010105942, WO2010105961, WO2010105962, WO2010094356, WO2010084203, WO2010078979, WO2010072456, WO2010069905, WO2010076165, WO2010072603, WO2010066486, WO2010066631, WO2010066632, WO2010063689, WO2010060821, WO2010049187, WO2010031607, WO2010000636.

Usos

[00264] A presente invenção está também dirigida a métodos para uso da protease de acordo com a invenção ou suas composições em lavagem de têxteis e tecidos, tais como lavagem de roupa doméstica e lavagem de roupa industrial bem como para ração animal.

[00265] A invenção está também dirigida a métodos para uso das suas composições na limpeza de superfícies duras tais como Lavagem de Louça Automatizada (ADW), lavagem de carros e limpeza de Superfícies industriais. Assim, uma modalidade, a presente invenção se refere a o uso em  limpeza tal como lavagem de roupa ou lavagem de louça de uma protease de acordo com a invenção ou uma composição detergente compreendendo uma protease de acordo com a presente invenção tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de Assim, uma modalidade, a presente invenção se refere a o uso de um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 60 %, pelo menos 61 %, pelo menos 62 %, pelo menos 63 %, pelo menos 64 %, pelo menos 65 %, pelo menos 66 %, pelo menos 67 %, pelo menos 68 %, pelo menos 69 %, pelo menos 70 %, pelo menos 71 %, pelo menos 72 %, pelo menos 73 %, pelo menos 74 %, pelo menos 75 %, pelo menos 76 %, pelo menos 77 %, pelo menos 78 %, pelo menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % que têm atividade de protease em um detergente, um processo de limpeza e/ou processo de lavagem de roupa.

[00266] Uso em detergentes. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser adicionados a, e assim se tornarem um componente de, uma composição detergente.

[00267] A composição detergente da presente invenção pode ser formulada, por exemplo, como uma composição detergente para lavagem de roupa manual ou à máquina, incluindo uma composição aditiva de lavagem de roupa adequada para pré-tratamento de tecidos enodoados e uma composição amaciadora de tecidos adicionada para enxaguamento, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações domésticas gerais de limpeza de superfícies duras, ou ser formulada para operações de lavagem de louça manual ou à máquina.

[00268] Em um aspeto específico, a presente invenção proporciona um aditivo de detergente compreendendo um polipeptídeo da presente invenção como descrito aqui.

Uso de proteases da invenção em Detergentes

[00269] As sujidades e nódoas que são importantes para formuladores de detergente são compostas por muitas substâncias diferentes, e uma gama de diferentes enzimas, todas com diferentes especificidades quanto ao substrato, foi desenvolvida para uso em detergentes em relação a limpeza de roupa e superfície duras, tal como lavagem de louça. Estas enzimas são consideradas como proporcionando um benefício de detergência de enzima, uma vez que melhoram especificamente a remoção de nódoas no processo de limpeza onde são aplicadas em comparação com o mesmo processo sem enzimas. Enzimas de remoção de nódoas que são conhecidas na técnica incluem enzimas tais como carboidrases, amilases, proteases, lipases, celulases, hemicelulases, xilanases, cutinases e pectinase.

[00270] Em um aspeto, a presente invenção se refere ao uso de um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 60 %, pelo menos 61 %, pelo menos 62 %, pelo menos 63 %, pelo menos 64 %, pelo menos 65 %, pelo menos 66 %, pelo menos 67 %, pelo menos 68 %, pelo menos 69 %, pelo menos 70 %, pelo menos 71 %, pelo menos 72 %, pelo menos 73 %, pelo menos 74 %, pelo menos 75 %, pelo menos 76 %, pelo menos 77 %, pelo menos 78 %, pelo menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % em composições detergentes, tais como limpeza de roupa ou superfícies duras. Assim, em um aspeto, a presente invenção demonstra o efeito de detergência de uma variedade de proteases exemplares da invenção em várias nódoas e sob várias condições. Em um aspeto particular da invenção, a composição detergente e o uso em processo de limpeza dizem respeito ao uso de uma protease da invenção em conjunto com pelo menos uma das enzimas de remoção de nódoas acima mencionadas.

[00271] Em um aspeto preferencial da presente invenção, a protease da invenção útil de acordo com a invenção pode ser combinada com pelo menos duas enzimas. Estas enzimas adicionais são descritas em detalhe na seção "outras enzimas", mais preferencial pelo menos três, quatro ou cinco enzimas. Preferencialmente, as enzimas têm diferente especificidade quanto ao substrato, p.ex., atividade carbolítica, atividade proteolítica, atividade amilolítica, atividade lipolítica, atividade hemicelulítica ou atividade pectolítica. A combinação de enzimas pode por exemplo ser uma protease da invenção com outra enzima de remoção de nódoas, p.ex., uma protease da invenção e uma protease, uma protease da invenção e uma amilase, uma protease da invenção e uma celulase, uma protease da invenção e uma hemicelulase, uma protease da invenção e uma lipase, uma protease da invenção e uma cutinase, uma protease da invenção e uma pectinase ou uma protease da invenção e uma enzima antirredeposição. Mais preferencialmente, a protease da invenção é combinada com pelo menos duas outras enzimas de remoção de nódoas, p.ex., uma protease da invenção, uma lipase e uma amilase; ou uma protease da invenção, uma amilase e uma pectinase; ou uma protease da invenção, uma amilase e uma cutinase; ou uma protease da invenção, uma amilase e uma celulase; ou uma protease da invenção, uma amilase e uma hemicelulase; ou uma protease da invenção, uma lipase e uma pectinase; ou uma protease da invenção, uma lipase e uma cutinase; ou uma protease da invenção, uma lipase e uma celulase; ou uma protease da invenção, uma lipase e uma hemicelulase. Ainda mais preferencialmente, uma protease da invenção pode ser combinada com pelo menos três outras enzimas de remoção de nódoas, p.ex., uma protease da invenção, uma amilase, uma lipase e uma amilase; ou uma protease da invenção, uma amilase, uma lipase e uma cutinase; ou uma protease da invenção, uma amilase, uma lipase e uma celulase; ou uma protease da invenção, uma amilase, uma lipase e uma hemicelulase. Uma protease da invenção pode ser combinada com qualquer uma das enzimas selecionadas da lista não exaustiva compreendendo: carboidrases, tais como uma amilase, uma hemicelulase, uma pectinase, uma celulase, uma xantanase ou uma pululanase, uma peptidase, outras proteases ou uma lipase.

[00272] Em outra modalidade da presente invenção, uma protease da invenção pode ser combinada com uma ou mais metaloproteases, tais como uma Metaloprotease de M4, incluindo NeutraseTM ou Termolisina. Tais combinações podem adicionalmente compreender combinações das outras enzimas de detergente como delineado acima.

[00273] O processo de limpeza ou o processo de cuidado de têxteis pode por exemplo ser um processo de lavagem de roupa, um processo de lavagem de louça ou limpeza de superfícies duras tais como azulejos do banheiro, pisos, tampos de mesas, ralos, pias e lavatórios. Os processos de lavagem de roupa podem por exemplo ser lavagem de roupa doméstica, mas podem também ser lavagem de roupa industrial. Além do mais, a invenção se refere a um processo para lavagem de tecidos e/ou peças de vestuário onde o processo compreende tratamento de tecidos com uma solução de lavagem contendo uma composição detergente, e pelo menos uma protease da invenção. O processo de limpeza ou um processo de cuidado de têxteis pode por exemplo ser levado a cabo em um processo de lavagem à máquina ou em um processo de lavagem manual. A solução de lavagem pode por exemplo ser uma solução de lavagem aquosa contendo uma composição detergente.

