JP2003516751A

JP2003516751A - 卵の染みに及ぼす洗浄性能改良を示すズブチラーゼ変異体

Info

Publication number: JP2003516751A
Application number: JP2001545529A
Authority: JP
Inventors: セイェルスガールトファーネ，ティーナ; エフ．ミッケルセン，フランク
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2003-05-20

Abstract

(57)【要約】本発明は、洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のためのズブチラーゼ変異体の使用であって、ズブチラーゼ変異体が、位置９５〜１０３（BASBPNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含む使用に関する。これらのズブチラーゼ変異体は、例えば清浄用または洗剤組成物、例えば自動食器洗浄用組成物中に用いられる場合に卵の染みに及ぼす優れたまたは改良された洗浄性能を示すのに有用である。本発明は、新規のズブチラーゼ変異体に、変異体をコードする単離ＤＮＡ配列、発現ベクター、宿主細胞ならびに本発明の変異体を産生および使用するための方法にも関する。さらに本発明は、本発明の変異体を含む清浄用および洗剤組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】産業上の利用分野本発明は、洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のためのズブチラ
ーゼ変異体の使用に関する。特に本発明は、洗濯物からまたは硬質表面からの卵
の染みの除去のためのズブチラーゼ変異体の使用であって、ズブチラーゼ変異体
が、位置９５〜１０３（BASBPNナンバリング。下記参照）からの活性部位ループ
（ｂ）領域中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含む使用に関する。これ
らのズブチラーゼ変異体は、例えば清浄用または洗剤組成物、例えば洗濯用洗剤
組成物および食器洗浄用組成物、例えば自動食器洗浄用組成物中に用いられる場
合に卵の染みに及ぼす優れたまたは改良された洗浄性能を示すのに有用である。
本発明は、新規のズブチラーゼ変異体に、変異体をコードする単離ＤＮＡ配列、
発現ベクター、宿主細胞ならびに本発明の変異体を産生および使用するための方
法にも関する。さらに本発明は、本発明の変異体を含む清浄用および洗剤組成物
に関する。発明の背景洗剤産業において、酵素は30年以上もの間洗浄用処方物中に必要な手段を供給
してきた。このような処方物中に用いられる酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、
アミラーゼ、セルラーゼならびにその他の酵素またはそれらの混合物を包含する
。商業的に最も重要な酵素はプロテアーゼである。

【０００２】多数の商業的に用いられるプロテアーゼ、例えばデュラザイム（登録商標）（
Novo Nordisk A/S）、レラーゼ（登録商標）（Novo Nordisk A/S）、マキサペム
（登録商標）（Gist-Brocades N.V.）、プラフェクト（登録商標）（Genencor I
nternational, Inc.）は、天然野生型プロテアーゼのタンパク質工学処理変異体
である。

【０００３】さらに多数のプロテアーゼ変異体が当業界で記載されている。従来技術のプロ
テアーゼ変異体の綿密なリストは、WO99/27082に示されている。

【０００４】しかしながら、多数の有用なプロテアーゼ変異体が記載されてきてはいるが、
多数の産業用途のための新規の改良型プロテアーゼまたはプロテアーゼ変異体の
必要は依然として存在する。

【０００５】特に例えば洗濯物または硬質表面からの卵の染みの除去の問題は、多数のプロ
テアーゼが卵白中に存在する物質により抑制されるという事実のために、顕著で
あった。このような物質の例としては、ＩＶ−０型トリプシン阻害剤（卵阻害剤
）およびＩＩＩ−０型トリプシン阻害剤（オボムコイド）が挙げられる。

【０００６】したがって本発明の目的は、このような物質により抑制されないか、または限
定程度にのみ抑制される改良型ズブチラーゼ変異体を提供することである。本発
明のさらに別の目的は、例えば洗濯物および／または硬質表面からの卵の染みの
除去に適している改良型ズブチラーゼ変異体を提供することである。発明の概要したがって第一の局面では、本発明は洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染
みの除去のためのズブチラーゼ変異体の使用であって、ズブチラーゼ変異体が位
置９５〜１０３（BASBPNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少
なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含む使用に関する。

【０００７】第二の局面では、本発明は、以下の：位置９８と９９の間の少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応する
活性部位（ｂ）ループ中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、そして
少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む変異体（BASBPNナンバリング）、位置９９と１００の間の少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応す
る活性部位（ｂ）ループ中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、そし
て少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む変異体（BASBPNナンバリング）、から成る群から選択されるズブチラーゼ変異体であって、本明細書中の実施例４
に開示された「卵抑制検定」で試験された場合、少なくとも10％、の残留活性を
有する変異体に関する。

【０００８】第三の局面では、本発明は、以下の：位置９８と９９の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そ
して位置１３３および１４３における置換をさらに含む変異体、位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置９９における置換をさらに含む変異体、位置９８と９９の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そ
して位置１６７、１７０および１９４における置換をさらに含む変異体、位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置２１６と２１７の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を
さらに含む変異体、位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置２１７と２１８の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を
さらに含む変異体、位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置４２と４３の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入をさら
に含む変異体、ならびに位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置１２９と１３０の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を
さらに含む変異体から成る群から選択されるズブチラーゼ変異体に関する。

【０００９】第四の局面では、本発明は、本発明のズブチラーゼ変異体をコードする単離Ｄ
ＮＡ配列に関する。

【００１０】第五の局面では、本発明は、本発明の単離ＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関
する。

【００１１】第六の局面では、本発明は、本発明の発現ベクターで形質転換される微生物宿
主細胞に関する。

【００１２】第七の局面では、本発明は、本発明のズブチラーゼ変異体の製造方法であって
、本発明の宿主が前記の変異体の発現および分泌を行なう条件下で培養され、変
異体が回収される方法に関する。

【００１３】第八の局面では、本発明は、本発明の変異体を含む清浄用または洗剤組成物、
好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物に関する。

【００１４】第九の局面では、本発明は、硬質表面からまたは洗濯物からの卵の染みの除去
方法であって、卵の染み含有硬質表面または卵の染み含有洗濯物を、位置９５〜
１０３（BASBPNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少なくとも
１つの追加のアミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体を含有する清浄用または洗
剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物と接触させることを包含する
方法に関する。

【００１５】本発明のさらに他の局面は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明ら
かである。

【００１６】アラインメントおよびナンバリングに関しては、ズブチリシンＢＰＮ‘（ａ）
（BASBPN）およびズブチリシン３０９（BLSABI）（ｂ）間のアラインメントを示
す図１に対する参照がなされる。

【００１７】これらのアラインメントは、本特許出願においては、残基のナンバリングのた
めの参照として用いられる。

【００１８】定義本発明をさらに詳細に考察する前に、以下の用語および慣例を先ず定義する。

【００１９】変異体の名称に関する命名法および慣例本発明により製造または意図される種々のズブチラーゼ酵素変異体を説明する
場合、参照を容易にするために以下の命名法および慣例が適応されてきた：参照の枠は、単離または親酵素をズブチリシンＢＰＮ‘（BASBPN）と一列に並
べることにより先ず定義される。

【００２０】アラインメントは、以下のパラメーター：ギャップ作製ペナルティー＝８およ
びギャップ延長ペナルティー＝８ならびにそれらのデフォルト値に保持される全
てのその他のパラメーターを用いて変異体をナンバリングするためにＧＣＧパッ
ケージバージョン9.1のＧＡＰルーチンにより得られる。

【００２１】別の方法は、ズブチラーゼ間の既知のアラインメント、例えばWO 91/00345に
示されたアラインメントを使用することである。ほとんどの場合、差はいかなる
重要性も有さない。

【００２２】それにより多数の欠失および挿入がBASBPNに関連して定義される。図１におい
て、ズブチリシン３０９（サビナーゼ（登録商標））は、BASBPNと比較して、位
置３６、５８、１５８、１６２、１６３および１６４に６つの欠失を有する。こ
れらの欠失は、図１において、星印（＊）で示されている。

【００２３】親酵素において実施される種々の修飾は、概して、以下のような３つの素子を
用いて示される：もとのアミノ酸位置置換アミノ酸したがって表示Ｇ１９５Ｅは、位置１９５におけるグリシンのグルタミン酸に
よる置換を意味する。

【００２４】もとのアミノ酸残基が任意のアミノ酸残基であり得る場合には、略記表示が用
いられて、位置および置換アミノ酸のみを示す：位置置換アミノ酸このような表示法は、同種ズブチラーゼにおける修飾（単数または複数）に関
連して特に当てはまる（下記を参照）。

【００２５】同様に置換中のアミノ酸残基（単数または複数）の同定が実体のない場合には
：もとのアミノ酸位置もとのアミノ酸（単数または複数）および置換アミノ酸（単数または複数）の
両方が任意のアミノ酸を含み得る場合には、その位置は例えば：１７０と示され
る。

【００２６】もとのアミノ酸（単数または複数）および／または置換アミノ酸（単数または
複数）が１つより多いがしかし全てというわけではないアミノ酸（単数または複
数）を含み得る場合には、選定アミノ酸は括弧の内側に示される：もとのアミノ酸位置{置換アミノ酸₁、・・・・・、置換アミノ酸_n ｝特定の変異体に関しては、任意のアミノ酸残基を示すために特定の三または一
文字表記、例えば表記ＸａａおよびＸが用いられる。

【００２７】置換：位置１９５におけるグリシンに代わるグルタミン酸の置換は以下のように示さ
れ：Ｇｌｙ１９５ＧｌｕまたはＧ１９５Ｅあるいは位置１９５におけるグリシンに代わる任意のアミノ酸残基の置換は以下
のように示される：Ｇｌｙ１９５ＸａａまたはＧ１９５ＸあるいはＧｌｙ１９５またはＧ１９５。

【００２８】したがって位置１７０における任意のアミノ酸残基に代わるセリンの置換は、
以下のように示される：Ｘａａ１７０ＳｅｒまたはＸ１７０Ｓあるいは１７０Ｓｅｒまたは１７０Ｓ。

【００２９】このような表示法は、同種ズブチラーゼにおける修飾（単数または複数）に関
連して特に当てはまる（下記を参照）。したがって１７０Ｓｅｒは、例えばBASB
PNにおけるＬｙｓ１７０Ｓｅｒ修飾およびBLSAVIにおけるＡｒｇ１７０Ｓｅｒ修
飾の両方を含むことを意味する（図１を参照）。

【００３０】もとのアミノ酸（単数または複数）および／または置換アミノ酸（単数または
複数）が１つより多いがしかし全てではないアミノ酸（単数または複数）を含み
得る修飾に関しては、位置１７０におけるアルギニンに代わるグリシン、アラニ
ン、セリンまたはトレオニンの置換は、以下のように示されて：Ａｒｇ１７０{Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ}またはＲ１７０{Ｇ、Ａ、
Ｓ、Ｔ}、以下の変異体を示す：Ｒ１７０Ｇ、Ｒ１７０Ａ、Ｒ１７０ＳおよびＲ１７０Ｔ。

【００３１】欠失：位置１９５におけるグリシンの欠失は、以下により示される：Ｇｌｙ１９５^*またはＧ１９５^*。

【００３２】同様に、１つより多いアミノ酸残基の欠失、例えば位置１９５および１９６に
おけるグリシンおよびロイシンの欠失は、以下のように示される：Ｇｌｙ１９５^*＋Ｌｅｕ１９６^*またはＧ１９５^*＋Ｌ１９６^*。

【００３３】挿入：Ｇ１９５後の追加のアミノ酸残基、例えばリシンの挿入は、以下により示され
る：Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓまたはＧ１９５ＧＫ、あるいはＧ１９５後に１つより多いアミノ酸残基、例えばＬｙｓ、Ａｌａおよび
Ｓｅｒが挿入される場合、これは以下のように示される：Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａＳｅｒまたはＧ１９５ＧＫＡＳ（配列番号
１）。

【００３４】このような場合、挿入アミノ酸残基（単数または複数）は、挿入アミノ酸残基
（単数または複数）に先行するアミノ酸残基の位置番号への小文字の付加により
ナンバリングされる。前記の例において、配列１９４〜１９６はしたがって以下
のようである：１９４１９５１９６ BLSAVI Ａ − Ｇ − Ｌ１９４１９５１９５ａ１９５ｂ１９５ｃ１９６変異体Ａ − Ｇ − Ｋ − Ａ− Ｓ− Ｌ（配列番号１
６）既存のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基が挿入される場合、命名法における
縮重が起こることは明らかである。例えば前記の例におけるグリシンの後にグリ
シンが挿入される場合、これはＧ１９５ＧＧにより示される。同一の実際の変化
は全く同様に、以下の：１９４１９５１９６ BLSAVI Ａ − Ｇ − Ｌから、１９４１９５１９５ａ１９６変異体Ａ − Ｇ − Ｇ − Ｌ（配列番号２７）１９４１９４ａ１９５１９６への変化に関してＡ１９４ＡＧとして示され得る。

【００３５】このような例は当業者には明らかであり、表示Ｇ１９５ＧＧおよびこの型の挿
入に関する対応する表示は、したがって、このような等価の縮退表示を含むこと
を意味する。

【００３６】ギャップの埋め：酵素における欠失が、ナンバリングのために用いられるズブチリシンＢＰＮ‘
配列との参照比較において存在する場合、このような位置での挿入は、位置３６
におけるアスパラギン酸の挿入に関しては以下のように示される： ^*３６Ａｓｐまたは^*３６Ｄ。

【００３７】多重修飾：多重修飾を含む変異体は、例えば以下のように＋により分離され：Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５ＧｌｕまたはＲ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅこれは位置１７０および１９５においてそれぞれアルギニンおよびグリシンに代
えてチロシンおよびグルタミン酸を置換する修飾を表す。

【００３８】したがってＴｙｒ１６７｛Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ｝＋Ａｒｇ１７０
｛Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ｝は、以下の変異体を示す：

【００３９】

【表１】

【００４０】この命名法は、特定の共通特性を有するアミノ酸残基、例えば正荷電（Ｋ、Ｒ
、Ｈ）、負荷電（Ｄ、Ｅ）の残基を置換、取替え、挿入または欠失するのを目指
した修飾、あるいは小アミノ酸を別の小アミノ酸に置換することを意味する、例
えばＴｙ１６７｛Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ｝＋Ａｒｇ１７０｛Ｇｌｙ、
Ａｌａ“、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ｝の保存的アミノ酸修飾（単数または複数）に関して
特に当てはまる。さらなる詳細に関しては、「本発明の詳細な説明」の節を参照
されたい。

【００４１】プロテアーゼタンパク質基質におけるアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼまたは（
互換可能的に）ペプチダーゼと分類される（Walsh, 1979, Enzymatic Reaction
Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Fransisco, Chapter 3参照）。

【００４２】アミノ酸位置／残基のナンバリング別記しない限り、本明細書中で用いられるアミノ酸ナンバリングはズブチラー
ゼＢＰＮ‘（BASBPN）配列のナンバリングに対応する。ＢＰＮ’配列をさらなる
説明のためには、図１またはSiezen et al., Protein Engng. 4(1991) 719-737
を参照されたい。

