CN107002058A - 枯草杆菌酶变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在液体洗涤剂中表现出改进的稳定性和或改进的洗涤性能的新颖蛋白酶变体。本发明的这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用，如衣物洗涤洗涤剂组合物和餐具洗涤组合物，包括自动餐具洗涤组合物。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明变体的方法。

Description

枯草杆菌酶变体
序列表的引用
本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及在液体洗涤剂组合物中表现出增加的稳定性和/或改进的洗涤性能的新颖枯草杆菌酶变体。本发明的这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用，如衣物洗涤洗涤剂组合物和餐具洗涤组合物，包括自动餐具洗涤组合物。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明变体的方法。
相关技术说明
在洗涤剂工业中，在洗涤配制品中酶已经应用了数十年。用于此类配制品的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或其混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。
已经用于衣物洗涤的野生型枯草杆菌酶是WO 91/02792中披露的BLAP蛋白酶。
越来越多的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体， 和(诺维信公司(Novozymes a/s))、Purafect和(杰能科国际公司(Genencor International,Inc.))。另外，许多变体在本领域中已有描述，例如在WO 2004/041979(诺维信公司)中描述了相对于亲本枯草杆菌酶在例如洗涤性能、热稳定性、洗涤期间的稳定性或催化活性上表现出改变的枯草杆菌酶变体。这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用。
BLAP蛋白酶的变体并且适用于清洁或洗涤剂组合物已经在例如EP 701 605中披露。
WO 99/57155披露了洗涤剂酶，例如通过将纤维素结合结构域附着到酶而被修饰的蛋白酶。建议将洗涤剂酶如蛋白酶与包含纤维素的织物结合，这将增强洗涤性能。
然而，多种因素使得进一步改进蛋白酶是有利的。特别是液体洗涤剂组合物仍然是许多洗涤剂蛋白酶的挑战，并且在储存过程中的活性丧失仍然是许多良好洗涤剂蛋白酶的问题。因此，尽管蛋白酶开发的深入研究仍然需要具有令人满意的洗涤性能和增加的稳定性的新的并且改进的蛋白酶。
发明概述
本发明涉及与亲本枯草杆菌酶相比在液体洗涤剂中具有改进的稳定性和/或改进的洗涤性能的变体枯草杆菌酶。本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少90％序列一致性，优选与SEQ ID NO:3具有至少95％序列一致性，优选至少96％序列一致性，优选至少97％序列一致性，优选至少98％序列一致性的枯草杆菌酶变体，其中该变体在位置101具有谷氨酸残基(E)，并且其中与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，该变体具有在液体洗涤剂组合物中的增加的稳定性。枯草杆菌酶进一步包括选自下组的取代，该组由以下各项组成：S156D，L262E，Q137H，S3T，R45E、D、Q，P55N，T58W、Y、L，Q59D、M、N、T，G61D、R，S87E，G97S，A98D、E、R，S106A、W，N117E，H120V、D、K、N，S124M，P129D，E136Q，S143W，S161T，S163A、G，Y171L，A172S，N185Q，V199M，Y209W，M222Q，N238H，V244T，N261T、D以及L262N、Q、D。
定义
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这些调控序列包括但不局限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
洗涤剂组合物：除非另外指明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒或粉末形式的通用或重垢型洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效洗涤剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手工洗碗剂或轻负荷洗碗剂，尤其是高起泡类型的那些；机器洗碗剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌性手洗型、清洁条、皂条、漱口液、义齿清洁剂、轿车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和洗发剂；沐浴凝胶、泡沫浴液；金属清洁剂；以及清洁助剂如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理型添加剂。就预期用于弄脏的物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在一些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代性实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具洗涤洗涤剂”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于包含表面活性剂的组合物。其意图是，除了根据本发明的枯草杆菌酶变体以外，该术语涵盖了可能包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。
餐具洗涤：术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的陶器，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的用餐工具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具连同陶瓷，塑料(例如三聚氰胺)，金属，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。
餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
硬表面清洁：在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及用餐工具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。该术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，由于复制期间发生的突变，该后代与其亲本细胞不完全相同。
改进的洗涤性能：术语“改进的洗涤性能”在此定义为相对于亲本枯草杆菌酶(即相对于具有与所述变体相同的氨基酸序列但排除所述变体中的改变的枯草杆菌酶)，例如相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽，例如通过增加的去污而显示洗涤性能的改变的枯草杆菌酶变体。术语“洗涤性能”包括在餐具洗涤以及还有在衣物洗涤中的洗涤性能。洗涤性能可以通过计算如在此的材料与方法部分中针对自动餐具洗涤的自动机械应力测定(AMSA)中定义的所谓的强度值(Int)来确定。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
衣物洗涤：术语“衣物洗涤”涉及家用衣物洗涤和工业衣物洗涤两者并且意指用一种包含本发明的洗涤剂组合物的溶液处理纺织品和/或织物的过程。衣物洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行或可以手动进行。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本：术语“亲本”意指对其做出改变以产生本发明的酶变体的蛋白酶。因此，亲本是与所述变体具有相同的氨基酸序列但在一个或更多个(例如两个或更多个)所述指定位置处不具有改变的蛋白酶。应理解的是，在上下文中的“具有相同的氨基酸序列”的表达涉及100％的序列一致性。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽。在一个具体实施例中，该亲本是与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的多肽具有至少60％的一致性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的一致性的蛋白酶。
蛋白酶：术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一种)。EC编号参照加利福尼亚州(California)的圣迭戈(SanDiego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学期刊(Eur.J.Biochem.)1994，223，1-5、欧洲生物化学期刊1995，232，1-6、欧洲生物化学期刊1996，237，1-5、欧洲生物化学期刊1997，250，1-6、以及欧洲生物化学期刊1999，264，610-650的增刊1-5。
蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC 3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，其中切割在P1处Ala之后。出于本发明的目的，根据以下“材料与方法(Materials and Methods)”所述的程序确定蛋白酶活性。本发明的这些枯草杆菌酶变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％和至少100％的蛋白酶活性。
序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔(Needle)输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：
(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔(Needle)输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：
(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
稳定性：术语“稳定性”包括储存稳定性和在使用过程中的稳定性，例如在洗涤过程中的稳定性(洗涤中稳定性)，并且反映了作为时间函数的根据本发明的枯草杆菌酶变体的稳定性，例如当蛋白酶置于溶液中时，尤其是在洗涤剂溶液中时，能够保留多少活性。这种稳定性受到许多因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂的量、表面活性剂等。使用如在此的材料与方法部分中所述的‘稳定性测定’可以测量蛋白酶稳定性。术语“改进的稳定性”或“增加的稳定性”在本文中被定义为相对于亲本蛋白酶的稳定性显示溶液中增加的稳定性的变体蛋白酶。术语“改进的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改进的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”。
术语“改进的化学稳定性(improved chemical stability)”在此定义为变体酶在一种或多种化学物存在下表现为在孵育一段时间之后仍保留酶活性，这种或这些种化学物是天然存在的或是合成的，可降低亲本酶的酶活性。改进的化学稳定性还可使得这些变体在这类化学物存在下能更好地催化反应。在本发明的一个特别的方面，这种改进的化学稳定性是洗涤剂的，尤其是液体洗涤剂的一种改进的稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”具体地是当本发明的一种蛋白酶变体被混合到一种液体洗涤剂配制品(尤其是根据表1的液体洗涤剂配制品)中并且然后保存在15℃和50℃之间的温度(例如20℃、30℃或40℃)下时，蛋白酶活性的改进的稳定性。
术语“改进的热活性”意指一种变体在特定温度下相对于亲本或相对于具有SEQID NO:3的蛋白酶的温度依赖的活性曲线展示改变的温度依赖的活性曲线。热活性值提供了变体在一定温度范围内增强水解反应的催化的效率的测量。一种具有较大热活性的变体将引起一种酶组合物在增强底物水解速率方面的增加，从而减少所需要的时间和/或降低活性所需要的酶浓度。可替代地，具有减小的热活性的一种变体将在比由亲本的温度依赖活性曲线定义的亲本的最佳温度更低的温度下提高酶促反应。
严格条件：不同的严格条件定义如下。
术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用1X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用1X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑精DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.5X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并且变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.3X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.15X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”意指这样一种制剂，该制剂包含与其天然关联或重组关联的按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料。优选地，该变体按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的这些变体优选以基本上纯的形式存在。例如，这可通过经由众所周知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外来的或不需要的核苷酸的多核苷酸制剂，并且其存在的形式适于在基因工程化多肽生产系统内进行使用。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’-和3’-非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸按重量计是至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的这些多核苷酸优选以基本上纯的形式存在。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)。
洗涤性能：术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤(如衣物洗涤或硬表面清洁)过程中去除存在于有待清洁的物体上的污渍的能力。洗涤性能上的改进可以通过计算如在材料与方法部分所述的AMSA测定中定义的所谓强度值(Int)来定量。
野生型枯草杆菌酶：术语“野生型枯草杆菌酶”意指由天然存在的生物(例如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物)表达的蛋白酶。野生型枯草杆菌酶的实例是BLAP，即具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的枯草杆菌酶。
变体命名规则
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽BPN’来确定另一种蛋白酶中的相应的氨基酸残基。将另一种蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法来确定与SEQID NO:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