[00274] Os tecidos e/ou peças de vestuário sujeitos a processos de lavagem, limpeza ou cuidado de têxteis da presente invenção podem ser roupa lavável convencional, por exemplo roupa de uso doméstico. Preferencialmente, a maior parte da roupa é peças de vestuário e tecidos, incluindo malhas, tecidos, sarjas, não tecidos, feltros, fios e turco. Os tecidos podem ser à base de celulose tais como celulósicos naturais, incluindo algodão, linho, juta, rami, sisal ou cairo ou celulósicos feitos pelo homem (p.ex., tendo origem em polpa de madeira) incluindo viscose/raiom, rami, fibras de acetato de celulose (tricell), liocel ou suas combinações. Os tecidos podem ser também não à base de celulose tais como poliamidas naturais incluindo lã, camelo, caxemira, mohair, coelho e seda ou polímero sintético tal como náilon, aramida, poliéster, acrílico, polipropileno e spandex/elastano, ou suas combinações, bem como combinação de fibras à base de celulose e não à base de celulose. Exemplos de combinações são combinações de algodão e/ou raiom/viscose com um ou mais materiais de companhia tais como lã, fibras sintéticas (p.ex., fibras de poliamida, fibras de acrílico, fibras de poliéster, fibras de álcool de polivinila, fibras de cloreto de polivinila, fibras de poliuretano, fibras de poliureia, fibras de aramida), e fibras contendo celulose (p.ex., raiom/viscose, rami, linho, juta, fibras de acetato de celulose, liocel).

[00275] Nos últimos anos tem existido um interesse crescente na substituição de componentes em detergentes, que sejam derivados de petroquímicos com componentes biológicos renováveis tais como enzimas e polipeptídeos sem comprometer o desempenho de lavagem. Quando os componentes de composições detergentes mudam são necessárias novas atividades de enzima ou novas enzimas tendo propriedades alternativas e/ou melhoradas em comparação com as enzimas de detergente comummente usadas tais como proteases, lipases e amilases para alcançar um desempenho de lavagem similar ou melhorado quando comparado com as composições detergentes tradicionais.

[00276] A invenção diz adicionalmente respeito ao uso de proteases da invenção um processo de remoção de nódoas proteináceas. As nódoas proteináceas podem ser nódoas tais como nódoas de alimentos, p.ex., alimentos para bebês, sebo, cacau, ovo, sangue, leite, tinta, grama, ou uma sua combinação.

[00277] As composições detergentes típicas incluem vários componentes adicionalmente às enzimas, estes componentes têm efeitos diferentes, alguns componentes como os tensoativos diminuem a tensão superficial no detergente, que permite que a nódoa sendo limpa seja levantada e dispersa e depois lavada, outros componentes como sistemas branqueadores removem descoloração frequentemente por oxidação e muitos branqueadores têm também fortes propriedades bactericidas, e são usados para desinfeção e esterilização. Ainda outros componentes como constituinte e quelante amolecem, p.ex., a água de lavagem por remoção dos íons de metal do líquido.

[00278] Em uma modalidade particular, a invenção se refere ao uso de uma composição compreendendo uma protease da invenção, em que a referida composição de enzima compreende adicionalmente pelo menos um ou mais dos seguintes: um tensoativo, um adjuvante, um quelante ou um agente de quelação, sistema branqueador ou componente branqueador na lavagem de roupa ou louça.

[00279] Em uma modalidade preferencial da invenção, a quantidade de um tensoativo, um adjuvante, um quelante ou agente de quelação, sistema branqueador e/ou componente branqueador é reduzida em comparação com a quantidade de tensoativo, adjuvante, quelante ou agente de quelação, sistema branqueador e/ou componente branqueador usados sem a protease da invenção adicionada. Preferencialmente, o pelo menos um componente que é um tensoativo, um adjuvante, um quelante ou agente de quelação, sistema branqueador e/ou componente branqueador está presente em uma quantidade que é 1 % menos, tal como 2 % menos, tal como 3 % menos, tal como 4 % menos, tal como 5 % menos, tal como 6 % menos, tal como 7 % menos, tal como 8 % menos, tal como 9 % menos, tal como 10 % menos, tal como 15 % menos, tal como 20 % menos, tal como 25 % menos, tal como 30 % menos, tal como 35 % menos, tal como 40 % menos, tal como 45 % menos, tal como 50 % menos do que a quantidade do componente no sistema sem a adição de protease da invenção, tal como uma quantidade convencional de tal componente. Em um aspeto, a protease da invenção é usada em composições detergentes em que a referida composição está isenta de pelo menos um composto que é um tensoativo, um adjuvante, um quelante ou agente de quelação, sistema branqueador ou componente branqueador e/ou polímero.

Método de Lavagem

[00280] As composições detergentes compreendendo uma protease da presente invenção são idealmente adequadas para uso em aplicações de lavagem de roupa. Conformemente, a presente invenção inclui um método para lavagem de um tecido. O método compreende os passos de contato de um tecido a ser lavado com uma solução de limpeza de roupa compreendendo a composição detergente de acordo com a invenção. O tecido pode compreender qualquer tecido capaz de ser lavado em condições normais de uso do consumidor. A solução tem preferencialmente um pH de cerca de 5,5 a cerca de 9. As composições podem ser empregues a concentrações de cerca de 100 ppm, preferencialmente 500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução. As temperaturas da água variam tipicamente de cerca de 5 °C a cerca de 90 °C, incluindo cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C, cerca de 40 °C, cerca de 45 °C, cerca de 50 °C, cerca de 55 °C, cerca de 60 °C, cerca de 65 °C, cerca de 70 °C, cerca de 75 °C, cerca de 80 °C, cerca de 85 °C e cerca de 90 °C. A razão de água em relação a tecido é tipicamente de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.

[00281] Em modalidades particulares, o método de lavagem é conduzido a um pH de cerca de 5,0 a cerca de 11,5, ou, em modalidades alternativas, mesmo de cerca de 6 a cerca de 10,5, tal como cerca de 5 a cerca de 11, cerca de 5 a cerca de 10, cerca de 5 a cerca de 9, cerca de 5 a cerca de 8, cerca de 5 a cerca de 7, cerca de 5,5 a cerca de 11, cerca de 5,5 a cerca de 10, cerca de 5,5 a cerca de 9, cerca de 5,5 a cerca de 8, cerca de 5,5 a cerca de 7, cerca de 6 a cerca de 11, cerca de 6 a cerca de 10, cerca de 6 a cerca de 9, cerca de 6 a cerca de 8, cerca de 6 a cerca de 7, cerca de 6,5 a cerca de 11, cerca de 6,5 a cerca de 10, cerca de 6,5 a cerca de 9, cerca de 6,5 a cerca de 8, cerca de 6,5 a cerca de 7, cerca de 7 a cerca de 11, cerca de 7 a cerca de 10, cerca de 7 a cerca de 9, ou cerca de 7 a cerca de 8, preferencialmente cerca de 5,5 a cerca de 9, e mais preferencialmente cerca de 6 a cerca de 8.

[00282] Em modalidades particulares, o método de lavagem é conduzido a um grau de dureza de cerca de 0 °dH a cerca de 30 °dH, tal como cerca de 1 °dH, cerca de 2 °dH, cerca de 3 °dH, cerca de 4 °dH, cerca de 5 °dH, cerca de 6 °dH, cerca de 7 °dH, cerca de 8 °dH, cerca de 9 °dH, cerca de 10 °dH, cerca de 11 °dH, cerca de 12 °dH, cerca de 13 °dH, cerca de 14 °dH, cerca de 15 °dH, cerca de 16 °dH, cerca de 17 °dH, cerca de 18 °dH, cerca de 19 °dH, cerca de 20 °dH, cerca de 21 °dH, cerca de 22 °dH, cerca de 23 °dH, cerca de 24 °dH, cerca de 25 °dH, cerca de 26 °dH, cerca de 27 °dH, cerca de 28 °dH, cerca de 29 °dH, cerca de 30 °dH. Em condições típicas de lavagem europeias, o grau de dureza é cerca de 15 °dH, sob condições de lavagem típicas dos EUA cerca de 6 °dH, e sob condições de lavagem típicas asiáticas, cerca de 3 °dH.

[00283] A presente invenção se refere a um método de limpeza de um tecido, uma louça ou superfície dura com uma composição detergente compreendendo uma protease da invenção.

[00284] Uma modalidade preferencial se refere a um método de limpeza, compreendendo o referido método os passos de: contato de um objeto com uma composição de limpeza compreendendo uma protease da presente invenção sob condições adequadas para limpeza do referido objeto. Em uma modalidade preferencial, a composição de limpeza é uma composição detergente e o processo é um processo de lavagem de roupa ou lavagem de louça.

[00285] Ainda outra modalidade se refere a um método para remoção de nódoas de tecido que compreende contato do referido tecido com uma composição compreendendo uma protease da presente invenção sob condições adequadas para limpeza do referido objeto.