【００４３】セリンプロテアーゼセリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、活性部位に必須セ
リン残基が存在する酵素である（White, Handler and Smith, 1973 “Principle
s of Biochemistry,” Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 27
1-272）。

【００４４】細菌セリンプロテアーゼは、20,000〜45,000ダルトン範囲の分子量を有する。
それらはジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは単純
な末端エステルを加水分解し、真核生物キモトリプシン（これもセリンプロテア
ーゼの１つである）と活性が類似している。さらに範囲を狭めた用語であり、亜
群を包含するアルカリ性プロテアーゼは、いくつかのセリンプロテアーゼの高ｐ
Ｈ最適条件を反映する（Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753参照
）。

【００４５】ズブチラーゼズブチラーゼと仮に呼ばれるセリンプロテアーゼの一亜群が、Siezen et al.,
Protein Engng. 4 (1991) 719-737およびSiezen et al. Protein Science 6 (1
997) 501-523により提唱されている。それらは、ズブチリシン様プロテアーゼと
従来は呼ばれたセリンプロテアーゼの170より多いアミノ酸配列の相同性分析に
より限定される。ズブチリシンは、従来はしばしば、グラム陽性細菌または真菌
により産生されるセリンプロテアーゼと定義され、そしてSiezen等によれば、現
在は、ズブチラーゼの一亜群である。広範な種々のズブチラーゼが同定されてお
り、多数のズブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。このようなズブチラ
ーゼおよびそれらのアミノ酸配列のさらに詳細な説明に関しては、Siezen et al
.（1997）を参照されたい。

【００４６】ズブチラーゼの一亜群であるＩ−Ｓ１または「真の」ズブチリシンは、「古典
的」ズブチリシン、例えばズブチリシン１６８（BSS168）、ズブチリシンＢＰＮ
‘（配列番号３８）、ズブチリシンCarlsberg（アルカラーゼ（登録商標）、NOV
O NORDISK A/S）およびズブチリシンＤＹ（BSSDY）を含む。

【００４７】ズブチラーゼのさらに別の亜群であるＩ−Ｓ２または高アルカリ性ズブチリシ
ンは、Siezen等（上記）により認識されている。亜群Ｉ−Ｓ２プロテアーゼは高
アルカリ性ズブチリシンとして記載されており、ズブチリシンＰＢ９２（BAALKP
）（マキサカル（登録商標）、Gist-Brocades NV）、ズブチリシン３０９（配列
番号４９）（サビナーゼ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）、ズブチリシン１４
７（BLS147）（エスペラーゼ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）およびアルカリ
性エラスターゼＹａＢ（BSEYAB）のような酵素を含む。

【００４８】「サビナーゼ（登録商標）」サビナーゼ（登録商標）は、NOVO NORDISK A/Sにより市販されている。それは
B. Lentusからのズブチリシン３０９であり、１つの位置においてのみBAALKPと
異なる（Ｎ８７Ｓ、本明細書中の図１参照）。サビナーゼ（登録商標）は、図１
においてｂ)で示された、そして配列番号４９で示されるようなアミノ酸配列を
有する。

【００４９】親ズブチラーゼ「親ズブチラーゼ」という用語は、Siezen等（1991および1997）により定義さ
れたズブチラーゼを意味する。さらなる詳細に関しては、すぐ上の「ズブチラー
ゼ」の説明を参照されたい。親ズブチラーゼは天然供給源から単離されたズブチ
ラーゼでもあり得るが、この場合、ズブチラーゼの特徴を保持しながら、その後
の修飾がなされてきた。さらに親ズブチラーゼは、J.E. Ness et al., Nature B
iotechnology, 17, 893-896(1999)に記載されているようなＤＮＡシャッフリン
グ技法により調製されてきた。あるいは「親ズブチラーゼ」という用語は、「野
生型ズブチラーゼ」と呼ばれ得る。

【００５０】ズブチラーゼ変異体の修飾（単数または複数）本明細書中で用いられる「修飾（単数または複数）」という用語は、ズブチラ
ーゼの化学的修飾、ならびにズブチラーゼをコードするＤＮＡの遺伝子操作を含
むよう定義される。修飾（単数または複数）は、アミノ酸側鎖（単数または複数
）の取替え、当該アミノ酸（単数または複数）中のまたはそこでの置換（単数ま
たは複数）、欠失（単数または複数）および／または挿入であり得る。

【００５１】ズブチラーゼ変異体本発明の情況において、ズブチラーゼ変異体または突然変異化ズブチラーゼと
いう用語は、もとのまたは親遺伝子を保有し、対応する親酵素を産生する親微生
物由来の突然変異体遺伝子を発現中の生物体により産生されたズブチラーゼを意
味し、親遺伝子は、前記の突然変異化ズブチラーゼプロテアーゼが適切な宿主中
で発現される場合に産生される突然変異体遺伝子を産生するために、突然変異化
されている。

【００５２】相同ズブチラーゼ配列特定の活性部位ループ領域およびサビナーゼ（登録商標）ズブチラーゼの前記
のループ中のアミノ酸挿入は、本発明のズブチラーゼ変異体を得るために本明細
書中の修飾に関して同定される。

【００５３】しかしながら本発明はこの特定のズブチラーゼの修飾に限定されないが、しか
しサビナーゼ（登録商標）との相同一次構造を有するその他の親（野生型）ズブ
チラーゼに及ぶ。２つのアミノ酸配列間の相同は、この情況においては、パラメ
ーター「同一性」により説明される。

【００５４】２つのズブチラーゼ間の同一性の程度を確定するために、ＧＣＧパッケージバ
ージョン9.1のＧＡＰルーチンが、同一設定を用いて適用され得る（下記）。ル
ーチンからの出力は、アミノ酸アラインメントの他に、２つの配列間の「同一性
パーセント」の算定である。

【００５５】この説明に基づいて、当業者が適切な相同ズブチラーゼおよび本発明により修
飾され得る対応する相同活性部位ループ領域を同定することはルーチンである。

【００５６】単離ＤＮＡ配列「単離された」という用語は、ＤＮＡ配列分子に適用される場合、ＤＮＡ配列
がその天然遺伝子環境から除去されており、したがってその他の外来のまたは望
ましくないコード配列を含有せず、遺伝子工学処理タンパク質産生系内での使用
に適した形態である。このような単離分子はそれらの天然環境から分離されたも
のであり、それらの例としては、ｃＤＮＡおよびゲノムクローンが挙げられる。
本発明の単離ＤＮＡ分子は、それらが普通は会合されないその他の遺伝子を含有
しないが、しかし天然５‘および３’非翻訳化領域、例えばプロモーターおよび
ターミネーターを含み得る。会合領域の同定は、当業者には明らかである（例え
ば、Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985参照）。「単離ＤＮＡ配列」と
いう用語は、択一的に「クローン化ＤＮＡ配列」と呼ばれ得る。

【００５７】単離タンパク質タンパク質に適用される場合、「単離された」という用語は、タンパク質がそ
のネイティブ環境から除去されていることを示す。

【００５８】好ましい形態では、単離タンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパ
ク質（即ち、「同種不純物」）を実質的に含有しない。

【００５９】単離タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確定した場合、純度が10％より高
い、好ましくは20％より高い、さらに好ましくは30％より高い。さらに、高精製
形態で、即ちＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確定した場合に、40％より高い純度で、60
％より高い純度で、80％より高い純度で、さらに好ましくは95％より高い純度で
、最も好ましくは99％より高い純度でタンパク質を提供するのが好ましい。

【００６０】「単離タンパク質」という用語は、択一的に「精製タンパク質」と呼ばれ得る
。

【００６１】同種不純物「同種不純物」という用語は、本発明のズブチラーゼが最初は得られる同種細
胞から生じる任意の不純物（例えば本発明のズブチラーゼとは別のポリペプチド
）を意味する。

【００６２】〜から得られる「〜から得られる」という用語は、特定の微生物供給源と結び付けて本明細書
中で用いる場合、特定供給源により、または供給源からの遺伝子が挿入されてい
た細胞によりポリヌクレオチドおよび／またはズブチラーゼが産生されることを
意味する。

【００６３】基質プロテアーゼに対する基質と結びつけて用いられる「基質」という用語は、そ
の最も広い形態において、ズブチリシンプロテアーゼによる加水分解を受け易い
少なくとも１つのペプチド結合を含有する化合物を含むと解釈されるべきである
。

【００６４】生成物プロテアーゼ酵素反応から得られる生成物と結び付けて用いられる「生成物」
という用語は、本発明の情況においては、ズブチラーゼプロテアーゼを包含する
加水分解反応の生成物を含むと解釈されるべきである。生成物は、その後の加水
分解反応における基質であり得る。

【００６５】洗浄性能本発明の情況においては、「洗浄性能」という用語は、例えば洗浄または硬質
表面清浄化中に清浄にされる対象物上に存在する卵の染みを除去する酵素の能力
として用いられる。本明細書中の実施例３中の「モデル洗剤洗浄性能試験」も参
照されたい。

【００６６】性能係数「性能係数」という用語は、以下の式に関して定義される：Ｐ＝Ｒ（変異体）−Ｒ（親）（式中、Ｐは性能係数であり、Ｒ（変異体）は「モデル洗剤洗浄性能試験」に記
載されたようなズブチラーゼ変異体で処理された後の被験物質の反射率（460 nm
で測定）であり、そしてＲ（親）は「モデル洗剤洗浄性能試験」に記載されたよ
うな対応する親ズブチラーゼで処理された後の被験物質の反射率（460 nmで測定
）である）。さらなる詳細に関しては、本明細書中の「モデル洗剤洗浄性能試験
」を参照されたい。

【００６７】残留活性「残留活性」という用語は、本明細書中の「卵抑制検定」に記載されているよ
うに定義される(実施例４参照)。

【００６８】本発明の詳細な説明本発明は、活性部位ループ（ｂ）領域が現在知られているものより長いズブチ
リシン変異体が、卵の染み除去に関して洗浄性能改良を示す、ということが判明
した。その同定は、親野生型酵素と比較してモデル洗剤組成物における洗浄性能
特性(卵の染みの除去に関して)改良を示すズブチリシン変異体、特にズブチリシ
ン３０９（BLSAVIまたはサビナーゼ（登録商標））の構築に際して成された。

【００６９】いかなる特定の理論にも限定されずに考えると、現在、作用改良は、ズブチラ
ーゼ変異体の活性部位ループ（ｂ）領域における卵白阻害剤の結合の妨害による
。これは次に、恐らくは、酵素のこの特定の部位における１つまたはそれ以上の
追加のアミノ酸残基の挿入のための活性部位ループ（ｂ）領域の構造変化のため
である。

【００７０】したがって本明細書中に記載された使用に適しているとして意図される変異体
は、野生型ズブチラーゼと比較した場合、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が
１つまたはそれ以上の以下の位置に挿入された変異体である：位置９５と９６の
間、位置９６と９７の間、位置９７と９８の間、位置９８と９９の間、位置９９
と１００の間、位置１００と１０１の間、位置１０１と１０２の間、位置１０２
と１０３の間、位置１０３と１０４の間およびそれらの組合せ。

【００７１】好ましくは挿入は、位置９７と９８の間、位置９８と９９の間、位置９９と１
００の間および／または位置１００と１０１の間、特に位置９８と９９の間およ
び位置９９と１００の間で成される。

【００７２】本発明の第一の局面のズブチラーゼ変異体は、天然物から同定され、単離され
た親または野生型ズブチラーゼであり得る。

【００７３】このような親野生型ズブチラーゼは、当業界で既知の標準技法により特異的に
スクリーニングされ得る。

【００７４】これを実行する好ましい一方法は、多数の異なる微生物、好ましくは異なるバ
シラス属菌株からのズブチラーゼ中の活性部位ループをコードすることが既知の
ＤＮＡ領域を特異的にＰＣＲ増幅することにより得る。

【００７５】ズブチラーゼは、それらのＤＮＡおよびアミノ酸配列が相同であるという意味
で、保存された酵素の一群である。したがって、活性部位ループにフランキング
する相対的に特異的なプライマーを構築することができる。

【００７６】これを実行する一方法は、異なるズブチラーゼのアラインメントを調べること
による(例えば、Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523参照)。それ
は、このルーチンの作業から、例えばBLSAVIからのような、Ｉ−Ｓ１またはＩ−
Ｓ２群のいずれかにおけるアミノ酸残基９５〜１０３間の活性部位ループ（ｂ）
に対応する活性部位ループにフランキングするＰＣＲプライマーを当業者が構築
することである。多数の異なる微生物、好ましくは異なるバシラス属菌株からの
ＤＮＡを増幅し、その後前記の増幅ＰＣＲ断片をＤＮＡシーケンシングするため
にこのようなＰＣＲプライマーを用いて、位置９５〜１０３までの活性部位ルー
プ領域に対応する、例えばBLSAVIと比較して長い活性部位領域を含むこれらの群
のズブチラーゼを産生する菌株を同定することができる。菌株およびこのような
注目のズブチラーゼの部分ＤＮＡ配列が同定されれば、このようなズブチラーゼ
のクローニング、発現および精製を当業者が完了することはルーチン作業である
。

【００７７】しかしながら本発明のズブチラーゼ変異体は主に親ズブチラーゼの変異体であ
るということが意図される。

【００７８】本明細書中に記載された使用に適したズブチラーゼ変異体は、当業界で既知の
標準技法により、例えば部位特異的／無作為突然変異誘発により、または異なる
ズブチラーゼ配列のＤＮＡシャッフリングにより構築され得る。さらなる詳細に
関しては、本明細書中の「材料と方法」の節(下記参照)を参照されたい。

【００７９】当業者により認められるように、本明細書中に記載された変異体は、位置９５
〜１０３までの少なくとも１つの挿入のほかに、少なくとも１つのさらに別の修
飾を含む。例えば変異体は、活性部位ループ（ｂ）領域に１つまたはそれ以上の
置換を、ならびに前記の領域の外側に１つまたはそれ以上の置換を含み得る。さ
らに変異体は、活性部位ループ（ｂ）領域の外側に１つまたはそれ以上のさらな
る挿入を含み得る。

【００８０】さらに、本明細書中に記載された領域における挿入は、１つより多いアミノ酸
残基の挿入を包含する。例えば本発明の変異体は、１つの挿入、２つの挿入また
は２つより多い挿入、例えば３、４または５つの挿入を含有し得る。

【００８１】本発明の好ましい実施態様では、以下の：位置９９における置換、位置１３３
における置換、位置１４３における置換、位置１６７における置換、位置１７０
における置換、位置１９４における置換、位置４２および４３間における挿入、
位置１２９および１３０間における挿入、位置２１６および２１７間における挿
入、位置２１７および２１８間における挿入ならびにそれらの組合せから成る群
から選択される位置において、さらなる修飾が実施される。

【００８２】本発明の興味深い実施態様において、追加のアミノ酸残基は位置９８および９
９間に挿入される（BASBPNナンバリング）。

【００８３】位置９８および９９間の挿入は、好ましくは以下の群から選択される（BASBPN
ナンバリングで）：

【００８４】

【表２】

【００８５】あるいはより特定的なズブチリシン３０９および密接に関連したズブチラーゼ、
例えばBAALKP、BLSUBLおよびBSKSMK：

【００８６】

【表３】

【００８７】さらに、位置９８および９９間の挿入がさらなる修飾と、即ち位置１３３〜１
４３におけるアミノ酸残基の置換、ならびに位置１６７、１７０および１９４に
おけるアミノ酸残基の置換と併有される、というのが目下好ましい。

