JP5947213B2 - プロテアーゼ変異体の使用 - Google Patents

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Description

本発明は、親サブチラーゼに比して、洗浄性能、熱安定性、保存安定性又は触媒活性を含む１又は２以上の特性において改変を示す、新規なサブチラーゼ（subtilase）変異体に関する。本発明の変異体は、例えば清浄又は洗剤組成物、例えば洗濯洗剤組成物及び食器洗い用組成物、例えば自動食器洗浄機用組成物における使用に適する。また、本発明は、前記変異体をコードする単離ＤＮＡ配列、発現ベクター、宿主細胞、及び本発明の変異体を生成及び使用する方法にも関する。さらに、本発明は、本発明の変異体を含む清浄及び洗剤組成物にも関する。
洗剤業界において、酵素は３０年以上も洗剤処方に利用されてきた。斯かる処方に使用される酵素としては、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、マンノシダーゼ、並びにその他の酵素、又はそれらの混合物が挙げられる。商業上最も重要な酵素はプロテアーゼである。
商業上使用されているプロテアーゼの中でも増加しているのは、タンパク質工学により合成された天然野生型プロテアーゼの変異体である。例としては、DURAZYM(R)、RELASE（登録商標）、ALCALASE（登録商標）、サビナーゼ（登録商標）、PRIMASE（登録商標）、DURALASE（登録商標）、ESPERASE（登録商標）、OVOZYME（登録商標）、RELASE(R)及びKANNASE（登録商標）（Novozymes A/S）、AXAPEM(R)（Gist-Brocades N.V.）、PURAFECT(R)（Genencor International, Inc.）、MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECT OxPTM、FN２TM、FN３TM及びFN４TM（Genencor International, Inc.）等が挙げられる。
他にも当業界では数々の変異体が報告されている。例えば国際公開第０４／０４１９７９号（NOVOZYMES A/S）は、親サブチラーゼと比べて、例えば洗浄性能、熱安定性、保存安定性又は触媒活性等において改変を示すサブチラーゼ変異体を記載する。これらの変異体は、例えば清浄又は洗剤組成物に適している。
これまで有用なプロテアーゼ変異体が数々報告されており、その多くが種々の洗剤において改善された活性、安定性、溶解性を示す。しかし、様々な要因ゆえに、プロテアーゼの更なる改善が望ましい。温度やｐＨ等について言えば、洗浄条件は変化し続けており、多くの菌株は依然として、従来の洗浄条件下における完全な除去は困難である。よって、プロテアーゼ開発における徹底的な研究にもかかわらず、新規の改良されたプロテアーゼが依然として必要とされている。
従って、本発明の目的は、親酵素と比較して改善された性能を有するサブチリシンの変異体を提供することである。
本発明は、親サブチリシンの変異体に関する。親サブチリシンは、例えば配列番号１に示すサブチリシンである。
一観点によれば、本発明の変異体は、親サブチリシン、例えば配列番号１に示すサブチリシンと比較して少なくとも１つの改善された特性を有する。前記改善された特性は、例えば、改善された洗浄性能、例えば改善されたしみ除去能力、硬質表面洗浄における改善された洗浄性能、例えば改善された食器洗い性能、改善された安定性、例えば貯蔵又は熱安定性又は改善された触媒活性である。本発明の一観点によれば、変異体は、改善された卵除去能力、例えば硬質表面からゆで卵卵黄の改善された除去能力を有する。
すなわち、本発明の一観点によれば、置換９｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝、１５｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、６８｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、２１８｛Ｄ，Ｓ，Ｇ，Ｖ｝及び２４５｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝を含む、親サブチリシンの変異体に関し、前記変異体はさらに、修飾６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄのうち少なくとも１つを含み、ここで前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する。
一観点によれば、本発明の変異体はさらに、置換Ｇ６１Ｅを含む。
一観点によれば、本発明の変異体はさらに、置換Ａ９８Ｓを含む。
一観点によれば、本発明の変異体はさらに、置換Ｓ９９Ｇを含む。
一観点によれば、本発明の変異体はさらに、次の置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一観点によれば、親サブチリシンは、配列番号１に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
別の観点によれば、変異体は、親サブチリシンと比較して改善された１又は２以上の特性を有し、改善された特性は、洗浄性能、安定性、触媒活性及び食器洗い性能を含む。
更なる観点によれば、改善された特性は、改善された洗浄性能、例えば改善されたしみ除去能力、硬質表面洗浄、例えば食器洗浄における改善された洗浄性能、改善された安定性、例えば貯蔵又は熱安定性、又は改善された触媒活性を含む。本発明の一観点によれば、前記変異体は、改善された卵除去能力、例えば硬質表面からゆで卵卵黄の改善された除去能力を有する。
別の観点は、変異体を生成する方法であって、親サブチリシンに対して、以下の置換：
ｉ）位置９の｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝による置換；
ii）位置１５の｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝による置換、
iii）位置６８の｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝による置換、
iv）位置２４５の｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝による置換、及び
ｖ）位置２１８の｛Ｄ，Ｓ，Ｇ又はＶ｝による置換、
並びに、以下の修飾のうち１又は２以上：
位置６１の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、
位置６２の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、
位置７６の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、
位置９７へのＧの挿入、
位置９８の｛Ｇ，Ｓ｝による置換、
位置９９のＧによる置換、
位置１０１のＧによる置換、
位置１２０の｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝による置換、
位置１３１の｛Ｔ，Ｓ｝による置換、
位置１３７のＨによる置換、
位置１９４のＰによる置換、
位置２２８のＶによる置換、
位置２３０のＶによる置換、及び
位置２６１のＤによる置換（前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド
［ＢＰＮ’］の位置に相当する）、
を導入することによる方法に関する。
本発明の別の観点は、変異体サブチリシンをコードする単離されたポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む核酸コントラクト、ベクター及び宿主細胞に関する。
本発明の一観点は、清浄又は洗剤組成物、好ましくは本発明の変異体を含む洗濯又は食器洗い用組成物に関する。本発明の一観点は、洗剤、例えば洗濯又は食器洗いへの変異体の使用に関する。
定義
・タンパク分解活性（proteolytic activity）：この用語は、本明細書において、タンパク分解によりタンパク質を分解する（break down）能力をいう。ここでタンパク分解（proteolysis）とは、タンパク質を形成するポリペプチド鎖内のアミノ酸を連結するペプチド結合を加水分解することにより、タンパク質を代謝することをいう。すなわち、タンパク分解活性を有するプロテアーゼによって、タンパク質はアミノ酸に分解される。用語「プロテアーゼ活性」（protease activity）及び「タンパク分解活性」は相互交換可能に用いられる。以下の「プロテアーゼ」の定義も参照。
・変異体：本明細書において「変異体」（variant）とは、１又は２以上（数個）の特定の位置における１又は２以上（数個）のアミノ酸残基の（１又は２以上の）改変又は修飾（例えば置換、挿入及び／又は欠失）を含むポリペプチドとして定義される。改変ポリヌクレオチドは、人間の介入によりポリヌクレオチド配列を修飾して得られる。斯かる変異体としてはサブチリシン変異体、即ち、サブチリシン（subtilisin）（例えば配列番号１に開示されるポリヌクレオチド配列又はその相同配列）の変異体が挙げられる。用語「プロテアーゼ変異体」及び「サブチリシン変異体」は相互交換可能に用いられる。本発明の変異体はプロテアーゼ活性又はタンパク分解活性を有することが好ましい。用語「１又は２以上（one or more）」、「１又は数個（one or several）」、及び、少なくとも１つ（at least one）、は相互交換可能に用いられる。
・修飾：本明細書において「修飾」（modification(s)）とは、サブチラーゼの化学修飾と、親プロテアーゼをコードするＤＮＡの遺伝子操作とを包含するものとして定義される。斯かる修飾としては、（１又は２以上の）アミノ酸側鎖の（１又は２以上の）置換、所望の（１又は２以上の）アミノ酸の（１又は２以上の）置換、欠失及び／又は挿入が挙げられる。
・野生型酵素：「野生型」（wild-type）プロテアーゼ変異体とは、天然微生物（例えば自然界に見られる細菌、酵母又は糸状菌等）により発現されるプロテアーゼ変異体を指す。即ち、斯かるプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、人間の介入によりポリヌクレオチド配列を修飾して得られるものではない。
・親酵素：本明細書において「親」（parent）プロテアーゼ変異体、例えば「親」サブチリシン変異体とは、本発明の酵素変異体を作製するべく修飾（例えば（１又は２以上の）置換、挿入、欠失及び／又は切断）を加える対象となるプロテアーゼ（例えばサブチリシン）を意味する。また、この用語は、変異体の比較・アラインメントの対象となるポリペプチドも意味する。斯かる親としては、天然（野生型）ポリペプチド又は変異体が挙げられる。例えば、斯かる親ポリペプチドとしては、天然ポリペプチドのアミノ酸配列を修飾又は改変した変異体が挙げられる。親は対立遺伝子多型であってもよい。対立遺伝子多型（allelic variant）とは、同一の染色体座を択一的に占める一遺伝子の複数形態の何れかによってコードされるポリペプチドである。
単離変異体又はポリペプチド：本明細書において「単離変異体」（isolated variant）又は「単離ポリペプチド」（isolated polypeptide）とは、出所源から単離された変異体又はポリペプチドを指す。一側面によれば、斯かる変異体又はポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される純度において、少なくとも１％の純度、好ましくは少なくとも５％の純度、より好ましくは少なくとも１０％の純度、より好ましくは少なくとも２０％の純度、より好ましくは少なくとも４０％の純度、より好ましくは少なくとも６０％の純度、より一層好ましくは少なくとも８０％の純度、最も好ましくは少なくとも９０％の純度を有する。
実質的に純粋な変異体又はポリペプチド：本明細書において「実質的に純粋な変異体」（substantially pure variant）又は「実質的に純粋なポリペプチド」（substantially pure polypeptide）とは、天然又は組換により混在する他のポリペプチド材料の含有率が、重量基準で最大１０％、好ましくは最大８％、より好ましくは最大６％、より好ましくは最大５％、より好ましくは最大４％、より好ましくは最大３％、より一層好ましくは最大２％、最も好ましくは最大１％、とりわけ好ましくは最大０.５％であるポリペプチド調製物を指す。従って、実質的に純粋な変異体又はポリペプチドは、調製物中の総ポリペプチド材料に対して、重量基準で少なくとも９２％の純度、好ましくは少なくとも９４％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、より好ましくは少なくとも９６％の純度、より好ましくは少なくとも９６％の純度、より好ましくは少なくとも９７％の純度、より好ましくは少なくとも９８％の純度、より一層好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９.５％の純度、とりわけ好ましくは１００％の純度を有することが好ましい。本発明の変異体及びポリペプチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは例えば、周知の組換え法や従来の精製法を用いて変異体又はポリペプチドを調製することにより達成される。
・成熟ポリペプチド：本明細書において「成熟ポリペプチド」（mature polypeptide）とは、翻訳及び任意の翻訳後修飾（例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等）を経た最終形態にある、プロテアーゼ変異体活性を有するポリペプチドとして定義される。一側面によれば、成熟ポリペプチドは、配列番号３又は配列番号４のポリペプチドである。シグナルプログラムSignalIP3.0を用いて成熟ポリペプチドを予測してもよい。
・成熟ポリペプチドコーディング配列：本明細書において「成熟ポリペプチドコーディング配列」（mature polypeptide coding sequence）とは、プロテアーゼ変異体活性を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義される。一側面によれば、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号３又は配列番号４をコードするヌクレオチドである。
・同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性を、「同一性」（identity）というパラメーターで表す。
本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277；http://emboss.org）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一残基数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
本発明の目的においては、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上；http://emboss.org）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一デオキシリボヌクレオチド数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
・相同配列：本明細書において「相同配列」（homologous sequence）とは、tfastyサーチ（Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S. A. Krawetz, ed., pp.185-219）において、ミクロドキウム・ニバレ（Micrododhium nivale）プロテアーゼ変異体CBS 100236とのＥ値（又は予測値：expectancy score）が０.００１未満と予測されるポリペプチドとして定義される。
・ポリペプチド断片：本明細書において「ポリペプチド断片」（polypeptide fragment）とは、成熟ポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は２以上（数個）のアミノ酸が欠失してなるポリペプチド、又はその相同配列をいう。斯かる断片はプロテアーゼ変異体活性を有する。
・下位配列：本明細書において「下位配列」（subsequence）とは、成熟ポリペプチドコーディング配列の５'及び／又は３'末端から１又は２以上（数個）のヌクレオチドが欠失してなるポリヌクレオチド配列、又はその相同配列をいう。斯かる下位配列はプロテアーゼ変異体活性を有するポリペプチド断片である。
・対立遺伝子多型（対立遺伝子変異体）：本明細書において「対立遺伝子多型（対立遺伝子変異体）」（allelic variant）とは、同一の染色体座を択一的に占める一遺伝子の複数形態の夫々を指す。対立遺伝子変異（allelic variation）は自然界において突然変異により生じる。これにより個体集団内に多型が生じる場合もある。遺伝子の突然変異はサイレントである（コードされるポリペプチドは変化しない）場合もあるが、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に変化が生じる場合もある。ポリペプチドの対立遺伝子多型とは、遺伝子の対立遺伝子多型によりコードされるポリペプチドである。
・単離ポリヌクレオチド：本明細書において「単離ポリヌクレオチド」（isolated polynucleotide）とは、出所源から単離されたポリヌクレオチドを指す。一側面によれば、斯かる単離ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動により決定される純度において、少なくとも１％の純度、好ましくは少なくとも５％の純度、より好ましくは少なくとも１０％の純度、より好ましくは少なくとも２０％の純度、より好ましくは少なくとも４０％の純度、より好ましくは少なくとも６０％の純度、より一層好ましくは少なくとも８０％の純度、最も好ましくは少なくとも９０％の純度、とりわけ好ましくは少なくとも９５％の純度を有する。
・実質的に純粋なポリヌクレオチド：本明細書において「実質的に純粋なポリヌクレオチド」（substantially pure polynucleotide）とは、他の外因性又は不所望のヌクレオチドを含まず、遺伝子組換えポリペプチド生産系における使用に適した形態にあるポリヌクレオチド調製物を指す。すなわち、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然又は組換により混在する他のポリペプチド材料の含量が、重量基準で最大１０％、好ましくは最大８％、より好ましくは最大６％、より好ましくは最大５％、より好ましくは最大４％、より好ましくは最大３％、より一層好ましくは最大２％、最も好ましくは最大１％、とりわけ好ましくは最大０.５％である。しかし、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然の５’及び３’非翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含んでいてもよい。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量基準で少なくとも９０％の純度、好ましくは少なくとも９２％の純度、より好ましくは少なくとも９４％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、より好ましくは少なくとも９６％の純度、より好ましくは少なくとも９７％の純度、より一層好ましくは少なくとも９８％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％、とりわけ好ましくは少なくとも９９.５％の純度を有することが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。即ち、天然又は組換により混在する他のポリペプチド材料を本質的に含まないポリヌクレオチド調製物であることが好ましい。斯かるポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成の何れに由来するものでもよく、これらの任意の組み合わせでもよい。
・コーディング配列：本明細書において使用される場合、「コーディング配列」（coding sequence）とは、そのポリペプチド産物のアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は通常、オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）により画定される。オープン・リーディング・フレームは通常、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧやＴＴＧ等の代替開始コドンから開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ等の停止コドンで停止する。コーディング配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、組換えポリヌクレオチドの何れでもよい。
・ｃＤＮＡ：本明細書において「ｃＤＮＡ」とは、真核細胞から得られるスプライス後の成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写により調製されるＤＮＡ分子として定義される。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に通常存在するイントロン配列を有さない。初期一次ＲＮＡ転写産物がｍＲＮＡの前駆体となり、これが一連の処理工程を経て、最終的にスプライス後の成熟ｍＲＮＡを生じる。これらの工程には、スプライシングと呼ばれるプロセスによるイントロン配列の除去が含まれる。よって、ｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡは、イントロン配列を有さない。
・核酸コンストラクト：本明細書において「核酸コンストラクト」（nucleic acid construct）とは、天然遺伝子から単離され、或いは天然では存在しない核酸のセグメントを含むように修飾され、或いは合成された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列の発現に必要な調節配列を含む場合、核酸コンストラクトは「発現カセット」（expression cassette）と同義となる。
・調節配列：本明細書において「調節配列」（control sequence）とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を含むものとして定義される。各調節配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して同種でも外来でもよく、互いに同種でも外来でもよい。斯かる調節配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、調節配列はプロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む。特定の制限部位を導入する目的で、調節配列にリンカーを付加してもよい。これにより斯かる調節配列と、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドのコーディング領域との連結が容易になる。
・作動式に連結され：本明細書において「作動式に連結され」（operably linked）との記載は、ポリペプチドのコーディング配列が調節配列により発現されるように、ポリヌクレオチド配列の調節配列がコーディング配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
・発現：「発現」（expression）との語は、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを意味する。斯かるステップとしては、これらに制限されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。
・発現ベクター：本明細書において「発現ベクター」（expression vector）とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むとともに、その発現を可能とする更なるヌクレオチドと作動式に連結された、線状又は環状ＤＮＡ分子として定義される。
・宿主細胞：本明細書において「宿主細胞」（host cell）とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターにより形質転換（transformation）、トランスフェクション（transfection）、形質導入（transduction）等が可能な任意の細胞型を含む。「宿主細胞」という語には、親細胞の任意の子孫であって、複製時に生じた突然変異により親細胞とは同一ではなくなったものも含まれる。
・改善された特性：本明細書において「改善された特性」（improved property）とは、変異体に伴う特性であって、親プロテアーゼ変異体と比較して改善されたものをいう。斯かる改善された特性としては、これらに限定されるものではないが、よごれ等の洗浄性能、例えばタンパク質含有よごれに対する性能、よごれ除去、例えば卵汚れの除去、安定性、例えば熱安定性、酸化安定性、化学安定性、ｐＨ安定性、或いは粉末、液体又はゲル上の洗剤処方又は食器洗い組成物中での安定性等が挙げられる。本発明の変異体は、改変された温度依存活性プロファイル、ｐＨ活性、基質特異性、生成物特異性等を有していてもよい。一実施形態によれば、改善された特性としては、改善された食器洗い性能及び改善された安定性、並びに改善された食器洗い性能と改善された安定性との組み合わせ等が挙げられる。一実施形態によれば、改善された特性としては、改善された洗浄又は食器洗い性能、例えばタンパク質性よごれ等の除去、例えば卵汚れ等の除去等が挙げられる。
・洗浄性能：本記載中「洗浄性能」（wash performance）とは、例えば洗浄又は硬表面清浄時に洗浄対象物に存在するタンパク質又は有機物によるよごれを除去する酵素の能力を指すものとして用いられる。洗浄性能の改善は、例えば本明細書実施例３において定義されるいわゆる強度値（intensity value：Int）を算出することにより定量化することができる。本明細書実施例３の洗浄性能試験も参照のこと。洗浄性能と食器洗い性能とは相互交換可能に用いられる。
・改善された洗浄性能：本明細書において「改善された洗浄性能」（improved wash performance）とは、親プロテアーゼ変異体の洗浄性能と比較して、例えばよごれ除去の向上等によるプロテアーゼ変異体の洗浄性能の改変を示す酵素変異体として定義される。「洗浄性能」には洗濯物の洗浄性能の他、例えば食器洗いにおける洗浄性能も含まれる。
・硬表面清浄（hard surface cleaning）：本用語は「食器洗い」（dish wash）を含み、硬物体の清浄、例えば典型的な食器洗いの対象の清浄を指す。斯かる食器洗いの対象としては、これらに制限されるものではないが、皿類、カップ類、グラス類、ボウル類、並びに食事用器具類、例えばスプーン類、ナイフ類、フォーク類、給仕用具類、セラミック類、プラスチック類、金属類、陶器類、ガラス類、及びアクリル類等が挙げられる。
・食器洗い用組成物：「食器洗い用組成物」（dish wash composition）とは、硬表面を清浄するためのあらゆる形態の組成物を指す。本発明は、如何なる種類の食器洗い用組成物にも、又は如何なる特定の洗剤にも限定されない。
・プロテアーゼ（proteases）
タンパク質基質中のアミド結合を開裂する酵素は、プロテアーゼに、或いは（ほぼ同義である）ペプチターゼ（peptitases）に分類される（Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3参照）。
アミノ酸の位置／残基の番号付け
別途記載がない限り、本明細書で使用するアミノ酸の番号付けは、サブチラーゼＢＰＮ’（BASBPN）配列の番号に従う。ＢＰＮ’配列の更なる説明は、配列番号２又は Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 を参照のこと。
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼはペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、その活性部位には重要なセリン残基が存在する（White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp.271-272）。
細菌セリンプロテアーゼは、２０，０００から４５，０００ダルトンの範囲の分子質量を有し、ジイソプロピルフルオロリン酸類により阻害される。単純に末端エステルを加水分解し、真核細胞のキモトリプシン、更にはセリンプロテアーゼと同様の活性を有する。サブグループを意味するより狭義の語であるアルカリプロテアーゼは、ｐＨ９．０〜１１．０という高い最適ｐＨを有する一部のセリンプロテアーゼを表す（概説につき、Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753 を参照のこと）。
サブチラーゼ
セリンプロテアーゼのサブグループである仮称サブチラーゼは、Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 及び Siezen et al., Protein Science 6 (1997) 501-523 により提案された。サブチラーゼは、従前はサブチリシン様プロテアーゼと呼ばれていたセリンプロテアーゼの１７０超のアミノ酸配列のホモロジー分析により定義された。サブチリシンは従前、グラム陽性細菌又は真菌により産生されるセリンプロテアーゼとして定義される場合が多かったが、Siezen et al. によれば、現在はサブチラーゼのサブグループとされている。様々なサブチラーゼが同定され、また、数々のサブチラーゼのアミノ酸配列が決定されてきた。サブチラーゼ及びそのアミノ酸配列のより詳しい解説については、Siezen et al. (1997) を参照のこと。
サブチラーゼのサブグループの一つであるI-S1、別称「真」（true）サブチリシンには、「旧知の」（classical）サブチリシン類、例えばサブチリシン１６８（BSS168）、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンCarlsberg（ALCALASE（登録商標）、NOVOZYMES A/S）、及びサブチリシンＤＹ（BSSDY）が含まれる。