[00286] Em uma modalidade preferencial, as composições para uso nos métodos acima compreendem adicionalmente pelo menos uma enzima adicional como apresentado na seção "outras enzimas" acima, tal como uma enzima selecionada do grupo consistindo em carboidrases, peptidases, proteases, lipases, celulase, xilanases ou cutinases ou uma sua combinação. Ainda em outra modalidade preferencial, as composições compreendem uma quantidade reduzida de pelo menos um ou mais dos seguintes componentes: um tensoativo, um adjuvante, um quelante ou agente de quelação, sistema branqueador ou componente branqueador ou um polímero.

[00287] Também contemplados são composições e métodos de tratamento de tecidos (p.ex., para desengomar um têxtil) usando uma ou mais das proteases da invenção. A protease pode ser usada em qualquer método de tratamento de tecidos que seja bem conhecido na técnica (ver, p.ex., Patente dos E.U.A. No. 6,077,316). Por exemplo, em um aspeto, a sensação e aparência de um tecido são melhoradas por um método compreendendo contato do tecido com uma protease em uma solução. Em um aspeto, o tecido é tratado com a solução sob pressão.

[00288] Em uma modalidade, a protease é aplicada durante ou após a tecelagem de tecidos, ou durante a fase de desengomagem, ou um ou mais passos adicionais de processamento de tecidos. Durante a tecelagem de tecidos, os fios são expostos a um considerável esforço mecânico. Antes da tecelagem em teares mecânicos, os fios de urdidura são frequentemente revestidos com amido ou derivados de amido de gomagem a fim de aumentar a sua resistência à tração e para evitar a quebra. A protease pode ser aplicada para remover estas proteínas ou derivados de proteínas de gomagem. Após os têxteis terem sido urdidos, um tecido pode prosseguir para uma etapa de desengomagem. Isto pode ser seguido por um ou mais passos adicionais de processamento de tecidos. Desengomagem é o ato de remoção da gomagem das matérias têxteis. Após tecelagem, o revestimento de gomagem deve ser removido antes de processamento adicional do tecido de modo a assegurar um resultado homogêneo e à prova de lavagem. É também proporcionado um método de desengomagem compreendendo hidrólise enzimática da gomagem pela ação de uma enzima.

Usos a Baixa Temperatura

[00289] Uma modalidade da invenção se refere a um método de lavagem de roupa, lavagem de louça ou limpeza industrial compreendendo contato de uma superfície a ser limpa com uma protease da invenção, e em que a referida lavagem de roupa, lavagem de louça, limpeza industrial ou institucional é realizada a uma temperatura de cerca de 40 °C ou mais baixa. Uma modalidade da invenção se refere a o uso de uma protease da invenção em lavagem de roupa, lavagem de louça ou limpeza industrial em que a temperatura da lavagem de roupa, lavagem de louça, limpeza industrial é cerca de 40 °C ou mais baixa.

[00290] Em outra modalidade, a invenção se refere ao uso de uma protease da invenção em um processo de remoção de proteínas, em que a temperatura no processo de remoção de proteínas é cerca de 40 °C ou mais baixa.

[00291] Assim, um aspeto da invenção se refere ao uso de um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro  de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 60 %, pelo menos 61 %, pelo menos 62 %, pelo menos 63 %, pelo menos 64 %, pelo menos 65 %, pelo menos 66 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease em lavagem de roupa, lavagem de louça ou um processo de limpeza em que a temperatura na lavagem de roupa, lavagem de louça, limpeza industrial é cerca de 40 °C ou mais baixa.

[00292] A presente invenção se refere também a o uso em processo de lavagem de roupa, lavagem de louça ou limpeza industrial de uma protease tendo pelo menos uma propriedade melhorada em comparação com uma protease de subtilisina 309 com (SEQ ID NO 4) e em que a temperatura no processo de lavagem de roupa, lavagem de louça ou limpeza é realizada a uma temperatura de cerca de 40 °C ou mais baixa.

[00293] Em cada um dos métodos e usos acima identificados, a temperatura de lavagem é cerca de 40 °C ou mais baixa, tal como cerca de 39 °C ou mais baixa, tal como cerca de 38 °C ou mais baixa, tal como cerca de 37 °C ou mais baixa, tal como cerca de 36 °C ou mais baixa, tal como cerca de 35 °C ou mais baixa, tal como cerca de 34 °C ou mais baixa, tal como cerca de 33 °C ou mais baixa, tal como cerca de 32 °C ou mais baixa, tal como cerca de 31 °C ou mais baixa, tal como cerca de 30 °C ou mais baixa, tal como cerca de 29 °C ou mais baixa, tal como cerca de 28 °C ou mais baixa, tal como cerca de 27 °C ou mais baixa, tal como cerca de 26 °C ou mais baixa, tal como cerca de 25  °C ou mais baixa, tal como cerca de 24 °C ou mais baixa, tal como cerca de 23 °C ou mais baixa, tal como cerca de 22 °C ou mais baixa, tal como cerca de 21 °C ou mais baixa, tal como cerca de 20 °C ou mais baixa, tal como cerca de 19 °C ou mais baixa, tal como cerca de 18 °C ou mais baixa, tal como cerca de 17 °C ou mais baixa, tal como cerca de 16 °C ou mais baixa, tal como cerca de 15 °C ou mais baixa, tal como cerca de 14 °C ou mais baixa, tal como cerca de 13 °C ou mais baixa, tal como cerca de 12 °C ou mais baixa, tal como cerca de 11 °C ou mais baixa, tal como cerca de 10 °C ou mais baixa, tal como cerca de 9 °C ou mais baixa, tal como cerca de 8 °C ou mais baixa, tal como cerca de 7 °C ou mais baixa, tal como cerca de 6 °C ou mais baixa, tal como cerca de 5 °C ou mais baixa, tal como cerca de 4 °C ou mais baixa, tal como cerca de 3 °C ou mais baixa, tal como cerca de 2 °C ou mais baixa, tal como cerca de 1 °C ou mais baixa.

[00294] Em outra modalidade preferencial, a temperatura de lavagem está na gama de cerca de 5-40 °C, tal como cerca de 5-30 °C, cerca de 5-20 °C, cerca de 5-10 °C, cerca de 10-40 °C, cerca de 10-30 °C, cerca de 10-20 °C, cerca de 15-40 °C, cerca de 15-30 °C, cerca de 15-20 °C, cerca de 20-40 °C, cerca de 20-30 °C, cerca de 25-40 °C, cerca de 25-30 °C, ou cerca de 30-40 °C. Em uma modalidade preferencial particular, a temperatura de lavagem é cerca de 30 °C.

[00295] Em modalidades particulares, o método de lavagem a baixa temperatura é conduzido a um pH de cerca de 5,0 a cerca de 11,5, ou, em modalidades alternativas, mesmo de cerca de 6 a cerca de 10,5, tal como cerca de 5 a cerca de 11, cerca de 5 a cerca de 10, cerca de 5 a cerca de 9, cerca de 5 a cerca de 8, cerca de 5 a cerca de 7, cerca de 5,5 a cerca de 11, cerca de 5,5 a cerca de 10, cerca de 5,5 a cerca de 9, cerca de 5,5 a cerca de 8, cerca de 5,5 a cerca de 7, cerca de 6 a cerca de 11, cerca de 6 a cerca de 10, cerca de 6 a cerca de 9, cerca de 6 a cerca de 8, cerca de 6 a cerca de 7, cerca de 6,5 a cerca de 11, cerca de 6,5 a cerca de 10, cerca de 6,5 a cerca de 9, cerca de 6,5 a cerca de 8, cerca de 6,5 a cerca de 7, cerca de 7 a cerca de 11, cerca de 7 a cerca de 10, cerca de 7 a cerca de 9, ou cerca de 7 a cerca de 8, preferencialmente cerca de 5,5 a cerca de 9, e mais preferencialmente cerca de 6 a cerca de 9.

