CN107002057A - 包括蛋白酶变体的液体清洁组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括蛋白酶变体的组合物，这些蛋白酶变体适用于在清洁或洗涤剂组合物中使用，如衣物洗涤洗涤剂组合物和餐具洗涤组合物，包括自动餐具洗涤组合物。

Description

包括蛋白酶变体的液体清洁组合物
序列表的引用
本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及包括蛋白酶变体的组合物，这些蛋白酶变体适用于在例如高pH清洁或洗涤剂组合物中使用，如衣物洗涤洗涤剂组合物和餐具洗涤组合物，包括自动餐具洗涤组合物。
相关领域描述
在洗涤剂工业中，在洗涤配制品中酶已经应用了数十年。在此类配制物中使用的酶包括淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、和蛋白酶连同其他酶，或其混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。传统上用于清洁过程中的许多蛋白酶是通常具有pH最佳值为9左右的碱性蛋白酶，因此适用于相当碱性的洗涤剂。然而，一些具体的液体洗涤剂具有高于10的pH，并且由于非常苛刻的条件以及酶在此类洗涤剂中作为结果的低储存稳定性，先前尚未认为这些洗涤剂适合于酶。此外，在液体洗涤剂中，特别是当含水量高时，酶倾向于更不稳定。
已描述了许多有用的蛋白酶变体，其中许多在不同洗涤剂中具有改进的活性、稳定性和溶解性。
然而，这些变体不适用于非常高的pH洗涤剂，因为这些洗涤剂的碱性环境将使酶在非常短的时间之后分解并因此降低它们的活性。
发明概述
本发明涉及在碱性条件下稳定并适用于高pH液体清洁的蛋白酶变体和包括此类变体的洗涤剂组合物。
本发明涉及具有pH为10或更高的液体清洁组合物，该组合物包括至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性。
在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为10或更高的液体清洁组合物，该组合物包括：(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性；以及(b)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：(a)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选地从约70％至约90％wt的水；(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性；以及(c)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
本发明还涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从40％至95％wt，优选从约70％至约90％wt的水；
(c)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供从约11至13.5的pH；以及
(d)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体。
在另一个实施例中，本发明进一步涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该碱性缓冲液系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供约11至13.5的pH，优选pH为从约12至13.5；
(e)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
在所述实施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物，或者它们可以彼此组合使用。
定义
术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
在此将术语“洗涤剂组分”定义为意指可以用于清洁组合物，如洗涤剂组合物中的化学品的类型。洗涤剂组分的实例是表面活性剂、助水溶剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、抗氧化剂以及增溶剂。该洗涤剂组合物可以包括一种或多种任何类型的洗涤剂组分。
术语“清洁组合物”包括“洗涤剂组合物”，并且除非另外指明，包括所有形式的洗涤剂组合物，如棒、均匀片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、凝胶、颗粒、液体(例如规则的、压缩的或浓缩的液体)、糊状、粉末、喷雾或片剂组合物，包括重垢液(HDL)、精细织物液体洗涤剂、液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，用于例如玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；纺织品和衣物预去污剂(pre-spotter)，连同餐具洗涤剂，例如手洗餐具洗涤剂、轻垢餐具洗涤剂、机洗餐具洗涤剂；通用或重垢清洗剂，液体、凝胶或糊状形式的通用清洗剂、液体清洁和消毒剂，包括抗细菌手洗类型、清洁棒、漱口水、义齿清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；头发香波和头发漂洗剂(hair-rinse)；淋浴露、泡沫浴；金属清洁剂；连同清洁辅助剂，例如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理类型。袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为具有袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol LLC公司销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同：US 2009/0011970 A1。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分(或组分)物理地彼此分开。因此，可以避免组分间的不良的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
如在此所述的清洁组合物(例如液体清洁组合物)适用于清洁过程，如衣物洗涤或硬表面清洁，包括餐具洗涤和工业清洁。示例性衣物洗涤过程可以选自下组，该组由以下各项组成：住宅衣物洗涤过程、工业衣物洗涤过程和公共机构衣物洗涤过程。
除了包含本发明的蛋白酶变体之外，该洗涤剂配制品还可以包含一种或多种另外的酶(如过水解酶、淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(例如内切葡聚糖酶)、角质酶、卤代过氧合酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、蛋白酶、DNA酶、黄原胶酶、以及木葡聚糖酶，或其任何混合物)，和/或组分，如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。
术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的陶器，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的用餐工具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具连同陶瓷，塑料(例如三聚氰胺)，金属，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。
术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。
术语“表达”包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及用餐工具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
术语“改进的特性”意指与相对于亲本蛋白酶有所改进的一种蛋白酶变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于洗涤性能、蛋白酶活性、热活性曲线、热稳定性、pH活性曲线、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改进的表面特性、底物特异性、产物特异性、增加的稳定性、在存储条件下的改进的稳定性、以及化学稳定性。
术语“稳定性(stability)”包括储存稳定性和在使用过程中的稳定性，例如在清洗过程中的稳定性，并且反应了作为时间函数的根据本发明的蛋白酶变体的稳定性，例如当蛋白酶变体置于溶液中时，尤其是在洗涤剂溶液中时，能够保留多少活性。这种稳定性受到许多因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂、表面活性剂的量等等。可使用如在实例3中所描述的测定来对蛋白酶稳定性进行测量。术语“改进的稳定性”或“增加的稳定性”在此处被定义为一种变体蛋白酶相对于亲本蛋白酶(例如相对于SEQ ID NO:2)的稳定性显示在溶液中增加的稳定性。
在本发明的一个具体方面，该改进的稳定性是在具有pH在10或更高的液体洗涤剂中的改进的稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”具体是当本发明的蛋白酶变体混入具有pH在10或更高的液体洗涤剂配制品中并且然后在15℃和50℃之间的温度(例如20℃、30℃或40℃)下储存时蛋白酶活性的改进的稳定性。
术语“改进的洗涤性能”在此定义为根据本发明的蛋白酶变体相对于亲本蛋白酶的洗涤性能，例如通过增加的去污显示改进的洗涤性能。术语“洗涤性能”包括衣物洗涤中的，但亦包括例如在餐具洗涤中的洗涤性能。洗涤性能可以被量化，如在此的“洗涤性能”定义下所描述的。
术语“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
术语“衣物洗涤”涉及家用衣物洗涤和工业衣物洗涤两者并且意指用一种包含本发明的洗涤剂组合物的溶液处理纺织品和/或织物的过程。衣物洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗涤机进行或可以手动进行。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化、自催化活化等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至269和SEQ ID NO:1的氨基酸1至275。本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的一种多核苷酸。
术语“核酸构建体”意指单-链或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
术语“可操作地连接”意指以下配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置，以使得控制序列指导编码序列的表达。
术语“亲本”意指对其做出改变以产生本发明的酶变体的一种蛋白酶。应理解的是，在上下文中的“具有相同的氨基酸序列”的表达涉及100％的序列一致性。在一个具体实施例中，该亲本是与SEQ ID NO:1或2的多肽具有至少60％的一致性，如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的一致性的蛋白酶。
术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括任何属于EC 3.4酶组的酶(包括其13个亚类中的每一种)。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1223:1-5(1994)；欧洲生物化学杂志232:1-6(1995)；欧洲生物化学杂志237:1-5(1996)；欧洲生物化学杂志250:1-6(1997)；以及欧洲生物化学杂志264:610-650(1999)的增刊1-5。洗涤剂工业如衣物和餐具洗涤中最广泛使用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是以下蛋白酶的亚组，这些蛋白酶特征在于在活性位点具有丝氨酸，该丝氨酸与底物形成共价加合物。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸残基和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶是指根据斯艾森(Siezen)等人，1991，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4:719-737和斯艾森(Siezen)等人，1997，蛋白质科学(Protein Science)6:501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。可用于洗涤剂中的蛋白酶主要是内肽酶(EC 3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，其中切割在P1处Ala之后。出于本发明的目的，根据如在以下材料与方法部分中所述的Suc-AAPF-pNA活性测定确定蛋白酶活性。在一方面，本发明的蛋白酶变体具有亲本酶的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的酶活性。在一个具体方面，本发明的蛋白酶变体具有SEQ ID NO:2的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的酶活性。
术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，其中切割在P1处Ala之后。出于本发明的目的，根据以下“材料与方法(Materials and Methods)”所述的程序确定蛋白酶活性。本发明的这些蛋白酶变体优选具有SEQ ID NO:2的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。
术语“残留活性”在此上下文中意指在储存后，特别是在液体洗涤剂中储存后留下的或剩余的蛋白酶活性。在将蛋白酶添加至洗涤剂中之后，当测量残留活性时，在t1测量该蛋白酶的活性。然后在储存一定量的时间之后，典型的数分钟或数周后，在t2测量残留活性。本发明的蛋白酶变体在pH为10的高pH液体洗涤剂中、在30℃的温度下储存之前(在t1)，并在t＝4小时或更长时间测量时，优选具有至少10％、至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性的残留活性。在此上下文中，高pH液体洗涤剂是pH为10或更高的液体洗涤剂，并且在此上下文中，非常高pH的液体洗涤剂是pH为12或更高的液体洗涤剂。根据本发明的蛋白酶变体优选更稳定，即与亲本蛋白酶(例如例如具有SEQ ID NO 2的蛋白酶)相比，在高pH液体洗涤剂(pH＝10或更高)中储存后具有更高的残留活性，和/或根据本发明的蛋白酶变体是更稳定的，即与亲本蛋白酶(例如具有SEQ ID NO 2的蛋白酶)相比，在液体洗涤剂(即在包括40％水或更多水的液体洗涤剂)中储存后具有更高的残留活性。优选地，与亲本蛋白酶的残留活性相比，例如与SEQ ID NO 2相比，当在30℃下在具有pH为10的液体洗涤剂和/或具有至少40％水的液体洗涤剂中储存4小时后测量时，本发明的蛋白酶变体的残留活性是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％如至少50％更高的。如实例3中所述。
