MX2012003386A - Variantes de subtilasa. - Google Patents

Variantes de subtilasa.

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Lars Beier
Juergen Carsten Franz Knoetzel
Astrid Benie
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Novozymes As
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Abstract

La presente invención se refiere a variantes de proteasa. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las variantes de proteasa variante y a constructos de ácido nucleico, vectores, y células hospederas que comprenden los polinucleótidos, y métodos para utilizar las enzimas variantes, tal como en composiciones para lavandería y detergentes.

Description

VARIANTES DE SUBTILASA Campo de la Invención La presente invención se refiere a variantes de subtilasa novedosas que muestran alteraciones relativas con la subtilasa precursora en una o más propiedades que incluyen: desempeño de lavado, estabilidad térmica, estabilidad de almacenamiento o actividad catalítica. Las variantes de la invención son adecuadas para el uso en por ejemplo composiciones de limpieza o detergentes, tales como composiciones detergentes para ropa y composiciones para lavaplatos, incluyendo composiciones para lavaplatos automática. La presente invención también se refiere a secuencias de ADN aislado que codifican las variantes, vectores de expresión, células hospederas, y métodos para producir y utilizar las variantes de la invención. Además, la presente invención se refiere a composiciones de limpieza y detergentes que comprenden las variantes de la invención.
Antecedentes de la Invención En la industria de detergentes se han implementado enzimas por más de 30 años en formulaciones de lavado. Las enzimas utilizadas en tales formulaciones comprenden proteasas, lipasas, amilasas, celulasas, manosidasas así como también las enzimas o mezclas de las mismas. Comercialmente Ref . :228290 las más importantes son proteasas.
Un número cada vez mayor de proteasas comercialmente utilizadas son variantes diseñadas de proteínas de proteasas de tipo natural de origen natural, por ejemplo DURAZYM(R) , RELASEMR, ALCALASEMR, SAVINASEMR, PRIMASEMR, DURALASEMR, ESPERASEMR, OVOZYMEMR, RELASE (R) y KA NASEMR (Novozymes A/S) , AXAPEM(R) (Gist-Brocades N.V.), PURAFECT (R) (Genencor International, Inc.), MAXATASE™, MAXACAL™, MAXAPEMM , PROPERASEMR, PURAFECTMR, PURAFECT OxPMR, FN2MR, FN 3MR y FN4MR (Genencor International, Inc.).
Además, se describen en la técnica una variedad de variantes, tal como en el documento WO 04/041979 (NOVOZYMES A/S) que describe variantes de subtilasa que muestran alteraciones relativas con la subtilasa precursora en por ejemplo desempeño de lavado, estabilidad térmica, estabilidad de almacenamiento o actividad catalítica. Las variantes son adecuadas para el uso en por ejemplo composiciones de limpieza o detergentes.
Se ha descrito una variedad de variantes de proteasa útiles muchas de las cuales han proporcionado actividad, estabilidad y solubilidad mejoradas en diferentes detergentes. Sin embargo, varios factores hacen ventajosa la mejora adicional de las proteasas. Las condiciones de lavado se mantienen en cambio por ejemplo con respecto a la temperatura y el pH y muchas manchas aún son difíciles de remover completamente bajo condiciones de lavado convencionales. De esta manera a pesar de la investigación intensiva en el desarrollo de proteasas sigue habiendo una necesidad por más proteasas mejoradas.
Por lo tanto, .es un objetivo de la presente invención proporcionar variantes de una subtilisina con propiedades mejoradas comparada a su enzima precursora.
Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a variantes de subtilisinas precursoras, que pueden ser una subtilisina tal como se muestra en SEQ ID NO 1.
En un aspecto las variantes de la presente invención tienen por lo menos propiedades mejoradas como son comparadas con la subtilisina precursora, tal como la subtilisina mostrada en SEQ ID NO 1, donde las propiedades mejoradas pueden ser el desempeño mejorado de lavado, tal como capacidad mejorada de remoción de manchas, desempeño mejorado de lavado en lavado de superficies duras, tal como desempeño mejorado de lavaplatos, estabilidad mejorada, tal como estabilidad de almacenamiento o térmica o actividad catalítica mejorada. En un aspecto de la invención las variantes tienen capacidades mejoradas de remoción de huevo tal como la remoción mejorada de yema de huevo hervida de superficies.
De esta manera, un aspecto de la presente invención se refiere a una variante de una subtilisina precursora que comprende las sustituciones 9{R,K,H}, 15 {G, A, S , T, M} , 68{G,A,S,T,M} , 218 {D,S,G,V} y 245{R,K,H} en donde la variante comprende además por lo menos una de las siguientes modificaciones: 6l{D,E}, 62{D,E}, 76{D,E}f *97aG, 98{G,S}, 99G, 101 G, 120{V,Q,D}, 13l{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261 D, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro SEQ ID NO: 2 [BPN' ] .
En un aspecto, la variante de acuerdo con la presente invención comprende además la sustitución G61E.
En un aspecto, la variante de acuerdo con la presente invención comprende además la sustitución A98S.
En un aspecto, la variante de acuerdo con la presente invención comprende además la sustitución S99G.
En un aspecto, la variante de acuerdo con la presente invención comprende las siguientes sustituciones S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D y Q245R.
En un aspecto, la subtilisina precursora es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad a SEQ ID NO. 1.
En otro aspecto, la variante tiene una o más propiedades mejoradas comparadas con la subtilisina precursora, en donde las propiedades mejoradas incluyen desempeño de lavado, estabilidad, actividad catalítica y desempeño de lavaplatos.
En un aspecto adicional, las propiedades mejoradas incluyen desempeño de lavado, tal como capacidad mejorada de remoción de manchas, desempeño mejorado de lavado en lavado de superficies duras, tal como lavaplatos, estabilidad mejorada, tal como estabilidad de almacenamiento térmica o actividad catalítica mejorada. En un aspecto de la invención las variantes tienen capacidades mejoradas de remoción de huevo tal como remoción mejorada de yema de huevo hervida de superficies duras.
Otro aspecto se refiere a un método para producir una variante al introducir en la subtilisina precursora las siguientes sustituciones: i . sustitución en la posición 9 con {R,K,H}; ii . sustitución en la posición 15 con {G, A, S, T,M} ; iii . sustitución en la posición 68 con {G, A, S, T, } ; iv. sustitución en la posición 245 con {R,K,H}, y v . sustitución en la posición 218 con {D, S, G O V} y una o más de las siguientes modificaciones: sustitución en la posición 61 con {D,E}, sustitución en la posición 62 con {D,E}, sustitución en la posición 76 con {D,E}, inserción de G en la posición 97, sustitución en la posición 98 con {G, s} , sustitución en la posición 99 con G, sustitución en la posición 101 con G, sustitución en la posición 120 con {V,Q,D}, sustitución en la posición 131 con {T,S}, sustitución en la posición 137 con H, sustitución en la posición 194 con P, sustitución en la posición 228 con V, sustitución en la posición 230 con V, sustitución en la posición 261 con D, donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 [BPN' ] .
Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados que codifican las subtilisinas variantes, y constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células hospederas que comprenden los polinucleótidos .
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición de limpieza o detergente, de manera preferente una composición de lavado o lavaplatos que comprenden las variantes de la presente invención. Un aspecto de la invención se refiere al uso de variantes en detergente por ejemplo para lavado o lavaplatos.
Descripción Detallada de la Invención Definiciones Actividad proteolítica: El término se refiere en este documento por ser capaz de descomponer proteínas mediante proteólisis, que es el catabolismo de la proteína por hidrólisis de los enlaces de péptido que enlazan aminoácidos conjuntamente en la cadena de polipéptido, formando la proteína. De esta manera las proteínas se descomponen en aminoácidos por las proteasas que tienen actividad proteolítica. Los términos "actividad de proteasa" y "actividad proteolítica" se utilizan intercambiablemente. Véase también la definición de "proteasas" posteriormente.
Variante: El término "variante" se define en este documento como un polipéptido que comprende una modificación o alteración (es) , tal como una sustitución, inserción, y/o supresión, de uno o más (varios) residuos de aminoácido en una o más (varias) posiciones especificas. El polinucleótido alterado se obtiene a través de intervención humana mediante modificación de una secuencia de polinucleótidos . Las variantes pueden ser una variante de subtilisina, por ejemplo una variante de una subtilisina, por ejemplo la secuencia de polinucleótidos dada a conocer en SEQ ID NO:l o una secuencia homologa de la misma. Los términos "variante de proteasa" y "variante de subtilisina" se utilizan intercambiablemente. Las variantes de la presente invención tienen de manera preferente actividad de proteasa o actividad proteolítica. Los términos "uno o más" , "uno o varios" y por lo menos uno se utilizan intercambiablemente.
Modificación (es) : El término "modificación (es) " utilizado en este documento se define para incluir una modificación química de una subtilasa así como también manipulación genética del ADN que codifica la proteasa precursora. La modificación (es) puede ser el reemplazo (s) de la cadena(s) lateral de aminoácidos, sustitución (es) , supresión (es) y/o inserciones en o en el aminoácido (s) de interés .
Enzima de Tipo Natural: El término variante de proteasa de "tipo natural" indica una variante de proteasa expresada por un micro organismo de origen natural, tal como una bacteria, levadura, u hongo filamentoso encontrados en la naturaleza, es decir, el polinucleótido que codifica la variante de proteasa no se obtiene a través de intervención humana por la modificación de la secuencia de polinucleótidos .
Enzima Precursora: El término variante de proteasa "precursora" , tal como variante de subtilisina "precursora" como se utiliza en este documento significa una proteasa, tal como una subtilisina la cual una modificación, por ejemplo, sustitución (es) , inserción (es) , supresión (es) , y/o truncamiento (s) , se hace para producir las variantes de enzimas de la presente invención. Este término también se refiere al polipéptido con el cual se compara y se alinea una variante. El precursor puede ser un polipéptido o una variante de origen natural (tipo natural) . Por ejemplo, el polipéptido precursor puede ser una variante de un polipéptido de origen natural que se ha modificado o alterado en la secuencia de aminoácidos. Un precursor también puede ser una variante alélica, que es un polipéptido modificado por cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico.
Variante o polipéptido aislado: El término "variante aislada" o "polipéptido aislado" como se utiliza en este documento se refiere a una variante de un polipéptido que se aisla de una fuente. En un aspecto, la variante o polipéptido es por lo menos 1% puro, de manera preferente por lo menos 5%, de manera más preferente por lo menos 10% puro, de manera más preferente por lo menos 20% puro, de manera más preferente por lo menos 40% puro, de manera más preferente por lo menos 60% puro, aún más de manera preferente por lo menos 80% puro, y de manera más preferente por lo menos 90% puro, como es determinado por SDS-PAGE.
Variante o polipéptido sustancialmente puro: El término "variante sustancialmente pura" o "polipéptido sustancialmente puro" indica en este documento una preparación de polipéptidos que contiene a lo sumo 10%, de manera preferente a lo sumo 8%, de manera más preferente a lo sumo 6%, más preferiblemente a lo sumo 5%, más preferiblemente a lo sumo 4%, más preferiblemente a lo sumo 3%, aún de manera más preferente a lo sumo 2%, de manera mucho más preferente a lo sumo 1 %, y aún de manera mucho más preferente a lo sumo 0.5% en peso del otro material de polipéptido con el cual se asocia nativa o recombinantemente . Por lo tanto, se prefiere que la variante o polipéptido sustancialmente puros sea por lo menos 92% puro, de manera preferente por lo menos 94% puro, de manera más preferente por lo menos 95% puro, de manera mas preferente por lo menos 96% puro, de manera más preferente por lo menos 96% puro, de manera más preferente por lo menos 97% puro, de manera más preferente por lo menos 98% puro, aún de manera más preferente por lo menos 99%, de manera mucho más preferente por lo menos 99.5% puro, y aún de manera mucho más preferente 100% puro en peso del material de polipéptido total presente en la preparación. Las variantes y polipéptidos de la presente invención están de manera preferente en una forma sustancialmente pura. Esto se puede lograr, por ejemplo, al preparar la variante o polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o mediante métodos de purificación clásicos.
Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" se define en este documento como un polipéptido que tiene actividad de variante de proteasa es decir en su forma final después de la traducción y cualquier modificación pos-traduccional , tal como procesamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro es el polipéptido de SEQ ID NO : 3 o SEQ ID NO: 4. Se puede utilizar el programa de señal SignallP3.0 para predecir el polipéptido maduro.
Secuencia de codificación de polipéptido maduro: El término "secuencia de codificación de polipéptido maduro" se define en este documento como una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de variante de proteasa. En un aspecto, la secuencia de codificación del polipéptido maduro son nucleótidos que codifican SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO : 4.
Identidad: La relevancia entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad" .
Para propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre las secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) como es implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice y colaboradores., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org), de manera preferente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales son penalización de espacio abierto de 10, penalización de espacio en extensión de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSU 62 (EMBOSS versión de BLOSUM62) . El resultado de la "identidad más larga" etiquetada por Leedle (obtenido utilizando la opción nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula como sigue: (residuos idénticos xlOO) / (Longitud de Alineación - Número Total de Espacios en la Alineación) .
Para propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre las dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice y colaboradores, 2000, supra; http://emboss.org), de manera preferente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son penalización de espacio abierto de 10, penalización de espacio en extensión de 0.5, y la matriz de sustitución EADNFULL (EMBOSS versión de NCBI NUC4.4). El resultado de "identidad más larga" etiquetada de Leedle (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula como sigue: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100) / (Longitud de Alineación - Número Total de Espacios en la Alineación) .
Secuencia Homologa: El término "secuencia homologa" se define en este documento como un polipéptido previsto que proporciona un valor E (o puntuación de expectación) de menor que 0.001 en una búsqueda tfasty (Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener y S. A. Krawetz, ed. , pp . 185-219) con la variante de proteasa de Micrododhium nivale CBS 100236.
Fragmento de polipéptido: El término "fragmento de polipéptido" se define en este documento como un polipéptido que tiene uno o más (varios) aminoácidos suprimidos de la amino y/o carboxilo terminal del polipéptido maduro; o una secuencia homologa del mismo; en donde el fragmento tiene actividad de variante de proteasa.
Subsecuencia: El término "subsecuencia" se define en este documento como una secuencia de polinucleótidos que tiene uno o más (varios) nucleótidos suprimidos del extremo 5' y/o 3' del polipéptido maduro que codifica la secuencia; o una secuencia homologa de la misma; en donde la secuencia codifica un fragmento de polipéptido que tiene actividad de variante de proteasa.
Variante alélica: El término "variante alélica" indica en este documento cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar por resultado polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencia de aminoácidos alterados. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen .
Polinucleótido aislado: El término "polinucleótido aislado" como se utiliza en este documento se refiere a un polinucleótido que se aisla de una fuente. En un aspecto, el polinucleótido aislado es por lo menos 1% puro, de manera preferente por lo menos 5% puro, de manera más preferente por lo menos 10% puro, de manera más preferente por lo menos 20% puro, más preferiblemente por lo menos 40% puro, más preferiblemente por lo menos 60% puro, aún de manera más preferente por lo menos 80% puro, y de manera mucho más preferente por lo menos 90% puro, y aún de manera mucho más preferente por lo menos 95% puro, como se determina por la electroforesis de azarosa.
Polinucleótido sustancialmente puro: El término "polinucleótido sustancialmente puro" como se utiliza en este documento se refiere a una preparación de polinucleótidos libre de otros nucleótidos extraños o indeseados y en una forma adecuada para el uso dentro de los sistemas de producción de polipéptidos genéticamente diseñados. De esta manera, un polinucleótido sustancialmente puro contiene a lo sumo 10%, de manera preferente a lo sumo 8%, de manera más preferente a lo sumo 6%, de manera más preferente a lo sumo 5%, de manera más preferente a lo sumo 4%, de manera más preferente a lo sumo 3%, aún de manera más preferente a lo sumo 2%, de manera mucho más preferente a lo sumo 1%, y aún de manera mucho más preferente a lo sumo 0.5% en peso de otro material de polinucleótido con el cual se asocian nativa o recombinantemente . Un polinucleótido sustancialmente puro puede, sin embargo, incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural, tal como promotores y terminadores . Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea por lo menos 90% puro, de manera preferente por lo menos 92% puro, de manera más preferente por lo menos 94% puro, de manera más preferente por lo menos 95% puro, de manera más preferente por lo menos 96% puro, de manera más preferente por lo menos 97% puro, aún de manera más preferente por lo menos 98% puro, de manera mucho más preferente 99%, y aún de manera mucho más preferente por lo menos 99.5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están de manera preferente en una forma sustancialmente pura, es decir, que la preparación de polinucleótido estA sustancialmente libre de otro material de polinucleótido con el cual se asocia nativa o recombinantemente . Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, de cADN, ARN, semi-sintético, sintético, o cualq ier combinación de los mismos.