另一种蛋白酶中对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数比对多个多肽序列来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；3.5版或更新版本；MAFFT(6.857版或更新版本)，以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83版或更新版本)。
当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系()时，可以使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物()。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER()利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，可获取若干工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵或组合延伸比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.另外的氨基酸残基的插入，例如像在G195之后插入赖氨酸可表示为：Gly195GlyLys或G195GK。可替代地，另外的氨基酸残基的插入，如在G195之后插入赖氨酸可表示为：*195aL。当插入一个以上氨基酸残基时，例如像在G195之后插入Lys和Ala可表示为：Gly195GlyLysAla或G195GKA。在此类情况下，还可以通过将小写字母添加到在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基位置编号处来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号，在这个实例中：*195aK*195bA。在以上的实例中，序列194至196因此为：
在取代和插入发生在相同的位置的情况下，这可表示为S99SD+S99A，或简写为S99AD。相同修饰也可以表示为S99A+*99aD。
在其中插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，显然是在命名中出现了简并。如果例如在以上实例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则将它表示为G195GG或者*195aGbG。对于以下变化，相同的实际变化也可以仅表示为A194AG或者*194aG，从：
到：
这类情况对于技术人员来说是显而易见的，并且因此表示式G195GG和这种类型插入的相应表示式旨在包括这类等同简并表示式。
多个改变：包括多个改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。可替代地，空格或逗号可将多个改变分隔开，例如分别为A170Y G195E或A170Y，G195E。
不同的改变：可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
可替代的不同改变或可任选的取代可用括号表示，例如Arg170[Tyr，Glu]或Arg170{Tyr，Glu}或简写为R170[Y,E]或R170{Y，E}。
氨基酸位置/残基的编号
如果没有提及其他，则本文中使用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN’(BASBPN)序列的编号。对于BPN’序列的进一步描述，参见SEQ ID NO:1或斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学4(1991)719-737。
发明详细说明
本发明涉及在液体洗涤剂中具有改进的稳定性和/或改进的洗涤性能的枯草杆菌酶变体。优选地，该枯草杆菌酶变体还具有良好的洗涤性能，更优选地，变体与亲本枯草杆菌酶、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3相比具有改进的洗涤性能。
亲本枯草杆菌酶原则上可以是任何天然存在的枯草杆菌酶，或者它可以是通过本领域已知的方法产生的修饰的枯草杆菌酶，例如制备杂交体或两个或更多个单独的枯草杆菌酶，或者通过在给定的枯草杆菌酶中取代，缺失或插入一个或多个氨基酸残基。
许多枯草杆菌酶具有良好的洗涤性能的经过证实的记录，并且有大量的出版物描述了这种枯草杆菌酶及其在衣物洗涤或清洁过程中的用途，然而，为了在洗涤剂中使用，还重要的是，枯草杆菌酶在洗涤剂组合物中，如液体洗涤剂中具有令人满意的稳定性。优选使用具有良好洗涤性能的亲本枯草杆菌酶，以提供在液体洗涤剂中具有改进的稳定性的这种枯草杆菌酶的变体。
根据本发明的优选的亲本枯草杆菌酶是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的BLAP蛋白酶，或与SEQ ID NO:2具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的枯草杆菌酶。优选的亲本枯草杆菌酶可以是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的枯草杆菌酶，其中与SEQ ID NO:2相比，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸已经被修饰，并且其中每个修饰独立地是一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代、氨基酸残基的缺失或插入一个氨基酸残基。
在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至269或由其组成。在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的等位基因变体。
一个优选的亲本枯草杆菌酶是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的枯草杆菌酶，其中在对应于SEQ ID NO:1的位置101的位置处的精氨酸残基取代为谷氨酸残基(R101E)。该优选的枯草杆菌酶的序列示于SEQ ID NO:3。
根据本发明的其他优选的亲本枯草杆菌酶是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白酶或与SEQ ID NO:3具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的枯草杆菌酶。在另一方面，该亲本包括SEQ IDNO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:3的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:3的氨基酸1至269或由其组成。在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:3的成熟多肽的等位基因变体。
优选的亲本枯草杆菌酶可以是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶，其中与SEQ ID NO:3相比，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸已经被修饰，并且其中每个修饰独立地是一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代、氨基酸残基的缺失或插入一个氨基酸残基。
本发明的另外的枯草杆菌酶变体包括与SEQ ID NO:3具有至少90％序列一致性的变体，该变体包括以下取代中的一个或多个：取代S156D；L262E；Q137H；S3T；R45E、D、Q；P55N；T58W、Y、L；Q59D、M、N、T；G61D、R；S87E；G97S；A98D、E、R；S106A、W；N117E；H120V、D、K、N；S124M；P129D；E136Q；S143W；S161T；S163A、G；Y171L；A172S；N185Q；V199M；Y209W；M222Q；N238H；V244T；N261T、D；L262N、Q、D，其中这些位置根据SEQ ID NO 1编号。
在优选的实施例中，与具有SEQ ID NO:3的序列的枯草杆菌酶相比，本发明的枯草杆菌酶变体具有在液体洗涤剂中的改进的稳定性和改进的洗涤性能。此实施例的这种优选的枯草杆菌酶的实例包括与SEQ ID NO:3具有至少90％序列一致性的枯草杆菌酶变体且包括以下取代中的一个或多个：取代R45E、D、Q；T58L；G61D；S87E；G97S；A98E；S106A；N117E；H120D、K、V；P129D；E136Q、Q137H；S156D；S161T；S163A、G；V199M；M222Q；N261T；L262E、Q、N。
本发明的枯草杆菌酶变体可以具有其他取代，例如本领域已知的取代以赋予枯草杆菌酶变体具体的有益特性。在本领域已知的枯草杆菌酶中存在大量的取代，并且预期在本发明中可以使用这种已知的取代，以将这些已知的有益效果赋予本发明的枯草杆菌酶变体。本发明的枯草杆菌酶变体可以包括一个或多个可用于本发明中的另外的取代，以便赋予另外的有益效果和/或改进现有效果，例如稳定性和洗涤性能。
优选的另外的突变包括以下取代中的一个或多个：V4I、N76D、V104T、N128Q、S141H、R145H、A194P、G195E、V205I、N218Q、A228V、N238E或S265H。
与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，优选具有改进的稳定性和/或在液体洗涤剂中改进的洗涤性能的本发明的枯草杆菌酶变体的特别优选实例包括以下变体，这些变体包括以下氨基酸序列：
SEQ ID NO:3+S3T，
SEQ ID NO:3+R45E、D
SEQ ID NO:3+P55N，
SEQ ID NO:3+T58W、Y、L，
SEQ ID NO:3+Q59D、M、N、T，
SEQ ID NO:3+G61D、R，
SEQ ID NO:3+S87E，
SEQ ID NO:3+G97S，
SEQ ID NO:3+A98D、E、R，
SEQ ID NO:3+S106A、W，
SEQ ID NO:3+N117E，
SEQ ID NO:3+H120V、D、K、N，
SEQ ID NO:3+S124M，
SEQ ID NO:3+P129D
SEQ ID NO:3+E136Q，
SEQ ID NO:3+S143W，
SEQ ID NO:3+S161T，
SEQ ID NO:3+S163A、G，
SEQ ID NO.3+Y171L，
SEQ ID NO:3+A172S，
SEQ ID NO:3+N185Q，
SEQ ID NO:3+V199M，
SEQ ID NO:3+Y209W，
SEQ ID NO:3+M222Q，
SEQ ID NO:3+N238H，
SEQ ID NO:3+V244T，
SEQ ID NO:3+N261T，
SEQ ID NO:3+L262N、Q、D、E
SEQ ID NO:3+N76D+S163G+N238E
SEQ ID NO:3+S156D+L262E
SEQ ID NO:3+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D+Y209W
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+S163G+N128Q+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+K27Q+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+V104T+H120D+S156D+L262E
SEQ ID NO:3+G195E+V199M
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+N261D
SEQ ID NO:3+A194P+G195E+V199M+V205I
SEQ ID NO:3+H120D+A228V
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+A228V
SEQ ID NO:3+H120D+N261D
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+A228V+L262E
SEQ ID NO:3+N76D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N238E
SEQ ID NO:3+Q137H+S141H+R145H+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Q137H+S141H+R145H+S156D+Y209W
SEQ ID NO:3+H120D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+Q137H+S141H+R145H+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+A194P+G195E+V199M+V205I+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+N62D+H120D
SEQ ID NO:3+H120D+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+A194P+G195E+V205I+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+H120D+N261D
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+S3T+Q59D+N76D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+H120D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+A194P+G195E+V199M+V205I
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Y209W+N261D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+H120D+Y209W
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D+Y209W
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+N76D+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+N76D+H120D
SEQ ID NO:3+H120D+P131F+A194P+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+E136H+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+N218S+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+N218Q+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+N218A+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+K27Q+R45E
SEQ ID NO:3+N76D+A228V+L262E
SEQ ID NO:3+R45E+A88S
SEQ ID NO:3+S87E+K237E
SEQ ID NO:3+N261D+L262E
SEQ ID NO:3+S87E+L262E
SEQ ID NO:3+S87E+N238E
SEQ ID NO:3+K27Q+S87E
SEQ ID NO:3+N76D+N117E
SEQ ID NO:3+H120D+N238E
SEQ ID NO:3+Q59D+L262E
SEQ ID NO:3+K27Q+L262E
SEQ ID NO:3+H120D+L262E