具体地，根据本发明的蛋白酶变体及其相应的亲本蛋白酶的相对稳定性在高pH、高于或在pH 10下不同于其在中性pH、高于或在pH 7下的相对稳定性。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)的尼德尔(Needle)程序，优选地5.0.0版或更新版本中所执行的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔(Needle)输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：
(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔(Needle)输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：
(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
不同的严格条件定义如下。
术语“基本上纯的变体”意指按重量计包含最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％、以及最多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是与其天然或重组地相关的。优选地，该变体按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的这些变体优选以基本上纯的形式存在。例如，这可通过经由众所周知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。
术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因工程化多肽生产系统内的形式的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’-和3’-非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸按重量计是至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的这些多核苷酸优选以基本上纯的形式存在。
术语“纺织品”意指包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料的任何纺织品材料，连同由这些材料制成的织物，例如服装、衣服和其他物品。当使用术语织物或衣服时，旨在也包括广义术语纺织品。
术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、在三个或更多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指占据位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)。术语蛋白酶变体可以是枯草杆菌酶亲本的变体，即蛋白酶变体是与亲本蛋白酶相比在三个或更多个(例如，若干个)位置处包括改变(即取代、插入和/或缺失)的枯草杆菌酶。
术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤(如衣物洗涤或硬表面清洁)过程中去除存在于有待清洁的物体上的污渍的能力。洗涤性能的改进可以通过计算在AMSA测定中定义的所谓强度值(Int)来量化。
术语“野生型蛋白酶”意指由天然存在的有机体(例如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物)表达的一种蛋白酶。野生型枯草杆菌酶的实例是枯草杆菌蛋白酶Savinase，即SEQ ID NO:2的氨基酸1至269。
变体命名规则
为了本发明的目的，使用枯草杆菌蛋白酶BPN'(SEQ ID NO:1的氨基酸1-275的序列(斯艾森(Siezen)等人，1991，蛋白质工程(Protein Eng.)4:719-737))来确定另一种蛋白酶中对应的氨基酸残基。将另一种蛋白酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽比对，并且基于比对，使用尼德曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453)如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)的尼德尔程序，优选地5.0.0版或更新版本中所执行的，确定与在SEQID NO:1中披露的多肽中的任何氨基酸残基相应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
另一种蛋白酶中对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数比对多个多肽序列来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；3.5版或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcids Research)32:1792-1797)；MAFFT(6.857版或更新版本；加藤(Katoh)和库玛(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和朝都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和朝都，2010，生物信息学26:1899-1900)；以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83版或更新版本；汤普森(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)。
当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，可获取若干工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(Protein Engineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。
取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。位置之前的“X”意指该位置处的任何原始氨基酸都可以被取代。
缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入：另外的氨基酸残基的插入，例如像在G195之后插入赖氨酸可表示为：Gly195GlyLys或G195GK。可替代地，另外的氨基酸残基的插入，如在G195之后插入赖氨酸可表示为：*195aK。当插入一个以上氨基酸残基时，例如像在G195之后插入Lys和Ala可表示为：Gly195GlyLysAla或G195GKA。在此类情况下，还可以通过将小写字母添加到在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基位置编号处来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号，在这个实例中：*195aK*195bA。在以上的实例中，序列194至196因此为：
在取代和插入发生在相同的位置的情况下，这可表示为S99SD+S99A，或简写为S99AD。相同修饰也可以表示为S99A+*99aD。
在其中插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，显然是在命名中出现了简并。如果例如在以上实例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则将它表示为G195GG或*195GaG。对于以下变化，相同的实际变化也可以仅表示为A194AG或者*194aG，从：
这类情况对于技术人员来说是显而易见的，并且因此表示式G195GG和这种类型插入的相应表示式旨在包括这类等同简并表示式。
多个改变：包括多个改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。可替代地，空格或逗号可将多个改变分隔开，例如分别为A170Y G195E或A170Y，G195E。
不同的改变：可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
可替代地，不同改变或可任选的取代可用括号表示，例如Arg170[Tyr，Gly]或Arg170{Tyr，Gly}或简写为R170[Y，G]或R170{Y，G}。
发明详述
具有高pH的碱性液体洗涤剂广泛用于清洁，如衣物洗涤和餐具洗涤清洁。尤其在北美，消费者尤其常用具有升高的pH的液体洗涤剂。高pH清洁组合物还用于工业清洁过程。
碱性洗涤剂是具有洗涤剂特性的液体。此类洗涤剂的pH通常在pH为9至12.5的范围内。高pH洗涤剂典型地包括组分如表面活性剂、助洗剂和漂白组分，并且此外，它们还可以包含大量的水和碱，如NaOH、TSP(磷酸三钠)、氨、碳酸钠、氢氧化钾(KOH)，这些碱通常以对应于0.1％至30％重量(wt)的量添加。
商业高pH值洗涤剂的实例包括但不限于艾禾美(Arm&Hammer)(丘奇&德怀特(Church&Dwight))、瑟夫闪(Surf)闪闪发光的海洋(Sparkling Ocean)(联合利华(Unilever))、可伶布尔斯特(Clean Burst)、SUN三重清洁热带微风(SUN Triple CleanTropical Breeze)(SUN产品)、普雷克斯自由清新(Purex Free and Clear)(汉高(Henkel))和Xtra热带激情(Tropical Passion)(丘奇&德怀特(Church&Dwight))。
向洗涤剂中添加酶是非常有利的，因为这些酶的比活性有效地从表面如织物和餐具中去除了特定的污渍。然而，在高pH液体洗涤剂中维持可接受的酶稳定性的困难已多年来阻止将酶包含在这些洗涤剂中。
本发明涉及包括适用于此类组合物的碱性稳定蛋白酶变体的高pH液体清洁组合物。
本发明的一个方面涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从40％至95％wt，优选从约70％至约90％wt的水；
(c)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供从约11至13.5的pH；以及
(d)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供从约7.5至13.5的pH，优选pH为从约10至13.5；
(d)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
本发明的组合物优选包含碱性缓冲液系统以提供pH为至少约7.5、至少约8、至少约9，优选pH为10或更高。优选地，pH为从约9至约13。为了达到高pH，有必要根据产品所需的pH，使存在碱金属氢氧化物、尤其是氢氧化钠或氢氧化钾，通常以按重量计组合物的0.1％至约30％(重量百分比，缩写wt％)，并且优选1.0％至2.5％的量，或更高量的适合的碱金属硅酸盐，如金属硅酸盐。
本发明的组合物优选包含20％至95％wt，优选40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水。优选从约75％至80％wt的水，优选从约80％至85％wt的水，优选从约70％-75％wt的水，或优选从约75％-80％wt的水。优选地，本发明的组合物包括10％wt或更多的水，如至少20％wt、至少25％wt、至少30％wt、至少35％wt、至少40％wt、至少45％wt、至少50％wt、至少55％wt、至少60％wt、至少65％wt、至少70％wt、至少75％wt、至少80％wt、至少85％wt、至少90％wt、或至少95％wt或更多、但小于100％wt重量百分数(wt)的水。
可以将这些蛋白酶变体以对应于每升的洗涤液0.01-200mg的酶蛋白、优选每升的洗涤液0.05-50mg的酶蛋白、特别是每升的洗涤液0.1-10mg的酶蛋白的量添加至根据本发明的高pH清洁组合物中。
用于在衣物洗涤液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，如0.001％-7％，如0.1％-5％的根据本发明的蛋白酶变体。
用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，如0.001％-30％，如0.01％-20％，如0.5％-15％的酶蛋白。
本发明涉及具有pH为10或更高的液体清洁组合物，该组合物包括至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性。
添加至根据本发明的清洁组合物中的蛋白酶变体显示改进至一定程度的半衰期，使得它能够在高pH(pH>10.0)液体清洁组合物如洗涤剂中储存和使用蛋白酶。此外，蛋白酶变体在高pH液体中显示显著的洗涤性能，并且因此开启了改进高pH液体洗涤剂的洗涤性能和/或降低用来达到相同洗涤性能的这些洗涤剂配制品中存在的洗涤剂浓度的可能性。。此外，蛋白酶变体在高pH液体中显示显著的洗涤性能，并且因此开启了改进高pH液体洗涤剂的洗涤性能和/或降低用来达到相同洗涤性能的这些洗涤剂配制品中存在的蛋白酶浓度的可能性。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为10或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，其中所述变体包括在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO 1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一个实施例中，本发明提供了具有pH为10或更高并包括蛋白酶的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，其中所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代，优选地，所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代以及在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ IDNO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约7至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一个实施例中，本发明涉及包括蛋白酶的具有pH为从约7至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代，优选地，所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代以及在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约8至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一个实施例中，本发明涉及包括蛋白酶的具有pH为从约8至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代，优选地，所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代以及在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约9至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一个实施例中，本发明涉及包括蛋白酶的具有pH为从约9至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代，优选地，所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代以及在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约10至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一个实施例中，本发明涉及包括蛋白酶的具有pH为从约10至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代，优选地，所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代以及在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约11至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO 1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。