CN1784490A - 变体枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌酶) - Google Patents

Abstract

对卵污渍具有改良的洗涤性能的新的枯草杆菌酶。这些枯草杆菌酶当用于例如清洁或洗涤剂组合物，如洗衣组合物和洗盘组合物，包括自动洗盘组合物中时对卵污渍具有优秀的或者改进的洗涤性能。

Description

变体枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌酶)

技术领域

本发明涉及对污渍，尤其卵污渍具有改良性能的新枯草杆菌酶(subtilase)。当这些枯草杆菌酶用于如清洁或洗涤剂组合物，如洗衣组合物和洗盘组合物中，包括自动洗盘组合物中时，对卵污渍表现出优良的或改进的性能。

本发明也涉及编码该枯草杆菌酶的分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、包含该核酸构建体的宿主细胞，以及生产和使用本发明的枯草杆菌酶的方法。而且，本发明涉及包含本发明枯草杆菌酶的清洁和洗涤剂组合物，以及这些酶在洗涤剂组合物中的用途和用于除去卵污渍的用途。

发明背景

在洗涤剂工业，酶已在洗涤配方中使用了30年以上。用于这些配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶和其它酶或它们的混合物。商业上最为重要的酶是蛋白酶。

数量不断增长的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体，如DURAZYM^(Novozymes A/S)、RELASE^(NovozymesA/S)、MAXAPEM^(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT^(GenencorInternational，Inc.)。

此外，本领域，如EP 130756(GENENTECH)(对应于美国重新发行(Reissue)专利号34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell，和Fersht(1985)Nature 318 375-376；Thomas，Russell，和Fersht(1987)J.Mol.Biol.193 803-813；Russel和Fersht Nature 328 496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO88/08033(Amgen)；WO 95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER&GAMBLE COMPANY)；WO 95/30010(PROCTER&GAMBLE COMPANY)；WO95/29979(PROCTER&GAMBLECOMPANY)；US 5.543.302(SOLVAY S.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO89/06279(NOVOZYMES A/S)；WO91/00345(NOVOZYMES A/S)；EP 525 610 A1(SOLVAY)；WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.)中描述了许多蛋白酶变体。

在WO 02/42740(NOVOZYMES A/S)中描述了用于筛选(AMSA)的试验方法。

WO 01/75087(MAXYGEN，INC./NOVOZYMES A/S)描述了枯草杆菌蛋白酶同系物，其改进了多种特定性质，包括热稳定性、低温下的活性和碱性稳定性。

WO 01/68821(NOVOZYMES A/S)描述了枯草杆菌酶，其适于从例如衣物和/或硬表面除去卵污渍。

然而，尽管已经描述了许多有用的蛋白酶和蛋白酶变体，仍然需要对许多工业用途进一步改进蛋白酶或蛋白酶变体。

具体地，由于存在于卵白中的物质抑制许多丝氨酸蛋白酶这一事实，从例如衣物或者硬表面除去卵污渍的问题已经变得突出。

因此，本发明的一个目的是提供改良的枯草杆菌酶，其适于例如从衣物或者硬表面除去卵污渍。

发明概述

从而，一方面，本发明涉及对卵污渍具有改良的洗涤性能的枯草杆菌酶，所述枯草杆菌酶选自

(a)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1到269所示氨基酸序列具有99.26％以上同一性；和

(b)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)MT173 DSM15575中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有至少99.26％同一性的所述枯草杆菌酶的变体；和

(c)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO：4的氨基酸1到269所示氨基酸序列具有97.40％以上同一性；和

(d)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有97.40％以上同一性的所述枯草杆菌酶的变体。

在第二方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其含有编码本发明的枯草杆菌酶的核酸序列。

在第三方面，本发明涉及编码枯草杆菌酶的分离的多核苷酸，其选自

(a)与SEQ ID NO：1的核苷酸1到807所示核酸序列具有至少88％同一性的多核苷酸；和

(b)已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88％同一性的变体，

(c)与SEQ ID NO：3的核苷酸1到807所示核酸序列具有至少88％同一性的多核苷酸；和

(d)已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88％同一性的变体。

在第四方面，本发明涉及核酸构建体，其含有根据本发明的核酸序列，其有效连接到指导枯草杆菌酶在适宜的宿主中表达的一个或多个控制序列。

在第五方面，本发明涉及重组表达载体，其含有根据本发明的核酸构建体、启动子、转录和翻译终止信号。

在第六方面，本发明涉及重组宿主细胞，其含有本发明的核酸构建体。

在第七方面，本发明涉及产生根据本发明的枯草杆菌酶的方法，该方法包括：

(a)在有助于产生枯草杆菌酶的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收枯草杆菌酶。

在第八方面，本发明涉及清洁或洗涤剂组合物，优选洗衣和洗盘组合物，其含有本发明的枯草杆菌酶。

本发明的其他方面涉及本发明的枯草杆菌酶用于清洁或洗涤剂组合物中的用途；本发明的枯草杆菌酶或组合物用于除去卵污渍的用途；清除或洗涤的方法，其包括从硬表面或者衣物除去卵污渍的方法，该方法包括将硬表面或者衣物与本发明的组合物接触。

图1进行了相关比对和编号参考，所述图1显示了枯草杆菌蛋白酶BPN’(a)(BASBPN)和本发明的新的枯草杆菌酶(b)和(c)之间的比对。

这些比对在本专利申请中用作对残基编号的参照。

定义

在更详细地讨论本发明之前，首先定义以下的术语和惯用语。

氨基酸命名法

A＝Ala＝丙氨酸

V＝Val＝缬氨酸

L＝Leu＝亮氨酸

I＝Ile＝异亮氨酸

P＝Pro＝脯氨酸

F＝Phe＝苯丙氨酸

W＝Trp＝色氨酸

M＝Met＝甲硫氨酸

G＝Gly＝甘氨酸

S＝Ser＝丝氨酸

T＝Thr＝苏氨酸

C＝Cys＝半胱氨酸

Y＝Tyr＝酪氨酸

N＝Asn＝天冬酰胺

Q＝Gln＝谷氨酰胺

D＝Asp＝天冬氨酸

E＝Glu＝谷氨酸

K＝Lys＝赖氨酸

R＝Arg＝精氨酸

H＝His＝组氨酸

X＝Xaa＝任意氨基酸

核酸命名法

A＝腺嘌呤

G＝鸟嘌呤

C＝胞嘧啶

T＝胸腺嘧啶(仅在DNA中)

U＝尿嘧啶(仅在RNA中)

变体命名的命名法和惯用语

在描述本发明的产生的或期待的多种枯草杆菌酶变体时，采用以下的命名法和惯用语以易于参照：

首先通过将分离的或亲本酶与枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)对比来定义参考框。

在本发明上下文中，“同源性”或“同源的”以其常规意思理解，两种氨基酸序列之间的“同源性”用University of Wisconsin Genetics ComputerGroup(GCG)包的GAP程序，对比对参数、比较矩阵、缺口和缺口延伸罚分使用默认设置定义的“相似性”来确定。缺口(GAP)罚分的默认值即缺口产生罚分3.0，缺口延伸罚分0.1(Wisconsin Package，版本8，1994年8月的程序手册，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)。该方法还描述于S.B.Needleman和C.D.Wunsch，Journal of Molecular Biology，48，443-445(1970)。可以从相同计算提取同一性。两种氨基酸序列之间同源性还可以用GCG包9.1版的GAP常规方法，对比对参数、比较矩阵使用默认参数通过“同一性”或者“相似性”确定，还可以应用缺口和缺口延伸罚分，使用下面的参数：缺口产生罚分＝8，缺口延伸罚分＝8并且所有其他参数保持默认值。除了氨基酸比对，该方法还输出两条序列之间“同一性百分率”和“相似性”的计算。使用GCG软件包9.1版计算的数目与8.0计算的略有不同。

另一种方法是使用公知的枯草蛋白酶之间的比对，如WO 91/00345中指出的比对。在多数情况中，方法之间差异将不重要。

枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)和本发明的新枯草杆菌酶之间的序列对比如图1所示。

因此，将定义许多与BASBPN相关的缺失和插入。在图1中，本发明的新枯草杆菌酶与BASBPN相比，在36、58、158、162、163和164位有6处缺失。这些缺失在图1中由星号(^*)表示。

一般采用以下的三个成分来表示对亲本酶所进行的多种修饰：

原始氨基酸位置替换的氨基酸

符号G195E意指195位的甘氨酸被谷氨酸替换。

位置替换的氨基酸

在原始氨基酸残基可以是任意氨基酸残基的情况下，有时可以用简略表达方式仅表示位置和替换的氨基酸：170Ser或者170S。

这种符号尤其与同源枯草杆菌酶的修饰相关(见下文)。

原始氨基酸位置

当鉴定替换氨基酸残基不重要时，这种符号尤其相关。用任意氨基酸残基替换195位的甘氨酸表示为Gly195或者G195。

位置

当原始氨基酸和替换氨基酸均可以包含任意氨基酸时，则只指出位置，如：170。

原始氨基酸 位置{ 替换的氨基酸₁，...，替换的氨基酸_n }

当原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸时，所选择的氨基酸表示在括号{}内：

对于特定的变体，使用特定的三个或一个字母代码，包括代码Xaa和X用来表示任何氨基酸残基。

替换：

用谷氨酸替换195位的甘氨酸表示为：

                 Gly195Glu或G195E

或者用任意氨基酸残基酸替换195位的甘氨酸表示为：

                 Gly195Xaa或G195X

或

                 Gly195或G195

因此用丝氨酸替换170位的任意氨基酸残基表示为：

                  Xaa170Ser或X170S

或

                  170Ser或170S

这种符号尤其与同源枯草杆菌酶的修饰相关(见下文)。因此170Ser意指包含例如BASBPN中的Lys170Ser修饰和本发明枯草杆菌酶的Arg170Ser的修饰(参见图1)。

对于其中的原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸的修饰而言，由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸替换170位的精氨酸表示为

Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G， A，S，T}

以表示变体

R170G、R170A、R170S和R170T。

缺失：

195位甘氨酸的缺失表示为：

                   Gly195^*或G195^*

相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示为

            Gly195^*+Leu196^*或G195^*+L196^*

插入：

额外的氨基酸残基的插入，如在G195后插入赖氨酸表示为：

            Gly195GlyLys或G195GK；

或者，当插入一个以上的氨基酸残基，如在G195后插入Lys和Ala时，这种插入表示为：

            Gly195GlyLysAla或G195GKA

在这些情况下，通过将小写字母加到插入氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置号来对插入氨基酸残基进行编号。在以上的实施例中，序列194-196因此为：

             194 195 196

BLSAVI       A-G-L

             194 195 195a 195b 196

变体         A-G-K-A-L

当插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基时，显然是在命名中出现了简并。如果例如在以上的实施例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则将它表示为G195GG。对从

          194 195 196

BLSAVI    A-G-L

          194 195 195a 196

至变体    A-G-G-L

          194 194a 195 196的同一现行变化还可以表示为A194AG。

这些例子对本领域技术人员来说是显而易见的，且表示法G195GG和这种类型插入的相应表示法因此是指包含此类等同的简并表示法。

填补缺口：

当与用于编号的枯草杆菌蛋白酶BPN′序列进行比较，在参照的酶中存在缺失时，则对于在36位天冬氨酸的插入而言，这种位置处的插入表示为：

                  ^*36Asp或^*36D

多重修饰：

用加号分隔含多重修饰的变体，如：

          Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E

代表在170和195位分别用酪氨酸和谷氨酸替换精氨酸和甘氨酸的修饰。

因此，Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示以下变体：

ryr167Gly+Arg170Gly，          Tyr167Gly+Arg170Ala，

Tyr167Gly+Arg170Ser，          Tyr167Gly+Arg170Thr，

Tyr167Ala+Arg170Gly，          Tyr167Ala+Arg170Ala，

Tyr167Ala+Arg170Ser，          Tyr167Ala+Arg170Thr，

Tyr167Ser+Arg170Gly，          Tyr167Ser+Arg170Ala，

Tyr167Ser+Arg170Ser，          Tyr167Ser+Arg170Thr，

Tyr167Thr+Arg170Gly，          Tyr167Thr+Arg170Ala，

Tyr167Thr+Arg170Ser            和Tyr167Thr+Arg170Thr。

这种命名法与针对替换、取代、插入或缺失具有特定共同性质的氨基酸残基，如带正电荷(K、R、H)、带负电荷(D、E)的残基的修饰，或用一种小氨基酸替换另一种小氨基酸的诸如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}的保守氨基酸的修饰特别相关。进一步的详细描述参见“发明详述”部分。