【００８８】それぞれ位置１３３および１３４における（位置９８および９９間の挿入に加
えての）置換は、好ましくは以下のものから成る群から選択される：

【００８９】

【表４】

【００９０】好ましい実施態様では、位置１３３における置換は、Ｘ１３３｛Ｄ、Ｅ、Ｋ、
Ｒ｝、好ましくはＸ１３３ＤまたはＸ１３３Ｅ、特にＸ１３３Ｅからなる群から
選択される。

【００９１】別の好ましい実施態様では、位置１４３における置換は、Ｘ１４３｛Ｄ、Ｅ、
Ｋ、Ｒ｝、好ましくはＸ１４３ＫまたはＸ１４３Ｒ、特にＸ１４３Ｋから成る群
から選択される。

【００９２】好ましい変異体の一例は、以下の挿入および置換を含むズブチラーゼ変異体で
ある：Ｘ９８ＸＳ＋Ｘ１３３Ｅ＋Ｘ１４３Ｋ。特に好ましい変異体は、以下の挿
入および置換を含むサビナーゼ（登録商標）変異体である：Ａ９８ＡＳ＋Ａ１３
３Ｅ＋Ｔ１４３Ｋ。

【００９３】さらに、それぞれ位置１６７、１７０および１３４における(位置９８および
９９間の挿入のほかの)置換は、好ましくは以下のものから成る群から選択され
る：

【００９４】

【表５】

【００９５】好ましい実施態様では、位置１６７における置換は、Ｘ１６７｛Ａ、Ｔ、Ｇ、
Ｓ｝から成る群から選択され、特にＸ１６７Ａ；位置１７０における置換は、Ｘ１７０｛Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｓ｝から成る群から選択され、特にＸ
１７０Ｓ；そして位置１９４における置換は、Ｘ１９４｛Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、
Ｗ、Ｙ｝から成る群から選択され、特にＸ１９４Ｐである。

【００９６】好ましい変異体の一例は、以下の挿入および置換：Ｘ９８ＸＴ＋Ｘ１６７Ａ＋
Ｘ１７０Ｓ＋Ｘ１９４Ｐを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体
は、以下の挿入および置換：Ａ９８ＡＴ＋Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ａ１９４Ｐ
を含むサビナーゼ（登録商標）変異体である。

【００９７】本発明のさらに興味深い実施態様では、追加のアミノ酸残基は位置９９および
１００間に挿入される（BASBPNナンバリング）。

【００９８】位置９９および１００間の挿入は、好ましくは以下のものから成る群から選択
される（BASBPNナンバリングで）：

【００９９】

【表６】

【０１００】あるいはより特定的なズブチリシン３０９および密接に関連したズブチラーゼ
、例えばBAALKP、BLSUBLおよびBSKSMK：

【０１０１】

【表７】

【０１０２】位置９９および１００間の挿入に関しては、本発明の興味深い一実施態様にお
いては、挿入は位置９９における置換と併有されるのが好ましい。したがって、
意図された前記の挿入のほかに、位置９９における以下の置換が関連すると考え
られる：

【０１０３】

【表８】

【０１０４】好ましい実施態様では、位置９９における置換は、Ｘ９９｛Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｓ｝
、特にＸ９９ＡまたはＸ９９Ｔから成る群から選択される。

【０１０５】好ましい変異体の一例は、以下の挿入および置換：Ｘ９９ＸＤ＋Ｘ９９Ａまた
はＸ９９ＸＲ＋Ｘ９９Ｔを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体
は、以下の挿入および置換：Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ９９ＡまたはＳ９９ＳＲ＋Ｓ９９Ｔ
を含むサビナーゼ（登録商標）変異体である。

【０１０６】位置９９および１００間の挿入に関しては、本発明の別の興味深い実施態様に
おいては、挿入は位置２１６および２１７間の少なくとも１つのアミノ酸残基の
さらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前期の挿入の
ほかに、位置２１６および２１７間の以下の挿入が関連すると考えられる：

【０１０７】

【表９】

【０１０８】好ましい実施態様では、位置２１６および２１７間の挿入は、Ｘ２１６Ｘ｛Ｆ
、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｗ、Ｙ｝から成る群から選択され、特にＸ２１６ＸＰである
。

【０１０９】好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換：Ｘ９９ＸＤ＋Ｘ９９Ａ＋Ｘ２
１６ＸＰならびにＸ９９ＸＤ＋Ｘ９９Ａ＋Ｘ２１６ＸＤＰを含むズブチラーゼ変
異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換：Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ９
９Ａ＋Ｓ２１６ＳＰならびにＳ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａ＋Ｓ２１６ＳＤＰを含むサビ
ナーゼ（登録商標）変異体である。

【０１１０】位置９９および１００間の挿入に関しては、本発明のさらに別の興味深い実施
態様では、挿入は、位置２１７および２１８間の少なくとも１つのアミノ酸残基
のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入
のほかに、位置２１７および２１８間の以下の挿入が関連すると考えられる：

【０１１１】

【表１０】

【０１１２】好ましい実施態様では、位置２１７および２１８間の挿入は、Ｘ２１７Ｘ｛Ｆ
、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｗ、Ｙ｝から成る群から選択され、特にＸ２１７ＸＰである
。

【０１１３】好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換：Ｘ９９ＸＤ＋Ｘ９９Ａ＋Ｘ２
１７ＸＰならびにＸ９９ＸＤ＋Ｘ２１７ＸＰを含むズブチラーゼ変異体である。
特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換：Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａ＋Ｌ２１
７ＬＰならびにＳ９９ＳＤ＋Ｌ２１７Ｐを含むサビナーゼ（登録商標）変異体で
ある。

【０１１４】位置９９および１００間の挿入に関しては、本発明のさらに興味深い実施態様
においては、挿入は、位置４２および４３間の少なくとも１つのアミノ酸残基の
さらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入の
ほかに、位置４２および４３間の以下の挿入が関連すると考えられる：

【０１１５】

【表１１】

【０１１６】好ましい実施態様では、位置４２および４３間の挿入は、Ｘ４２Ｘ｛Ｈ、Ｖ、
Ｃ、Ｎ、Ｑ｝から成る群から選択され、特にＸ４２ＸＮである。

【０１１７】好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換：Ｘ９９ＸＤ＋Ｘ４２ＸＮなら
びにＸ９９ＸＤ＋Ｘ９９Ａ＋Ｘ４２ＸＮを含むズブチラーゼ変異体である。特に
好ましい変異体は、以下の挿入および置換：Ｓ９９ＳＤ＋Ｄ４２ＤＮならびにＳ
９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａ＋Ｄ４２ＤＮを含むサビナーゼ（登録商標）変異体である。

【０１１８】位置９９および１００間の挿入に関しては、本発明のさらに興味深い実施態様
においては、挿入は、位置１２９および１３０間の少なくとも１つのアミノ酸残
基のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿
入のほかに、位置１２９および１３０間の以下の挿入が関連すると考えられる：

【０１１９】

【表１２】

【０１２０】好ましい実施態様では、位置１２９および１３０間の挿入は、Ｘ１２９Ｘ｛Ｄ
、Ｅ、Ｋ、Ｒ｝から成る群から選択される。

【０１２１】好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換：Ｘ９９ＸＤ＋Ｘ１２９ＸＤな
らびにＸ９９ＸＤ＋Ｘ９９Ａ＋Ｘ１２９ＸＤを含むズブチラーゼ変異体である。
特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換：Ｓ９９ＳＤ＋Ｐ１２９ＰＤなら
びにＳ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａ＋Ｐ１２９ＰＤを含むサビナーゼ（登録商標）変異体
である。

【０１２２】あるアミノ酸残基の類似のアミノ酸残基へのいわゆる保存的置換は、酵素の特
徴の小変化のみを生じると予測されることは、当業者には周知である。

【０１２３】以下の表Ｉは、保存的アミノ酸置換の群を列挙する。

【０１２４】表Ｉ保存的アミノ酸置換一般特性アミノ酸塩基性（正荷電）Ｋ＝リシンＨ＝ヒスチジン酸性（負荷電）Ｅ＝グルタミン酸Ｄ＝アスパラギン酸極性Ｑ＝グルタミンＮ＝アスパラギン疎水性Ｌ＝ロイシンＩ＝イソロイシンＶ＝バリンＭ＝メチオニン芳香族Ｆ＝フェニルアラニンＷ＝トリプトファンＹ＝チロシン小Ｇ＝グリシンＡ＝アラニンＳ＝セリンＴ＝トレオニンこの原則によれば、保存的置換を含むズブチラーゼ変異体は、互いに徹底的に
は異ならない特徴を示すと予測される。

【０１２５】本明細書中に開示されたおよび／または例示されたズブチラーゼ変異体を基礎
にして、同様に改良された洗浄性能を示す他のズブチラーゼ変異体を得るために
、これらの変異体に対する適切な保存的修飾（単数または複数）を当業者が同定
するのは、ルーチン作業である。

【０１２６】構造分散性の天然または人工的作製から酵素を単離するために、そして親ズブ
チラーゼから変異体を設計および産生するためにも、親ズブチラーゼは亜群Ｉ−
Ｓ１およびＩ−Ｓ２、特に亜群Ｉ−Ｓ２に属するのが好ましい。

【０１２７】亜群Ｉ−Ｓ１からの変異体に関しては、BSS168（BSSAS、BSAPRJ、BSAPRN、BMS
AMP）、BASBPN、BSSDY、BLSCAR（BLKERA、BLSCA1、BLSCA2、BLSCA3）、BSSPRCお
よびBSSPRDまたは亜群Ｉ−Ｓ１の特徴を保有しているその機能的変異体からなる
群から親ズブチラーゼを選択するのが好ましい。

【０１２８】亜群Ｉ−Ｓ２からの変異体に関しては、BSAPRQ、BLS147（BSAPRM、BAH101）、
BLSAVI（BSKSMK、BAALKP、BLSUBL）、BYSYAB、BAPB92、TVTHERおよびBSAPRSまた
は亜群Ｉ−Ｓ２の特徴を保有しているその機能的変異体からなる群から親ズブチ
ラーゼを選択するのが好ましい。

【０１２９】特に親ズブチラーゼはBLSAVI（サビナーゼ（登録商標）、Novo Nordisk A/S）
であり、本発明の好ましいズブチラーゼ変異体はしたがって、サビナーゼ（登録
商標）の変異体である。したがって特に興味深い変異体は、サビナーゼ（登録商
標）変異体、即ちBLSAVI変異体であって、この場合、１．ＳｅＲが位置９８および９９間に挿入されており、位置１３３のＡｌａが
Ｇｌｕで置換されており、そして位置１４３のＴｈｒがＬｙｓで置換されている
（BASBPNナンバリング）か、あるいは２．Ａｓｐが位置９９および１００間に挿入されており、そして位置９９のＳ
ｅｒがＡｌａで置換されているか（BASBPNナンバリング）、あるいは３．Ｔｈｒが位置９８および９９間に挿入されており、位置１６７のＴｙｒが
Ａｌａで置換されており、位置１７０のＡｒｇがＳｅｒで置換されており、そし
て位置１９４のＡｌａがＰｒｏで置換されているか（BASBPNナンバリング）、あ
るいは４．Ａｓｐが位置９９および１００間に挿入されており、位置９９のＳｅｒが
Ａｌａで置換されており、そしてＰｒｏが位置２１７および２１８間に挿入され
ている（BASBPNナンバリング）。

【０１３０】５．Ａｓｐが位置９９および１００間に挿入されており、位置９９のＳｅｒが
Ａｌａで置換されており、そしてＰｒｏが位置２１６および２１７間に挿入され
ている（BASBPNナンバリング）。

【０１３１】６．Ａｓｐが位置９９および１００間に挿入されており、位置９９のＳｅｒが
Ａｌａで置換されており、そしてＡｓｐ−Ｐｒｏが位置２１６および２１７間に
挿入されている（BASBPNナンバリング）。

【０１３２】７．Ａｓｐが位置９９および１００間に挿入されており、位置９９のＳｅｒが
Ａｌａで置換されており、そしてＡｓｐが位置１２９および１３０間に挿入され
ている（BASBPNナンバリング）。

【０１３３】８．Ａｓｐが位置９９および１００間に挿入されており、そしてＡｓｎが位置
４２および４３間に挿入されている（BASBPNナンバリング）。

【０１３４】９．Ａｓｐが位置９９および１００間に挿入されており、位置９９のＳｅｒが
Ａｌａで置換されており、そしてＡｓｎが位置４２および４３間に挿入されてい
る（BASBPNナンバリング）。

【０１３５】１０．Ａｓｐが位置９９および１００間に挿入されており、位置９９のＳｅｒ
がＴｈｒで置換されている。

【０１３６】１１．Ａｓｐが位置９９および１００間に挿入されており、位置９９のＳｅｒ
がＡｌａで置換されており、そして位置１３１のＰｒｏがＴｈｒで置換されてい
る。

【０１３７】本発明は、前記のズブチラーゼ変異体のいずれかの、そのアミノ酸配列に対す
る任意のその他の修飾と組合せた使用も包含する。特に、改良された特性を酵素
に提供するための当業界で既知のその他の修飾との組合せが意図される。当業界
は異なる改良特性を有する多数のズブチラーゼ変異体を記載し、そしてそれらの
多くが本明細書中の「発明の背景」の節に記載されている（上記参照）。それら
の参考文献は、本明細書中に記載されたズブチラーゼ変異体と有益に併有され得
るズブチラーゼ変異体を同定するための参考文献として、本明細書に開示される
。

【０１３８】このような組合せは、位置：２２２（酸化安定性を改良する）、２１８（熱安
定性を改良する）、酵素を安定化するＣａ結合部位、例えば位置７６における置
換、ならびに従来技術から明らかな多数のその他のものを含む。

【０１３９】さらに別の実施態様では、本明細書中に記載されたズブチラーゼ変異体は、以
下の位置のいずれかにおける１つまたはそれ以上の修飾（単数または複数）と併
有され得る：

【０１４０】

【表１３】

【０１４１】特に以下のBLSAVI、BLSUBL、BSKSMKおよびBAALKP変異体は、組合せのために適
切であると考えられる：

【０１４２】

【表１４】

【０１４３】さらに、変異体Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ、Ｓ８７Ｎ＋Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ
、Ｋ２７Ｒ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｎ１２３Ｓ＋Ｔ２７４Ａ、Ｎ７６Ｄ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ
１０４ＩまたはＮ７６Ｄ＋Ｖ１０４Ａのいずれかあるいはこれらの突然変異（Ｖ
１０４Ｎ、Ｓ１０１Ｇ、Ｋ２７Ｒ、Ｖ１０４Ｙ、Ｎ１２３Ｓ、Ｔ２７４Ａ、Ｎ７
６Ｄ、Ｖ１０４Ａ）のその他の組合せ、あるいは前記の修飾（単数または複数）
のうちのいずれかひとつまたはそれ以上と組合せたＳ１０１Ｇ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ
１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｄ＋Ａ２３２Ｖ＋Ｑ２３６Ｈ＋Ｑ２４５Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｎ
２５２Ｋを含む変異体は、改良された特性を示す。