SEQ ID NO:3+K27Q+Q59D
SEQ ID NO:3+K27Q+S156D
SEQ ID NO:3+K27Q+G61D
SEQ ID NO:3+Q59D+N261D
SEQ ID NO:3+Q59D+N117E
SEQ ID NO:3+K237E+N261D
SEQ ID NO:3+Q59D+N238E
SEQ ID NO:3+A15T+H120D+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+S163G+N238E
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+L262E
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+Q59D+H120D
SEQ ID NO:3+G61D+N76D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D
SEQ ID NO:3+S3T+H120D
SEQ ID NO:3+G61D+H120D
SEQ ID NO:3+P55S+H120D
SEQ ID NO:3+S163G+A228V
SEQ ID NO:3+S163G+N261D；
SEQ ID NO:3+S3T+S163G
SEQ ID NO:3+G61D+S163G
SEQ ID NO:3+S156D+S163G
SEQ ID NO:3+Q59D+S163G
SEQ ID NO:3+N76D+S163G
SEQ ID NO:3+P55S+S163G
SEQ ID NO:3+H120D+S163G
SEQ ID NO:3+T58L+Q59D
SEQ ID NO:3+P55S+T58L
SEQ ID NO:3+T58L+G97D
SEQ ID NO:3+T58L+S106A
SEQ ID NO:3+T58L+A228V
SEQ ID NO:3+S3T+T58L
SEQ ID NO:3+T58L+S156D
SEQ ID NO:3+T58L+Y91H
SEQ ID NO:3+T58L+H120D
SEQ ID NO:3+T58L+S163G
SEQ ID NO:3+S163G+N261D；
SEQ ID NO:3+T58L+N261D；
SEQ ID NO:3+T58L+N76D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+H120D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+A228V
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Y209W
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Y209W+V244T
SEQ ID NO:3+N76D+H120D
SEQ ID NO:3+N76D+S156D
SEQ ID NO:3+H120D+S156D
SEQ ID NO 3+R45E+L262E
SEQ ID NO 3+Q59D+G61D
SEQ ID NO 3+S87E+L262E
SEQ ID NO 3+G61D+L262E
SEQ ID NO 3+Q59D+L262E
SEQ ID NO 3+R45E+Q59D
SEQ ID NO 3+Q59D+S156D
SEQ ID NO 3+S156D+L262E
SEQ ID NO 3+S163G+N238E+L262E
SEQ ID NO 3+S3T+V4I+S163G+N261D
SEQ ID NO 3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO 3+Y91H+N117H+N238H
SEQ ID NO 3+T58L+S163G+N261D
SEQ ID NO 3+S3T+V4I+S163G+N261D
SEQ ID NO 3+S87E+S163G+L262E
SEQ ID NO 3+S156D+S163G+L262E
SEQ ID NO 3+T58LS163G+N261D
SEQ ID NO 3+S156DS163G+L262E
SEQ ID NO 3+S3T+N76D+Y209W+N261D+L262E
本发明的枯草杆菌酶变体与亲本蛋白酶相比优选具有在液体洗涤剂中的改进的稳定性，优选本发明的枯草杆菌酶变体与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的蛋白酶相比具有在液体洗涤剂中的改进的稳定性。
可以提到，作为本发明的优选的枯草杆菌酶变体的实例，其与亲本酶相比，具有在液体洗涤剂中的改进的稳定性和/或改进的洗涤性能：
SEQ ID NO:3+R45E、D、Q
SEQ ID NO:3+Q58L
SEQ ID NO:3+Q59D，
SEQ ID NO:3+G61D，
SEQ ID NO:3+S87E，
SEQ ID NO:3+G97S，
SEQ ID NO:3+A98E，
SEQ ID NO:3+N117E，
SEQ ID NO:3+H120D、K、V
SEQ ID NO:3+P129D
SEQ ID NO:3+E136Q，
SEQ ID NO:3+Q137H，
SEQ ID NO:3+S156D，
SEQ ID NO:3+S160A，
SEQ ID NO:3+S163A、G，
SEQ ID NO:3+V199M
SEQ ID NO:3+M222Q
SEQ ID NO:3+N261T或
SEQ ID NO:3+L262EQ、N。
与亲本枯草杆菌酶相比，本发明的这些优选的枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，例如洗涤剂稳定性和/或改进的或者同等的洗涤性能。在这方面，改进的洗涤性能旨在意指在至少一种污渍上的变体的洗涤性能比亲本枯草杆菌酶的洗涤性能更高，其中洗涤性能是在适合的条件下在给定的洗涤剂组合物中使用适合的洗涤性能测定法确定的。
在一个优选实施例中，使用本申请的“方法和材料”部分中描述的AMSA测试来测量改进的洗涤性能。
变体的洗涤性能为与亲本枯草杆菌酶的洗涤性能相比，优选至少1单位更高、优选至少2单位更高、例如至少3单位更高、例如至少4单位更高、例如至少5单位更高、例如至少6单位更高、例如至少7单位更高、例如至少8单位更高、例如至少9单位更高。
这些枯草杆菌酶变体可以进一步包括在一个或多个(例如若干个)其他位置处的一个或多个另外的改变，所述其他位置选自下组，该组由以下各项组成：3、4、9、12、14、15、40、43、68、72、79、86、88、92、98、99、101、120、146、183、184、188、194、216、218、224、228、236、245、255、261、267和270，优选位置9、15、68和/或120(根据SEQ ID NO:1编号)。本领域的技术人员清楚如果一个位置已经被改变一次，则其不会被改变第二次。在一个优选实施例中，在选自下组的任何位置处的改变是取代，该组由以下各项组成：3、4、9、12、14、15、40、43、68、72、79、86、88、92、98、99、101、120、146、183、184、188、194、216、218、224、228、236、245、255、261、267和270。在更优选的实施例中，该枯草杆菌酶变体进一步包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：3{D、E、L}，4I，9{H、K、R、G}，12{D、E}，14T，15{G、M、S、T}，40{A、G、M、S、T}，43{D、E}，63G，68{A、G、I、L、M、S、T}，72{V、L}，N76{D、E}，79T，86H，88V，92S，98T，99{E、T、A、G、M、D}，101L，120{I、N}，146S，183{E、D}，184{E、D}，188G，194P，216{D、E}，218{E、D}，224{S、A、T、G、M}，228T，236D，245{H、K、R}，255{D、E}，261{E}，267{I、L、V}和/或270{G、M、S、T}(根据SEQ ID NO:1编号)。在更优选的实施例中，该枯草杆菌酶变体进一步包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3的成熟多肽，或与其具有至少60％，优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少95％的序列一致性的多肽中的S3{D、E、L}，V4I，S9{H、K、R、G}，Q12{D、E}，P14T，A15{G、M、S、T}，P40{A、G、M、S、T}，N43{D、E}，V68{A、G、I、L、M、S、T}，I72{V、L}，N76{D、E}，I79T，P86H，A88V，A92S，A98T，S99{E、T、A、G、M、D}，S101L，H120{I、N}，G146S，N183{E、D}，N184{E、D}，S188G，A194P，S216{D、E}，N218{E、D}，T224{S、A、T、G、M}，A228T，S236D，Q245{H、K、R}，T255{D、E}，N261{，E}，L267{I、L、V}和/或A270{G、M、S、T}，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的相应位置。
一个实施例进一步涉及生产与具有SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，具有改进的稳定性和/或改进的洗涤性能的枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括以下步骤
a)在与SEQ ID NO:2具有至少90％序列一致性的枯草杆菌酶中用谷氨酸残基(E)取代对应于SEQ ID NO:1的位置101的位置处的氨基酸，
b)进一步引入任一个以下取代位置S156D，L262E，Q137H，S3T，R45E、D、Q，P55N，T58W、Y、L，Q59D、M、N、T，G61D、R，S87E，G97S，A98D、E、R，S106A、W，N117E，H120V、D、K、N，S124M，P129D，E136Q，S143W，S161T，S163A、G，Y171L，A172S，N185Q，V199M，Y209W，M222Q，N238H，V244T，N261T、D或L262N、Q、D。
c)回收该变体。
根据一个实施例和/或根据上述实施例中的任一个，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少90％序列一致性的枯草杆菌酶变体，其中该变体在对应于SEQ ID NO:1的位置101的位置处具有谷氨酸残基(E)，并且其中变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比具有减少的纤维素结合。一个实施例涉及与SEQ ID NO:3具有至少90％序列一致性的枯草杆菌酶变体，其中该变体在对应于SEQ ID NO:1的位置101的位置处具有谷氨酸残基(E)，并且其中该变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，具有减少的纤维素结合，并且其中该变体包括用中性或带负电荷的残基取代蛋白酶表面上带正电荷的氨基酸残基；或者蛋白酶表面上的中性残基被带负电荷的残基取代。根据一个实施例或上述实施例中的任一个，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少90％序列一致性的枯草杆菌酶变体，其中该变体在对应于SEQ ID NO:1的位置101的位置处具有谷氨酸残基(E)，并且其中该变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，具有减少的纤维素结合，和/或其中该变体包括用中性或带负电荷的残基取代蛋白酶表面上带正电荷的氨基酸残基；或者蛋白酶表面上的中性残基被带负电荷的残基取代，其中该枯草杆菌酶变体包括选自下组的取代，该组由以下各项组成：V4D、E、I，R10N、Q、D、E、S，H17D，K27S、N、Q、E、D，N43E，I44V，R45E、D、Q、N，G46D，S49N、D，P52E，G53D、E，Q59D，G61D，N62D，L75D，N76D，I79D，S87E，G97D，A98E，*103aE，I104T，N117E，H120D，E136K、Q，S156D，R170E、Q、N、D、S，N185D，G195E，N218A，K235L、W、N、Q、E、S，K237N、Q、D、E、S，N238D、E，V244D，R246Q、E、D，R247S、E、Q、D，K251S、D、Q、E、N，N261D，L262D、E和S265H，优选取代选自：N117E、S156D、N238E、N261D和L262E，并且优选地，该变体进一步包括选自以下项的取代：S3T、N128Q、Q137H、S141H、R145H、S163G、A194P、V199M、V205I、N218Q或A228V。根据一个实施例和/或根据上述实施例中的任一个，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少90％序列一致性的枯草杆菌酶变体，其中该变体在对应于SEQID NO:1的位置101的位置处具有谷氨酸残基(E)，其中与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，该变体具有减少的纤维素结合，并且其中该枯草杆菌酶变体进一步包括选自以下项的取代：N117E+S3T、S156D+S3T、N238E+S3T、N261D+S3T、L262E+S3T、N117E+N128Q、S156D+N128Q、N238E+N128Q、N261D+N128Q、L262E+N128Q、N117E+Q137H、S156D+Q137H、N238E+Q137H、N261D+Q137H、L262E+Q137H、N117E+S141H、S156D+S141H、N238E+S141H、N261D+S141H、L262E+S141H、N117E+R145H、S156D+R145H、N238E+R145H、N261D+R145H、L262E+R145H、N117E+S163G、S156D+S163G、N238E+S163G、N261D+S163G、L262E+S163G、N117E+A194P、S156D+A194P、N238E+A194P、N261D+A194P、L262E+A194P、N117E+V199M、S156D+V199M、N238E+V199M、N261D+V199M、L262E+V199M、N117E+V205I、S156D+V205I、N238E+V205I、N261D+V205I、L262E+V205I、N117E+N218Q、S156D+N218Q、N238E+N218Q、N261D+N218Q、L262E+N218Q、N117E+A228V、S156D+A228V、N238E+A228V、N261D+A228V、L262E+A228V、S156D+N262E。根据一个实施例和/或根据上述实施例中的任一个，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少90％序列一致性的枯草杆菌酶变体，其中该变体在对应于SEQ ID NO:1的位置101的位置处具有谷氨酸残基(E)，其中该变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比具有减少的纤维素结合，并且其中该枯草杆菌酶变体进一步包括选自以下项的取代：
SEQ ID NO:3+V4D、E、I
SEQ ID NO:3+R10N、Q、D、E、S，
SEQ ID NO:3+H17D，
SEQ ID NO:3+K27S、N、Q、E、D，
SEQ ID NO:3+R45E、D、Q、N，
SEQ ID NO:3+G53D，
SEQ ID NO:3+Q59D，
SEQ ID NO:3+G61D，
SEQ ID NO:3+L75D，
SEQ ID NO:3+N76D，
SEQ ID NO:3+I79D，
SEQ ID NO:3+S87E，
SEQ ID NO:3+G97D，
SEQ ID NO:3+A98E，
SEQ ID NO:3+*103aE，
SEQ ID NO:3+N117E，
SEQ ID NO:3+H120D，
SEQ ID NO:3+E136K、Q，
SEQ ID NO.3+S156D，
SEQ ID NO:3+R170E、Q、N、D，
SEQ ID NO:3+N185D，
SEQ ID NO:3+G195E，
SEQ ID NO:3+K235L、W、N、Q、E、S，