蛋白酶

分解蛋白质底物中的酰胺键的酶归类为蛋白酶，或(可互换地)肽酶(见Walsh，1979，酶反应机理(Enzymatic Reaction Mechanisms).W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。

氨基酸位置/残基的编号

如果没有另外指出，本文所用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN′(BASBPN)序列的氨基酸编号。对BPN′序列的详细描述，参见图1或Siezen等人，蛋白质工程(Protein Engng.)4(1991)719-737。

丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是一种催化肽键水解的酶，其中在活性部位存在必需的丝氨酸残基(White，Handler和Smith，1973“生物化学原理(Principles of Biochemistry)，”第五版，McGraw-Hill Book公司，纽约，第271-272页)。

细菌丝氨酸蛋白酶的分子量在20,000-45,000道尔顿的范围内。它们被二异丙基氟代磷酸酯抑制。它们水解简单末端脂类，且其活性与真核生物糜蛋白酶(也是一种丝氨酸蛋白酶)相似。一个更为狭义的术语：包括在一个亚组的碱性蛋白酶反映某些丝氨酸蛋白酶的高pH最佳值，为pH 9.0-11.0(综述参见Priest(1977)细菌学评论(BacteriologicalRev.)41：711-753)。

枯草杆菌酶

Siezen等人提出丝氨酸蛋白酶的一个亚组，其暂称为枯草杆菌酶(subtilase)，见蛋白质工程，4(1991)719-737和Siezen等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523。它们是通过对170多个先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定了大量的枯草杆菌酶，并已测定了一些枯草杆菌酶的氨基酸序列。对此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述参见Siezen等人(1997)。

枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或″真″枯草杆菌蛋白酶，包含“标准的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN′、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE^，Novozymes A/S)和枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。

Siezen等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I-S2或强碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶并包括：枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL^，Gist-BrocadesNV)、枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI)(SAVINASE^，Novozymes A/S)、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE^，Novozymes A/S)和碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。

亲本枯草杆菌酶

术语“亲本枯草杆菌酶”描述一种根据Siezen等人(1991和1997)定义的枯草杆菌酶。关于进一步的细节，参见上述对“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从天然来源分离的枯草杆菌酶，其中，在保持枯草杆菌酶特性的情况下经过进一步修饰。而且，亲本枯草杆菌酶还可以是通过如以下文献所述的DNA改组技术制备的枯草杆菌酶：J.E.Ness等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，17，893-896(1999)。

术语“亲本枯草杆菌酶”可另外称为“野生型枯草杆菌酶”。

枯草杆菌酶的修饰

本文所用的术语“修饰”定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及对编码枯草杆菌酶的DNA所进行的遗传操作。修饰可以是氨基酸侧链的取代、目标氨基酸处的替换、缺失和/或插入。

枯草杆菌酶变体

在本发明的上下文中，术语枯草杆菌酶变体或突变的枯草杆菌酶指由表达突变基因的生物体产生的枯草杆菌酶，该突变基因来源于含原始或亲本基因并产生相应亲本酶的亲本微生物，所述亲本基因已发生突变以产生突变基因，这种突变基因在适宜的宿主中表达时产生所述的突变枯草杆菌酶。类似地，所述突变基因还可以来自通过DNA改组技术产生的亲本基因。

同源枯草杆菌酶序列

在本上下文中，两种氨基酸序列之间的同源性用参数“同一性”描述。

为了确定两种枯草杆菌酶之间的同一性程度，可以使用相同的设置应用(下文)GCG程序包9.1版的GAP方法。此方法的计算结果除了氨基酸序列对比外，还有两个序列之间的“同一性百分率”的计算结果。

根据此说明，本领域技术人员可常规地鉴定适宜的同源性枯草杆菌酶和相应的同源活性部位环区，它们可以根据本发明进行修饰。

分离的多核苷酸

本文所用的术语“分离的多核苷酸”指经分离和纯化并因此为适用于遗传工程化的蛋白质产生体系的形式的多核苷酸。这些分离的分子可以从其自然环境中分离，并包括cDNA和基因组克隆以及来自DNA改组实验或定点突变实验的多核苷酸。本发明的分离的多核苷酸不含其它通常与之相关的基因，但可包括5′和3′非翻译区如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域技术人员来说是显而易见的(例如，参见Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。术语“分离的核酸序列”另外可称为“分离的DNA序列”、“克隆的核酸序列”或“克隆的DNA序列”。

分离的蛋白质

术语“分离的”在应用于蛋白质时指此蛋白质已从其自然环境中分离出。

在优选的形式中，分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(参见以下))。

通过SDS-PAGE测定分离的蛋白质的纯度大于10％，优选大于20％，更优选大于30％。还优选提供通过SDS-PAGE测定纯度大于40％，大于60％，大于80％，更优选大于95％，并最优选大于99％的高度纯化形式的蛋白质。

术语“分离的蛋白质”可另称为“纯化的蛋白质”。

同源杂质

术语“同源杂质”意指任何来源于最初获得本发明枯草杆菌酶的同源细胞的杂质(如除了本发明枯草杆菌酶之外的另一多肽)。

自......获得

本文所用与特定的微生物源相关的术语“自......获得”意指该多核苷酸和/或枯草杆菌酶是由特定来源或由细胞产生，其中所述细胞中已插入来自于所述来源的基因。

底物

本文所用的与蛋白酶的底物相关的术语“底物”应以其最广义的形式解释为包括含有至少一个易于被枯草杆菌蛋白酶水解的肽键的化合物。

产物

本文所用的与来自蛋白酶酶促反应的产物有关的术语“产物”在本发明的上下文中应解释为包括涉及蛋白酶枯草杆菌酶的水解反应的产物。产物可以是在随后的水解反应中的底物。

洗涤性能

在本发明上下文中，术语“洗涤性能”用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于目标上的污渍，尤其卵污渍至清洁的能力。还参见实施例2中的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”。

％除去的蛋白质膜

在本发明上下文中，术语“％除去的蛋白质膜”用作酶在自动洗盘期间除去所要清洗的目标上存在的污渍，尤其卵污渍的能力。性能数据来自干净、脏的和洗过的钢盘的重力测量：

将该数据拟合四参数逻辑斯谛模型(logistic model)，其可以写做：

F(z)＝Y₀+V_max*C^λ(k_s ^λ+C^λ)

其中F(z)为从作为截距的Y₀计算的响应值，Y₀+V_max为最大响应，C为酶剂量，K_s为半饱和值。λ为陡度参数，其在米氏(Michaelis-Menten)模型中为1，但是在这里它等于或不等于1，因为我们允许拟合S形曲线。将每个曲线拟合与参考酶的性能相比较。

对于进一步细节，见本文实施例4中的“小规模自动盘洗涤(ADW小洗涤)”。

附图简述

图1显示了使用上文提到的GAP方法对枯草杆菌蛋白酶BPN’(a)和本发明的新枯草杆菌酶(b)和(c)的氨基酸序列之间的比对。

图2示意性描绘了实施例4中描述的ADW小洗涤的设置。

图3显示了对卵黄污渍的ADW小洗涤试验方法的结果。

图4显示了AMSA试验方法(实施例5)联合通过商业途径可得的方法的结果。

发明详述

在本发明的第一个有趣的方面，对卵污渍具有改进的洗涤性能的枯草杆菌酶是分离的枯草杆菌酶，其与SEQ ID NO：2(即成熟枯草杆菌酶)的氨基酸1-269所示氨基酸序列具有99.26％以上的同一性。在本发明的有趣的实施方案中，所述枯草杆菌酶与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269所示氨基酸序列具有99.26％以上或者99.63％以上的同一性(下文中称作“同源枯草杆菌酶”)。在本发明的另一有趣的实施方案中，所分离的枯草杆菌酶由SEQ ID NO：2的氨基酸1-269所示氨基酸序列组成。

在本发明的另一有趣的实施方案中，对卵污渍具有改进的洗涤性能的枯草杆菌酶是分离的枯草杆菌酶，其与SEQ ID NO：4(即成熟枯草杆菌酶)的氨基酸1-269所示氨基酸序列具有97.40％以上的同一性。在本发明的有趣的实施方案中，所述枯草杆菌酶与SEQ ID NO：4的氨基酸1-269所示氨基酸序列具有97.40％以上，或者97.77％以上，或者98.14％以上，或者98.51％以上，或者98.89％以上，或者99.26％以上，或者99.63％以上同源性。在本发明的另一有趣的实施方案中，所分离的枯草杆菌酶由SEQ ID NO：4的氨基酸1-269所示氨基酸序列组成。

可以使用完全Smith-Waterman比对进行序列比对和同一性得分计算，完全Smith-Waterman比对可用于蛋白质和DNA比对。对蛋白质和DNA比对分别使用默认得分矩阵BLOSUM50和同一性矩阵。缺口中第一个残基的罚分对于蛋白质为-12，对于DNA为-16，而对于缺口中额外残基的罚分对于蛋白质为-2，对于DNA为-4。比对来自Fasta包版本v3.1t11(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools forBiological Sequence Analysis″，PNAS 85：2444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA″Methods in Enzymology 183：63-98)。

通过进行此类比对，发现了具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的枯草杆菌酶和多种已知的枯草杆菌酶的氨基酸序列之间下面的同一性(百分数)。

	BLSavi	BLAP	BASBPN	BLSCAR	SEQ IDNO：6	WO01/75087SEQ IDNO：16	WO01/75087SEQ IDNO：24
								BLSavi	100
BLAP		100
								BASBPN			100
BLSCAR				100
								SEQ IDNO：6					100
WO01/75087SEQ IDNO：16	88.1	87.36	60.00	55.84	97.03	100
								WO01/75087SEQ IDNO：24	91.08	90.34	59.64	57.66	95.54		100
SEQ IDN0：4	91.5	90.7	60.7	59.1	95.91	96.65	97.40
								SEQ IDNO：2	88.1	87.4	59.3	55.8	96.28	99.26	95.17

¹⁾BLAP(迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶)已经在US 5,352,604中描述。

公知所称作的一个氨基酸残基向一个相似氨基酸残基的保守替换预期在酶的特征中仅产生微小改变。

下表I列出了保守氨基酸替换组。

表I

保守氨基酸替换共性碱性(带正电荷)酸性(带负电荷)极性疏水

氨基酸R＝精氨酸K＝赖氨酸H＝组氨酸E＝谷氨酸D＝天冬氨酸Q＝谷氨酰胺N＝天冬酰胺L＝亮氨酸I＝异亮氨酸

芳族小	V＝缬氨酸M＝甲硫氨酸F＝苯丙氨酸W＝色氨酸Y＝酪氨酸G＝甘氨酸A＝丙氨酸S＝丝氨酸T＝苏氨酸

因此，在本发明的另一有趣的实施方案中，具有SEQ ID NO：2和SEQID NO：4的氨基酸序列的枯草杆菌酶组合一个或多个氨基酸残基的替换、缺失和/或插入。

特别地，设想与本领域公知的其他修饰组合以为酶提供改进的性质。本领域描述了具有不同的改进性质的许多枯草杆菌酶变体并且它们中的许多在本文的“发明背景”部分提及(见上文)。

这些组合包括位置：222(提高氧化稳定性)、218(提高热稳定性)、Ca2+结合位点中的替换，其稳定该酶，例如，76位，和现有技术中许多其他显而易见的位置。

在其他实施方案中，本文描述的枯草杆菌变体可以有利地与任一如下位置的一个或多个修饰组合：

27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(BPN’编号)。

特别地，认为下面的BLSAVI、BLSUBL、BSKSMK、和BAALKP修饰也适于组合：

K27R、^*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K和T274A。

此外，含有任一种如下修饰：S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或者N76D+V104A或者修饰K27R、N76D、S101G、S103A、V104N、V104Y、V104I、V104A、N123S、G159D、A232V、Q236H、Q245R、N248D、N252K、T274A联合上面提及的任意一个或多个修饰的组合显示出改进的性质。