【０１４４】さらに本発明の主局面（単数または複数）のズブチラーゼ変異体は、好ましく
は位置１２９、１３１および１９４のいずれかにおける１つまたはそれ以上の修
飾（単数または複数）と、好ましくは１２９Ｋ、１３１Ｈおよび１９４Ｐ修飾と
して、最も好ましくはＰ１２９Ｋ、Ｐ１３１ＨおよびＡ１９４Ｐ修飾として併有
される。任意のそれらの修飾（単数または複数）は、それらの産生においてより
高い発現レベルのズブチラーゼ変異体を提供すると予測される。

【０１４５】前記のように、本明細書中に開示された変異体は、限定程度に、ＩＶ−０型ト
リプシン阻害剤により抑制されるだけであり、その結果、それらは卵の染みに及
ぼす優れた洗浄性能を示す。したがって、当業者に、開発作業の初期段階で、こ
の目的のための有効且つ好ましい変異体を選定させるために、本発明者は、問題
の変異体の性能を最初に査定するために、当業者により容易に実行され得る適切
な予備試験を提供した。

【０１４６】したがって、本明細書中の実施例４に開示された「卵抑制検定」は、選定の変
異体の能力を最初に査定するために用いられ得る。言い換えれば、「卵抑制検定
」は、ＩＶ−０型トリプシン阻害剤により、選定変異体が抑制され得るか否かな
らびにその程度を査定するために用いられ得る。この試験を用いて、卵の染みを
除去するための選定変異体の適格性が査定され得る。その論理的根拠は、選定変
異体がＩＶ−０型トリプシン阻害剤により強く抑制される場合には、それは普通
はさらなる試験的実験を実行する必要がないということである。

【０１４７】したがって、本明細書中に記載された使用のために特別に興味深い変異体は、
本明細書中の実施例４に記載された「卵抑制検定」で試験した場合に、少なくと
も10％、例えば少なくとも15％、例えば少なくとも20％、好ましくは少なくとも
25％、例えば少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも35％の残留活性を有
する変異体である。本発明の特に興味深い実施態様では、変異体は、本明細書中
の実施例４に記載された「卵抑制検定」で試験した場合に、少なくとも40％、例
えば少なくとも45％、例えば少なくとも50％、好ましくは少なくとも55％、例え
ば少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも65％、例えば少なくとも70％、
さらに好ましくは少なくとも75％、例えば少なくとも80％、例えば少なくとも90
％の残留活性を有する。

【０１４８】明らかに、本発明の変異体は、少なくとも記述された最低レベルに関して、さ
らに好ましくは記述された中間レベルで、最も好ましくは記述された最高レベル
に関して、前記の判定基準を満たすのが好ましい。

【０１４９】択一的に、または前記の検定に加えて、選定変異体の適格性は、本明細書中の
実施例３に開示された「モデル洗剤洗浄性能試験」で試験され得る。「モデル洗
剤洗浄性能試験」は、標準洗剤組成物中に混入された場合に、参照系、即ち親ズ
ブチラーゼ（同一モデル洗剤系に混入され、同一条件下で試験される）と比較し
て、標準テキスタイルから卵の染みを除去する変異体の能力を査定するために用
いられ得る。この試験を用いて、卵の染みを除去するための選定変異体の適格性
が最初に検査され得る。その論理的根拠は、選定変異体が親ズブチラーゼと比較
される試験において有意の改良を示さない場合、それは普通はさらなる試験的実
験を実行する必要がないということである。

【０１５０】したがって本明細書中に記載された使用のために特別に興味深い変異体は、本
明細書中の実施例３に開示された「モデル洗剤洗浄性能試験」に記載されたよう
な以下の： 6.2％ＬＡＳ（ナンサ８０Ｓ） 2％Ｃ₁₆〜Ｃ₁₈の脂肪酸のナトリウム塩 4％非イオン性界面活性剤（プルラファックスＬＦ４０４） 22％ゼオライトＰ 10.5％Ｎａ₂ＣＯ₃ 4％Ｎａ₂Ｓｉ₂Ｏ₅ 2％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ） 6.8％アクリレート液ＣＰ５ 40％ 20％過ホウ酸ナトリウム（実験式ＮａＢＯ₂・Ｈ₂Ｏ₂） 0.2％ＥＤＴＡ 21％Ｎａ₂ＳＯ₄ 水（残余量）を含むモデル洗剤組成物で試験した場合に、同一条件下で試験された親ズブチラ
ーゼと比較して、卵の染みに及ぼす洗浄性能の改良を示すような変異体である。

【０１５１】洗浄性能における改良は、本明細書中の実施例３で定義されたいわゆる「性能
係数」を用いることにより定量され得る。

【０１５２】本発明の非常に興味深い実施態様では、本発明の変異体は、「洗浄性能試験」
で試験した場合、少なくとも1、例えば少なくとも1.5、例えば少なくとも2、好
ましくは少なくとも2.5、例えば少なくとも3、例えば少なくとも3.5、特に少な
くとも4、例えば少なくとも4.5、例えば少なくとも5つの性能係数を有する。

【０１５３】明らかに、本発明の変異体は、少なくとも記述された最低レベルに関して、さ
らに好ましくは記述された中間レベルで、最も好ましくは記述された最高レベル
に関して、前記の判定基準を満たすのが好ましい。

【０１５４】前記のように、本発明は新規のズブチラーゼ変異体も提供する。本発明の新規
のズブチラーゼ変異体局面に関する詳細および明細は、本発明の使用局面と結び
つけて前記された変異体の詳細および明細と同一であるかまたは類似する。これ
は、適切な場合はいつでも、本明細書中で詳細に考察された使用（例えば好まし
い挿入および置換等）に関する記述は、必要な変更を加えて、本発明の新規のズ
ブチラーゼ変異体に、ならびに本発明の方法局面に、そして清浄用および洗剤組
成物局面に適用する。

【０１５５】ズブチラーゼ変異体の産生ズブチラーゼをクローニングするための、ならびに遺伝子（例えばズブチラー
ゼ遺伝子）中への挿入を導入するための多数の方法は、当業界で周知である（「
発明の背景」の節で引用された参考文献を比較されたい）。

【０１５６】概して、遺伝子のクローニングおよび前記遺伝子中への挿入（無作為および／
または部位特異的）の導入のための標準手法は、本発明のズブチラーゼ変異体を
生成するために用いられ得る。適切な技法のさらなる説明に関しては、本明細書
中の実施例（下記参照）、ならびにSambrook et al.(1989) Molecular cloning:
A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Au
subel, F.M. et al.(eds.) “Current protocols in Molecular Biology”, Joh
n Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) “Molecu
lar Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990およびWO
96/34946を参照されたい。

【０１５７】さらにズブチラーゼ変異体は、多彩性の人工的作製のための標準技法により、
例えば異なるズブチラーゼ遺伝子のＤＮＡシャッフリングにより構築され得る（
WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370: 389-91 (1994)）。例えばサビナーゼ
（登録商標）の活性部位（ｂ）ループより長い活性部位（ｂ）ループ領域を含む
ことが天然で同定された１つまたはそれ以上の部分ズブチラーゼ配列を有するサ
ビナーゼ（登録商標）をコードする遺伝子のＤＮＡシャッフリングは、改良型洗
浄性能変異体に関するその後のスクリーニング後に、本明細書中に記載された目
的に適したズブチラーゼ変異体を提供する。

【０１５８】発現ベクター本発明の酵素をコードするＤＮＡ構築物を含む組換え発現ベクターは、組換え
ＤＮＡ法を便利に施され得る任意のベクターであり得る。ベクターの選択はしば
しば、それが導入される宿主細胞に依存する。したがってベクターは、自律的複
製ベクター、即ち染色体外存在物として存在し、その複製が染色体複製とは無関
係なベクター、例えばプラスミドであり得る。

【０１５９】あるいはベクターは、宿主細胞中への導入時に、一部分またはその全体を宿主
細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体（単数または複数）と一
緒に複製されるものであり得る。

【０１６０】ベクターは、好ましくはその中で本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列が、Ｄ
ＮＡの転写に必要とされる追加のセグメントと操作可能的に連結される発現ベク
ターである。概して発現ベクターはプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来し、
あるいは両方の素子を含有し得る。「操作可能的に連結される」という用語は、
セグメントが、それらの意図された目的と共同して機能するよう、例えば転写が
プロモーターで開始して、酵素をコードするＤＮＡ配列を介して進行するよう整
列されることを示す。

【０１６１】プロモーターは、選定宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得
るし、そして宿主細胞と同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来
し得る。

【０１６２】細菌宿主細胞中での使用のための適切なプロモーターの例としては、バシラス
属のBacillus stearothermophilusマルトゲン性アミラーゼ遺伝子、Bacillus li
cheniformisα−アミラーゼ遺伝子、デンプン液化バシラスBacillus amylolique
faciensα−アミラーゼ遺伝子、枯草菌Bacillus subtilusアルカリ性プロテアー
ゼ遺伝子またはBacillus pumilusキシロシダーゼ遺伝子、あるいはラムダファー
ジＰ_RまたはＰ_Lプロモーター、あるいは大腸菌lac、trpまたはtacプロモーター
が挙げられる。

【０１６３】本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は、必要な場合、適切なターミネーター
とも操作可能的に連結され得る。

【０１６４】本発明の組換えベクターは、当該宿主細胞中でベクターを複製させるＤＮＡ配
列をさらに含み得る。

【０１６５】ベクターは、選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞中の欠陥を補足す
る遺伝子、または例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシ
ン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン等のような抗生物質に対する耐性、
あるいは重金属または除草剤に対する耐性をコードする遺伝子も含み得る。

【０１６６】宿主細胞の分泌経路に本発明の酵素を向けるために、分泌シグナル配列（リー
ダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られている）が組換えベクタ
ー中に提供される。分泌シグナル配列は、的確なリーディングフレーム中で酵素
をコードするＤＮＡ配列と接合される。分泌シグナル配列は一般に、酵素をコー
ドするＤＮＡ配列に対して５‘に置かれる。分泌シグナル配列は、普通は酵素と
会合するものであり得るし、あるいは別の分泌タンパク質をコードする遺伝子か
らであり得る。

【０１６７】それぞれ本発明の酵素、プロモーターおよび任意にターミネーターおよび／ま
たは分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を結繋するために、あるいは適切
なＰＣＲ増幅計画によりこれらの配列を集合するために、そして複製または組込
みに必要な情報を含有する適切なベクター中にそれらを挿入するために用いられ
る手法は、当業者には周知である（例えば、Sambrook et al.前記引用を比較さ
れたい）。

【０１６８】宿主細胞宿主細胞中に導入される本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は、当該宿主に
対して同種または異種であり得る。宿主細胞に対して同種である、即ち、天然に
宿主細胞により産生される場合、それは典型的には別のプロモーター配列と操作
可能的に連結され、あるいは適切な場合には、その天然環境におけるのとは違う
別の分泌シグナル配列および／またはターミネーター配列と操作可能的に連結さ
れる。「同種の」という用語は、当該宿主生物体にとって天然である酵素をコー
ドするＤＮＡ配列を含むよう意図される。「異種の」という用語は、天然で宿主
により発現されないＤＮＡ配列を含むよう意図される。したがってＤＮＡ配列は
別の生物体からであり得るし、あるいはそれは合成配列であり得る。

【０１６９】その中に本発明のＤＮＡ構築物または組換えベクターが導入される宿主細胞は
、本発明の酵素を産生し得る任意の細胞であり、その例としては、細菌、酵母、
真菌および高等真核生物細胞、例えば植物が挙げられる。

【０１７０】培養時に本発明の酵素を産生し得る細菌宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例
えばバシラス属の菌株、例えば枯草菌B. subtilus、B. licheniformis、B. lent
us、短バシラスB. brevis、B. stearothermophilus、B. alkalophilus、デンプ
ン液化バシラスB. amyloliquefaciens、B. coagulans、B. circulans、B. lautu
s、巨大菌B. megatheriumまたはB. thuringiensis、あるいはストレプトミセス
属の菌株、例えばS. lividansまたはS. murinus、あるいはグラム陰性細菌、例
えば大腸菌である。

【０１７１】細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔、接合により、あるい
はそれ自体既知の方法でコンピテント細胞を用いることにより実行され得る（Sa
mbrook et al.上記を比較されたい）。

【０１７２】細菌、例えば大腸菌中で酵素を発現する場合、酵素は典型的には不溶性顆粒（
封入体として既知である）として細胞質中に保持され得るし、あるいは細菌分泌
配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒は回
収されて、変性され、その後、変性剤を希釈することにより酵素は構造復元され
る。後者の場合には、細胞を粉砕することにより、例えば音波処理または浸透圧
ショックにより酵素を細胞周辺腔から回収して、細胞周辺腔の内容物を放出し、
酵素を回収し得る。

【０１７３】グラム陽性細菌、例えばバシラス属またはストレプトミセス属菌株中で酵素を
発現する場合、酵素は細胞質中に保持され得るし、あるいは細菌分泌配列により
細胞外培地に向けられる。後者の場合、酵素は下記のように培地から回収され得
る。

【０１７４】ズブチラーゼ変異体の産生方法本発明は、本発明の単離酵素の産生方法であって、酵素をコードするＤＮＡ配
列で形質転換された適切な宿主細胞が酵素の産生を可能にする条件下で培養され
、その結果生じた酵素が培養から回収される方法を提供する。

【０１７５】酵素をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターが異種宿主中で形質転換され
る場合、本発明の酵素の異種組換え体産生を可能にし得る。

【０１７６】それにより、同種不純物を含有しないことを特徴とする高度精製ズブチラーゼ
組成物を製造することができる。

【０１７７】この情況では、同種不純物は、本発明の酵素が本来得られる同種細胞から生じ
るあらゆる不純物（例えば本発明の酵素以外の他のポリペプチド）を意味する。

【０１７８】形質転換化宿主細胞を培養するために用いられる培地は、当該宿主細胞を増殖
するのに適した任意の慣用的培地であり得る。発現ズブチラーゼは、培地中に分
泌されるのが便利であり、周知の手法により、例えば遠心分離または濾過により
培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質様
構成成分を沈殿し、その後、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィー処理することにより、そ
こから回収される。

【０１７９】清浄用および洗剤組成物概して、清浄用および洗剤組成物は当業界で十分記載されており、適切な清浄
用および洗剤組成物のさらなる説明に関しては、WO 96/34946; WO 97/07202; WO
95/30011を参照されたい。