SEQ ID NO:3+K237N、Q、D、E、S，
SEQ ID NO:3+N238D、E，
SEQ ID NO:3+V244D
SEQ ID NO:3+R246Q、E、D，
SEQ ID NO:3+R247S、E，
SEQ ID NO:3+K251S、D、Q、E、N，
SEQ ID NO:3+N261D，
SEQ ID NO:3+L262D、E
SEQ ID NO:3+S265H
SEQ ID NO:3+A194P+G195E
SEQ ID NO:3+G195E+V199M
SEQ ID NO:3+N76D+A228V+N261D；
SEQ ID NO:3+N76D+S163G+N238E
SEQ ID NO:3+S156D+L262E
SEQ ID NO:3+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D+Y209W
SEQ ID NO:3+K27Q+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+V104T+H120D+S156D+L262E
SEQ ID NO:3+V104T+S156D+L262E
SEQ ID NO:3+Q137H+S141H+R145H+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+A228V；
SEQ ID NO:3+H120D S163G N261D
SEQ ID NO:3+N76D+S101E+A228V+L262E；
SEQ ID NO:3+N76D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N238E
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Q137H+S141H+R145H+S156D+Y209W
SEQ ID NO:3+H120D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+A194P+G195E+V199M+V205I；
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+A194P+G195E+V199M+V205I；
SEQ ID NO:3+A228V+N261D；
SEQ ID NO:3+N76D+A228V；
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+N261D；
SEQ ID NO:3+H120D+A228V；
SEQ ID NO:3+N76D+N261D；
SEQ ID NO:3+A194P+G195E+V199M+V205I+A228V+N261D；
SEQ ID NO:3+A194P+G195E+V205I+A228V；或
SEQ ID NO:3+H120D+N261D。
优选地，这些变体选自下组,该组由以下各项组成：
SEQ ID NO:3+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+S156D+L262E
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+A228V；
SEQ ID NO:3+G195E+V199M
SEQ ID NO:3+H120D S163G N261D
SEQ ID NO:3+N76D+A228V+N261D；
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D+Y209W
SEQ ID NO:3+Q137H+S141H+R145H+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+Q137H+S141H+R145H+S156D+L262E
SEQ ID NO:3+N76D+Q137H+S141H+R145H+A228V+N261D；
SEQ ID NO:3+N76D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N238E
SEQ ID NO:3+H120D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Q137H+S141H+R145H+S156D+Y209W，
其中这些位置对应于SEQ ID NO:1中的位置，并且其中该枯草杆菌酶变体与SEQID NO:3具有至少60％，例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％或至少99％的序列一致性。一个实施例涉及编码根据上述实施例中的任一个的变体的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的表达载体，包含该核苷酸序列或该表达载体的重组宿主细胞。一个实施例进一步涉及用于生产与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比具有减少的纤维素结合的枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括以下步骤
a)在与SEQ ID NO:2具有至少90％序列一致性的枯草杆菌酶中用谷氨酸残基(E)取代对应于SEQ ID NO:1的位置101的位置处的氨基酸，
b)进一步引入以下取代位置中的任一个：4D、E、I，10N、Q、D、E、S，H17D，K27S、N、Q、E、D，N43E，I44V，R45E、D、Q、N，G46D，S49N、D，P52E，G53D、E，Q59D，G61D，N62D，L75D，N76D，I79D，S87E，G97D，A98E，*103aE，I104T，N117E，H120D，E136K、Q，S156D，R170E、Q、N、D、S，N185D，G195E，N218A，K235L、W、N、Q、E、S，K237N、Q、D、E、S，N238D、E，V244D，R246Q、E、D，R247S、E、Q、D，K251S、D、Q、E、N，N261D，L262D、E和S265H；
c)回收该变体。
这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小氨基或羧基-末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能有利于纯化的小的延伸，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。对于BPN’(SEQ ID NO:1)，包含氨基酸S221、H64以及D32的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必需的。
这些枯草杆菌酶变体可以由150至350，例如175至330、200至310、220至300、240至290、260至280，或269、270、271、272、273、274或275个氨基酸组成。
在一个实施例中，枯草杆菌酶变体具有改进的洗涤性能。在另一个实施例中，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，优选在洗涤期间改进的稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，枯草杆菌酶变体具有在液体洗涤剂中改进的稳定性，其中使用如本文的材料和方法部分中实施例4中所述的‘稳定性测定’来测量稳定性。在一个实施例中，与SEQ ID NO:2的多肽相比，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，其中使用如本文的材料和方法部分中实施例4中所述的‘稳定性测定’来测量稳定性。在一个实施例中，与SEQ ID NO:3的多肽相比，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，其中使用如本文的材料和方法部分中实施例4中所述的‘稳定性测定’来测量稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，枯草杆菌酶具有改进的洗涤性能，其中使用如本文的材料和方法部分中的实施例7中所述的自动机械应力测定(AMSA)来测量洗涤性能。在一个实施例中，与SEQ ID NO:2的多肽相比，枯草杆菌酶变体具有改进的洗涤性能，其中使用如本文的材料和方法部分中的实施例7中所述的自动机械应力测定(AMSA)来测量洗涤性能。在一个实施例中，与SEQ ID NO:3的多肽相比，枯草杆菌酶变体具有改进的洗涤性能，其中使用如本文的材料和方法部分中的实施例7中所述的自动机械应力测定(AMSA)来测量洗涤性能。
亲本蛋白酶
在蛋白质底物中切割酰胺键的酶被分类为蛋白酶，或(互换地)肽酶。
丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶是一种酶，其催化肽键的水解，并且其中在活性位点存在必需的丝氨酸残基。
细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围是20,000至45,000道尔顿。它们受到二异丙基氟磷酸的抑制。它们水解简单末端酯并且在活性上与同样是丝氨酸蛋白酶的真核糜蛋白酶相似。更狭义的术语，碱性蛋白酶，包括一个亚组，反映了一些丝氨酸蛋白酶从pH 9.0-11.0的高最适pH。
枯草杆菌酶
斯艾森(Siezen)等人(1991)，蛋白质工程(Protein Eng.)4:719-737以及斯艾森等人(1997)，蛋白质科学(Protein Science)6:501-523提出了被暂时命名为枯草杆菌酶(subtilase)的一个丝氨酸蛋白酶亚组。它们是通过对先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的170多个氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶先前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据斯艾森(Siezen)等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定多种多样的枯草杆菌酶，并且已确定很多枯草杆菌酶的氨基酸序列。对于此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述，参见斯艾森(Siezen)等人(1997)。
枯草杆菌蛋白酶
枯草杆菌酶的一个亚组是枯草杆菌蛋白酶，它们为来自S8家族，特别是来自S8A子族的丝氨酸蛋白酶，如由MEROPS数据库(http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum？family＝S8)所定义的。
BPN’和赛威蛋白酶(Savinase)分别具有MEROPS编号S08.034和S08.003。
亲本枯草杆菌酶
术语“亲本枯草杆菌酶”描述一种根据斯艾森(Siezen)等人(1997)，蛋白质科学(Protein Science)6:501-523定义的枯草杆菌酶。更详细的信息参见以上“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从自然来源中分离的枯草杆菌酶，其中在保留枯草杆菌酶特征的同时，已对其进行后续修饰(例如一条或多条氨基酸侧链的一个或多个置换，一个或多个取代、一个或多个缺失和/或一个或多个插入)。此外，亲本枯草杆菌酶可以是已经通过DNA改组技术制备的枯草杆菌酶。
可替代地，术语“亲本枯草杆菌酶”可被称为“野生型枯草杆菌酶”。该亲本枯草杆菌酶优选属于枯草杆菌蛋白酶亚组。枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或“真”枯草杆菌蛋白酶，包括“标准的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN’、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)(诺维信公司)、以及枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。
斯艾森(Siezen)等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I-S2或强碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶，并且包括多种酶，如枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(杰能科国际(Genencor International，Inc.))、枯草杆菌蛋白酶309(赛威蛋白酶(赛威蛋白酶(Savinase))诺维信公司(Novozymes A/S))、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(益瑞蛋白酶(ESPERASE)诺维信公司(Novozymes A/S))、以及碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。BPN’是来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’，BPN’具有氨基酸序列SEQ ID NO:1。
供参照，下表1给出以上所提及的不同枯草杆菌酶的一些首字母缩略词的清单。关于另外的首字母缩略词，参见斯艾森(Siezen)等人(1991和1997)。
表1：不同枯草杆菌酶的首字母缩略词
同源枯草杆菌酶序列
两个氨基酸序列之间的同源性是在出于本发明的目的由参数“一致性”描述的背景下，两个氨基酸序列之间的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法来确定的。来自程序的结果除了氨基酸比对之外还计算两个序列之间的“百分比一致性”。
基于本描述，对于本领域技术人员而言，鉴别可以根据本发明来修饰的适当同源枯草杆菌酶是常规的。
基本上同源的亲本枯草杆菌蛋白酶变体可以具有一个或多个(若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入，在此背景下，术语“一个或多个”与术语“若干个”是互换使用的。这些改变优选地具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白或多肽的三维折叠或活性的如上所述的保守氨基酸取代以及其他取代；小缺失，典型地为1至约30个氨基酸；以及较小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基，高达约20-25个残基的小连接肽，或有利于纯化的小的延伸(亲和标签)，如聚组氨酸段，或蛋白。
尽管上述变化优选具有较不重要的性质，但此类变化还可以具有实质性性质，例如高达300个氨基酸或更多的更大多肽作为氨基或羧基末端延伸的融合。
可以使用SEQ ID NO:3的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针具有至少100个核苷酸长度，例如至少200个核苷酸长度、至少300个核苷酸长度、至少400个核苷酸长度、至少500个核苷酸长度、至少600个核苷酸长度、至少700个核苷酸长度、至少800个核苷酸长度、或至少900个核苷酸长度。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其他适合的载体材料并且固定于其上。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生。
融合多肽可以进一步包括两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。
该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源所用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是细菌蛋白酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)蛋白酶。
在一方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白酶。
在一个方面，该亲本是解淀粉芽孢杆菌蛋白酶，例如SEQ ID NO:1的蛋白酶或其成熟多肽。