[00296] Em modalidades particulares, o método de lavagem a baixa temperatura é conduzido a um grau de dureza de cerca de 0 °dH a cerca de 30 °dH, tal como cerca de 1 °dH, cerca de 2 °dH, cerca de 3 °dH, cerca de 4 °dH, cerca de 5 °dH, cerca de 6 °dH, cerca de 7 °dH, cerca de 8 °dH, cerca de 9 °dH, cerca de 10 °dH, cerca de 11 °dH, cerca de 12 °dH, cerca de 13 °dH, cerca de 14 °dH, cerca de 15 °dH, cerca de 16 °dH, cerca de 17 °dH, cerca de 18 °dH, cerca de 19 °dH, cerca de 20 °dH, cerca de 21 °dH, cerca de 22 °dH, cerca de 23 °dH, cerca de 24 °dH, cerca de 25 °dH, cerca de 26 °dH, cerca de 27 °dH, cerca de 28 °dH, cerca de 29 °dH, cerca de 30 °dH. Em condições típicas de lavagem europeias, o grau de dureza é cerca de 15 °dH, sob condições de lavagem típicas dos EUA cerca de 6 °dH, e sob condições de lavagem típicas asiáticas, cerca de 3 °dH.

Ração Animal

[00297] A presente invenção está também dirigida a métodos para uso da protease da presente invenção tendo atividade de protease em ração animal, bem como a composições de ração e aditivos de ração compreendendo as proteases da invenção.

[00298] Assim, em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma composição de ração ou um aditivo de reação compreendendo um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 60 %, pelo menos 61 %, pelo menos 62 %, pelo menos 63 %, pelo menos 64 %, pelo menos 65 %, pelo menos 66 %, pelo menos 67 %, pelo menos 68 %, pelo menos 69 %, pelo menos 70 %, pelo menos 71 %, pelo menos 72 %, pelo menos 73 %, pelo menos 74 %, pelo menos 75 %, pelo menos 76 %, pelo menos 77 %, pelo menos 78 %, pelo  menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease.

[00299] Outro aspeto da invenção se refere a um método para o tratamento de proteínas, compreendendo o passo de adição de pelo menos uma protease de acordo com a invenção a pelo menos uma proteína ou fonte de proteínas tal como soja. Assim, um aspeto se refere a um método para o tratamento de proteínas, compreendendo o passo de adição de pelo menos um polipeptídeo isolado tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 60 %, pelo menos 61 %, pelo menos 62 %, pelo menos 63 %, pelo menos 64 %, pelo menos 65 %, pelo menos 66 %, pelo menos 67 %, pelo menos 68 %, pelo menos 69 %, pelo menos 70 %, pelo menos 71 %, pelo menos 72 %, pelo menos 73 %, pelo menos 74 %, pelo menos 75 %, pelo menos 76 %, pelo menos 77 %, pelo menos 78 %, pelo menos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease a pelo menos uma proteína ou fonte de proteínas tal como soja.

[00300] O termo animal inclui todos os animais. Exemplos de animais são não ruminantes, e ruminantes. Animais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como ovelhas, cabras, gado, p.ex., gado de corte, vacas, e bezerros, cervo, iaque, camelo, lhama e canguru. Em uma modalidade particular, o animal é um animal não ruminante. Animais não ruminantes incluem animais monogástricos, p.ex., porcos ou suínos (incluindo, mas não se limitando a, leitões, porcos em crescimento e porcas); aves domésticas tais como perus, patos e galinhas (incluindo mas não se limitando a frangos de corte, galinhas poedeiras); cavalos (incluindo mas não se limitando a sangues quentes, sangues frios e sangues mornos), bezerros; peixes (incluindo mas não se limitando a charuteiro, pirarucu, barbo, robalo, anchova, bocachico, goraz, peixe-gato, cachama, carpa, peixe-lobo, catla, chanos, savelino, ciclídeo, fogueteiro-galego, bacalhau, perca, dourado, calafate, enguia, caboz, peixe- dourado, gurami, garoupa, guapote, alabote, jamelão, labeo, lai, verdemã, cavalinha, peixe-leite, sargo, mudfish, tainha, pacu, pearlspot, peixe-rei, robalo, lúcio, pâmpano, ruivaca, salmão, sampa, picão, robalo-legítimo, panga, shiner, sleeper, cabeça-de-cobra, lutjanídeo, falso robalo, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, sweetfish, tenca, terror, tilápia, truta, atum, areeiro, corégono-branco, picão-verde e peixe-magro); e crustáceos (incluindo mas não se limitando a camarões e gambas).

[00301] O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparação, mistura, ou composição adequado para, ou destinado para, toma por um animal.

[00302] No uso de acordo com a invenção, a protease pode ser alimentada ao animal antes do, após o, ou simultaneamente com o regime alimentar. Este último é preferencial.

[00303] Em uma modalidade particular, a protease, na forma na qual é adicionada à ração, ou quando estando incluída em um aditivo de ração, está bem definida. Bem definida significa que a preparação de protease é pelo menos 50 % pura como determinado por Cromatografia de exclusão por tamanhos (ver Exemplo 12 de WO 01/58275). Em outras modalidades particulares, a preparação de protease é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, ou pelo menos 95 % pura como determinado por este método.

[00304] Uma preparação de protease bem definida é vantajosa. Por exemplo é muito mais fácil dosear corretamente na ração uma protease que esteja essencialmente isenta de interferir ou contaminar outras proteases. O termo dosear corretamente se refere em particular ao objetivo de obtenção de resultados consistentes e constantes, e à capacidade de otimização da dosagem com base no efeito desejado.

[00305] Para o uso em ração animal, no entanto, a protease não necessita de ser tão pura; pode, p.ex., incluir outras enzimas, em cujo caso deveria ser denominada uma preparação de protease.

[00306] A preparação de protease pode ser (a) diretamente adicionada à ração (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas), ou (b) pode ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias tais como aditivos ou pré-misturas de ração que são subsequentemente adicionadas à ração (ou usadas em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima se refere à pureza da preparação de protease original, usada de acordo com (a) ou (b) acima.

[00307] As preparações de protease com purezas desta ordem de magnitude são em particular obteníveis usando métodos recombinantes de produção, ao passo que elas não são tão facilmente obtidas e também sujeitas a uma variação lote-para-lote muito mais elevada quando a protease é produzida por métodos de fermentação tradicionais.

[00308] Tal preparação de protease pode obviamente ser misturada com outras enzimas.

[00309] A proteína pode ser uma proteína animal, tal como farinha de carne e ossos, farinha de penas, e/ou farinha de peixe; ou pode ser uma proteína vegetal.

[00310] O termo proteínas vegetais como usado aqui se refere a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada de ou tendo origem em um legume, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteína. Em modalidades particulares, o conteúdo de proteínas das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, ou 60 % (p/p).

[00311] As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteínas vegetais, tais como legumes e cereais, por exemplo materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, tais como farinha de soja, farinha de tremoço e farinha de colza.

[00312] Em uma modalidade particular, a fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, p.ex., soja, tremoço, ervilha, ou feijão.

[00313] Em outra modalidade particular, a fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, p.ex., beterraba, beterraba-sacarina, espinafre ou quinoa.

[00314] Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são colza, semente de girassol, semente de algodão, e couve.

[00315] Soja é uma fonte de proteínas vegetais preferencial.

[00316] Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz, triticale, e sorgo.

[00317] Em uma modalidade particular de um processo de tratamento, a(s) protease(s) em questão está(ão) afetando as (ou atuando sobre as, ou exercendo sua influência de solubilização nas) proteínas, tais como proteínas ou fontes de proteínas vegetais. Para alcançar isto, a proteína ou fonte de proteínas é tipicamente suspensa em um solvente, p.ex., um solvente aquoso tal como água, e os valores de pH e temperatura são ajustados prestando a devida atenção às características da enzima em questão. Por exemplo, o tratamento pode ter lugar a um valor de pH ao qual a atividade da protease real é pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou pelo menos 90 %. Do mesmo modo, por exemplo, o tratamento pode ter lugar a uma temperatura à qual a atividade da protease real é pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou pelo menos 90 %. As indicações de percentagens de atividade acima são em relação às atividades máximas. A reação enzimática é continuada até ser alcançado o resultado desejado, após o que pode ou não ser parada por inativação da enzima, p.ex., por um passo de tratamento com calor.