在另一个实施例中，本发明涉及包括蛋白酶的具有pH为从约11至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代，优选地，所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代以及在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约7至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为从约7至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代，优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN’(SEQ IDNO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约8至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为从约8至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代，优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN’(SEQ IDNO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约9至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为从约9至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代，优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN’(SEQ IDNO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约10至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为从约10至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代，优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN’(SEQID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代。
本发明的一个实施例涉及包括蛋白酶的具有pH为从约11至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为从约11至约13或更高的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有至少60％一致性的变体蛋白酶，并且其中所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代，优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN’(SEQID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代。
在一些优选实施例中，该蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：
S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E；
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E。
在一些优选实施例中，在此提供的这些清洁组合物被这样配制，使得其具有以下pH：从约7.5至约13.5、或约8.0至约13.5、约8.5至约13.5、约9.0至13.5，或者在替代性实施例中，甚至从约9.5至约13.5，如从约10至约13.5、从约10至约13、从约10至约12.5、从约10至约12、从约10至约11.5、从约10至约11、从约10至约10.5。在一些优选实施例中，液体清洁组合物被这样配制，使得pH为从约10至约13.5。在其他优选实施例中，液体清洁组合物被这样配制，使得pH为从约12至13.5。
本发明的一个方面涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从40％至95％wt，优选从约70％至约90％wt的水；
(c)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供从约11至13.5的pH；以及
(d)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体，其中所述变体包括在一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
本发明的另一个方面涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体，其中所述变体包括在一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该碱性缓冲液系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供约8至13.5的pH，优选pH为从约10至13.5；
(d)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
在一个优选实施例中，该蛋白酶变体包括取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。因此，本发明的一个实施例涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从40％至95％wt，优选从约70％至约90％wt的水；
(c)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供从约11至13.5的pH；以及
(d)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体，其中所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN'(SEQ ID NO 1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D，优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO 1)的取代X205I和X209W的取代，进一步优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO 1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN’(SEQ ID NO 1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代。
本发明的另一个实施例涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体，其中所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D，优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代，进一步优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供从约8至13.5的pH，优选pH为从约10至13.5；
(d)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
在一些优选实施例中，该蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：
S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E；
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E。
当与亲本蛋白酶如具有SEQ ID NO:2的蛋白酶相比时，本发明的蛋白酶变体在pH为10或更高的液体清洁组合物中具有改进的稳定性。这使得这些变体适用于高pH液体洗涤剂，用于例如衣物洗涤或餐具洗涤。
在一个实施例中，该蛋白酶变体相比于亲本蛋白酶在高pH液体清洁组合物中具有改进的稳定性，特别是改进的储存稳定性。在一个优选实施例中，该蛋白酶变体相比于亲本蛋白酶具有改进的稳定性，特别是改进的储存稳定性，和同等或改进的洗涤性能。
在一个实施例中，该蛋白酶变体相比于亲本蛋白酶在高pH液体清洁组合物中具有改进的稳定性以及同等或改进的洗涤性能，其中储存稳定性可以使用‘加速储存稳定性测定’进行测量，并且洗涤性能可以使用自动机械应力测定(AMSA)进行测量。
在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少60％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少70％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少75％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少80％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少85％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少90％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少93％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少95％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少96％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少97％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该蛋白酶变体与该亲本蛋白酶具有至少98％但小于100％的序列一致性。
在一个实施例中，该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1至少60％一致，例如与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少60％一致，例如与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。
在一方面，该亲本蛋白酶中的改变的总数在3与30之间，优选在3与20之间，更优选在3与15之间，甚至更优选在3与10之间，最优选在3与8个改变之间。在另一方面，该亲本蛋白酶中的改变的总数是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个改变。
亲本或前体蛋白酶可以是任何蛋白酶,或甚至更优选的如下定义的任何枯草杆菌酶。该亲本蛋白酶优选是与SEQ ID NO:2具有至少60％一致性的蛋白酶，但是该亲本可以是任何丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在活性位点处存在一个必需丝氨酸残基的酶(怀特(White)、汉德勒(Handler)和史密斯(Smith)，1973，“生物化学原理(Principles of Biochemistry)”，第五版，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill BookCompany)，纽约，第271-272页)。细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围是20,000至45,000道尔顿。它们受到二异丙基氟磷酸的抑制。它们水解简单末端酯并且在活性上与同样是丝氨酸蛋白酶的真核糜蛋白酶相似。甚至更优选的亲本是碱性蛋白酶，其涵盖一个亚组，反映了一些丝氨酸蛋白酶从pH 9.0至11.0的高最适pH(综述参见普里斯特(Priest)(1977)细菌学评论(Bacteriological Rev.)41:711-753)。
该亲本蛋白酶可以是枯草杆菌酶，它是已经由斯艾森(Siezen)等人(1991)，蛋白质工程(Protein Eng.)4:719-737以及斯艾森等人(1997)，蛋白质科学(Protein Science)6:501-523提出的丝氨酸蛋白酶的一个亚组。它们是通过对先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的170多个氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶先前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据斯艾森(Siezen)等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定了多种多样的枯草杆菌酶，并且已确定许多枯草杆菌酶的氨基酸序列。对于此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述，参见斯艾森(Siezen)等人(1997)。枯草杆菌蛋白酶如上所述是枯草杆菌酶的一个亚组，所述枯草杆菌酶是来自S8家族、特别是来自S8A子族的丝氨酸蛋白酶，如MEROPS数据库(http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum？family＝S8)所定义的。枯草杆菌蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQ ID NO:1)和枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:2)，它们分别具有MEROPS编号S08.034和S08.003。亲本蛋白酶也可以是从自然来源中分离的枯草杆菌酶，其中在保留枯草杆菌酶特征的同时，已对其进行后续修饰(例如一条或多条氨基酸侧链的一个或多个置换，一个或多个取代、一个或多个缺失和/或一个或多个插入)。此外，亲本蛋白酶可以是一种通过DNA改组技术制备的枯草杆菌酶，如由内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)，17:893-896所描述的。