一种尤其有趣的变体是这样的变体，其除了根据本发明的修饰之外还含有下面的替换：

S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K。

此外，本发明的主要方面的枯草杆菌酶变体优选与129、131和194位的一个或多个修饰，优选作为129K、131H和194P修饰，最优选作为P129K、P131H和A194P修饰联合。预期这些修饰的任意一种在枯草杆菌酶变体生产中提供枯草杆菌酶变体的更高表达水平。

此外，预期在活性位点(b)环区域中插入至少一个额外的氨基酸残基，对应于从95位到103位(BASBPN编号)插入至少一个氨基酸残基，将赋予本发明的枯草杆菌酶的额外的洗涤性能。具体地，优选在下面的位置：98和99位，和99和100位之间插入至少一个额外的氨基酸残基，如一个额外的氨基酸残基。

此外，优选纯化形式的、与具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的枯草杆菌酶具有免疫化学同一性或者部分免疫化学同一性的分离的枯草杆菌酶也认为在本发明的范围内。通过免疫学交叉反应同一性试验通过众所周知的乌赫特朗尼氏双向免疫扩散方法测定免疫化学性质。具体地，通过Harboe和Ingild，在N.H.Axelsen，J.Kroll，和B.Weeks，编者，A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell ScientificPublications，1973，23章，或者Johnstone和Thorpe，Immunochemistryin Practice，Blackwell Scientific Publications，1982(更具体地27-31页)描述的方法通过免疫兔(或者其他啮齿动物)制备含有与具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的枯草杆菌酶的表位免疫反应或者结合所述表位的多克隆抗体的抗血清。使用特定免疫化学技术，具有免疫化学同一性的枯草杆菌酶是这样的枯草杆菌酶，其与抗血清以相同的方式反应，如沉淀的总融合(total fusion)、相同的沉淀形态，和/或相同的电泳迁移率。Axelsen，Bock，和Krll在N.H.Axelsen，J.Krll，和B.Weeks，编者，A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell ScientificPublications，1973，第10章中描述了免疫化学同一性的进一步解释。使用特定免疫化学技术，具有部分免疫化学同一性的枯草杆菌酶是这样的枯草杆菌酶，其与抗血清以部分相同的方式反应，如沉淀的部分融合、部分相同的沉淀形态、和/或部分相同的电泳迁移率。Bock和Axelsen在N.H.Axelsen，J.Krll，和B.Weeks，编者，A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，第11章中描述了部分免疫化学同一性。

抗体也可以是单克隆抗体。可以根据例如E.Harlow和D.Lane，编者，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，New York描述的方法制备和使用单克隆抗体。

本发明人已经分离了编码具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的枯草杆菌酶的基因并将其插入到大肠杆菌MT173中。含有该基因的大肠杆菌MT173菌株根据国际承认用于专利程序的微生物保藏(InternationalRecognition of the Deposits of Microorganisms for the Purpose of PatentProcedures)布达佩斯条约于2000年2月8日保藏在德国不伦瑞克的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig)，保藏号为DSM 15575。

本发明人已经分离了编码具有SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的枯草杆菌酶的基因并将其插入到大肠杆菌MT173中。含有该基因的大肠杆菌MT173菌株根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约于2000年2月8日保藏在德国不伦瑞克的德意志微生物保藏中心，保藏号为DSM 15574。

在本发明的一个有趣的实施方案中，所述枯草杆菌酶与克隆到保藏号为DSM 15575的大肠杆菌MT173中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶具有99.26％以上或者99.63％以上的同一性。

在本发明的另一个有趣的实施方案中，所述枯草杆菌酶与克隆到保藏号为DSM 15574的大肠杆菌MT173中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶具有97.40％以上，或者97.77％以上，或者98.14％以上，或者98.51％以上，或者98.89％以上，或者99.26％以上，或者99.63％以上的同一性。

如上文提到的，本发明的枯草杆菌酶显示出对卵污渍的极佳的洗涤性能。因此，为了技术人员在其研发工作早期能够选择用于该目的的有效而优选的枯草杆菌酶，本发明人已经提供了许多适宜的早期试验，其可以通过技术人员容易地进行以初步评估所讨论的枯草杆菌酶的性能。

从而，实施例2中公开的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”可以用于评估所选枯草杆菌酶的效率。换句话说，“标准的洗涤剂洗涤性能试验”可以用于评估枯草杆菌酶当掺入到标准洗涤组合物中时与参照系统(掺入到相同标准洗涤系统并且在相同条件下试验)相比从织物表面除去卵污渍的能力。使用该试验，可以初步研究所选的枯草杆菌酶除去卵污渍的适合性，基本理论是如果所选的枯草杆菌酶与参照酶相比在测试中不显示出显著改进，那么通常不必进行进一步的测试实验。

因此，尤其令人感兴趣的用于衣物洗涤目的的枯草杆菌酶是这样的枯草杆菌酶，其当在含有

6.2％2％4％22％

LAS(Nansa 80S)C16-C18脂肪酸的钠盐非离子表面活性剂(Plurafax LF404)沸石P

10.5％4％2％6.8％20％0.2％21％

Na2CO3Na2Si2O5羧甲基纤维素(CMC)丙烯酸盐液体CP5 40％过硼酸钠(经验式NaBO2.H2O2)EDTANa2SO4水(平衡量)

的标准洗涤剂组合物中如本文“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中描述的进行试验时，与在相同条件下试验的参考酶相比对卵污渍具有提高的洗涤性能。

可以采用在本文的实施例2中定义的所称作的“性能因子”对洗涤性能的改进进行定量。

在本发明的一个非常令人感兴趣的实施方案中，本发明的枯草杆菌酶在“洗涤性能试验”测试时，其性能因子至少为1，如至少为1.5，例如至少为2，优选至少为2.5，如至少为3，例如至少为3.5，特别是至少为4，如至少为4.5，例如至少为5。

明显地，优选本发明的枯草杆菌酶在所述的最低水平上，更优选在所述的中等水平上，最优选在所述的最高水平上符合上述标准。

本文中实施例3中公开的“完整规模自动盘洗涤(ADW)试验”或者实施例4中公开的“小规模自动盘洗涤(ADW小洗涤)”或者实施例5中公开的“自动机械压力测定(AMSA)”可以用于评估所选枯草杆菌酶在自动盘洗涤中的效率。换句话说，这些试验可以用于评估枯草杆菌酶当掺入到洗涤组合物(商业的或标准的)中时与参照系统(掺入到相同标准洗涤系统并且在相同条件下试验)相比从硬表面除去卵污渍的能力。使用该试验，可以初步研究所选的枯草杆菌酶除去卵污渍的适合性，基本理论是如果所选的枯草杆菌酶与参照酶相比在测试中不显示出显著改进，那么通常不必进行进一步的测试实验。

因此，尤其令人感兴趣的用于自动盘洗涤目的的枯草杆菌酶是这样的枯草杆菌酶，其当在含有：

三聚磷酸钠二水合柠檬酸钠一水合过硼酸钠四乙酰基乙二胺二硅酸钠(非晶体)直链脂肪醇乙氧基化物(非离子表面活性剂，低泡沫)马来酸/丙烯酸共聚物(钠盐，对碳酸钠50％活性)无水碳酸钠

23.0％22.3％6.0％2.0％5.0％2.0％4.0％加到100％

的标准洗涤剂组合物中如本文实施例3、4或5中描述的进行试验时，与在相同条件下试验的参考酶相比对卵污渍具有提高的性能。

通过用于人工产生多样性的标准技术，例如通过不同枯草杆菌酶基因的DNA改组(见WO95/22625和J.E.Ness等人，Nature Biotechnology，17，893-896(1999))可以构建本发明的枯草杆菌酶。

本发明的枯草杆菌酶显然还可以从天然来源中分离，即本发明的枯草杆菌酶可以是例如细菌枯草杆菌酶，例如革兰氏阳性细菌枯草杆菌酶，例如，芽孢杆菌属多肽，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结牙孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)枯草杆菌酶；或者链霉菌属枯草杆菌酶，如变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)枯草杆菌酶；或者革兰氏阴性细菌枯草杆菌酶，如大肠杆菌或假单胞菌(Pseudomonas)sp枯草杆菌酶。

本发明的枯草杆菌酶也可为真菌多肽，更优选酵母枯草杆菌酶如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia枯草杆菌酶；或者更优选的丝状真菌枯草杆菌酶如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉菌属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)枯草杆菌酶。

在一个令人感兴趣的实施方案中，枯草杆菌酶为卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasii、可鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)枯草杆菌酶。

在另一个有趣的实施方案中，枯草杆菌酶为棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporium)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichodermakoningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichoderma viride)枯草杆菌酶。

可以理解，对于上述的种，本发明包含理想和不理想状态和其它分类学等同物，如变形物，而不管它们已知的种名如何。本领域技术人员易于认识到适当等同物的同一性。

这些种的菌株对公众来说是易于在一些培养物保藏中心得到的，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究服务专利培养物保藏所，北方地区研究中心(NRRL)。

而且，可以采用上述的探针从包括自自然界(如土壤、堆肥、水等)分离的微生物的其它来源中鉴定并获得此类枯草杆菌酶。用于从天然栖所分离微生物的技术在本领域中是已知的。类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库可获得所述多核苷酸。一旦用探针检测到编码枯草杆菌酶的多核苷酸，可以采用本领域技术人员已知的技术分离或克隆该序列(例如，参见Sambrook等人，1989，上文)。

用于克隆本发明枯草杆菌酶的许多方法和用于将插入物导入基因(如枯草杆菌酶基因)的许多方法在本领域是熟知的，参见在“发明背景”部分引用的参考文献。

通常可以采用用于克隆基因和向该基因引入插入物(随机和/或定点)的标准方法以获得本发明的枯草杆菌酶。为了进一步描述适宜的技术，参照本文的实施例(见下文)和(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等人(编辑)“分子生物学最新方法”(“Current protocols in Molecular Biology”)，JohnWiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)“用于芽孢杆菌的分子生物学方法”(“Molecular Biological Methods for Bacillus”)，John Wiley和Sons，1990)；和WO 96/34946。

而且，本发明的枯草杆菌酶可以通过标准技术构建，用于人为地产生多样性，如通过不同枯草杆菌酶基因的DNA改组技术(参见WO95/22625；Stemmer WPC，自然370：389-91(1994))。例如将编码Savinase^的基因与实际上已鉴定的一种或多种部分枯草杆菌酶序列进行DNA改组，在随后筛选改进的洗涤性能后，提供本发明的枯草杆菌酶。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码本发明的枯草杆菌酶。

在一个有趣的实施方案中，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的核苷酸1到807所示的多核苷酸具有至少88％、或至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性，或者与SEQ ID NO：3的核苷酸1到807所示的多核苷酸具有至少88％、或至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。在本发明的另一个有趣的实施方案中，所述多核苷酸含有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3的核苷酸1到807所示的多核苷酸、其等位基因变体、或者其能够编码本发明枯草杆菌酶的片段。显然，所述多核苷酸可以由SEQ ID NO：1或者SEQ IDNO：3的核苷酸1到807所示的多核苷酸组成。

本发明还包括编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：2不同；本发明还包括编码具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：4不同。本发明还涉及SEQ ID NO：1的子序列，其编码具有蛋白酶解活性的SEQ ID NO：2的片段，还涉及SEQID NO：3的子序列，其编码具有蛋白酶解活性的SEQ ID NO：4的片段。

SEQ ID NO：1的子序列为SEQ ID NO：1的核苷酸1到807包括的多核苷酸，只是5’和/或3’末端的一个或多个核苷酸已经被缺失；SEQ IDNO：3的子序列为SEQ ID NO：3的核苷酸1到807包括的多核苷酸，只是5’和/或3’末端的一个或多个核苷酸已经被缺失；

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在现有技术中是已知的，它包括从基因组DNA中分离、由cDNA制备、或它们的组合。可以从这些基因组DNA克隆本发明的多核苷酸，例如通过使用已知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆的DNA片段。例如，参见Innis等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR：A Guide to Methods and Application)，Academic Press，纽约。可以使用其它的核酸扩增方法如连接酶链反应(LCR)、连接激活的转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