サブチラーゼの別のサブグループであるI-S2、別称、高アルカリサブチリシンは、Siezen et al. により認められた（同上）。サブグループI-S2 プロテアーゼは、高アルカリ性のサブチリシンとして規定され、例としてはサブチリシンＰＢ９２（BAALKP）（MAXACAL（登録商標）、Genencor International Inc.)、サブチリシン３０９（サビナーゼ（登録商標）、NOVOZYMES A/S）、サブチリシン１４７（BLS147）（ESPERASE（登録商標）、NOVOZYMES A/S)、及びアルカリ性エラスターゼＹａＢ（BSEYAB）等の酵素が挙げられる。
「サビナーゼ （登録商標） 」
サビナーゼ（登録商標）は、NOVOZYMES A/Sが販売するＢ．レンタス（B. Lentus）由来のサブチリシン３０９であり、ＢＡＡＬＫＰとの差異は一箇所のみ（Ｎ８７Ｓ）である。サビナーゼ（登録商標）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
親サブチラーゼ
「親サブチラーゼ」（parent subtilaze）という語は、Siezen et al. により定義されるサブチラーゼをいう（１９９１及び１９９７）。更なる詳細については、上記「サブチラーゼ」の欄を参照のこと。親サブチラーゼは、天然物から単離されたサブチラーゼに対して、サブチラーゼの特性を保持しつつ修飾を加えたものであってもよい。更には、例えばJ.E. Ness et al., Nature Biotechnology, 17, 893-896 (1999) 等に記載のＤＮＡシャフリング（DNA shuffling）法により調製されたサブチラーゼであってもよい。
或いは、「親サブチラーゼ」を「野生型サブチラーゼ」（wild type subtilaze）と称する場合もある。
参考のために、本明細書記載の種々のサブチラーゼの同義語を以下の表に示す。更なる同義語については、Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 及び Siezen et al, Protein Science 6 (1997) 501-523 を参照のこと。
Figure 0005947213
サブチラーゼの修飾
本明細書において「修飾」（modification(s)）とは、サブチラーゼの化学修飾に加えて、サブチラーゼをコードするＤＮＡの遺伝子操作をも含むものとして定義される。１又は２以上の修飾としては、１又は２以上のアミノ酸側鎖の１又は２以上の置換、１又は２以上の所望のアミノ酸における１又は２以上の置換、欠失及び／又は挿入が挙げられる。
サブチラーゼ変異体
「変異体」という語及び「サブチラーゼ変異体」という語は上述の通りである。
相同サブチラーゼ配列
本明細書において、２つのアミノ酸配列間のホモロジーは、「同一性」というパラメーターにより記載される。本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、上述の Needleman-Wunsch アルゴリズムを用いて決定される。上記ルーチンにより、アミノ酸アラインメントに加えて、２つの配列間の「％同一性」が出力される。
本明細書に基づき、当業者であれば定型の操作により、本発明に従い修飾し得る適切な相同サブチラーゼを特定することが可能である。
一側面によれば、親プロテアーゼは、配列番号１に対し、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
実質的に相同な親プロテアーゼ変異体は、１又は２以上（数個）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい。本明細書において「１又は２以上」（one or more）と「数個」（several）は相互交換可能に用いられる。これらの変更は軽微なものであることが好ましい。即ち、上述の保存アミノ酸の置換や、タンパク質又はポリペプチドの三次元フォールディング又は活性に実質的な影響を与えないその他の置換；微小な欠失、通常は１から約３０のアミノ酸の欠失；並びに、アミノ末端又はカルボキシル末端の微小な伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基や、最大２０〜２５残基程度の微小なリンカーペプチド、或いは精製を容易にする微小な伸長（アフィニティータグ）、例えばポリヒスチジントラクトやタンパク質Ａ等である（Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4:1075；及びNilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198:3。また、概要について、Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107 も参照のこと）。
上述の変更は軽微なものであることが好ましいが、斯かる変更は本質的なものであってもよい。例えば、アミノ酸数が最大３００又はそれ以上のより大きなポリペプチドを、アミノ又はカルボキシル末端の双方に連結、伸長してもよい。
親プロテアーゼは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はプロテアーゼ活性を有するその断片を含み、又はこれらの何れかから構成される。一側面によれば、親プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は配列番号１のアミノ酸配列から構成される。
サブチラーゼ変異体
本発明は、親サブチラーゼに対し、以下の１又は２以上の特性が改変された新規サブチラーゼ変異体に関する。洗浄性能、例えば改善されたしみの除去能力、硬質表面洗浄、例えば食器洗いにおける洗浄性能、安定性、例えば貯蔵又は熱安定性及び触媒活性。本発明の一観点によれば、前記変異体は、改善された卵除去能力、例えば硬質表面からのゆで卵卵黄の改善された除去能力を有する。
本発明のサブチラーゼ変異体の洗剤組成物における洗浄性能は、洗浄実験により決定することができる。酵素変異体は、実施例３に詳細に説明するように、自動機械負荷分析（Automated Mechanical Stress Assay：ＡＭＳＡ）を用いて試験することができる。
本発明の変異体の触媒活性は、実施例に詳細に説明するように、“Kinetic Suc AAPF-pNA”アッセイを用いて決定することができる。
一態様によれば、本発明の一部として想定される変異体は、親サブチラーゼと比較して１又は２以上のアミノ酸残基が置換、欠失又は挿入されている変異体であって、置換９｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝、１５｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、６８｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、２１８｛Ｄ，Ｓ，Ｇ，Ｖ｝及び２４５｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝を含み、更に修飾６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄのうち少なくとも１つを含む（前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する）。
本発明の一態様によれば、変異体は更に、改変Ｇ６１Ｅ、Ａ９８Ｓ又はＳ９９Ｇのうち少なくとも１つを含む。
本発明の特定の態様によれば、変異体は、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
天然由来又は人工多様化合成により得られた酵素の場合も、或いは親サブチラーゼから変異体を設計して産生する場合も、親サブチラーゼはサブグループＩ−Ｓ１又はＩ−Ｓ２、特にサブグループＩ−Ｓ２に属することが好ましい。
サブグループＩ−Ｓ１由来の変異体に関しては、ＢＳＳ１６８（ＢＳＳＡＳ、ＢＳＡＰＲＪ、ＢＳＡＰＲＮ、ＢＭＳＡＭＰ）、ＢＡＳＢＰＮ、ＢＳＳＤＹ、ＢＬＳＣＡＲ（ＢＬＫＥＲＡ、ＢＬＳＣＡ１、ＢＬＳＣＡ２、ＢＬＳＣＡ３）、ＢＳＳＰＲＣ（セリンプロテアーゼＣ）、及びＢＳＳＰＲＤ（セリンプロテアーゼＤ）、或いはサブグループＩ−Ｓ１の特性を保持するその機能的変異体からなる群より選択される親サブチラーゼを選択するのが好ましい。
サブグループＩ−Ｓ由来の変異体に関しては、ＢＳＡＰＲＱ、ＢＬＳ１４７（ＢＳＡＰＲＭ、ＢＡＨ１０１）、ＢＬＳＡＶＩ（ＢＳＫＳＭＫ、ＢＡＡＬＫＰ、ＢＬＳＵＢＬ）、ＢＹＳＹＡＢ、ＢＡＰＢ９２、ＴＶＴＨＥＲ、及びＢＳＡＰＲＳ、或いはサブグループＩ−Ｓ２の特性を保持するその機能的変異体からなる群より選択される親サブチラーゼを選択するのが好ましい。
例えば、親サブチラーゼはＢＬＳＡＶＩ（サビナーゼ（登録商標）、NOVOZYMES A/S）であり、従って本発明の好ましいサブチラーゼ変異体は、サビナーゼ（登録商標）（配列番号１）の変異体である。
変異体の設計上の規約
本発明の目的においては、配列番号２に記載のＢＰＮ’のアミノ酸配列を用いて、別のプロテアーゼ又はプロテアーゼ変異体の対応するアミノ酸残基を決定する。別のプロテアーゼ又はプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を、配列番号２に開示のプロテアーゼのアミノ酸配列とアラインし、このアラインメントに基づいて、配列番号２に開示のプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列における任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置の番号を決定することができる。
ポリペプチド配列のアラインメントは、例えば「ClustalW」を用いて実施することができる（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., 1994, CLUSTAL W:Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, sites-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22:4673-4680）。ＤＮＡ配列のアラインメントは、例えば、ポリペプチドアラインメントをテンプレートとして用い、アミノ酸をＤＮＡ配列の対応するコドンに置き換えることにより実施される。
配列同一性がおよそ２０〜３０％を超えない程度のポリペプチド配列間の類似性を検出するには、常用の配列対比較アルゴリズムで十分である（Doolittle, 1992, Protein Sci. 1:191-200; Brenner et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6073-6078）。しかし、同程度且つ同様の生物学的機能を有する真に相同なポリペプチドであっても、従来の配列に基づく比較ではその関連性を検出できない程度にまで分化したものも多々存在する（Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295:613-615）。ポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率的表現を用いてデータベースを検索する検索プログラムを用いることにより、より高い感度で配列に基づく検索を行うことができる。例えば、PSI-BLAST プログラムは、反復データベース検索プロセスを通じてプロファイルを生成するもので、遠縁のホモログを検出することが可能である（Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）。着目するポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーが１又は２以上（数個）の表現がタンパク質構造データベースに存在する場合には、更に高い感度が達成可能である。例えばGenTHREADER（Jones 1999, J. Mol. Biol. 287:797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19:874-881）等のプログラムは、種々のソース由来の情報（PSI-BLAST、二次構造予測（secondary structure prediction）、構造アラインメントプロファイル（structural alignment profiles）、及び溶媒和ポテンシャル（solvation potentials））をニューラルネットワークに入力し、クエリー配列の折り畳み構造を予測する。同様に、Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313:903-919 の方法を用いれば、未知の構造の配列を SCOP データベースに存在するスーパーファミリーモデルとアラインすることができる。これらのアラインメントを用いれば、更に着目するポリペプチドのホモロジーを生成することができる。斯かるモデルの精度を検証するには、その目的で開発された種々のツールを用いればよい。
構造既知のタンパク質の場合、構造的アラインメントの検索及び生成に、幾つかのツールやリソースが利用できる。例えばタンパク質の SCOP スーパーファミリーは構造的にアラインメントがなされており、斯かるアラインメントはアクセス及びダウンロード可能である。２以上のタンパク質構造のアラインメントには、種々のアルゴリズム、例えばディスタンス・アラインメント・マトリックス（distance alignment matrix）（Holm and Sander, 1998, Proteins 33:88-96）又はコンビナトリアル・エクステンション（combinatorial extension）（Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747）が使用できる。更には、これらのアルゴリズムを実行し、着目する構造について構造データベースにクエリーすれば、可能性のある構造的ホモログを発見することも可能である（例えば Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567）。これらの構造的アラインメントを用いて、同一の構造的スーパーファミリーに属するタンパク質中の、構造的及び機能的に対応するアミノ酸残基を予測することもできる。斯かる情報を、ホモロジーモデリング及びプロファイル検索から得られた情報と組み合わせれば、所望の突然変異によりあるタンパク質を近縁又は遠縁のホモログに移行させるためには、どの残基を変異させればよいかを予測することが可能となる。
本発明の種々のプロテアーゼ変異体を記述するにあたり、参照の便宜のため、以下に記載の命名法を採用する。いずれの場合も、アミノ酸の略称としては、周知のＩＵＰＡＣによる１文字又は３文字の略称を用いる。
本発明に従って製造又は設計される種々のサブチラーゼ酵素変異体を記述するに当たり、参照の便宜のため、以下の命名法及び規約を採用する。
基準系は、単離酵素又は親酵素を最初に上述のサブチリシンＢＰＮ’（BASBPN）配列番号２とアラインすることにより定義する。
親プロテアーゼ変異体
置換 アミノ酸置換については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、置換アミノ酸。従って、位置２２６におけるスレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表す。多重突然変異については、例えば加算記号（「＋」）により区切って表記する。例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）に置換し、位置４１１のセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）に置換する突然変異を表す。或いは、多重突然変異をスペースで区切り、例えばＧ２０５Ｒ Ｓ４１１Ｆのように表記し、又はカンマ（，）で区切り、例えばＧ２０５Ｒ，Ｓ４１１Ｆのように表記してもよい。
欠失 アミノ酸欠失については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置＊。従って、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表す。多重欠失については、置換の場合と同様に、例えばカンマ（，）で区切り、「Ｇｌｙ１９５＊、Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊、Ｓ４１１＊」のように表記すればよい。
挿入 アミノ酸挿入については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸。従って、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」又は「＊１９５ａＫ」と表す。アミノ酸の多重挿入は、［原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸＃１、新たに挿入されるアミノ酸＃２；等］と表す。例えば、位置１９５のグリシンの後にリシン及びアラニンを挿入する場合、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と表す。
斯かる場合において、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基の番号付けは、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対し、小文字を付加することにより行う。すなわち、上記例の場合、配列は以下のようになる。
Figure 0005947213
親プロテアーゼ変異体は、任意の材料から取得できる。例としては微生物材料、例えば真菌、例えば糸状菌又は酵母が挙げられる。或いは、既知の核酸又はアミノ酸配列情報から調製した人工配列でもよい。
斯かる菌株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH（ＤＳＭ）及びCentraalbureau Voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）等の菌株保存機関から、一般に容易に入手可能である。
本発明の一側面によれば、親サブチリシンは、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
本発明の一側面によれば、親プロテアーゼは、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であるアミノ酸配列を含む。
別の側面によれば、親プロテアーゼは、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であり、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の一側面によれば、変異体は、配列番号１との差異が３０アミノ酸、２９アミノ酸、２８アミノ酸、２７アミノ酸、２６アミノ酸、２５アミノ酸、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸であるアミノ酸配列を有する。
本発明の特定の側面によれば、本発明の変異体は、配列番号１との差異が１２アミノ酸、より好ましくは１１アミノ酸、より好ましくは１０アミノ酸、より一層好ましくは９アミノ酸、最も好ましくは８アミノ酸であるアミノ酸配列を有する。
一側面によれば、親（例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有する親プロテアーゼ変異体）との比較における、本発明の変異体中のアミノ酸改変の数は、２０改変、１９改変、１８改変、１７改変、１６改変、１５改変、１４改変、１３改変、１２改変、１１改変、１０改変、９改変、８改変、７改変、６改変、５改変、４改変、より好ましくは３改変、より一層好ましくは２改変、最も好ましくは１改変からなり、或いはこれらを含む。別の側面によれば、本発明の変異体中のアミノ酸改変の数は、好ましくは２０改変、１９改変、１８改変、１７改変、１６改変、１５改変、１４改変、１３改変、１２改変、１１改変、１０改変、９改変、８改変、７改変、６改変、５改変、４改変、３改変、２改変、又は１改変からなる。
一側面によれば、親（例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有する親プロテアーゼ変異体）との比較における、本発明の変異体中のアミノ酸改変の数は、２０置換、１９置換、１８置換、１７置換、１６置換、１５置換、１４置換、１３置換、１２置換、１１置換、１０置換、９置換、８置換、７置換、６置換、５置換、４置換、より好ましくは３置換、より一層好ましくは２置換、最も好ましくは１置換からなり、或いはこれらを含む。別の側面によれば、本発明の変異体中のアミノ酸改変の数は、２０置換、１９置換、１８置換、１７置換、１６置換、１５置換、１４置換、１３置換、１２置換、１１置換、１０置換、９置換、８置換、７置換、６置換、５置換、４置換、３置換、２置換、又は１置換からなる。
一側面によれば、変異体は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であるアミノ酸配列を含む。
一側面によれば、変異体は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であり、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
一側面によれば、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列又はその対立遺伝子多型、又はプロテアーゼ変異体活性を有するその断片等からなり、或いはこれを含む変異体の使用に関する。一側面によれば、斯かる変異体は、配列番号３のアミノ酸配列からなり、或いはこれを含む。別の側面によれば、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列、又は対立遺伝子多型からなり、或いはこれを含む変異体の硬表面清浄における使用に関する。更に、本発明は、タンパク質性の汚れ、特にゆで卵による汚れを、硬表面又は洗濯物布地から除去する方法であって、卵よごれを含む硬表面又は卵よごれを含む洗濯物布地を、配列番号３のアミノ酸配列又はその対立遺伝子多型からなり、或いはこれを含むサブチリシン変異体を含む清浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は食器洗い用組成物に接触させることを含む方法にも関する。
一側面によれば、変異体は、配列番号３に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であるアミノ酸配列を含む。
一側面によれば、変異体は、配列番号３に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であり、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
一側面によれば、変異体は、配列番号３との差異が３０アミノ酸、２９アミノ酸、２８アミノ酸、２７アミノ酸、２６アミノ酸、２５アミノ酸、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸であるアミノ酸配列を有する。
一側面によれば、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列又はその対立遺伝子多型、又はプロテアーゼ変異体活性を有するその断片等からなり、或いはこれを含む変異体の使用に関する。一側面によれば、斯かる変異体は、配列番号４のアミノ酸配列からなり、或いはこれを含む。別の側面によれば、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列、又は対立遺伝子多型からなり、或いはこれを含む変異体の硬表面清浄における使用に関する。更に、本発明は、タンパク質性の汚れ、特にゆで卵による汚れを、硬表面又は洗濯物布地から除去する方法であって、卵よごれを含む硬表面又は卵よごれを含む洗濯物布地を、配列番号４のアミノ酸配列又はその対立遺伝子多型からなり、或いはこれを含むサブチリシン変異体を含む清浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は食器洗い用組成物に接触させることを含む方法にも関する。
一側面によれば、変異体は、配列番号４に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であるアミノ酸配列を含む。
一側面によれば、変異体は、配列番号４に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であり、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
一側面によれば、変異体は、配列番号４との差異が３０アミノ酸、２９アミノ酸、２８アミノ酸、２７アミノ酸、２６アミノ酸、２５アミノ酸、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸であるアミノ酸配列を有する。
実質的に相同な変異体は、１又は２以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい。これらの変更は軽微なものであることが好ましい。即ち、上述の保存アミノ酸の置換や、タンパク質又はポリペプチドの三次元フォールディング又は活性に実質的な影響を与えないその他の置換；微小な欠失、通常は１から約３０のアミノ酸の欠失；並びに、アミノ末端又はカルボキシル末端の微小な伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基や、最大２０〜２５残基程度の微小なリンカーペプチド、或いは精製を容易にする微小な伸長（アフィニティータグ）、例えばポリヒスチジントラクトやタンパク質Ａ等である（Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4:1075；及びNilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198:3。また、概要について、Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107 も参照のこと）。
上述の変更は軽微なものであることが好ましいが、斯かる変更は本質的なものであってもよい。例えば、アミノ酸数が最大３００又はそれ以上のより大きなポリペプチドを、アミノ又はカルボキシル末端の双方に連結、伸長してもよい。
変異体の調製
親プロテアーゼの変異体は、当業界で周知の任意の突然変異誘発法、例えば部位特異的突然変異誘発法、合成遺伝子構築法、半合成遺伝子構築法、ランダム突然変異誘発法、シャッフリング等を用いて調製可能である。
部位特異的突然変異誘発法（site-directed mutanogenesis）は、親プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド分子内の所定の部位に１又は数個の突然変異を形成する手法である。インビトロ（in vitro）でもインビボ（in vivo）でも実施可能である。
合成遺伝子構築法（synthetic gene construction）は、所望のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド分子を設計し、これをインビトロで合成するものである。遺伝子合成は数々の手法を用いて実施可能である。例としては、Tian, et. al.が報告する多重マイクロチップ法（multiplex microchip-based technology）（Tian, et. al., Nature 432:1050-1054）や、類似の手法が挙げられる。これらの手法は、光プログラム可能なマイクロ流体チップ上で、オリゴヌクレオチドを合成、構築するものである。
部位特異的突然変異誘発法は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、インビトロで実施可能である。また、親プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド内の部位を制限酵素で切断し、次いで当該ポリヌクレオチド中に所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドを連結する工程を含むカセット突然変異誘発法によっても、部位特異的突然変異誘発法をインビトロで実施することができる。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを同一の制限酵素で消化することにより、プラスミド及び挿入物の付着末端を互いに連結することが可能となる。例えばScherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4949-4955；及び Barton et al., 1990, Nucleic Acids Research 18:7349-4966 等を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発法は、当業界で周知の任意の手法により、インビボでも実施可能である。例えば、米国特許出願第２００４/０１７１１５４号；Storici et al., 2001, Nature Biotechnology 19:773-776； Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290；及び Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43:15-16 等を参照のこと。
本発明では任意の部位特異的突然変異誘発法を使用できる。親プロテアーゼ変異体の変異体の調製に使用し得るキットは多々市販されている。
単一又は多重のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を形成・検証するには、公知の突然変異誘発法、組換え、及び／又はシャッフリングを用いた後、適切なスクリーニング法、例えば Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号等に開示の手法を用いればよい。他の使用可能な方法としては、error-pr1 ＰＣＲ、ファージ・ディスプレイ（phage display）（例えば Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開第９２／０６２０４号等）及び領域特異的突然変異誘発法（Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145；Ner et al., 1988, DNA 7:127）等が挙げられる。