可替代地，术语“亲本蛋白酶”可以称为“前体蛋白酶”，并且用于描述其中进行突变以获得本发明的变体的起始蛋白酶。该亲本蛋白酶优选属于枯草杆菌蛋白酶亚组。
枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或“真”枯草杆菌蛋白酶，包括“标准的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN’、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)(诺维信公司)、以及枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。BPN’是来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’，枯草杆菌蛋白酶BPN’具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。斯艾森(Siezen)等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I-S2或高碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶，并且包括以下酶，如：枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(杰能科国际(GenencorInternational，Inc.))、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(诺维信公司)、碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)和具有氨基酸序列SEQ ID NO 2的枯草杆菌蛋白酶309(诺维信公司)。
两个氨基酸序列之间的同源性是在出于本发明的目的由参数“一致性”描述的背景下，两个氨基酸序列之间的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法来确定的。来自程序的结果除了氨基酸比对之外还计算两个序列之间的“百分比一致性”。
基于本描述，对于本领域的技术人员而言，鉴别可以根据本发明来修饰的适当同源枯草杆菌酶是相当简单的。
该亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，它具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或者由其组成。
该亲本蛋白酶可以是与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，它具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者由其组成。
该亲本蛋白酶可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本蛋白酶可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源所用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是细菌蛋白酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)蛋白酶。
在一方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白酶。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心，北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
根据本发明的高pH稳定的蛋白酶变体可以通过包括以下方法来制备,该方法包括以下步骤：
(a)将取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D引入亲本蛋白酶中，其中这些位置对应于SEQ ID NO:1的位置，以及
(b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过使用涉及包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；和巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(NucleicAcids Res.)18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，US 2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；US 5,223,409、WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
除了根据本发明的蛋白酶之外，根据本发明的液体清洁组合物还包括另外的组分，如以下列出的非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的织物的类型、污渍的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。
在一个具体实施例中，该高pH液体清洁组合物包括本发明的蛋白酶变体以及一种或多种洗涤剂组分，如表面活性剂、助水溶剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、抗氧化剂、以及增溶剂。
可以使用常规稳定剂和蛋白酶抑制剂来稳定本发明的清洁组合物的蛋白酶变体，例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、不同的盐(如NaCl、KCl)、乳酸、甲酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸(例如，如WO 96/41859中的))、或肽醛(如二肽醛、三肽醛或四肽醛或醛类似物)(或者具有形式B1-B0-R，其中R是H、CH3、CX3、CHX2、或CH2X(X＝卤素)，B0是单个氨基酸残基(优选地具有一个任选取代的脂肪族或芳香族侧链)；并且B1由一个或多个氨基酸残基组成(优选一个、两个或三个)，任选地包括一个N-末端保护基团(例如，如WO 2009/118375、WO 2013/004635中的)，或者如描述于WO 2005/105826、WO 2009/118375、WO 98/13459中的)或者蛋白类型的蛋白酶抑制剂，如RASI、BASI、WASI(水稻、大麦和小麦的双功能α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)(例如，如WO 2009/095425中的)或CI2或SSI。
此外，在PCT公开WO 94/04651和WO 98/13460中已经披露了肽醛用于稳定液体洗涤剂中的某些蛋白酶的用途。更具体地，WO 94/04651披露了肽醛Phe-Gly-Ala-PheH和Phe-Gly-Ala-LeuH用于稳定枯草杆菌蛋白酶型蛋白酶的用途。为了稳定胰凝乳蛋白酶型蛋白酶，WO 94/04651披露了Leu-Leu-TyrH作为适合的肽醛。此外，WO 94/04651建议使用氨基甲酸甲酯或甲基脲作为肽醛的N-末端保护基团。WO 98/13460披露了肽蛋白酶抑制剂，肽醛抑或三氟甲基酮的用途，其中该肽链包含2-5个氨基酸，并且该醛/三氟甲基酮来源于氨基酸丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯甘氨酸(phenylglycine)、苯丙氨酸或高苯丙氨酸(homophenylalanine)，并且其中该N-末端保护基团优选为磺酰胺(sulphonamide)或酰胺基磷酸(amidophosphate)。作为实例，可以使用CH3SO2Phe-Gly-Ala-LeuH。
在另一个实施例中，具有通式I的化合物：
其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸；可用于稳定和/或抑制本发明的蛋白酶变体。
在另一个实施例中，蛋白酶抑制剂是具有化学式B2-B1-B0-R的肽化合物，其中：
R是氢、CH3、CX3、CHX2或CH2X，其中X是卤素原子；
B0是在对位和/或间位有OH取代的苯丙氨酸残基；
B1是单个氨基酸残基；并且
B2由一个或多个氨基酸残基组成，任选地包括一个N端保护基团。
如上所述的具有化学式B2-B1-B0-R的所述蛋白酶抑制剂可用作本发明意义上的任选的蛋白酶抑制剂(例如与如在此所披露的本发明的任何实施例组合或作为其一部分)。
因此，在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为10或更高的液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性；
(b)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性；
(c)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该碱性缓冲液系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供约11至13.5的pH，优选pH为从约12至13.5；
(d)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在所述实施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它们可以彼此组合使用。
因此，在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为10或更高的液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性，优选地，所述变体包括在一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO 1)位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；
(b)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性，优选地，所述变体包括在一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO 1)位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；
(c)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体，优选地，所述变体包括在一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该碱性缓冲液系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供约11至13.5的pH，优选pH为从约12至13.5；
(d)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在所述实施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它们可以彼此组合使用。
因此，在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为10或更高的液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性，优选地，所述变体包括在对应于BPN’(SEQ IDNO:1)的位置205和209的位置处的取代，进一步优选地，所述变体包括在对应于BPN’(SEQID NO:1)的位置205和209的位置处的取代以及在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；
(b)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性，优选地，所述变体包括在对应于BPN’(SEQ IDNO:1)的位置205和209的的位置处的取代，进一步优选地，所述变体包括在对应于BPN’(SEQID NO:1)的位置205和209的位置处的取代以及在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN’(SEQ ID NO 1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；
(c)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体，优选地，所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代，进一步优选地，所述变体包括在对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置205和209的位置处的取代以及在以下一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、206、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该碱性缓冲液系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供约11至13.5的pH，优选pH为从约12至13.5；
(d)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在所述实施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它们可以彼此组合使用。
因此，在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为10或更高的液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性，优选地，所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN'(SEQ ID NO 1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D；
(b)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(d)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；