分离的多核苷酸可以例如通过遗传工程中所用的标准克隆方法获得，以便将该多核苷酸从其天然位置重新定位到可使其复制的不同位点处。克隆方法可包括切除和分离含编码枯草杆菌酶的多核苷酸的所需核酸片段，将此片段插入到载体分子，并将此重组载体整合到宿主细胞，在宿主细胞中复制出该多核苷酸的多个拷贝或克隆。此多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成来源、合成来源或它们的任一组合。

为本发明的目的，两个核酸序列之间的同一性程度如上述测定。

编码本发明的枯草杆菌酶的多核苷酸的修饰对于合成与该枯草杆菌酶基本类似的枯草杆菌酶的合成是必需的。术语“基本上类似的”枯草杆菌酶指非天然存在的枯草杆菌酶的形式。这些枯草杆菌酶在某些设计方式上可与从其天然来源分离得到的枯草杆菌酶不同，如在比活、热稳定性、pH最佳值等方面存在不同的变体。可以在呈现为SEQ ID NO：1一部分如其子序列所编码的多肽的多核苷酸的基础上或者在呈现为SEQ ID NO：3一部分如其子序列所编码的多肽的多核苷酸的基础上构建变体序列，和/或通过引入核苷酸替换来构建变体序列，其中引入的核苷酸替换不产生另一种由该多核苷酸编码的枯草杆菌酶的氨基酸序列，但其与欲用于生产这种酶的宿主生物体的密码子使用相匹配；或者通过引入可产生不同氨基酸序列的核苷酸替换。核苷酸替换的一般性描述，参见Ford等人，1991，蛋白质的表达和纯化(Protein Expressionand Purification)2：95-107。

对于本领域技术人员来说，显然这种取代可以在所述分子的关键功能区之外进行并仍产生活性枯草杆菌酶。对本发明的分离的多核苷酸编码的多肽的活性至关重要的氨基酸残基，优选其不发生替换，可以根据本领域中已知的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如，参见Cunningham和Wells，1989，科学(Science)244：1081-1085)。在后一技术中，在此分子的每一个带正电荷的残基处引入突变，并试验所得突变分子的蛋白水解活性，以鉴定此分子活性的关键氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也可以通过三维结构分析测定，这种三维结构是由诸如核磁共振分析、结晶学或光亲合标记技术而测定的(例如，参见de Vos等人，1992，科学255：306-312；Smith等人，1992，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的核酸核建体，所述核酸与一种或多种能够指导多肽在适宜的宿主细胞内表达的调控序列有效连接。

可以多种方式操作编码本发明枯草杆菌酶的分离多核苷酸以提供枯草杆菌酶的表达。在插入载体之前对多核苷酸操作的适当性和必需性取决于表达载体。采用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术在现有技术中是已知的。

所述调控序列包括所有表达本发明枯草杆菌酶所必需或有利的组分。每一种调控序列对于编码枯草杆菌酶的多核苷酸来说可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于先导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，所述调控序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。可以为此调控序列提供用于引入特定限制性位点的接头，促进此调控序列与编码枯草杆菌酶的多核苷酸编码区连接。

所述调控序列可以是适宜的启动子序列，其为被宿主细胞识别用于表达核酸序列的多核苷酸。所述的启动子序列含介导枯草杆菌酶表达的转录调控序列。所述的启动子可以是在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的任何多核苷酸，包括突变体、截短和杂合启动子，并可以由与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内枯草杆菌酶的基因获得。

用于指导本发明核酸构建体的转录，尤其是在细菌宿主细胞中转录的适宜的启动子的实例为得自以下的启动子：大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院院报75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院报80：21-25)。其它的启动子如在以下文献中所述：“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”，科学美国人(Scientific American)，1980，242：74-94；和Sambrook等人，1989，见上文。

用于指导在丝状真菌宿主细胞中本发明的核酸构建体的转录的适宜的启动子的实例为得自以下的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、Rhiomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhiomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)，以及Na₂-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)和它们的突变体、截短和杂合启动子。

在酵母宿主中，有用启动子得自以下来源的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它酵母宿主细胞的有用启动子如Romanos等人，1992，酵母(Yeast)8：423-488所述。

所述调控序列还可以是一种适宜的转录终止子序列，其为由宿主细胞识别用于终止转录的序列。终止子序列有效连接到编码枯草杆菌酶的多核苷酸的3’末端。任何在所选择的宿主细胞中发挥功能的终止子可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子得自以下来源的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

优选的酵母宿主细胞终止子得自以下来源的基因：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的酵母宿主细胞的终止子。

所述调控序列还可以是适宜的先导序列，为对宿主细胞翻译重要的mRNA非翻译区。所述先导序列有效连接到编码多肽的多核苷酸的5’末端。任何在所选择的宿主细胞内发挥功能的先导序列可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的先导序列得自以下来源的基因：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

适宜的酵母宿主细胞先导序列得自以下来源的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

所述调控序列还可以是聚腺苷酸化序列，该序列有效连接到多核苷酸的3’末端且在转录时被宿主细胞识别为一种将聚腺苷残基加至被转录的mRNA的信号的序列。任何在所选择的宿主细胞中发挥功能的聚腺苷酸化序列可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列得自以下来源的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列如由Guo和Sherman，1995，分子细胞生物学(Molecular Cellular Biology)15：5983-5990所描述。

所述的调控序列还可以是信号肽编码区，其编码连接到枯草杆菌酶的氨基末端的氨基酸序列并指导所编码的枯草杆菌酶进入细胞分泌途径。所述多核苷酸的编码序列的5’端本身可以包含一个天然连接在具有编码所分泌的枯草杆菌酶的编码区节段的翻译读框上的信号肽编码区。可选择地，所述编码序列的5’端可以包含此编码序列的外源信号肽编码区。当所述的编码序列并不天然包含一个信号肽编码区时，可能需要外源信号肽编码区。可选择地，所述的天然信号肽编码区可用外源信号肽编码区简单替换以促进枯草杆菌酶的分泌。但任何可指导所表达的枯草杆菌酶进入所选择的宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区均可用于本发明。

细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自以下来源的基因的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。其它的信号肽如在以下文献中所述：Simonen和Palva，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57：109-137。

丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自以下基因的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶。

酵母宿主细胞的有用信号肽得自以下来源的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的信号肽编码区。

所述调控序列还可以是编码位于枯草杆菌酶氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得的多肽已知是一种酶原或前多肽(或在某些情况下为酶原)。前多肽一般没有活性，并可以通过催化切割或自身催化切割来自前多肽的前肽而转化为成熟的活性多肽。所述的前肽编码区可以得自以下来源的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)。

当在枯草杆菌酶的氨基末端存在信号肽和前肽区两者时，所述的前肽区与枯草杆菌酶的氨基末端相邻，所述的信号肽区与所述前肽区的氨基末端相邻。

加入对与宿主细胞生长相关的多肽的表达进行调节的调控序列也是有利的。那些调控系统的实例是其对化学或物理刺激物(包括存在的调节化合物)的应答可以使得基因的表达被开启或关闭的系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可以用作调控序列。调控序列的其它实例为允许基因扩增的调控序列。在真核系统中，它们包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸与调控序列有效连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的核酸构建体、启动子和转录与翻译终止信号的重组表达载体。

包含编码本发明酶的核酸构建体的重组表达载体可以是任何可方便地进行重组DNA操作的载体。

载体的选择一般取决于它将被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体而存在的载体，这种载体的复制独立于染色体的复制，如质粒。另外，所述载体可以是在导入宿主细胞后，被部分或全部整合入宿主细胞基因组，并与将其整合进去的染色体一起复制。

所述载体优选为这样的表达载体，其中，编码本发明的酶的DNA序列与其它的DNA转录所需的节段有效连接。一般来说，所述表达载体来自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。术语“有效连接”指将所述诸节段以使其按它们的预期目的发挥功能的方式排列，如转录在启动子中引发并通过编码此酶的DNA序列而前行。

所述的启动子可以是任何在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的DNA序列，并可以得自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质编码基因。

用于细菌宿主细胞的适宜的启动子的实例包括以下基因的启动子：嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或噬菌体λ-P_R或P_L启动子或大肠杆菌 lac、 trp或 tac启动子。

如果需要，编码本发明酶的DNA序列还可以有效连接到适宜的终止子上。

本发明的重组载体还可包含能够使所述载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。

所述载体还可以包含可选择的标记，例如其产物弥补宿主细胞缺陷的基因，或编码如对抗生素像卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等的抗性，或对重金属或除草剂的抗性的基因。

为了指导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也公知为先导序列、前原序列或前序列)。可以将分泌信号序列以正确读框连接到编码酶的DNA序列。分泌信号序列一般位于编码此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信号序列可以是通常与该酶相关的或来自编码另一种分泌蛋白质的基因。

用于分别连接编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列，或通过适宜的PCR扩增方案装配这些序列和将它们插入至含有复制或整合所需信息的适宜的载体的方法对本领域技术人员来说是已知的(参见例如，Sambrook等人，在所引述的文章中)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。

导入到宿主细胞中的编码本发明的酶的DNA序列可以与所讨论的宿主同源或异源。如果与所述宿主细胞同源，即由该宿主细胞天然产生，编码本发明的酶的DNA序列一般与非天然环境中存在的另一启动子序列有效连接，或者在可应用的情况下与另一分泌信号序列和/或终止子序列相连接。所用术语″同源″指包括编码天然存在于所讨论的宿主生物体中的酶的DNA序列。所用术语“异源的”包括所述宿主细胞中本身不表达的酶的DNA序列。因此所述的DNA序列可以来源于另一生物体或者是合成的序列。

导入本发明的DNA构建体或重组载体的宿主细胞包括任何能够产生本发明的酶的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞，包括植物。

通过培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌属菌株，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，特别是迟缓芽孢杆菌，或链霉菌属菌株，如变铅青链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。

所述细菌的转化可以通过已知的方式用原生质体转化、电穿孔、接合或使用感受态细胞进行(参见Sambrook等人，见上)。

当在细菌如大肠杆菌中表达所述的酶时，该酶一般以非溶解性颗粒驻留于细胞质中(已知称作包涵体)，或由细菌分泌序列引导到周质间隙。在前一种情况下，将细胞裂解，回收所述颗粒，变性，其后通过稀释变性试剂使酶重新折叠。后一种情况下，该酶通过以下操作回收：如超声或渗透压休克破坏细胞，使所述的周质间隙的内容物释放，再回收该酶。

当在革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达该酶时，该酶可以驻留于细胞质中，或由细菌分泌序列引导到胞外培养基中。在后一种情况下，该酶可按下述方法从培养基中回收。

在本发明的另一实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。文中所用“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目)、产担子孢子酵母和属于半知菌的酵母(芽孢纲)。因为酵母的分类在将来可以改变，所以对于本发明，酵母将如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，编者，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所描述的定义。

在优选实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia细胞。

在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、可鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一优选实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门和卵菌门亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人，1995，上文定义)。丝状真菌特征是由菌丝体壁，其由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖组成。营养体生长是通过菌丝延长，碳代谢是专性需氧的。相比，酵母，如酿酒酵母的营养体生长是通过单细胞菌体的出芽，碳代谢是发酵的。

在甚至更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是但不限于，枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、草根霉菌属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)的细胞。

在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporium)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum细胞。在甚至最优选的实施方案中，丝状真菌亲本细胞是Fusariumvenenatum(Nirenberg sp.nov.)。在另一最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichodermakoningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

通过一种本身已知方法可以转化真菌细胞，所述方法包括原生质体形成、转化原生质体和再生细胞壁。用于转化曲霉属宿主细胞的适宜的方法在EP 238 023和Yelton等人1984，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属的适宜方法由Malardier等人，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。使用Becker和Guarente，Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编者，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，卷194，182-187页，Academic Press Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal ofBacteriology 153：163；和Hinnen等人，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920所描述的方法转化酵母。