【０１８０】さらに本明細書中の実施例は、多数のズブチラーゼ変異体に関する卵の染みに
及ぼす洗浄性能における改良を立証する。

【０１８１】洗剤組成物ズブチラーゼ変異体は、付加され、したがって洗剤組成物の一構成成分になり
得る。

【０１８２】本発明の洗剤組成物は、例えば手洗いまたは機械洗い洗濯用洗剤組成物、例え
ば汚れた布帛の前処理に適した洗濯用添加剤組成物およびリンス付加布帛柔軟剤
組成物として処方され得るし、あるいは一般家庭硬質表面清浄作業における使用
のための洗剤組成物として処方され、あるいは手洗いまたは機械食器洗浄作業の
ために処方され得る。

【０１８３】特定の局面において、本発明は、本発明のズブチラーゼ酵素を含む洗剤添加剤
を提供する。洗剤添加剤ならびに洗剤組成物は、１つまたはそれ以上の他の酵素
、例えば別のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラ
ーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ
、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼおよび／またはペルオキシダ
ーゼを含み得る。

【０１８４】概して、選択される酵素（単数または複数）の特性は、選定洗剤と相溶性であ
り（即ち、ｐＨ−最適条件、他の酵素および非酵素成分との相溶性等）、そして
酵素（単数または複数）は有効量で存在すべきである。

【０１８５】プロテアーゼ：適切なプロテアーゼとしては、動物、植物または微生物起源の
ものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学的修飾化またはタンパク質工学
処理突然変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタ
ロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様
プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリシン、特に
バシラス属から得られるもの、例えばズブチリシンNovo、ズブチリシンCarlsber
g、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７およびズブチリシン１６８である
（WO 89/06279に記載）。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例え
ばブタまたはウシ起源の）およびWO 89/06270およびWO 94/25583に記載されたフ
ザリウム属プロテアーゼである。

【０１８６】有用なプロテアーゼの例は、WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116およびW
O 98/34946に記載された変異体、特に以下の位置：２７、３６、５７、７６、８
７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６
、２１８、２２２、２２４、２３５および２７４のうちの１つまたはそれ以上に
おける置換を有する変異体である。

【０１８７】好ましい市販プロテアーゼ酵素としては、アルカラーゼ^TM、サビナーゼ^TM、プ
リマーゼ^TM、デュラナーゼ^TM、エスペラーゼ^TMおよびカンナーゼ^TM（Novo Nordi
sk A/S）、マキサターゼ^TM、マキサカル^TM、マキサペム^TM、プロペラーゼ^TM、プ
ラフェクト^TM、プラフェクトＯｘＰ^TM、ＦＮ２^TMおよびＦＮ３^TM（Genencor Int
ernational Inc.）が挙げられる。

【０１８８】リパーゼ：適切なリパーゼとしては、細菌または真菌起源のものが挙げられる
。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。有用なリパ
ーゼの例としては、フミコラ属（サーモミセス属と同義語）からの、例えば欧州
特許第258 068号および欧州特許第305 216号に記載されているようなH. lanugin
osa（T. lanuginosus）からの、またはWO 96/13580に記載されているようなH. i
nsolensからのリパーゼ、シュードモナス属リパーゼ、例えばP. alcaligenesま
たはP. pseudoalcaligenes（欧州特許第218 272号）、P. cepacia（欧州特許第3
31 376号）、P. stutzeri（英国特許第1,372,034号）、P. fluorescens、シュー
ドモナス種菌株ＳＤ７０５（WO 95/06720およびWO 96/27002）、P. wisconsinen
sis（WO 96/12012）からのリパーゼ、バシラス属リパーゼ、例えば枯草菌B. sub
tilus（Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-3
60）、B. stearothermophilus（JP 64/744992）またはB. Pumilus（WO 91/16422
）からのリパーゼが挙げられる。

【０１８９】その他の例は、例えば、WO 92/05249WO 94/01541、欧州特許第407225号、欧州
特許第260 105号、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO
95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079およびWO 97/07202に記載されているもの
のようなリパーゼ変異体である。

【０１９０】好ましい市販リパーゼ酵素としては、リポラーゼ^TMおよびリポラーゼウルトラ ^TM （Novo Nordisk A/S）が挙げられる。

【０１９１】アミラーゼ：適切なアミラーゼ（αおよび／またはβ）としては、細菌または
真菌起源のものが挙げられる。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異
体が包含される。アミラーゼとしては、例えばバシラス属Bacillus、例えば英国
特許第号により詳細に記載されているB. licheniformisの特定菌株から得られる
α−アミラーゼが挙げられる。

【０１９２】有用なアミラーゼの例は、WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873およびWO9
7/43424に記載されている変異体、特に以下の位置：１５、２３、１０５、１０
６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９
７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０
８および４４４のうちの１つまたはそれ以上に置換を伴う変異体である。

【０１９３】市販アミラーゼは、デュラミル^TM、テルマミル^TM、フンガミル^TMおよびＢＡＮ ^TM （Novo Nordisk A/S）、ラピダーゼ^TMおよびプラスター^TM（Genencor Interna
tional Inc.）である。

【０１９４】セルラーゼ：適切なセルラーゼとしては、細菌または真菌起源のものが挙げら
れる。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。適切な
セルラーゼとしては、米国特許第4,435,307号、米国特許第5,648,263号、米国特
許第5,691,178号、米国特許第5,776,757号およびWO 89/09259に開示されている
バシラス属、シュードモナス属、フミコラ続、フザリウム属、チエラビア属、ア
クレモニウム属、からのセルラーゼ、例えばHumicola insolens、Myceliophthor
a thermophilaおよびFusarium oxysporumから産生される真菌セルラーゼが挙げ
られる。

【０１９５】特に適切なセルラーゼは、色保護利点を有するアルカリ性または中性セルラー
ゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第0 495 257号、欧州特許第0
531 372号、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940に記載されたセルラーゼ
である。その他の例は、例えばWO 94/07998、欧州特許第0 531 315号、米国特許
第5,457,046号、米国特許第5,686,593号、米国特許第5,763,254号、WO 95/24471
WO 98/12307PCT/DK98/00299に記載されたもののようなセルラーゼ変異体である
。

【０１９６】市販セルラーゼとしては、セルザイム^TMおよびカレザイム^TM（Novo Nordisk A
/S）、クラジナーゼ^TMおよびプラダックスＨＡ^TM（Genencor International Inc
.）ならびにＫＡＣ−５００（Ｂ）^TM（Kao Corporation）が挙げられる。

【０１９７】ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼと
しては、植物、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的修飾化またはタ
ンパク質工学処理突然変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例として
は、WO 93/24618、WO 95/10602およびWO 98/15257に記載されているもののよう
な、ヒトヨタケ属Coprinusからの、例えばC. cinereusからのペルオキシダーゼ
およびそれらの変異体が挙げられる。

【０１９８】市販ペルオキシダーゼとしては、ガードザイム^TM（Novo Nordisk A/S）が挙げ
られる。

【０１９９】洗剤酵素（単数または複数）は、１つまたはそれ以上の酵素を含有する別個の
添加剤を付加することにより、あるいはこれらの酵素の全てを含む併合添加剤を
付加することにより、洗剤組成物中に含入され得る。本発明の洗剤添加剤、即ち
別個の添加剤または併合添加剤は、例えば顆粒、液体、スラリー等として処方さ
れ得る。好ましい洗剤添加剤処方物は、顆粒、特に無粉塵性顆粒、液体、特に安
定化液、あるいはスラリーである。無粉塵性顆粒は、例えば米国特許第4,106,99
1号および第4,661,452号に開示されているように生成され、そして任意に、当業
界で既知の方法により被覆され得る。蝋質コーティング物質の例は、1000〜2000
0の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコー
ル、ＰＥＧ）；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノ
ール；アルコールが12〜20個の炭素原子を有し、15〜80エチレンオキシド単位が
存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；ならびに脂肪
酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による適用に適
した皮膜形成コーティング物質の例は、英国特許第1483591号に示されている。
液体酵素調製物は、確立された方法にしたがって、例えばポリオール、例えばプ
ロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を付加すること
により安定化され得る。保護酵素は、欧州特許第238,216号に開示された方法に
より調製され得る。

【０２００】本発明の洗剤組成物は、任意の便利な形態で、例えば棒、錠剤、粉末、顆粒、
ペーストまたは液体であり得る。液体洗剤は、水性で典型的には70％までの水お
よび0〜30％の有機溶媒を含有するか、または非水性あり得る。

【０２０１】洗剤組成物は、典型的には１つまたはそれ以上の界面活性剤を含み、それらは
非イオン性、例えば半極性および／または陰イオン性および／または陽イオン性
および／または両イオン性であり得る。界面活性剤は、典型的には0.1重量％〜6
0重量％のレベルで存在する。その中に含入される場合、洗剤は通常は約1％〜約
40％の陰イオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−
オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート
）、アルコールエトキシスルフェート、第二級アルカンスルホネート、α−スル
ホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−またはアルケニルコハク酸または石鹸を含
有する。

【０２０２】その中に含入される場合、洗剤は普通は、約0.2％〜40％の非イオン性界面活
性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、ア
ルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸
モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル
脂肪酸アミドまたはグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルカミ
ド」）を含有する。

【０２０３】洗剤は、0〜65％の洗剤ビルダーまたは錯生成剤、例えばゼオライト、ジホス
フェート、トリホスフェート、ホスホネート、カルボネート、シトレート、ニト
リロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル
またはアルケニルコハク酸、可溶性シリケートまたは層化シリケート（例えば、
ＳＫＳ−６（Hoechst））を含有し得る。

【０２０４】洗剤は、１つまたはそれ以上のポリマーを含み得る。例としては、カルボキシ
メチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、
ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビ
ニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイ
ン酸／アクリル酸コポリマー、ならびにラウリルメタクリレート／アクリル酸コ
ポリマーがある。

【０２０５】洗剤は、過酸生成漂白活性剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミンまたは
ノナノイルオキシベンゼンスルホネートと併合され得るＨ₂Ｏ₂供給源、例えばペ
ルボレートまたはペルカルボネートを含み得る漂白系を含有し得る。択一的に、
漂白系は、例えばアミド、イミドまたはスルホン型のペルオキシ酸を含み得る。

【０２０６】本発明の洗剤組成物の酵素（単数または複数）は、慣用的安定剤、例えばポリ
オール、例えばプロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコー
ル、乳酸またはホウ酸またはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステルまたは
フェニルホウ素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニルホウ素酸を付加すること
により安定化され、そして組成物は、例えばWO 92/19709およびWO 92/19708に記
載されたように処方され得る。

【０２０７】洗剤は、その他の慣用的洗剤成分、例えば布帛コンディショナー、例えば粘土
、起泡増進剤、石鹸泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ沈殿防止剤、汚れ再沈着防止剤
、染料、殺細菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇り抑制剤または香料も含有
し得る。

【０２０８】洗剤組成物中に、任意の酵素、特に本発明の酵素が、0.01〜100 mgの酵素タン
パク質／洗浄液１リットル、好ましくは0.05〜5 mgの酵素タンパク質／洗浄液１
リットル、特に0.1〜1 mgの酵素タンパク質／洗浄液１リットルに対応する量で
付加され得る、ということが目下意図される。

【０２０９】本発明の酵素は、WO 97/07202（この記載内容は、参照により本明細書中に含
まれる）に開示された洗剤処方物中に追加のに混入され得る。

【０２１０】本発明は、以下の実施例でさらに詳細に記載されるが、それらの実施例は、い
かなる点においても、特許請求されるような本発明の範囲を限定するよう意図さ
れない。

【０２１１】洗剤組成物において、省略構成成分表記は、以下の意味を有する：ＬＡＳ：線状Ｃ₁₂アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムＴＡＳ：獣脂アルキル硫酸ナトリウムＸＹＡＳ：Ｃ_1X〜Ｃ_1Yのアルキル硫酸ナトリウムＳＳ：式２−ブチルオクタン酸の第二級石鹸界面活性剤２５ＥＹ：平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合されるＣ₁₂〜Ｃ₁₅の主に
線状の第一級アルコール４５ＥＹ：平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合されるＣ₁₄〜Ｃ₁₅の主に
線状の第一級アルコールＸＹＥＺＳ：平均Ｚモルのエチレンオキシド／モルと縮合されるＣ_1X〜Ｃ _1Y のアルキル硫酸ナトリウム非イオン性：平均エトキシル化度3.8および平均プロポキシル化度4.5のＣ〜
Ｃの混合エトキシル化／プロポキシル化脂肪アルコール。プルラファックスＬＦ
４０４の商品名でBASF GmbHから販売されているＣＦＡＡ：Ｃ₁₂〜Ｃ₁₄のアルキルＮ−メチルグルカミドＴＦＡＡ：Ｃ₁₆〜Ｃ₁₈のアルキルＮ−メチルグルカミドシリケート：非晶質ケイ酸ナトリウム（ＳｉＯ₂：Ｎａ₂Ｏ比＝2.0）ＮａＳＫＳ−６：式δ−Ｎａ₂Ｓｉ₂Ｏ₅の結晶層化シリケートカルボネート：無水炭酸ナトリウムホスフェート：トリポリ燐酸ナトリウムＭＡ／ＡＡ：平均分子量約80,000の1:4マレイン酸／アクリル酸のコポリ
マーポリアクリレート：平均分子量8,000のポリアクリレートホモポリマー。
ＰＡ３０の商品名でBASF GmbHから販売されているゼオライトＡ： 1〜10μmの範囲の一次粒子サイズを有する式Ｎａ₁₂（Ａｌ
Ｏ₂ＳｉＯ₂）₁₂・２７ＨＯの水和アルミノケイ酸ナトリウムシトレート：クエン酸三ナトリウム二水和物シトリック：クエン酸ペルボレート：無水過ホウ酸ナトリウム一水和物漂白剤。実験式ＮａＢＯ ₂ ・Ｈ₂Ｏ₂ ＰＢ４：無水過ホウ酸ナトリウム四水和物ペルカルボネート：実験式２Ｎａ₂ＣＯ₃・３Ｈ₂Ｏ₂の無水過炭酸ナトリウ
ム漂白剤ＴＡＥＤ：テトラアセチルエチレンジアミンＣＭＣ：ナトリウムカルボキシメチルセルロースＤＥＴＰＭＰ：ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）。デ
クエスト２０６０の商品名でMonsantoにより販売されているＰＶＰ：ポリビニルピロリドンポリマーＥＤＤＳ：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ‘−二コハク酸。ナトリウム塩の形
態の［Ｓ，Ｓ］異性体石鹸泡抑制剤： 25％パラフィン蝋、融点50℃、17％疎水性シリカ、58％パ
ラフィン油粒状石鹸泡抑制剤： 12％シリコーン／シリカ、18％ステアリルアルコール
、70％粒状形態のデンプンスルフェート：無水硫酸ナトリウムＨＭＷＰＥＯ：高分子量ポリエチレンオキシドＴＡＥ２５：獣脂アルコールエトキシレート

【０２１２】洗剤実施例Ｉ本発明の粒状布帛清浄用組成物は、以下のように調製され得る：線状Ｃ₁₂のアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム 6.5 硫酸ナトリウム 15.0 ゼオライトＡ 26.0 ニトリロ三酢酸ナトリウム 5.0 酵素 0.1 ＰＶＰ 0.5 ＴＡＥＤ 3.0 ホウ酸 4.0 ペルボレート 18.0 フェノールスルホネート 0.1 少量成分全量で100％まで