[00318] Em outra modalidade particular de um processo de tratamento da invenção, a ação de protease é sustentada, significando, p.ex., que a protease é adicionada às proteínas, mas sua influência de hidrólise não é por assim dizer ligada até mais tarde quando desejado, logo que sejam estabelecidas condições de hidrólise adequadas, ou logo que sejam inativados quaisquer inibidores de enzima, ou quaisquer outro meios que poderiam ter sido aplicados para adiar a ação da enzima.

[00319] Em uma modalidade, o tratamento é um pré-tratamento de ração animal ou proteínas para uso em ração animal, i.e., as proteínas são hidrolisadas antes da toma.

[00320] O termo melhoria do valor nutricional de uma ração animal significa melhoria da disponibilidade das proteínas, levando deste modo a extração de proteínas aumentada, rendimentos de proteínas mais elevados, e/ou utilização de proteínas melhorada. O valor nutricional da ração é portanto aumentado, a digestibilidade das proteínas e/ou aminoácidos é também aumentada e/ou a taxa de crescimento e/ou ganho de peso e/ou conversão da ração (i.e., o peso da ração ingerida em relação ao ganho de peso) do animal é/são melhorado(s).

[00321] A protease pode ser adicionada à ração em qualquer forma, seja uma protease relativamente pura ou em mistura com outros componentes destinados a adição a ração animal, i.e., na forma de aditivos de reação animal, tal como as assim chamadas pré-misturas para ração animal.

[00322] Em um aspeto adicional, a presente invenção se refere a composições para uso em ração animal, tais como ração animal, e aditivos de ração animal, p.ex., pré-misturas.

[00323] Sem ser a protease da invenção, os aditivos de ração animal da invenção contêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral traço, e/ou pelo menos um macromineral e/ou pelo menos um aminoácido. Exemplos de aminoácidos que são usados em ração animal são lisina, alanina, beta-alanina, treonina, metionina e triptofano.

[00324] Ingredientes aditivos de ração adicionais, opcionais, são agentes corantes, p.ex., carotenoides tais como beta-caroteno, astaxantina, e luteína; estabilizantes; aditivos melhoradores do crescimento e compostos de aroma/aromatizantes, p.ex., creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodecalactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, propilideno ftalida, butilideno ftalida, capsaicina e/ou tanina; peptídeos antimicrobianos; ácidos graxos polinsaturados (PUFAs); espécies geradoras de oxigênio reativo; igualmente pode ser usado um suporte que possa conter, por exemplo, 40-50 % por peso de fibras de madeira, 8-10 % por peso de estearina, 4-5 % por peso de pó de curcuma, 4-58 % por peso de pó de alecrim, 22-28 % por peso de calcário, 13 % por peso de uma goma, tal como goma arábica, 5-50 % por peso de açúcar e/ou amido e 5-15 % por peso de água.

[00325] Uma ração ou um aditivo de ração da invenção pode também compreender pelo menos uma outra enzima selecionada do grupo compreendendo fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease adicional (EC 3.4), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase tal como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); lisozima (EC 3.2.1.17); e beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6), ou qualquer sua mistura.

[00326] Em uma modalidade particular, a ração ou aditivo de ração da invenção também compreende uma fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26).

[00327] Em uma modalidade particular, a ração ou aditivo de ração da invenção também compreende uma xilanase (EC 3.2.1.8).

[00328] Uma ração ou um aditivo de ração da invenção pode também compreender pelo um probiótico ou alimento direto microbiano (DFM) opcionalmente em conjunto com uma ou mais de outras enzimas selecionadas do grupo compreendendo fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease adicional (EC 3.4), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase tal como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); e/ou beta- glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6), ou qualquer sua mistura.

[00329] O alimento direto microbiano pode ser uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer sua combinação, preferencialmente de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp e mais preferencialmente de estirpes de Bacillus subtilis 3A-P4 (PTA-6506); 15A-P4 (PTA-6507); 22C-P1 (PTA-6508); 2084 (NRRL B-500130); LSSA01 (NRRL-B-50104); BS27 (NRRL B-501 05); BS 18 (NRRL B-50633); e BS 278 (NRRL B-50634).

[00330] Em uma modalidade particular, estas outras enzimas estão bem definidas (como definido acima para preparações de protease).

[00331] Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMPs) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina, e Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas, e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos divulgados em WO 03/044049 e WO 03/048148, bem como variantes ou fragmentos dos acima que retenham atividade antimicrobiana.

[00332] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFPs) são os peptídeos de Aspergillus giganteus, e Aspergillus niger, bem como suas variantes e fragmentos que retenham atividade antifúngica, como divulgado em WO 94/01459 e WO 02/090384.

[00333] Exemplos de ácidos graxos polinsaturados são ácidos graxos polinsaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentaenoico e ácido gama-linoleico.

[00334] Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são químicos tais como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas tais como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

[00335] Usualmente, as vitaminas solúveis em gordura e água, bem como minerais traços, formam parte de uma assim chamada pré-mistura destinada para adição à ração, ao passo que macrominerais são usualmente separadamente adicionados à ração. Qualquer um destes tipos de composição, quando enriquecido com uma protease da invenção, é um aditivo de ração animal da invenção.

[00336] Em uma modalidade particular, o aditivo de ração animal da invenção se destina a estar incluído (ou prescrito como tendo de estar incluído) em regimes alimentares ou ração de animais a níveis de 0,01 a 10,0 %; mais particularmente 0,05 a 5,0 %; ou 0,2 a 1,0 % (significando % g de aditivo por 100 g de ração). Isto é assim em particular para pré-misturas.

[00337] O que se segue são listas não exclusivas de exemplos destes componentes:

[00338] Exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, p.ex., vitamina K3.

[00339] Exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, p.ex., Ca-D-pantotenato.

[00340] Exemplos de minerais traços são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto.

[00341] Exemplos de macrominerais são cálcio, fósforo e sódio.

[00342] Os requisitos nutricionais destes componentes (exemplificados com aves domésticas e leitões/porcos) são listados na Tabela A de WO 01/58275. Requisito nutricional significa que estes componentes devem ser proporcionados no regime alimentar nas concentrações indicadas.

[00343] Em alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A de WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um dos, um ou mais do que, um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze, ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual está incluído no aditivo da invenção em uma tal quantidade de modo a proporcionar uma concentração na ração dentro da gama indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da Tabela A.

[00344] Ainda em uma modalidade adicional, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos uma das vitaminas em baixo, preferencialmente para proporcionar uma concentração na ração dentro das gamas especificadas na tabela 1 em baixo (para regimes alimentares de leitões, e regimes alimentares de frangos de corte, respectivamente). Tabela 1: Recomendações típicas de vitaminas

[00345] A presente invenção se refere também a composições de rações animais. As composições de rações animais ou regimes alimentares têm um conteúdo de proteína relativamente elevado. Os regimes alimentares de aves domésticas e porcos podem ser caracterizados como indicado na Tabela B de WO 01/58275, colunas 2-3. Os regimes alimentares de peixes podem ser caracterizados como indicado na coluna 4 desta Tabela B. Além do mais, tais regimes alimentares de peixes têm um conteúdo de gordura em bruto de 200-310 g/kg.

[00346] WO 01/58275 corresponde a US 09/779334 que é deste modo incorporada por referência.

[00347] Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um conteúdo de proteína em bruto de 50-800 g/kg, e além do mais compreende pelo menos uma protease como reivindicado aqui.

[00348] Além do mais, ou em alternativa (ao conteúdo de proteína em bruto indicado acima), a composição de ração animal da invenção tem um conteúdo de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um conteúdo de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um conteúdo de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um conteúdo de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um conteúdo de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um conteúdo de lisina de 0,5-50 g/kg.

[00349] Em modalidades particulares, o conteúdo de energia metabolizável, proteína em bruto, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina está dentro de qualquer uma das gamas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B de WO 01/58275 (L. 2-5).

[00350] A proteína em bruto é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, i.e., Proteína em bruto (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. O conteúdo de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis14aed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

[00351] A energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC Nutrient requirements in swine, nona edição revista 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, e a European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN, 9071463-12-5.

[00352] O conteúdo no regime alimentar de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em regimes alimentares animais completos é calculado com base em tabelas de ração tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN, 90-72839-13-7.

[00353] Em uma modalidade particular, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína vegetal como definido acima.