(e)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性，优选地，所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN'(SEQ ID NO 1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D；
(f)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体，优选地，所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该碱性缓冲液系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供约11至13.5的pH，优选pH为从约12至13.5；
(d)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在所述实施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它们可以彼此组合使用。
因此，在另一个实施例中，本发明涉及具有pH为10或更高的液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性，优选地，所述变体包括对应于BPN'(SEQ ID NO1)的取代X205I和X209W的取代，进一步优选地，所述变体包括对应于BPN'(SEQ ID NO 1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN'(SEQ ID NO 1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代；
(b)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性，优选地，所述变体包括对应于BPN'(SEQ ID NO1)的取代X205I和X209W的取代，进一步优选地，所述变体包括对应于BPN'(SEQ ID NO 1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN'(SEQ ID NO 1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代；
(c)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明涉及一种液体清洁组合物，该组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体，优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X205I和X209W的取代，进一步优选地，所述变体包括对应于BPN’(SEQ ID NO 1)的取代X205I和X209W的取代以及对应于BPN’(SEQ ID NO 1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X206L、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D的一个或多个取代；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该碱性缓冲液系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供约11至13.5的pH，优选pH为从约12至13.5；
(d)任选地，一种蛋白酶抑制剂，优选地，所述蛋白酶抑制剂是一种肽醛蛋白酶抑制剂，进一步优选地，所述蛋白酶抑制剂是具有通式I的化合物，其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、CH3、CX3、CHX2、CH2X，其中X是卤素原子，B1是单个氨基酸残基，并且B2是一个或多个氨基酸残基，B2任选地包括N-末端保护基团，条件是如果B1是亮氨酸，那么B2不能是亮氨酸。
在所述实施例中，(c1)和(c2)可以用作彼此的替代物或它们可以彼此组合使用。
在一些优选实施例中，该蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：
S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E；
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
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该组合物可以如在例如WO 92/19709、WO 92/19708和US 6,472,364中描述的来配制。在一些实施例中，在此利用的这些酶由存在于为这些酶提供此类离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，连同其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV)稳定化。
本发明的蛋白酶变体还可以掺入到WO 97/07202(通过引用结合在此)中所披露的洗涤剂配制品中。
本发明的液体清洁组合物的特征在于具有高pH(在pH 10或高于pH10)。液体高pH清洁组合物可以进一步包括高量的水。在本发明的一个优选方面，该液体清洁组合物包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从40％至95％wt，优选从约70％至约90％wt的水；
(c)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供从约11至13.5的pH；以及
(d)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体。
表面活性剂可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例中，该清洁组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和与一种或多种阴离子表面活性剂的化合物。表面活性剂典型地以按重量计约0.1％至60％、如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％的水平存在。当被包括在根据本发明的清洁组合物中时，表面活性剂通常将包含按重量计从约1％至约40％，如从约1％至约20％，优选按重量计从约0％至约5％。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)，LAS的异构体，支链烷基苯磺酸盐(BABS)，苯基链烷磺酸盐，α-烯烃磺酸盐(AOS)，烯烃磺酸盐，链烯烃磺酸盐，链烷-2,3-二基双(硫酸盐)，羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐，烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))，脂肪醇硫酸盐(FAS)，伯醇硫酸盐(PAS)，醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)，仲链烷磺酸盐(SAS)，石蜡烃磺酸盐(PS)，酯磺酸盐，磺化的脂肪酸甘油酯，α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))，烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)，氨基酸的脂肪酸衍生物，磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯，以及其组合。
当被包括在根据本发明的清洁组合物中时，它将通常包含按重量计从约0％至约10％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。
非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。
半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)(例如烷基二甲基氧化胺)、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。
特别优选的表面活性剂包括LAS、MES、醇醚硫酸盐、乙氧基化月桂醇或十二烷基苯磺酸钠。
根据本发明的液体高pH清洁组合物典型地包含按重量计至少20％并且按重量计高达95％的水，如高达约70％wt的水、高达约65％wt的水、高达约55％wt的水、高达约45％wt的水、高达约35％wt的水。包括但不局限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在液体清洁组合物中。该清洁组合物可以包含从0％-30％的有机溶剂。
该清洁组合物还可以包含这样一种助水溶剂，它是将疏水化合物溶解于水溶液中(或相反地，将极性物质溶剂于非极性环境中)的化合物。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的综述，胶体&界面科学新见(Current Opinion in Colloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶剂示出连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在清洁组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。根据本发明的清洁组合物可以包含按重量计0-5％、如约0.5％至约5％、或约3％至约5％wt的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。根据本发明的清洁组合物可以包含按重量计约0-65％，如约5％至约45％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地为40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和螯合剂例如通过从液体中去除金属离子来软化洗涤水。助洗剂和/或共助洗剂可以特别是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。
根据本发明的清洁组合物还可以包含按重量计0-20％，如约5％至约10％wt的洗涤剂共助洗剂、或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 2009/102854和US 5,977,053中。
根据本发明的清洁组合物可以包含按重量计0-50％，如约0.1％至约25％的漂白系统。漂白系统经常通过氧化去除颜色，并且许多漂白剂还具有强杀细菌特性，并且用于消毒和灭菌。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、次氯酸盐、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预形成的过酸及其混合物。
可用于本发明组合物中的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰胶原、钴-胺催化剂和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂；特别优选锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)的络合物，具体地是Me3-TACN，如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2',2”-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。漂白催化剂还可以是其他金属化合物，如铁或钴络合物。
适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))、及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括与过酸形成漂白活化剂组合的基于过氧化物的漂白体系，其可以包含例如无机盐，包括碱金属盐例如过硼酸盐的钠盐(通常为单或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。因此形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且特别是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是有效的漂白活化剂。最后，ATC为衣物添加剂提供良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。该漂白系统还可以包括过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。该漂白系统还可以包括漂白催化剂。
在一些实施方案中，漂白组分可以是选自具有以下化学式的有机催化剂的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
一种具体的漂白剂是次氯酸盐，如次氯酸钠(NaClO)。次氯酸盐通过高pH稳定，并且此外，次氯酸盐是抗细菌剂。通常，根据本发明的清洁组合物包含3％-8％次氯酸钠和0.01％-0.05％氢氧化钠；使用氢氧化钠以减缓次氯酸钠分解成氯化钠和氯酸钠。次氯酸盐可能不是洗涤剂配方的一部分，但是在洗涤过程期间添加了单独的产品。
在本发明的一个方面，本发明的高pH清洁组合物不包括任何漂白剂，即该清洁组合物可以无漂白剂。
根据本发明的清洁组合物可以包含按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。本发明的清洁组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当该织物与一种洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包括该洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变该织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index) (C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如描述于WO 2005/003274、WO 2005/003275、WO 2005/003276以及EP 1876226(通过引用而特此结合)中。该洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。
根据本发明的清洁组合物可以包括一种或多种(另外的)酶，如淀粉酶、过水解酶、阿拉伯糖酶、糖酶、纤维素酶(例如内切葡聚糖酶)、角质酶、半乳聚糖酶、卤代过氧合酶、脂肪酶、甘露聚糖酶，氧化酶，例如漆酶和/或过氧化物酶，果胶酶、果胶裂解酶、蛋白酶、DNA酶、木聚糖酶、黄原胶酶、和木葡聚糖酶。
一般而言，一种或多种所选酶的特性应与洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