在另一方面，该亲本是迟缓芽孢杆菌蛋白酶，例如SEQ ID NO:2的蛋白酶或其成熟多肽。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的多种技术来分离或克隆该多核苷酸。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有蛋白酶活性的枯草杆菌酶变体的方法。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过使用涉及包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。
在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示和区域定向的诱变。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的适合的启动子的实例是从以下项获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因，连同tac启动子
控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
从苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因和枯草芽孢杆菌SP82基因获得适合的mRNA稳定区的实例。
该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌醹-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母醹-因子的基因获得前肽编码序列。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。
表达载体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。
载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。在另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
可通过以下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化，感受态细胞转化，电穿孔或接合。可通过以下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化或电穿孔。可通过以下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化、电穿孔、接合、或转导。可通过以下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔、或接合。可通过以下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态(natural competence)，原生质体转化，电穿孔或接合。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。
这些宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中进行培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对具有蛋白酶活性的变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取。
在可替代的方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。
组合物
在某一方面中，根据本发明的枯草杆菌酶变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置处不具有改变的蛋白酶或者相比于SEQ ID NO:2的多肽或相比于SEQ ID NO 3的多肽具有改进的洗涤性能，其中使用自动机械应力测定(AMSA)测量洗涤性能。
在某另一个方面，根据本发明的枯草杆菌酶变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置处不具有改变的蛋白酶或者相比于SEQ ID NO:2的多肽或相比于SEQ ID NO 3的多肽具有改进的稳定性，优选在洗涤期间改进的稳定性，其中如在本文的材料和方法部分中实例4中所述‘稳定性测定’来测量稳定性。
组合物可以是洗涤剂组合物，其包括根据本发明的可以用于清洁过程如衣物洗涤或硬表面清洁的枯草杆菌酶变体。
另外的组分的选择处于本领域技术人员能力范围内并且包含常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的织物的类型、污渍的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
本发明的酶
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至洗涤剂组合物中：0.01-200mg酶蛋白/升洗涤液，优选0.05-50mg酶蛋白/升洗涤液，特别是0.1-10mg酶蛋白/升洗涤液。
用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-30％，例如0.01％-20％，例如0.5％-15％的酶蛋白。
用于在衣物洗涤造粒(laundry granulation)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于在衣物洗涤液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。
可以使用常规稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的一种或多种酶，这些稳定剂例如是多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且该组合物可以如例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述进行配制，或者可以使用如WO 2005/105826和WO 2009/118375所述的肽醛或酮来稳定根据本发明的枯草杆菌酶变体。
本发明的变体还可以掺入到WO 97/07202(通过引用结合在此)中所披露的洗涤剂配制品中。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。典型地，表面活性剂按重量计以从大约0.1％至60％，如大约1％至大约40％、或大约3％至大约20％、或大约3％至大约10％的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当包含在其中时，所述去污剂通常将会包含按重量计约1％至约40％，例如约5％至约30％，包括约5％至约15％，或约20％至约25％的阴离子型表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES、也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。
助水溶剂
助水溶剂是如下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集并且脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶剂显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。
洗涤剂可以包含按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以包含按重量计大约0-65％，如大约5％至大约45％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂，或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性络合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-20％，例如约5％至约10％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中
漂白系统
所述洗涤剂可以包含按重量计0-50％，如约0.1％至约25％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidicacid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))、及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，这些系统可以包括例如与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。因此形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为衣物洗涤添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。该漂白系统还可以包括过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。该漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
洗涤剂可以包含按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与一种洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包括所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如描述于WO2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276以及EP 1876226(通过引用而特此结合)中。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。
另外的酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。
表现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纤维素酶(EC 3.2.1.4)的实例是已经描述于WO 02/099091中的那些。
纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且特别是在对应于WO 02/099091的SEQ ID NO:8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的其变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(Genencor InternationalInc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶
适合的另外的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶(subtilase)可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(Lantibioticpeptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的糜蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
另外的优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在(例如)WO95/23221中所述)、以及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’进行编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R、S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、赛威蛋白酶赛威蛋白酶 以及(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： 以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，如描述于EP 258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(美国5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是例如EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中所描述的那些脂肪酶变体。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
淀粉酶
可以与本发明的枯草杆菌酶变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如从在GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株获得的α淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有在WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的淀粉酶或与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与其具有90％序列一致性的变体。优选变体是在位置181和182中具有一个缺失并且在位置193中具有一个取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的适合的淀粉酶是具有在WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是那些在以下一个或多个位置具有取代、缺失或插入的变体：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。
能被使用的另外的淀粉酶是那些具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的淀粉酶或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。
其他的适合的淀粉酶是具有在WO01/66712中的SEQ ID NO:12的淀粉酶或与SEQID NO:12具有90％序列一致性的其变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K及R458K的变体，以及一种在选自下组的一个或多个位置中另外具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345及A339，最优选的是在所有这些位置中另外具有取代的变体。
其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、StainzymePlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase及Preferenz S100(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(GenencorInternational Inc./DuPont))。
过氧化物酶/氧化酶
适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
可以通过添加包含一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等，优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚(ethoxylated nonylphenol)；具有15个至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇，其中醇包含12个至20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单-和双-和三甘油酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。