Secuencia de codificación: Cuando se utiliza en este documento el término "secuencia de codificación" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto de polipéptido. Los límites de la secuencia de codificación se determinan en general por un marco de lectura abierto, que se lleva usualmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codón de detención tal como TAA, TAG y TGA. La secuencia de codificación puede ser un ADN, cADN, polinucleótido sintético recombinante . cADN: El término "cADN" se define en este documento como una molécula de ADN que se puede preparar mediante transcripción inversa de una molécula de mARN, empalmada, madura obtenida de una célula eucariótica. El cADN carece de secuencias de intrones que están usualmente presentes en el ADN genómico correspondiente. El trascripto de ARN inicial es un precursor al mARN que se procesa a través de una serie de etapas antes de presentarse como mARN empalmado maduro. Esas etapas incluyen la remoción de secuencias de intrones mediante un proceso llamado empalme. El cADN derivado de mARN carece, por lo tanto de cualquier secuencia de intrones.
Constructos de ácido nucleico: El término "constructo de ácido nucleico" como se utiliza en este documento se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra individual o de doble hebra, que aisla de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otra manera no existirían en la naturaleza o que es sintético. El término constructo de ácido nucleico es sinónimo con el término "cásete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia de codificación de la presente invención.
Secuencias de control: El término "secuencias de control" se define en este documento para incluir todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña al polinucleótido que codifica el polipéptido o nativo o extraño entre sí. Estas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia pro-péptidos , promotor, secuencia de péptidos de señal, y terminador de transcripción. En un mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de detención transcripcionales y traduccionales . Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores para el propósito de introducir sitios de restricción especifica que facilita la ligación de la secuencias de control con la región de codificación del polinucleótido que codifica un polipéptido.
Operablemente' enlazados: El término "operablemente enlazados" indica en este documento una configuración en la cual una secuencia de control se coloca en una posición apropiada relativa con la secuencia de codificación de la secuencia de polinucleótidos tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia de codificación en un polipéptido .
Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación pos-transcripcional , traducción, modificación pos- traduccional y secreción.
Vector de expresión: El término "vector de expresión" se define en este documento como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucloeótido que codifica un polipéptido de la presente invención y se enlaza operablemente a los nucleótidos adicionales que proporcionan su expresión.
Célula hospedera: El término "célula hospedera", como se utiliza en este documento, incluye cualquier tipo de célula que sea susceptible a transformación, transíección, traducción, y similar con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula precursora que no es idéntica a la célula precursora debido a las mutaciones que se llevan a cabo durante la replicación.
Propiedad mejorada: El término "propiedad mejorada" se define en este documento como una característica asociada con una variante que se mejora comparada con la variante de proteasa precursora. Estas propiedades mejoradas incluyen, pero no se limitan a, desempeño de lavado tal como desempeño de manchas, por ejemplo desempeño a manchas que contienen proteínas, remoción de manchas por ejemplo remoción de manchas de huevo, estabilidad por ejemplo, termoestabilidad, estabilidad de pH, o estabilidad en polvo, formulaciones detergentes liquidas o en gel o composiciones para lavaplatos, perfil de actividad dependiente de temperatura alterada, actividad de pH, especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química. En una modalidad, las propiedades mejoradas incluyen lavado mejorado o desempeño de lavaplatos por ejemplo remoción de manchas de suelos proteínicos, tal como manchas de huevo.
Desempeño de lavado: En el presente contexto el término "desempeño de lavado" se utiliza como una capacidad de una enzima para remover manchas proteínicas u orgánicas presentes en el objetivo que se limpia durante por ejemplo lavado o limpieza de superficies duras. La mejora en el desempeño de lavado se puede cuantificar al calcular el así llamado valor de intensidad (Int) definido en el Ejemplo 3, en este documento. También véase la prueba de desempeño de lavado en el Ejemplo 3 en este documento.
Desempeño mejorado de lavado: El término "desempeño mejorado de lavado" se define en este documento cómo una enzima variante que muestra una alteración del desempeño de lavado de una variante de proteasa relativo con el desempeño de lavado de la variante de proteasa precursora por ejemplo mediante remoción incrementada de manchas. El término "desempeño de lavado" incluye desempeño de lavado en ropa pero también por ejemplo en lavaplatos.
Limpieza de superficies duras: El término incluye "lavaplatos" y es la limpieza de objetos duros tales como objetos típicos para lavado de platos que incluye, pero no se limita a, platos, tazas, vasos, tazones y cubiertos tales como cucharas, cuchillos, tenedores, utensilios para servir, cerámicas, plásticos, metales, porcelana, vidrio y acrílicos.
Composición para lavaplatos: El término "composición para lavaplatos" se refiere a todas las formas de composiciones para limpiar superficies duras.
La presente invención no se restringe a ningún tipo particular de composición para lavaplatos o cualquier detergente particular.
Proteasas Las enzimas que escinden los enlaces de amida en los sustratos de proteína son clasificadas como proteasas, o péptidas (intercambiablemente) (véase alsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms . W.H. Freeman y Company, San Francisco, Capítulo 3) .
Numeración de las posiciones/residuos de aminoácidos .
Si nada más se menciona la numeración de aminoácidos utilizada en este documento corresponde a aquella de la secuencia BP ' subtilasa (BASBPN) . Para descripción adicional de la secuencia BPN' , véase SEQ ID NO : 2 o Siezen y colaboradores Protein Engng . 4 (1991)719-737.
Serina proteasas Una serina proteasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces de péptido, y en las cuales existe un residuo de serina esencial en el sitio activo (White, Handler y Smith, 1973 "Principios de Bioquímica", Quinta Edición, cGraw-Hill Book Company, NY, pp . 271-272) .
Las serina proteasas bacterianas tienen pesos moleculares en intervalo de 20,000 a 45,000 Dalton. Se inhiben por diisopropilfluorofosfato . Hidrolizan ásteres terminales simples y son similares en actividad a la quimotrips ina eucariótica, también una serina proteasa. Un término más especifico, proteasa alcalina, que cubre un subgrupo, refleja el pH alto óptimo de algunas de las serina proteasas, de pH 9.0 a 11.0 (para revisión, véase Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711 -753) .
Subtilasas Un subgrupo de la serina proteasas designadas tentativamente subtilasas se han propuesto por Siezen y colaboradores, Protein Engng. 4 (1991)719-737 y Siezen y colaboradores Protein Science 6 (1997)501-523. Se definen por el análisis de homología de más de 170 secuencias de aminoácidos de serina proteasas previamente referidas como proteasas similar a subtilisina. Una subtilisina se definió frecuentemente de manera previa como una serina proteasa producida por bacterias Grampositivas u hongos, y de acuerdo con Siezen y colaboradores ahora es un subgrupo de las subtilasas. Se ha identificado una amplia variedad de subtilasas, y se ha determinado la secuencia de aminoácidos de una variedad de subtilasas. Para una descripción más detallada de estas subtilasas y sus secuencias de aminoácidos se hacen referencia a Siezen y colaboradores (1997) .
Un subgrupo de las subtilasas, I-Sl o subtilisinas "verdaderas", comprende las subtilisinas "clásicas", tal como subtilisina 168 (BSS168), subtilisina BPN' , subtilisina Carlsberg (ALCALASEMR, NOVOZYMES A/S) , y subtilisina DY (BSSDY) .
Un subgrupo adicional de las subtilasas, I-S2 o subtilisinas alcalinas altas, es reconocido por Siezen y colaboradores (supra) . El subgrupo de proteasas I-S2 se describe como subtilisinas sumamente alcalinas y comprende enzimas tales como subtilisina PB92 (BAALKP) (MAXACALmr, Genencor International Inc.), subtilisina 309 (SAVINASEMR, NOVOZYMES A/S) , subtilisina 147 (BLS147) ( ESPERASEMR, NOVOZYMES A/S) , y elastasa alcalina YaB (BSEYAB) .
"SAVINASE"*" SAVINASEMR (es comercializada por NOVOZYMES A/S. Es la subtilisina 309 de B. Lentus y difiere de BAALKP solamente en una posición (N87S) . La SAVINASEMR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1.
Subtilasa precursora El término "subtilasa precursora" describe una subtilasa definida de acuerdo con Siezen y colaboradores (1991 y 1997) . Para detalles adicionales véase la descripción de "Subtilasas" en lo anterior. Una subtilasa precursora también puede ser una subtilasa aislada de una fuente natural, en donde se han hecho modificaciones subsecuentes mientras que retienen la característica de una subtilasa. Adicionalmente , una subtilasa precursora puede ser una subtilasa que se ha preparado por la técnica de entrelazado de ADN, tal como se describe por J.E. Ness y colaboradores, Nature Biotechnology, 17, 893-896 (1999) .
Alternativamente el término "subtilasa precursora" se puede denominar "subtilasa de tipo natural" .
Para referencia se proporciona una tabla de los acrónimos para varias subtilasas mencionadas en este documento, para acrónimos adicionales, véase Siezen y colaboradores, Protein Engng . 4(1991)719-737 y Siezen y colaboradores Protein Science 6(1997) 501-523 Tabla 3 Organismo enzima acronimo Bacteria: Grampositiva Bacillus subtilis 168 subtilisina 1168, apr BSS168 Bacillus subtilisina BPN' (NOVO) BASBPN amyloliquefaciens Bacillus subtilis DY subtilisina DY BSSDY Bacillus licheniformis subtilisina Carlsberg BLSCAR Bacillus lentus subtilisina 309 BLSAVI Bacillus lentus subtilisina 147 BLS147 Bacillus alcalophilus subtilisina PB92 BAPB92 PB92 Bacillus YaB elastasa alcalina YaB BYSYAB Bacillus sp. N S-21 subtilisina ALPI BSAPRQ Bacillus sp. G-825-6 subtilisina Sendai BSAPRS Thermoactinomyces termitasa TVTHER vulgaris Modificación (es) de una subtilasa El término "modificación (es) " utilizado en este documento se define para incluir modificación química de una subtilasa así como también manipulación genética del ADN que codifica una subtilasa. La modificación (es) puede ser el reemplazo (s) de la cadena(s) lateral de aminoácidos, sust i tuc ión ( es ) , supres ión ( es ) y/o inserc ión ( es ) en o en aminoác ido ( s ) de interés .
Variante de subtilasa El término "variante" y el término "variante de subtilasa" se define en lo anterior.
Secuencias de subtilasa homologas La homología entre dos secuencias de aminoácidos en este contexto se describe por el parámetro "identidad" para propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch como se describe en lo anterior. El resultado de la rutina es además de la alineación de aminoácidos el cálculo del "Porcentaje de Identidad" entre las dos secuencias.
Con base en esta descripción es de rutina para una persona experta en la técnica identificar subtilasas homologas adecuadas, que se pueden modificar de acuerdo con la invención.
En un aspecto, la proteasa precursora comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO:l de manera preferente de por lo menos 80%, de manera más preferente de por lo menos 81%, de manera más preferente de por lo menos 82%, de manera más preferente de por lo menos 83%, de manera más preferente de por lo menos 84%, de manera más preferente de por lo menos 85%, de manera más preferente de por lo menos 86%, de manera más preferente de por lo menos 87%, de manera más preferente de por lo menos 88%, de manera más preferente de por lo menos 89%, aún de manera más preferente de por lo menos 90%, de manera más preferente de por lo menos 91%, de manera más preferente de por lo menos 92%, de manera más preferente de por lo menos 93%, de manera más preferente de por lo menos 94%, de manera mucho más preferente de por lo menos 95%, y aún de manera mucho más preferente de por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% o aún 100% de identidad a SEQ ID NO 1.
Las variantes de proteasa precursoras sustancialmente homologas pueden tener una o más (varias) sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos, en el presente contexto el término "uno o más" se utiliza intercambiablemente con el término "varios" . Estos cambios son de manera preferente de una naturaleza menor, es decir sustituciones de aminoácidos conservadoras como se describe en lo anterior y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento tridimensional o actividad de la proteína o polipéptido; supresiones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino o carboxilo-terminal pequeñas, tal como un residuo de metionina amino-terminal , un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad) , tal como un tracto de poli-histidina, o proteína A (Nilsson y colaboradores, 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson y colaboradores, 1991, Methods Enzymol . 198: 3. Véase, también, en general, Ford y colaboradores, 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Aunque los cambios descritos en lo anterior son de manera preferente de una naturaleza menor, estos cambios también pueden ser de una naturaleza sustantiva tal como fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más ambos como extensiones amino o carboxilo terminal.
La proteasa precursora puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: l o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de proteasa. En un aspecto, la proteasa precursora comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Variantes de Subtilasa La presente invención se refiere a variantes de subtilasas novedosas que muestran alteraciones relativas con la subtilasa precursora en una o más propiedades incluyendo: desempeño de lavado, tal como capacidad mejorada de remoción de manchas, desempeño de lavado en lavado de superficies duras, tal como lavaplatos, estabilidad, por ejemplo estabilidad de almacenamiento térmica y actividad catalítica. En un aspecto de la invención las variantes tienen capacidades mejoradas de remoción de huevo tal como remoción mejorada de yema de huevo hervida de superficies duras.
El desempeño de lavado en las composiciones detergentes de las variantes de subtilasa de acuerdo con la invención se puede determinar en los experimentos de lavado. Las variantes de enzimas se pueden someter a prueba utilizando el ensayo de Tensión Mecánica Automática (AMSA) , como se describe con detalle en el Ejemplo 3.
La actividad catalítica de las variantes de la presente invención se puede determinar utilizando el ensayo "Sue AAPF-pNA Cinético" , como se describe con detalle en los Ej emplos .
En una modalidad la variante que se contempla por ser parte de la invención es tal variante donde, se compara con la subtilasa precursora, uno o más residuos de aminoácido se han sustituido, suprimido o insertado, la variante que comprende una variante de una subtilisina precursora que comprende las sustituciones 9{R,K,H}, 15{G, A, S, ?,?} , 68{G,A,S,T,M} , 218{D,S,G,V} y 245{R,K,H} en donde la variante comprenden además por lo menos una de las siguientes modificaciones: 6l{D,E}, 62{D,E}, 76{Ü,E}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120{V,Q,D}, 13l{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D, en donde las posiciones corresponden en las posiciones del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 [???'] .
En una modalidad de la invención la variante comprende además por lo menos una de las alteraciones G61E, A98S o S99G.
En una modalidad particular de la invención la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D y Q245R.
Se prefiere que la subtilasa precursora que pertenece a los subgrupos I-Sl o I-S2, especialmente al subgrupo I-S2, ambos para las enzimas de naturaleza o la creación artificial de diversidad, y para diseñar y producir variantes de una subtilasa precursora.
En relación con las variantes del subgrupo I-Sl, se prefiere seleccionar una subtilasa precursora del grupo que consiste de BSS168 (BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, B SAMP) , BASBPN, BSSDY, BLSCAR (BLKERA, BLSCA1 , BLSCA2 , BLSCA3 ) , BSSPRC (serina proteasa C) , y BSSPRD (serina proteasa D) , o variantes funcionales de las mismas que tienen retenida la característica del subgrupo I-Sl.
En relación con las variantes del subgrupo I-S2 se prefiere seleccionar una subtilasa precursora del grupo que consiste de BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM, BAH101) , BLSAVI (BSKSMK, BAALKP, BLSUBL) , BYSYAB, BAPB92 , TVTHER, y BSAPRS, o variantes funcionales de los mismos que tienen retenida la característica del subgrupo I-S2.
En particular, la subtilasa precursora es BLSAVI (SavinaseMR, NOVOZYMES A/S) , y una variante de subtilasa preferida de la invención es por consiguiente una variante de SavinaseMR (SEQ ID NO 1) .
Convenciones para la Designación de Variantes Para propósitos de la presente invención, la secuencia de aminoácidos de BPN' como se da a conocer en SEQ ID NO: 2 se utiliza para determinar el residuo de aminoácidos correspondiente en otra proteasa o variante de proteasa. La secuencia de aminoácidos de otra proteasa o variante de proteasa se alinea con la secuencia de aminoácidos de la proteasa dada a conocer de SEQ ID NO : 2 , y con base en la alineación se puede determinar el número de posición de aminoácidos que corresponde a cualquier residuo de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa dada a conocer en SEQ ID NO: 2.
Una alineación de secuencia de polipéptidos se puede hacer, por ejemplo, utilizando "ClustalW" (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J., 1994, CLUSTAL W: Mejorando la sensibilidad de la alineación de secuencia múltiple progresiva a través de la ponderación de secuencia, penalizaciones de espacio de posiciones especificas y selección de matriz de peso, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680) . Una alineación de secuencias de ADN se puede hacer utilizando la alineación de polipéptido como una plantilla, reemplazando los aminoácidos con el codón correspondiente de la secuencia de ADN.