突然変異誘発法／シャッフリング法をハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせることにより、宿主細胞により発現されるクローン化突然変異ポリペプチドの活性を検出することが可能となる。当業界の標準法により、活性ポリペプチドをコードする突然変異ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、即時に配列決定することができる。これらの手法により、着目するポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を、迅速に決定することが可能となる。
半合成遺伝子構築法（semi-synthetic gene construction）は、合成遺伝子構築法、及び／又は部位特異的突然変異誘発法、及び／又はランダム突然変異誘発法、及び／又はシャッフリングの態様を組み合わせることにより実施される。半合成構築法の代表的なプロセスは、合成ポリヌクレオチド断片をＰＣＲ法と組み合わせたものである。すなわち、例えば遺伝子の所定の領域を新規合成し、他の領域は部位特異的突然変異プライマー等を用いて増幅し、更に別の領域についてはerror-pr1 ＰＣＲ や non-error-pr1 ＰＣＲ増幅等を用いることができる。その後、ポリヌクレオチド断片をシャッフルしてもよい。
本発明の別の側面は、変異体を生成する方法であって、親サブチリシン中に、以下の置換：
ｉ）位置９の｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝による置換；
ii）位置１５の｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝による置換、
iii）位置６８の｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝による置換、
iv）位置２４５の｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝による置換、及び
ｖ）位置２１８の｛Ｄ，Ｓ，Ｇ又はＶ｝による置換、
並びに、以下の修飾のうち１又は２以上：位置６１の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、位置６２の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、位置７６の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、位置９７へのＧの挿入、位置９８の｛Ｇ，Ｓ｝による置換、位置９９のＧによる置換、位置１０１のＧによる置換、位置１２０の｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝による置換、位置１３１の｛Ｔ，Ｓ｝による置換、位置１３７のＨによる置換、位置１９４のＰによる置換、位置２２８のＶによる置換、位置２３０のＶによる置換、及び位置２６１のＤによる置換（前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する）、を導入することによる方法に関する。
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ａ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ１２０Ｖ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置でのＱ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ１２０Ｑ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｎ７６Ｄ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６１、６８、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６１６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６１、６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
ある特定の側面は、親サブチリシンに対して、下記の置換：
ｉ）位置９のＳのＲによる置換、
ii）位置１５のＡのＴによる置換、
iii）位置６８のＶのＡによる置換、
iv）位置２４５のＱのＲによる置換、及び
ｖ）位置２１８のＮのＤ、Ｓ、Ｇ又はＶによる置換、
並びに、以下の修飾のうち１又は２以上：
位置６１のＧのＥによる置換、位置６２のＮのＤによる置換、位置７６のＮのＤによる置換、位置９７へのＧの挿入、位置９８のＡのＳによる置換、位置９９のＳのＧによる置換、位置１０１のＳのＧによる置換、位置１２０のＨのＤ、Ｖ又はＱによる置換、位置１３１のＰのＴによる置換、位置１３９のＱのＨによる置換、位置１９４のＡのＰによる置換、位置２２８のＡのＶによる置換、位置２３０のＡのＶによる置換、及び位置２６１のＮのＤによる置換、を導入する方法に関する。
変異体：
一側面によれば、本発明は、置換９｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝、１５｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、６８｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、２１８｛Ｄ，Ｓ，Ｇ，Ｖ｝及び２４５｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝、並びに次の修飾：６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄのうち少なくとも１つを含む、親サブチラーゼの変異体に関する（前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する）。
一側面によれば、変異体は、位置９に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９に対応する位置に、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９に対応する位置に、Ｒによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対し、置換Ｓ９Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５に対応する位置に、Ｔによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対し、置換Ａ１５Ｔを含む。
一側面によれば、変異体は、位置６１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６１に対応する位置に、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６１に対応する位置に、Ｅによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｇ６１Ｅを含む。
一側面によれば、変異体は、位置６２に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６２に対応する位置に、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６２に対応する位置に、Ｄによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ６２Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置６８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６８に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６８に対応する位置に、Ａによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｖ６８Ａを含む。
一側面によれば、変異体は、位置７６に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、７６に対応する位置に、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置７６に対応する位置に、Ｄによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ７６Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９７に対応する位置に挿入を含む。別の側面によれば、変異体は、９７に対応する位置に、Ｇの挿入を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、＊９７ａＧの挿入を含む。
一側面によれば、変異体は、位置９８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９８に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９８に対応する位置に、Ｓによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ９８Ｓを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９９に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９９に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９９に対応する位置に、Ｇによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９９Ｇを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１０１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１０１に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１０１に対応する位置に、Ｇによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ１０１Ｇを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１２０に対応する位置に、Ｑ、Ｖ、Ｎ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に、Ｄによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｈ１２０Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１２０に対応する位置に、Ｑ、Ｎ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１２０Ｎに対応する位置に、による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｈ１２０Ｎを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１２０に対応する位置に、Ｑ、Ｖ、Ｎ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に、Ｖによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｈ１２０Ｖを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１２０に対応する位置に、Ｑ、Ｎ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に、Ｑによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｈ１２０Ｑを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１３１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１３１に対応する位置に、Ｔ又はＳによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１３１に対応する位置に、Ｓによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｐ１３１Ｓを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１３７に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１３７に対応する位置に、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１３７に対応する位置に、Ｈによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｑ１３７Ｈを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１９４に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１９４に対応する位置に、Ｐによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１９４Ｐを含む。
一側面によれば、変異体は、位置２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２１８に対応する位置に、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２１８に対応する位置に、Ｖによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ２１８Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置２２８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２２８に対応する位置に、Ｌ、Ｉ又はＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２２８に対応する位置に、Ｖによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ２２８Ｖを含む。
一側面によれば、変異体は、位置２３０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２３０に対応する位置に、Ｌ、Ｉ又はＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２３０に対応する位置に、Ｖによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ２３０Ｖを含む。
一側面によれば、変異体は、位置２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２４５Ｒに対応する位置に、による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｑ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置２６１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２６１に対応する位置に、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２６１に対応する位置に、Ｄによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ２６１Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９及び１５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び１５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び１５に対応する位置に、夫々Ｒ及びＴによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ及びＡ１５Ｔを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９及び６８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び６８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び６８に対応する位置に、夫々Ｒ及びＡによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ及びＶ６８Ａを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び２１８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び２１８に対応する位置に、夫々Ｒ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ及びＮ２１８Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１５及び６８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５及び６８に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５及び６８に対応する位置に、夫々Ｔ及びＡによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ及びＶ６８Ａを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１５及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５及び２１８に対応する位置に、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５及び２１８に対応する位置に、夫々Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ及びＮ２１８Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１５及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５及び２４５に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５及び２４５に対応する位置に、夫々Ｔ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置６８及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６８及び２１８に対応する位置に、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６８及び２１８に対応する位置に、夫々Ａ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｖ６８Ａ及びＮ２１８Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置６８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６８及び２４５に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６８及び２４５に対応する位置に、夫々Ａ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｖ６８Ａ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｅ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び６１に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｄ又はＥによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６１に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＥによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＧ６１Ｅを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６２に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び６２に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｄ又はＥによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６２に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＮ６２Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び６８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＡによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び７６に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び７６に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｄ又はＥによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び７６に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＮ７６Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９７に対応する位置に修飾を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び１５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含み、９７に対応する位置に挿入を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び１５に対応する位置に、夫々Ｒ及びＴによる置換を含み、位置９７に対応する位置に、Ｇの挿入を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、修飾Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及び＊９７ａＧを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び９８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＳによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＡ９８Ｓを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９９に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び９９に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９９に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＧによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＳ９９Ｇを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１２０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＨ１２０Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１２０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＮによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＨ１２０Ｎを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１２０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＨ１２０Ｖを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１２０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＱによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＨ１２０Ｑを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１３１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１３１に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１３１に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及び｛Ｓ、Ｔ｝による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＰ１３１｛Ｓ、Ｔ｝を含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１３７に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１３７に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１３７に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＱ１３７Ｈを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１９４に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１９４に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１９４に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＰによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＡ１９４Ｐを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２１８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２１８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｎ２１８Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２２８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２２８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２２８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＡ２２８Ｖを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２３０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２３０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２３０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＡ２３０Ｖを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｑ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２６１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２６１に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２６１に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＮ２６１Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１５、６８及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５、６８及び２１８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５、６８及び２１８に対応する位置に、夫々Ｔ、Ａ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ及びＮ２１８Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１５、６８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５、６８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５、６８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｔ、Ａ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置６８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ａ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８及び２１８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８及び２１８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ及びＮ２１８Ｄを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｔ、Ａ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｑ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ１２０Ｑ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｑ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ１２０Ｖ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ７６Ｄ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６１ ６８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