分散剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉末洗涤剂，表面活性剂科学系列(Surfactant Science Series)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)。
染料转移抑制剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在受试组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从大约0.0001％至大约10％、从大约0.01％至大约5％或甚至从大约0.1％至大约3％的水平存在。
荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。适当的荧光增白剂水平包括从大约0.01wt％，从0.05wt％，从大约0.1wt％或甚至从大约0.2wt％至上限水平0.5wt％或甚至0.75wt％的较低水平。
污垢释放聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些污垢释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上去除污垢，特别是从聚酯基织物上去除疏水污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉末洗涤剂(Powdered Detergents)，表面活性剂科学系列(Surfactant science series)第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制
该洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。存在多种洗涤剂配制品形式，例如层(相同或不同相)、袋以及用于机械给料装置的形式。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参照M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物洗涤洗涤剂组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考文献：(US 2009/0011970 A1)。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
衣物洗涤皂条
本发明的枯草杆菌酶变体可以被添加至衣物洗涤皂条中并且用于手洗衣物洗涤、织物和/或纺织品。术语洗涤皂条包括洗涤条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗涤皂条包括包含来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗涤皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间推移显著改变的实体形式，即如果将一个固体物件(例如洗涤皂条)放置在一种容器内，那么该固体物件不会改变以填充放置该固体物件的容器。该条是典型地呈条形式但是可以呈其他固体形状，如圆形或卵形的一种固体。
该衣物肥皂棒可以包含一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酸基本硼酸、一个或多个肥皂或合成的表面活性剂、多元醇例如甘油、pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，因此该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗涤皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。
衣物洗涤皂条可以在常规的衣物洗涤皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备衣物洗涤皂条。可以在工艺的不同阶段向肥皂中添加预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
颗粒洗涤剂配制品
如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO 09/124162、WO 09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO 09/112298、WO09/103822、WO 09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO09/047128、WO 09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO09/040544、WO 09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO09/021813、WO 09/030632以及WO 09/015951。
WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO 2011005623、WO2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO 2011005830、WO2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO 2011005813、WO 2010135238、WO2010120863、WO 2010108002、WO 2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO2010090915、WO 2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO 2010033897、WO2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO 2010030539、WO 2010024467、WO2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO 2010014395、WO 2010044905、
WO 2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO2010099997、WO 2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO 2010069718、WO2010069957、WO 2010057784、WO 2010054986、WO 2010018043、WO 2010003783、WO2010003792、
WO 2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO2010105942、WO 2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO 2010084203、WO2010078979、WO 2010072456、WO 2010069905、WO 2010076165、WO 2010072603、WO2010066486、WO 2010066631、WO 2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO2010049187、WO 2010031607、WO 2010000636。
用途
可以在纺织品和织物的洗涤(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)中使用根据本发明的枯草杆菌酶变体或其组合物。
还可以在用于清洁硬表面例如地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同清洁硬物体，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)的表面的方法中使用根据本发明的枯草杆菌酶变体或其组合物。
洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗衣物洗涤洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的衣物洗涤添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
可以将本发明的多肽添加至洗涤添加剂中。
清洁过程或者纺织品护理过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用衣物洗涤，但是它也可以是工业衣物洗涤。用于洗涤织物和/或服装的方法，其中该方法包括用包含洗涤剂组合物可以添加本发明的至少一种枯草杆菌酶变体的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品护理过程。洗涤溶液可以例如是包含洗涤剂组合物的水性洗涤溶液。
最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学产品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物比较时类似或改进的洗涤性能。
本发明进一步涉及本发明的枯草杆菌酶变体在蛋白质污渍去除过程中的用途。蛋白质污渍可能是如食品污渍等污渍，如婴儿食品、皮脂、可可、鸡蛋、血、牛奶、墨水、草、或其组合。
典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污渍被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化去除颜色并且很多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。再其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中去除金属离子来软化洗涤水。
包括本发明的枯草杆菌酶变体的组合物可以包括一种或多种洗涤剂组分，例如表面活性剂、助水溶剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelatingagent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、抗氧化剂、以及增溶剂。
组合物可以包括本发明的枯草杆菌酶变体以及一种或多种选自下组的另外的酶，该组包括：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物。
组合物可以包括本发明的枯草杆菌酶变体，选自下组的一种或多种另外的酶，该组包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶或其任何混合物，以及一种或多种洗涤剂组分，例如表面活性剂、助水溶剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、抗氧化剂、以及增溶剂。
洗涤方法
一种清洁方法包括以下步骤：在适合于清洁物体的条件下将所述物体与包括本发明的枯草杆菌酶变体的洗涤剂组合物接触。
一种用于从织物或餐具上去除污渍的方法可以包括在适合于清洁所述物体的条件下将所述织物或餐具与包括本发明的枯草杆菌酶变体的组合物接触。
处理织物(例如使纺织品退浆)的组合物和方法可以使用一种或多种本发明的枯草杆菌酶变体。该变体可以用于任何织物处理方法，这些方法在本领域是熟知的(参见，例如，US 6,077,316)。例如，在一方面，通过如下方法改进织物的触感和外观，该方法包括将该织物与溶液中的蛋白酶接触。在一方面，在压力下用该溶液处理该织物。
洗涤剂组合物适合用于在衣物洗涤和硬表面应用(包括餐具洗涤)中使用。此类方法包括使有待清洁的织物/餐具与包括洗涤剂组合物的溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。餐具可以包括任何餐具，例如陶器、用餐工具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。该溶液优选具有从约5.5至约11.5的pH。可在溶液中按以下浓度使用组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。
可以使用常规稳定剂和蛋白酶抑制剂来稳定洗涤剂组合物的一种或多种酶，例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、不同的盐(例如NaCl、KCl)、乳酸、甲酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))、或肽醛(如二肽醛、三肽醛或四肽醛或醛类似物)(或者具有形式B1-B0-R，其中R是H、CH3、CX3、CHX2、或CH2X(X＝卤素)，B0是单个氨基酸残基(优选地具有一个任选取代的脂肪族或芳香族侧链)；并且B1由一个或多个氨基酸残基组成(优选一个、两个或三个)，任选地包括一个N-末端保护基团，或者如描述于WO 09118375、WO 98/13459中的)或者蛋白类型的蛋白酶抑制剂，例如RASI、BASI、WASI(水稻、大麦和小麦的双功能α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)或CI2或SSI。可以如在例如WO 92/19709、WO 92/19708和US 6,472,364中描述的配制该组合物。在一些实施例中，在此利用的这些酶由存在于为这些酶提供此类离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，连同其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))稳定化。
这些洗涤剂组合物被典型地这样配制，使得在用于水性清洁操作过程中，洗涤水具有以下pH：从约5.0至约11.5，或在替代实施例中，甚至从约6.0至约10.5。在一些优选实施例中，颗粒或液体衣物洗涤产品被配制成具有从约6至约8的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
材料与方法
用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)
为了评定在衣物中的洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA平板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用来衡量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart(柯达(Kodak))，Midtager 29，DK-2605(丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
表1：标准洗涤剂和测试材料的组成
标准洗涤剂和测试材料如下：
Tergo-O-Tometer(TOM)
Tergo-O-tometer(TOM)是一种中等规模标准洗涤系统，它可以用于同时测试12种不同的洗涤条件。TOM基本上是大型的具有多达12个开放金属烧杯淹没至其中的温度受控的水浴。每个烧杯构成一个小的顶部加载型洗涤机器并且在实验期间，它们中的每一者将包含特定洗涤剂/酶系统的溶液并且对弄脏的和未弄脏的织物测试其性能。通过旋转搅拌臂获得机械应力，该旋转搅拌臂搅拌在每个烧杯内的液体(1L)。因为TOM杯子不含盖子，所以有可能在TOM实验期间收回样品并且在洗涤期间在线分析信息。在一个TOM实验中，如压载物与污物的比率和织物与洗涤液的比率的因素可以变化。因此，TOM提供了在小规模实验(如AMSA和微型洗涤)与在全规模洗涤机中的更费时的全规模实验之间的联系。
洗涤并冲洗之后，将小块布样摊开铺平并且允许在室温下风干过夜。在洗涤的次日评估所有洗涤。使用具有大孔径的Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计进行小块布样的光反射评估。在入射光中没有UV的条件下进行测量，并提取460nm的反射率。在未洗涤的和洗涤的小块布样上进行测量。将有待测量的测试小块布样放置在相同类型和颜色的另一个小块布样的顶部(成对小块布样)。