【０２１３】洗剤実施例ＩＩ圧縮粒状布帛清浄用組成物（密度800 g/l）は、本発明にしたがって以下のよ
うに調製し得る：４５ＡＳ 8.0 ２５Ｅ３Ｓ 2.0 ２５Ｅ５ 3.0 ２５Ｅ３ 3.0 ＴＦＡＡ 2.5 ゼオライトＡ 17.0 ＮａＳＫＳ−６ 12.0 クエン酸 3.0 カルボネート 7.0 ＭＡ／ＡＡ 5.0 ＣＭＣ 0.4 酵素 0.1 ＴＡＥＤ 6.0 ペルカルボネート 22.0 ＥＤＤＳ 0.3 粒状石鹸泡抑制剤 3.5 水／少量成分全量で100％まで

【０２１４】洗剤実施例ＩＩＩ着色布帛の洗濯に際して特に有用である本発明の粒状布帛清浄用組成物を、以
下のように調製した：ＬＡＳ 10.7 − ＴＡＳ 2.4 − ＴＦＡＡ − 4.0 ４５ＡＳ 3.1 10.0 ４５Ｅ７ 4.0 − ２５Ｅ３Ｓ − 3.0 ６８Ｅ１１ 1.8 − ２５Ｅ５ − 8.0 シトレート 15.0 7.0 カルボネート − 10.0 クエン酸 2.5 3.0 ゼオライトＡ 32.1 25.0 Ｎａ−ＳＫＳ−６ − 9.0 ＭＡ／ＡＡ 5.0 5.0 ＤＥＴＰＭＰ 0.2 0.8 酵素 0.10 0.05 シリケート 2.5 − スルフェート 5.2 3.0 ＰＶＰ 0.5 − ポリ（４−ビニルピリジン）−Ｎ−オキシド／ビニルイミダゾールとビニル
ピロリドンのコポリマー − 0.2 ペルボレート 1.0 − フェノールスルホネート 0.2 − 水／少量成分全量で100％まで

【０２１５】洗剤実施例ＩＶ「洗浄による柔軟化」能力を提供する本発明の粒状布帛清浄用組成物は、以下
のように調製し得る：４５ＡＳ − 10.0 ＬＡＳ 7.6 − ６８ＡＳ 1.3 − ２５Ｅ３ − 5.0 ココアルキルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド 1.4 1.0 シトレート 5.0 3.0 Ｎａ−ＳＫＳ−６ − 11.0 ゼオライトＡ 15.0 15.0 ＭＡ／ＡＡ 4.0 4.0 ＤＥＴＰＭＰ 0.4 0.4 ペルボレート 15.0 − ペルカルボネート − 15.0 ＴＡＥＤ 5.0 5.0 緑粘土 10.0 10.0 ＨＭＷＰＥＯ − 0.1 酵素 0.10 0.05 シリケート 3.0 5.0 カルボネート 10.0 10.0 粒状石鹸泡抑制剤 1.0 4.0 ＣＭＣ 0.2 0.1 水／少量成分全量で100％まで

【０２１６】洗剤実施例Ｖ本発明のヘビーデューティー液体布帛清浄用組成物は、以下のように調製し得
る：ＬＡＳ酸形態 − 25.0 クエン酸 5.0 2.0 ２５ＡＳ酸形態 8.0 − ２５ＡＥ２Ｓ酸形態 3.0 − ２５ＡＥ７ 8.0 − ＣＦＡＡ 5 − ＤＥＴＰＭＰ 1.0 1.0 脂肪酸 8 − オレイン酸 − 1.0 エタノール 4.0 6.0 プロパンジオール 2.0 6.0 酵素 0.10 0.05 ココアルキルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド − 3.0 緑粘土 − 5.0 ＰＶＰ 2.0 − 水／少量成分全量で100％まで

【０２１７】粉末自動食器洗浄用組成物Ｉ非イオン性界面活性剤 0.4〜2.5％メタケイ酸ナトリウム 0 〜 20％二ケイ酸ナトリウム 3 〜 20％三リン酸ナトリウム 20 〜40％炭酸ナトリウム 0 〜 20％過ホウ酸ナトリウム 2 〜 9％テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） 1 〜 4％硫酸ナトリウム 5 〜 33％酵素 0.0001〜0.1％

【０２１８】粉末自動食器洗浄用組成物ＩＩ非イオン性界面活性剤（例えばアルコールエトキシレート） 1 〜 2％二ケイ酸ナトリウム 2 〜 30％炭酸ナトリウム 10 〜 50％ホスホン酸ナトリウム 0 〜 5％クエン酸三ナトリウム二水和物 9 〜30％ニトリロ三ナトリウム酢酸（ＮＴＡ） 0 〜20％過ホウ酸ナトリウム一水和物 5 〜10％テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） 1 〜 2％ポリアクリレートポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー） 6 〜 25％酵素 0.0001〜0.1％香料 0.1〜0.5％水 5 〜10

【０２１９】粉末自動食器洗浄用組成物ＩＩＩ非イオン性界面活性剤 0.5〜2.0％二ケイ酸ナトリウム 25 〜 40％クエン酸ナトリウム 30 〜 55％炭酸ナトリウム 0 〜 29％重炭酸ナトリウム 0 〜 20％過ホウ酸ナトリウム一水和物 0 〜 15％テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） 0 〜 6％マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0 〜 5％粘土 1 〜 3％ポリアミノ酸 0 〜 20％ポリアクリル酸ナトリウム 0 〜 8％酵素 0.0001〜0.1％

【０２２０】粉末自動食器洗浄用組成物ＩＶ非イオン性界面活性剤 1 〜 2％ゼオライトＭＡＰ 15 〜42％二ケイ酸ナトリウム 30 〜 34％クエン酸ナトリウム 0 〜 12％炭酸ナトリウム 0 〜 20％過ホウ酸ナトリウム一水和物 7 〜 15％テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） 0 〜 3％ポリマー 0 〜 4％マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0 〜 5％有機ホスホネート 0 〜 4％粘土 1 〜 2％酵素 0.0001〜0.1％硫酸ナトリウム残余量

【０２２１】粉末自動食器洗浄用組成物Ｖ非イオン性界面活性剤 1 〜 7％二ケイ酸ナトリウム 18 〜 30％クエン酸三ナトリウム 10 〜 24％炭酸ナトリウム 12 〜 20％モノペルスルフェート（２ＫＨＳＯ₅、ＫＨＳＯ₄、Ｋ₂ＳＯ₄） 15 〜 21％漂白安定剤 0.1〜 2％マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0 〜 6％ジエチレントリアミンペンタアセテート、五ナトリウム塩 0 〜 2.5％酵素 0.0001〜0.1％硫酸ナトリウム、水残余量

【０２２２】清浄界面活性剤系を有する粉末および液体食器洗浄用組成物ＶＩ非イオン性界面活性剤 0 〜 1.5％オクタデシルジメチルアミンＮ−オキシド二水和物 0 〜 5％オクタデシルジメチルアミンＮ−オキシド二水和物およびヘキサデシルジメ
チルアミンＮ−オキシド二水和物の80:20重量Ｃ18／Ｃ16配合物 0 〜 4％オクタデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ−オキシド無水物およびヘ
キサデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ−オキシド無水物の70:30重量Ｃ1
8／Ｃ16配合物 0 〜 5％平均エトキシル化度3のＣ₁₃〜Ｃ₁₅のアルキルエトキシスルフェート 0 〜 10％平均エトキシル化度3のＣ₁₂〜Ｃ₁₅のアルキルエトキシスルフェート 0 〜 5％平均エトキシル化度12のＣ₁₃〜Ｃ₁₅のエトキシル化アルコール 0 〜 5％平均エトキシル化度９のＣ₁₂〜Ｃ₁₅のエトキシル化アルコール 0 〜 6.5％平均エトキシル化度30のＣ₁₃〜Ｃ₁₅のエトキシル化アルコールの配合物 0 〜 4％二ケイ酸ナトリウム 0 〜 33％トリポリ燐酸ナトリウム 0 〜 46％クエン酸ナトリウム 0 〜 28％クエン酸 0 〜 29％炭酸ナトリウム 0 〜 20％過ホウ酸ナトリウム一水和物 0 〜11.5％テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） 0 〜 4％マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0 〜 7.5％硫酸ナトリウム 0 〜12.5％酵素 0.0001〜0.1％

【０２２３】非水性液体自動食器洗浄用組成物ＶＩＩ液体非イオン性界面活性剤（例えばアルコールエトキシレート） 2.0〜10.0％アルカリ金属ケイ酸塩 3.0〜15.0％アルカリ金属リン酸塩 20.0〜40.0％高級グリコール、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから
選択される液体担体 25.0〜45.0％安定剤（例えばリン酸およびＣ₁₆〜Ｃ₁₈のアルカノールの部分エステル） 0.5〜7.0％発泡抑制剤（例えばシリコーン） 0 〜1.5％酵素 0.0001〜0.1％

【０２２４】非水性液体食器洗浄用組成物ＶＩＩＩ液体非イオン性界面活性剤（例えばアルコールエトキシレート） 2.0〜10.0％ケイ酸ナトリウム 3.0〜15.0％アルカリ金属炭酸塩 7.0〜20.0％クエン酸ナトリウム 0.0〜1.5％安定剤（例えば微粉砕シリコーンおよび低分子量ジアるきるポリグリコール
エーテルの混合物） 0.5〜7.0％低分子量ポリアクリレートポリマー 5.0〜15.0％粘土ゲル増粘剤(ベントナイト) 0.0〜10.0％ヒドロキシプロピルセルロースポリマー 0.0〜0.6％酵素 0.0001〜0.1％高級グリコール、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから
選択される液体担体残余量

【０２２５】チキソトロピック液体自動食器洗浄用組成物ＩＸＣ₁₂〜Ｃ₁₄の脂肪酸 0 〜0.5％ブロックコポリマー界面活性剤 1.5％〜15.0％クエン酸ナトリウム 0 〜 12％トリポリ燐酸ナトリウム 0 〜 15％炭酸ナトリウム 0 〜 8％三ステアリン酸アルミニウム 0 〜0.1％スルホン酸クメンナトリウム 0 〜1.7％ポリアクリレート増粘剤 1.32〜2.5％ポリアクリル酸ナトリウム 2.4〜6.0％ホウ酸 0 〜4.0％ギ酸ナトリウム 0 〜0.45％ギ酸カルシウム 0 〜0.2％ナトリウムｎ−デシジフェニルオキシドジスルフォネート 0 〜4.0％モノエタノールアミン(ＭＥＡ) 0 〜1.86％水酸化ナトリウム（50％） 1.9〜9.3％１,２−プロパンジオール 0 〜9.4％酵素 0.0001〜0.1％石鹸泡抑制剤、染料、香料、水残余量

【０２２６】液体自動食器洗浄用組成物Ｘアルコールエトキシレート 0 〜20％脂肪酸エステルスルホネート 0 〜30％ドデシル硫酸ナトリウム 0 〜20％アルキルポリグリコシド 0 〜21％オレイン酸 0 〜10％二ケイ酸ナトリウム一水和物 18 〜 33％クエン酸ナトリウム二水和物 18 〜 33％ステアリン酸ナトリウム 0 〜 2.5％過ホウ酸ナトリウム一水和物 0 〜 13％テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） 0 〜 8％マレイン酸／アクリル酸コポリマー 4 〜 8％酵素 0.0001〜0.1％

【０２２７】保護化漂白剤粒子を含有する液体自動食器洗浄用組成物ＸＩケイ酸ナトリウム 5 〜 10％ピロリン酸四カリウム 15 〜 25％三リン酸ナトリウム 0 〜 2％炭酸カリウム 4 〜 8％保護化漂白剤粒子、例えば塩素 5 〜 10％高分子増粘剤 0.7〜1.5％水酸化カリウム 0 〜 2％酵素 0.0001〜0.1％水残余量

【０２２８】ＸＩＩ：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩおよびＸに記載されたような自動食器
洗浄用組成物。この場合、ペルボレートはペルカルボネートに置換される。

【０２２９】

【０２３０】ＸＩＩＩ：マンガン触媒を追加のに含有するＩ〜ＶＩに記載されたような自動
食器洗浄用組成物。マンガン触媒は、例えば、”Efficient manganese catalyst
s for low-temperature bleaching”, Nature, (1994), 369, 637-639に記載さ
れた化合物の１つであり得る。

【０２３１】

【０２３２】方法および材料テキスタイル：ＷＦＫ１０Ｎ標準テキスタイル片（卵の染み）は、WFK Testgewebe GmbH, Chr
istenfeld 10, D-41379 Bruggen-Bracht, Germanyから入手した。

【０２３３】菌株：枯草菌B. subtilusＤＮ1885（Diderichsen et al., 1990）。

【０２３４】 B. lentus 309および147は、ＮＣＩＢに保管され、寄託番号ＮＣＩＢ10309お
よび10147を与えられた、そして米国特許第3,723,250号（この記載内容は、参照
により本明細書中に含まれる）に記載されているバシラス属のBacillus lentus
の特定菌株である。

【０２３５】大腸菌ＭＣ1000（M.J. Casadaban and S.N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 13
8 179-207）は、慣用的方法によりｒ^-、ｍ⁺を作製されたものであって、米国特
許出願第039,298号に記載されている。

【０２３６】プラスミド：ｐＪＳ３（配列番号６０）：ズブチラーゼ３０９をコードする合成遺伝子を
含有する大腸菌−枯草菌シャトルベクター（Jacob Schiodt et al. in Protein
and Peptide letters 3:39-44 (1996)により記載されている）。

【０２３７】ｐＳＸ２２２：枯草菌発現ベクター（WO 96/34946に記載）一般分子生物学的方法：別記しない限り、ＤＮＡ操作および形質転換は、分子生物学の標準方法を用い
て実施した（Sambrook et al.(1989) Molecular cloning:A laboratory manual,
Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al.(e
ds.) “Current protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 19
95; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) “Molecular Biological Metho
ds for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990）。

【０２３８】ＤＮＡ操作のための酵素は、供給元の使用説明書にしたがって用いた。

【０２３９】ＤＮＡ操作のための酵素別記しない限り、ＤＮＡ操作用の酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガ
ーゼ等は全て、New England Biolabs, Inc.から入手する。

【０２４０】タンパク質分解活性本発明の情況において、タンパク質分解活性は、Kilo NOVOプロテアーゼ単位
（ＫＮＰＵ）中で発現される。活性は酵素標準（サビナーゼ（登録商標））に対
して相対的に確定され、確定は、標準条件、即ち50℃、ｐＨ8.3、反応時間9分、
測定時間3分でのタンパク質分解酵素によるジメチルカゼイン（ＤＭＣ）溶液の
消化を基礎にしている。フォルダーＡＦ220／1は、Novo Nordisk A/S, Denmark
に要請して入手可能である（このフォールダーは参照により本明細書中に含まれ
る）。