更なる実施形態によれば、本明細書に記載のサブチラーゼ変異体は、以下の何れかの位置に、１又は２以上の修飾を有するのが有利である。
２７、３６、５６、８７、９５、９６、１００、１０２、１０３、１０４、１２３、１５９、１６７、１７０、２０６、２２２、２２４、２３２、２３５、２３６、２４５、２４８、２５２及び２７４。
具体的には、以下のＢＬＳＡＶＩ、ＢＬＳＵＢＬ、ＢＳＫＳＭＫ及びＢＡＡＬＫＰ修飾が、組み合わせに適している。
Ｋ２７Ｒ、＊３６Ｄ、Ｓ５６Ｐ、Ｓ８７Ｎ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ｖ１０４Ｎ、Ｖ１０４Ｙ、Ｓ１０６Ａ、Ｎ１２３Ｓ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ｒ１７０Ｌ、Ｎ２０４Ｄ、Ｖ２０５Ｉ、Ｑ２０６Ｅ、Ｌ２１７Ｄ、Ｍ２２２Ｓ、Ｍ２２２Ａ、Ｔ２２４Ｓ、Ａ２３２Ｖ、Ｋ２３５Ｌ、Ｑ２３６Ｈ、Ｎ２４８Ｄ、Ｎ２５２Ｋ及びＴ２７４Ａ。
更に有用な変異体として、Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ、Ｓ８７Ｎ＋Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ、Ｋ２７Ｒ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｎ１２３Ｓ＋Ｔ２７４Ａ、Ｎ７６Ｄ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ、Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ、Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄ、Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄ、Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ｖ２０５Ｉ又はＮ７６Ｄ＋Ｖ１０４Ａのうち何れかの修飾を、或いは他の修飾の組み合わせとして、Ｋ２７Ｒ、＊３６Ｄ、Ｓ５６Ｐ、Ｓ８７Ｎ、Ｇ９７Ｎ、Ｓ９９ＳＥ、Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ｖ１０４Ｎ、Ｖ１０４Ｙ、Ｓ１０６Ａ、Ｎ１２３Ｓ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ｒ１７０Ｌ、Ｎ２０４Ｄ、Ｖ２０５Ｉ、Ｑ２０６Ｅ、Ｌ２１７Ｄ、Ｍ２２２Ｓ、Ｍ２２２Ａ、Ｔ２２４Ｓ、Ａ２３２Ｖ、Ｋ２３５Ｌ、Ｑ２３６Ｈ、Ｎ２４８Ｄ、Ｎ２５２Ｋ又はＴ２７４Ａを、上述の１又は２以上の修飾との組み合わせで有するものが、改善された特性を発揮する。
ある側面によれば、変異体は、配列番号３の成熟ポリペプチドの位置６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｎ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄの１又は２以上に対応する位置に修飾を含む。
ある側面によれば、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの位置６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｎ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄ１又は２以上に対応する位置に修飾を含む。
更に、本発明の主側面に係るサブチラーゼ変異体を、位置６１、６２、７６、９７、９８、９９、１０１、１２０、１３１、１３７、１９４、２２８、２３０及び２６１の何れかの位置における１又は２以上の修飾、好ましくは６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｄ，Ｎ，Ｖ，Ｑ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄ、より一層好ましくは６１Ｅ、６２Ｄ、７６Ｄ、＊９７ａＧ、９８Ｓ、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０Ｄ、１３１Ｔ、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄと組み合わせることが好ましい。これらの修飾は何れも、サブチラーゼ変異体の生産において、その発現レベルを増大させることが期待される。
特に興味ある変異体は、本発明の修飾の他に、次の置換を含む変異体である。
Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒ。
更に興味深い変異体の例を以下に挙げる。
Figure 0005947213
本発明の選択された変異体の洗浄性能は、例えば本明細書の実施例３に示す洗浄性能試験により検証することができる。斯かる洗浄性能試験により、例えば変異体を標準的な洗剤組成物又は市販の洗剤組成物に組み込んだ上で、硬表面からタンパク質性の汚れを除去する能力を、基準となる系との対比で、即ち親サブチラーゼ又は（同一の洗剤系に組み込んで同一条件下で試験した場合に）より優れた洗浄性能を示す同様のサブチラーゼとの比較において検証することができる。本発明の酵素変異体は、自動機械負荷分析（Automated Mechanical Stress Assay：ＡＭＳＡ）を用いて試験された。ＡＭＳＡ試験を用いれば、少量の酵素洗剤溶液が多数存在する場合でも、その洗浄性能を迅速に検証することができる。この試験を用いて選択された変異体の洗浄性能をまず検査し、選択された変異体が親サブチラーゼと比べて顕著な改善を示さない場合には、通常それ以上の実験を実施する必要はない。
従って、本明細書に記載の目的において特に興味深い変異体は、市販の洗剤組成物 例えば欧州系の食器洗い用洗剤、米国系の食器洗い用洗剤、アジア系の洗濯用洗剤、欧州系の洗濯用洗剤、又はラテンアメリカ系の洗濯用洗剤（一部の例を洗浄性能試験（実施例３）に示す）において試験した場合に、同一条件下で試験された親サブチラーゼと比べて改善された洗浄性能を示すような変異体である。
もちろん、本発明の変異体は、上記基準を少なくとも上記記載の最低レベルで充足すればよいが、最高レベルで充足することがより好ましい。
核酸コンストラクト
本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドと、これと作動式に連結された１又は２以上の調節配列とを含む核酸コンストラクトであって、適切な宿主細胞中において、調節配列に適合する条件下、前記調節配列により前記コーディング配列が発現されるような核酸コンストラクトにも関する。
本発明のプロテアーゼ変異体の発現を可能とするべく、当該変異体をコードする単離ポリヌクレオチドを、種々の手法により操作してもよい。発現ベクターの種類によっては、ベクターへの挿入前にポリヌクレオチドを操作することが好適又は必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を用いてポリヌクレオチドを修飾する手法は、当業者には周知である。
調節配列としては、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞に認識される、適切なプロモーター配列が挙げられる。プロモーター配列は、変異プロテアーゼ変異体の発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すものであれば、如何なる核酸配列であってもよく、突然変異型、切断型、ハイブリッド型等のプロモーターであってもよい。また、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする何れの遺伝子から取得されたものでもよい。
細菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を引き起こすのに適したプロモーターの例としては、大腸菌（E. coli）乳糖オペロン（lac operon）、ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（amyM）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）xylA 及び xylB 遺伝子、及び原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731）由来のプロモーター、並びに tac プロモーター（DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25）が挙げられる。更なるプロモーターは"Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94；及び Sambrook et al., 1989（同上）に記載されている。
糸状菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を引き起こすのに適したプロモーターの例としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ （国際公開第００/５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Daria（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Quinn（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼ II、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）β−キシロシダーゼ由来のプロモーター、並びに NA2-tpiプロモーター（アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ由来のプロモーターのハイブリッド）；並びにこれらの突然変異型、切断型、ハイブリッド型プロモーターが挙げられる。
酵母宿主の場合、有用なプロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（GAL１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコール デヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH１、ADH２/GAP）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（CUP１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に有用な他のプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488 に記載されている。
調節配列としては、転写を停止するために宿主細胞に認識される、適切な転写ターミネーター配列も挙げられる。ターミネーター配列は、変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動式に連結される。本発明では、選択された宿主細胞において機能し得る任意のターミネーターを使用することができる。
糸状菌宿主細胞の場合、ターミネーターとしては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ由来のターミネーターが好ましい。
酵母宿主細胞の場合、ターミネーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）シトクロームＣ（CYC1）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ由来のターミネーターが好ましい。酵母宿主細胞に有用な他のターミネーターは、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。
調節配列としては、適切なリーダー配列も挙げられる。リーダー配列は、宿主細胞による翻訳に重要な役割を果たすｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動式に連結される。リーダー配列本発明では、選択された宿主細胞において機能し得る任意のリーダー配列本を使用することができる。
糸状菌宿主細胞の場合、リーダー配列としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、及びアスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼ由来のリーダー配列が好ましい。
酵母宿主細胞に適したリーダー配列としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/GAP）由来のリーダー配列が挙げられる。
調節配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。ポリアデニル化配列は、ポリペプチドをコードする配列の３’末端に作動式に連結され、転写時に宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。本発明では、選択された宿主細胞において機能し得る任意のポリアデニル化配列を使用することができる。
糸状菌宿主細胞の場合、ポリアデニル化配列としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ由来のポリアデニル化配列が好ましい。
酵母宿主細胞において有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990 に記載されている。
調節配列としては、シグナルペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、変異プロテアーゼ変異体のアミノ末端に連結され、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導するためのアミノ酸配列をコードする配列である。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端が、翻訳リーディングフレーム内において、分泌される変異プロテアーゼ変異体をコードするコーディング領域のセグメントと当初から連結された、固有のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。或いは、コーディング配列の５’末端が、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。外来のシグナルペプチドコーディング領域が必要となるのは、例えば、コーディング配列が生来のシグナルペプチドコーディング領域を有さない場合である。或いは、変異プロテアーゼ変異体の分泌を促進するために、外来のシグナルペプチドコーディング領域により、生来のシグナルペプチドコーディング領域をそのまま置換してもよい。しかしながら、本発明では、発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に誘導し得るものであれば、任意のシグナルペプチドコーディング領域を使用できる。
糸状菌宿主細胞において有効なシグナルペプチドコーディング配列としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼＶ及びフミコラ・ランギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ由来の配列が挙げられる。
酵母宿主細胞において有用なシグナルペプチドとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼが挙げられる。他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。
調節配列としては、プロペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、変異プロテアーゼ変異体のアミノ末端に配置されるアミノ酸配列をコードする配列である。得られるポリペプチドは酵素前駆体（proenzyme）又はプロポリペプチド（propolypeptide）（或いは場合によりチモーゲン（zymogen））と呼ばれる。プロポリペプチドは通常不活性であるが、触媒又は自己触媒によりプロペプチドがプロポリペプチドから切断されると、成熟活性ポリペプチドに変換される。プロペプチドコーディング領域としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びミセリオフィソラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号）由来の配列が挙げられる。
ポリペプチドのアミノ末端にシグナルペプチド及びプロペプチド領域の双方が存在する場合には、ポリペプチドのアミノ末端の隣にプロペプチド領域が配置され、プロペプチド領域のアミノ末端の隣にシグナルペプチド領域が配置される。
また、宿主細胞の生育との関連において、変異プロテアーゼ変異体の発現調節を可能にする調節配列を付与することも望ましい。調節系の例としては、調節化合物の存在等の化学又は物理刺激に応答して遺伝子の発現を開始又は停止させる系が挙げられる。原核細胞系における調節系としては、lac、tac、及びtrp オペレータ系が挙げられる。酵母においては、例えば ADH2 系又はGAL1 系が使用できる。糸状菌においては、例えば TAKA α−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）グルコアミラーゼプロモーターを調節配列として使用できる。他の調節配列の例としては、遺伝子の増幅を可能にする系が挙げられる。真核細胞系における斯かる調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子や、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、斯かる調節配列に作動式に連結される。
発現ベクター
本発明は、本発明の変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドと、プロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む組換え発現ベクターにも関する。上述の種々のヌクレオチド及び調節配列を組み合わせ、１又は２以上（数個）の制限部位を含む組換え発現ベクターを構築すれば、前記変異体をコードするポリヌクレオチドを斯かる部位に挿入又は置換することができ、好適である。或いは、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを、発現に適したベクターに挿入することにより、ポリヌクレオチドを発現させてもよい。発現ベクターを作製する際には、発現に適した調節配列とコーディング配列とが作動式に連結されるように、コーディング配列をベクター内に配置する。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に好適に利用でき、且つポリヌクレオチドの発現を生じ得るものであれば、任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）が使用できる。ベクターの選択は、通常はベクターを導入する宿主細胞と、ベクターとの適合性に依存する。ベクターは線状でも閉環状プラスミドでもよい。
ベクターは自己複製ベクター、即ち、染色体外成分として存在し、染色体複製とは独立に複製するベクターであってもよい。例としては、プラスミド、染色体染色体要素、ミニ染色体、又は人工染色体等が挙げられる。斯かるベクターは、自己複製を促進する任意の手段を含んでいてもよい。或いは、ベクターは、宿主細胞内に導入されるとゲノム内に組み込まれ、統合された染色体と一緒に複製されるものであってもよい。なお、宿主細胞のゲノムに導入されるＤＮＡ群は、単一のベクター又はプラスミドが含んでいてもよく、或いは２以上のベクター又はプラスミドが共同で含んでいてもよい。
本発明のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入等を生じた細胞の選択を容易にする、１又は２以上（数個）の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、殺生物剤、ウイルス耐性、重金属耐性、原栄養又は栄養要求性等を付与する物質を産生する遺伝子である。
酵母宿主細胞に適したマーカーとしては、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、及びURA3 が挙げられる。糸状菌宿主細胞に使用される選択マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチン カルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hph（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びtrpC（アントラニル酸シンターゼ）、並びにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス（Aspergillus）細胞での使用には、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の amdS 及び pyrG 遺伝子、並びにストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）の bar 遺伝子が好適である。
本発明のベクターは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込み、又は、細胞内におけるゲノムとは独立したベクターの自律的な複製を可能にする（１又は２以上の）要素を含むことが好ましい。
宿主細胞ゲノムへの組み込みの場合、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、或いはベクターのその他の要素に基づく相同又は非相同組換えにより、ゲノムへの組み込みを生じさせてもよい。或いは、宿主細胞ゲノムの（１又は２以上の）染色体内の（１又は２以上の）正確な位置に対して、相同組換えによるベクターの組み込みを生じさせるような更なるヌクレオチド配列を、ベクターが含んでいてもよい。正確な位置に組み込まれる確率を高めるべく、組み込み要素は、相同組換えの可能性を高めるよう、対応する標的配列と高い同一性を有する十分な数の核酸（例えば１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対）を有することが好ましい。斯かる組み込み要素は、宿主細胞のゲノムの標的配列に相同な配列であれば、任意の配列でよい。更に、斯かる組み込み要素は、非コーディング配列でもコーディング配列ヌクレオチド配列でもよい。一方、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよい。
自律的な複製の場合、ベクターは更に、所期の宿主細胞内でのベクターの自律的な複製を可能にする複製起点を含んでいてもよい。複製起点としては、自律的複製を生じさせるプラスミド複製子であって、細胞内で機能し得る任意の配列が挙げられる。本明細書において「複製起点」（origin of replication）又は「プラスミド複製子」（plasmid replicator）とは、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能にするヌクレオチド配列として定義される。
酵母宿主細胞に使用される複製起点の例としては、２ミクロン複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3との組み合わせ、及び、ARS4とCEN6との組み合わせが挙げられる。
糸状菌細胞において有用な複製起点の例としては、AMA1 及び ANS1 が挙げられる（Gems et al., 1991, Gene 98:61-67；Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15:9163-9175；国際公開第００／２４８８３号）。AMA1 遺伝子の単離、及び、当該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に開示の手法により達成することができる。
本発明のポリヌクレオチドを２コピー以上、宿主細胞に挿入することにより、プロテアーゼ変異体の産生を増進してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増大は、前記配列の少なくとも１つの更なるコピーを宿主細胞ゲノム内に組み込むことにより、或いは、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチド内に含め、適切な選択物質の存在下で細胞を培養した場合に、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、更には前記ポリヌクレオチドの更なるコピーを含む細胞が選択できるようにすることにより達成される。
実質的に純粋なプロテアーゼ変異体を得るべく、上述の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築する手法は、当業者には周知である（例えば Sambrook et al., 1989（同上）参照）。
宿主細胞
本発明は、変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、当該変異体の組換え産生に有利に使用される組換え宿主細胞にも関する。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入し、ベクターが上述の染色体組み込み体として、或いは自己複製染色体外ベクターとして維持されるようにする。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその起源に大きく依存する。
宿主細胞としては、変異プロテアーゼ変異体の組換え産生に有用な任意の細胞が挙げられる。宿主細胞は真核細胞、例えば哺乳類、虫、植物、又は真菌の細胞であってもよい。
一側面によれば、宿主細胞は真菌細胞である。本明細書において「真菌」（fungi）とは、子嚢菌（Ascomycota）門、担子菌（Basidiomycota）門、ツボカビ（Chytridiomycota）門、及び接合菌（Zygomycota）門を含む（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK の定義による）とともに、卵菌類（Oomycota）（Hawksworth et al., 1995（同上）１７１頁に言及あり）及び全ての分生子形成菌（Hawksworth et al., 1995（同上））をも含む。
別の側面によれば、真菌宿主細胞は酵母細胞である。本明細書において「酵母」（yeast）とは、有子嚢胞子酵母（Endomycetales）、担子胞子形成酵母、及び不完全菌に属する酵母（Blastomycetes）を含む。酵母の分類は今後変更される可能性があるが、本発明の目的においては、酵母はBiology and Activities of Yeast（Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980）に記載の定義に従うものとする。
別の側面によれば、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）細胞である。
別の側面によれば、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロミセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。別の側面によれば、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）細胞である。別の側面によれば、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
別の側面によれば、真菌宿主細胞は、糸状菌細胞である。「糸状菌」は（Hawksworth et al., 1995（同上）に定義のとおり）全ての真菌亜門（Eumycota）及び卵菌亜門（Oomycota）の線状体を含む。糸状菌は通常、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類からなる菌糸壁を特徴とする。栄養増殖は菌糸伸長により、炭素代謝は偏性好気性である。対して酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）による栄養増殖は、単細胞性葉状体の出芽により、炭素代謝は醗酵でも可能である。