Los algoritmos de comparación de secuencia en pares en uso común son adecuados para detectar similitudes entre las secuencias de polipéptidos que no han divergido más allá del punto de aproximadamente 20-30% de identidad de secuencia (Doolittle, 1992, Protein Sci. 1: 191-200; Brenner y colaboradores, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95, 6073-6078) . Sin embargo, los polipéptidos verdaderamente homólogos con el mismo plegamiento y función biológica similar han divergido frecuentemente al punto donde la comparación basada en secuencia tradicional no logra detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J". Mol. Biol . 295: 613-615). Se puede lograr una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencia utilizando los programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para buscar las bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda de base de datos iterativo y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul y colaboradores, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Aún se puede lograr una mayor sensibilidad si la familia o súper familia para el polipéptido de interés tiene uno o más (varios) representantes en las bases de datos de la estructura de la proteína. Los programas tal como GenTHREADER (Jones 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan la información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructural, y potenciales de solvatación) como entrada a una red neural que predice el plegamiento estructural para una secuencia de consulta. De manera similar, el método de Gough y colaboradores, 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, se puede utilizar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de súper familia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones pueden a su vez ser utilizados para generar modelos de homología para el polipéptido de interés, y tales modelos se pueden evaluar para precisión utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para ese propósito.
Para las proteínas de estructura conocida, son disponibles varias herramientas y recursos para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo las súper familias SCOP de proteínas se han alineado estructuralmente , y esas alineaciones son accesibles y se pueden descargar. Se pueden alinear dos o más estructuras de proteínas utilizando una variedad de algoritmos tal como la matriz de alineación de distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33:88-96) o extensión de combinación (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747), y se pueden utilizar adicionalmente implementaciones de estos algoritmos para consultar las bases de datos de estructura con estructura de interés a fin de descubrir homólogos estructurales posibles (por ejemplo Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567). Estas alineaciones estructurales se pueden utilizar para predecir los residuos de aminoácido estructural y funcionalmente correspondientes en proteínas dentro de la misma súper familia estructural.
Esta información, junto con la información derivada de la modelación de homología y las búsquedas de perfil, se pueden utilizar para predecir qué residuos mutan cuando se mueven las mutaciones de interés de una proteína a un homólogo cercano o remoto.
Al describir las diversas variantes de proteasa de la presente invención, la nomenclatura descrita a continuación se adapta para facilidad de referencia. En todos los casos, se emplea la abreviación de aminoácidos de una sola letra o tres letras IUPAC aceptada.
Al describir las diversas variantes de enzima de subtilasa producidas o contempladas de acuerdo con la invención, se han adaptado las siguientes nomenclaturas y convenciones para facilidad de referencia: Una estructura de referencia primero se define al alinear la enzima aislada o precursora con la SEQ ID NO 2 se subtilisina BPN' (BASBPN) como se describe en lo anterior.
Variantes de Proteasa Precursora Sustituciones Para una sustitución de aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina con alanina en la posición 226 se designa como "Thr226Ala" o "T226A" . Se pueden separar múltiples mutaciones mediante marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg + Ser411Phe" o "G205R + S411F", que representan mutaciones en las posiciones 205 y 411 que sustituyen glicina (G) con arginina (R) , y serina (S) con fenilalanina (F) , respectivamente. Se pueden separar múltiples mutaciones alternativamente por un espacio por ejemplo G205R S411F, o se pueden separa por una coma (,) por ejemplo G205R, S411F.
Supresiones Para una supresión de aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición*. Por consiguiente, la supresión de glicina en la posición 195 se designa como "Glyl95*" o "G195*" . Múltiples supresiones se pueden separar como se describe en lo anterior para sustituciones por ejemplo por una coma (,) "Glyl95*, Ser411*" o "G195*, S411*" .
Inserciones Para una inserción de aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido recientemente insertado. Por consiguiente la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se designa "Glyl95GlyLys" o "G195GK" o "*195aK". Se designan múltiples inserciones de aminoácidos [Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido recientemente insertado #1, aminoácido recientemente insertado #2; etcétera]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 se indica como "Glyl95GlylysAla" o "G195GKA" .
En tales casos, el residuo (s) de aminoácidos insertado se enumera por la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido que precede el residuo (s) de aminoácido insertado.
En el ejemplo anterior, las secuencias serían de esta manera: La variante de proteasa precursora se puede obtener de cualquier fuente adecuada, tal como, una fuente microbiana, tal como un hongo, por ejemplo, hongo filamentoso o una levadura, o una secuencia artificial preparada de información de secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos conocida .
Estas cepas son fácilmente accesibles al público en las recolecciones de cultivos, tal como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, por sus siglas en inglés) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y Zelikulturen GmbH (DSM) y Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) .
En un aspecto de la presente invención, la subtilisina precursora es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad a SEQ ID NO: 1.
En un aspecto de la presente invención, la proteasa precursora comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO: 1 de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente de por lo menos 81%, de manera más preferente de por lo menos 82%, de manera más preferente de por lo menos 83%, de manera más preferente de por lo menos 84%, de manera más preferente de por lo menos 85%, de manera más preferente de por lo menos 86%, de manera más preferente de por lo menos 87%, de manera más preferente de por lo menos 88%, de manera más preferente de por lo menos 89%, de manéra más preferente de por lo menos 90%, de manera más preferente de por lo menos 91%, de manera más preferente de por lo menos 92%, de manera más preferente de por lo menos 93%, de manera más preferente de por lo menos 94%, de manera mucho más preferente por lo menos 95%, y aún de manera mucho más preferente por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% o aún 100% de identidad de SEQ ID NO 1.
En otro aspecto, la proteasa precursora comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO: 1 de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente de por lo menos 81%, de manera más preferente de por lo menos 82%, de manera más preferente de por lo menos 83%, de manera más preferente de por lo menos 84%, de manera más preferente de por lo menos 85%, de manera más preferente de por lo menos 86%, de manera más preferente de por lo menos 87%, de manera más preferente de por lo menos 88%, de manera más preferente de por lo menos 89%, de manera más preferente de por lo menos 90%, de manera más preferente de por lo menos 91%, de manera más preferente de por lo menos 92%, de manera más preferente de por lo menos 93%, de manera más preferente de por lo menos 94%, de manera mucho más preferente de por lo menos 95%, y aún de manera mucho más preferente de por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% o aún 100% de identidad de SEQ ID NO 1, y que tiene actividad de proteasa .
En un aspecto de la presente invención, las variantes tienen unas secuencias de aminoácidos que difiere de SEQ ID NO : 1 por treinta aminoácidos, veintinueve aminoácidos, veintiocho aminoácidos, veintisiete aminoácidos, veintiséis aminoácidos, veinticinco aminoácidos, veinticuatro aminoácidos, veintitrés aminoácidos, veintidós aminoácidos, veintiún aminoácidos, veinte aminoácidos, diecinueve aminoácidos, dieciocho aminoácidos, diecisiete aminoácidos, dieciséis aminoácidos, quince aminoácidos, catorce aminoácidos, trece aminoácidos, doce aminoácidos, once aminoácidos, diez aminoácidos, nueve aminoácidos, ocho aminoácidos, siete aminoácidos, seis aminoácidos, cinco aminoácidos, cuatro aminoácidos, tres aminoácidos, dos aminoácidos, o un aminoácido.
En un aspecto particular de la invención, las variantes de acuerdo con la invención tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de SEQ ID NO: 1 por doce aminoácidos, de manera más preferente de once aminoácidos, de manera más preferente por diez aminoácidos, aún de manera más preferente por nueve aminoácidos y aún de manera mucho más preferente por ocho aminoácidos.
En un aspecto, el número de alteraciones de aminoácidos en las variantes de la presente invención comprende o consiste de, como es comparado con el precursor (por ejemplo, una variante de proteasa precursora que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N0:1), 20 alteraciones, 19 alteraciones, 18 alteraciones, 17 alteraciones, 16 alteraciones, 15 alteraciones, 14 alteraciones, 13 alteraciones, 12 alteraciones, 11 alteraciones, 10 alteraciones, 9 alteraciones, 8 alteraciones, 7 alteraciones, 6 alteraciones, 5 alteraciones, 4 alteraciones, mucho más preferiblemente con 3 alteraciones, aún más preferiblemente con 2 alteraciones, y mucho más preferiblemente con 1 alteración. En otro aspecto, el número de alteraciones de aminoácidos en las variantes de la presente invención consiste preferiblemente de 20 alteraciones, 19 alteraciones, 18 alteraciones, 17 alteraciones, 16 alteraciones, 15 alteraciones, 14 alteraciones, 13 alteraciones, 12 alteraciones, 11 alteraciones, 10 alteraciones, 9 alteraciones, 8 alteraciones, 7 alteraciones, 6 alteraciones, 5 alteraciones, 4 alteraciones, 3 alteraciones, 2 alteraciones, o 1 alteración.
En un aspecto, el número de alteraciones de aminoácidos en las variantes de la presente invención comprenden o consisten de, como es comparado con el precursor (por ejemplo, una variante de proteasa precursora que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1) , 20 sustituciones , 19 sustituciones , 18 sustituciones , 17 sustituciones , 16 sustituciones , 15 sustituciones , 14 sustituciones , 13 sustituciones , 12 sustituciones , 11 sustituciones , 10 sustituciones , 9 sustituciones , 8 sustituciones , 7 sustituciones , 6 sustituciones , 5 sustituciones , 4 sustituciones , más preferiblemente 3 sustituciones, aún mucho más preferiblemente 2 sustituciones, Y mucho más ;preferiblemente 1 sustitución . En otro aspecto, el número de sustituciones de aminoácidos en las variantes de la presente invención consiste de 20 sustituciones , 19 sustituciones 18 sustituciones , 17 sustituciones , 16 sustituciones 15 sustituciones , 14 sustituciones , 13 sustituciones 12 sustituciones , 11 sustituciones , 10 sustituciones 9 sustituciones , 8 sustituciones , 7 sustituciones, 6 sustituciones, 5 sustituciones, 4 sustituciones, 3 sustituciones, 2 sustituciones, o 1 sustitución .
En un aspecto, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO: 1 de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente por lo menos 81%, de manera más preferente por lo menos 82%, de manera más preferente por lo menos 83%, de manera más preferente por lo menos 84%, de manera más preferente por lo menos 85%, de manera más preferente por lo menos 86%, de manera más preferente por lo menos 87%, de manera más preferente por lo menos 88%, de manera más preferente por lo menos 89%, de manera más preferente por lo menos 90%, de manera más preferente por lo menos 91 %, de manera más preferente por lo menos 92%, de manera más preferente por lo menos 93%, de manera más preferente por lo menos 94%, de manera mucho más preferente por lo menos 95%, y aún de manera mucho más preferente por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% o aún 100% de identidad a SEQ ID NO 1.
En un aspecto, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO: 1 de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente por lo menos 81%, de manera más preferente por lo menos 82%, de manera más preferente por lo menos 83%, de manera más preferente por lo menos 84%, de manera más preferente por lo menos 85%, de manera más preferente por lo menos 86%, de manera más preferente por lo menos 87%, de manera más preferente por lo menos 88%, de manera más preferente por lo menos 89%, de manera más preferente por lo menos 90%, de manera más preferente por lo menos 91%, de manera más preferente por lo menos 92%, de manera más preferente por lo menos 93%, de manera más preferente por lo menos 94%, de manera mucho más preferente por lo menos 95%, y aún de manera mucho más preferente por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% o aún 100% de identidad a SEQ ID NO 1 y que tiene actividad de proteasa.
En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de una variante que puede comprender o consistir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad variante de proteasa. En un aspecto, la variante comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una variante que puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una variante alélica de la misma en la limpieza de superficies duras. Adicionalmente, la presente invención también se refiere a un método para remover manchas proteínicas, especialmente manchas de huevo hervido de superficies duras o de ropa, el método comprende poner en contacto la superficie dura que contiene mancha de huevo o textiles de ropa que contienen manchas de huevo con una composición de limpieza o detergente, de manera preferente una composición de textiles de ropa o lavaplatos, que comprende una variante de subtilisina que puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una variante alélica. En un aspecto, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO: 3 de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente por lo menos 81%, de manera más preferente por lo menos 82%, de manera más preferente por lo menos 83%, de manera más preferente por lo menos 84%, de manera más preferente por lo menos 85%, de manera más preferente por lo menos 86%, de manera más preferente por lo menos 87%, de manera más preferente por lo menos 88%, de manera más preferente por lo menos 89%, de manera más preferente por lo menos 90%, de manera más preferente por lo menos 91%, de manera más preferente por lo menos 92%, de manera más preferente por lo menos 93%, de manera más preferente por lo menos 94%, de manera mucho más preferente por lo menos 95%, y aún de manera mucho más preferente por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% o aún 100% de identidad a SEQ ID NO 3.
En un aspecto, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO: 3 de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente por lo menos 81%, de manera más preferente por lo menos 82%, de manera más preferente por lo menos 83%, de manera más preferente por lo menos 84%, de manera más preferente por lo menos 85%, de manera más preferente por lo menos 86%, de manera más preferente por lo menos 87%, de manera más preferente por lo menos 88%, de manera más preferente por lo menos 89%, de manera más preferente por lo menos 90%, de manera más preferente por lo menos 91 %, de manera más preferente por lo menos 92%, de manera más preferente por lo menos 93%, de manera más preferente por lo menos 94%, de manera mucho más preferente por lo menos 95%, y aún de manera mucho más preferente por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% o aún 100% de identidad a SEQ ID NO 3 y que tiene actividad de proteasa.
En un aspecto, las variantes tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de SEQ ID NO: 3 por treinta aminoácidos, veintinueve aminoácidos, veintiocho aminoácidos, veintisiete aminoácidos, veintiséis aminoácidos, veinticinco aminoácidos, veinticuatro aminoácidos, veintitrés aminoácidos, veintidós aminoácidos, veintiún aminoácidos, veinte aminoácidos, diecinueve aminoácidos, dieciocho aminoácidos, diecisiete aminoácidos, dieciséis aminoácidos, quince aminoácidos, catorce aminoácidos, trece aminoácidos, doce aminoácidos, once aminoácidos, diez aminoácidos, nueve aminoácidos, ocho aminoácidos, siete aminoácidos, seis aminoácidos, cinco aminoácidos, cuatro aminoácidos, tres aminoácidos, dos aminoácidos, o un aminoácido.
En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de una variante que puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad variante de proteasa. En un aspecto, la variante comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una variante que puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una variante alélica de la misma en la limpieza de superficies duras. Adicionalmente , la presente invención también se refiere a un método para remover manchas proteínicas, especialmente manchas de huevo hervidas de superficies duras o de textiles de ropa, el método comprende poner en contacto la superficie dura que contiene mancha de huevo o los textiles de ropa que contienen mancha de huevo con una composición de limpieza o detergente, de manera preferente una composición de ropa o lavaplatos, que comprende una variante de subtilisina que puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una variante alélica.
En un aspecto, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO : 4 de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente por lo menos 81%, de manera más preferente por lo menos 82%, de manera más preferente por lo menos 83%, de manera más preferente por lo menos 84%, de manera más preferente por lo menos 85%, de manera más preferente por lo menos 86%, de manera más preferente por lo menos 87%, de manera más preferente por lo menos 88%, de manera más preferente por lo menos 89%, de manera más preferente por lo menos 90%, de manera más preferente por lo menos 91%, de manera más preferente por lo menos 92%, de manera más preferente por lo menos 93%, de manera más preferente por lo menos 94%, de manera mucho más preferente por lo menos 95%, y aún de manera mucho más preferente por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% o aún 100% de identidad a SEQ ID NO 4.
En un aspecto, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO: 4 de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente por lo menos 81%, de manera más preferente por lo menos 82%, de manera más preferente por lo menos 83%, de manera más preferente por lo menos 84%, de manera más preferente por lo menos 85%, de manera más preferente por lo menos 86%, de manera más preferente por lo menos 87%, de manera más preferente por lo menos 88%, de manera más preferente por lo menos 89%, de manera más preferente por lo menos 90%, de manera más preferente por lo menos 91%, de manera más preferente por lo menos 92%, de manera más preferente por lo menos 93%, de manera más preferente por lo menos 94%, de manera mucho más preferente por lo menos 95%, y aún de manera mucho más preferente por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% o aún 100% de identidad a SEQ ID NO 4 y que tiene actividad de proteasa.