【０２４１】ＧＵは、標準条件下で、基質としてＮ−アセチルカゼインを用いた40℃で15分
のインキュベーション中に、1 mmoleのグリシンと等価の量のＮＨ₂基を産生する
タンパク質分解酵素活性と定義されるグリシン単位である。

【０２４２】酵素活性は、可溶性基質であるスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−
フェニル−パラ−ニトロ−フェノールとの反応により、ＰＮＡ検定を用いても測
定し得る。これは、Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M
., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., and Smith, L.A., (1988)に記載されて
いる。

【０２４３】発酵：ズブチラーゼ酵素の製造のための発酵は、5日間、100 mlＢＰＸ培地を含入す
る500 mlバッフルドエーレンマイヤーフラスコ中で、回転振盪台（300 r.p.m.）
上で30℃で実施した。

【０２４４】その結果として、例えば2リットルのブロスを製造するためには、20個のエー
レンマイヤーフラスコを同時に発酵させた。

【０２４５】培地：ＢＰＸ培地組成（1リットル当たり）ジャガイモデンプン 100 g 大麦ground barley 50 g ダイズ粉 20 g Ｎａ₂ＨＰＯ₄ｘ12Ｈ₂Ｏ 9 g プルロニック 0.1 g ナトリウムカゼイネート 10 g 培地中のデンプンをα−アミラーゼで液化し、120℃で45分間加熱することに
より培地を滅菌する。滅菌後、ＮａＨＣＯ₃の付加（0.1 M）により、ｐＨを9に
調整する。実施例１酵素変異体の構築および発現：部位特異的突然変異誘発：所望の挿入物を含有するオリゴ体を用いたＰＣＲにより産生されるＤＮＡ断片
の伝統的クローニング（Sambrook et al.(1989) Molecular cloning:A laborato
ry manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989）により、特定の挿入を含み、
そして特定の置換を含む本発明のズブチラーゼ３０９（サビナーゼ（登録商標）
）部位特異的変異体を作製した（下記参照）。

【０２４６】鋳型プラスミドＤＮＡはｐＪＳ３（下記参照）またはズブチラーゼ３０９の変
異体を含有するこの類似体であった。

【０２４７】オリゴ特異的突然変異誘発により、挿入および置換を変異体の構築に導入した
。

【０２４８】ズブチラーゼ３０９変異体を大腸菌中で形質転換させた。これらの形質転換体
の一夜培養から精製されたＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ断片
の精製、結繋、枯草菌の形質転換により枯草菌中で形質転換させた。枯草菌の形
質転換は、Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221により記載さ
れているように実施した。

【０２４９】特定領域において挿入および置換を導入するための部位特異的突然変異誘発：部位特異的突然変異誘発を実施するために用いるための全体的戦略：挿入および置換の部位にフランキングするＤＮＡ配列に対応し、挿入および置
換を限定するＤＮＡ塩基対により分離される突然変異原性プライマー（オリゴヌ
クレオチド）を合成した。

【０２５０】その後、結果的に生じた突然変異原性プライマーを、修飾化プラスミドｐＪＳ
３とのＰＣＲ反応に用いた（前記参照）。その結果生じたＰＣＲ断片を精製し、
二次ＰＣＲ反応で伸長させて、その結果生じたＰＣＲ産物を精製し、大腸菌−枯
草菌シャトルベクター中でクローン化する（下記参照）か、または三次ＰＣＲ反
応で伸長させた後、エンドヌクレアーゼにより消化させて、大腸菌−枯草菌シャ
トルベクター中でクローン化した（下記参照）。ＰＣＲ反応は、通常条件下で実
施する。

【０２５１】この戦略後、サビナーゼ（登録商標）において挿入および置換を構築したが、
この場合、挿入および置換は、下記の表にしたがって導入した。各ＰＣＲ過程に
用いたプライマーが、用いたクローニング部位と同様に示されている。

【０２５２】前記の戦略にしたがって、詳細な例を以下に示す：２つの挿入および１つの置換をサビナーゼ（登録商標）で構築したが、この場
合、挿入は位置９９（^*９９ａＤ）および２１７（^*２１７ａＰ）にそれぞれ導入
し、置換は位置Ｓ９９Ａに導入した（下記参照）。

【０２５３】位置９９での挿入および置換は、対立プライマー（5’ GAG TTA AGC CCA GAA
GAT GTG GAC GCG 3’（アンチセンス））（配列番号８３）とのＰＣＲ反応に用
いられた突然変異原プライマー（5’ CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GG
A CTT TAA CAG C 3’（センス））（配列番号７１）により導入した。

【０２５４】プライマー；5’ CAT CGA TGT ACC GTT TGG TAA GCT GGC ATA TGTTG3’（配列
番号９４）を用いて位置２１７で挿入を導入する２回目のＰＣＲにより、生成さ
れたＰＣＲ断片をサビナーゼのＣ末端に向けて延長させた。ｐＪＳ３中のＭｌｕ
Ｉ部位の下流に位置するプライマー；5’ AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA
TTA ACG CGT TGC 3’（配列番号１０５）を用いた３回目のＰＣＲにより、２回
目のＰＣＲ産物を、サビナーゼのＣ末端に向けて延長させた。ＰＣＲ反応は全て
、鋳型としてプラスミドｐＪＳ３を用いた。３回目のＰＣＲから生じた延長ＤＮ
Ａ断片を、修飾化プラスミドｐＪＳ３のＳａｌＩ−およびＭｌｕＩ−部位中
でクローン化した（前記参照）。

【０２５５】周知の技法によりプラスミドＤＮＡを大腸菌中で形質転換させ、一大腸菌コロ
ニーをシーケンシングして、意図した突然変異を確証した。

【０２５６】他の変異体は全て、同様の方法で構築した。

【０２５７】本発明のズブチラーゼ変異体を精製するために、本発明の変異体を含む枯草菌
ｐＪＳ３発現プラスミドを、コンピテント枯草菌菌株中で形質転換させ、10μg/
mlクロラムフェニコールを含有する培地（ＣＡＭ）中で前記と同様に発酵させた
。

【０２５８】プライマーおよびクローニング部位：

【０２５９】

【表１５】

【０２６０】

【表１６】

【０２６１】

【表１７】

【０２６２】

【表１８】

【０２６３】

【表１９】

【０２６４】

【表２０】

【０２６５】

【表２１】

【０２６６】

【表２２】

【０２６７】実施例２酵素変異体の精製：本手法は、枯草菌宿主細胞における本発明のズブチラーゼの産生のための2リ
ットル規模発酵の精製に関する。

【０２６８】約1.6リットルの発酵ブロスを、1リットルビーカー中で5000 rpmで35分間遠心
分離した。10％酢酸を用いて上清をｐＨ6.5に調整し、Seitz Supra S100フィル
タープレートで濾過した。

【０２６９】濾液を、AmiconＳ１Ｙ１０ＵＦカートリッジを装備したAmicon ＣＨ２Ａ
ＵＦユニットを用いて、濾液を約400 mlに濃縮した。ＵＦ濃縮物を遠心分離し、
濾過した後、ｐＨ7でバシトラシン親和性カラムで室温で吸収させた。ｐＨ7に調
整した0.01ジメチルグルタル酸、0.1 Mホウ酸および0.002 M塩化カルシウムを含
有する緩衝溶液中の25％２−プロパノールおよび1 M塩化ナトリウムを用いて、
バシトラシンカラムから、室温でプロテアーゼを溶離した。

【０２７０】バシトラシン精製過程からのプロテアーゼ活性を有する分画を併合し、ｐＨ6.
5に調整した0.01ジメチルグルタル酸、0.2 Mホウ酸および0.002 M塩化カルシウ
ムを含有する緩衝液で平衡させた750 mlのセファデックスＧ２５カラム（直径5
cm）に適用した。

【０２７１】セファデックスＧ２５カラムからのタンパク質分解活性を有する分画を併合し
、ｐＨ6.5に調整した0.01 Mジメチルグルタル酸、0.2 Mホウ酸および0.002 M塩
化カルシウムを含有する緩衝液で平衡させた150 mlのＣＭセファロースＣＬ６
Ｂ陽イオン交換カラム（直径5 cm）に適用した。

【０２７２】 2リットルの同一緩衝液中の0〜0.1 M塩化ナトリウム（ズブチリシン１４７の
場合は0〜0.2 M塩化ナトリウム）の線状勾配を用いて、プロテアーゼを溶離した
。

【０２７３】最終精製過程において、ＣＭセファロースカラムからのプロテアーゼ含有分画
を併合し、ＧＲ８１ＰＰ膜（Danish Sugar Factories Inc.）を装備したAmicon
限外濾過セル中で濃縮した。

【０２７４】構築および発酵のための実施例１の技法を、そして前記の単離手法を用いて、
以下のズブチリシン３０９変異体を生成し、単離した：位置９６挿入変異体：Ｌ９６ＬＡＬ９６ＬＡ＋Ａ９８Ｔ＋Ａ１０８Ｃ＋Ａ１３８Ｃ位置９７挿入変異体：Ｇ９７ＧＩ＋Ｓ９９Ｔ位置９８挿入変異体：

【０２７５】

【表２３】

【０２７６】位置９９挿入変異体：

【０２７７】

【表２４】

【０２７８】実施例３「モデル洗剤洗浄性能試験」：

【０２７９】標準洗剤組成物中の選定ズブチラーゼ変異体の洗浄性能を査定するために、以
下の実験条件を用いて標準洗浄実験を実施し得る：洗剤：モデル洗剤洗剤用量： 4.0 g/l ｐＨ： 10.1 洗浄時間 20分温度 30℃ 水硬度： 15°dH 酵素濃度： 10 nm（洗剤溶液中）試験系： 10 mlビーカー（撹拌棒付）テキスタイル／容積： 5テキスタイル片（直径2.5 cm）/50 ml洗剤溶液被験物質：ＷＦＫ１０Ｎ（卵の染み）

【０２８０】モデル洗剤の組成を以下に示す： 6.2％ＬＡＳ（Nansa 80S） 2％Ｃ₁₆〜Ｃ₁₈脂肪酸のナトリウム塩 4％非イオン性界面活性剤（プルラファックスＬＦ４０４） 22％ゼオライトＰ 10.5％Ｎａ₂ＣＯ₃ 4％Ｎａ₂Ｓｉ₂Ｏ₅ 2％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ） 6.8％アクリレート液ＣＰ５40％ 20％過ホウ酸ナトリウム（実験式ＮａＢＯ₂・Ｈ₂Ｏ₂） 0.2％ＥＤＴＡ 21％Ｎａ₂ＳＯ₄ 水ＨＣｌまたはＮａＯＨの付加により、洗剤溶液のｐＨを10.1に調整する。試験
系へのＣａＣｌ₂およびＭｇＣｌ₂（Ｃａ²⁺：Ｍｇ²⁺＝4:1）の付加により、水硬
度を15°dHに調整する。洗浄後、テキスタイル片を水道水で洗い流して、風乾し
た。

【０２８１】 Macbeth ColorEye 7000光度計（Macbeth, Division of Kollmorgen Instrumen
ts Corporation, Germany）を用いて460 nmで、被験物質上での反射率（Ｒ（変
異体））の測定を実施する。測定は、メーカーのプロトコールにしたがって実施
する。

【０２８２】ブランク値を決定するために、酵素を付加せずに同様の洗浄実験を実施する。
反射率（Ｒ（ブランク））のその後の測定は、直ぐ上で記載したように実施する
。

【０２８３】次に前記と同様に参照実験を実施するが、この場合、親酵素の洗浄性能を試験
する。その後の反射率（Ｒ（親））測定は、直ぐ上で記載したように実施する。

【０２８４】以下の式にしたがって限定される性能係数（Ｐ）によって、洗浄性能を評価す
る：Ｐ＝（Ｒ（変異体）−Ｒ（ブランク））−（Ｒ（親）−Ｒ（ブランク））＝Ｒ（変異体）−Ｒ（親）前記の試験方法を用いて、以下の結果を得た：

【０２８５】

【表２５】

【０２８６】明らかなように、ズブチラーゼ変異体は、親ズブチラーゼ、即ちサビナーゼ（
登録商標）との比較において、卵の染みに及ぼす洗浄性能改良を示す。実施例４「卵抑制検定」以下の抑制検定は、試験されるズブチラーゼ変異体がペプチド−ｐＮＡ結合の
加水分解を触媒し、それにより黄色ｐＮＡを放出するという原理に基づいており
、これは405 nmで追跡調査し得る。所定時間後の放出ｐＮＡの量は、ズブチラー
ゼ活性の直接測定値である。それぞれ阻害剤を用いておよび用いずにこのような
加水分解実験を実行することにより、ある種のズブチラーゼ変異体が抑制される
程度に関する定量的測定値を得ることができる。

【０２８７】反応条件：酵素濃度： 0.0003 mg/ml ＩＶ−０型トリプシン阻害剤の濃度： 0.0015 mg/ml 初期基質濃度： 0.81 mM 反応時間： 11分検定温度： 25℃ 検定ｐＨ：8.6 吸光度測定： 405 nm 検定溶液：基質溶液（2 mM）：500 mgのＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮ
Ａを4 mlＤＭＳＯ（200 mM）中に溶解する。この溶液を下記の緩衝溶液で100倍
に希釈する。その結果生じる基質溶液中の基質の濃度は、2 mMである。

【０２８８】阻害剤溶液（0.005 mg/ml）：5 mgのＩＶ−０型トリプシン阻害剤（SigmaＴ−
1886）を10 mlの水に溶解する。この溶液を下記の緩衝溶液で100倍に溶解する。
その結果生じる阻害剤溶液中の阻害剤の濃度は、0.005 mg/mlである。

【０２８９】酵素溶液（0.001 mg/ml）：酵素1 mgを水10 ml中に溶解する。この溶液を下記
の緩衝溶液で100倍に溶解する。その結果生じる酵素溶液中の酵素の濃度は、0.0
01 mg/mlである。

【０２９０】緩衝溶液（ｐＨ8.6）：トリス15.7 mgを適量の水に溶解し、0.75 mlの30％（w
/v）ＢＲＩＪ（BRIJ 35ポリオキシエチレンラウリルエーテル、30％（w/v）、S
igmaカタログ番号430ＡＧ−6）を付加する。4 MＮａＯＨを用いてｐＨを8.6に調
整し、溶液を水で1リットルに希釈する。

【０２９１】阻害剤を用いた検定 1容積単位（例えば80 μl）の阻害剤溶液を適切な反応容器（例えば分光光度
計セルまたは微小滴定プレート）中で1容積単位（例えば80 μl）の酵素溶液と
混合し、25℃で15分間平衡させる。1.375容積単位（例えば110 μl）の基質溶液
を反応容器に付加し、その後、405 nmでの吸光度を11分間追跡調査する（例えば
10秒毎または30秒毎に測定することにより）。線状回帰分析を用いて吸光度曲線
の勾配を算定する。吸光度曲線の勾配は、α_inhibitorで示される。