別の側面によれば、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブイェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、マナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、スキゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、テルモアスカス（Thermoascus）、ティエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である。
別の側面によれば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）細胞である。別の側面によれば、糸状菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロークウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium グラムinearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium グラムinum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネガンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクララム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブキナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコキロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、又はフザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）細胞である。別の側面によれば、糸状菌宿主細胞は、ブイェルカンデラ・アジュスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレジエナ（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ジルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロザ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・トロピカム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・ゾナタム（Chrysosporium zonatum）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌジノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロール（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
真菌細胞は、公知の手法により、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換してもよい。アスペルギウス（Aspergillus）及びトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞の形質転換に適した手法は、欧州特許第２３８０２３号及び Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474 に記載されている。フサリウム（Fusarium）属の形質転換に適した手法は、Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156、及び国際公開第９６／００７８７号に記載されている。酵母は、例えばBecker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York；Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163；及び Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920 に記載の手法により形質転換される。
サブチラーゼ変異体を製造する方法
本発明は、本発明に係る単離酵素を製造する方法を提供する。この手法によれば、酵素をコードするＤＮＡ配列で形質転換された適切な宿主細胞を、酵素の産生を可能とする条件下で培養し、得られた酵素を培養物から回収する。
酵素をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを異種宿主細胞に形質転換すれば、本発明の酵素の異種組換え産生が可能となる。これにより、同種の不純物を含まない、高度に精製されたサブチラーゼ組成物を産生することが可能となる。
形質転換宿主細胞を培養するのに使用される培地としては、対象となる宿主細胞の成育に適した培地であれば、従来の任意の培地を使用できる。発現されたサブチラーゼは培地に分泌されるのが好適であり、周知の手法、例えば遠心分離又は濾過による培地からの細胞の分離や、硫酸アンモニウム等の塩を用いた培地中のタンパク質成分の沈殿等を用いて培地から回収した後、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法に供してもよい。
清浄及び洗剤組成物
本発明の酵素を洗剤組成物に添加してもよい。すなわち、本発明の酵素を洗剤組成物の構成要素としてもよい。清浄及び洗剤組成物については当業界では概して詳しく報告されているとおりであるが、適切な清浄及び洗剤組成物の更なる説明については、国際公開第９６／３４９４６号；国際公開第９７／０７２０２号；国際公開第９５／３００１１号を参照のこと。
本発明の洗剤組成物は、例えば手洗い用又は洗濯機用洗剤組成物として、例えば汚れた布地の前処理に適した洗濯用添加剤組成物や、リンスを添加した柔軟剤組成物として調製することができる。また、家事全般における硬表面清浄作業用の洗剤組成物として、又は手洗い又は食器洗い機用に調製することができる。
特定の形態によれば、本発明は、本発明の酵素を含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤及び洗剤組成物は、１又は２以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼ等を含んでいてもよい。
一般に、選択される酵素の特性は、選択される洗剤と適合性を有すべきであり（即ち最適ｐＨ、他の酵素系及び非酵素系成分との適合性等）、また、酵素は有効量で存在すべきである。
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼとしては、動物由来、植物由来又は微生物由来のものが挙げられる。微生物由来のものが好ましい。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。プロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼが挙げられるが、アルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼが好ましい。アルカリ性プロテアーゼの例としては、サブチリシン、特にバシラス（Bacillus）由来のもの、例えば、サブチリシンNovo、サブチリシンCarlsberg、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７及びサブチリシン１６８（国際公開第８９/０６２７９号に記載）が挙げられる。トリプシン様プロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば豚又は牛由来のもの）、及び、国際公開第８９／０６２７０号及び国際公開第９４／２５５８３号に記載のフサリウム（Fusarium）プロテアーゼが挙げられる。
有用なプロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号、国際公開第９８／２０１１５号、国際公開第９８／２０１１６号、及び国際公開第９８／３４９４６号に記載の変異体、特に位置２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５及び２７４のうち１又は２以上の位置に置換を有する変異体が挙げられる。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素としては、ドゥラジム（Durazym）（登録商標）、リラーゼ（Relase）（登録商標）、アルカラーゼ（Alcalase）（登録商標）、サビナーゼ（登録商標）、プリマーゼ（Primase）（登録商標）、ドゥララーゼ（Duralase）（登録商標）、エスペラーゼ（Esperase）（登録商標）、オボザイム（Ovozyme）（登録商標）及びカンナーゼ（Kannase）（登録商標）（Novozymes A/S）、マキサターゼ（Maxatase）（登録商標）、マキサセル（Maxacal）（登録商標）、マキサペム（Maxapem）（登録商標）、プロペラーゼ（Properase）（登録商標）、プラフェクト（Purafect）（登録商標）、プラフェクトOxP（Purafect OxP）（登録商標）、FN2（登録商標）、FN3（登録商標）及び FN4（登録商標）（Genencor International、Inc.）が挙げられる。
リパーゼ：適切なリパーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ（Humicola）（別名テルモミセス（Thermomyces））由来のリパーゼ、例えばＨ．ラヌギノザ（H. lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノザ（T. lanuginosus））由来のもの（欧州特許出願第２５８ ０６８号及び欧州特許出願第３０５ ２１６号に記載）、又はＨ．イソレンス（H. insolens）由来のもの（国際公開第９６／１３５８０号に記載）、フュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、例えばＰ．アルカリ（P. alcali）遺伝子又はＰ．フュードアルカリ（P. pseudoalcali）遺伝子（欧州特許出願第２１８ ２７２号）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）（欧州特許出願第３３１ ３７６号）、Ｐ．スツツゼリ（P. stutzeri）（英国特許出願第１，３７２，０３４号）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）、フュードモナス株（Pseudomonas sp. strain）SD705（国際公開第９５／０６７２０号及び国際公開第９６／２７００２号）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（P. wisconsinensis）（国際公開第 号 ９６/１２０１２）、バチラス（Bacillus）リパーゼ、例えばＢ．サブチリス（B. subtilis）由来のもの（Dartois et al. (1993), (Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360）、Ｂ．ステアロテルモフィラス（B. stearothermophilus）（特開昭６４−７４４９９２）又はＢ．プミラス（B. pumilus）由来のもの（国際公開第９１／１６４２２号）が挙げられる。
他の例としては、例えば国際公開第９２／０５２４９号、国際公開第９４／０１５４１号、欧州特許出願第４０７ ２２５号、欧州特許出願第２６０ １０５号、国際公開第９５／３５３８１号、国際公開第９６／００２９２号、国際公開第９５／３０７４４号、国際公開第９４／２５５７８号、国際公開第９５／１４７８３号、国際公開第９５／２２６１５号、国際公開第９７／０４０７９号及び国際公開第９７／０７２０２号に記載のリパーゼ変異体が挙げられる。
好ましい市販のリパーゼ酵素としては、リペックス（Lipex）（登録商標）、リポラーゼ（Lipolase）（登録商標）及びリポラーゼウルトラ（Lipolase Ultra）（登録商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。
アミラーゼ：適切なアミラーゼ（α及び／又はβ）としては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、バチラス（Bacillus）から得られるα−アミラーゼ、例えばＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）の特別株由来のものが挙げられる。詳細は英国特許出願第１,２９６,８３９号に記載されている。
有用なアミラーゼの例としては、国際公開第９４／０２５９７号、国際公開第９４／１８３１４号、国際公開第９６／２３８７３号、及び国際公開第９７／４３４２４号に記載の変異体、特に位置１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４のうち１又は２以上の位置に置換を有する変異体が挙げられる。
市販のアミラーゼとしては、ドゥラミル（Duramyl）（登録商標）、テルマミル（Termamyl）（登録商標）、フンガミル（Fungamyl）（登録商標）及びBAN（登録商標）（Novozymes A/S）、ラピダーゼ（Rapidase）（登録商標）及びピュラスター（Purastar）（登録商標）（Genencor International Inc.）が挙げられる。
セルラーゼ：適切なセルラーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。適切なセルラーゼとしては、バシラス（Bacillus）属、フュードモナス（Pseudomonas）属、フミコラ（Humicola）属、フサリウム（Fusarium）属、チエラビア（Thielavia）属、アクレモニウム（Acremonium）属由来のセルラーゼ、例えばフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミセリオフィソラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）由来の真菌セルラーゼ（米国特許第４，４３５，３０７号、米国特許第５，６４８，２６３号、米国特許第５，６９１，１７８号、米国特許第５，７７６，７５７号及び国際公開第８９／０９２５９号に開示）が挙げられる。
特に適切なセルラーゼは、色彩上の利点を有するアルカリ性又は中性のセルラーゼである。斯かるセルラーゼの例としては、欧州特許出願第０ ４９５ ２５７号、欧州特許出願第０ ５３１ ３７２号、国際公開第９６／１１２６２号、国際公開第９６／２９３９７号、国際公開第９８／０８９４０号に記載のセルラーゼが挙げられる。他のセルラーゼ変異体の例としては、例えば国際公開第９４／０７９９８号、欧州特許出願第０ ５３１ ３１５号、米国特許第５，４５７，０４６号、米国特許第５，６８６，５９３号、米国特許第５，７６３，２５４号、国際公開第９５／２４４７１号、国際公開第９８／１２３０７号及び国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号に記載のものが挙げられる。
市販のセルラーゼとしては、セルザイム（Celluzyme）（登録商標）及びケアザイム（Carezyme）（登録商標）（Novozymes A/S）、クラジナーゼ（Clazinase）（登録商標）及びピュラダックスHA（Puradax HA）（登録商標）（Genencor International Inc.）、並びにKAC-500(B)（登録商標）（Kao Corporation）が挙げられる。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス（Coprinus）由来、例えばＣ．シネレウス（C. cinereus）由来のペルオキシダーゼ、及びその変異体（国際公開第９３／２４６１８号、国際公開第９５／１０６０２号、及び国際公開第９８／１５２５７号に記載）が挙げられる。市販の ペルオキシダーゼとしては、ガードザイム（Guardzyme）（登録商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。
洗剤酵素を洗剤組成物に含めるには、１又は２以上の酵素を含む個別の添加剤を加えてもよく、これら全ての酵素を含む組み合わせ添加剤を加えてもよい。本発明の洗剤添加剤、即ち個別の添加剤又は組み合わせ添加剤は、例えば粉末、液体、スラリー等として調製することができる。好ましい洗剤添加剤処方は、顆粒、特に非粉化顆粒、液体、特に安定化した液体、又はスラリーである。
非粉化顆粒は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号及び同第４，６６１，４５２号に開示の方法によって調製することができる。周知の方法により被覆してもよい。ワックス被覆材料の例としては、平均モル重量１０００〜２００００のポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；アルコール部分が１２〜２０の炭素原子を含み、１５〜８０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドが挙げられる。流動床法による適用に適した膜形成被覆材料の例は、英国特許出願第１４８３５９１号に記載のとおりである。液体酵素調製物を、確立された方法に従い、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸等を添加することにより安定化してもよい。保護された酵素は、例えば欧州特許出願第２３８，２１６号に開示の方法に従い調製することができる。
本発明の洗剤組成物は、任意の便宜な形態とすることができる。例としては、棒状、錠剤状、粉末状、顆粒状、ペースト状、液状、粒状又は細粒状の、汎用又は「強力」（heavy-duty）洗浄剤、特に洗濯用洗剤；液状、ゲル状又はペースト状の汎用洗浄剤、特に所謂「強力」（heavy-duty）液剤；液状高級布地用洗剤；手洗い用食器洗い洗剤又は簡易（light duty）食器洗い洗剤、特に泡立ち型のもの；家庭用及び業務用の食器洗浄機用洗浄剤、例えば種々の錠剤状、粒状、液状及び濯ぎ補助型のものが挙げられる。組成物は単位毎の個別包装としてもよい。例としては、当業界に周知のものや、水溶性及び／又は透水性のものが挙げられる。液体洗剤としては、水性のもの、典型的には最大７０％の水と０〜３０％の有機溶媒を含むものでもよく、非水性のものでもよい。
本発明の洗剤組成物は更に、界面活性剤、洗浄助剤（builders）、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、着色剤、漂白増強剤、キレート剤、染料移動剤、付着助剤（deposition aids）、分散剤、更なる酵素、及び酵素安定化剤、触媒材料、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、光学的光沢剤、光活性化剤、蛍光剤、柔軟材、予調製過酸、ポリマー状分散剤、土壌粘土除去／再付着防止剤（anti-redeposition agents）、充填剤塩、ヒドロトロープ（hydrotropes）、漂白剤、消泡剤、可塑剤、柔軟剤、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、縮み防止剤、殺菌剤、殺真菌剤、変色防止剤、防腐剤、アルカリ源、溶解剤、担体、処理助剤、顔料、染料、香料、及びｐＨ調整剤、他の酵素、酵素安定化系を含んでいてもよい。
すなわち、洗剤組成物は、１又は２以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、非イオン性（半極性含む）、及び／又は、アニオン性、及び／又は、カチオン性、及び／又は、双イオン性、及び／又は、両イオン性、及び／又は、半極性非イオン性、及び／又は、これらの混合の何れでもよい。界面活性剤は通常、洗剤組成物に対して０．１〜６０重量％の範囲の量で存在するが、別の実施形態では、約１％〜約５０％の量であり、更に別の実施形態では、約５％〜約４０％の量である。
場合により、洗剤は通常、約１％〜約４０％のアニオン性界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、２級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸、又は石鹸を含む。
更なる適切なアニオン性界面活性剤としては、石鹸、及び、スルフェート又はスルホン酸基を含むものが挙げられる。スルホン酸型の界面活性剤の中で考慮されるものとしては、（Ｃ９−Ｃ１３−アルキル）ベンゼンスルホン酸塩及びオレフィンスルホン酸塩が挙げられる。後者は、アルケンスルホン酸塩及びヒドロキシアルカンスルホン酸塩、並びに同ジスルホン酸塩の混合物であると理解される。これは例えば、末端又は内部に二重結合を有するＣ１２−Ｃ１８モノオレフィンのスルホン酸化により得られる。他に適切なものとしては、（Ｃ１２−Ｃ１８）アルカンスルホン酸塩、及び、α−スルホ脂肪酸（エステルスルホン酸塩）のエステル、例えばココナッツ、パーム核又は獣脂の脂肪酸の水素添加物のα−スルホン酸化メチルエステルが挙げられる。ＭＥＳの鹸化により得られるα−スルホカルボン酸も使用できる。
更に適切なアニオン性界面活性剤としては、モノ−、ジ−及びトリ−エステル並びにそれらの混合物を含む、スルホン酸化脂肪酸グリセロールエステルが挙げられる。
好適なアルキル（アルケニル）硫酸塩は、例えばココナッツ脂肪アルコール、獣脂脂肪アルコール、ラウリル、ミリスチル、セチル若しくはステアリルアルコール等のＣ１２−Ｃ１８脂肪アルコール又はＣ１０−Ｃ２０オキソアルコールの硫酸モノエステルのアルカリ金属塩及びナトリウム塩、又は同鎖長の２級アルコールの硫酸モノエステルのアルカリ金属塩及びナトリウム塩が挙げられる。洗浄技術の観点からは、とりわけ好適なのはＣ１２−Ｃ１６アルキルスルホン酸塩、Ｃ１２−Ｃ１５アルキルスルホン酸塩、特にＣ１４−Ｃ１５アルキルスルホン酸塩である。適切なアニオン性界面活性剤としては、例えば米国特許第３，２３４，２５８号又は米国特許第５，０７５，０４１号に従って調製されるアルカン−２，３−ジイルビス（硫酸塩）も挙げられる。
他に適切なのは、１〜６モルのエチレンオキシドでエトキシ化された直鎖又は分岐のＣ７−Ｃ２１アルコール硫酸モノエステル、例えば平均３．５モルのエチレンオキシド（ＥＯ）による２−メチル−分岐Ｃ９−Ｃ１１アルコール、又は、１〜４ＥＯによるＣ１２−Ｃ１８脂肪アルコールが挙げられる。これらは高発泡特性を有するため、通常は洗浄及び清浄組成物に少量、例えば１〜５重量％加えられる。
アニオン性界面活性剤は更に、スルホコハク酸とＣ８−Ｃ１８脂肪アルコール残基とのジエステル、及び／又は、そのモノエステルの塩、或いはそれらの混合物を含んでいてもよい。とりわけ好ましいのは、脂肪アルコール残基の鎖長分布が小さいスルホコハク酸塩である。また、好ましくはアルキル（アルケニル）鎖内に８〜１８Ｃ原子を有するアルキル（アルケニル） スルホコハク酸又はその塩を使用することも可能である。
考慮に値する他のアニオン性界面活性剤としては、アミノ酸の脂肪酸誘導体、例えばメチルタウリン（タウリド（taurides））及び／又はメチルグリシン（サルコシド（sarcosides））の誘導体である。考慮すべき他のアニオン性界面活性剤は石鹸である。飽和脂肪酸石鹸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、水素化エルカ酸及びベヘン酸の塩、並びに、天然脂肪酸由来の石鹸混合物、例えばココナッツ、パーム核又は獣脂脂肪酸由来のもの。アニオン性界面活性剤（石鹸を含む）は、そのナトリウム、カリウム又はアンモニウム塩の形態で存在していてもよく、有機塩基（例えばモノ−、ジ−又はトリエタノールアミン）との可溶塩の形態で存在してもよい。アニオン性界面活性剤はそのナトリウム又はカリウム塩の形態で存在してもよい。
非イオン性界面活性剤としては、アルコキシル化された（好適にはエトキシ化及び／又はプロポキシ化された）１級アルコールであって、８〜１８Ｃ原子を有し、アルコール１モルに対して平均１〜１２モルのエチレンオキシド（ＥＯ）及び／又は１〜１０モルのプロピレンオキシド（ＰＯ）を有するものを用いることが好ましい。とりわけ好ましいのは、Ｃ８−Ｃ１６アルコールアルコキシレート、好適にはエトキシ化及び／又はプロポキシ化されたＣ１０−Ｃ１５アルコールアルコキシレート、特にＣ１２−Ｃ１４アルコールアルコキシレートであって、エトキシ化度が２〜１０、又は３〜８、及び／又は、プロポキシ化度が１〜６、又は１．５〜５のものである。アルコール残基は、直鎖であるか、特に２位にメチル分岐鎖を有することが好ましいが、通常のオキソアルコールのように、直鎖とメチル分岐鎖との混合物であってもよい。しかしながら、とりわけ好ましいのは、１２〜１８のＣ原子を有する天然由来の直鎖アルコール（例えばココナッツ、パーム及び獣脂脂肪アルコール又はオレイルアルコール等）と、アルコール１モルあり平均２〜８のＥＯとからなるアルコールエトキシレートである。エトキシ化アルコールとしては、例えば、３ＥＯ又は４ＥＯを有するＣ１２−Ｃ１４アルコール、７ＥＯを有するＣ９−Ｃ１１アルコール、３ＥＯ、５ＥＯ、７ＥＯ又は８ＥＯを有するＣ１３−Ｃ１５アルコール、３ＥＯ、５ＥＯ又は７ＥＯを有するＣ１２−１８アルコール、これらの混合物、例えば３ＥＯを有するＣ１２−Ｃ１４アルコールと５ＥＯを有するＣ１２−Ｃ１８アルコールとの混合物が挙げられる。上述のエトキシ化及びプロポキシ化度は統計平均値であって、製品によって整数の場合も小数の場合もある。アルコールエトキシレート及びプロポキシレートは、同族体分布が制限されていることが好ましい（狭い範囲のエトキシレート／プロポキシレート、ＮＲＥ／ＮＲＰ）。これらの非イオン性界面活性剤に加えて、１２超のＥＯを有する脂肪アルコールエトキシレートを使用してもよい。例としては、１４ＥＯ、２５ＥＯ、３０ＥＯ又は４０ＥＯを有する獣脂脂肪アルコールエトキシレートが挙げられる。
他に適切なものとしては、アルコキシル化（エトキシ化及び／又はプロポキシ化）されたアミンであって、１アルキル鎖当たり１〜１８のＣ原子を有し、アミン１モル当たり平均で１〜１２モルのエチレンオキシド（ＥＯ）及び／又は１〜１０モルのプロピレンオキシド（ＰＯ）を有する１級及び２級アミンが挙げられる。
加えて、更なる非イオン性界面活性剤として、一般式Ｒ１Ｏ（Ｇ）ｘのアルキルポリグリコシドも使用できる。式中、Ｒ１は、Ｃ原子数８〜２２、好ましくは１２〜１８の１級直鎖又はメチル分岐（特に２位メチル分岐鎖）アルキル基であり、記号「Ｇ」は、Ｃ原子数５又は６のグリコース（単糖）単位である。Ｇとしてはグルコースが好ましい。重合度ｘは、グリコース単位の平均数を表し、通常は１〜１０の範囲であるが、１．２〜１．４が好ましい。
単独の非イオン性界面活性剤として、又は他の非イオン性界面活性剤との組み合わせとして使用可能な、更なる非イオン性界面活性剤の種類としては、アルコキシル化（好ましくはエトキシ化、又は、エトキシ化及びプロポキシ化）脂肪酸アルキルエステル、であって、アルキル鎖が１〜４のＣ原子を有するもの、特に脂肪酸メチルエステル（例えば特開昭５８−２１７５９８に記載のもの）が挙げられる。
アミンオキシド型の非イオン性界面活性剤、例えばＮ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシド及びＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシド、並びに脂肪酸アルカノールアミド又はエトキシ化脂肪酸アルカノールアミド型の非イオン性界面活性剤も適切である。
より好適な実施形態によれば、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、４級アンモニウム化合物、ヨウ化アルキルピリジニウム、Tween 80、Tween 85、Triton X-100、Brij 56、生物学的界面活性剤、ラムノリピド（rhamnolipid）、サーファクチン（surfactin）、ビスコンシン（visconsin）、又はスルホン酸である。
場合により、洗剤は通常、約０．２％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニル-フェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルコサミド」）を有していてもよい。
ある実施形態によれば、本発明は、布地１グラム当たり、少なくとも１つの界面活性剤の濃度が、０〜５００、０．００００１〜１００、０．０００１〜５０、０．０００１〜４０、０．００１〜３０、０．０１〜２０、０．１〜１５、１〜１０ミリグラムである方法に関する。
ある実施形態によれば、本発明は、溶液１Ｌ当たり、少なくとも１つの界面活性剤の濃度が、０〜５０、０．０００１〜４０、０．００１〜３０、０．０１〜２０、０．１〜１０、又は１〜５ｇである方法に関する。
洗剤は、０〜６５％の洗浄助剤（detergent builder）又は錯化剤（complexing agent）、例えばゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、カルボン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩、例えばＭＧＤＡ（メチルグリシン二酢酸）、又は代わりにＧＬＤＡ（Ｌ−グルタミン酸、Ｎ，Ｎ−二酢酸、四ナトリウム塩）を含んでいてもよい。洗剤組成物は、洗浄助剤による補助を受けない（unbuilt）、即ち本質的に洗浄助剤を含まないものであってもよい。
洗浄助剤の量は、例えば５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超又は５０％超であり、また、８０％未満、６５％未満である。食器洗い用洗剤の場合、洗浄助剤の量は通常４０〜６５％、特に５０〜６５％である。
洗浄助剤としては特に、Ｃａ及びＭｇと水溶性錯体を形成するキレート剤であってもよい。洗浄助剤とＣａ＋＋及び／又はＭｇ＋＋とにより形成される錯体の強度は、ｌｏｇＫ値により（平衡又は安定度定数として、又は所与のｐＨでの条件安定度定数として）表され、３〜８の範囲、特に５〜８の範囲である。安定度定数は、例えば２５℃で、イオン強度０．１Ｍで測定され、条件安定度定数は、例えば同じ条件で、ｐＨ８．５又は９で測定される。