通过从一起用酶洗涤的小块布样的反射值中减去未用酶(空白)洗涤的小块布样的反射值来计算单个小块布样的反射值。
通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且减去来自未用酶洗涤的小块布样的测量值来计算针对每种污渍的蛋白酶变体效果。
通过如下计算相对性能(RP)，将新蛋白酶变体的性能与参照性能(REF)＝SEQ IDNO:3进行比较：
RP＝(R蛋白酶变体-R空白)/(RREF-R空白)
常规分子生物学方法：
除非另外提及，使用标准分子生物学方法(萨姆布鲁克(Sambrook)等人(1989)；奥苏贝尔(Ausubel)等人(1995)；哈伍德(Harwood)和卡廷(Cutting)(1990))进行DNA操纵和转化。
蛋白酶活性测定：
1)Suc-AAPF-pNA活性测定：
蛋白水解活性可以通过采用Suc-AAPF-PNA底物的方法来确定。Suc-AAPF-PNA是N-琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且它是可以通过内切蛋白酶切割的一种封闭肽。在切割后，一个游离PNA分子被释放出来，并且它具有黄色颜色并且因此可以通过可见光分光光度法在波长405nm进行测量。Suc-AAPF-PNA底物是通过巴亨(Bachem)(目录号L1400，溶解在DMSO中)制造。
待分析的蛋白酶样品被稀释在残余活性缓冲液中(100mM Tris pH 8.6)。通过转移60μl的稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加140μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mMTris pH 8.6中)进行该测定。将该溶液在室温混合并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。
在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的蛋白酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。应该将蛋白酶样品稀释至其中斜率为线性的水平。
加速储存稳定性测定
在升高的温度下孵育长达24小时的情况下，使用加速测定评估蛋白酶变体在液体洗涤剂中的储存稳定性。
基于280nm处的吸光度和理论消光系数，使用0.01％Triton X-100将所有纯化的蛋白酶样品稀释至0.2和0.1mg/ml的浓度。针对每个变体，包括具有高蛋白酶浓度的2个孔和具有低浓度的2个孔。作为参照，在每个微量滴定板上包括SEQ ID NO:3。使用磁棒(在Zephyr移液台(Caliper LifeSciences公司)上持续30min)，将30μl蛋白酶样品与270μl洗涤剂(CNS EDTA pH 9)在微量滴定板(Nunc U96PP 0.5ml)的孔中混合。然后将20μl的这种混合物转移至另一个微量滴定板(加有磁棒的Nunc U96PP 0.5ml)中，并且与150μl 100mMTris(pH 8.6)混合(在Zephyr上至少5min)。将30μl的这种稀释液转移至Nunc F 96-MTP中，并且在添加70μl底物溶液后，通过每20sec在405nm下测量吸光度持续5min来确定非应激样品的初始活性(在SpectraMax Plus上)。密封后，将洗涤剂板在Eppendorf恒温混合器(无摇动)中在适当温度(针对CNS为47℃，EDTA pH 9)下孵育。在1-4和20-25小时孵育后，抽取20μl样品，并且像初始非应激活性一样，测量应激样品的残余活性。
在用洗涤剂孵育过程中的活性下降被假定为指数式的。从Log(活性)对孵育时间(0、1-4和20-25小时)的线性回归发现半衰期(T1/2)，并且将半衰期改进系数(T1/2IF)计算为相对于SEQ ID NO:3参照的半衰期的蛋白酶变体的半衰期。
洗涤剂
实例1：变体的制备和表达
通过利用生物的天然感受态转化适合的表达盒来将表达盒引入枯草芽孢杆菌。
通过PCR(例如桑布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆(Molecular Cloning)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))进行DNA操作，例如引入突变并将表达盒构建到枯草芽孢杆菌中，并且所有DNA操作可以由本领域的普通技术人员重复。使用编码枯草杆菌酶变体的重组枯草杆菌构建体来接种包含富营养培养基(例如，PS-1：100g/L蔗糖(丹尼斯克目录号109-0429)、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/L Na2HPO4.12H2O(默克(Merck)目录号6579)、0.1ml/L替换-Dowfax63N10(陶氏化学(Dow))的摇瓶。典型地在30℃下在220rpm的振摇下进行4天的培养。
实例2：变体的发酵
可以通过本领域熟知的或如以下的方法进行发酵。将具有相关表达质粒的枯草杆菌菌株在LB-琼脂板上划线，并在37℃下生长过夜。将菌落转移到在500ml摇瓶中的100mlPS-1培养基上。通过在4500rpm下离心20-25分钟从发酵液中去除细胞和其他未溶解的材料。然后，过滤出上清液以获得澄清溶液。
实例3：变体的纯化
将培养液离心(26000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。将上清液通过Nalgene 0.2μm过滤单元进行过滤，以便去除其余的芽孢杆菌宿主细胞。用3M Tris碱将0.2μm滤液中的pH调节至pH 8，并将经pH调节的滤液施加至在20mM Tris/HCl、1mMCaCl2(pH 8.0)中平衡的MEP Hypercel柱(来自颇尔公司(Pall corporatio))上。将柱用平衡缓冲液洗涤后，将该柱用20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2(pH 4.5)逐步洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定法)，并且合并峰级分。将来自该MEP Hypercel柱的合并物的pH用20％(v/v)CH3COOH或3M Tris碱调节至pH 6，并且将经pH调节的合并物用去离子水稀释至与20mM MES/NaOH、2mM CaCl2(pH 6.0)相同的电导率。将经稀释的合并物施加至在20mM MES/NaOH、2mM CaCl2(pH 6.0)中平衡的SP-琼脂糖FF柱(来自GE医疗公司(GE Healthcare))上。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)经五个柱体积进行洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定法)，并且通过SDS-PAGE对活性级分进行分析。将级分(在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上的仅见到一条带)合并为纯化的制剂并且用于另外的实验。
实例4：本发明变体的稳定性
如实例1-3所述产生和纯化本发明的变体，并使用上述披露的稳定性测试在47℃的温度下测试在液体洗涤剂中的稳定性并计算半衰期。参照多肽是具有SEQ ID NO:3的枯草杆菌酶。
表2：SEQ ID NO:3的变体的稳定性。第一列表示SEQ ID NO:3中的取代。第二列表示实验中发现的半衰期，并且在第三列中，相对于SEQ ID NO:3表示数据，最后一列表示标准差：
在这些条件下，所有变体具有在液体洗涤剂中的同等的稳定性，改进的稳定性或显著改进的稳定性。
实例5残留活性
使用上述披露的稳定性测试在45℃的温度下测试本发明的变体在液体洗涤剂中的稳定性，并且计算19小时后的半衰期和残留活性。亲本多肽是具有SEQ ID NO:3的枯草杆菌酶。
表3：SEQ ID NO:3的变体的稳定性。第一列表示与SEQ ID NO:3相比的取代。第二列表示计算的19小时后的残留活性，并且最后一列表示具有标准差的残留活性的：
数据示出这些变体在测试条件下具有增加的稳定性，并且与具有SEQ IDNO:3的亲本枯草杆菌酶相比，还具有19小时后的增加的残留活性。
实例6
通过使用以下标准污物确定变体在洗涤剂中的洗涤性能：
A：棉布上的蛋黄：产品号10EG，从如下可获得：W-测试织物有限公司(W-Testgewebe GmbH)，Christenfeld 10,41379，布吕根(Brüggen)，德国
B：棉布上的血：产品号CS01，从如下可获得：CFT(测试材料中心)B.V.，弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰，
C：棉布上的蛋：产品号C37，从如下可获得：CFT(测试材料中心)B.V.，弗拉尔丁恩，荷兰，
D：棉布上的血：产品号111，从如下可获得：Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialien AG[联邦材料与测试机构，测试材料(Federalmaterials and testing agency,Testmaterials)]，圣加仑州(St.Gallen)，瑞士(Switzerland)。
以下污渍E-R均从CFT(测试材料中心)B.V.，弗拉尔丁恩，荷兰可获得：
E：棉布上的可可：产品号CH-09
F：棉布上的蛋：产品号C38
G：棉布上的巧克力-牛奶：产品号C03
H：可可-燕麦：产品号C-S-54
I：聚酯/棉布上的巧克力-牛奶：产品号PC-3-009
J：棉布上与牛奶一起熬制的可可：产品号C-H019
K：棉布上的代餐混合饮料：产品号C-H165
L：棉布上的巧克力布丁：产品号C-H118
M：棉布上的巧克力布丁：产品号C-H172
N：肉干瓦莱特(meat pate vallette)：产品号KC-H 171
O：棉布上的巧克力布丁：产品号KC-H 172
P：棉布上的老化的巧克力冰淇淋：产品号CS-68
Q：棉布上的巧克力布丁：产品号CS-69
R：老化的蛋黄碳黑：产品号CS-38
S：棉布上的蛋：产品号WFK 10N从W-测试织物有限公司可获得，Christenfeld 10，41379布吕根(Brüggen)，德国
T：棉布上的可可：产品号EMPA 112，从Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialien AG[国家材料与测试机构，测试材料(Federal materials andtesting agency,Testmaterials)]，圣加仑州(St.Gallen)，瑞士(Switzerland)可获得。
U：棉布上的血-牛奶/墨水：产品号C05
V棉布上的花生油色素/墨水：产品号C10
W：棉布上的草屑：产品号164，从Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialien AG[国家材料与测试机构，测试材料(Federal materials andtesting agency,Testmaterials)]，圣加仑州(St.Gallen)，瑞士(Switzerland)可获得。
X：与牛奶一起熬制的可可：产品号C-H010
Y：血/牛奶/墨水，产品号EMPA 117，从Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialien AG[国家材料与测试机构，测试材料(Federal materials andtesting agency,Testmaterials)]，圣加仑州(St.Gallen)，瑞士(Switzerland)可获得。
Z：巧克力牛奶和烟灰，产品号CFT C03，从CFT(测试材料中心)B.V.，弗拉尔丁恩，荷兰可获得：
将具有以下组成的液体洗涤剂用作基本配制品(所有的值都以重量百分比计)：0％至0.5％黄原胶、0.2％至0.4％消泡剂、0.2％至8％三乙醇胺、1％至7％甘油、0.3％至3％乙醇、0至12％FAEOS(脂肪醇醚硫酸酯)、1％至28％非离子型表面活性剂、0.5％-4％硼酸、0.5％至6％柠檬酸钠(二水合物)、1％至6％苏打、0至16％椰子脂肪酸、0.5％至6％HEDP(1-羟基乙烷-(1,1-二磷酸))、0至0.4％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、0至0.05％光学增亮剂、0至0.001％颜料、剩余部分为去离子水。
基于这种基本配制品，通过添加如表4中所指示的对应的蛋白酶来制备不同洗涤剂。参照是具有SEQ ID NO.3中的氨基酸序列的蛋白酶，该参照蛋白酶已经示出良好的洗涤性能(尤其在液体洗涤剂中)。以基于总蛋白质含量(5mg/l洗涤液体)的相同量添加蛋白酶。
液体洗涤剂的剂量之比是4,7克/升洗涤液体，并且在20℃和40℃的温度下进行60分钟洗涤程序，水具有15.5°与16.5°(德国硬度)之间的水硬度。
白度(即污物的增白)被光度测定地确定为洗涤性能的指示。使用美能达(Minolta)CM508d分光仪装置，该装置事先使用提供有单位的白标准进行校准。
获得的结果是使用洗涤剂获得的反射单位(remission unit)与使用包含参照蛋白酶的洗涤剂获得的反射单位之间的差值。因此，正值指示洗涤剂中变体的改进的洗涤性能。从表4a(在40℃的结果)和表4b(在20℃的结果)明显看出，根据本发明的变体显示改进的洗涤性能。
表4a和b：按照下表，具有与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列(除了取代以外)的蛋白酶变体对如所示的污渍在40℃的洗涤性能；参照是根据SEQ IDNO:3的蛋白酶。
a)
b)
蛋白酶变体 U G V T W
S163G 0,9 1,5 1,8 nd 0,9
G61D 1,5 1,7 nd nd nd
S156D 1,6 2,1 0,5 nd nd
H120D 0,8 1,6 2,4 nd nd
G195E V199M 1,5 0,7 1,1 nd nd
A228V N261D 0,5 1,3 1,6 nd nd
V244T 1,3 1,1 2,7 nd nd
T58L nd 2,0 1,1 0,9 0,4
S3T V4I N261D 1,5 1,7 0,4 nd nd
A194P G195E V199M V205I 0,8 nd nd 1,1 nd
H120D A228V 2,1 1,9 nd nd nd
H120D N261D nd nd 0,8 1,2 nd
N76D A228V N261D nd 0,5 nd 1,8 nd
表4c-e：按照下表，具有与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列(除了取代以外)的蛋白酶变体对如所示的污渍在20℃的洗涤性能；参照是根据SEQ ID NO:3的蛋白酶。
c)
d)
e)
f)
实例7：脂肪酶变体的洗涤性能
按照下表，具有与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列(除了取代以外)的蛋白酶变体对如所示的污渍的洗涤性能；参照是根据SEQ ID NO:3的蛋白酶。在衣物洗涤中使用自动机械应力测定(AMSA)评估，其中可以检查许多小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，该盖子将待洗涤的纺织品对槽开口强力挤压。在洗涤期间，将平板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性振荡方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。
在表5中指定的实验条件下进行衣物洗涤实验。
表5
洗涤剂剂量 2.0g/L
测试溶液体积 160μL(20μL酶+140μL洗涤剂)
pH 8.4
洗涤时间 20分钟
温度 20℃
水硬度 12°dH
标准洗涤剂和测试材料如表1所述：
表6：标准洗涤剂和测试材料的组成
测试材料获得自测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV)，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。
通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+＝2:1:4.5)添加到测试系统中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品被沾污时，反射光的强度低于干净样品。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