[00354] A composição de ração animal da invenção pode conter também proteína animal, tal como Farinha de Carne e Ossos, Farinha de penas e/ou Farinha de Peixe, tipicamente em uma quantidade de 0-25 %. A composição de ração animal da invenção pode conter também Grãos Secos Destilados com Solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0-30 %.

[00355] Ainda em modalidades particulares adicionais, a composição de ração animal da invenção contém milho a 0-80 %; e/ou sorgo a 0-80 %; e/ou trigo a 0-70 %; e/ou Cevada a 0-70 %; e/ou aveia a 0-30 %; e/ou farinha de soja a 0-40 %; e/ou farinha de peixe a 0-25 %; e/ou farinha de carne e ossos a 0-25 %; e/ou soro de leite coalhado a 0-20 %.

[00356] Os regimes alimentares animais podem, p.ex., ser fabricados como ração em puré (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os alimentos moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminais essenciais e minerais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzimas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração em puré, uma formulação de enzimas sólida ou líquida pode ser adicionada antes do ou durante o passo de mistura dos ingredientes. Para ração peletizada, a preparação de protease/enzimas (líquida ou sólida) pode ser também adicionada antes do ou durante o passo de ingredientes da ração. Tipicamente, uma preparação de protease/enzimas líquida é adicionada após o passo de peletização. A enzima pode ser também incorporada em um aditivo ou pré- mistura de ração.

[00357] A enzima pode ser adicionada à mistura de ração como um grânulo, que está opcionalmente peletizado ou extrusado. O grânulo compreende tipicamente uma partícula nuclear e um ou mais revestimentos, que são tipicamente revestimentos de sal e/ou cera. A partícula nuclear pode ser uma combinação homogênea de um composto ativo opcionalmente em conjunto com sais (p.ex., sal de zinco orgânico ou inorgânico ou cálcio) ou uma partícula inerte com um composto ativo aplicado nela. O composto ativo é a protease da invenção opcionalmente combinada com uma ou mais enzimas adicionais. A partícula inerte pode ser solúvel em água ou insolúvel em água, p.ex., amido, um açúcar (tal como sacarose ou lactose), ou um sal (tal como NaCl, Na2SO4). O revestimento de sal tem tipicamente espessura de 1 μm e pode ser um sal particular ou uma mistura de sais, tal como Na2SO4, K2SO4, MgSO4 e/ou citrato de sódio. Outros exemplos são aqueles descritos em, p.ex., WO 2008/017659, WO 2006/034710, WO 1997/05245, WO 1998/54980, WO 1998/55599, WO 2000/70034 ou revestimento de polímero tal como descrito em WO 2001/00042.

[00358] Alternativamente, a protease pode ser preparada por congelação de uma mistura de solução de enzima líquida com um agente de volume tal como farinha de soja moída, e depois liofilização da mistura.

[00359] A concentração de enzima final no regime alimentar está dentro da gama de 0,01-200 mg de proteína de enzima por kg de regime alimentar, por exemplo na gama de 0,5-25 mg de proteína de enzima por kg de regime alimentar animal.

[00360] A protease deve obviamente ser aplicada em uma quantidade eficaz, i.e., em uma quantidade adequada para melhoria da hidrólise, digestibilidade, e/ou melhoria do valor nutricional da ração. Está presentemente contemplado que a enzima seja administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (gamas de dosagem): 0,01-200; 0,01-100; 0,5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0,05-50; ou 0,10-10 - sendo todas estas gamas em mg de proteína protease por kg de ração (ppm).

[00361] Para determinação dos mg de proteína protease por kg de ração, a protease é purificada da composição de ração, e a atividade específica da protease purificada é determinada usando um ensaio relevante (ver sob atividade de protease, substratos e ensaios). A atividade de protease da composição de ração como tal é também determinada usando o mesmo ensaio, e com base em estas duas determinações, a dosagem em mg de proteína protease por kg de ração é calculada.

[00362] Os mesmos princípios se aplicam para determinação de mg de proteína protease em aditivos de ração. Obviamente, se uma amostra da protease usada para preparação do aditivo de ração ou da ração estiver disponível, a atividade específica é determinada a partir desta amostra (nenhuma necessidade de purificar a protease da composição ou aditivo de ração).

[00363] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.

Materiais e Métodos Ensaios de lavagem Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) para roupa

[00364] De modo a se avaliar o desempenho de lavagem em roupa são realizadas experiências de lavagem, usando o Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA). Com o AMSA, o desempenho de lavagem de uma grande quantidade de soluções de pequeno volume de enzima-detergente pode ser examinado. A placa de AMSA tem um número de ranhuras para soluções de teste e uma tampa apertando firmemente a amostra de roupa, o têxtil a ser lavado contra todas as aberturas de ranhura. Durante o tempo de lavagem, a placa, soluções de teste, têxtil e tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o têxtil e aplicar tensão mecânica de um modo regular, periodicamente oscilante. Para descrição adicional ver WO 02/42740, especialmente o parágrafo "Special method embodiments" nas páginas 23-24.

[00365] O desempenho de lavagem é medido como o brilho da cor do têxtil lavado. O brilho pode ser também expresso como a intensidade da luz refletida da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está enodoada, a intensidade da luz refletida é mais baixa do que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem.

[00366] As medições de cor são feitas com um digitalizador de mesa profissional (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Br0ndby, Dinamarca), que é usado para capturar uma imagem do têxtil lavado.

[00367] Para extrair um valor para a intensidade da luz das imagens digitalizadas, os valores de pixel de 24 bits da imagem são convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) foi calculado por adição dos valores RGB em conjunto como vetores e depois consideração do comprimento do vetor resultante:

Tabela 1: Composição de detergentes modelo e materiais de teste

Os materiais de teste foram obtidos do Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Holanda. Ensaios de protease 1) Ensaio de Suc-AAPF-pNA: Substrato de Pna : Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem). Temperatura: Temperatura ambiente (25 °C) Tampões do ensaio: Ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 % ajustado até valores de pH 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, e 11,0 com HCl ou NaOH.

[00368] 20 μL de protease (diluídos em Triton X-100 a 0,01 %) foram misturados com 100 μL de tampão de ensaio. O ensaio foi iniciado por adição de 100 μL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com Triton X-100 a 0,01 %). O aumento na OD405 foi monitorizado como uma medida da atividade de protease. 2) Ensaio de Protazyme AK: Substrato: Comprimido de Protazyme AK (casein reticulada e corada; da Megazyme) Temperatura: Controlada (temperatura de ensaio). Tampões do ensaio: Ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 Mm, Triton X-100 a 0,01 %, pH 7,0.

[00369] Um comprimido de Protazyme AK foi suspenso em 2,0 mL de Triton X-100 a 0,01 % por agitação suave. 500 μL desta suspensão e 500 μL de tampão de ensaio foram dispensados em tubo Eppendorf e colocados em gelo. Foram adicionados 20 μL de amostra de protease (diluída em Triton X100 a 0,01 %). O ensaio foi iniciado por transferência do tubo Eppendorf para um termomisturador Eppendorf, que estava definido para a temperatura de ensaio. O tubo foi incubado durante 15 minutos no termomisturador Eppendorf à sua taxa de agitação mais elevada (1400 rpm). A incubação foi parada por transferência do tubo de volta para o banho de gelo. Depois, o tubo foi centrifugado em uma centrífuga gelada durante alguns minutos e 200 μL de sobrenadante foram transferidos para uma placa de microtitulação. A OD650 foi lida como uma medida da atividade de protease. Um tampão cego foi incluído no ensaio (em vez da enzima). 3) Ensaio de Suc-AAPX-pNA: Substratos de pNA : Suc-AAPA-pNA (L-1775 da Bachem) Suc-AAPR-pNA (L-1720 da Bachem) Suc-AAPD-pNA (L-1835 da Bachem) Suc-AAPI-pNA (L-1790 da Bachem) Suc-AAPM-pNA (L-1395 da Bachem) Suc-AAPV-pNA (L-1770 da Bachem) Suc-AAPL-pNA (L-1390 da Bachem) Suc-AAPE-pNA (L-1710 da Bachem) Suc-AAPK-pNA (L-1725 da Bachem) Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem). Temperatura: Temperatura ambiente (25 °C) Tampão do ensaio: Ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 Mm, Triton X-100 a 0,01 %, pH 9,0.