洗浄助剤はアミノ基を有していてもよく、例えばアミノカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート又はホスフェートであってもよい。１、２又は３つのアミノ基（通常は２級又は３級アミノ基）を含むモノマー分子であってもよく、２、３、４又は５つのカルボキシル基を有していてもよい。適切な洗浄助剤の例としては、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩、ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミンン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、Ｎ−（１，２−ジカルボキシエチル）−Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸（ＩＤＳ）及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、及びそれらの塩が挙げられる。
洗浄助剤の緩衝能（別名余アルカリ度（reserve alkalinity））は４超であることが好ましい（緩衝定数における酸及び塩の総量を一定とした場合に、１リットルの緩衝溶液のｐＨを１単位変更するのに必要な強酸の当量数）。
洗浄助剤は、例えば国際公開第０９／１０２８５４号に記載される、環境配慮型の抑制剤（sequesterant）であってもよい。適切な環境配慮型の抑制剤としては、１又は２以上のアミノ酸系抑制剤、コハク酸系抑制剤、クエン酸及びそれらの塩が挙げられる。
適切なアミノ酸系化合物の例としては、ＭＧＤＡ（メチルグリシン二酢酸）並びにその塩及び誘導体、ＧＬＤＡ（グルタミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸）並びにその塩及び誘導体が挙げられる。他の適切な洗浄助剤は、米国特許第６４２６２２９号に記載されている。特定の適切な洗浄助剤としては、例えば、アスパラギン酸−Ｎ−モノ酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ、Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ、Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）及びスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）、並びにこれらのアルカリ金属塩又はアンモニウム塩が挙げられる。一側面によれば、ＧＬＤＡ塩及びその誘導体も使用できる。一側面によれば、ＧＬＤＡの四ナトリウム塩が使用できる。
適切な洗浄助剤の更なる例としては、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチリデンジアミントリアセテート（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ジエチレントリアミンン五（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）及びアミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）が挙げられる。
適切なコハク酸化合物の例は、米国特許第５９７７０５３号に記載されている。一側面によれば、適切なコハク酸化合物としてイミノコハク酸四ナトリウムが挙げられる。
洗浄助剤の分類は、M.K.Nagarajan et al., JAOCS, Vol. 61, no. 9 (September 1984), pp. 1475-1478 に記載の方法により行うことができる。この方法は、濃度０．２００％の仮想的な洗剤溶液において、ｐＨ１０．５における水硬度を２００ｐｐｍ（ＣａＣＯ３換算）から１０ｐｐｍまで下げるのに必要な洗浄助剤の最低濃度を決定し、仮想的な洗剤中における重量％で表す。或いは、現代の一般的な洗濯用洗剤がより低いｐＨを有することを反映して、ｐＨ８．５で実施してもよい。この方法を何れかのｐＨで実施した場合に求められるレベルは０〜２５％（強）、２５〜３５％（中）又は＞３５％（弱）である。より好ましいのは、強及び中の洗浄助剤を含む組成物であり、最も好ましいのは、強程度の洗浄助剤を含む組成物である。
洗浄助剤は、強洗浄助剤、例えばメチルグリシン二酢酸（「ＭＧＤＡ」）又はＮ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）等であってもよく、中洗浄助剤、例えばナトリウムトリ−ポリリン酸（ＳＴＰＰ）等であってもよく、弱洗浄助剤、例えばナトリウムクエン酸塩等であってもよい。より好ましいのは、強及び中の洗浄助剤を含む組成物であり、最も好ましいのは、強程度の洗浄助剤を含む組成物である。他の洗浄助剤の例としては、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、カルボン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩及び層状ケイ酸塩（例えば Hoechst 製 SKS-6）等が挙げられる。
洗剤は１又は２以上のポリマーを含んでいてもよい。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニル−ピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー等が挙げられる。
洗剤は、漂白系、又は、１又は２以上の漂白剤を含んでいてもよい。これらはＨ２Ｏ２源、例えば過ホウ酸塩又は過カルボン酸塩等を含んでいてもよく、更にはこれらとの組み合わせで、過酸形成漂白活性化剤、例えば四アセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸等を含んでいてもよい。或いは、漂白系は、例えばアミド、イミド、又はスルホン形のペルオキシ酸を含んでいてもよい。更に適切な漂白剤としては、その他の光漂白剤、予調製過酸、過酸化水素源、漂白活性化剤、過酸化水素、漂白触媒、及びこれらの混合物が挙げられる。一般に、漂白剤を使用する場合、本発明の組成物は、清浄組成物に対する重量比で、例えば約０．１％〜約５０％、更には約０．１％〜約２５％の漂白剤を含有する。
洗剤は、他の従来の洗剤成分を含んでいてもよい。例えば、粘土を含む柔軟材、発泡増強剤、消泡剤、防腐剤、汚れ成分懸濁剤、汚れ成分再付着防止剤（anti-soil redeposition agents）、染料、抗細菌剤、光学的光沢剤、ヒドロトロープ（hydrotropes）、変色防止剤、又は香料等が挙げられる。
地方や地域によって、例えば水硬度や洗浄温度等の条件にばらつきがあるため、地域用の洗剤組成物も求められる。洗剤例１及び２は夫々、一般的な欧州の自動食器洗浄機（ＡＤＷ）用洗剤及び一般的な欧州の粉末洗剤の組成範囲である。
洗剤例１：一般的な欧州のＡＤＷ洗剤組成物
Figure 0005947213
洗剤例２：一般的な欧州の粉末洗剤組成物
Figure 0005947213
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤及びプロテアーゼ阻害剤により安定化されていてもよい。例としては、ポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、異なる塩、例えばＮａＣｌ；ＫＣｌ；乳酸、ギ酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル等、又はフェニルホウ酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニルホウ酸、又はペプチドアルデヒド、例えばジ−、トリ−又はテトラペプチドアルデヒド又はアルデヒド類似物（式Ｂ１−Ｂ０−Ｒで表されるもの（式中、ＲはＨ、ＣＨ３、ＣＸ３、ＣＨＸ２、又はＣＨ２Ｘ（Ｘ＝ハロゲン）であり、Ｂ０は単一のアミノ酸残基（好ましくは、置換されていてもよい脂肪族又は芳香族側鎖を有するもの）であり；Ｂ１は１又は２以上（好ましくは１、２又は３つ）のアミノ酸残基からなり、Ｎ末端保護基を有していてもよい）、又は、国際公開第０９１１８３７５号及び国際公開第９８／１３４５９号に記載のもの）、又はタンパク質型のプロテアーゼ阻害剤、例えばRASI、BASI、WASI（米、大麦及び小麦由来の二官能型α−アミラーゼ／サブチリシン阻害剤）又は CI2 又は SSI が挙げられる。組成物は、例えば国際公開第９２／１９７０９号、国際公開第９２／１９７０８号及び米国特許６，４７２，３６４号の記載に従って調製される。ある実施形態によれば、本明細書で使用される酵素は、最終的に調製された組成物中において、水溶性の亜鉛（II）、カルシウム（II）及び／又はマグネシウム（II）イオン源の存在により安定化される。これにより、前述のイオンや、その他の他の金属イオン（例えばバリウム（II）、スカンジウム（II）、鉄（II）、マンガン（II）、アルミニウム（III）、錫（II）、コバルト（II）、銅（II）、ニッケル（II）、及びオキソバナジウム（IV）等）が酵素に提供される。
現時点では、洗剤組成物に対し、任意の単一の酵素、特に本発明の酵素を、例えば洗浄液１リットル当たり酵素タンパク質０．０１〜２００ｍｇ、好ましくは洗浄液１リットル当たり酵素タンパク質０．０５〜５０ｍｇ、特に洗浄液１リットル当たり酵素タンパク質０．１〜１０ｍｇ加えることが考えられる。
通常、本発明の洗剤組成物は、本発明により提供される少なくとも１つの酵素を、例えば、少なくとも０．０００１重量％、約０．０００１〜約１０、約０．００１〜約１、又は約０．０１〜約０．１、又は約０．０５〜約１５％、又は約０．０５〜約２０％、又は約１〜約２０％、又は約１〜約１５％の濃度で含んでいればよい。好ましい実施形態によれば、本明細書において提供される洗剤組成物は通常、水を用いた清浄操作において、洗浄水のｐＨが約５．０〜約１１．５となるように調製され、別の実施形態によれば、約６．０〜約１０．５となるように調製される。好ましい実施形態によれば、粒状又は液状洗濯製品は、ｐＨが約６〜約８となるように調製される。所望の使用レベルとなるようにｐＨを調整する手法としては、緩衝剤、アルカリ、酸等の使用が挙げられ、当業者には周知である。
更に、本発明の酵素を、国際公開第９７／０７２０２号に開示の洗剤処方に配合してもよい。本公報は引用により本明細書に組み込まれる。
材料及び方法
プロテアーゼ変異体活性の決定方法
布地：
標準布片はEMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St.Gallen, Switzerlandから入手される。特にタイプEMPA117（血液、ミルク及びインク汚れ付着ポリエステル／綿布地）。標準布片はCenter For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, the Netherlandsから入手される。特にタイプC-10（オイル／ミルク／色素汚れ付着綿）及びPC-03（チョコレートミルク／すす汚れ付着ポリエステル／綿布地）。
メラミンタイル：
標準的なメラミンタイルはCenter For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen（オランダ）から入手される。特にタイプDM-21（卵黄）。
菌種及びプラスミド：
バシラス・レンタス（Bacillus lentus）株３０９はＮＣＩＢに寄託され、受託番号ＮＣＩＢ１０３０９を受けているもので、米国特許第３，７２３，２５０号に記載されている。本公報は引用により本明細書に組み込まれる。親サブチラーゼ３０９又はサビナーゼ（登録商標）は、株３０９から取得される。発現宿主生物はバシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）である。
プラスミドｐＳＸ２２２を、大腸菌（E. coli）−バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）シャトルベクター及びバシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）発現ベクターとして使用する（国際公開第９６/３４９４６号に記載のとおり）。
一般的な分子生物学的手法：
別途記載しない限り、ＤＮＡ操作及び形質転換は、分子生物学の標準的な手法を用いて行う（Sambrook et al. (1989) Molecular cloning：A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY；Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995； Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990）。
ＤＮＡ操作のための酵素：
別途記載しない限り、ＤＮＡ操作のための酵素（例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ等）は全て、New England Biolabs, Inc. から入手する。ＤＮＡ操作用の酵素は、サプライヤーの説明書に従って使用する。
醗酵：
サブチラーゼ酵素の産生のための醗酵は、５０ｍｌ試験管内に１５ｍｌの二重ＴＹ培地（double TY media）を入れて、ｐＨ７．３、３７℃で、回転振盪台を用いて２２５ｒｐｍで２〜３日かけて行う。
ＴＹ培地の説明については、"Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) の１．１．３「Media Preparation and Bacteriological Tools」の欄を参照のこと。
精製：
宿主細胞から分泌されるサブチラーゼ変異体は、周知の手法により培地から好適に回収できる。例としては、遠心分離又は濾過により細胞を培地から分離し、又は、例えば硫酸アンモニウム等の塩を用いて培地中のタンパク質成分を沈殿させた後、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法にかける手法が挙げられる。
触媒活性
本発明の変異体の触媒活性は、例えば以下の「Kinetic Suc AAPF-pNA」アッセイを用いて決定することができる。
ｐＮＡ基質：Suc-AAPF-pNA（Bachem L-1400）。
温度：室温。
アッセイ緩衝剤：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ９．０。
２０ｍｌプロテアーゼ（０.０１％ Triton X-100で希釈）を１００ｍｌのアッセイ緩衝剤と混合する。１００ｍｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、更に０.０１％の Triton X-100 で４５倍に希釈する）を加えてアッセイを開始する。ＯＤ４０５の増加をモニターし、プロテアーゼ活性の指標とする。
洗浄性能試験：
選択されたサブチラーゼ変異体の洗剤組成物中における洗浄性能を調べるには、洗浄実験を実施する。本発明の酵素変異体は自動機械負荷アッセイ（Automated Machine Stress Assay：ＡＭＳＡ）で試験する。ＡＭＳＡ試験により、少量の酵素洗剤溶液の洗浄性能を、多数調べることが可能になる。詳細は実施例３を参照のこと。
洗剤：
本発明のサブチラーゼ酵素の洗浄性能試験のための洗剤は、完成品である市販の洗剤を市場で購入し、熱処理（水溶液中８５℃で５分間）によって酵素成分を不活性化することにより、得ることができる。また、酵素を含まない市販の洗剤基材を製造者から直接購入することも可能である。更には、本明細書の記載に従い、適切なモデル洗剤を調製し、洗浄性能試験に使用してもよい。
実施例１
酵素変異体の構築及び発現：
本発明の変異体は、当業者に周知の手法で構築し、発現させることが可能である。下記は本発明に係る変異体の作製法の例である。
部位特異的突然変異誘発法：
特定の挿入／欠失／置換を含む本発明のサブチリシン３０９（サビナーゼ（登録商標））の位置特異的変異体は、所望の突然変異を含むオリゴを用いたＰＣＲで作製したＤＮＡ断片を従来法でクローニングすることにより作製される（Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989）。
テンプレートプラスミドＤＮＡとしてはｐＳＸ２２２、又はサブチリシン３０９変異体を含有するその類似体が使用し得る。オリゴを用いた突然変異誘発法によって、変異体のコンストラクトに突然変異を導入する。
サブチリシン３０９変異体を大腸菌（E. coli）に形質転換する。斯かる形質転換体の一晩培養物から精製されたＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ断片の精製、連結、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）の形質転換という手順により、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）に形質転換する。Ｂ．サブチリス（B. subtilis）の形質転換は、Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221 に記載の手法で実施する。
特定の領域に突然変異を導入するための部位特異的突然変異誘発法：
変異原性プライマー（オリゴヌクレオチド）は、突然変異部位の側位に存在し、挿入／欠失／置換を定義するＤＮＡ塩基対により分離されるＤＮＡ配列に対応するように合成する。
続いて、得られた変異原性プライマーを用いて、修飾されたプラスミドｐＳＸ２２２のＰＣＲ反応を実施する。得られたＰＣＲ断片を精製し、第２のＰＣＲ反応により伸長し、得られたＰＣＲ産物を精製し、第３のＰＣＲ反応により伸長した後、エンドヌクレアーゼで消化し、大腸菌（E. coli）−Ｂ．サブチリス（B. subtilis）シャトルベクターｐＳＸ２２２にクローン化する。ＰＣＲ反応は通常の条件下で実施する。プラスミドＤＮＡは常法により大腸菌（E. coli）に形質転換し、大腸菌（E. coli）コロニーの一つの配列を決定して計画通りの突然変異が生じていることを確認する。
本発明のサブチラーゼ変異体を精製するために、本発明の変異体を含むｐＳＸ２２２発現プラスミドをコンピテントなＢ．サブチリス（B. subtilis）株に形質転換し、上述の手法で醗酵した。
実施例２
酵素の精製及び濃度測定：
醗酵後、サブチリシン変異体の精製は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（Hydrophobic Charge Induction Chromatography：ＨＣＩＣ）及びそれに続く真空濾過により行う。
酵素を捕捉するために、ＨＣＩＣには、４−メルカプト−エチル−ピリジン（４−ＭＥＰ）を結合したセルロースマトリックスを使用する。
８０〜１００μｍサイズのセルロースマトリックスのビーズを、酵母エキス及びサブチリシン変異体分泌能を有する形質転換Ｂ．サブチリス（B. subtilis）を含む培地と混合し、Unifilter（登録商標）マイクロプレート中、ｐＨ９.５でインキュベートする。
４−ＭＥＰはｐＨ＞７で疎水性であり、サブチリシン変異体はｐＨ９．５で疎水性であるので、分泌された酵素とビーズ上の４−ＭＥＰとの間に疎水性会合が形成される。インキュベーション後、培地及び細胞残屑を真空濾過で除去し、ビーズ及び酵素をフィルター上に回収する。
酵素をビーズから溶出させるために、フィルターを溶出緩衝液（ｐＨ５）で洗浄してｐＨを低下させる。こうしてビーズから離れた酵素を、緩衝液から回収することができる。
精製されたサブチリシン酵素変異体の濃度を、活性部位滴定（active site titration：ＡＳＴ）により決定する。
精製された酵素を、様々な量の活性部位を阻害する異なる濃度の高親和性阻害剤ＣＩ−２Ａとともにインキュベートする。プロテアーゼと阻害剤とは１：１の比率で互いに結合するので、酵素濃度は全プロテアーゼを不活性化する阻害剤濃度と直接関係することになる。残存プロテアーゼ活性の測定は、阻害剤とのインキュベーション後に基質（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中０．６ｍＭ Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）を加え、続く４分間の間に生じる分解産物ｐＮＡ（パラニトロフェノール）を、Elisa Readerを用いて４０５nmで周期的に測定することにより行う。
実施例３
本発明の変異体の硬表面に対する洗浄性能をＡＭＳＡで評価した。方法及び結果を以下に示す。
硬表面に対するサブチリシン変異体の洗浄性能：
ＡＭＳＡ試験法の説明：
食器洗い用洗剤組成物、即ちＭＧＤＡ添加ＡＤＷモデル洗剤及びＳＴＰＰ添加ＡＤＷモデル洗剤中における、選択されたプロテアーゼ変異体の洗浄性能を評価するために洗浄実験を実施する。自動機械負荷分析（Automated Mechanical Stress Assay：ＡＭＳＡ）を用いて本発明のプロテアーゼを試験する。ＡＭＳＡによれば、少量ずつ多数の酵素洗剤溶液の洗浄性能を調べることができる。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液用の多数のスロットと、食器洗いサンプル、即ち洗浄対象のメラミンタイルを、スロットの全開口部に対して硬く締め付けるリッドとを有する。洗浄期間の間、プレート、試験溶液、メラミンタイル及びリッドを烈しく振盪し、試験溶液を汚れたメラミンタイルに接触させると共に、定期的且つ周期的な振動による機械的応力を印加する。更なる説明については、国際公開第０２／４２７４０号、特に２３〜２４頁の「Special Method Examples」のパラグラフを参照のこと。
実験は以下に示す実験条件下で行った。
Figure 0005947213
Figure 0005947213
異なる変異体についてのＡＤＷ試験の結果を以下に示す。結果中、インデックスは１である。サビナーゼの性能試験を１の値とし、変異体の結果をこの値と比較する。
Figure 0005947213
Figure 0005947213
これらの結果は、本発明の変異体が、タンパク質性よごれ、例えばゆで卵による汚れに対して、有効に作用することを示している。
更なるサブチリシン変異体の硬表面に対する洗浄性能
本発明の更なる変異体についても、硬表面に対する洗浄性能を、ＡＭＳＡにより、上述と同様の条件下で評価した。
Figure 0005947213
Figure 0005947213
これらの結果は、本発明の変異体が、タンパク質性よごれ、例えばゆで卵による汚れに対して、有効に作用することを示している。
布地に対するサブチリシン変異体の洗浄性能：
市販の洗剤基材組成物中における選択されたサブチラーゼ変異体の洗浄性能を評価するべく、洗浄実験を実施した。本発明の酵素変異体を、自動機械負荷分析（ＡＭＳＡ）を用いて試験した。ＡＭＳＡによれば、少量ずつ多数の酵素洗剤溶液の洗浄性能を調べることができる。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液用の多数のスロットと、食器洗いサンプル、即ち洗浄対象のメラミンタイルを、スロットの全開口部に対して硬く締め付けるリッドとを有する。洗浄期間の間、プレート、試験溶液、メラミンタイル及びリッドを烈しく振盪し、試験溶液を前記布地に接触させ、機械的応力を印加する。
ＡＭＳＡ試験法の説明：
食器洗い用洗剤組成物、即ちＭＧＤＡ添加ＡＤＷモデル洗剤及びＳＴＰＰ添加ＡＤＷモデル洗剤中における、選択されたプロテアーゼ変異体の洗浄性能を評価するために洗浄実験を実施する。自動機械負荷分析（Automated Mechanical Stress Assay：ＡＭＳＡ）を用いて本発明のプロテアーゼを試験する。ＡＭＳＡによれば、少量ずつ多数の酵素洗剤溶液の洗浄性能を調べることができる。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液用の多数のスロットと、食器洗いサンプル、即ち洗浄対象のメラミンタイルを、スロットの全開口部に対して硬く締め付けるリッドとを有する。洗浄期間の間、プレート、試験溶液、メラミンタイル及びリッドを烈しく振盪し、試験溶液を前記布地に接触させると共に、定期的且つ周期的な振動による機械的応力を印加する。更なる説明については、国際公開第０２／４２７４０号、特に２３〜２４頁の「Special Method Examples」のパラグラフを参照のこと。
実験は以下に詳述する実験条件下で行った。
Figure 0005947213
試験系にＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２及びＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝４：１：７．５）を加えて、水硬度を１５°ｄＨに調節した。洗浄後、布地を水道水で漱ぎ、乾燥した。
酵素変異体の性能は、個々のプロテアーゼにより洗浄された布地の色の明度として測定する。明度は、白色光照射時の光の反射強度として表すこともできる。汚れた試料からの反射光強度は、きれいな試料からの反射光強度よりも低い。よって、反射光強度を用いて、プロテアーゼの洗浄性能を測定することができる。
測色は、専用フラットベッドスキャナー（Kodak iQsmart、Kodak、Midtager 29、DK-2605 Brandby、Denmark）を用い、洗浄された布地を撮像して行う。
スキャン撮像からの光強度値の抽出は、例えば、特別設計のソフトウェアアプリケーション（Novozymes Color Vector Analyzer）を使用し、画像からの２４ビットピクセル値を、赤、緑及び青（ＲＧＢ）値に転換して行う。強度値（Ｉｎｔ）の算出は、ＲＧＢ値をベクトルとして加算し、得られたベクトルの長さを求めることにより行う。
Figure 0005947213
布地：
C-10及びPC-03は、Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Netherlandsから入手し、EMPA117は、EMPA Testmaterials AG Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, Switzerlandから入手する。
種々の変異体のＡＭＳＡ洗濯試験の結果を以下に示す。サビナーゼの性能結果を１の値とし、変異体の結果をこの値と比較する。
Figure 0005947213
種々の変異体のＡＭＳＡ洗濯試験の更なる結果を以下に示す。親（即ち置換Ｎ２１８Ｄ不含有）の性能結果を１の値とし、変異体の結果をこの値と比較する。
Figure 0005947213
結果は、本発明の変異体が、親と比較して、洗濯布地における高められた洗浄性能を有することを明白に示す。

Claims (15)

  1. 置換９Ｒ、１５Ｔ、６８Ａ、２１８Ｄ及び２４５Ｒを含む、親サブチリシンの変異体であって、
    変異体が更に、修飾６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ及び２６１Ｄのうち少なくとも１つを含み、前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当すると共に、
    改善された卵汚れ除去能を有する、変異体。
  2. 変異体が置換Ｇ６１Ｅを含む、請求項１に記載の変異体。
  3. 変異体が置換Ａ９８Ｓを含む、請求項１又は２に記載の変異体。
  4. 変異体が置換Ｓ９９Ｇを含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の変異体。
  5. 変異体が置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の変異体。
  6. 親サブチリシンが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１〜５の何れか一項に記載の変異体。
  7. 親サブチリシンがサブグループＩ−Ｓ２に属する、請求項１〜６の何れか一項に記載の変異体。
  8. 変異体が、親サブチリシンと比較して改善された１又は２以上の特性を有し、
    改善された特性が、洗浄性能、安定性、触媒活性及び食器洗い性能を含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の変異体。
  9. 請求項１〜８の何れか一項に記載の変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト。
  11. 請求項１０に記載の核酸コンストラクトを含む発現ベクター。
  12. 請求項１０に記載の核酸コンストラクトを含む宿主細胞。
  13. 請求項１〜８の何れか一項に記載の変異体を含む清浄又は洗剤組成物。
  14. 請求項１に記載の変異体を作製する方法であって、
    親サブチリシンに対して、以下の置換：
    ｉ）位置９のＳのＲによる置換、
    ii）位置１５のＡのＴによる置換、
    iii）位置６８のＶのＡによる置換、
    iv）位置２４５のＱのＲによる置換、及び
    ｖ）位置２１８のＮのＤによる置換、
    並びに、以下の修飾のうち１又は２以上：
    位置６１のＧのＥによる置換、
    位置６２のＮのＤによる置換、
    位置７６のＮのＤによる置換、
    位置９７へのＧの挿入、
    位置９８のＡのＳによる置換、
    位置９９のＳのＧによる置換、
    位置１０１のＳのＧによる置換、
    位置１２０のＨのＤによる置換、
    位置１３１のＰのＴによる置換、
    位置１３７のＱのＨによる置換、
    位置１９４のＡのＰによる置換、
    位置２２８のＡのＶによる置換、
    位置２３０のＡのＶによる置換、及び、
    位置２６１のＮのＤによる置換、
    を導入することを含み、
    前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する方法。
  15. 親サブチリシンが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016052334A (ja) * 2009-09-25 2016-04-14 ノボザイムス アクティーゼルスカブ プロテアーゼ変異体の使用

Families Citing this family (267)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7888093B2 (en) * 2002-11-06 2011-02-15 Novozymes A/S Subtilase variants
US20070161531A1 (en) * 2005-07-08 2007-07-12 Novozymes A/S Subtilase variants
MX339402B (es) * 2008-11-11 2016-05-25 Danisco Us Inc Composiciones y metodos que comprenden variantes de serina proteasa.