产生本发明的枯草杆菌酶的方法

本发明进一步涉及产生本发明的枯草杆菌酶的方法，该方法包括：

a)在有助于所述枯草杆菌酶产生的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和

b)回收所述的枯草杆菌酶。

当含编码所述酶的DNA序列的表达载体转化入异源宿主细胞中时即可使本发明的该酶异源重组产生。

由此可以产生以不含同源杂质为特征的高度纯化的枯草杆菌酶组合物。

本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明的酶的同源细胞的任何杂质(例如除本发明的酶之外的其他多肽)。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于所讨论的宿主细胞生长的常规培养基。所表达的枯草杆菌酶可方便地分泌到培养基中，然后可以通过已知的方法回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，再利用盐如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质组分，接下来进行层析，如离子交换层析、亲和层析等。

本发明的枯草杆菌酶的用途

本发明的枯草杆菌酶可以有多种工业用途，尤其是在洗涤剂工业中。因此本发明还涉及包含本发明枯草杆菌酶的清洁或洗涤剂组合物，优选地为包含本发明枯草杆菌酶的洗衣或洗盘组合物。

含有本发明的枯草杆菌酶的洗涤剂组合物：

一般来说，清洁和洗涤剂组合物已在本领域中有所描述，对合适的清洁和洗涤剂组合物的进一步描述可以参见WO 96/34946；WO97/07202；WO 95/30011。

而且此处所述的实例表明本发明的枯草杆菌酶对卵污渍所表现出的改进的洗涤性能。

洗涤剂组合物

本发明的酶可以添加到清洁或洗涤剂组合物中而成为其中的组分。

例如，本发明的洗涤剂组合物可以制成用于手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括适用于预处理污染织物的洗涤添加剂组合物和漂洗添加的纤维软化剂组合物，或制成用于清洁普通家具硬表面的洗涤剂组合物，或被制成用于手洗或机洗的洗盘操作。

在一特定的方面，本发明提供一种包含本发明的枯草杆菌酶的洗涤添加剂。所述的洗涤添加剂和洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它的酶如另一种蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶、例如漆酶，和/或过氧化物酶。

一般来说，所选择的酶的性能应当与所选择的洗涤剂相适应(即pH-最适宜，与其它酶或非酶组分具相容性等)，且所述的酶应以有效剂量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括来自动物、植物、微生物的蛋白酶。来源于微生物的蛋白酶是优选的。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。所述的蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO 89/06270和WO 94/25583中所公开的镰孢霉属的蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729，WO 98/20115，WO98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在一个或多个下述位置发生替换的变体：27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(BPN’编号)。

优选的可商购的蛋白酶包括Alcalase^TM，Savinase^TM，Primase^TM，Duralase^TM，Esperase^TM和Kannase^TM(Novozymes A/S)，Maxatase^TM，Maxacal^TM，Maxapem^TM，Properase^TM，Purafect^TM，Purafect OxP^TM，FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括那些来源于细菌或真菌的脂肪酶。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括如EP258 068和EP 305 216中所公开的来自腐质霉属(Thermomyces与之同物异名)，例如来自H.1anuginosa(T.1anuginosus)的脂肪酶或如WO96/13580中所公开的来自H.Insolens的脂肪酶，假单胞菌脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.Alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.Pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.Cepacia)(EP 331376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.Fluorescens)，假单胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)，芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993)，生物化学与生物物理学学报(Biochemica etBiophysica Acta)，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)。

其它的实例为如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 407 225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所公开的脂肪酶变体。

优选的可商购的脂肪酶包括Lipolase^TM和LipolaseUltra^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些来源于细菌或真菌的淀粉酶。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如来源于芽孢杆菌的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌的特定菌株，详细内容参见GB 1,296,839。

有用的淀粉酶的实例是如WO 94/02597，WO 94/18314，WO96/23873和WO 97/43424中所描述的变体，尤其是那些在一个或多个下列位置发生替换的变体：15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM，Termamyl^TM，Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)，Rapidase^TM和Purastar^TM(来自GenencorInternational Inc.)。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括来源于细菌或真菌的纤维素酶。也包括其经化学修饰或蛋白工程突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、草根霉属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如可由在US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US5,776,757和WO 89/09259中公开的Humicola insolens、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的所述真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶是具有颜色保护优势的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例为如EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中所公开的纤维素酶。其它的实例为如那些在WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所公开的纤维素酶变体。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(NovozymesA/S)，Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些来源于植物、细菌或真菌的过氧化物酶/氧化酶。也包括化学修饰或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括如WO 93/24618，WO95/10602和WO 98/15257所述的来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus))和其变体的过氧化物酶。

所述的洗涤剂酶可以通过添加含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，也就是独立添加剂或组合添加剂可以制成例如颗粒状、液体、浆状等等。优选的洗涤剂添加剂形式为颗粒状(特别是非粉末化颗粒)、液体(特别是稳定的液体)或浆。

非粉末化颗粒可依照例如US 4,106,991和4,661,452所述进行生产并可任选地用已知的方法包被。蜡状包被材料的实例是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中，醇含12到20个碳原子且其中存在15到80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中给出了适合于通过流化床技术应用的成膜包被材料的实例。液体酶制剂可以依照现成的方法通过例如添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以稳定。受保护的酶可依照EP 238,216中所公开的方法进行制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如棒状、片状、粉末、颗粒、粘团或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或不含水的。

所述的洗涤剂组合物一般包含一种或多种表面活性剂，它们可以是非离子表面活性剂，包括半极性的和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。所述的表面活性剂一般占到0.1％到60％的重量。

当包含在所述洗涤剂中时，通常包含约1％到约40％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸酯、α-烯属磺酸酯、硫酸烷基酯(硫酸脂肪醇酯)、乙氧基硫酸醇酯、仲链烷磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或皂。

当包含在所述洗涤剂中时，通常含有约0.2％到约40％的非离子表面活性剂例如脂肪醇乙氧基化物、乙氧基化壬基酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

所述的洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂增洁剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层叠式硅酸盐(例如购自Hoechst的SKS-6)。

所述的洗涤剂还可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。

所述的洗涤剂还可以含有可能包含H₂O₂来源的漂白体系，如可以与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐结合的过硼酸盐或过碳酸盐。可选择地，所述的漂白体系可以包含例如酰胺、二酰亚胺或砜类的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物中的酶可以通过诸如以下的常规稳定剂稳定：多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，且所述的组合物也可制备为如WO 92/19709和WO 92/19708中所述的组合物。

所述的洗涤剂还可以包含其它的常规洗涤剂成分例如纤维调节剂包括黏土、增泡剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污渍悬浮剂、抗污渍再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增白剂、助溶剂、失泽抑制剂或香料。

目前认为在所述洗涤剂组合物中任何酶，特别是本发明的酶可以以相当于每升洗涤液中具有0.01-100mg酶蛋白质，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白质，特别优选每升洗涤液中具有0.1-1mg酶蛋白质的量加入。

本发明的酶可以添加到如WO 97/07202所公开的洗涤剂配方中，该文献引入本文作为参考。

通过下述的实例对本发明进行较详细说明，这些实例不作为对本发明请求保护范围的任何限制。

在洗涤剂组合物中，简写成分的意义如下：

LAS：             直链C₁₂烷基苯磺酸钠

TAS：             牛油烷基硫酸钠

XYAS：            C_1x-C_1y烷基硫酸钠

SS：              式2-丁基辛酸的仲皂化表面活性剂

25EY：            与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C₁₂-C₁₅的

                  直链伯醇

45EY：            与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C₁₄-C₁₅

                  的直链伯醇

XYEZS：           每摩尔与平均Z摩尔的环氧乙烷缩合的C_1x-C_1y烷基

                  硫酸钠

非离子：          平均乙氧基化程度3.8而平均丙氧基化程度为4.5

                  的C₁₃-C₁₅混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，由

                  BASF GmbH售出，商品名为Plurafax LF404

CFAA：            C₁₂-C₁₄烷基N-甲基葡糖酰胺

TFAA：            C₁₆-C₁₈烷基N-甲基葡糖酰胺

硅酸盐：          无定型硅酸钠(SiO₂∶Na₂O比率＝2.0)

NaSKS-6：         分子式为δ-Na₂Si₂O₅的晶状多层硅酸盐

碳酸盐：          无水碳酸钠

磷酸盐：          三磷酸钠

MA/AA：           1∶4马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约为80,000

聚丙烯酸酯：      平均分子量为8,000的聚丙烯酸酯均聚物，由BASF

                  GmbH销售，商品名为PA30

沸石A：           基本颗粒大小在1-10微米范围内的分子式为Na₁₂

                 (AlO₂SiO₂)₁₂·27H₂O的水合硅铝酸钠

柠檬酸盐：          二水合三柠檬酸钠

Citric：            柠檬酸

过硼酸盐：          无水一水合过硼酸钠漂白剂，经验式为NaBO₂·H₂O₂

PB4：               无水过硼酸钠四水合物

过碳酸盐：          经验式为2Na₂CO₃·3H₂O₂的无水过碳酸钠漂白剂

TAED：              四乙酰基乙二胺

CMC：               羧甲基纤维素钠

DETPMP：            二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto出售，

                    商品名为Dequest 2060

PVP：               聚乙烯吡咯烷酮聚合物

EDDS：              钠盐形式的乙二胺-N，N′-二琥珀酸[S，S]异构体

抑泡剂：            25％固体石蜡，熔点温度50℃，17％疏水硅石，

                    58％石蜡油

粒状抑泡剂：        12％硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％粒状淀粉

硫酸盐：            无水硫酸钠

HMWPEO：            高分子量聚环氧乙烷

TAE25：             乙氧基化牛油醇(25)

洗涤剂实例I

本发明的粒状纤维清洁组合物可如下制备：

直链C12烷基苯磺酸钠硫酸钠沸石A次氮基三乙酸钠酶PVPTAED硼酸

6.515.026.05.00.10.53.04.0

过硼酸盐苯酚磺酸盐次要组分

18.00.1补充至100％

洗涤剂实例II

本发明的致密颗粒纤维清洁组合物(密度800g/1)可依照下述制备：

45AS25E3S25E525E3TFAA沸石ANaSKS-6柠檬酸碳酸盐MA/AACMC酶TAED过碳酸盐EDDS粒状抑泡剂水/次要组分

8.02.03.03.02.517.012.03.07.05.00.40.16.022.00.33.5补充至100％

洗涤剂实例III

本发明的对洗涤彩色织物特别有用的粒状织物清洁组合物可依照下述制备：

LASTAS

10.72.4

--

TFAA45AS45E725E3S68E1125E5柠檬酸盐碳酸盐柠檬酸沸石ANa-SKS-6MA/AADETPMP酶硅酸盐硫酸盐PVP聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物过硼酸盐苯酚磺酸盐水/次要组分	-3.14.0-1.8-15.0-2.532.1-5.00.20.102.55.20.5-1.00.2	4.010.0-3.0-8.07.010.03.025.09.05.00.80.05-3.0-0.2--
			补充至100％

洗涤剂实例IV

本发明的提供“洗涤过程中的软化处理”能力的粒状织物清洁组合物可依照下述制备：

45ASLAS68AS

-7.61.3

10.0--

45E725E3椰油-烷基-二甲基羟基乙基氯化铵柠檬酸盐Na-SKS-6沸石AMA/AADETPMP过硼酸盐过碳酸盐TAED绿土黏土HMWPEO酶硅酸盐碳酸盐粒状抑泡剂CMC水/次要组分	4.0-1.45.0-15.04.00.415.0-5.010.0-0.103.010.01.00.2	-5.01.03.011.015.04.00.4-15.05.010.00.10.055.010.04.00.1
			补充至100％

洗涤剂实例V

本发明的强力液体织物清洁组合物可依照下述制备：

酸式LAS柠檬酸酸式25AS酸式25AE2S25AE7CFAA

-5.08.03.08.05

25.02.0----

DETPMP脂肪酸油酸乙醇丙二醇酶椰油-烷基二甲基羟基乙基氯化铵绿土黏土PVP水/次要组分	1.08-4.02.00.10--2.0	1.0-1.06.06.00.053.05.0-
			补充至100％

粉末自动洗盘组合物I

非离子表面活性剂	0.4-2.5％
		硅酸钠	0-20％
二硅酸钠	3-20％
		三磷酸钠	20-40％
碳酸钠	0-20％
		过硼酸钠	2-9％
四乙酰基乙二胺(TAED)	1-4％
		硫酸钠	5-33％
酶	0.0001-0.1％