En un aspecto, las variantes tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de SEQ ID NO : 4 por treinta aminoácidos, veintinueve aminoácidos, veintiocho aminoácidos, veintisiete aminoácidos, veintiséis aminoácidos, veinticinco aminoácidos, veinticuatro aminoácidos, veintitrés aminoácidos, veintidós aminoácidos, veintiún aminoácidos, veinte aminoácidos, diecinueve aminoácidos, dieciocho aminoácidos, diecisiete aminoácidos, dieciséis aminoácidos, quince aminoácidos, catorce aminoácidos, trece aminoácidos, doce aminoácidos, once aminoácidos, diez aminoácidos, nueve aminoácidos, ocho aminoácidos, siete aminoácidos, seis aminoácidos, cinco aminoácidos, cuatro aminoácidos, tres aminoácidos, dos aminoácidos, o un aminoácido.
Las variantes sustancialmente homologas pueden tener una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos. Estos cambios son de manera preferente de una naturaleza menor, que es conservadora de sustituciones de aminoácidos como se describe en lo anterior y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento tridimensional o actividad de la proteína o polipéptido; supresiones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino o carboxilo terminales pequeñas tal como un residuo de metionina amino-terminal , un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad) , tal como un tracto de poli -histidina , o proteína A (Nilsson y colaboradores, 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson y colaboradores, 1991, Methods Enzymol . 198: 3. Véase, también, en general, Ford y colaboradores, 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Aunque los cambios descritos en lo anterior son de manera preferente de una naturaleza menor, estos, cambios también pueden ser de una naturaleza sustantiva tal como fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más, ambos como extensiones amino- o carboxilo- terminales .
Preparación de las Variantes Las variantes de las variantes de proteasa precursoras se pueden preparar de acuerdo con cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio, construcción génica sintética, construcción génica semi-sintética, mutagénesis aleatoria, entrelazado, etcétera.
La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica en la cual se crean una o varias mutaciones en un sitio definido en una molécula de polinucleótido que codifica la variante de proteasa precursora. La técnica se puede realizar in vitro o in vivo.
La construcción génica sintética implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido designada para codificar una molécula de polipéptido de interés. La síntesis génica se puede realizar utilizando una variedad de técnicas, tal como la tecnología basada en microchip multiplex descrita por Tian, y colaboradores, (Tian, y colaboradores, Nature 432:1050-1054) y tecnologías similares en donde los oligonucleótidos se sintetizan y se ensamblan en chips microfluídicos fotoprogramables .
La mutagénesis dirigida al sitio se puede lograr in vitro por PCR que implica el uso de cebadores de oligonucleótido que contienen la mutación deseada. La mutagénesis dirigida al sitio también se puede realizar in vitro por mutagénesis de cásete que implica la escisión por una enzima de restricción por un sitio en el plásmido que comprende un polinucleótido que codifica la variante de proteasa precursora y la ligación subsecuente de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Usualmente la enzima de restricción que se digiere en el plásmido y el oligonucleótido es el mismo, permitiendo extremos pegajosos del plásmido y se inserta para ligarse entre sí. Véase, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 76: 4949-4955; ' y Barton y colaboradores, 1990, Nucleic Acids Research 18: 7349-4966.
La mutagénesis dirigida al sitio se puede lograr in vivo mediante métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. 2004/0171 154; Storici y colaboradores, 2001, Nature Biotechnology 19: 773-776; Kren y colaboradores, 1998, iVat. Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet . Newslett. 43: 15-16.
Cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio se puede utilizar en la presente invención. Existen muchos kits comerciales disponibles que se pueden utilizar para preparar variantes de una variante de proteasa precursora .
Sustituciones, supresiones, y/o inserciones de aminoácidos individuales o múltiples se pueden hacer y someter a prueba utilizando métodos conocidos de mutagénesis , de combinación y/o entrelazado, seguido por un procedimiento de clasificación relevante, tales como aquellos dados a conocer por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen PCR propensa a errores, expresión en fago (por ejemplo, Lowman y colaboradores, 1991, Biochem. 30:10832-10837; Patente de E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire y colaboradores, 1986, Gene 46: 145; Ner y colaboradores, 1988, ADN 7 : 127) .
Los métodos de mutagénesis/entrelazado se pueden combinar con métodos de clasificación automatizada, de alto rendimiento para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados , clonados expresados por las células hospederas. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospederas y secuenciar rápidamente utilizando métodos estándares en la técnica. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés.
La construcción génica semi-sintética se logra al combinar aspectos de la construcción génica sintética, y/o mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria, y/o entrelazado. La construcción semi-sintética es tipificada por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótido que se sintetizan, en combinación con técnicas de PCR. Las regiones definidas de genes se pueden desintetizar de esta manera de nuevo, mientras que las otras regiones se pueden amplificar utilizando cebadores mutagénicos específicos de sitio, mientras que todavía otras regiones se pueden someter a amplificación por PCR propensa a errores o PCR no propensa a errores. Luego se puede entrelazar los fragmentos de polinucleótido.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir una variante para introducir en la subtilisina precursora las siguientes sustituciones: i. sustitución en la posición 9 con {R,K,H}; ii. sustitución en la posición 15 con {G, A, S, T, M} ; iii. sustitución en la posición 68 con {G,A,S,T,M}; iv. sustitución en la posición 245 con {R,K,H}, y v. sustitución en la posición 218 con {D, S, G O V} y una o más de las siguientes modificaciones: sustitución en la posición 61 con {D,E}, sustitución en la posición 62 con {D,E}, sustitución en la posición 76 con {D,E}, inserción de G en la posición 97, sustitución en la posición 98 con {G,S}, sustitución en la posición 99 con G, sustitución en la posición 101 con G, sustitución en la posición 120 con {V, Q, D}, sustitución en la posición 131 con {T,S}, sustitución en la posición 137 con H, sustitución en la posición 194 con P, sustitución en la posición 228 con V, sustitución en la posición 230 con V, sustituir en las posiciones 261 con D, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 [BPN' ] .
En un aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68, 218 y 245. En otro aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, el método comprende sustituir R, T, A, D y R en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto el método comprende las sustituciones de S9R, A15T, V68A, N218D y Q245R en el polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68, 120, 218 y 245. En otro aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, el método comprende sustituir R, T, A, V, D y R en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68, 120, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto el método comprende las sustituciones de S9R, A15T, V68A, H120V, N218D y Q245R en el polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68, 120, 218 y 245. En otro aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68, 120, 218 y 245 con Q, R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, el método comprende sustituir R, T, A, Q, D y R en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68, 120, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto el método comprende las sustituciones de S9R, A15T, V68A, H120Q, N218D y Q245R en el polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68, 76, 218 y 245. En otro aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68, 76, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I , V, E o D. En otro aspecto, el método comprende sustituir R, T, A, D, D y R en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68, 76, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto el método comprende las sustituciones de S9R, A15T, V68A, N76D, N218D y Q245R en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.
En un aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 61, 68, 218 y 245. En otro aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 61 68, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I , V, E O D. En Otro aspecto, el método comprende sustituir R, T, E, A, D y R en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 61, 68, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto el método comprende las sustituciones de S9R, A15T, G61E, V68A, N218D y Q245R en el polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 61, 68, 98 218 y 245. En otro aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 61 68, 98, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, el método comprende sustituir R, T, E, A, S, D y R en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 61, 68, 98, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto el método comprende las sustituciones de S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, N218D y Q245R en el polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 61, 68, 98 99, 218 y 245. En otro aspecto, el método comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 61 68, 98, 99, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, el método comprende sustituir R, T, E, A, S, G, D y R en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 61, 68, 98, 99, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto el método comprende las sustituciones de S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D y Q245R en el polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
Un aspecto particular se refiere a un método, en donde las siguientes sustituciones se introducen en la subtilisina precursora: i. sustitución S en la posición 9 con R; ii. sustitución A en la posición 15 con T; iii. sustitución V en la posición 68 con A; iv. sustitución Q en la posición 245 con R v. sustitución N en la posición 218 con D, S, G o V y una o más de las siguientes modificaciones: sustitución de G en la posición 61 con E, sustitución de N en la posición 62 con D, sustitución de N en la posición 76 con D, inserción de G in position 97, sustitución de A en la posición 98 con S, sustitución de S en la posición 99 con G, sustitución de S en la posición 101 con G, sustitución de H en la posición 120 con D, V, o Q, sustitución de P en la posición 131 con T, sustitución de Q en la posición 137 con H, sustitución de A en la posición 194 con P, sustitución de A en la posición 228 con V, sustitución de A en la posición 230 con V, sustitución de N en las posiciones 261 con D.
Variantes En un aspecto la presente invención se refiere a una variante de una subtilisina precursora que comprende las sustituciones 9{R,K,H}, 15 {G, A, S, T, M} , 68 {G, A, S , T , M} , 218 {D,S,G,V} y 245{R,K,H} en donde la variante comprende además por lo menos una de las siguientes modificaciones: 6l{D,E}, 62{D,E}( 76{D,E}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120{V,Q,D}, 131{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 [BP ' ] .
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9 con R, K o H. En otro aspecto, la variante comprende R como una sustitución en una posición que corresponde la posición 9. En otro aspecto la variante comprende la sustitución S9R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 15. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 15 con G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende T como una sustitución en una posición que corresponde la posición 15. En otro aspecto la variante comprende la sustitución A15T del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 61. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 61 con E o D. En otro aspecto, la variante comprende E como una sustitución en una posición que corresponde la posición 61. En otro aspecto la variante comprende la sustitución G61E del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 62. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 62 con E o D. En otro aspecto, la variante comprende D como una sustitución en una posición que corresponde la posición 62. En otro aspecto la variante comprende la sustitución N62D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 68. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 68 con G,A,S,T o M. En otro aspecto, la variante comprende una como una sustitución en una posición que corresponde la posición 68. En otro aspecto la variante comprende la sustitución V68A del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 76. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 76 con E o D. En otro aspecto, la variante comprende D como una sustitución en una posición que corresponde la posición 76. En otro aspecto la variante comprende la sustitución N76D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una inserción en una posición que corresponde la posición 97. En otro aspecto, la variante comprende una inserción en una posición que corresponde a 97 de G. En otro aspecto la variante comprende la inserción *97aG del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 98. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 98 con G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende S como una sustitución en una posición que corresponde la posición 98. En otro aspecto la variante comprende la sustitución A98S del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 99. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 99 con G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 99 con G. En otro aspecto la variante comprende la sustitución S99G del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 101. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 101 con G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 101 con G. En otro aspecto la variante comprende la sustitución S101G del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 120. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 120 con Q, V, N, E o D. En otro aspecto, la variante comprende D como una sustitución en una posición que corresponde la posición 120. En otro aspecto la variante comprende la sustitución H120D del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 120. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 120 con Q, V, N, E o D. En otro aspecto, la variante comprende N como una sustitución en una posición que corresponde la posición 120. En otro aspecto la variante comprende la sustitución H120N del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 120. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 120 con Q, V, N, E o D. En otro aspecto, la variante comprende V como una sustitución en una posición que corresponde la posición 120. En otro aspecto la variante comprende la sustitución H120V del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 120. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 120 con Q, V, N, E o D. En otro aspecto, la variante comprende Q como una sustitución en una posición que corresponde la posición 120. En otro aspecto la variante comprende la sustitución H120Q del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 131. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 131 con T o S. En otro aspecto, la variante comprende S como una sustitución en una posición que corresponde la posición 131. En otro aspecto la variante comprende la sustitución P131S del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 137.
En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 137 con R, K o H. En otro aspecto, la variante comprende H como una sustitución en una posición que corresponde la posición 137. En otro aspecto la variante comprende la sustitución Q137H del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 194. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 194 con P. En otro aspecto la variante comprende la sustitución A194P del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 218. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 218 con E, D, L, I, V, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende V como una sustitución en una posición que corresponde la posición 218. En otro aspecto la variante comprende la sustitución N218D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 228. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 228 con L, I o V. En otro aspecto, la variante comprende V como una sustitución en una posición que corresponde la posición 228. En otro aspecto la variante comprende la sustitución A228V del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 230. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 230 con L, I o V. En otro aspecto, la variante comprende V como una sustitución en una posición que corresponde la posición 230. En otro aspecto la variante comprende la sustitución A230V del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 245 con R, K o H. En otro aspecto, la variante comprende R como una sustitución en una posición que corresponde la posición 245. En otro aspecto la variante comprende la sustitución Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 261. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 261 con E o D. En otro aspecto, la variante comprende D como una sustitución en una posición que corresponde la posición 261. En otro aspecto la variante comprende la sustitución N261D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9 y 15. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9 y 15 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R y T como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9 y 15 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R y A15T del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9 y 68. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9 y 68 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R y A como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9 y 68 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R y V68A del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9 y 218. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9 y 218 con R, K, H, E, D, L, I, V, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9 y 218 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R y N218D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9 y 245 con R, K o H. En otro aspecto, la variante comprende R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 15 y 68. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 15 y 68 con G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende T y A como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 15 y 68 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones A15T y V68A del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 15 y 218. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 15 y 218 con E, D, L, I, V, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende T y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 15 y 218 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones A15T y N218D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 15 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 15 y 245 con G, A, S, T, R, K o H. En otro aspecto, la variante comprende T y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 15 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones A15T y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 68 y 218. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 68 y 218 con E, D, L, I, V, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende una y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 68 y 218 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones V68A y N218D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 68 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 68 y 245 con G, A, S, T, R, K o H. En otro aspecto, la variante comprende una A y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 68 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones V68A y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 218 y 245 con E, D, R, K, H. En otro aspecto, la variante comprende D y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 61. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 61 con R, K, H, G, A, S, T, M, D o E. En otro aspecto, la variante comprende R, T y E como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 61 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y G61E del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 62. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 62 con R, K, H, G, A, S, T, M, D o E. En otro aspecto, la variante comprende R, T y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 62 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y N62D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 68. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 68 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y A como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 68 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, V68A del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 76. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 76 con R, K, H, G, A, S, T, M, D o E. En otro aspecto, la variante comprende R, T y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 76 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y N76D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una modificación en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 97. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9 y 15 con R, K, H, G, A, S, T o M, y una inserción en una posición que corresponde a 97. En otro aspecto, la variante comprende R y T como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9 y 15 respectivamente y una inserción en la posición 97 con G. En otro aspecto la variante comprende las modificaciones S9R, A15T y *97aG del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 98. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 98 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y S como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 98 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y A98S del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 99. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 99 con R, K, H, G, A, S, T o . En otro aspecto, la variante comprende R, T y G como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 99 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y S99G del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 120. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 120 con R, K, H, G, A, S, T, N, Q, V, D, E o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 120 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y H120D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 120. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 120 con R, K, H, G, A, S, T, N, Q, V, D, E o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 120 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y H120N del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 120. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 120 con R, K, H, G, A, S, T, N, Q, V, D, E o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 120 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y H120Q del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 120. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 120 con R, K, H, G, A, S, T, N, Q, V, D, E o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 120 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y H120V del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 131. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 131 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y {S, T} como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 131 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y P131 {s, T} del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 137. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 137 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y H como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 137 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y Q137H del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 194. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 194 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y P como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 194 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y A194P del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 218. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 218 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende R, T y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 218 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, N218D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 228. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 228 con R, K, H, G, A, S, T, L, I, V o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y V como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 228 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y A228V del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 230. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 230 con R, K, H, G, A, S, T, L, I, V o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y V como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 230 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y A230V del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 245 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15 y 261. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15 y 261 con R, K, H, G, A, S, T, D, E o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15 y 261 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T y N261D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 15, 68 y 218. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 15, 68 y 218 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende T, A y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 15, 68 y 218 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones A15T, V68A y N218D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 15, 68 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 15, 68 y 245 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende T, A y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 15, 68 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones A15T, V68A y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 68, 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 68, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende una, D y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 68, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones V68A, N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68 y 218. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68 y 218 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende R, T, A y D como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68 y 218 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, V68A y N218D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68 y 245 con R, K, H, G, A, S, T o M. En otro aspecto, la variante comprende R, T, A y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, V68A y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 15, 68, 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 15, 68, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende T, A, D y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 15, 68, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones A15T, V68A, N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68, 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende R, T, A, Dy R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, V68A, N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO . 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68, 120, 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68, 120, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, Q, E o D. En otro aspecto, la variante comprende R, T, A, Q, D y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, V68A, H120Q, N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68, 120, 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68, 120, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, Q, E o D. En otro aspecto, la variante comprende R, T, A, V, D y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, V68A, H120V, N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 68, 76, 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 68, 76, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende R, T, A, D, D y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 68, 76, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, V68A, H76D, N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 61, 68, 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 61 68, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende R, T, E, A, D y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 61, 68, 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, G61E, V68A, N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 61, 68, 98 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 61, 68, 98, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende R, T, E, A, S, D y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 61, 68, 98 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En un aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde la posición 9, 15, 61, 68, 98, 99, 218 y 245. En otro aspecto, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a 9, 15, 61, 68, 98, 99, 218 y 245 con R, K, H, G, A, S, T, M, L, I, V, E o D. En otro aspecto, la variante comprende R, T, E, A, S, G, D y R como una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 15, 61, 68, 98, 99 218 y 245 respectivamente. En otro aspecto la variante comprende las sustituciones S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D y Q245R del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 1.