DE102011118037A1 (de) 2011-06-16 2012-12-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Geschirrspülmittel mit Bleichkatalysator und Protease
KR101956895B1 (ko) 2011-07-01 2019-03-12 노보자임스 에이/에스 안정화된 서브틸리신 조성물
US20140228274A1 (en) 2011-07-01 2014-08-14 Novozymes A/S Liquid Detergent Composition
WO2013076269A1 (en) 2011-11-25 2013-05-30 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
JP2015525248A (ja) 2012-05-16 2015-09-03 ノボザイムス アクティーゼルスカブ リパーゼを含む組成物およびその使用方法
MX364390B (es) 2012-06-20 2019-04-25 Novozymes As Uso de polipeptidos que tienen actividad proteasa en alimentos para animales y detergentes.
EP2888360B1 (en) 2012-08-22 2017-10-25 Novozymes A/S Metalloproteases from alicyclobacillus sp.
MX2015002211A (es) 2012-08-22 2015-05-08 Novozymes As Metaloproteasa de exiguobacterium.
EP2888358A1 (en) 2012-08-22 2015-07-01 Novozymes A/S Detergent compositions comprising metalloproteases
EP3556836A1 (en) 2012-12-07 2019-10-23 Novozymes A/S Preventing adhesion of bacteria
ES2655032T3 (es) 2012-12-21 2018-02-16 Novozymes A/S Polipéptidos que poseen actividad proteasa y polinucleótidos que los codifican
EP3321360A3 (en) 2013-01-03 2018-06-06 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US20160024440A1 (en) 2013-03-14 2016-01-28 Novozymes A/S Enzyme and Inhibitor Containing Water-Soluble Films
DE102013207933A1 (de) 2013-04-30 2014-10-30 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungsmittel enthaltend Proteasen
EP3461881A1 (en) 2013-05-03 2019-04-03 Novozymes A/S Microencapsulation of detergent enzymes
CN105209612A (zh) 2013-05-14 2015-12-30 诺维信公司 洗涤剂组合物
EP2997143A1 (en) 2013-05-17 2016-03-23 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
EP3786269A1 (en) 2013-06-06 2021-03-03 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
EP3013955A1 (en) 2013-06-27 2016-05-04 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
WO2014207227A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
US20160152925A1 (en) 2013-07-04 2016-06-02 Novozymes A/S Polypeptides Having Anti-Redeposition Effect and Polynucleotides Encoding Same
EP3019603A1 (en) 2013-07-09 2016-05-18 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
US9719077B2 (en) * 2013-07-29 2017-08-01 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
EP3027747B1 (en) 2013-07-29 2018-02-07 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
CN117904081A (zh) * 2013-07-29 2024-04-19 诺维信公司 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
WO2015049370A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Novozymes A/S Detergent composition and use of detergent composition
EP3453757B1 (en) 2013-12-20 2020-06-17 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
WO2015109972A1 (en) 2014-01-22 2015-07-30 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
WO2015134729A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase
EP3114272A1 (en) 2014-03-05 2017-01-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase
US10155935B2 (en) 2014-03-12 2018-12-18 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
US20170015950A1 (en) 2014-04-01 2017-01-19 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
US10131863B2 (en) 2014-04-11 2018-11-20 Novozymes A/S Detergent composition
EP3131921B1 (en) 2014-04-15 2020-06-10 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
DE102014209241A1 (de) 2014-05-15 2015-11-19 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel mit erhöhter Bleichleistung
CN106459937A (zh) 2014-05-27 2017-02-22 诺维信公司 用于产生脂肪酶的方法
EP3760713A3 (en) 2014-05-27 2021-03-31 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
US20170121695A1 (en) 2014-06-12 2017-05-04 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
DE102014212639A1 (de) * 2014-06-30 2015-12-31 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungsmittel enthaltend Proteasen
DE102014212642A1 (de) * 2014-06-30 2015-12-31 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungsmittel enthaltend Amylasen
DE102014212643A1 (de) * 2014-06-30 2015-12-31 Henkel Ag & Co. Kgaa Flüssiges Reinigungsmittel enthaltend flüssige und feste Enzymformulierungen
CN106661566A (zh) 2014-07-04 2017-05-10 诺维信公司 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸
EP3739029A1 (en) 2014-07-04 2020-11-18 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
WO2016079110A2 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Novozymes A/S Use of enzyme for cleaning
MX2017007103A (es) 2014-12-05 2017-08-24 Novozymes As Variantes de lipasa y polinucleotidos que las codifican.
DE102014225473A1 (de) 2014-12-10 2016-06-16 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel mit einer Kombination aus Amylase und Protease
EP3234121A1 (en) 2014-12-15 2017-10-25 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising subtilase variants
US20180000076A1 (en) 2014-12-16 2018-01-04 Novozymes A/S Polypeptides Having N-Acetyl Glucosamine Oxidase Activity
CN107002061A (zh) 2014-12-19 2017-08-01 诺维信公司 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
US10400230B2 (en) 2014-12-19 2019-09-03 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
EP3280800A1 (en) 2015-04-10 2018-02-14 Novozymes A/S Detergent composition
CN107567489A (zh) 2015-04-10 2018-01-09 诺维信公司 衣物洗涤方法，dna酶和洗涤剂组合物的用途
WO2016174234A2 (en) * 2015-04-29 2016-11-03 Novozymes A/S Polypeptides suitable for detergent
AR104783A1 (es) 2015-05-08 2017-08-16 Novozymes As VARIANTES DE a-AMILASA Y POLINUCLEÓTIDOS QUE LAS CODIFICAN
EP3964575A3 (en) 2015-05-08 2022-09-28 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
WO2016184944A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Novozymes A/S Odor reduction
BR112017025607B1 (pt) 2015-06-02 2022-08-30 Unilever Ip Holdings B.V. Composição de detergente para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido
ES2670044T3 (es) 2015-06-04 2018-05-29 The Procter & Gamble Company Composición detergente líquida para lavado de vajillas a mano
EP3287513A1 (en) 2015-06-04 2018-02-28 The Procter & Gamble Company Hand dishwashing liquid detergent composition
EP3101102B2 (en) 2015-06-05 2023-12-13 The Procter & Gamble Company Compacted liquid laundry detergent composition
EP3101100B1 (en) 2015-06-05 2018-02-07 The Procter and Gamble Company Compacted liquid laundry detergent composition
EP3101107B1 (en) 2015-06-05 2019-04-24 The Procter and Gamble Company Compacted liquid laundry detergent composition
TR201906232T4 (tr) 2015-06-11 2019-05-21 Unilever Nv Çamaşır için deterjan bileşimi.
WO2016202739A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
CN107922095A (zh) 2015-06-17 2018-04-17 诺维信公司 容器
WO2016206837A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Unilever Plc Laundry detergent composition
WO2016135351A1 (en) 2015-06-30 2016-09-01 Novozymes A/S Laundry detergent composition, method for washing and use of composition
CA2987160C (en) 2015-07-01 2022-12-13 Novozymes A/S Methods of reducing odor
CN107969136B (zh) 2015-07-06 2021-12-21 诺维信公司 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸
DE102015217816A1 (de) 2015-09-17 2017-03-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Verwendung hochkonzentrierter Enzymgranulate zur Erhöhung der Lagerstabilität von Enzymen
ES2794837T3 (es) 2015-09-17 2020-11-19 Henkel Ag & Co Kgaa Composiciones detergentes que comprenden polipéptidos que tienen actividad degradante de xantano
CN108350443B (zh) 2015-09-17 2022-06-28 诺维信公司 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
EP3356504B1 (en) 2015-10-01 2019-08-14 Unilever PLC Powder laundry detergent composition
WO2017060493A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Novozymes A/S Polypeptides
CA2994357C (en) * 2015-10-09 2023-09-12 Novozymes A/S Laundry method, use of polypeptide and detergent composition
CN108291215A (zh) 2015-10-14 2018-07-17 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
EP4324919A2 (en) 2015-10-14 2024-02-21 Novozymes A/S Polypeptide variants
BR112018007474A2 (pt) 2015-10-14 2018-10-30 Novozymes A/S ?limpeza de membranas de filtração de água?
MX2018004683A (es) 2015-10-28 2018-07-06 Novozymes As Composicion detergente que comprende variantes de amilasa y proteasa.
EP3380608A1 (en) 2015-11-24 2018-10-03 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
WO2017093318A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Novozymes A/S Methods for producing lipases
PL3387125T3 (pl) 2015-12-07 2023-01-09 Henkel Ag & Co. Kgaa Kompozycje do mycia naczyń zawierające polipeptydy posiadające aktywność beta-glukanazy oraz ich zastosowania
US20190002819A1 (en) 2015-12-28 2019-01-03 Novozymes Bioag A/S Heat priming of bacterial spores
EP3397742B1 (en) * 2015-12-29 2021-12-15 Novozymes A/S Detergent compositions and uses of the same
JP2019504625A (ja) 2016-01-29 2019-02-21 ノボザイムス アクティーゼルスカブ β−グルカナーゼ変異体およびこれをコードするポリヌクレオチド
WO2017140392A1 (en) 2016-02-17 2017-08-24 Unilever Plc Whitening composition
CN108884415A (zh) 2016-03-21 2018-11-23 荷兰联合利华有限公司 洗衣洗涤剂组合物
DE102016204814A1 (de) * 2016-03-23 2017-09-28 Henkel Ag & Co. Kgaa Verbesserte Reinigungsleistung an Protein sensitiven Anschmutzungen
DE102016204815A1 (de) * 2016-03-23 2017-09-28 Henkel Ag & Co. Kgaa Proteasen mit verbesserte Enzymstabilität in Waschmittel
BR112018069220A2 (pt) 2016-03-23 2019-01-22 Novozymes As uso de polipeptídeo que tem atividade de dnase para tratamento de tecidos
WO2017174251A1 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Unilever Plc Laundry detergent composition
WO2017174769A2 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Novozymes A/S Detergent compositions and uses of the same
WO2017186943A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
WO2017210188A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Novozymes A/S Stabilized liquid peroxide compositions
US11001787B2 (en) 2016-06-23 2021-05-11 Novozymes A/S Use of enzymes, composition and method for removing soil
WO2018001959A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Novozymes A/S Lipase variants and compositions comprising surfactant and lipase variant
WO2018002261A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Novozymes A/S Detergent compositions
WO2018007573A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Novozymes A/S Detergent compositions with galactanase
WO2018011276A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 The Procter & Gamble Company Bacillus cibi dnase variants and uses thereof
EP4357453A2 (en) 2016-07-18 2024-04-24 Novozymes A/S Lipase variants, polynucleotides encoding same and the use thereof
WO2018029021A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 Basf Se Liquid laundry formulation
PL3284805T3 (pl) 2016-08-17 2020-07-13 The Procter & Gamble Company Kompozycja czyszcząca zawierająca enzymy
CN109790491B (zh) 2016-09-27 2021-02-23 荷兰联合利华有限公司 家用洗衣方法
WO2018060216A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Novozymes A/S Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition
US20190284647A1 (en) 2016-09-29 2019-09-19 Novozymes A/S Spore Containing Granule
EP3532592A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Novozymes A/S Detergent compositions
EP3535377B1 (en) 2016-11-01 2022-02-09 Novozymes A/S Multi-core granules
RU2019120191A (ru) 2016-12-01 2021-01-11 Басф Се Стабилизация ферментов в композициях
WO2018108865A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Novozymes A/S Use of polypeptides
WO2018108382A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 Unilever Plc Laundry detergent composition
WO2018177938A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Novozymes A/S Polypeptides having dnase activity
CN110651039A (zh) 2017-03-31 2020-01-03 诺维信公司 具有rna酶活性的多肽
WO2018177936A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Novozymes A/S Polypeptides having dnase activity
CN110651029B (zh) 2017-04-04 2022-02-15 诺维信公司 糖基水解酶
US20200109352A1 (en) 2017-04-04 2020-04-09 Novozymes A/S Polypeptide compositions and uses thereof
WO2018185150A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Novozymes A/S Polypeptides
EP3385362A1 (en) 2017-04-05 2018-10-10 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising fungal mannanases
ES2728758T3 (es) 2017-04-05 2019-10-28 Henkel Ag & Co Kgaa Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas
EP3607042A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
CA3058520A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
EP3478811B1 (en) 2017-04-06 2019-10-16 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3607043A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
US10968416B2 (en) 2017-04-06 2021-04-06 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018184818A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3607044A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
US20220297171A1 (en) * 2017-04-14 2022-09-22 Novozymes A/S Processes For Solubilizing Municipal Solid Waste With Enzyme Compositions Comprising Protease And Enzyme Compositions Thereof
WO2018202846A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Novozymes A/S Compositions comprising lipase and sulfite
WO2018224544A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having cellulase activity and amylase activity, and uses thereof in cleaning and detergent compositions
EP3418366A1 (en) * 2017-06-19 2018-12-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing cleaning composition
EP3645692A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Novozymes A/S Enzyme slurry composition
WO2019048486A1 (de) * 2017-09-05 2019-03-14 Henkel Ag & Co. Kgaa Leistungsverbesserte proteasevarianten ii
US11739310B2 (en) 2017-09-05 2023-08-29 Henkel Ag & Co. Kgaa Performance-enhanced protease variants I
CN111247235A (zh) 2017-09-20 2020-06-05 诺维信公司 酶改善吸水性和/或白度的用途
US11414814B2 (en) 2017-09-22 2022-08-16 Novozymes A/S Polypeptides
CN111108195A (zh) 2017-09-27 2020-05-05 宝洁公司 包含脂肪酶的洗涤剂组合物
US11332725B2 (en) 2017-09-27 2022-05-17 Novozymes A/S Lipase variants and microcapsule compositions comprising such lipase variants
US11732221B2 (en) 2017-10-02 2023-08-22 Novozymes A/S Polypeptides having mannanase activity and polynucleotides encoding same
WO2019068713A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Novozymes A/S POLYPEPTIDES HAVING MANNANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THESE POLYPEPTIDES
US20200318037A1 (en) 2017-10-16 2020-10-08 Novozymes A/S Low dusting granules
CN111448302A (zh) 2017-10-16 2020-07-24 诺维信公司 低粉化颗粒
WO2019076800A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Novozymes A/S CLEANING COMPOSITIONS AND USES THEREOF
EP3701001A1 (en) 2017-10-24 2020-09-02 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having mannanase activity
HUE057471T2 (hu) 2017-10-27 2022-05-28 Procter & Gamble Polipeptid-variánsokat tartalmazó mosószerkészítmények
EP3701016A1 (en) 2017-10-27 2020-09-02 Novozymes A/S Dnase variants
DE102017125558A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten
CN111527190A (zh) 2017-11-01 2020-08-11 诺维信公司 多肽以及包含此类多肽的组合物
WO2019086532A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Novozymes A/S Methods for cleaning medical devices
CN111479919A (zh) 2017-11-01 2020-07-31 诺维信公司 多肽以及包含此类多肽的组合物
DE102017125560A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten
DE102017125559A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten
EP3717643A1 (en) 2017-11-29 2020-10-07 Danisco US Inc. Subtilisin variants having improved stability
CN111417707A (zh) 2017-11-29 2020-07-14 巴斯夫欧洲公司 储存稳定的酶制剂、其制备和应用
US11725197B2 (en) 2017-12-04 2023-08-15 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
WO2019137289A1 (en) * 2018-01-09 2019-07-18 Novozymes A/S Use of enzyme in removing airborne particulate matter from textile
EP3749761A1 (en) 2018-02-08 2020-12-16 Novozymes A/S Lipases, lipase variants and compositions thereof
US20210071156A1 (en) 2018-02-08 2021-03-11 Novozymes A/S Lipase Variants and Compositions Thereof
CN111770788B (zh) 2018-03-13 2023-07-25 诺维信公司 使用氨基糖低聚物进行微囊化
CN112262207B (zh) 2018-04-17 2024-01-23 诺维信公司 洗涤剂组合物中包含碳水化合物结合活性的多肽及其在减少纺织品或织物中的褶皱的用途
EP3781680A1 (en) 2018-04-19 2021-02-24 Novozymes A/S Stabilized cellulase variants
CN112272701A (zh) 2018-04-19 2021-01-26 诺维信公司 稳定化的纤维素酶变体
CN112368375A (zh) 2018-04-26 2021-02-12 巴斯夫欧洲公司 脂肪酶
WO2019211143A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Basf Se Amylase enzymes
WO2019238761A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Basf Se Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes
EP3814472A1 (en) 2018-06-28 2021-05-05 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
EP3814473A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
WO2020007863A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020007875A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020008024A1 (en) 2018-07-06 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020030623A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Basf Se Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent
US20210340466A1 (en) 2018-10-01 2021-11-04 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
CN112969775A (zh) 2018-10-02 2021-06-15 诺维信公司 清洁组合物
WO2020070009A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Endonuclease 1 ribonucleases for cleaning
WO2020070014A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity
WO2020070209A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition
WO2020070199A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same
WO2020070249A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning compositions
EP3677676A1 (en) 2019-01-03 2020-07-08 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
CN112805377A (zh) 2018-10-05 2021-05-14 巴斯夫欧洲公司 在液体中稳定淀粉酶的化合物
CN112805376A (zh) 2018-10-05 2021-05-14 巴斯夫欧洲公司 在液体中稳定水解酶的化合物
BR112021005412A2 (pt) 2018-10-05 2021-06-15 Basf Se preparação de enzima, processo para fabricar uma preparação de enzima estável, métodos para reduzir a perda da atividade proteolítica, para preparação de uma formulação detergente, para remover manchas e para aumentar a estabilidade na armazenagem de uma formulação detergente líquida, usos de um composto e da preparação de enzima, e, formulação detergente
CN112996894A (zh) 2018-10-11 2021-06-18 诺维信公司 清洁组合物及其用途
EP3647398A1 (en) 2018-10-31 2020-05-06 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions containing dispersins v
EP3647397A1 (en) 2018-10-31 2020-05-06 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions containing dispersins iv
WO2020104231A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Basf Se Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme
EP3887515A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Danisco US Inc. Subtilisin variants having improved stability
CN113302270A (zh) 2018-12-03 2021-08-24 诺维信公司 低pH粉末洗涤剂组合物
WO2020127775A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novozymes A/S Detergent pouch comprising metalloproteases
CN113366103A (zh) 2018-12-21 2021-09-07 诺维信公司 具有肽聚糖降解活性的多肽以及编码其的多核苷酸
CN114096676A (zh) 2019-02-20 2022-02-25 巴斯夫欧洲公司 用确定成分培养基和镁补料的芽孢杆菌工业发酵工艺
MX2021010109A (es) 2019-02-20 2021-09-21 Basf Se Proceso de fermentacion industrial para bacillus mediante el uso de un medio definido y una alimentacion de oligoelementos.