该组合物可以包括一种或多种另外的蛋白酶，这些蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 2007/044993(杰能科国际公司(GenencorInt.))中的中性金属蛋白酶，如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、 Ultra、 Ultra、以及(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPurafectPurafectPurafect 以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，如描述于EP 258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 2010/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 2010/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 2011/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 2011/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 2011/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 2011/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 2012/137147)。优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 2010/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 2005/056782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 2009/067279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(尤其是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 2010/100028)。
适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。可商购的淀粉酶是DuramylTM、特妙淀粉酶TM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、Preferenz S1000、PreferenzS100及Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor InternationalInc./DuPont))。
适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包括一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于清洁组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等，优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，尤其是无粉尘颗粒；液体，尤其是稳定化液体；或者浆液。
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤清洁组合物中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独抑或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。
本发明的清洁组合物还可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不多于两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉末洗涤剂，表面活性剂科学系列(Surfactant ScienceSeries)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)。
本发明的清洁组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不局限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
本发明的清洁组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约05％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals andChemicals)，孟买，印度供应。适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
本发明的清洁组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉布和基于聚酯的织物)移除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉末洗涤剂(PowderedDetergents)，表面活性剂科学系列(Surfactant science series)第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 03/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
本发明的清洁组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物的功能还可以是抗再沉积剂。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
本发明的清洁组合物可以配制成袋，这些袋可以被配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。该内部体积可以被分成袋的区室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Indiana,US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物洗涤洗涤剂组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包含固体的室不同。参见例如US2009/0011970。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。因此，可以避免组分间的不良的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
本发明还针对根据本发明的清洁组合物在纺织品和织物洗涤中的使用方法，如家用衣物洗涤以及工业衣物洗涤。此类方法包括在清洁硬表面如地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)中使用根据本发明的组合物或其组合物的方法。
可以将本发明的蛋白酶变体添加至根据本发明的高pH清洁组合物中并且因此使其成为该高pH清洁组合物的组分。因此，本发明的一个方面涉及蛋白酶变体在高pH清洁过程如在pH为10或高于pH 10下的衣物洗涤和/或硬表面清洁中的用途。
本发明的清洁组合物可以配制为(例如)手洗或机洗衣物洗涤洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的衣物洗涤添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
清洁过程或者纺织品护理过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用衣物洗涤，但是它也可以是工业衣物洗涤。此外，本发明涉及一种用于洗涤织物和/或服装的方法，其中该方法包括用包含根据本发明的高pH清洁组合物和本发明的至少一种蛋白酶变体的洗涤溶液处理织物。清洁过程或纺织品护理过程可以是例如以机器洗涤过程或以手洗过程或以预去渍剂(pre-spotter)过程进行的。洗涤溶液可以例如是包含清洁组合物的水洗溶液。
本发明进一步涉及本发明的清洁组合物在蛋白质污渍去除过程中的用途。蛋白质污渍可能是如食品污渍等污渍，如婴儿食品、皮脂、可可、鸡蛋、血液、牛奶、墨水、草、或其组合。
优选实施例涉及清洁方法，该方法包括在适合于清洁物体的条件下将该物体与包括本发明的蛋白酶变体的高pH清洁组合物接触的步骤。在优选实施例中，该清洁组合物用于衣物或餐具洗涤过程中。
仍另一个实施例涉及用于从织物或餐具上去除污渍的方法，该方法包括在适合于清洁该物体的条件下将该织物或餐具与包括本发明的蛋白酶的高pH清洁组合物接触。
还考虑了使用本发明的清洁组合物处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。可以在任何织物处理方法中使用高pH清洁组合物，这些方法在本领域是熟知的(参见，例如，US 6,077,316)。例如，在一方面，通过一种方法改进织物的触感和外观，该方法包括将该织物与溶液中的蛋白酶接触。在一方面，在压力下用该溶液处理该织物。
本发明的高pH清洁组合物适合用于在液体衣物洗涤和液体硬表面应用(包括餐具洗涤和汽车洗涤)中使用。因此，本发明包括用于洗涤织物或洗涤硬表面的方法。该方法包括使有待清洁的织物/餐具与包括根据本发明的高pH清洁组合物的溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。硬表面可以包括任何餐具，如陶器、刀具、陶瓷、塑料(如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃、丙烯酸树脂或其他硬表面(如汽车、地板等)。该溶液优选具有从约9至约13.5的pH。可在溶液中按以下浓度使用组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃和约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。
在一些优选实施例中，在此提供的这些高pH清洁组合物被典型地这样配制，使得用于水性清洁操作过程中，洗涤水具有以下pH：从约9至约13.5，或在替代性实施例中，或从约10至约13.5，甚至从约11至约13.5。在一些优选实施例中，液体衣物洗涤产品被配制成具有从约12至约13.5的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲剂、酸、碱等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。在本发明的上下文中，使用碱将pH调节至约9至13.5，优选约10至13.5。
在下面各段中对本发明进行了进一步的概述：
1.一种具有pH为10或更高的液体清洁组合物，包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性
(b)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
2.一种液体清洁组合物，包括：
(a)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为7.5或更高、优选10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性；
(c)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
3.如段落1所述的液体清洁组合物，其中所述pH为从约12至13.5。
4.如段落1-3中任一项所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％一致性的蛋白酶的变体，其中所述变体包括在一个或多个位置的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
5.如段落1-4中任一项所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％一致性的蛋白酶的变体，其中所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。
6.如段落1-5中任一项所述的液体清洁组合物，其中该变体包括一个或多个取代，这些取代对应于取代X209W、X262E、X76D、X194P、X204D、X206L。
7.根据前述段落中任一项所述的液体清洁组合物，其中该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少60％一致，例如与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。
8.根据前述段落中任一项所述的液体清洁组合物，其中所述蛋白酶变体在40℃下具有大于至少一种稳定的蛋白酶变体的储存稳定性，该至少一种稳定的蛋白酶变体选自下组，该组由以下各项组成：
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262ES9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；
S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+L262E。
9.根据前述段落中任一项所述的液体清洁组合物，其中所述蛋白酶变体选自下组，该组由以下各项组成：
S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E；
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E。
10.一种液体清洁组合物，包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该碱性缓冲液系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供约7.5至13.5的pH，优选pH为从约12至13.5；
(d)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
11.如段落10所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶变体包括在一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
12.根据段落11所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。
13.根据段落10至12中任一项所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶变体与SEQID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、但小于100％的序列一致性。
14.根据段落10-13中任一项所述的液体清洁组合物，其中所述蛋白酶变体选自下组，该组由以下各项组成：
S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E；
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E。