En modalidades adicionales una variante de subtilasa descrita en este documento se puede combinar ventajosamente con una o más modificación (es) en cualquiera de las posiciones: 27, 36, 56, 87, 95, 96, 100, 102, 103, 104, 123, 159, 167, 170, 206, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y 274.
Específicamente, las siguientes modificaciones BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK, y BAALKP son consideradas apropiadas para combinación: K27R, *36D, S56P, S87N, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, S106A, N123S, G159D, Y167A, R170S, R170L, N204D, V205I, Q206E, L217D, M222S, M222A, T224S, A232V, K235L, Q236H, N248D, N252K y T274A.
Adicionalmente las variantes que comprenden cualquiera de las modificaciones S101 G+V104N, S87N+S101 G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104 I , S99D+S101 R+S103A+V104I+G160S, S3T+V4I+S99D+S101 R+S103A+V104I+G160S+V199M+V205I+L217D, S3T+V4I+S99 D+S101R+S 103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217D, S3T+V4I+S99D+S101 R+S103A+V104I+G160S+V205I o N76D+V104A, u otra combinaciones de las modificaciones K27R, *36D, S56P, S87N, G97N, S99SE , S101G, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, S106A, N123S, G159D, Y167A, R170S, R170L, N204D, V205I, Q206E, L217D, M222S, M222A, T224S, A232V, K235L, Q236H, N248D, N252K y T274A en combinación con cualquiera o más de la modificación (es) mencionadas en lo anterior muestran propiedades mejoradas.
En un cierto aspecto, la variante comprende una modificación en una posición que corresponde a una de más de las posiciones 6l{E,D}, 62{D,E}, VeÍD^}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120{N,V,Q,D} , 13l{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 26ID del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 3.
En un cierto aspecto, la variante comprende una modificación en una posición que corresponde a una de más de las posiciones 61{E,D}, 62{D,E}, 76{D,E}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120{N,V,Q,D} , 13l{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D del polipéptido maduro de SEQ ID NO. 4.
Por otra parte, las variantes de subtilasa del aspecto (s) principal de la invención se combinan de manera preferente con una o más modificación (es) en cualquiera de las posiciones 61, 62, 76, 97, 98, 99, 101, 120, 131, 137, 194, 228, 230 y 261, de manera preferente como las modificaciones 6l{D,E}, 62{D,E}, 76{D,E}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120 {V, Q, N, D} , 13l{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D. Aún de manera más preferente como, 61 E, 62D, 76D, *97aG, 98S, 99G, 101G, 120D, 131T, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D. Cualquiera de esa modificación (es) se espera que proporcionen un mayor de expresión de la variante de subtilasa en la producción de la misma.
Una variante interesante particular es una variante que, además de las modificaciones de acuerdo con la invención, contiene las siguientes sustituciones: S9R, A15T, G61 E, V68A, A98S, S99G, N218D y Q245R. Las variantes interesantes particulares incluyen lo siguiente : S9R, V68A, S99G, Q245R, N261D S9R, A15T, *97aG, P131S,Q137H S9R, A15T, V68A, Q245R S9R,A15T,H120N, P131T,N218D S9R, A15T, V68A, HÍ20N, 218D, Q245R S9R, Ab5T, V68A, 599G, Q245R, N261D S9R, Ab5T, G61E, V68A, A985 , 599G, Q245R S9R, Ab5T, V68A, H120D, P131SQ137H, Q245R S9R, AÍ5T, V68A, 599G, AÍ94P, Q245R, N261D S9R, AÍ5T, V68A, 599G, A228V, Q245R, N261D S9R, AÍ5T, V68A, 76D, 599G, Q245R, N261D S9R, AÍ5T, *97aG, SiOlG, PÍ31SQ137H S9R, A15T, *97aG, P1315,Q137H,N218D S9R, A15T, S101G, H120N, P131T,N218D S9R, Ai5T, V68A, Si01G,Q245R S9R, AÍ5T, V68A, 2185 , Q245R S9R,Ai5T, V68A,N218D,Q245R S9R,Ai5T, V68A,N218G,Q245R S9R,A15T, V68A,N218V,Q245R S9R, A15T, V68A, N76D, Q245R S9R,A15T, V68A,Q245R,N261D S9R, A15T,N62D, *97aG, P131SQ137H S9R, A15T, N62D, V68A, Q245R S9R, A15T, V68A,A194P, Q245R S9R, A15T, V68A,A228V, Q245R ' S9R,A15T, V68A, A230V,Q245R S9R, A15T, G61E , V68A, A98S , S99G, N218D, Q245R S9R, A15T, G61E , N76D, V68A, A98S , S99G, Q245R S9R,A15T, V68A,S99G,A194P,N218D,Q245R,N261D S9R, A15T, V68A, S99G , N218D, A228V, Q245R, N261D S9R, V68A, S99G,N218G,Q245R,N261D S9R, V68A, S99G,N218V,Q245R,N261D S9R, A15T, V68A, S99G, A194P , N218S , Q245R , N261D S9R, A15T, V68A, S99G , A194P , N218G, Q245R, N261D S9R, A15T, V68A, S99G, A194P , 218V, Q245R, N261D S9R, A15T, V68A, HÍ20V, N218D, Q245R S9R, Ai5T, V68A, Hi20Q,N218D, Q245R S9R, Ai5T, V68A, 76D, N218D, Q245R El desempeño de lavado de una variante seleccionada de la invención se puede someter a prueba en la prueba de desempeño de lavado dada a conocer en el Ejemplo 3 en este documento. La prueba de desempeño de lavado se puede emplear para evaluar la capacidad de una variante, cuando se incorpora en una composición detergente estándar o comercial, para remover manchas proteínicas de un textil estándar como es comparado con un sistema de referencia, particularmente la subtilasa precursora o una subtilasa similar que muestra un desempeño de lavado aún mejor (incorporada en el mismo sistema de detergente y sometido a prueba bajo condiciones idénticas) . Las variantes de enzimas de la presente solicitud se sometieron a prueba utilizando el Ensayo de tensión Mecánica Automática (AMSA, por sus siglas en inglés) . Con la AMSA el desempeño de lavado de una gran cantidad de soluciones detergentes de enzimas de volumen pequeño se pueden examinar rápidamente. Utilizando esta prueba, el desempeño de lavado de una variante seleccionada se puede investigar inicialmente , la razón es que si una variante seleccionada no muestra una mejora significativa en la prueba comparada con la subtilasa precursora, no es normalmente necesario llevar a cabo experimentos de prueba adicionales .
Por lo tanto, las variantes que son particularmente interesantes para los propósitos descritos en este documento, son tales variantes que, cuando se someten a prueba en una composición detergente comercial tal como detergentes para lavaplatos de tipo europeo, lavaplatos de tipo estadounidense, un detergente para ropa de tipo asiático, un detergente de ropa de tipo europeo o un tipo de detergente para ropa de América Latina, algunos ejemplos se describen en la prueba de desempeño de lavado (Ejemplo 3) , muestra un desempeño mejorado de lavado como es comparado con la subtilasa precursora sometida a prueba bajo condiciones idénticas .
Evidentemente, se prefiere que la variante de la invención cumpla los criterios anteriores en por lo menos el nivel más bajo establecido, de manera más preferente en el nivel más alto establecido.
Constructos de Ácido Nucleico La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico que comprenden un polinucleotido que codifica una variante de proteasa de la presente invención enlazada operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula hospedera adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un polinucleotido aislado que codifica una variante de proteasa de la presente invención se puede manipular en una variedad de formas para proporcionar la expresión de la variante. La manipulación del polinucleotido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Son bien conocidas en el campo las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante .
La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, que es reconocida por una célula hospedera para la expresión del polinucleotido. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional que median la expresión de la variante de proteasa variante. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre actividad transcripcional en la célula hospedera de selección incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, se puede obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula hospedera.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención, especialmente en una célula hospedera bacteriana, son los promotores obtenidos del operón de E. coli lac, gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) , gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB) , gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM) , gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y gen de beta- lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff y colaboradores, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 75: 3727-3731) , así como también el promotor tac (DeBoer y colaboradores, 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 80: 21-25). Promotores adicionales se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook y colaboradores, 1989, supra.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori {glaA) , lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa-fosfato- isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Daria ( O 00/56900) , Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900) , proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como también el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa-fosfata- isomerasa de Aspergillus oryzae) ; y promotores mutantes, truncados e híbridos de las mismas.
En hospedero de levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1 , ADH2/GAP) , triosa-fosfato-isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI) , metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) , y 3-fosfoglicerato-cinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células hospederas de levadura se describen en Romanos y colaboradores, 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, que es reconocida por una célula hospedera para terminar la transcripción. La secuencia terminadora se enlaza operativamente a la terminal 3' del polinucleótido que codifica la variante de proteasa variante. Cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedera de selección se puede utilizar en la presente invención.
Terminadores preferidos para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum.
Terminadores preferidos para las células hospederas de levadura se obtienen de los gentes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) , y gliceraldehído-3 -fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células hospederas de levadura se describen en Romanos y colaboradores, 1992, supra.
La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de una mARN que es importante para la traducción por la célula hospedera. La secuencia líder se enlaza operativamente al extremo 5' del polinucleótido que codifica la variante de proteasa variante. Cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula hospedera de selección se puede utilizar en la presente invención .
Los líderes preferidos para las células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa- fosfato- isomerasa de Aspergillus nidulans .
Líderes adecuados para las células hospederas de levadura se obtienen de los genes de enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , 3 -fosfoglicerato-cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor-alfa de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol-deshidrogenasa/gliceraldehído-3 -fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) .
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada operativamente a la terminal 3' de la secuencia que codificas el polipéptido y, cuando se transcribe, se reconoce por la célula hospedera como una señal para ayudar a los residuos de poliadenosina al transcribir el mARN. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedera de selección se puede utilizar en la presente invención.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células hospedera fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum, y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.
Las secuencias de poliadenilación útiles para las células hospederas de levadura se describen por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser un péptido de señal que codifica la región que codifica una secuencia de aminoácidos enlazada a la amino-terminal de una variante de proteasa variante y dirige el polipéptido codificado en la ruta secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación del polinucleótido puede contener inherentemente una región de codificación del péptido señal enlazada naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación que codifica la variante de proteasa variante secretada. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una región de codificación del péptido señal que es extraña a la secuencia de codificación. La región de codificación del péptido señal extraña se puede requerir donde la secuencia de codificación no contenga naturalmente una región de codificación del péptido señal. Alternativamente, la región de codificación del péptido señal extraña puede reemplazar simplemente la región de codificación del péptido señal natural a fin de aumentar la secreción de la variante de proteasa variante. Sin embargo, cualquier región de codificación del péptido señal que dirija el polipéptido excretado en la ruta secretora de una célula hospedera de selección se puede utilizar en la presente invención .
La secuencia de codificación del péptido señal efectiva para las células hospederas fúngicas filamentosas son las secuencias de codificación del péptido señal obtenidas de los genes de TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor iehei, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, y lipasa de Humicola lanuginosa.
Los péptidos de señal útiles para las células hospederas de levadura se obtienen de los gentes del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias de codificación del péptido señal útiles se describen en Romanos y colaboradores, 1992, supra.
La secuencia de control también puede ser una región de codificación de pro-péptido que codifica una secuencia de aminoácidos posicionada en la amino-terminal de una variante de proteasa variante. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Un propolipéptido está en general inactivo y se puede convertir a un polipéptido activo maduro por escisión catalítica o auto-catalítica del pro-péptido del propolipéptido. La región de codificación del pro-péptido se puede obtener de los genes del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) .
Donde ambas regiones de péptido señal y pro-péptido están presentes en la amino-terminal de un polipéptido, la región de pro-péptido se posiciona junto a la amino-terminal de un polipéptido y la región de péptido señal se posiciona junto a la amino-terminal de la región de pro-péptido.
También puede ser deseable agregar secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de la variante de proteasa variante relativa con el crecimiento de la célula hospedera. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que la expresión del gen se encienda o se apague en respuesta a un estímulo químico físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac, y trp. En la levadura, el sistema ADH2 o sistema GALl se pueden utilizar. En los hongos filamentosos, el promotor de TAKA alfa-amilasa, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden utilizar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos , estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante de proteasa variante se enlazaría operativamente con la secuencia reguladora.
Vectores de Expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de proteasa variante de la presente invención, un promotor, y señales de detección transcripcionales y traduccionales . Las diversas secuencias de nucleótidos y de control descritas en lo anterior se pueden unir conjuntamente para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en tales sitios. Alternativamente, el polinucleótido se puede expresar al insertar el polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de modo que la secuencia de codificación se enlaza operativamente con las secuencias de control apropiadas para expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueden llevar a cabo la expresión del polinucleótido. La selección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual el vector se va a introducir. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.
El vector puede ser un vector autónomamente de replicación, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica , la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento, un elemento extracromosómica, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedera, se integra en el genoma y se replica conjuntamente con el cromosoma (s) en el cual se ha integrado. Adicionalmente , un solo vector plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a ser introducidos en el genoma de la célula hospedera, o un transposón, se pueden utilizar.
Los vectores de la presente invención contienen de manera preferente uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas, transíectadas , transducidas, o similares. Un marcador seleccionable es un gen del producto del cual proporciona una resistencia a biocidas o virales, resistencia a metales pesados, prototropía de auxotrófos, y similar.
Marcadores adecuados para células hospedera de levadura son ADE2 , HIS3, LEU2 , LYS2 , ME 3 , TRP1, y URA3. Los marcadores seleccionables para el uso en una célula hospedera fúngica filamentosa incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina-carbamoiltransferasa) , bar ( fosfinotricina-acetiltransferasa) , hph (hogromicina fosfotransferasa) , D (nitrato reductasa) , pyrG (orotidina-5 ' -fosfato-descarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) , y trpC (antranilato sintasa) , así como también equivalentes de los mismos. Preferidos para el uso en una célula de Aspergillus son los gentes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus .
Los vectores de la presente invención contienen de manera preferente un elemento (s) que permite la integración del vector en el genoma de la célula hospedera o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula hospedera, el vector puede depender de la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma por recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración o recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera en una ubicación (es) precisa en el cromosoma (s) . Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener de manera preferente un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10,000 pares base, de manera preferente de 400 a 10,000 pares base, y de manera mucho más preferente de 800 a 10,000 pares base, que tienen un alto grado de identidad a la secuencia objetivo correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula hospedera. Adicionalmente, los elementos de integración pueden ser secuencias de nucleótidos no de codificación o de codificación. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula hospedera por recombinación no homologa.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique autónomamente en la célula hospedera en cuestión. El origen de la replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que media la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se define en este documento como una secuencia de nucleótidos que permite que un plásmido o vector se repliquen in vivo.
Los ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula hospedera de levadura son los 2 micro-orígenes de la replicación, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3 , y la combinación de ARS4 y CEN6.
Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en la célula fúngica filamentosa son AMAl y ANSI (Geras y colaboradores, 1991, Gene 98: 61-67; Cullen y colaboradores, 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMAl y la construcción de los plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede lograr de acuerdo con los métodos dados a conocer en el documento WO 00/24883.
Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención se puede insertar en la célula hospedera para incrementar la producción de una variante de proteasa.
Un incremento en el número de copias del polinucleótido se puede obtener al integrar por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera o al incluir un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y en consecuencia copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar para cultivar las células en presencia de un agente seleccionable apropiado.
Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos en lo anterior para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por una persona de experiencia en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, supra) para obtener variantes de la variante de proteasa sustancialmente pura.
Células Hospederas La presente invención también se refiere a células hospederas recombinantes, que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de proteasa variante, que se utilizan ventajosamente en la producción recombinante de la variante. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula hospedera de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico de auto-replicación como se describe en lo anterior. La selección de una célula hospedera dependerá en un alto grado del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
La célula hospedera puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante de proteasa variante. La célula hospedera también puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, de insecto, vegetal o fúngica.
En un aspecto, la célula hospedera es una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en este documento incluye la phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (como se define por Hawksworth y colaboradores, In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU) así como también la Oomycota (como es citada por Hawksworth y colaboradores, 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth y colaboradores, 1995, supra) .