EP3942032A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US20220169953A1 (en) 2019-04-03 2022-06-02 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions
WO2020207944A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Novozymes A/S Polypeptide variants
US20220186151A1 (en) 2019-04-12 2022-06-16 Novozymes A/S Stabilized glycoside hydrolase variants
WO2020229480A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
EP3983425A1 (en) 2019-06-13 2022-04-20 Basf Se Method of recovering a protein from fermentation broth using a divalent cation
JP2022538360A (ja) 2019-07-01 2022-09-01 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 酵素を安定化するためのペプチドアセタール
EP3994255A1 (en) 2019-07-02 2022-05-11 Novozymes A/S Lipase variants and compositions thereof
WO2021001297A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 Basf Se Method for preparing a fermentation medium
WO2021004830A1 (en) 2019-07-05 2021-01-14 Basf Se Industrial fermentation process for microbial cells using a fed-batch pre-culture
EP3997202A1 (en) 2019-07-12 2022-05-18 Novozymes A/S Enzymatic emulsions for detergents
WO2021030400A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 Novozymes Bioag A/S Pesticidal combinations of yersinia and proteases
WO2021037878A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Novozymes A/S Composition comprising a lipase
CN114787329A (zh) 2019-08-27 2022-07-22 诺维信公司 洗涤剂组合物
EP4031644A1 (en) 2019-09-19 2022-07-27 Novozymes A/S Detergent composition
US20220340843A1 (en) 2019-10-03 2022-10-27 Novozymes A/S Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains
BR112022006082A2 (pt) 2019-10-18 2022-06-21 Basf Se Preparação enzimática, formulação de detergente, e, uso de pelo menos um diol
WO2021105336A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Basf Se Compositions comprising polymer and enzyme
WO2021115912A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Basf Se Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes
US20220411773A1 (en) 2019-12-20 2022-12-29 Novozymes A/S Polypeptides having proteolytic activity and use thereof
WO2021122118A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning compositions comprising dispersins vi
AU2020410142A1 (en) 2019-12-20 2022-08-18 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning composition coprising a dispersin and a carbohydrase
WO2021122121A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning compositions comprising dispersins ix
CN114929848A (zh) 2019-12-20 2022-08-19 诺维信公司 稳定的液体无硼酶组合物
BR112022015120A2 (pt) 2020-01-29 2022-12-13 Unilever Ip Holdings B V Recipiente plástico transparente e processo de fabricação de recipiente plástico transparente
EP4097226A1 (en) 2020-01-31 2022-12-07 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
WO2021152123A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
BR112022015985A2 (pt) 2020-02-14 2022-10-11 Basf Se Variante de mananase, polinucleotídeo, construto de expressão, célula hospedeira, métodos para expressar uma variante de mananase, para aumentar a estabilidade no tensoativo de uma mananase e para prover uma formulação de detergente, preparação enzimática líquida, formulação, método de lavagem ou limpeza, e, uso de uma mananase
EP3892708A1 (en) 2020-04-06 2021-10-13 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions comprising dispersin variants
EP4133066A1 (en) 2020-04-08 2023-02-15 Novozymes A/S Carbohydrate binding module variants
US20230167384A1 (en) 2020-04-21 2023-06-01 Novozymes A/S Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity
WO2021254824A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Basf Se Compositions and their use
EP4172298A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 Novozymes A/S Use of cellulases for removing dust mite from textile
EP3936593A1 (en) 2020-07-08 2022-01-12 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions and uses thereof
WO2022008416A1 (en) 2020-07-09 2022-01-13 Basf Se Compositions and their applications
WO2022008732A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Basf Se Enhancing the activity of antimicrobial preservatives
WO2022014428A1 (ja) 2020-07-15 2022-01-20 花王株式会社 アミラーゼ配合洗浄剤組成物
EP4189051B1 (en) 2020-07-27 2024-02-28 Unilever IP Holdings B.V. Use of an enzyme and surfactant for inhibiting microorganisms
WO2022043321A2 (en) 2020-08-25 2022-03-03 Novozymes A/S Variants of a family 44 xyloglucanase
WO2022058322A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Novozymes A/S Animal feed comprising insects or insect meal
CN116507725A (zh) 2020-10-07 2023-07-28 诺维信公司 α-淀粉酶变体
WO2022084303A2 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Novozymes A/S Use of polypeptides having dnase activity
WO2022083949A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Basf Se Compositions and their use
EP4237525A1 (en) 2020-10-28 2023-09-06 Novozymes A/S Use of lipoxygenase
BR112023008326A2 (pt) 2020-10-29 2023-12-12 Novozymes As Variantes de lipase e composições compreendendo tais variantes de lipase
CN116670261A (zh) 2020-11-13 2023-08-29 诺维信公司 包含脂肪酶的洗涤剂组合物
WO2022106400A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of immunochemically different proteases
EP4032966A1 (en) 2021-01-22 2022-07-27 Novozymes A/S Liquid enzyme composition with sulfite scavenger
WO2022162043A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Novozymes A/S Lipase with low malodor generation
EP4291625A1 (en) 2021-02-12 2023-12-20 Novozymes A/S Stabilized biological detergents
CN116829709A (zh) 2021-02-12 2023-09-29 诺维信公司 α-淀粉酶变体
EP4305146A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Novozymes A/S Polypeptide variants
EP4060036A1 (en) 2021-03-15 2022-09-21 Novozymes A/S Polypeptide variants
US20240060061A1 (en) 2021-03-15 2024-02-22 Novozymes A/S Dnase variants
EP4314222A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Novozymes A/S Detergent composition with reduced polymer content
EP4359518A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Novozymes A/S Alpha-amylase polypeptides
WO2023061827A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Basf Se Compositions comprising polymers, polymers, and their use
WO2023066741A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Basf Se Phosphate-free composition and methods for their manufacture and use
WO2023088776A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Basf Se Compositions comprising polymers, polymers, and their use
WO2023088761A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Basf Se Compositions comprising polymers, polymers, and their use
WO2023110599A2 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Basf Se Compositions and their applications
WO2023116569A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Novozymes A/S Composition comprising a lipase and a booster
WO2023117980A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Basf Se Environmental attributes for plastic additives
EP4206309A1 (en) 2021-12-30 2023-07-05 Novozymes A/S Protein particles with improved whiteness
EP4234664A1 (en) 2022-02-24 2023-08-30 Evonik Operations GmbH Composition comprising glucolipids and enzymes
WO2023165507A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Novozymes A/S Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents
WO2023165950A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Novozymes A/S Dnase variants and compositions
WO2023194204A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Novozymes A/S Hexosaminidase variants and compositions
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2023233026A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Unilever Ip Holdings B.V. Laundry detergent product
WO2023247348A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
WO2023247664A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Novozymes A/S Lipase variants and compositions comprising such lipase variants
DE102022206585A1 (de) 2022-06-29 2024-01-04 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungsmittel mit verbesserter proteolytischer reinigungsleistung
WO2024012894A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Basf Se Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3234258A (en) 1963-06-20 1966-02-08 Procter & Gamble Sulfation of alpha olefins
GB1234445A (ja) 1967-10-03 1971-06-03
GB1296839A (ja) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
JPS58217598A (ja) 1982-06-10 1983-12-17 日本油脂株式会社 洗剤組成物
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
DE3684398D1 (de) 1985-08-09 1992-04-23 Gist Brocades Nv Lipolytische enzyme und deren anwendung in reinigungsmitteln.
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US4810414A (en) 1986-08-29 1989-03-07 Novo Industri A/S Enzymatic detergent additive
NZ221627A (en) 1986-09-09 1993-04-28 Genencor Inc Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios
EP0305216B1 (en) 1987-08-28 1995-08-02 Novo Nordisk A/S Recombinant Humicola lipase and process for the production of recombinant humicola lipases
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
WO1989006270A1 (en) 1988-01-07 1989-07-13 Novo-Nordisk A/S Enzymatic detergent
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US5776757A (en) 1988-03-24 1998-07-07 Novo Nordisk A/S Fungal cellulase composition containing alkaline CMC-endoglucanase and essentially no cellobiohydrolase and method of making thereof
EP0406314B1 (en) 1988-03-24 1993-12-01 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
NO176976C (no) 1989-08-21 1995-07-26 Hans Brattrud Trinnlöst justerbart V-formet overlöp
EP0528828B2 (de) 1990-04-14 1997-12-03 Genencor International GmbH Alkalische bacillus-lipasen, hierfür codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren
DE69107455T3 (de) 1990-05-09 2004-09-23 Novozymes A/S Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung.
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
US5065142A (en) 1990-05-23 1991-11-12 Service Machine Company Voltage pickup circuit and flashing display for high voltage indicator device, and input electrode therefor
US5075041A (en) 1990-06-28 1991-12-24 Shell Oil Company Process for the preparation of secondary alcohol sulfate-containing surfactant compositions
KR930702514A (ko) 1990-09-13 1993-09-09 안네 제케르 리파제 변체
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
ATE219136T1 (de) 1991-01-16 2002-06-15 Procter & Gamble Kompakte waschmittelzusammensetzungen mit hochaktiven cellulasen
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
PL170474B1 (pl) 1991-04-30 1996-12-31 Procter & Gamble C iekla kom pozycja detergentow a PL PL PL
EP0583339B1 (en) 1991-05-01 1998-07-08 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes and detergent compositions
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
ES2334590T3 (es) 1992-07-23 2010-03-12 Novozymes A/S Alfa-amilasa mutante, detergente y agente de lavado de vajilla.
EP0663950B1 (en) 1992-10-06 2004-03-17 Novozymes A/S Cellulase variants
DE69415659T3 (de) 1993-02-11 2010-05-12 Genencor International, Inc., Palo Alto Oxidativ stabile alpha-amylase
PL306812A1 (en) 1993-04-27 1995-04-18 Gist Brocades Nv Novel lipase variants suitable for use in detergents
DK52393D0 (ja) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
JPH09503664A (ja) 1993-10-13 1997-04-15 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｈ▲下２▼ｏ▲下２▼安定ペルオキシダーゼ変異体
JPH07143883A (ja) 1993-11-24 1995-06-06 Showa Denko Kk リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
WO1995022615A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Novo Nordisk A/S A method of preparing a variant of a lipolytic enzyme
AU1890095A (en) 1994-03-08 1995-09-25 Novo Nordisk A/S Novel alkaline cellulases
US6599730B1 (en) 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
WO1995030744A2 (en) 1994-05-04 1995-11-16 Genencor International Inc. Lipases with improved surfactant resistance
ES2165420T3 (es) 1994-06-03 2002-03-16 Novozymes Biotech Inc Lacasas myceliophthora purificadas y acidos nucleicos que las codifican.
WO1995035381A1 (en) 1994-06-20 1995-12-28 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
WO1996000292A1 (en) 1994-06-23 1996-01-04 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
CN101659926A (zh) 1994-06-30 2010-03-03 诺沃奇梅兹有限公司 非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达系统及所用启动子和终止子
EP0788541B1 (en) 1994-10-06 2008-03-12 Novozymes A/S Enzyme preparation with endoglucanase activity
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
WO1996013580A1 (en) 1994-10-26 1996-05-09 Novo Nordisk A/S An enzyme with lipolytic activity
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
CN1182451A (zh) 1995-03-17 1998-05-20 诺沃挪第克公司 新的内切葡聚糖酶
KR100380006B1 (ko) 1995-05-05 2004-05-27 노보자임스 에이/에스 프로테아제변이체와조성물
JP4307549B2 (ja) 1995-07-14 2009-08-05 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 脂肪分解活性を有する修飾された酵素
DE19528059A1 (de) 1995-07-31 1997-02-06 Bayer Ag Wasch- und Reinigungsmittel mit Iminodisuccinaten
ATE267248T1 (de) 1995-08-11 2004-06-15 Novozymes As Neuartige lipolytische enzyme
EP0783034B1 (en) 1995-12-22 2010-08-18 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Chelating agent and detergent comprising the same
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
AU3938997A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
CN100362100C (zh) 1996-09-17 2008-01-16 诺沃奇梅兹有限公司 纤维素酶变体
CA2266527A1 (en) 1996-09-24 1998-04-02 John Mcmillan Mciver Liquid detergents containing proteolytic enzyme, peptide aldehyde and calcium ions
AU730286B2 (en) 1996-10-08 2001-03-01 Novo Nordisk A/S Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors
KR100591553B1 (ko) 1996-11-04 2006-06-19 노보자임스 에이/에스 섭틸라제 변종과 조성물
JP4044143B2 (ja) 1996-11-04 2008-02-06 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ズブチラーゼ変異体及び組成物
US6159731A (en) 1997-02-12 2000-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis
RU2252958C2 (ru) * 1997-10-23 2005-05-27 Джененкор Интернэшнл, Инк. Вариант субтилизина (варианты), кодирующая его днк, экспрессирующий вектор, очищающая композиция, корм для животных, композиция для обработки ткани
AR015977A1 (es) * 1997-10-23 2001-05-30 Genencor Int Variantes de proteasa multiplemente substituida con carga neta alterada para su empleo en detergentes
JP2003530440A (ja) 1998-10-13 2003-10-14 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 洗剤組成物または成分
US6376450B1 (en) * 1998-10-23 2002-04-23 Chanchal Kumar Ghosh Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants
US6831053B1 (en) * 1998-10-23 2004-12-14 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants
DE69932345T2 (de) 1998-10-26 2007-07-19 Novozymes A/S Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
CN100482801C (zh) 1999-03-22 2009-04-29 诺沃奇梅兹有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
CZ2002212A3 (cs) * 1999-07-22 2002-07-17 The Procter & Gamble Company Varianty subtilisinové proteasy mající aminokyselinové substituce v definovaných epitopových oblastech
JP2003516751A (ja) * 1999-12-15 2003-05-20 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 卵の染みに及ぼす洗浄性能改良を示すズブチラーゼ変異体
US6727085B2 (en) * 1999-12-15 2004-04-27 Fanoe Tina Sejersgaard Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains
US7109016B2 (en) * 2000-08-21 2006-09-19 Novozymes A/S Subtilase enzymes
EP1326966B2 (en) * 2000-10-13 2015-03-18 Novozymes A/S Subtilase variants
EP1340063B1 (en) 2000-11-27 2012-10-17 Novozymes A/S Automated mechanical stress assay for screening cleaning ingredients
EP1421187B1 (en) 2001-07-27 2007-10-10 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides
CN1711354A (zh) * 2002-11-06 2005-12-21 诺和酶股份有限公司 枯草杆菌酶变体
TWI319007B (en) * 2002-11-06 2010-01-01 Novozymes As Subtilase variants
US7888093B2 (en) * 2002-11-06 2011-02-15 Novozymes A/S Subtilase variants
CN102766545B (zh) * 2003-05-07 2014-08-06 诺维信公司 变体枯草杆菌蛋白酶（枯草杆菌酶）
US20070161531A1 (en) * 2005-07-08 2007-07-12 Novozymes A/S Subtilase variants
EP2385112B1 (en) * 2005-07-08 2016-11-30 Novozymes A/S Subtilase variants
JP2009534022A (ja) * 2006-04-20 2009-09-24 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 卵のシミに対する洗浄能力が向上したサビナーゼ変異体
US20080090747A1 (en) * 2006-07-18 2008-04-17 Pieter Augustinus Protease variants active over a broad temperature range
RU2639534C2 (ru) * 2009-09-25 2017-12-21 Новозимс А/С Применение вариантов протеазы
JP5947213B2 (ja) * 2009-09-25 2016-07-06 ノボザイムス アクティーゼルスカブ プロテアーゼ変異体の使用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016052334A (ja) * 2009-09-25 2016-04-14 ノボザイムス アクティーゼルスカブ プロテアーゼ変異体の使用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016052334A (ja) 2016-04-14
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