使用柯达iQsmart平板扫描仪(Kodak Midtager 29、DK-2605丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。可以通过将RGB值作为向量相加并随后考虑所得向量的长度计算强度值(Int)：
结果示于表7中。结果作为与SEQ ID NO:3相比在三种不同的小块布样上的酶浓度为30nM的相对性能给出。
表7：与SEQ ID NO:3相比，变体的AMSA相对性能。
表8与SEQ ID NO:3相比在两种不同的小块布样上的酶浓度为30nM的相对性能。
结果示出，与SEQ ID NO 3的洗涤性能相比，SEQ ID NO 3的稳定化变体示出同等或改进的洗涤性能。
实例8：Terg-O-tometer(TOM)洗涤测定的结果
在以下指定的实验条件下进行TOM洗涤实验：
表10与具有与SEQ ID NO:3相比的所示突变的枯草杆菌酶变体的SEQ ID NO:3相比的相对性能。
实例9：蛋白酶变体的洗涤性能
在不同条件下，洗涤具有如表15所示的与SEQ ID NO:3相比的突变的变体，这些条件是具有低浓度蛋白酶(30nM)的AMSA洗涤，具有高浓度蛋白酶(300nM)的AMSA洗涤，TOM洗涤和全规模洗涤(FSW)。使用表1中披露的洗涤剂和PC-03(棉布/聚酯上的巧克力-牛奶/墨水)测试材料用于洗涤。将结果与具有SEQ ID NO:3的参照蛋白酶的性能和下表11中所示的性能进行比较，其中参照蛋白酶的结果设定为1.00。
表11
序列表
<110> 弗里斯(Friis), 艾斯本 彼得（Esben Peter）
<120> 枯草杆菌酶变体
<130> 12755-WO-PCT
<160> 3
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 275
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 1
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275
<210> 2
<211> 269
<212> PRT
<213> 迟缓芽孢杆菌
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Asp Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 3
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> BLAP R101E (根据SEQ ID NO.1编号)
<400> 3
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Asp Gly Glu Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265

Claims (9)

1.与SEQ ID NO:3具有至少90％的序列一致性，优选与SEQ ID NO:3具有至少95％的序列一致性、优选至少96％的序列一致性、优选至少97％的序列一致性、优选至少98％的序列一致性的一种枯草杆菌酶变体，其中该变体在位置101处具有谷氨酸残基(E)，其中该枯草杆菌酶变体进一步包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：S156D，L262E，Q137H，S3T，R45E、D、Q，P55N，T58W、Y、L，Q59D、M、N、T，G61D、R，S87E，G97S，A98D、E、R，S106A、W，N117E，H120V、D、K、N，S124M，P129D，E136Q，S143W，S161T，S163A、G，Y171L，A172S，N185Q，V199M，Y209W，M222Q，N238H，V244T，N261T、D和L262N、Q、D，其中与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，该变体具有在液体洗涤剂组合物中的增加的稳定性，并且其中这些位置对应于SEQ ID NO:1的位置。
2.如权利要求1所述的枯草杆菌酶变体，其中与具有SEQ ID NO:3的枯草杆菌酶相比，该枯草杆菌酶进一步具有改进的洗涤性能。
3.如权利要求1所述的枯草杆菌酶变体，其中与具有SEQ ID NO:3的枯草杆菌酶相比，该枯草杆菌酶进一步具有改进的稳定性。
4.如权利要求1至3中任一项所述的枯草杆菌酶变体，其中该枯草杆菌酶变体包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：R45E、D、Q；T58L；G61D；S87E；G97S；A98E；S160A；N117E；H120D、K、V；P129D；E136Q；Q137H；S156D；S161T；S163A、G；V199M；M222Q；N261T和L262E、Q N。
5.如权利要求1至4中任一项所述的枯草杆菌酶变体，其中该变体选自下组，该组由以下各项组成：
SEQ ID NO:3+S3T，
SEQ ID NO:3+R45E、D
SEQ ID NO:3+P55N，
SEQ ID NO:3+T58W、Y、L，
SEQ ID NO:3+Q59D、M、N、T，
SEQ ID NO:3+G61D、R，
SEQ ID NO:3+S87E，
SEQ ID NO:3+G97S，
SEQ ID NO:3+A98D、E、R，
SEQ ID NO:3+S106A、W，
SEQ ID NO:3+N117E，
SEQ ID NO:3+H120V、D、K、N，
SEQ ID NO:3+S124M，
SEQ ID NO:3+P129D
SEQ ID NO:3+E136Q，
SEQ ID NO:3+S143W，
SEQ ID NO:3+S161T，
SEQ ID NO:3+S163A、G，
SEQ ID NO.3+Y171L，
SEQ ID NO:3+A172S，
SEQ ID NO:3+N185Q，
SEQ ID NO:3+V199M，
SEQ ID NO:3+Y209W，
SEQ ID NO:3+M222Q，
SEQ ID NO:3+N238H，
SEQ ID NO:3+V244T，
SEQ ID NO:3+N261T，
SEQ ID NO:3+L262N、Q、D、E
SEQ ID NO:3+N76D+S163G+N238E
SEQ ID NO:3+S156D+L262E
SEQ ID NO:3+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D+Y209W
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+S163G+N128Q+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+K27Q+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+V104T+H120D+S156D+L262E
SEQ ID NO:3+G195E+V199M
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+N261D
SEQ ID NO:3+A194P+G195E+V199M+V205I
SEQ ID NO:3+H120D+A228V
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+A228V
SEQ ID NO:3+H120D+N261D
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+A228V+L262E
SEQ ID NO:3+N76D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N238E
SEQ ID NO:3+Q137H+S141H+R145H+N238E+L262E
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Q137H+S141H+R145H+S156D+Y209W
SEQ ID NO:3+H120D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+Q137H+S141H+R145H+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+A194P+G195E+V199M+V205I+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+N62D+H120D
SEQ ID NO:3+H120D+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+A194P+G195E+V205I+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+H120D+N261D
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+S3T+Q59D+N76D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+H120D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+A194P+G195E+V199M+V205I
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Y209W+N261D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+H120D+Y209W
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D+Y209W
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+N76D+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+S3T+V4I+N76D+H120D
SEQ ID NO:3+H120D+P131F+A194P+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+E136H+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+N218S+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+N218Q+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+N218A+A228V+N261D
SEQ ID NO:3+K27Q+R45E
SEQ ID NO:3+N76D+A228V+L262E
SEQ ID NO:3+R45E+A88S
SEQ ID NO:3+S87E+K237E
SEQ ID NO:3+N261D+L262E
SEQ ID NO:3+S87E+L262E
SEQ ID NO:3+S87E+N238E
SEQ ID NO:3+K27Q+S87E
SEQ ID NO:3+N76D+N117E
SEQ ID NO:3+H120D+N238E
SEQ ID NO:3+Q59D+L262E
SEQ ID NO:3+K27Q+L262E
SEQ ID NO:3+H120D+L262E
SEQ ID NO:3+K27Q+Q59D
SEQ ID NO:3+K27Q+S156D
SEQ ID NO:3+K27Q+G61D
SEQ ID NO:3+Q59D+N261D
SEQ ID NO:3+Q59D+N117E
SEQ ID NO:3+K237E+N261D
SEQ ID NO:3+Q59D+N238E
SEQ ID NO:3+A15T+H120D+N261D
SEQ ID NO:3+N76D+S163G+N238E
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+L262E
SEQ ID NO:3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+Q59D+H120D
SEQ ID NO:3+G61D+N76D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D
SEQ ID NO:3+S3T+H120D
SEQ ID NO:3+G61D+H120D
SEQ ID NO:3+P55S+H120D
SEQ ID NO:3+S163G+A228V
SEQ ID NO:3+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+S3T+S163G
SEQ ID NO:3+G61D+S163G
SEQ ID NO:3+S156D+S163G
SEQ ID NO:3+Q59D+S163G
SEQ ID NO:3+N76D+S163G
SEQ ID NO:3+P55S+S163G
SEQ ID NO:3+H120D+S163G
SEQ ID NO:3+T58L+Q59D
SEQ ID NO:3+P55S+T58L
SEQ ID NO:3+T58L+G97D
SEQ ID NO:3+T58L+S106A
SEQ ID NO:3+T58L+A228V
SEQ ID NO:3+S3T+T58L
SEQ ID NO:3+T58L+S156D
SEQ ID NO:3+T58L+Y91H
SEQ ID NO:3+T58L+H120D
SEQ ID NO:3+T58L+S163G
SEQ ID NO:3+S163G+N261D
SEQ ID NO:3+T58L+N261D
SEQ ID NO:3+T58L+N76D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+H120D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+A228V
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+S156D
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Y209W
SEQ ID NO:3+S3T+N76D+Y209W+V244TSEQ ID NO:3+N76D+H120D
SEQ ID NO:3+N76D+S156D
SEQ ID NO:3+H120D+S156D
SEQ ID NO 3+R45E+L262E
SEQ ID NO 3+Q59D+G61D
SEQ ID NO 3+S87E+L262E
SEQ ID NO 3+G61D+L262E
SEQ ID NO 3+Q59D+L262E
SEQ ID NO 3+R45E+Q59D
SEQ ID NO 3+Q59D+S156D
SEQ ID NO 3+S156D+L262E
SEQ ID NO 3+S163G+N238E+L262E
SEQ ID NO 3+S3T+V4I+S163G+N261D
SEQ ID NO 3+H120D+S163G+N261D
SEQ ID NO 3+Y91H+N117H+N238H
SEQ ID NO 3+T58L+S163G+N261D
SEQ ID NO 3+S3T+V4I+S163G+N261D
SEQ ID NO 3+S87E+S163G+L262E
SEQ ID NO 3+S156D+S163G+L262E
SEQ ID NO 3+T58LS163G+N261D
SEQ ID NO 3+S156DS163G+L262E和
SEQ ID NO 3+S3T+N76D+Y209W+N261D+L262E。
6.一个核苷酸序列，其编码根据权利要求1-5中任一项所述的变体。
7.一种表达载体，其包含如权利要求6所述的核苷酸序列。
8.一种重组宿主细胞，其包含如权利要求6所述的核苷酸序列或如权利要求7所述的表达载体。
9.产生根据权利要求1-5中任一项所述的变体的一种方法，该方法包括：
a.提供如权利要求8所述的重组宿主细胞；
b.在导致该变体表达的条件下培养该重组宿主细胞；并且
c.分离该变体。
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