En otro aspecto, la célula hospedera fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este documento incluye levadura de ascosporogenosis (Endomycetales) , levadura de basidiosporogenosis , y levadura que pertenece al Fungi Imperfecti (Blastomycetes) . Puesto que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, la levadura se definirá como se describe por Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol . Symposium No. de Serie 9, 1980) .
En otro aspecto, la célula hospedera de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia .
En otro aspecto, la célula hospedera de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto, la célula hospedera de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otro aspecto, la célula hospedera de levadura es una célula de Yarrowia lipolitica .
En otro aspecto, la célula hospedera fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión de Eumycota y Oomycota (como se define por Hawks orth y colaboradores, 1995, supra) . Los hongos filamentosos se caracterizan en general por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosan, mañano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es mediante el alargamiento de las hifas y el catabolismo del carbono es obligadamente aeróbico. En contraste, el crecimiento vegetativo por las levadoras tal como Saccharomyces cerevisiae es mediante la germinación de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
En otro aspecto, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureojasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis , Chrysosporium, Coprinus , Coriolus , Cryptococcus , Filibasidium, Fusarium, Humicola , Magnaporthe, Muco , Myceliophthora , Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia , Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, T ermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.
En otro aspecto, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori , Aspergillus fumigatus , Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En otro aspecto, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirína, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus irsutus, Hu icola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor iehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa , Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplasto, transformación de los protoplastos , y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células hospederas de Aspergillus y Trichoderma se describen en el documento EP 238 023 y Yelton y colaboradores, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 81: 1470-1474. Métodos adecuados para la transformación de especies de Fusarium se describen por Malardier y colaboradores, 1989, Gene 78: 147-156, y WO 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simón, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito y colaboradores, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen y colaboradores, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 75: 1920.
Método para producir una variante de subtilasa La presente invención proporciona un método para producir una enzima aislada de acuerdo con la invención, en donde una célula hospedera adecuada, que se ha transformado con una secuencia de ADN que codifica la enzima, se cultiva bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante se recubre del cultivo.
Cuando un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la enzima se transforma en una célula hospedera heterologa es posible permitir la producción recombinante heterologa de la enzima de la invención. En consecuencia es posible hacer una composición de subtilasa sumamente purificada, caracterizada en estar libre de impurezas homologas.
El medio utilizado para cultivar las células hospederas transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para desarrollar las células hospederas en cuestión. La subtilasa expresada se puede secretar convenientemente en el medio de cultivo y se puede recubrir del mismo mediante procedimientos bien conocidos que incluyen separación de las células del medio mediante centrifugación o filtración, precipitación de componentes proteínicos del medio por medio de una sal tal como un sulfato de amonio, seguido por procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por afinidad, o similar.
COMPOSICIONES DE LIMPIEZA Y DETERGENTES La enzima de la invención se puede agregar a y de esta manera ser un componente de una composición detergente. En general, las composiciones de limpieza y detergente se describen bien en la técnica y se hace referencia a los documentos WO 96/34946; O 97/07202; O 95/30011 para la descripción adicional de composiciones de limpieza y detergentes adecuados .
La composición detergente de la invención se puede formular por ejemplo como una composición detergente para ropa a mano o a máquina incluyendo una composición de aditivo para ropa adecuado para el pre-tratamiento de telas manchadas y un enjuague agregado a la composición suavizante de telas, o se formula como una composición detergente para el uso general en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas, o se formula para operaciones de lavaplatos a mano o a máquina.
En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo detergente así como también la composición detergente puede comprender una o más de otras enzimas tal como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o una peroxidasa En general las propiedades de la enzima (s) seleccionada deben ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH-óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etcétera.), y la enzima (s) debe estar presente en cantidades efectivas.
Proteasas : Proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen mutantes químicamente modificados o diseñados por proteínas. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, de manera preferente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descritas en el documento WO 89/06279). Ejemplos de proteasas similar a tripsina son tripsina (por ejemplo de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusaríum descrita en los documentos WO 89/06270 y WO 94/25583.
Los ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en los documentos WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274. Enzimas de proteasa comercialmente disponibles preferidas incluyen DurazymMR, RelaseMR, AlcalaseMR, SavinaseMR, PrimaseMR, DuralaseMR, EsperaseMR, OvozymeMR y KannaseMR (Novozymes A/S) , MaxataseMR, MaxacalMR, Maxapem MR, ProperaseM , PurafectMR, Purafect OxPMR, FN2MR, FN3MR y FN4MR (Genencor International, Inc.).
Lipasas : Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de Thermomyces) , por ejemplo de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como se describe en los documentos EP 258 068 y EP 305 216 o de H. insolens como se describe en el documento WO 96/13580, una Pseudomonas lipasa, por ejemplo de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligen.es (EP 218 272) , P. cepacia (EP 331 376) , P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, cepa de Pseudomonas sp. SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo de B . subtilis (Dartois y colaboradores (1993) , Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B . stearothermophilus (JP 64/744992) o B . pu ilus (WO 91/16422) .
Otros ejemplos son las variantes de lipasa tales como aquellas descritas en los documentos WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.
Enzimas de lipasa comercialmente disponibles preferidas incluyen LipexMR, LipolaseMR y Lipolase UltraMR (Novozymes A/S) .
Amilasas : Amilasas adecuadas (a y/o ß) incluyen aquellas de origen bacteriano fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo una cepa especial de B. licheniformis, descrita con más detalle en el documento GB 1,296,839.
Los ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en los documentos WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444.
Las amilasas comercialmente disponibles son DuramylMR, TermamylMR, FungamylMR y BANMR (Novozymes A/S) , Rapidase y Purastar (de Genencor International Inc.).
Celulasas : Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano fúngico. Se incluyen los mutantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. Celulosas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum dadas a conocer en los documentos US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259.
Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de estas celulasas son celulasas descritas en los documentos EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasa tales como aquellas descritas en los documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
Celulasas comercialmente disponibles incluyen CelluzymeMR, y CarezymeMR (Novozymes A/S) , ClazinaseMR, y Puradax HAMR (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)MR (Kao Corporation) .
Peroxidasas/Oxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano fúngico. Se incluyen los mutantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo de C. cinereus, y variantes del mismo como aquellas descritas en los documentos WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GuardzymeMR (Novozymes A/S) .
La enzima (s) detergente se puede incluir en una composición detergente al agregar aditivos separados que contienen una o más enzimas, o al agregar un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo detergente de la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, se puede formular por ejemplo como un granulado, un líquido, una suspensión, etcétera. Formulaciones aditivas detergentes preferidas son granuladas, en granulados sin polvo particulares, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o suspensiones.
Se pueden producir granulados sin polvo, por ejemplo, como se da a conocer en los documentos US 4,106,991 y 4,661,452 y se pueden recubrir opcionalmente por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de recubrimiento cerosos son productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol , PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los cuales hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para la aplicación mediante técnicas del lecho fluido se proporcionan en el documento GB 1483591. Las preparaciones de enzimas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas al agregar un poliol tal como propilenglicol , un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con los métodos establecidos. Enzimas protegidas se pueden preparar de acuerdo con el método dado a conocer en el documento EP 238, 216.
La composición detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una tableta, un polvo, un granulo, una pasta, un líquido, una forma granular o en polvo para todo propósito o un agente de lavado "para uso industrial" , un agente de lavado para todo propósito en forma líquida, gel o pasta, especialmente el así llamado tipo de líquido para uso industrial; un detergente de telas finas líquido; un agente de lavado de platos a mano o un agente de lavado de platos de trabajo ligero, especialmente aquellos de tipo de alta espumación; un agente de lavado de platos a máquina, incluyendo las diversas tipos de tableta, granular, líquido y auxiliar de enjuague para uso doméstico e institucional. La composición también puede estar en paquetes de dosis unitaria, incluyendo aquellos conocidos en la técnica y aquellos que son solubles en agua, insolubles en agua y/o permeables al agua. Un detergente líquido puede ser acuoso, que contiene típicamente hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.
La composición detergente de la presente invención puede comprender además tensioactivos , mejoradores, blanqueadores, activadores de blanqueado, catalizadores de blanqueado, colorantes, potenciadores de blanqueo, agentes quelantes, agentes de transferencia de tinte, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas adicionales, y estabilizantes de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueo, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, abrillantadores ópticos, fotoactivadores , fluorescentes, acondicionadores de telas, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de remoción/anti-redeposición de manchas de arcilla, sales rellenadoras , hidrótropos, abrillantadores, supresores de espuma, agentes elastizantes de estructura, ablandadores de telas, tensioactivos hidrolizables , conservadores, antioxidantes, agentes anti-encogimiento, germicidas, fungicidas, anti -manchas , agentes anticorrosión, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes , portadores, auxiliares de procesamiento, pigmentos, tintes, perfumes y agentes de control de pH, sistemas estabilizantes de enzimas.
De esta manera, la composición detergente comprende uno o más tensioactivos , que pueden ser no iónicos incluyendo semi-polares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos y/o anfolíticos y/o semi-polares no iónicos y/o mezclas de los mismos. Los tensioactivos están típicamente presentes en un nivel de 0.1% a 60% en peso, mientras que en modalidades alternativas, en niveles de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 50 por ciento, mientras que en aún modalidades adicionales, en niveles de aproximadamente 5 por ciento a aproximadamente 40 por ciento, en peso de la composición detergente.
Cuando se incluye en este documento el detergente contendrá usualmente de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un tensioactivo aniónico tal como alquilbencensulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso) , etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de alfa-sulfo ácido graso, ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón.
Tensioactivos aniónicos adecuados adicionales son jabones y aquellos que contienen grupo sulfato o sulfonato. Los tensioactivos del tipo sulfonato que entran en consideración son alquilbencensulfonatos de (alquilo C9-C13) y olefinsulfonatos , los últimos se entiende que son mezclas de alquenosulfonatos e hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos , como es obtenido, por ejemplo, mediante sulfonación de monoolefinas de C12-C18 que tienen un enlace doble terminal o internamente localizado. También son adecuados alquensulfonatos de (C12-C18) ésteres de alfa-sulfoácidos grasos (sulfonatos de éster) , por ejemplo los ésteres de metilo alfa-sulfonados de coco hidrogenado, grano de palma o ácidos grasos de cebo un ácido alfa-sulfocarboxílico que resulta de la saponificación de MES se puede utilizar.
Tensioactivos aniónicos adecuados adicionales son ésteres de glicerol de ácido graso sulfonado que comprenden mono-, di- y tri-ésteres y mezclas de los mismos.
Sulfatos de alqu(en)ilo a los cuales la preferencia se proporciona son las sales de metal alcalino y las sales de sodio de monoésteres de ácido sulfúrico de alcoholes grasos de C12-C18, por ejemplo de alcohol graso de coco, alcohol graso de sebo, alcohol laurílico, miristílico, cetílico o estearílico, o de alcoholes oxo de C10-C20 y monoésteres de ácido sulfúrico de alcoholes secundarios que tienen esa longitud de cadena. Desde el punto de vista de la tecnología de lavado, se da preferencia especial a los sulfatos de alquilo de C12-C16 y sulfatos de alquilo de C12-C15 y también a los sulfatos de alquilo de C14-C15. Los tensioactivos aniónicos adecuados son también los alcano-2,3-diilbis (sulfatos) que se preparan, por ejemplo, de acuerdo con los documentos US3,234,258 o US5,075,041.
También son adecuados los monoésteres de ácido sulfúrico de alcoholes de C7-C21 de cadena recta o ramificado etoxilados de 1 a 6 mol de óxido de etileno, tal como alcoholes de C9-C11 2 -metil -ramificados con, en promedio, 3.5 mol de óxido de etileno (EO, por sus siglas en inglés) o alcoholes grasos de C12-C18 de 1 a 4 EO. Debido a sus características de espumación altas, se utiliza normalmente en composiciones de lavado y limpieza solamente en niveles relativamente bajos, por ejemplo en niveles de 1% a 5% en peso .
Los tensioactivos aniónicos también pueden incluir diésteres, y/o sales de monoésteres de ácido sulfosuccínico con residuos de alcohol graso de C8-C18 o mezclas de los mismos. Se da preferencia especial a sulfosuccinatos en los cuales los residuos de alcohol graso tienen una distribución de longitud de cadena reducida. Del mismo modo es también posible utilizar sulfosuccinatos de alqu(en)ilo que tienen de manera preferente de 8 a 18 átomos de carbono en la cadena de alqu(en)ilo, o sales de los mismos.
Tensioactivos aniónicos adicionales que entran en consideración son derivados de ácido graso de aminoácidos, por ejemplo de metiltaurina (tauridos) y/o de metilglicina (sarcosidos) . Tensioactivos aniónicos adicionales que entran en consideración son jabones. Los jabones de ácido graso saturados tales como las sales de ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido erúcico hidrogenado y ácido behénico y mezclas de jabón derivadas de ácidos grasos naturales, por ejemplo de coco, de grano de palma y ácidos grasos de sebo. Los tensioactivos aniónicos, incluyendo los jabones, pueden estar presentes en la forma de sus sales de sodio, potasio o amonio y en la forma de sales solubles de bases orgánicas tal como mono-, di- o trietanolamina . Los tensioactivos aniónicos pueden estar presentes en la forma de sus sales de sodio o potasio.
Como tensioactivos no iónicos, se utilizan los alcoholes especialmente primarios, de manera preferente alcoxilados, ventajosamente etoxilados y/o propoxilados, que tienen de 8 a 18 átomos de carbono, y en promedio, de 1 a 12 moles de óxido de etileno (EO, por sus siglas en inglés) y/o de 1 a 10 moles de óxido de propileno (PO) por mol de alcohol. Se da preferencia especial a alcoxilatos de alcohol de C8-C16, ventajosamente etoxilatos de alcohol de C10-C15 etoxilados y/o propoxilados, especialmente alcoxilatos de alcohol de C12-C14, que tienen un grado de etoxilación entre 2 y 10, o entre 3 y 8, y/o un grado de propoxilación entre 1 y 6, o entre 1.5 y 5. El residuo de alcohol puede ser de manera diferente lineal o, especialmente en la posición 2, ramificado con metilo, o puede comprender una mezcla de cadenas ramificadas con metilo y lineales, como están usualmente presentes en los alcoholes oxo. Se da preferencia especial, sin embargo, a los etoxilatos de alcohol derivados de alcoholes lineales de origen natural que contienen de 12 a 18 átomos de carbono, por ejemplo alcohol graso de coco, palma y sebo o alcohol oleílico, y en promedio de 2 a 8 de EO por mol de alcohol. Los alcoholes etoxilados incluyen, por ejemplo, alcoholes de C12-C14 con 3 EO o 4 EO, alcoholes de C9-C11 con 7 EO, alcoholes de C13-C15 con 3 EO, 5 EO, 7 EO u 8 EO, alcoholes de C12-18 con 3 EO, 5 EO o 7 EO, mezclas de los mismos, tales como mezclas de alcohol de C12-C14 con 3 EO y alcohol de C12-C18 con 5 EO . Los grados mencionados de etoxilación y propoxilación representan promedios estadísticos que, para un producto especifico, puede ser un número entero o un número fraccional. Etoxilatos y propoxilatos de alcohol preferidos tienen una distribución homologa restringida (etoxilatos/propoxilatos de intervalo reducido, NRE/NRP) . Además de esos tensioactivos no iónicos los etoxilatos que tienen más de 12 EO también se pueden utilizar ejemplos de los mismos son etoxilato de alcohol graso de sebo con 14 EO, 25 EO, 30 EO o 40 EO.
También son adecuadas aminas etoxiladas, que están etoxiladas y/o propoxiladas , especialmente aminas primarias y secundarias que tienen de 1 a 18 Átomos de carbono por cadena de alquilo y, en promedio, de 1 a 12 moles de óxido de etileno (EO) y/o de 1 a 10 moles de óxido de propileno (PO) por mol de amina .
Además, como tensioact ivos no iónicos adicionales, también se pueden utilizar poliglicósidos de alquilo de la fórmula general RiO(G)x, en donde Rx es un grupo alquilo de cadena recta o ramificado con metilo primario (especialmente ramificado con metilo en la posición 2) que tiene de 8 a 22, de manera preferente de 12 a 18, átomos de carbono y el símbolo "G" indica una unidad de glicosa (monosacárido) que tiene de 5 o 6 átomos de carbono; de manera preferente G es glucosa. El grado de oligomerización x, que indica el número promedio de unidades de glicosa, estará en general entre 1 y 10; x es de manera preferente de 1.2 a 1.4.
Una clase adicional de tensioact ivos no iónicos utilizados, que se utilizan ya sea como un solo tensioactivo no iónico o en combinación con otros tensioactivos no iónicos, comprende ésteres de alquilo de ácido graso alcoxilados de manera preferente etoxilados o etoxilados o propoxi lados , que tienen de 1 a 4 átomos de carbono en la cadena de alquilo, especialmente ésteres metílicos de ácido graso, como se describe, por ejemplo, en el documento JP58/217598.