粉末自动洗盘组合物II

非离子表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)	1-2％
		二硅酸钠	2-30％
碳酸钠	10-50％
		磷酸钠	0-5％

柠檬酸三钠二水合物	9-30％
		乙酸次氮基三钠(NTA)	0-20％
一水合过硼酸钠	5-10％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	1-2％
聚丙烯酸盐聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物)	6-25％
		酶	0.0001-0.1％
香料	0.1-0.5％
		水	5-10

粉末自动洗盘组合物III

非离子表面活性剂	0.5-2.0％
		二硅酸钠	25-40％
柠檬酸钠	30-55％
		碳酸钠	0-29％
碳酸氢钠	0-20％
		一水合过硼酸钠	0-15％
四乙酰基乙二胺(TAED)	0-6％
		马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
黏土	1-3％
		聚氨基酸	0-20％
聚丙烯酸钠	0-8％
		酶	0.0001-0.1％

粉末自动洗盘组合物IV

非离子表面活性剂	1-2％
		沸石MAP	15-42％
二硅酸钠	30-34％

柠檬酸钠	0-12％
		碳酸钠	0-20％
一水合过硼酸钠	7-15％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-3％
多聚物	0-4％
		马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
有机磷酸脂	0-4％
		黏土	1-2％
酶	0.0001-0.1％
		硫酸钠	平衡

粉末自动洗盘组合物V

非离子表面活性剂	1-7％
		二硅酸钠	18-30％
柠檬酸三钠	10-24％
		碳酸钠	12-20％
单过硫酸盐(2KHSO5·KHSO4·K2SO4)	15-21％
		漂白稳定剂	0.1-2％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-6％
		二亚乙基三胺五乙酸五钠盐	0-2.5％
酶	0.0001-0.1％
		硫酸钠，水	平衡

粉末和液体的具洗涤表面活性剂系统的洗盘组合物VI

非离子表面活性剂	0-1.5％
		脱水十八烷基二甲基胺N-氧化物	0-5％
脱水十八烷基二甲基胺N-氧化物和脱水十六烷	0-4％

基二甲基胺N-氧化物的80∶20wt.C18/C16混合物
		无水十八烷基双(羟乙基)N-氧化物和无水十六烷基双(羟乙基)胺N-氧化物的70∶30wt.C18/C16混合物	0-5％
平均乙氧基化程度为3的C13-C15烷基乙氧基硫酸酯	0-10％
		平均乙氧基化程度为3的C12-C15烷基乙氧基硫酸酯	0-5％
平均乙氧基化程度为12的C13-C15乙氧基化的醇	0-5％
		平均乙氧基化程度为9的C12-C15乙氧基化醇混合物	0-6.5％
平均乙氧基化程度为30的C13-C15乙氧基化醇混合物	0-4％
		二硅酸钠	0-33％
三聚磷酸钠	0-46％
		柠檬酸钠	0-28％
柠檬酸	0-29％
		碳酸钠	0-20％
一水合过硼酸钠	0-11.5％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-7.5％
		硫酸钠	0-12.5％
酶	0.0001-0.1％

非水的液态自动洗盘组合物VII

液体非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
		碱金属硅酸盐	3.0-15.0％

碱金属磷酸盐	20.0-40.0％
		选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液体载体	25.0-45.0％
稳定剂(例如磷酸和C16-C18链烷醇的不完全酯)	0.5-7.0％
		泡沫抑制剂(例如硅氧烷)	0-1.5％
酶	0.0001-0.1％

非水的液态洗盘组合物VIII

液体非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
		硅酸钠	3.0-15.0％
碱金属碳酸盐	7.0-20.0％
		柠檬酸钠	0.0-1.5％
稳定系统(例如细粒硅氧烷和低分子量二烷基聚乙二醇醚的混合物)	0.5-7.0％
		低分子量聚丙烯酸酯聚合物	5.0-15.0％
黏土凝胶增稠剂(例如斑脱土)	0.0-10.0％
		羟丙基纤维素聚合物	0.0-0.6％
酶	0.0001-0.1％
		选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物和乙二醇醚的液体载体	平衡量

触变性液体自动洗盘组合物IX

C12-C14脂肪酸	0-0.5％
		嵌段共聚物表面活性剂	1.5-15.0％
柠檬酸钠	0-12％
		三聚磷酸钠	0-15％
碳酸钠	0-8％
		三硬脂酸铝	0-0.1％

枯烯磺酸钠	0-1.7％
		聚丙烯酸盐增稠剂	1.32-2.5％
聚丙烯酸钠	2.4-6.0％
		硼酸	0-4.0％
甲酸钠	0-0.45％
		甲酸钙	0-0.2％
正癸基二苯基氧化物二磺酸钠	0-4.0％
		一乙醇胺(MEA)	0-1.86％
氢氧化钠(50％)	1.9-9.3％
		1，2-丙二醇	0-9.4％
酶	0.0001-0.1％
		抑泡剂、染料、香料、水	平衡量

液体自动洗盘组合物X

脂肪醇乙氧基化物	0-20％
		脂肪酸酯磺酸酯	0-30％
十二烷基硫酸钠	0-20％
		烷基多苷	0-21％
油酸	0-10％
		二硅酸钠一水合物	18-33％
脱水柠檬酸钠	18-33％
		硬脂酸钠	0-2.5％
一水合过硼酸钠	0-13％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-8％
马来酸/丙烯酸共聚物	4-8％
		酶	0.0001-0.1％

含被保护的漂白颗粒的液体自动洗盘组合物XI

硅酸钠	5-10％
		焦磷酸四钾	15-25％
三磷酸钠	0-2％
		碳酸钾	4-8％
被保护的漂白颗粒，如氯	5-10％
		聚合增稠剂	0.7-1.5％
氢氧化钾	0-2％
		酶	0.0001-0.1％
水	平衡

XII：如I、II、III、IV、VI和X所述的自动洗盘组合物，其中，由过碳酸盐替代过硼酸盐。

XIII：如I-VI所述的自动洗盘组合物，其还含有锰催化剂。所述的锰催化剂可以是例如，在“用于低温漂白的高效锰催化剂”(“Efficientmanganese catalysts for low-temperature bleaching”)，自然，(1994)，369，637-639中所述的化合物中的一种。

材料和方法

蛋白水解活性

在本发明的上下文中蛋白水解活性是用Kilo NOVO蛋白酶单位(KNPU)表示的。所述的活性相对于酶标准品(SAVINASE^)而确定，所述的测定是基于在标准条件下蛋白水解酶对二甲基酪蛋白(DMC)溶液的消化进行的，所述的标准条件为50℃，pH 8.3，反应时间9分钟，测定时间3分钟。需要时可向Novozymes A/S，Denmark索取AF 220/1文件夹，该文件夹包括在此作为参考。

GU是甘氨酸单位，定义为在标准条件下，N-乙酰基酪蛋白作为底物在40℃温育15分钟，产生相当于1毫摩尔甘氨酸的NH₂-基团量的蛋白水解酶活性。

也可以用PNA试验根据与在美国油脂化学家学会会志(Journal ofAmerican Oil Chemists Society)，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，L.A.，(1988)中描述的底物琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-对硝基苯酚反应测定酶活性。

实施例1-构建和表达本发明的枯草杆菌酶

实施例1包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4。应该理解术语SEQ IDNO：2在任何时候可以被术语SEQ ID NO：4替代。

具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶位于载体pJRoC112中，所述载体与质粒pKH400(以前在WO98/41623中描述)非常相似。所述质粒与编码成熟枯草杆菌蛋白酶的区域外面即复制起点相似，赋予氯霉素抗性的cat基因、指导枯草杆菌蛋白酶转录起始的启动子和来自Savinase的前/原区在这些质粒中相同。不同之处仅存在于编码成熟枯草杆菌蛋白酶的基因部分内。

该质粒在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中都复制。在枯草芽孢杆菌中，本发明的枯草杆菌蛋白酶从该质粒表达。下面描述蛋白酶的发酵和纯化。

通过在1841和3730位导入两个BamHI位点从pJS3(如J.Schidt等人在Protein and Peptide Letters，3，39-44(1996))中描述的，含有编码枯草杆菌酶309(Savinase)的合成基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体)构建PKH400。

已经将成熟基因亚克隆到质粒pzero-2(Invitrogen，Groningen，荷兰)。将含有具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的枯草杆菌酶的完整成熟区的约1240bp PmeI-BamHI片段与载体pZero-2连接并用限制性内切酶BamHI-EcoRV消化。将连接混合物转化到感受态大肠杆菌细胞中。通过PCR分析转化体以证实插入片段的存在并对编码成熟枯草杆菌蛋白酶的该片段测序。所得质粒称作pTVB364，于2000年2月10日保藏在DSMZ，保藏号为DSM 13306。

发酵：

产生枯草杆菌酶的发酵是通过将含有100ml BPX培养基的500ml带挡板的三角瓶在回转式摇床上(300转/分钟)于30℃培养5天而进行的。

因此，为了制备如2升的肉汤，同时发酵了20个三角瓶。

培养基：

BPX培养基组成(每升)马铃薯淀粉大麦粉大豆粉Na2HPO4×12H2O泊洛尼克(Pluronic)酪蛋白酸钠

100g50g20g9g0.1g10g

培养基中的淀粉用α-淀粉酶液化，并将培养基于120℃加热灭菌45分钟。灭菌后通过加入NaHCO₃至0.1M，将培养基的pH调节至9。

纯化

该过程涉及到对在芽孢杆菌宿主细胞中产生本发明的枯草杆菌酶的2升规模发酵物进行纯化。

用1升的烧杯于5000转/分钟离心约1.6升发酵液35分钟。用10％醋酸将上清调节至pH 6.5，并通过Seitz Supra S100过滤板过滤。

用配备有Amicon S1Y10 UF柱体的Amicon CH2A UF单元浓缩滤液至约400ml。室温下离心并过滤该UF浓缩物，然后吸附于pH 7的杆菌肽亲和柱上。使用25％异丙醇和1M氯化钠(在具有0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙的pH调节至7的缓冲液中)将枯草杆菌酶从该杆菌肽柱上室温洗脱下来。

合并来自杆菌肽纯化步骤的具蛋白酶活性的级分，并加至用pH调节至6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液平衡过的750ml Sephadex G25柱(直径为5cm)。

合并来自Sephadex G25柱的具蛋白水解活性的级分，并加至用pH调节至6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液平衡过的150ml CM Sepharose CL 6B阳离子交换柱(直径为5cm)。

使用在2升同一缓冲液中的0-0.1M氯化钠线性梯度洗脱蛋白酶。

在最后的纯化步骤中，合并来自CM Sepharose柱的含蛋白酶的级分，并在配备有GR81PP膜(来自Danish Sugar Factories Inc.)的Amicon超滤室中浓缩。

通过使用上述构建和发酵技术，和上面的分离步骤，产生和分离了具有SEQ ID NO：2中给出的氨基酸序列的新的枯草杆菌酶。

实施例2-“标准的洗涤剂洗涤性能试验”

为评估枯草杆菌酶在标准洗涤剂组合物中的洗涤性能，用下述的实验条件进行了标准洗涤实验：

洗涤剂：洗涤剂剂量pH洗涤时间温度：水硬度：酶浓度：测试系统：织物/体积：测试材料：

标准洗涤剂4.0g/l10.120分钟30℃15°dH10nm(在洗涤剂溶液中)10ml烧杯和搅拌棒5件织物(2.5cm)/50ml洗涤剂溶液WFK10N(卵污渍)

所述的标准洗涤剂的组分如下：

6.2％2％4％

LAS(Nansa 80S)C16-C18脂肪酸钠盐非离子表面活性剂(Plurafax LF404)

22％10.5％4％2％6.8％20％0.2％21％

沸石PNa2CO3Na2Si2O5羧甲基纤维素(CMC)丙烯酸盐液体CP5 40％过硼酸钠(经验式NaBO2·H2O2)EDTANa2SO4水(平衡量)

通过添加HCl或NaOH将洗涤剂溶液的pH调节到10.1。通过添加CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺∶Mg²⁺＝4∶1)将水硬度调节到15°dH。洗涤后将织物用自来水冲洗并于空气中干燥。