15.根据前述段落中任一项所述的清洁组合物，该清洁组合物包括一种或多种选自下组的另外的酶，该组由以下各项组成：淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(例如内切葡聚糖酶)、角质酶、卤代过氧合酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、蛋白酶、黄原胶酶、和木葡聚糖酶、或其任何混合物。
16.如前述段落中任一项所述的液体清洁组合物在清洁过程如衣物洗涤或硬表面清洁，包括餐具洗涤和工业清洁中的用途。
17.如段落16所述的用途，其中该衣物洗涤过程选自下组，该组由以下各项组成：住宅衣物洗涤过程、工业衣物洗涤过程和公用衣物洗涤过程。
通过以下实例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实例
材料与方法
Suc-AAPF-pNA活性测定
蛋白水解活性可以通过采用Suc-AAPF-PNA作为底物的方法来确定。Suc-AAPF-PNA是N-琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且是可以通过内切蛋白酶切割的一种封闭肽。在切割后，一个游离PNA分子被释放出来，它具有黄色颜色并且因此可以通过可见光分光光度法在波长405nm处进行测量。该Suc-AAPF-PNA底物由巴亨公司(Bachem)(目录号L1400，溶解于DMSO中)来生产。
待分析的蛋白酶样品被稀释在残留活性缓冲液(100mM Tris pH 8.6)中。通过转移30μl的稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加70μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mMTris pH 8.6中)进行该测定。将该溶液在室温混合并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。
在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的蛋白酶的活性成正比例。将蛋白酶样品稀释至其中斜率为线性的水平。
实例1：蛋白酶变体的制备和表达
下面总结了突变和表达盒到枯草芽孢杆菌的引入。所有DNA操纵是通过PCR(例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人；分子克隆(Molecular Cloning)；冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press))进行的。
使用编码蛋白酶变体的重组枯草杆菌构建体来接种包含富营养培养基(例如，100g/L蔗糖(丹尼斯克目录号109-0429)、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/L Na2HPO4.12H2O(默克(Merck)目录号6579)、0.1ml/L替换-Dowfax63N10(陶氏化学(Dow))的摇瓶中。典型地在30℃下在220rpm的振摇下进行4天的培养。
实例2：蛋白酶变体的纯化
将培养液以26000x g离心20分钟，并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便去除剩余芽孢杆菌宿主细胞。用3M Tris碱将0.2μm滤液中的pH调节至pH 8，并将经pH调节的滤液施加至在20mM Tris/HCl、1mM CaCl2(pH 8.0)中平衡的MEP Hypercel柱(颇尔公司(Pall Corporation))上。将柱用平衡缓冲液洗涤后，将该柱用20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2(pH 4.5)逐步洗脱。使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析，并且合并峰级分。将来自该MEPHypercel柱的合并物的pH用20％(v/v)CH3COOH或3M Tris碱调节至pH 6，并且将经pH调节的合并物用去离子水稀释至与20mM MES/NaOH、2mM CaCl2(pH 6.0)相同的电导率。将经稀释的合并物施加至在20mM MES/NaOH、2mM CaCl2(pH 6.0)中平衡的SP-琼脂糖(Sepharose)快流柱(GE医疗公司(GE Healthcare))上。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将蛋白酶变体用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)经五个柱体积进行洗脱。使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析，并且通过SDS-PAGE将活性级分进行分析。将级分(在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上的仅观察到一条带)合并为纯化的制剂并且用于另外的实验。
实例3：加速储存稳定性测定
在升高的温度下孵育长达24小时的情况下，使用加速测定评估蛋白酶变体在液体洗涤剂中的储存稳定性。
基于280nm处的吸光度和理论消光系数，使用0.01％Triton X-100将所有纯化的蛋白酶样品稀释至0.2和0.1mg/ml的浓度。针对每个变体，包括具有高蛋白酶浓度的2个孔和具有低浓度的2个孔。作为参照，在每个微量滴定板上包括Savinase(SEQ ID NO 2)或经稳定的蛋白酶变体。使用磁棒(在Zephyr移液台(Caliper LifeSciences公司)上持续30min)，将30μl蛋白酶样品与270μl洗涤剂(瑟夫(Surf)闪闪发光的海洋(SparklingOcean)，DC-2014-0009)在微量滴定板(Nunc U96PP 0.5ml)的孔中混合。然后将20μl的这种混合物转移至另一个微量滴定板(加有磁棒的Nunc U96PP 0.5ml)中，并且与150μl 100mMTris(pH 8.6)混合(在Zephyr上至少5min)。将30μl的这种稀释液转移至Nunc F 96-MTP中，并且在添加70μl底物溶液后，通过每20sec在405nm下测量吸光度持续5min来确定非应激样品的初始活性(在SpectraMax Plus上)。在密封后，将洗涤剂板在艾本德恒温混匀仪(Eppendorf Thermomixer)中在50℃和pH 11下进行孵育(未振荡)。在1、3-4和23-24小时孵育后，抽取20μl样品，并且像初始非应激活性一样，测量应激样品的残留活性。
在用洗涤剂孵育过程中的活性下降被假定为指数式的。从Log(活性)对比孵育时间的线性回归发现半衰期(T1/2)。Savinase(SEQ ID NO 2)在该实验的条件下具有非常短的半衰期，并且因此相对于已经稳定的蛋白酶变体测量这些突变的影响。
变体T1/2IF在40℃下的加速储存稳定性：单突变的半衰期改进影响
突变G61E
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E，T1/2：0.9
S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E，T1/2：4.8
突变Y209W
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E，T1/2：4.5
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E，T1/2：13.0
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E，T1/2：4.6
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E，T1/2：12.4
突变M222S
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E，T1/2：12.0
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E，T1/2：14.5
突变V205I
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E，T1/2：5.0
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E，T1/2：1.2
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+Q206L+S259D+L262E，T1/2：5.0
S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E，T1/2：1.6
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E，T1/2：3.0
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E，T1/2：6.6
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E，T1/2：1.0
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E，T1/2：4.6
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E，T1/2：0.9
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E，T1/2：5.0
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E，T1/2：9.9
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E，T1/2：13.0
突变S256D
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E，T1/2：4.5
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E，T1/2：6.6
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E，T1/2：12.4
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E，T1/2：13.3
突变S188E
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E，T1/2：12.0
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E，T1/2：13.7
突变T260E
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E，T1/2：13.5
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E，T1/2：15.1
突变H120T
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E，T1/2：3.0
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E，T1/2：5.4
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E，T1/2：12.0
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E，T1/2：12.2
突变G160P
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E，T1/2：13.2
S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E，T1/2：14.3
突变Q182E
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E，T1/2：4.5
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E，T1/2：4.6
S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E，T1/2：12.3
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E，T1/2：13.2
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH，T1/2：4.2
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH，T1/2：4.6
S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E，T1/2：11.5
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E，T1/2：14.0
突变N185E
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E，T1/2：12.0
S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E，T1/2：12.4
突变N261M
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E，T1/2：12.0
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E，T1/2：12.7
突变S259D
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+L262E，T1/2：6.0
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E，T1/2：7.2
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+L262E，T1/2：6.0
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E，T1/2：6.5
实例4：本发明的蛋白酶的满量程洗涤结果
在满量程洗涤(full scale wash)中，测试本发明的蛋白酶的洗涤性能。在衣物洗涤液体洗涤剂中，在22种不同的污渍上以剂量反应测试洗涤性能。
洗涤并漂洗之后，将小块布样摊开铺平并且允许在室温下风干过夜。在洗涤的次日评估所有洗涤。使用具有非常小孔径的Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计进行小块布样的光反射评估。在入射光中没有UV的情况下进行测量并且提取460nm处的反射。在未洗涤的和洗涤的小块布样上进行测量。将有待测量的测试小块布样放置在相同类型和颜色的另一个小块布样的顶部。
通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且与来自未用酶洗涤的小块布样的测量值相减来计算针对每种污渍的酶效果，ΔRem酶。将洗涤性能表示为Δ反射值(ΔRem)。
使用洗涤剂组合物和小块布样在以下表21中所指定的实验条件下执行实验。
表21：用于满量程洗涤衣物洗涤实验的实验条件