Tensioactivos no iónicos del tipo de óxido de amina, por ejemplo óxido de N- (coco-alquil) -N, iV-dimetilamina y óxido de N- (sebo-alquil) -?,?-bis (2-hidroxietil) amina, y de la alcanolamida de ácido graso o de tipo alcanolamida de ácido graso etoxilado también pueden ser adecuados.
En una modalidad más preferida, el tensioactivo es dodecilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario, yoduros de alquil-piridinio, Tween 80, Tween, 85, Tritón X-100, Brij 56, tensioactivos biológicos, ramnolípidos , surfactina, visconsina, o sulfonatos.
Cuando se incluye en este documento el detergente contendrá usualmente de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 40% de un tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosido, alquildimetilamineóxido, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanol-amida de ácido graso, amida de ácido graso de polihidroxialquilo, o derivados de N-acilo N-alquilo de glucosamina ( "glucamidas" ) .
En algunas modalidades la invención se refiere a un método en donde la concentración de por lo menos un tensioactivo es de 0 a 500, de 0.00001 a 100, de 0.0001 a 50, de 0.0001 a 40, de 0.001 a 30, de 0.01 a 20, de 0.1 a 15, de 1 a 10 miligramos por gramo de textil.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método, en donde la concentración de por lo menos un tensioactivo es de 0 a 50, de 0.0001 a 40, de 0.001 a 30, de 0.01 a 20 de 0.1 a 10, o de 1 a 5 g por L de solución.
El detergente puede contener 0-65% de un mejorador de detergente o agente formador de complejos tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, cido etilen-diaminatetraacético, ácido dietilentriaminpentaacético, ácido alquil- o alquenil-succínico, silicatos solubles o silicatos en capas por ejemplo MGDA: ácido metilglicindiacético o alternativamente GLDA: ácido L-Glutámico, ácido N,N-diacético, sal de tetrasodio. La composición detergente también puede estar no mejorada, es decir esencialmente libre de mejorador de detergente.
La cantidad de un mej orador de detergente puede ser arriba de 5%, arriba de 10%, arriba de 20%, arriba de 30%, arriba de 40% o arriba de 50%, y puede estar abajo de 80%, 65%. En un detergente para lavaplatos, el nivel del mej orador es típicamente de 40-65%, particularmente de 50-65%.
El mej orador puede de manera particular ser un agente quelante que forma complejos solubles en agua con Ca y Mg. La resistencia del complejo formado entre el mejorador y Ca++ y/o Mg++, expresado como el valor K log (ya sea proporcionado como la constante de equilibrio o estabilidad o como la constante de estabilidad condicional en un pH dado) , puede estar en el intervalo de 3-8, particularmente 5-8. La constante de estabilidad se puede medir a 25°C y la resistencia iónica 0.1 M, y la constante de estabilidad condicional se puede medir en las mismas condiciones a pH de 8.5 o 9.
El mej orador puede contener un grupo amino y puede ser, por ejemplo, amino carboxilato, amino-policarboxilato o un fosfonato. Puede ser una molécula monomérica que comprende uno, dos o tres grupos amino (grupos amino típicamente secundarios o terciarios), y puede contener dos, tres, cuatro o cinco grupos carboxilo. Ejemplos de mejoradores adecuados son ácido diacético de meteilgliciona (MGDA) , ácido glutámico acido N, -diacético (sal de tetrasodio de ácido N,N-dicarboximetil-glutámico, GLDA) , ácido nitrilotriacético (NTA) , ácido dietilen-triamin-pentaacético (DTPA) , ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) , ácido Etilendiamin-N , N ' -disuccínico (EDDS) , ácido N- (1, 2 -dicarboxietil ) -D, L-aspártico (IDS) y ácido N- (2 -hidroxietil ) iminodiacético (EDG) , y sales de los mismos.
El mejorador tiene de manera preferente una capacidad amortiguadora (también llamada alcalinidad reservada) mayor que 4 (el número de equivalentes de un ácido fuerte requerido para cambiar el pH de un litro de una solución amortiguadora por una unidad, manteniendo la cantidad total del ácido y la sal en la constante amortiguadora) .
El mej orador puede ser un secuestrante ambientalmente apto, por ejemplo, como se describe por el documento O09/102854. Los secuestrantes ambientalmente aptos adecuados incluyen uno o más de secuestrantes basados en aminoácido, secuestrantes basados en succinato, ácido cítrico y sales de los mismos.
Ejemplos de compuestos basados en aminoácido adecuado incluyen MGDA (ácido metil-glicina-diacético) , y sales y derivados del mismo y GLDA (ácido glutámico-N, N-diacético) y sales y derivados del mismo. Otros me oradores adecuados se describen en el documento US6426229. Los mej oradores adecuados particulares incluyen; por ejemplo, ácido aspártico-ácido N-monoacético (ASMA) , ácido aspártico-ácido N, N-diacético (ASDA) , ácido aspártico-N-ácido monopropiónico (ASMP) , ácido iminodisuccínico (IDA) , ácido N-(2-sulfometil) -aspártico (SMAS) , ácido N- ( 2 -sulfoetil ) -aspártico (SEAS), ácido N- (2-sulfometil) -glutámico (SMGL) , ácido N- (2-sulfoetil) -glutámico (SEGL) , ácido N-metiliminodiacético (MIDA) , ácido a-alanina-N, N-diacético ( -ALDA) , ácido serina-N, N-diacético (SEDA) , ácido isoserina-N, N-diacético (ISDA) , ácido fenilalanina-N, N-diacético (PHDA) , ácido antranílico-N, - acido diacético (ANDA) , ácido sulfanílico -?,?-ácido diacético (SLDA) , ácido taurina-N,N-diacético (TUDA) y ácido sulfometil-N, N-diacético (SMDA) y sales de metal alcalino o sales de amonio del mismo. En un aspecto, las sales de GLDA y derivados de las mismas se pueden emplear. En un aspecto, se puede emplear la sal de tetrasodio de GLDA.
Ejemplos adicionales de mej oradores adecuados incluyen N- (hidroxietil) -etilidendiamintriacetato (HEDTA) , dietanolglicina (DEG) , ácido 1-Hidroxi-Etilidene-l, 1-Difosfónico (HEDP) , ácido Dietilentriamin-Penta (Metilen-Fofónico) (DTPMP) , ácido Etilen-diamina . tetra (metilen-fosfónico) (EDTMPA) y ácido aminotris (metilenfosfónico) (ATMP) .
Ejemplos de compuestos de succinato adecuados se describen en el documento US5977053. En un aspecto, los compuestos de succinato adecuados incluyen iminosuccinato de tetrasodio.
Los mej oradores se pueden clasificar por la prueba descrita por M. K.Nagarajan y colaboradores, JAOCS, Vol . 61, no. 9 (Septiembre de 1984) , páginas 1475-1478 para determinar el nivel de mej orador mínimo requerido para disminuir la dureza del agua en pH 10.5 de 200 ppm (como CaC03) a 10 ppm en una solución de un detergente hipotético dosificado a 0.200 por ciento, proporcionado como el porciento en peso del mej orador en el detergente hipotético. Alternativamente, la determinación se puede hacer en pH 8.5 para reflejar el pH más bajo de detergentes para ropa modernos típicos. Utilizando este método en cualquier pH, el nivel requerido puede ser 0-25% (fuerte) , 25-35% (medio) o >35% (débil) . Son más preferidas las composiciones que incluyen mej oradores fuertes y medios, son más preferidas las composiciones con mejoradores fuertes.
El mej orador puede ser un mej orador fuerte tal como ácido metil-glicin-diacético ( "MGDA" ) o sal de tetrasodio de ácido N, N-Dicarboximetil-glutámico (GLDA) ; puede ser un mejorador medio tal como tri-poli-fosfato de sodio (STPP) , o puede ser un mejorador débil tal como citrato de sodio. Son más preferidas las composiciones que incluyen mej oradores fuertes y medios, son más preferidas las composiciones con mej oradores fuertes. Otros ejemplos de mejoradores son zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiamintetraacético (EDTA) , ácido dietilentriaminpentaacético, ácido alquil- o alquenilsuccínico, silicatos solubles y silicatos en capas (por ejemplo SKS-6 de Hoechst) .
El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetil-celulosa, poli (vinilpirrolidona) , poli (etilenglicol) , poli (alcohol vinílico) , poli (vinil-piridina-N-óxido) , poli (vinilimidazoe) , policarboxilatos tales como poli-acrilatos , copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de lauril-metacrilato/ácido acrílico.
El detergente puede contener un sistema blanqueador, o uno o más agentes blanqueadores, que pueden comprender una fuente de H202 tal como perborato o percarbonato que se pueden combinar con un activador de blanqueo formador de perácido tal como tetraacetiletilndiamina o nonanoiloxibencensulfonato .
Alternativamente, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos de por ejemplo el tipo de amida, imida, o sulfona. Agentes blanqueadores adecuados adicionales incluyen otros fotoblanqueadores , ácidos preformados, fuentes de peróxido de hidrógeno, activadores de blanqueo, peróxido de hidrógeno, catalizadores de blanqueo y mezclas de los mismos. En general, cuando un agente blanqueador se utiliza, las composiciones de la presente invención pueden comprender de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 50% o aún de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 25% de agente blanqueador en peso de la composición de limpieza sujeto.
El detergente también puede contener otros ingredientes detergentes convencionales tales como por ejemplo acondicionadores de telas que incluyen arcillas, potenciadores de espuma, supresores de espumas, agentes anti-corrosión, agentes de suspensión de manchas, agentes de redeposición anti-manchas, tintes, bactericidas, abrillantadores ópticos, hidrótropos, inhibidores de manchas o perfumes.
Las variaciones en las condiciones locales y regionales, tal como dureza de agua y temperatura del agua exigen composiciones detergentes regionales. Los Ejemplos Detergentes 1 y 2 proporcionan intervalos para la composición detergente típica europea para lavaplatos automática (ADW, por sus siglas en inglés) y un detergente en polvo Europeo típico respectivamente.
Ejemplo Detergente 1. Composición detergente típica europea Grupo Subnombre Contenido Tensioactivos 0-30% Sulfonatos 0-20% Sulfatos 0-15% Jabones 0-10% No iónicos 0-10% Catiónicos 0-10% Otros 0-10% Blanqueador 0-30% STP/SPM 0-30% NOBS+TAED 0-10% Mejoradores 0-60% Fosfatos 0-40% Zeolita 0-40% Na20Si02 0-20% Na2C03 0-20% Rellenadores 0-40% Na2S04 0-40% NaCl 0-40% Otros hasta 100% Polímeros Enzimas Reguladores de espuma Agua Hidrótropos Otros La (s) enzima (s) de la composición detergente de '.. invención se puede estabilizar utilizando agentes estabilizantes convencionales e inhibidores de proteasa, por ejemplo un poliol tal como propilenglicol o glicerol, una azúcar o alcohol de azúcar, sales diferentes tal como NaCl; KCl ; ácido láctico, ácido fórmico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado 'de ácido f nilborónico tal como ácido 4-formilfenil-borónico, o un aldehido de péptido tal como aldehidos de di-, tri- o tetrapéptido o análogos de aldehido (ya sea de la forma B1-B0-R en donde, R es H, CH3 , CX3, CHX2, o CH2X (X=halógeno) , BO es un residuo de aminoácido individual (de manera preferente con una cadena lateral alifática o aromática opcionalmente sustituida) ; y Bl consiste de uno o más residuos de aminoácido (de manera preferente uno, dos o tres) , que comprende opcionalmente un grupo de protección N-terminal, o como se describe en los documentos O09118375, WO098/13459) o un inhibidor de proteasa de tipo de proteína tal como RASI, BASI, ASI (inhibidores de alfa-amilasa/subtilisina bifuncional de arroz, cebada y trigo) o C12 o SSI . La composición se puede formular como se describe por ejemplo en el documento WO 92/19709, WO 92/19708 y US6,472,364. En algunas modalidades, las enzimas empleadas en este documento se estabilizan por la presencia de fuentes solubles en agua de iones de zinc (II) , calcio (II) y/o magnesio (II) en las composiciones terminadas que proporcionan tales iones a las enzimas, así como también otros iones de metal (por ejemplo, bario (II), escandio (II), hierro (II), manganeso (II), aluminio (III), Estaño (II), cobalto (II), cobre (II), Níquel (II) y oxovanadio (IV)).
Se contempla en la presente que en las composiciones detergentes cualquier enzima individual, en particular la enzima de la invención, se puede agregar en una cantidad que corresponde a 0.01-200 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, de manera preferente 0.05-50 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, en particular 0.1-10 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado .
Típicamente, las composiciones detergentes de la presente invención comprenden por lo menos 0.0001 por ciento en peso, de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1 o de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1, o de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 15% en peso, o de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 20%, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 20%, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 15% por ciento de por lo menos una enzima proporcionada por la presente invención. En algunas modalidades preferidas, las composiciones detergentes proporcionadas en este documento se formulan típicamente tal que durante el uso en operaciones de limpieza acuosas, el agua de lavado tiene un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5, o en modalidades alternativas, aún de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 10.5. En algunas modalidades preferidas, los productos para ropa granulares o líquidos se formulan para tener un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. Las técnicas para controlar el pH en niveles de uso recomendados incluyen el uso de amortiguadores, álcalis, ácidos, etcétera, y son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica.
La enzima de la invención se puede incorporar adicionalmente en formulaciones detergentes dadas a conocer en el documento O 97/07202 que se incorpora en este documento como referencia.
MATERIALES Y MÉTODOS Métodos para la Determinación de la Actividad de la Variante de Proteasa TEXTILES : Piezas textiles estándares se obtienen de EMPA St . Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St . Gallen, Suiza.
Especialmente el tipo EMPA117 (textil de poliéster/algodón manchada con sangre, leche y tinta) . Las piezas textiles estándares se obtienen de Center For Testmaterials BV, P.O.
Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos. Especialmente el tipo C-10 (algodón manchado con aceite/leche/pigmento) y PC- 03 (textil de poliéster/algodón manchado con chocolate, leche/tizne) .
AZULEJO DE MELAMINA: Azulejos de melamina estándares se obtienen de Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos. Especialmente el tipo de DM-21 (yema de huevo) .
CEPAS Y PLÁSMIDOS: La cepa de Bacillus lentus 309 se deposita con el NCIB y de acuerdo con el número de acceso NCIB 10309, y se describe en la Patente de E.U.A. No. 3,723,250 incorporada a manera de referencia en este documento. La subtilasa precursora 309 o SavinaseMR se puede obtener de la cepa 309.
El organismo hospedero de expresión es Bacillus subtilis .
El plásmido pSX222 se utiliza como vector lanzadera de E. coli - B. subtilis y el vector de expresión de B. subtilis (como se describe en el documento WO 96/34946) .
MÉTODOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR GENERAL: A menos que se de otra manera, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizan utilizando métodos estándares de biología molecular (Sambrook y colaboradores (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, F. M. y colaboradores (eds.) "Current protocols in Molecular Biology" . John Wiley y Sons, 1995 ; Harwood, C. R . , and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley y Sons , 1990.
ENZIMAS PARA LAS MANIPULACIONES de ADN: A menos que se mencione de otra manera, todas las enzimas para las manipulaciones de ADN, tal como por ejemplo endonucleasas, ligasas etcétera, de restricción, se obtienen de New England Biolabs, Inc. Enzimas para las manipulaciones de ADN se utilizan de acuerdo con las especificaciones de los proveedores.
FERMENTACIÓN: Fermentaciones para la producción de enzimas de subtilasa se realizan en pH 7.3 y a 37°C sobre una mesa de agitación giratoria a 225 rpm, en tubos de 50 mi que contienen medio TY doble de 15 mi de 2-3 días.
Para una descripción del medio TY, véase la página 1.1.3, Media Preparation and Bacteriological Tools en "Current protocols in Molecular Biology" . John Wiley y Sons, 1995; Har ood, C. R.( and Cutting, S. M. (eds.).
PURIFICACIÓN La variante de subtilasa secretada de las células hospederas se puede recubrir convenientemente del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, incluyendo separación de las células del medio por centrifugación o filtración, y precipitación de componentes proteínicos del medio por medio de una sal tal como sulfato de amonio, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por afinidad, o similar.
ACTIVIDAD CATALÍTICA La actividad catalítica de las variantes de la presente invención se puede determinar utilizando el siguiente ensayo "Kinetic Sue AAPF-pNA" : Substrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400) .
Temperatura: temperatura ambiente.