对试验材料反射能力(R_{枯草杆菌酶})的测定是用Macbeth ColorEye 7000光度计(Macbeth，Division of Kollmorgen Instruments Corporation，德国)在460nm下进行的。测定方法依制造商的建议进行。

为确定空白值，进行了不添加酶的类似洗涤实验。接下来如上述进行反射能力(R_空白)的测定。

然后如上所述进行参考实验，其中测定了Savinase^的洗涤性能。接下来，如上所述测定了反射能力(R_savinase)。

所述的洗涤性能是用根据下述公式定义的性能因子(P)进行评估的：

      P＝(R_{枯草杆菌酶}-R_空白)-(R_savinase-R_空白)

       ＝R_{枯草杆菌酶}-R_savinase

实施例3-完整规模自动盘洗涤(ADW)试验

以家用盘洗涤组合物使用标准条件试验了本发明的枯草杆菌酶在完整规模ADW中的性能。所用的污渍是涂在钢盘上的卵/奶混合物。此外，加入含有多种食物的稳定污渍(ballast soil)。

实例：

洗涤剂洗涤剂剂量pH水硬度温度酶浓度试验方法机器

商业或标准洗涤剂5.0g/l按现状按现状50℃或55℃10nM到230nM，基于机器中洗涤水的总体积如下述用卵/奶或者卵黄将钢盘弄脏Bosch或其他通过商业途径可得的

洗涤程序：

使用自来水；应用下面的步骤：

步骤	时间(秒)	温度
			主要洗涤	12001)	50℃2)
漂洗	3001)	39℃2)
			干燥	1530	65℃

1)在所指示的时间间隔期间加热自来水。

2)加热自来水时的最后温度。

用于完整规模ADW试验的卵/奶弄脏

材料：

220ml全脂奶

15个卵，中等大小

钢盘，直径18cm

将盘洗涤组合物在微波炉中以85℃加热5分钟以失活组合物中的酶活性。

钢盘的弄脏：

将220ml全脂奶与15个生卵在Braun UK 20厨房机器中混合2分钟。过滤后，通过浸没在混合物中将不锈钢盘弄脏。

将盘子以直立位置在室温中干燥过夜。然后将干燥的盘子在120℃加热45分钟以便变性表面上的蛋白质。

用于完整规模ADW试验的卵黄弄脏

材料：

3dL巴氏消毒的卵黄。

钢盘，直径18cm

将盘洗涤组合物在微波炉中以85℃加热5分钟以失活组合物中的酶活性。

钢盘的弄脏：

在精确到3位小数的天平上对钢盘称重。

约3dL巴氏消毒的卵黄充分混合并通过厨房筛过滤。

将卵黄液在盘子上滚上一薄层，例如，使用油漆滚筒。进行两次(两次滚动期间不干燥，并且第二次也将滚筒浸泡在卵黄中)。

所得卵黄层应该约1g。

将盘子放置在室温干燥最少4小时。

然后将弄脏的盘子和支架下降到煮沸去矿物质水中恰好30秒。

将盘子在室温放置干燥30分钟。

室温干燥后，将盘子在烘箱中80℃干燥30分钟。

将盘子在室温冷却30-60分钟，之后将它们再次称重。

洗涤和室温下干燥时，将盘子在烘箱中80℃干燥30分钟。

再次在室温冷却30-60分钟后将盘子称重。

ADW实验

对于每次实验，根据上面所列条件洗涤10个弄脏的盘子。除了弄脏的盘子，机器还装有10个瓷盘、4个玻璃杯、4个茶杯和16副刀具。

此外，将50g稳定浆液(ballast slurry)加入到机器。浆液的成分如下：制作3000g，并且称出下面的组分：

步骤	材料	剂量(g)
			1	人造奶油	189

	猪油	189
				油炸油(Deep-Fry Oil)	189
肉汤粉	51
		2		油菜籽油	948
卵	474
			3	调味蕃茄酱	189
芥末	189
		4		高脂肪乳脂，38％脂肪	282
全脂奶，3.5％脂肪	189
			5	马铃薯面粉	66
小麦面粉	18
		Quark粉		18
苯甲酸	9

1.将人造奶油、猪油和油炸油在低温熔解。之后在良好搅拌下加入筛过的肉汤粉并冷却到40℃。

2.混合油菜籽油和卵。

3.向油/卵物质加入调味蕃茄酱和芥末，然后混合5分钟。

4.将1)中产生的脂肪/肉汤(冷却)缓慢加入到3)中产生的混合物并继续混合5分钟。

5.向混合物加入高脂肪乳脂和全脂奶并混合5分钟。

6.加入最后的面粉和粉末(表中步骤5)。将稳定浆液混合成光滑物质。

7.称出50g稳定浆液。

卵/奶的测量和计算

使用Minolta Chroma Meter(型号：CR-300)在6个不同位置测量光反射值(R值)。在干净盘子(R_干净)上、加热后脏盘子(R_脏)上和洗涤后盘子(R_洗涤后)上进行测量。

根据下面的公式计算除去的蛋白质膜(％RPF)：

％RPF＝100％×(R_洗涤后-R_脏)/(R_干净-R_脏)

卵/奶的测量和计算

性能数据来自干净的、脏的和洗涤的钢盘的重力测量。性能计算为：

数据分析

将％RPF拟合为所加入的mg酶蛋白的函数。

将该数据拟合四参数逻辑斯谛模型，其可以写做：

F(z)＝Y₀+V_max*C^λ(k_s ^λ+C^λ)

其中F(z)为从作为截距的Y₀计算的响应值，Y₀+V_max为最大响应，C为酶剂量，K_s为半饱和值。λ为陡度参数，其在米氏(Michaelis-Menten)模型中为1，但是在这里它等于或不等于1，因为我们允许拟合S形曲线。

将每个曲线拟合与参照酶的性能比较。

实施例4小规模自动盘洗涤(ADW小洗涤)

ADW小洗涤描述

小洗涤开发为计算机化机器人。每个机器人携带具有8个支架的框架。每个支架含有将要弄脏和洗涤的6个35×45mm钢盘。如果需要，6个位置可以代表剂量范围中的6个点，例如，如下文所示的0-20-40-75-100-160nM酶。一个洗涤单位由分别为卵黄和卵/奶弄脏的两个盘和具有150ml wash float的恒温容器组成。机器人一次对24个容器进行操作。

如所提到的，对于待测的每种酶需要两个支架，一个支架用卵黄弄脏，另一个用卵/奶弄脏。在每一次试验中包括参考酶，并且每种酶剂量重复两次。

设置在图2中示意性描绘。

如下制备卵/奶污渍：

将10个卵和167ml奶在食物处理器中低速混合2分钟。混合物在使用前通过一次性布过滤。将支架安装两个小盘子并浸入过滤的污渍中。将盘子直立在吸收性桌布上。将它们放置干燥4小时或者直到第二天，将它们通过在热空气烘箱中以120℃热处理变性35分钟。

如下制备卵黄污渍：

将20个卵黄～400ml巴氏消毒的给养(catering)卵黄(～420g)+167ml去离子水在食物处理器中以最低速混合2分钟，然后在使用前通过一次性布过滤。将支架安装两个小盘子并浸入过滤的污渍中。将盘子直立在吸收性桌布上。将它们放置干燥4小时或者直到第二天，然后将它们在沸水中变性30秒。变性后，将盘子在热空气烘箱中以80℃热处理变性30分钟。

洗涤剂

通过在市场上购买完全配制的商业洗涤剂并随后通过热处理(85℃水溶液中5分钟)使酶组分失活可以得到用于本发明的改组蛋白酶的洗涤性能试验的洗涤剂。此外，没有酶的商业洗涤剂基质可以直接从生产商购买。此外，可以购买适宜的标准洗涤剂并用于洗涤性能试验。

可以在标准洗涤剂组合物中测试蛋白酶，所述洗涤剂含有

三聚磷酸钠二水合柠檬酸钠一水合过硼酸钠四乙酰基乙二胺二硅酸钠(非晶体)

23.0％22.3％6.0％2.0％5.0％

直链脂肪醇乙氧基化物(非离子表面活性剂，低泡沫)马来酸/丙烯酸共聚物(钠盐，对碳酸钠50％活性)无水碳酸钠

2.0％4.0％加到100％

洗涤floats通过将CaCl₂、MgSO₄和NaHCO₃、去离子水混合以配制多种水硬度值来制备。加入洗涤剂：18-25g/4L。

评估：

性能数据来自干净的、脏的和洗涤的钢盘的重力测量。性能计算为：

数据分析

将％RPF拟合为所加入的mg酶蛋白的函数。

将该数据拟合四参数逻辑斯谛模型，其可以写做：

F(z)＝Y₀+V_max*C^λ(k_s ^λ+C^λ)

其中F(z)为从作为截距的Y₀计算的响应值，Y₀+V_max为最大响应，C为酶剂量，K_s为半饱和值。λ为陡度参数，其在米氏(Michaelis-Menten)模型中为1，但是在这里它等于或不等于1，因为我们允许拟合S形曲线。将每个曲线拟合与参考酶的性能相比较。

使用上面对卵黄污渍的试验方法，得到了图3中所示结果(％RPF为mg酶蛋白的函数)。如所看到的，本发明的枯草杆菌酶与SEQ IDNO：6(称作PH004)相比显示出对卵污渍的改进的洗涤性能。

实施例5自动化机械压力测定(AMSA)

AMSA试验方法描述：

进行洗涤实验以评估洗涤组合物中所选改组蛋白酶变体的洗涤性能。使用自动机械压力测定(AMSA)测试本申请的蛋白酶。使用AMSA，可以检查大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA盘具有许多用于试验溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的织物样品对所有缝开口强力挤压。在洗涤时间期间，盘子、试验溶液、织物和盖子剧烈振动从而使受试溶液与织物接触并以规则、周期性摆动方式应用机械压力。关于进一步描述见WO 02/42740，特别是第23-24页的“特定方法实施方案”段落。

在下面的特定实验条件下进行实验：

商业洗涤剂基质	欧洲三合一ADW型
		洗涤剂剂量	5-5.5g/L
试验溶液体积	160μL
		pH	按现状
洗涤时间	20分钟
		温度	50℃
水硬度	25°dH
		试验溶液中的酶浓度	对于wfk10N为0.25mg/L，0.5mg/L，1mg/L和2.5mg/L对于变性wfk10N为1mg/L，2.5mg/L，4mg/L和6mg/L
试验物质	Wfk10N，或者变性wfk10N

通过向试验系统加入CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺∶Mg²⁺＝4∶1)调节水硬度。洗涤后，将织物用自来水冲洗并干燥。

酶变体的性能测量为用该特定蛋白酶洗涤的织物样品的颜色的亮度。亮度也可以表达为当用白光照亮时从织物样品反射的光的强度。当织物受到污染时，反射光的强度低于干净织物的强度。因此，反射光的强度可用于测量改组蛋白酶的洗涤性能。

使用专业平板扫描仪(PFU DL2400pro，可以从：J.M.Thomsen，Dorfgade 2，Dorf，Dronninglund，DK-9330得到)测色，该扫描仪用于捕获洗涤的织物样品的图像。该扫描仪可以具有200dpi的分辨率并输出24位的输出色深(color depth)。为了得到准确结果，经常用Kodakreflective IT8 target校准扫描仪。

为了从扫描的图像提取光强度值，使用专门设计的软件应用程序(Novozymes Color Vector Analyzer)。该程序从图像接受24位象素值并将它们转化成红、绿和蓝色(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加并考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：

$\mathrm{Int}=\sqrt{r^2+g^2+b^2}$

洗涤剂

通过在市场上购买完全配制的商业洗涤剂并随后通过热处理(85℃水溶液中5分钟)使酶组分失活可以得到用于本发明的改组蛋白酶的洗涤性能试验的洗涤剂。此外，没有酶的商业洗涤剂基质可以直接从生产商购买。此外，可以购买适宜的标准洗涤剂并用于洗涤性能试验。

可以在标准洗涤剂组合物中测试蛋白酶，所述洗涤剂组合物含有

三聚磷酸钠二水合柠檬酸钠一水合过硼酸钠四乙酰基乙二胺二硅酸钠(非晶体)直链脂肪醇乙氧基化物(非离子表面活性剂，低泡沫)马来酸/丙烯酸共聚物(钠盐，对碳酸钠50％活性)无水碳酸钠