通过向测试系统添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3-＝3:1:6)，将水硬度调节至6.7°dH。
表22：在所有free&clear中，在15℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包括蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值(测试的酶如下：
1：S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
2：S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
3：S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E)；
Δ(对比空白)
表23：在所有Free&Clear中，在30℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包括蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值(在以下“结果(酶-空白)”中所测试的酶如下：
1：S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
2：S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
3：S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
4：S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E)；
所有free&clear 30℃
表24：在所有艾禾美(Arm&Hammer)中，在30℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包括蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值(测试的酶如下：
1：S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
2：S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
3：S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E)；
Δ(对比空白)洗涤剂艾禾美(Arm&Hammer)
表25：在普雷克斯(Purex)中，在30℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包括蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值(测试的酶如下：
1：S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
2：S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
3：S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E)；
Purex
表26：在Sun三重清洁(Triple Clean)中，在30℃下，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包括蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值(测试的酶如下：
1：S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
2：S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
3：S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E)；
Δ(对比空白)洗涤剂Sun Triple Clean
表27：在30℃下，在Xtra中，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包括蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值。测试的酶包括以下项：
1：S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
2：S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
3：S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E：
Δ(对比空白)洗涤剂Xtra
实例5：在微型洗涤中测试枯草杆菌蛋白酶309变体
使用微型洗涤系统，使用衣物洗涤液体洗涤剂在一种技术污渍上测试本发明的蛋白酶的洗涤性能。
微型洗涤测定是如下测试方法，其中污染的纺织品被连续地提起放进测试溶液中并且随后漂洗。
表28：在以下指定的实验条件下进行洗涤实验：
测试材料从EMPA试验材料AG(EMPA Testmaterials AG，12，CH-9015街，加仑，瑞士)获得。
随后将纺织品风干并且将洗涤性能测量为这些纺织品的颜色的亮度。还可以将亮度表示为反射比(R)，反射比是当用白光照射时，从测试材料反射或发射的光的量度。使用Zeiss MCS 521 VIS分光光度计在460nm处测量纺织品的反射比(R)。根据制造商的方案进行测量。
通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且与来自未用酶洗涤的小块布样的测量值相减来计算针对每种污渍的酶效果，ΔRem酶。
如在微型洗涤测定中针对衣物洗涤方法所描述的，用该洗涤剂组合物和小块布样在如下表29中所指定的实验条件下执行实验。
表29：用于微型洗涤衣物洗涤实验的实验条件
通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3 -＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至8.4°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水漂洗并干燥。
表30：在25℃下，与具有枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO 2)的洗涤剂相比，蛋白酶枯草杆菌蛋白酶309变体的相对性能
结果表30示出，在25℃下，在血液/牛奶/墨水上，与枯草杆菌蛋白酶309(SEQ IDNO:2)相比，枯草杆菌蛋白酶309变体示出改进的或同等的洗涤性能。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
尼耳森（Nielsen）, 延斯 埃里克（Jens Erik）
<120> 包括蛋白酶变体的液体清洁组合物
<130> 13106-WO-PCT
<160> 2
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 275
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）
<400> 1
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275
<210> 2
<211> 269
<212> PRT
<213> 迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus）
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265

Claims (17)

1.一种具有pH为10或更高的液体清洁组合物，包括：
(a)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性
(b)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
2.一种液体清洁组合物，包括：
(a)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；
(b)至少0.01wt％的蛋白酶，其中该蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，并且其中该蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的特征在于当在40℃下在具有pH为7.5或更高、优选10的液体洗涤剂中4小时后进行测量时，具有比亲本蛋白酶高至少10％的残留活性；
(c)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
3.如权利要求1所述的液体清洁组合物，其中所述pH为从约12至13.5。
4.如权利要求1-3中任一项所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％一致性的蛋白酶的变体，其中所述变体包括在一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
5.如权利要求1-4中任一项所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶是与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％一致性的蛋白酶的变体，其中所述变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。
6.如权利要求1-5中任一项所述的液体清洁组合物，其中该变体包括一个或多个取代，这些取代对应于取代X209W、X262E、X76D、X194P、X204D、X206L。
7.根据前述权利要求中任一项所述的液体清洁组合物，其中该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少60％一致，例如与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的液体清洁组合物，其中所述蛋白酶变体在40℃下具有大于至少一种稳定的蛋白酶变体的储存稳定性，该至少一种稳定的蛋白酶变体选自下组，该组由以下各项组成：
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262ES9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；
S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+L262E。
9.根据前述权利要求中任一项所述的液体清洁组合物，其中所述蛋白酶变体选自下组，该组由以下各项组成：
S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E；
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E。
10.一种液体清洁组合物，包括：
(a)从0％至20％wt，优选0.1％至2.5％wt的洗涤剂表面活性剂；
(b)从0.001％至10％wt，优选0.1％至5％wt的蛋白酶变体；以及
(c1)从20％至95％wt，优选从40％至95％wt，进一步优选从约70％至约90％wt的水；和/或
(c2)从1％至30％wt的碱性缓冲液系统，该碱性缓冲液系统包括碱金属硅酸盐或碱金属氢氧化物或其混合物，以提供约7.5至13.5的pH，优选pH为从约11至13.5；
(d)任选地，蛋白酶抑制剂，优选所述蛋白酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂。
11.如权利要求10所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶变体包括在一个或多个位置处的取代，这些位置选自对应于BPN'(SEQ ID NO:1)的位置3、9、18、43、49、61、76、115、120、182、185、188、194、205、206、209、216、217、218、222、255、256、259、260、261和262的位置。
12.根据权利要求11所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶变体包括一个或多个取代，这些取代对应于BPN’(SEQ ID NO:1)的取代X3V、X9D、X9E、X18S、X43R、X43K、X49T、X61D、X76D、X115W、X120T、X120V、X120D、X182D、X182E、X185E、X185D、X188E、X188D、X194P、X205I、X206L、X209W、X216V、X217M、X218T、X222S、X255E、X255D、X256D、X256E、X259D、X259E、X260A、X260E、X260D、X261M、X261W、X262E和X262D。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的液体清洁组合物，其中该蛋白酶变体与SEQID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、但小于100％的序列一致性。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的液体清洁组合物，其中所述蛋白酶变体选自下组，该组由以下各项组成：
S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E；
S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+*275aH；
S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E；
S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E；
S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH；
S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E；
S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+N261W+L262E。
15.根据前述权利要求中任一项所述的清洁组合物，该清洁组合物包括一种或多种选自下组的另外的酶，该组由以下各项组成：过水解酶、淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(例如内切葡聚糖酶)、角质酶、卤代过氧合酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、蛋白酶、DNA酶、黄原胶酶、和木葡聚糖酶、或其任何混合物。
16.如前述权利要求中任一项所述的液体清洁组合物在清洁过程如衣物洗涤或硬表面清洁，包括餐具洗涤和工业清洁中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其中该衣物洗涤过程选自下组，该组由以下各项组成：住宅衣物洗涤过程、工业衣物洗涤过程和公共机构衣物洗涤过程。
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