Solución amortiguadora de ensayo: Tris/HCl 50mM, CaCl2 1 mM, H 9.0. 20 mi de proteasa (diluidos en Tritón X-100 al 0.01%) se mezclan con 100 mi de solución amortiguadora de ensayo. El ensayo se inicia al agregar 100 mi de substrato de pNA (50 mg disueltos en 1.0 mi de DMSO y se diluyen adicionalmente 45x con Tritón X-100 al 0.01%) . El incremento en OD405 se supervisa como una medida de la actividad de la proteasa .
PRUEBA DE DESEMPEÑO DE LAVADO A fin de evaluar los desempeños de lavado de las variantes de subtilasas seleccionadas en composiciones detergentes, se realizan experimentos de lavado. Las variantes de enzimas de la presente solicitud se sometieron a prueba utilizando el Ensayo de Tensión Mecánica Automática (AMSA) . Con la prueba AMSA se puede determinar el desempeño de lavado de una gran cantidad de soluciones detergentes de enzimas de volumen pequeño. Para descripción adicional véase el ejemplo 3.
DETERGENTES Para las pruebas de desempeño de lavado de las enzimas de la invención se pueden adquirir detergentes comerciales completamente formulados en el mercado inactivan subsecuentemente los componentes enzimáticos por el tratamiento con calor (5 minutos a 85°C en solución acuosa) .
Por otra parte una base detergente comercial sin enzimas se puede adquirir directamente del fabricante. Además un detergente modelo adecuado se puede componer de acuerdo con las disposiciones en la página 19-24 en este documento y se utilizan para pruebas de desempeño de lavado.
EJEMPLO 1 CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN DE LAS VARIANTES DE ENZIMAS: Las variantes de la presente invención se pueden construir y expresar por métodos conocidos para la persona experta en la técnica. A continuación se muestra un ejemplo de cómo las variantes de acuerdo con la invención se pueden hacer .
Mutagénesis Dirigida al sitio: Variantes dirigidas al sitio subtilisina 309 (SavinaseMR) de la invención que comprenden inserciones/supresiones/sustituciones específicas se hacen mediante clonación tradicional de fragmentos de ADN (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Ed., Cold Spring Harbor, 1989) producidos por PCR con oligos que contienen las mutaciones deseadas.
La plantilla de ADN plásmido puede ser pSX222, o un análogo de este que contiene una variante de subtilisina 309. Las mutaciones se introducen por mutagénesis dirigida al oligo a la construcción de variantes.
Las variantes de subtilisina 309 se transforman en ADN de E. coli purificado de un cultivo durante toda la noche de estos transformantes se transforma en B. subtilis mediante digestión de endonucleasa de restricción, purificación de los fragmentos de ADN, ligación, transformación de B. subtilis. La transformación de B. subtilis se realiza como se describe por Dubnau y colaboradores, 1971, J. Mol. Biol. 56, páginas 209-221.
Mutagénesis dirigida al sitio a fin de introducir mutaciones en una región específica: Se sintetizan cebadores mutagénicos (oligonucleótidos) que corresponden a la secuencia de ADN que flanquea los sitios de mutación, separados por los pares base de ADN que definen las inserciones/supresiones/sustituciones.
Subsecuentemente, los cebadores mutagénicos resultantes se utilizan en una reacción de PCR con el plásmido modificado pSX222. El fragmento de PCR resultante se purifica y se extiende en una segunda reacción de PCR, el producto de PCR resultante se purifica y se extiende en una tercera reacción de PCR antes de ser digerido por las endonucleasas y se clona en el vector lanzadera de E. coli -B. subtilis pSX222. Las reacciones de PCR se realizan bajo condiciones normales. El ADN plásmido se transforma en E. coli mediante técnicas bien conocidas y se secuencia una colonia de E. coli para confirmar la mutación diseñada.
A fin de purificar las variantes de subtilasa de la invención, el plásraido de expresión pSX222 que comprende una variante de la invención se transformó en una cepa de B. subtilis competente y se fermentó como se describe en lo anterior .
EJEMPLO 2 PURIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS Después de que se logra la purificación de fermentación de las variantes de subtilisina utilizando la Cromatografía de Inducción de Carga Hidrofóbica (HCIC, por sus siglas en inglés) y filtración de vacío subsecuente.
Para capturar la enzima, el HCIC utiliza una matriz de celulosa a la cual se enlaza 4 -Mercapto-Etil-Piridina (4-MEP) .
Las cuentas de matriz de celulosa de 80-100 µp? de tamaño se mezclan con un medio que contiene extracto de levadura y la B. subtilis transformadas capaz de secretar las variantes de subtilisina y se incuba a pH 9.5 en microplacas de UnifilterMR.
Como la 4-MEP es hidrofóbica en pH > 7 y las variantes de subtilisina son hidrofóbicas en pH 9.5 se hace una asociación hidrofóbica entre la enzima secretada y la 4-MEP en las cuentas. Después de la incubación en medio y los restos celulares se remueven por filtración al vacío mientras que las cuentas y la enzima se mantienen en el filtro.
Para eluir la enzima de las cuentas el pH ahora se disminuye al lavar el filtro con una solución amortiguadora de elución (pH 5) . Mediante esto las enzimas parten de las cuentas y se pueden recuperar de la solución amortiguadora.
La concentración de las variantes de enzima de subtilisina purificada se evalúa por titulación de sito activo (AST, por sus siglas en inglés) .
La enzima purificada se incuba con el inhibidor de alta afinidad C1-2A en diferentes concentraciones para inhibir una cantidad variante de los sitios activos. La proteasa y el inhibidor se enlazan entre sí en una relación de 1:1 y por consiguiente la concentración de enzimas se puede relacionar directamente con la concentración del inhibidor, en la cual toda la proteasa está inactiva. Para medir la actividad de la proteasa residual, un substrato (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA en solución amortiguadora de Tris/HCl 0.6 mM) se agrega después de la incubación con el inhibidor y durante los siguientes 4 minutos el desarrollo del producto de degradación pNA (paranitrofenol ) se mide periódicamente a 405 nm en un lector Elisa.
EJEMPLO 3 Las variantes de la presente invención se sometieron a prueba para el desempeño de lavado en AMSA en tanto las superficies duras como textiles. Los métodos y los resultados se proporcionan a continuación.
DESEMPEÑO DE LAVADO DE LAS VARIANTES DE SUBTILISINA SOBRE SUPERFICIES DURAS Descripción del método de prueba AMSA: Se llevan a cabo experimentos de lavado a fin de evaluar el desempeño de lavado de las variantes de proteasa seleccionadas en composiciones detergentes para lavaplatos, es decir, detergente modelo ADW con detergente modelo MGDA y AD con STP . Las proteasas de la presente solicitud se someten a prueba utilizando el Ensayo de Tensión Mecánica Automática (AMSA) . Con la AMSA, se puede examinar el desempeño de lavado de una gran cantidad de soluciones detergentes de enzimas de volumen pequeño. La placa de AMSA tiene un número de ranuras para soluciones de prueba y una tapa comprime firmemente la muestra para lavaplatos, el azulejo de melanina que se lava contra todas las aberturas de la ranura. Durante el tiempo de lavado, la placa, soluciones de prueba, azulejo de melanina y la tapa se agitan vigorosamente para poner en contacto la solución de prueba con el azulejo de melanina manchado y aplican tensión mecánica en una manera oscilante periódica regular. Para descripción adicional véase el documento WO 02/42740 especialmente el párrafo "Special method embodiments" en la página 23-24.
El experimento se realizón bajo las condiciones experimentales especificadas a continuación: * GDA: ácido metilglicin-diacético o alternativamente GLDA: ácido L-Glutámico, ácido N, N-diacético, sal de tetrasodio * Tripolifosfato de sodio Los resultados de la prueba ADW de diferentes variantes se muestran a continuación. En el resultado el índice es 1. El resultado de desempeño de Savinase se asigna al valor de 1 y los resultados de las variantes se comparan con este valor.
Prueba de las variantes en el detergente MGDA en placas de Melamina con Yema de Huevo (Hervida) Prueba de las variantes en el detergente STPP en placas de Melamina con Yema de Huevo (Hervida) El resultado muestra claramente que las variantes de la presente invención se desempeñan bien en manchas proteínicas tales como manchas de huevo hervido.
DESEMPEÑO DE LAVADO DE VARIANTES DE SUBTILISINA ADICIONALES EN LAS SUPERFICIES DURAS Variantes adicionales de la presente invención se sometieron a prueba para el desempeño de lavado en AMSA en superficies duras bajo las mismas condiciones como se describen en lo anterior: Prueba de las variantes en detergente MDA en placas de Melamina en Yemas de Huevo (Hervidas) El resultado muestra claramente que las variantes de la presente invención se desempeñan bien en las manchas proteínicas tales como manchas de huevo hervido.
DESEMPEÑO DE LAVADO DE LAS VARIANTES DE SUBTILISINA EN TEXTILES A fin de evaluar los desempeños de lavado de las variantes de subtilasa seleccionadas en una composición base detergente comercial, se realizaron experimentos de lavado. Las variantes de enzima de la presente solicitud se sometieron a prueba utilizando el Ensayo de Tensión Mecánica Automática (AMSA) . Con la prueba AMSA se puede examinar el desempeño de lavado de una gran cantidad de soluciones detergentes de enzimas de volumen pequeño. La placa de AMSA tiene una variedad de ranuras para las soluciones de prueba y una tapa comprime firmemente la muestra de textil a ser lavada contra todos los orificios de ranura. Durante el tiempo de lavado, la placa, soluciones de prueba, el textil y la tapa se agitan vigorosamente para poner en contacto la solución de prueba con el textil y aplicar estrés mecánico. Descripción del Método de Prueba AMSA: Se realizan experimentos de lavado a fin de evaluar el desempeño de lavado de las variantes de proteasa seleccionadas en composiciones detergentes para ropa. Las proteasas de la presente solicitud se someten a prueba utilizando el Ensayo de Tensión Mecánica Automática (AMSA) . Con la AMSA, se puede examinar el desempeño de lavado de una gran cantidad de soluciones detergentes de enzimas de volumen pequeño. La placa AMSA tiene una variedad de ranuras para soluciones de prueba y una tapa presiona firmemente la muestra para ropa, el textil que se lava contra todos los orificios de ranura. Durante el tiempo de lavado, la placa, soluciones de prueba, textil y tapa se agitan vigorosamente para poner en contacto la solución de prueba con el textil y aplicar estrés mecánico en una manera oscilante periódica regular. Para descripción adicional véase el documento O 02/42740 especialmente el párrafo "Special method embodiments" en la página 23-24.
El experimento se condujo baje experimentales especificadas a continuación Alquiletoxi sulfato de sodio (C-9- 15, 2EO) 6.0% Dodecil benzen sulfonato de sodio 3.0% Toluen sulfonato de sodio 3.0% Ácido olico 2.0% Etoxilato de alcohol primario (C12- 15, 7EO) 3.0% Etoxilato de alcohol primario (C12- 15, 3E0) 2.5% Detergente modelo para ropa Etanol 0.5% Monopropilen glicol 2.0% Citrato de trisodio 2H20 4.0% Trietanolamina 0.4% Agua desionizada ad 100% pH ajustado a 8.5 con NaOH Dosificación de detergente 5, g/L Volumen de solución de prueba 160 micro L pH Como se encuentre Tiempo de lavado 20 minutos Temperatura 20°C Dureza del agua 15° dH Concentración de enzimas en la 2.5/5/10/30 nM solución de prueba C-10 (Aceite/leche/pigmento en Se ajustó la dureza del agua a 15°dH mediante la adición de CaC12, MgCl2, y NaHC03 (Ca2+:Mg2+ = 4:1:7.5) al sistema de prueba. Después del lavado los textiles se enjuagaron en agua de la llave y se secaron.
El desempeño de la variante de enzima se mide como la brillantez del color del textil lavado con esa proteasa específica. El brillo también se puede expresar como la intensidad de la luz reflejada de la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra se tiñe la intensidad de la luz reflejada es menor, que aquella de una muestra limpia. Por lo tanto la intensidad de la luz reflejada se puede utilizar para medir el desempeño de lavado de una proteasa.
Las mediciones de color se hacen con un escáner de cama plana profesional (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Brandby, Dinamarca) , que se utiliza para capturar una imagen del textil lavado.
Para extraer un valor para la intensidad de luz de las imágenes escaneadas, por ejemplo, se utiliza una aplicación de software diseñado especial (Novozymes Color Vector Analyzer) los valores de pixeles de 24 bits de la imagen se convierten en valores para rojo, verde y azul (RGB) . El valor de intensidad (Int) se calcula al agregar los valores RGB juntos como vectores y luego tomando la longitud del vector resultante: Textiles : C-10 y PC-03 se obtienen de Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos, y EMPA117 se obtiene de EMPA Testmaterials AG Móvenstrasse 12, CH-9015 St . Gallen, Suiza.
Los resultados de la prueba para ropa AMSA diferentes variantes se muestran a continuación. El resultado del desempeño de la Savinase se asigna al valor de 1 y los resultados de las variantes se comparan con este valor.
Los resultados adicionales de la prueba para ropa AMSA de diferentes variantes se muestran a continuación. El resultado de desempeño del precursor (es decir sin la sustitución de N218D) se asigna al valor de uno y los resultados de las variantes se comparan con este valor.
Los resultados muestran claramente que variantes de la presente invención tienen un desempeño incrementado de lavado en textiles de lavandería comparados con el precursor.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una variante de una subtilisina precursora, caracterizada porque comprende las sustituciones 9{R,K,H}, 15{G,A,S,T,M} , 68{G,A,S,T,M} , 218{D,S,G,V} y 245{R,K,H} en donde la variante comprende además por lo menos una de las siguientes modificaciones: 6l{D,E}, 62{DfE}, 76{D,E}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120{V,Q,D}, 13l{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 [BP 1 ] .
2. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante comprende la sustitución G61E.
3. La variante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la variante comprende la sustitución A98S.
4. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la variante comprende la sustitución S99G. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la variante comprende las siguientes sustituciones S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D y Q245R.
5. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la subtilisina precursora es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad a SEQ ID NO: 1.
6. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la subtilisina precursora pertenece al subgrupo I-S2.
7. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la variante tiene una o más propiedades mejoradas comparada con la subtilisina precursora, en donde las propiedades mejoradas incluyen desempeño de lavado, estabilidad, actividad catalítica y desempeño para lavaplatos.
8. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Un constructo de ácido nucleico, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 8.
10. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el constructo de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9.
11. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el constructo de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10.
12. Una composición de limpieza o detergente, caracterizada porque preferiblemente una composición para lavandería o lavaplatos comprende la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
13. Un método para producir una variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se realiza al introducir la subtilisina precursora a las siguientes sustituciones: i. sustitución en la posición 9 con {R,K,H}; ii. sustitución en la posición 15 con {G,A,S,T,M}; iii. sustitución en la posición 68 con {G,A,S,T,M}; iv. sustitución en la posición 245 con {R,K,H}, y v. sustitución en la posición 218 con {D, S, G o V} y una o más de las siguientes modificaciones: sustitución en la posición 61 con {D,E}, sustitución en la posición 62 con {D,E}, sustitución en la posición 76 con {D,E}, inserción de G en la posición 97, sustitución en la posición 98 con {G,S}, sustitución en la posición 99 con G, sustitución en la posición 101 con G, sustitución en la posición 120 con {v,Q,D}, sustitución en la posición 131 con {T,S}, sustitución en la posición 137 con H, sustitución en la posición 194 con P, sustitución en la posición 228 con V, sustitución en la posición 230 con V, sustituir en las posiciones 261 con D, en donde las posiciones corresponden a las posiciones del polipéptido maduro de SEQ ID NO : 2 [???'] .
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las siguientes sustituciones se introducen en la. subtilisina precursora: i. sustitución S en la posición 9 con R; ii. sustitución A en la posición 15 con T; iii. sustitución V en la posición 68 con A; iv. sustitución Q en la posición 245 con R v. sustitución N en la posición 218 con {D, S, G O V} y una o más de las siguientes modificaciones: sustitución de G en la posición 61 con E, sustitución de N en la posición 62 con D, sustitución de N en la posición 76 con D, inserción de G en la posición 97, sustitución de A en la posición 98 con S, sustitución de S en la posición 99 con G, sustitución de S en la posición 101 con G, sustitución de H en la posición 120 con D, sustitución de P en la posición 131 con T, sustitución de Q en la posición 137 con H, sustitución de A en la posición 194 con P, sustitución de A en la posición 228 con V, sustitución de A en la posición 230 con V, sustitución de N en la posiciones 261 con D.
15. El método de conformidad con la reivindicación 13 o 14, caracterizado porque la subtilisina precursora pertenece al subgrupo I-S2, donde de manera preferente la subtilisina precursora comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad a SEQ ID NO. 1.
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