23.0％22.3％6.0％2.0％5.0％2.0％4.0％加到100％

织物：

从wfk-Cleaning Technology Research Institute，Christenfeld 10，D-41379 Brüggen-Bracht，德国可以得到标准织物。特别是wfk10N(用卵/色素污染的棉织物)、wfk10eggEG(用卵黄污染的棉织物)型。在高压灭菌锅中进行wfk10N的变性。

使用上面的试验方法联合通过商业途径可得到的洗涤剂，得到了图4中显示的结果。可以看到，本发明的枯草杆菌酶与SEQ ID NO：6的蛋白酶(称作PH004)相比显示出对卵污渍的改进的洗涤性能。

生物材料的保藏

下面的生物材料已经根据布达佩斯条约保藏在德国不伦瑞克的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig)，其具有下面的保藏号：

保藏物	保藏号	保藏日
			大肠杆菌MT173	DSM 15574	2003年4月16日
大肠杆菌MT173	DSM 15575	2003年4月16日

                            序列表

<110>诺和酶股份有限公司

     麦克西根公司

<120>枯草杆菌酶

<130>10414.003-US

<160>6

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>807

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>通过DNA改组制备

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(807)

<223>通过DNA改组制备

<400>1

gcg caa tcg gta cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc cca gct gcc     48

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1               5                   10                  15

cat aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat     96

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

            20                  25                  30

aca ggg ata tcc act cat cca gat cta aat att cgt ggt ggc gca agc    144

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

        35                  40                  45

ttt gta cca ggg gaa ccg tcg act caa gat ggg aac ggg cat ggg acg    192

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

    50                  55                  60

cac gtt gca gga acg att gcg gct ctt gat aat tca atc ggt gtg att    240

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Ser Ile Gly Val Ile

65                  70                  75                  80

ggt gtg gca cca agt gct gat cta tac gct gta aaa gta ctt gga gca    288

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

                85                  90                  95

aat ggt aga gga agc gtt agt gga att gct caa ggt cta gag tgg gct    336

Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

            100                 105                 110

gca gcg aat aac atg cat att gct aac atg agt ctc ggt agt gat gca    384

Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala

        115                 120                 125

cct agt act aca ctt gag cgt gca gtc aac tac gcg aca agc caa ggt    432

Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly

    130                 135                 140

gta cta gtt att gca gcg act ggt aac aac ggt tct ggt tca gtt ggc    480

Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly

145                 150                 155                 160

tat cct gct cgt tat gca aac gca atg gct gta gga gcg act gac caa    528

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

                165                 170                 175

aac aac aga cgt gca aac ttt tct cag tac ggt aca gga att gac atc    576

Asn Asn Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile

            180                 185                 190

gta gca cct gga gtt aac gta caa agt acg tat cca gga aac cgt tat    624

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr

        195                 200                 205

gtg agt atg aat ggt aca tct atg gcc act cca cac gtc gcc ggc gtc    672

Val Ser Met Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val

    210                 215                 220

gcc gcc ctt gtt aaa caa aag aac cca tct tgg tct aat gta caa att    720

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225                 230                 235                 240

cga aat cat cta aag aat acg gca act agt tta gga agc acg aac ttg    768

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

                245                 250                 255

tat gga agc gga ctt gtt aac gca gaa gcg gca acg cgt                807

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

            260                 265

<210>2

<211>269

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成构建体

<400>2

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1               5                   10                  15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

            20                  25                  30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

        35                  40                  45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

    50                  55                  60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Ser Ile Gly Val Ile

65                  70                  75                  80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

                85                  90                  95

Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

            100                 105                 110

Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala

        115                 120                 125

Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly

    130                 135                 140

Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly

145                 150                 155                 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

                165                 170                 175

Asn Asn Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile

        180                     185                 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr

        195                 200                 205

Val Ser Met Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val

    210                 215                 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225                 230                 235                 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

                245                 250                 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

            260                 265

<210>3

<211>807

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>通过DNA改组制备

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(807)

<223>通过DNA改组制备

<400>3

gcg caa tcg gta cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc cca gct gcc     48

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly lle Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1               5                   10                  15

cat aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat     96

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

            20                  25                  30

aca ggg ata tcc act cat cca gat cta aat att cgt ggt ggc gca agc    144

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

        35                  40                  45

ttt gta cca ggg gaa ccg tcg act caa gat ggg aat ggg cac ggg acg    192

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly Hi s Gly Thr

    50                  55                  60

cac gtt gca gga aca gtg gca gct ctt aat aat tca atc ggt gtg att    240

His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile

65                  70                  75                  80

ggt gtg gca cca agt gct gat cta tac gct gta aaa gta ctt gga gca    288

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

                85                  90                  95

aat ggt aga gga agc gtt agt gga att gct caa ggt cta gag tgg gct    336

Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

            100                 105                 110

gca gcg aat aac atg cat att gct aac atg agt ctc ggt agt gat gca    384

Ala A1a Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala

        115                 120                 125

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Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly

    130                 135                 140

gta cta gtt att gca gcg act ggt aac aac ggt tcc ggt tca gta ggc    480

Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly

145                 150                 155                 160

tat ccg gcc cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga gct act gat cga    528

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

                165                 170                 175

aac aac aac cgc gct agc ttt tca cag tat ggc gca ggc ctt gac att    576

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

            180                 185                 190

gtc gca ccc ggg gta aac gtg cag agc aca tac cca ggt tca aca tat    624

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

        195                 200                 205

gcc agc tta aac ggt aca tcg atg gct act cct cat gtt gca ggt gcg    672

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

    210                 215                 220

gcc gcc ctt gtt aaa caa aag aac cca tct tgg tct aat gta caa att    720

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225                 230                 235                 240

cga aat cat cta aag aat acg gca act agt tta gga agc acg aac ttg    768

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

                245                 250                 255

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Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

            260                 265

<210>4

<211>269

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成构建体

<400>4

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1               5                   10                  15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

            20                  25                  30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

        35                  40                  45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

    50                  55                  60

His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile

65                  70                  75                  80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

                85                  90                  95

Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

            100                 105                 110

Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala

        115                 120                 125

Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly

    130                 135                 140

Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly

145                 150                 155                 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

                165                 170                 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

            180                 185                 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

        195                 200                 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

    210                 215                 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225                 230                 235                 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

                245                 250                     255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

            260                 265

<210>5

<211>275

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>5

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1               5                   10                  15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

            20                  25                  30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

        35                  40                  45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

    50                  55                  60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

65                  70                  75                  80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

                85                  90                  95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

            100                 105                 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

        115                 120                 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

    130                 135                 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145                 150                 155                 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

                165                 170                 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

            180                 185                 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

        195                 200                 205

Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

    210                 215                 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225                 230                 235                 240

Trp Thr Ash Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

                245                 250                 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

            260                 265                 270

Ala Ala Gln

        275

<210>6

<211>269

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>通过DNA改组制备

<400>6

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

l               5                   10                  15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

            20                  25                  30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

        35                  40                  45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

    50                  55                  60

His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile

65                  70                  75                  80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

                85                  90                  95

Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

            100                 105                 110

Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala

        115                 120                 125

Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly

    130                 135                 140

Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly

145                 150                 155                 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

                165                 170                 175

Asn Asn Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile

            180                 185                 190

Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Glu Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Ser Tyr

        195                 200                 205

Asp Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val

    210                 215                 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225                 230                 235                 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

                245                 250                 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

            260                 265

Claims (25)

1.枯草杆菌酶，其选自

(a)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1到269所示氨基酸序列具有99.26％以上同一性；或

(b)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)MT173 DSM15575中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有99.26％以上同一性的所述枯草杆菌酶的变体；或

(c)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO：4的氨基酸1到269所示氨基酸序列具有97.40％以上同一性；或

(d)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有97.40％以上同一性的所述枯草杆菌酶的变体。

2.根据权利要求1的枯草杆菌酶，其具有

I)与1a)或者1b)中描述的氨基酸序列具有99.26％以上，或者99.63％以上同一性的氨基酸序列；或者

II)与1c)或者1d)中描述的氨基酸序列具有97.40％以上，或者97.77％以上，或者98.14％以上，或者98.51％以上，或者98.89％以上，或者99.26％以上，或者99.63％以上同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求2的枯草杆菌酶，其由SEQ ID NO：2的氨基酸1到269所示氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO：4的氨基酸1到269所示氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1的枯草杆菌酶，其具有

I)与克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶具有99.26％以上，或者99.63％以上同一性的氨基酸序列；或者

II)与克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶具有97.40％以上，或者97.77％以上，或者98.14％以上，或者98.51％以上，或者98.89％以上，或者99.26％以上，或者99.63％以上同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求4的枯草杆菌酶，其由

I)克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶；或

II)克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶组成。

6.前面权利要求任意一项的枯草杆菌酶，其中所述枯草杆菌酶是：

I)具有如SEQ ID NO：2的氨基酸1到269所示氨基酸序列的枯草杆菌酶变体，其含有一个或多个氨基酸残基替换、缺失和/或插入；或

II)具有如SEQ ID NO：4的氨基酸1到269所示氨基酸序列的枯草杆菌酶变体，其含有一个或多个氨基酸残基替换、缺失和/或插入。

7.根据权利要求6的枯草杆菌酶，其含有如下位置之一的至少一种修饰：27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(BASBPN编号)。

8.根据权利要求7的枯草杆菌酶，其中所述修饰选自K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K和T274A(BASBPN编号)。

9.分离的多核苷酸，其含有编码权利要求1-8任意一项中定义的枯草杆菌酶的多核苷酸。

10.分离的多核苷酸，其编码枯草杆菌酶，所述多核苷酸选自

(a)与SEQ ID NO：1的核苷酸1到807所示多核苷酸具有至少88％同一性的多核苷酸；或

(b)已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88％同一性的变体，

(c)与SEQ ID NO：1的核苷酸1到807所示多核苷酸具有至少88％同一性的多核苷酸；或

(d)已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88％同一性的变体。

11.根据权利要求10的多核苷酸，其具有

I)与SEQ ID NO：1的核苷酸1到807所示的多核苷酸具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；或

II)与SEQ ID NO：3的核苷酸1到807所示的多核苷酸具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核酸序列。

12.根据权利要求10的多核苷酸，其具有

I)与已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；或

II)与已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。

13.核酸构建体，其含有权利要求9-12任意一项的核酸序列，所述核酸序列与指导枯草杆菌酶在适宜宿主中表达的一种或多种控制序列有效连接。

14.重组表达载体，其含有权利要求13的核酸构建体、启动子、转录和翻译终止信号。

15.重组宿主细胞，其含有权利要求13的核酸构建体。

16.根据权利要求15的宿主细胞，其是细菌，优选芽孢杆菌属，特别是迟缓芽孢杆菌。

17.根据权利要求15的宿主细胞，其是真菌或酵母，优选丝状真菌，特别是曲霉属。

18.产生根据权利要求1-8任意一项的枯草杆菌酶的方法，该方法包括：

(a)在有助于产生枯草杆菌酶的条件下培养权利要求15-17任意一项中定义的重组宿主细胞；和

(b)回收枯草杆菌酶。

19.清洁或洗涤剂组合物，优选洗衣或洗盘组合物，其含有根据权利要求1-8任意一项的枯草杆菌酶。

20.根据权利要求19的组合物，其还含有纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、其他蛋白酶、淀粉酶或者它们的混合物。

21.权利要求1-8任意一项中定义的枯草杆菌酶的用途，用于清洁或洗涤剂组合物中。

22.权利要求1-8任意一项中定义的枯草杆菌酶的用途，用于除去卵污渍。

23.权利要求19-20任意一项中定义的清洁或洗涤剂组合物的用途，用于除去卵污渍。

24.清洁或盘洗涤的、洗涤硬表面或者衣物的方法，所述方法包括将硬表面或者衣物与权利要求19-20中定义的组合物接触。

25.从硬表面或者衣物除去卵污渍的方法，所述方法包括将含有卵污渍的硬表面或者含有卵污渍的衣物与权利要求19-20中定义的组合物接触。

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