【０２９２】阻害剤を用いない検定 1容積単位（例えば80 μl）の緩衝溶液を適切な反応容器（例えば分光光度計
セルまたは微小滴定プレート）中で1容積単位（例えば80 μl）の酵素溶液と混
合し、25℃で15分間平衡させる。1.375容積単位（例えば110 μl）の基質溶液を
反応容器に付加し、その後、405 nmでの吸光度を11分間追跡調査する（例えば10
秒毎または30秒毎に測定することにより）。線状回帰分析を用いて吸光度曲線の
勾配を算定する。吸光度曲線の勾配は、αで示される。

【０２９３】ブランク 1容積単位（例えば80 μl）の阻害剤溶液を適切な反応容器（例えば分光光度
計セルまたは微小滴定プレート）中で1容積単位（例えば80 μl）の緩衝溶液と
混合し、25℃で15分間平衡させる。1.375容積単位（例えば110 μl）の基質溶液
を反応容器に付加し、その後、405 nmでの吸光度を11分間追跡調査する。これら
の測定値は計算に用いられないが、しかし単に、緩衝溶液および／または基質溶
液に酵素が付加されなかった対照として役立つ。

【０２９４】残留活性（ＲＡ）の算定以下の式にしたがって、残留酵素活性（ＲＡ）を算定する：ＲＡ＝（α_inhibitor／α）ｘ100％前記の試験を用いて、以下の結果を得た：

【０２９５】

【表２６】

【０２９６】明らかなように、ズブチラーゼ変異体は、親ズブチラーゼ、即ちサビナーゼ（
登録商標）よりはるかに小程度に阻害された。実施例５自動食器洗浄（ＡＤＷ）における本発明のズブチラーゼ変異体の性能標準条件を用いて、市販家庭用食器洗浄用組成物（ソマットターボ、Henkel W
ashmittel GmbH）中で、ＡＤＷにおける本発明の変異体の性能を試験した。用い
た汚れは、スチールプレート上に被覆された卵／ミルク混合物であった。さらに
種々の食品を含有するバラスト汚れを付加した。

【０２９７】洗剤：ソマットターボ洗剤用量： 4.0 g/l ｐＨ： 10.7 水硬度： 3°dH（機械イオン交換）温度 55℃ 酵素濃度：機械中の洗浄水の総容積を基礎にして、20 nMおよび40 nM 試験方法：下記のようなスチールプレート上を卵／ミルク汚染する機械：シリンダコンパクトCylinda Compact 洗浄プログラム：予洗なしでプログラム４材料 220 ml非脱脂乳卵15個、中サイズスチールプレート、直径18 cm 組成物中の酵素活性を不活性化するために、ソマットターボ食器洗浄用組成物
を電子レンジで5分間、85℃で加熱した。

【０２９８】スチールプレートの汚染 220 mlの非脱脂乳をBraun UK20調理機中で2分間、15個の卵と混合した。篩に
掛けた後、浸漬により混合物中でステンレススチールプレートを汚染した。

【０２９９】プレートを、直立位置で室温で一夜乾燥させた。次に、表面のタンパク質を変
性するために、乾燥プレートを120℃で45分間加熱した。

【０３００】ＡＤＷ実験各実験に関しては、10枚の汚れたプレートを、シリンダコンパクト機中で、予
洗なしで洗浄した（プログラム４）。汚れたプレートのほかに、機械には10枚の
磁器プレート、4個のガラス、4個のカップおよび16片の刃物類を充填した。

【０３０１】さらに50 gのバラストスラリーを機械に付加した。スラリーの組成を以下に示
す：ジャガイモデンプン（5.43％）、小麦粉（4.38％）、植物油（4.32％）、マ
ーガリン（4.32％）、ラード（4.32％）、クリーム（8.76％）、非脱脂乳（8.76
％）、卵（8.76％）、トマトケチャップ（3.00％）、バーベキューソース（2.19
％）、マスタード（4.00％）、安息香酸（0.73％）、水（3 mMＣａ²⁺＋Ｍｇ²⁺）
（36.7％）。

【０３０２】測定および計算ミノルタ彩度計（ＣＲ−300型）を用いて、プレート上の6つの異なる位置で、
光反射値（Ｒ値）を測定した。測定は、清浄プレート上（Ｒ（清浄））、加熱後
の汚損プレート上（Ｒ（汚染））および洗浄後のプレート上（Ｒ（洗浄後））で
成された。

【０３０３】以下の式にしたがって、除去タンパク質皮膜（ＲＰＦ％）を算定した：ＲＰＦ（％）＝100％ｘ（Ｒ（洗浄後）−Ｒ（汚染））／（Ｒ（清浄）−Ｒ
（汚染）前記の試験方法を用いて、以下の結果を得た（±は標準偏差を示す）：

【０３０４】

【表２７】

【０３０５】明らかなように、本発明の変異体は、サビナーゼ（登録商標）と比較した場合
、優れた性能を有する。実施例６市販粉末洗剤中の本発明のズブチラーゼ変異体の洗浄性能市販洗剤組成物中の選定ズブチラーゼ変異体の洗浄性能を査定するために、以
下の実験条件を用いて標準洗浄実験を実施した：洗剤用量： 4.0 g/l 洗浄温度： 30℃ 洗浄時間 20分水硬度： 15°dH（Ｃａ²⁺：Ｍｇ²⁺＝4:1）ｐＨ：調整せず酵素濃度： 1、2、5、10、30 nM 試験系： 150 mlガラスビーカー（撹拌棒付）テキスタイル／容積： 5テキスタイル片（直径2.5 cm）、50 ml洗剤中被験物質：ＷＦＫ１０Ｎ（卵の染み）使用した洗剤は、ドイツのスーパーマーケット（Persil Megapearls）から入
手した。使用前に、電子レンジ処理（85℃で5分間）により、洗剤中の全酵素活
性を不活性化した。

【０３０６】反射率測定は、本明細書中の実施例３に記載したように実施した。

【０３０７】データ（Ｒ値）は、以下のように評価した：サビナーゼ（登録商標）より高いＲ値を有する変異体は、値１とした。

【０３０８】サビナーゼ（登録商標）より低いＲ値を有する変異体は、値−１とした。

【０３０９】サビナーゼ（登録商標）と同様のＲ値を有する変異体は、値０とした。

【０３１０】結果：変異体値サビナーゼ（登録商標）０Ｌ９６ＬＡ１Ｌ９６ＬＡ＋Ａ９８Ｔ＋Ａ１０８Ｃ＋Ａ１３８Ｃ１Ｇ９７ＧＩ＋Ｓ９９Ｔ１明らかなように、ズブチラーゼ変異体は、サビナーゼ（登録商標）と比較した
場合、市販洗剤中での洗浄性能改良を示す。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】前記のＧＡＰルーチンを用いたズブチリシンＢＰＮ‘（ａ）およびサビナーゼ
（登録商標）（ｂ）間のアラインメントを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:125） (31)優先権主張番号ＰＡ２００００１５２７ (32)優先日平成12年10月13日(2000．10．13) (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA03 BA14 CA02 CA06 CA20 DA07 DA11 EA04 GA11 GA25 HA03 HA06 4B050 CC04 DD02 EE01 FF05E FF11E FF12E FF14E GG01 HH01 LL04 4B065 AA15X AA19X AA19Y AA60X AB01 AC14 BA02 BA16 BB01 BB03 BB18 BB24 BB26 BB27 BC26 BD14 CA33 CA57 4H003 AB03 AB19 AC08 DA01 DA19 EA12 EA15 EA16 EA28 EB16 EB30 EB42 EC02 EE05 FA47

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のためのズ
ブチラーゼ変異体の使用であって、位置９５〜１０３（BASBPNナンバリング）の
活性部位ループ（ｂ）領域に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むズブチ
ラーゼ変異体の使用。
【請求項２】追加のアミノ酸残基が、位置９５と９６、位置９６と９７、
位置９７と９８、位置９８と９９、位置９９と１００、位置１００と１０１、位
置１０１と１０２、位置１０２と１０３、位置１０３と１０４の間およびそれら
の組合せから成る群から選択される位置に挿入されている請求項１記載の使用。
【請求項３】追加のアミノ酸残基が、位置９８と９９の間および９９と１
００の間から成る群から選択される位置に挿入されている請求項２記載の使用。
【請求項４】変異体が、本明細書中の実施例４に開示された「卵抑制検定
」で試験された場合、少なくとも10％、例えば少なくとも15％、好ましくは少な
くとも20％、さらに好ましくは少なくとも25％の残留活性を有する請求項１〜３
のいずれかに記載の使用。
【請求項５】位置９８と９９の間の挿入がＸ９８ＸＡ、Ｘ９８ＸＴ、Ｘ９
８ＸＧおよびＸ９８ＸＳから成る群から選択される請求項１〜４のいずれかに記
載の使用。
【請求項６】位置９９と１００の間の挿入がＸ９９ＸＤ、Ｘ９９ＸＥ、Ｘ
９９ＸＫおよびＸ９９ＸＲから成る群から選択される請求項１〜４のいずれかに
記載の使用。
【請求項７】変異体が少なくとも１つのさらなる修飾を含む前記請求項の
いずれかに記載の使用。
【請求項８】さらなる修飾が、位置９９における置換、位置１３３におけ
る置換、位置１４３における置換、位置１６７における置換、位置１７０におけ
る置換、位置１９４における置換、位置４２と４３の間の挿入、位置１２９と１
３０の間の挿入、位置２１６と２１７の間の挿入、位置２１７と２１８の間の挿
入およびそれらの組合せから成る群から選択される位置において実施される請求
項７記載の使用。
【請求項９】変異体が以下の：位置９８と９９の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そ
して位置１３３および１４３における置換をさらに含む変異体、位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置９９における置換をさらに含む変異体、位置９８と９９の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そ
して位置１６７、１７０および１９４における置換をさらに含む変異体、位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置２１６と２１７の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を
さらに含む変異体、位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置２１７と２１８の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を
さらに含む変異体、位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置４２と４３の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入をさら
に含む変異体、ならびに位置９９と１００の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、
そして位置１２９と１３０の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を
さらに含む変異体から成る群から選択される請求項８記載の使用。
【請求項１０】親ズブチラーゼがＩ−Ｓ１亜群に属する前記請求項のいず
れかに記載の使用。
【請求項１１】親ズブチラーゼがＢＳＳ１６８、BASBPN、ＢＳＳＤＹおよ
びＢＬＳＣＡＲまたはＩ−Ｓ１亜群の特徴を保有しているそれらの機能的変異体
から成る群から選択される請求項１０記載の使用。
【請求項１２】親ズブチラーゼがＩ−Ｓ２亜群に属する請求項１〜９のい
ずれかに記載の使用。
【請求項１３】親ズブチラーゼがＢＬＳ１４７、ＢＬＳＡＶＩ、ＢＡＰＢ
９２、ＴＶＴＨＥＲおよびＢＹＳＹＡＢまたはＩ−Ｓ２亜群の特徴を保有してい
る機能的変異体から成る群から選択される請求項１２記載の使用。
【請求項１４】親ズブチラーゼがＢＬＳＡＶＩ（配列番号１）である請求
項１３記載の使用。
【請求項１５】変異体がＳ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａである請求項１４記載の使
用。
【請求項１６】変異体がＳ９９ＳＲ＋Ｓ９９Ｔである請求項１４記載の使
用。
【請求項１７】変異体がＡ９８ＡＳ＋Ａ１３３Ｅ＋Ｔ１４３Ｋである請求
項１４記載の使用。
【請求項１８】変異体がＡ９８ＡＴ＋Ｙ１６７Ａ＋Ｒ１７０Ｓ＋Ａ１９４
Ｐである請求項１４記載の使用。
【請求項１９】変異体がＳ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａ＋Ｐ１２９ＰＤである請求
項１４記載の使用。
【請求項２０】変異体がＳ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａ＋Ｓ２１６ＳＰである請求
項１４記載の使用。
【請求項２１】変異体がＳ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａ＋Ｓ２１６ＳＤＰである請
求項１４記載の使用。
【請求項２２】変異体がＳ９９ＳＤ＋Ｓ９９ＳＡ＋Ｌ２１７ＬＰである請
求項１４記載の使用。
【請求項２３】変異体がＳ９９ＳＤ＋Ｄ４２ＤＮである請求項１４記載の
使用。
【請求項２４】変異体がＳ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａ＋Ｄ４２ＤＮである請求項
１４記載の使用。
【請求項２５】以下の：位置９８と９９の間の少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応する
活性部位（ｂ）ループ中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、そして
少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む変異体（BASBPNナンバリング）、位置９９と１００の間の少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応す
る活性部位（ｂ）ループ中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、そし
て少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む変異体（BASBPNナンバリング）、から成る群から選択されるズブチラーゼ変異体であって、本明細書中の実施例４
に開示された「卵抑制検定」で試験された場合、少なくとも10％、の残留活性を
有する変異体。
【請求項２６】変異体が少なくとも15％、好ましくは少なくとも20％、さ
らに好ましくは少なくとも25％の残留活性を有する請求項２５記載の変異体。
【請求項２７】請求項９〜２４のいずれかに記載されているような特徴を
有する請求項２５〜２６記載の変異体。
【請求項２８】請求項９〜２４のいずれかで限定されるようなズブチラー
ゼ変異体。
【請求項２９】請求項２５〜２８のいずれかで限定されるようなズブチラ
ーゼ変異体をコードする単離ＤＮＡ配列。
【請求項３０】請求項２９の単離ＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項３１】請求項３０の発現ベクターで形質転換される微生物宿主細
胞。
【請求項３２】細菌、好ましくはバシラス属、特にB. lentusである請求
項３１記載の微生物宿主細胞。
【請求項３３】真菌または酵母、好ましくは糸状真菌、特にアスペルギル
ス属である請求項３１記載の微生物宿主細胞。
【請求項３４】請求項３１〜３３のいずれかに記載の宿主が前記変異体の
発現および分泌を行なう条件下で培養され、変異体が回収される請求項２５〜２
７のいずれかに記載のズブチラーゼ変異体の製造方法。
【請求項３５】請求項２５〜２８のいずれかに記載の変異体を含む清浄用
または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物。
【請求項３６】セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクター
ゼ、別のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含む請求項３
５記載の組成物。
【請求項３７】清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯および／または
食器洗浄用組成物中の請求項２５〜２８のいずれかで限定されるような変異体の
使用。
【請求項３８】硬質表面または洗濯物からの卵の染みの除去方法であって
、卵の染み含有硬質表面または卵の染み含有洗濯物を、位置９５〜１０３（BASB
PNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少なくとも１つの追加の
アミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体を含有する清浄用または洗剤組成物、好
ましくは洗濯または食器洗浄用組成物と接触させることを包含する方法。
【請求項３９】変異体が請求項２〜２４のいずれかで限定されるような特
徴を有する請求項３８記載の方法。
【請求項４０】組成物がセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレ
ダクターゼ、別のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含む
請求項３８〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のための
、位置９５〜１０３（BASBPNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中
に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体を含有する清
浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物の使用。
【請求項４２】変異体が請求項２〜２４のいずれかで限定されるような特
徴を有する請求項４１記載の使用。
【請求項４３】組成物がセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレ
ダクターゼ、別のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含む
請求項４１〜４２のいずれかに記載の使用。