[00370] 20 μL de protease (diluídos em Triton X-100 a 0,01 %) foram misturados com 100 μL de tampão de ensaio. O ensaio foi iniciado por adição de 100 μL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com Triton X-100 a 0,01 %). O aumento na OD405 foi monitorizado como uma medida da atividade de protease.

Ensaio de Farinha de Soja-Milho (Ensaio SMM) Atividade de protease em farinha de soja-milho a pH 3, 4, 5, 6, e 7

[00371] Um ensaio de ponto final usando farinha de soja-milho como substrato foi usado para obtenção do perfil de atividade das proteases a pH 37.

[00372] Tampões do ensaio: Ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CAPS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 % ajustado usando HCl ou NaOH para dar valores de pH de 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0 quando se agitam 10 mL de tampão de ensaio com 1 g de farinha de soja-milho (razão 30:70).

[00373] 2 mL da pasta de farinha de soja-milho são misturados durante 30 min antes da adição de protease e incubação durante 3 horas a 40 °C (500 rpm). A protease é adicionada através de 100 μL de tampão de acetato de sódio (NaAc) a 100 mM (NaAc a 9,565 g/L, ácido acético a 1,75 g/L, CaCl2 a 5 mM, BSA a 0,01 %, Tween20 a 0,01 %, pH 6,0). Os sobrenadantes são coletados após centrifugação (10 min, 4000 rpm, 0 °C) e a atividade de proteína foi determinada usando um ensaio colorimétrico baseado no método de o-Ftaldialdeído (OPA) essencialmente de acordo com Nielsen et al. (Nielsen, PM, Petersen, D, Dampmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J Food Sci, 2001, 66: 642-646). Este ensaio deteta grupos α-amino livres e consequentemente a atividade de protease pode ser medida como um aumento na absorvância. Primeiramente, 500 μL de cada sobrenadante são filtrados através de um filtro Microcon de 100 kDa por centrifugação (60 min, 11,000 rpm, 5 °C). As amostras são diluídas 10x em água desionizada e 25 μL de cada amostra são carregados em uma placa de microtitulação de 96 poços (5 replicados). Finalmente, 200 μL de reagente OPA são dispensados em todos os poços e a placa é agitada (10 seg, 750 rpm) e a absorvância medida a 340 nm. O nível de atividade de protease é calculado como a diferença entre a absorvância na amostra tratada com enzima e a amostra em branco e expresso como "Abs x fator de diluição".

EXEMPLOS Estirpes Dactylosporangium variesporum DSM 43911. Meios e Soluções Exemplo 1: Preparação de DNA e sequenciação do genoma de Dactylosporangium variesporum

[00374] O DNA cromossômico de Dactylosporangium variesporum (reclassificada em 2011 como Saccharothrix variisporea) foi isolado por "Estojo QIAamp DNA Blood Mini" (Qiagen, Hilden, Alemanha). 5 ug de DNA cromossômico foram enviados para sequenciação do genoma em FASTERIS SA, Suíça. O genoma foi sequenciado por Illumina Sequencing. A sequência do genoma foi analisada quanto a proteases de S1 secretadas e uma protease de S1 (SEQ ID: 1 /SEQ ID:2) foi selecionada para expressão.

Exemplo 2: Expressão da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum

[00375] Um sistema de vetor de integração linear foi usado para a clonagem de expressão da protease 1 de S1A de Dactylosporangium variesporum (SEQ ID NO: 2). O construto de integração linear foi um produto de fusão de PCR produzido por fusão do gene entre duas regiões cromossômicas homólogas de Bacillus subtilis em conjunto com um promotor forte e um marcador de resistência ao cloranfenicol. A fusão foi feita por SOE PCR (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. e Pease, L.R. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes, gene splicing by overlap extension Gene 77: 61-68). O método de SOE PCR está também descrito no pedido de patente WO 2003/2003095658. O gene foi expresso sob o controle de um sistema promotor triplo (como descrito em WO 99/43835), consistindo nos promotores do gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, e o promotor cryIIIA de Bacillus thuringiensis incluindo sequência de estabilização. O gene codificando acetil-transferase de cloranfenicol foi usado como marcador (descrito em, p.ex., Diderichsen, B.; Poulsen, G.B.; Joergensen, S.T.; A useful cloning vector for Bacillus subtilis. Plasmid 30:312 (1993)). Os construtos de genes finais foram integrados no cromossoma de Bacillus por recombinação homóloga no lócus da pectato liase. O gene codificando a protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum foi amplificado a partir de DNA cromossômico da estirpe Dactylosporangium variesporum com iniciadores específicos quanto ao gene contendo saliência para os dois fragmentos flanqueantes. Os fragmentos flanqueantes a montante e a jusante foram amplificados a partir de DNA genômico da estirpe iMB1361 (descrito no pedido de patente WO 2003095658). A protease 1 de S1 foi expressa com um sinal de secreção de Bacillus clausii (com a seguinte sequência de aminoácidos: MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA (SEQ ID NO 6)) substituindo o sinal de secreção nativo.

[00376] Os 2 fragmentos do vetor e o fragmento do gene foram sujeitos a uma reação PCR com Processamento por Sobreposição de Extensão (SOE) para montar os três fragmentos em um construto de vetor linear. Uma alíquota do produto de PCR foi transformada em um hospedeiro de Bacillus subtilis com protease eliminada. Os transformantes foram selecionados em placas LB suplementadas com 6 μg de cloranfenicol por mL. Um clone de Bacillus subtilis recombinante contendo o construto de expressão integrado foi cultivado em cultura líquida. O sobrenadante contendo enzima foi coletado e a enzima purificada como descrito no Exemplo 3.

Exemplo 3: Purificação da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum

[00377] O caldo de cultura foi centrifugado (20000 x g, 20 min) e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado do precipitado. O sobrenadante foi filtrado através de uma unidade de filtração de 0,2 μm Nalgene de modo a se remover o resto das células hospedeiras de Bacillus. O filtrado de 0,2 μm foi transferido para CH3COOH/NaOH a 10 mM, CaCl2 a 1 mM, pH 4,5 em uma coluna G25 sephadex (da GE Healthcare). O filtrado transferido para G25 sephadex foi aplicado a uma coluna SP-sepharose FF (da GE Healthcare) equilibrada em CH3COOH/NaOH a 10 mM, CaCl2 a 1 mM, pH 4,5. Após lavagem da coluna com o tampão de equilíbrio, a protease foi eluída com um gradiente linear de NaCl (0 --> 0,5 M) no mesmo tampão ao longo de cinco volumes da coluna. As frações da coluna foram analisadas quanto a atividade de protease (usando o ensaio de Suc-AAPF-pNA a pH 9) e as frações do pico foram agrupadas. (NH4)2SO4 sólido foi adicionado ao agrupamento da coluna SP-sepharose FF até uma concentração de (NH4)2SO4 final de 1,0 M e o agrupamento ajustado com sal foi aplicado a uma coluna Phenyl-Toyopearl (da TosoHaas) equilibrada em H3BO3 a 100 mM, MES a 10 mM, CaCl2 a 2 mM, (NH4)2SO4 a 1,0 M, pH 6,0. Após lavagem da coluna com o tampão de equilíbrio, a protease foi eluída com um gradiente linear de (NH4)2SO4 (1,0 -- > 0 M) no mesmo tampão ao longo de três volumes de coluna. As frações da coluna foram analisadas quanto a atividade de protease (usando o ensaio de Suc-AAPF-pNA a pH 9) e as frações ativas foram analisadas por SDS-PAGE. As frações onde apenas era vista uma banda no gel de SDS-PAGE corado com coomassie foram agrupadas e transferidas para H3BO3 a 100 m, MES a 10 mM, CaCl2 a 1 mM, pH 6,0 em uma coluna G25 sephadex (da GE Healthcare). A enzima transferida para G25 sephadex foi a preparação purificada e foi usada para caracterização adicional.

Exemplo 4: Caracterização da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum

[00378] O ensaio de Suc-AAPF-pNA foi usado para obtenção do perfil pH-atividade e do perfil pH-estabilidade (atividade residual após 2 horas aos valores de pH indicados). Para o perfil pH-estabilidade, a protease foi diluída 10x nos diferentes tampões de ensaio para alcançar os valores de pH destes tampões e depois incubada durante 2 horas a 37 oC. Após incubação, o pH das incubações de protease foi ajustado até ao mesmo valor de pH por diluição no tampão de ensaio a pH 9,0. As atividades residuais foram medidas a pH 9,0 em relação a uma amostra, que foi mantida a condições estáveis (5 oC, pH 9,0). O ensaio de Protazyme AK foi usado para obtenção do perfil temperatura-atividade a pH 7,0. O ensaio de Suc-AAPX-pNA e dez diferentes substratos de Suc-AAPX-pNA foram usados para obtenção da especificidade quanto a P1 das enzimas a pH 9,0. Os resultados são mostrados nas tabelas 25 e Figuras 1-4. Tabela 2: perfil pH-atividade a 37 °C

Nota: as atividades são em relação ao pH ótimo para a enzima. Tabela 3: perfil pH-estabilidade (atividade residual após 2 horas a 37 °C)

Nota: as atividades são atividade residuais em relação a uma amostra, que foi mantida a condições estáveis (5 oC, pH 9,0). Tabela 4: Perfil temperatura-atividade a pH 7,0

Nota: as atividades são em relação à temperatura ótima para a enzima. Tabela 5: Especificidade quanto a P1 em 10 substratos de Suc-AAPX-pNA a pH 9,0 (25 °C)

Nota: as atividades são em relação ao melhor substrato (Suc-AAPF-pNA) para a enzima.

Outras características para a protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum

[00379] Inibidores: PMSF e CI-2A.

[00380] A determinação da sequência N-terminal por degradação de EDMAN foi: IDVIGGN.

[00381] O peso molecular relativo como determinado por SDS-PAGE foi aprox. Mr = 20 kDa.

[00382] O peso molecular determinado por Análise de peso molecular intacto foi 18553,9 Da.

[00383] A sequência madura (a partir dos dados de MS, dados de degradação de EDMAN e sequência de DNA): IDVIGGNAYYMGGGGRCSVGFSVNGGFVTAGHCGTSG QSTTQPTGTFAGSSFPGNDYAWVRVAAGNTPRGLVNRYPGTVPVAG STEAPVGASVCRSGSTTGWHCGTIQQRNTSVTYPQGTVSGVVRTNAC AEPGDSGGSWISGDQAQGVTSGGSGNCSSGGTTYFQPVNEILQAYGL QLVTSGGTPT (SEQ ID NO 3)

[00384] O peso molecular calculado a partir desta sequência madura foi 18554,1 Da.

Exemplo 5: Lavagem AMSA usando a protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum

[00385] O desempenho de lavagem da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporumfoi testada usando um detergente líquido e um detergente em pó a 2 diferentes temperaturas de lavagem em 3 nódoas técnicas diferentes usando o Ensaio de Estresse Mecânico Automático.

[00386] As experiências foram conduzidas como descrito no método AMSA para lavagem de roupa usando um procedimento de lavagem de ciclo único, com a composição detergente e amostras descritas na tabela 1 e as condições experimentais como especificadas na tabela 6 em baixo. Tabela 6: Condições experimentais para experiências de lavagem de roupa

[00387] A dureza da água foi ajustada até 15 °dH por adição de CaCl2, MgCl2, e NaHCO3 (Ca2+:Mg2+:CO3- = 4:1:7,5) ao sistema de teste. Após lavagem, os têxteis foram passados por água da torneira e secos. Tabela 7: Valor de intensidade delta de detergente contendo protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum em comparação com detergente sem protease a 20 °C

[00388] Os resultados mostram que o detergente contendo protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum é mais eficaz na remoção de nódoas em comparação com detergente sem protease. A protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum é eficaz na remoção de nódoas de chocolate/leite, sangue/leite, e óleo/leite a 20 °C. Tabela 8: Valor de intensidade delta de detergente contendo protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum em comparação com detergente sem protease a 40 °C

[00389] Os resultados mostram que o detergente contendo protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum é mais eficaz na remoção de nódoas em comparação com detergente sem protease. A protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum é eficaz na remoção de nódoas de chocolate/leite, sangue/leite, e óleo/leite a 40 °C. Tabela 9: Desempenho de lavagem relativo de detergente contendo protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum em comparação com detergente protease 10R a 20 °C.

[00390] Os resultados mostram que o detergente contendo protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum tem desempenho de lavagem melhorado em comparação com detergente protease 10R (SEQ ID NO 5) em nódoas de chocolate/leite, sangue/leite, e óleo/leite a 20 °C. Tabela 10: Desempenho de lavagem relativo de detergente contendo protease S1 de Dactylosporangium variesporum em comparação com detergente com protease 10R a 40 °C.

[00391] Os resultados mostram que o detergente contendo protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum tem desempenho de lavagem melhorado em comparação com detergente protease 10R (SEQ ID NO 5) em nódoa de chocolate/leite, e está se desempenhando tão bem como o detergente protease 10R em nódoas de sangue/leite, e óleo/leite a 40 °C.

Exemplo 6: Atividade de protease em ensaio de farinha de soja-milho

[00392] Os resultados da realização do ensaio de farinha de Soja-milho acima mencionado são mostrados na Tabela 11 em baixo. A atividade proteolítica da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum em farinha de soja-milho aumenta com pH crescente de pH 3 a pH 6 e depois diminui. A atividade a pH 6 é mais elevada do que para protease 10R de Nocardiopsis (SEQ ID NO 5) indicando que a protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporumpoderá ter o potencial de ser mais eficaz na hidrólise de proteínas no papo de aves domésticas. Tabela 11: Atividade de protease em farinha de soja-milho a pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 e 7,0

[00393] A Figura 5 mostra a atividade em farinha de soja-milho da protease 1 de S1 de Dactylosporangium variesporum em comparação com a protease 10R (SEQ ID NO 5).

Claims (20)

1. Composição, caracterizadapelo fato de que compreende um polipeptídeo tendo atividade de protease, a composição sendo uma composição detergente para lavagem de roupa ou lavagem de louça automática, em que o polipeptídeo tendo atividade de protease é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipetídeo compreende ou consiste de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo maduro corresponde aos aminoácidos 1 a 187 de SEQ ID NO: 2.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais selecionadas entre proteases, amilases, lipases, cutinases, celulases, endoglucanases, xiloglucanases, pectinases, pectina liases, xantanases, peroxidases, haloperoxigenases, catalases, mananases, ou qualquer mistura destas.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadapelo fato de que compreende um ou mais componentes selecionados entre tensoativos e adjuvantes.

6. Construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, caracterizadopelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão, em que a sequência de controle é estranha ao polinucleotídeo, e em que o polipeptídeo tendo atividade de protease é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

7. Microorganismo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle estranhas que dirigem a produção do polipeptídeo, em que o polipeptídeo com atividade de protease é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

8. Método de melhoria do valor nutricional de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease é adicionado à ração, em que o polipeptídeo com atividade de protease é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro é aminoácidos 1 a 187 de SEQ ID NO: 2.

11. Aditivo de ração animal, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais polipeptídeos com atividade de protease; e um ou mais aditivo adicional selecionado do grupo que consiste de uma vitamina solúvel em gordura, uma vitamina solúvel em água, um ou mais mineral traço, e uma enzima selecionada do grupo que consiste de amilase; fitase; xilanase; galactanase; alfa-galactosidase; protease, fosfolipase; e/ou beta- glucanase, em que o polipeptídeo com atividade de protease é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

12. Aditivo de ração animal de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

13. Aditivo de ração animal de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro corresponde aos aminoácidos 1 a 187 de SEQ ID NO: 2.

14. Uso de um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, caracterizado pelo fato de que é em detergentes ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 em um processo de limpeza, em que o polipeptídeo tendo atividade de protease é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

16. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro é aminoácidos 1 a 187 de SEQ ID NO: 2.

17. Composição de ração animal, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo tendo atividade de protease, em que o polieptídeo tendo atividade de protease é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

19. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro corresponde aos aminoácidos 1 a 187 de SEQ ID NO: 2.

20. Composição de ração animal de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais amilases; fitases; xilanases; galactanases; alfa-galactosidases; proteases, fosfolipases, beta-glucanases, ou qualquer mistura destas.

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