JP2015509364A - サブチリシン変異体およびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、サブチリシン変異体およびサブチリシン変異体を得るための方法に関する。本発明はまた、この変異体をコードするポリヌクレオチド；このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞；ならびにこの変異体を用いる方法に関する。

Description

発明の分野
本発明は、洗浄性能、熱安定性、保管安定性、または触媒活性を含む１つまたは複数の特性において、親サブチリシンに対する改変を示す新規のサブチリシン変異体に関する。本発明の変異体は、例えば、ランドリー洗剤組成物および自動皿洗浄組成物を含む皿洗浄組成物など、クリーニング組成物または洗剤組成物で使用するのに適している。本発明はまた、変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列、発現ベクター、宿主細胞、および本発明の変異体を生成および使用するための方法に関する。
発明の背景
洗剤産業では、３０年を超える期間、酵素が洗浄用配合物の中に組み込まれてきた。そのような配合物の中に用いられる酵素には、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、マンノシダーゼ、およびその他の酵素、またはそれらの混合物が含まれる。商業的に最も重要な酵素はプロテアーゼである。
商業的使用が増加しているプロテアーゼには、天然の野生型プロテアーゼのタンパク質工学による変異体、例えば、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）およびＫａｎｎａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ ａ／ｓ）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆａｓｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯＸＰ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）およびＥｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）およびＢＬＡＰ（図２９、米国特許第５３５２６０４号明細書）（Ｈｅｎｋｅｌ ＡＧ ＆ Ｃｏ．ＫＧａＡ）がある。
さらに、いくつかの変異体が、当技術分野において、例えば洗浄性能、熱安定性、保管安定性または触媒活性において、親サブチリシンに対する改変を示すサブチリシン変異体を記載する国際公開第０４／０４１９７９号パンフレット（ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ Ａ／Ｓ）などに記載されている。変異体は、例えばクリーニング組成物または洗剤組成物の中で使用するのに適している。
いくつかの有用なサブチリシン変異体が記載されており、これらの多くは、種々の洗剤において、向上した活性、安定性および溶解性を提供している。国際公開第９４／０２６１８号パンフレットには、向上した保管安定性を有するサブチリシン変異体が記載されている。置換Ｌ２１１ＸおよびＮ２１２Ｚ（ここで、ＸはＬ以外の任意のアミノ酸であり、ＺはＮ以外の任意のアミノ酸である）が、他のいくつかの突然変異と共に記載されている。しかしながら、これらの変異体の洗浄性能は示されておらず、また卵の汚れなど特定の汚れについても何ら記載がない。卵の汚れは完全に除去することが特に困難であることが当技術分野では周知であり、卵の汚れに対して向上した性能を有するいくつかのプロテアーゼ変異体が、例えば国際公開第０１／４４４５２号パンフレットに記載されているが、卵の汚れを含む種々の汚れに対して高い洗浄性能を有するプロテアーゼの必要性は依然として存在する。
発明の概要
したがって、本発明の目的は、親プロテアーゼに比較して、特性が向上したプロテアーゼ変異体を提供することである。
本発明は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含む、プロテアーゼ活性を有するサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選択されるサブチリシン変異体に関する。それ故、本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含む、プロテアーゼ活性を有するサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択されるサブチリシン変異体に関する。本発明はまた、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含む、プロテアーゼ活性を有するサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択され、かつ配列番号２および／または４に少なくとも６０％の同一性があるアミノ酸配列を有するサブチリシン変異体に関する。
本発明はまた、変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド；このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞；ならびに変異体を生成する方法に関する。
本発明はまた、サブチリシン親プロテアーゼのプロテアーゼ活性を有する変異体を得るための方法であって、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を親サブチリシンに導入するステップであって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択されるステップと、この変異体を回収するステップと、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するか否かをテストするステップとを含む方法に関する。この変異体は、配列番号２および／または４に対して少なくとも６０％の配列同一性を有することが好ましい。本発明はまた、このような方法により得られる変異体に関する。
本発明はさらに、クリーニング組成物および洗剤組成物などの組成物、ならびにランドリーおよび／または皿洗浄などのクリーニングプロセスにおける、本発明のこのような組成物および変異体の使用に関する。
定義
プロテアーゼ：「プロテアーゼ」という用語は、ペプチド結合を加水分解する酵素として本明細書に定義される。プロテアーゼは、ＥＣ３．４酵素群（そのサブクラス１３種のそれぞれを含む）に属するいずれの酵素も含む。ＥＣ番号は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，２２３，１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，２３２，１−６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２３７，１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７，２５０，１−６；およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，２６４，６１０−６５０にそれぞれ公開された補遺１〜５を含む、ＮＣ−ＩＵＢＭＢ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによる酵素命名法１９９２による。
プロテアーゼ活性：「プロテアーゼ活性」という用語は、タンパク質分解活性（ＥＣ３．４）を意味する。本発明のプロテアーゼは、エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）である。いくつかのプロテアーゼ活性タイプがあり、３つの主要な活性タイプは、以下のものである：Ｐ１のＡｒｇまたはＬｙｓの後にアミド基質の切断があるトリプシン様、Ｐ１の疎水性アミノ酸１個の後に切断が起こるキモトリプシン様、およびＰ１のＡｌａの後に切断があるエラスターゼ様。本発明の目的のために、プロテアーゼ活性は、「材料および方法」に記載される手順に従って測定される。本発明のサブチリシン変異体は、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％および少なくとも１００％を有する。
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を介して自然に生じ、また、個体群中の多型性によりもたらされ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされるポリペプチドにおける変化無し）であり得るか、または改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもある。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、原核細胞または真核細胞から得られる、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡ分子から逆転写により調製することができるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。
コード配列：「コード配列」という用語は、そのポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、このフレームは、通常は、ＡＴＧ開始コドン、またはＧＴＧおよびＴＴＧなどの代わりの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成または組換えポリヌクレオチドであり得る。
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要なすべての成分を意味する。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して在来もしくは外来のものであっても、または相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列は、プロモータ、ならびに転写および翻訳の終止シグナルを含む。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域と制御配列との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてもよい。
発現：「発現」という用語は、これらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含む、変異体の生成に関与するいずれかのステップを含む。
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、またその発現をもたらす追加のヌクレオチドに作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を含む。
高度の緊縮条件：「高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに５０％ホルムアミドにおける、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的には、６５℃で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、３回、それぞれ１５分間洗浄される。
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞タイプを意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。
向上した特性：「向上した特性」という用語は、親に比較して、または配列番号２のプロテアーゼに比較して、あるいは前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の１つまたは複数において改変を有しないプロテアーゼに比較して向上した変異体に関連する特徴を意味する。このような向上した特性としては、これらに限定されないが、洗浄性能、プロテアーゼ活性、熱活性プロファイル、耐熱性、ｐＨ活性プロファイル、ｐＨ安定性、基質／補助因子特異性、向上した表面特性、基質特異性、生成物特異性、増大した安定性、例えばキレーター安定性または前処理バイオマス存在下での溶解性、保管条件下での向上した安定性および化学安定性が挙げられる。
向上した化学安定性：「向上した化学安定性」という用語は、親酵素の酵素活性を低減する、天然または合成の１つまたは複数の化学物質の存在下で一定期間インキュベートした後に、酵素活性が維持されることを示す変異体酵素として本明細書において定義される。さらに、向上した化学安定性により、そのような化学物質の存在下で反応をより良好に触媒することができる変異体が得られる可能性がある。本発明の特定の態様において、向上した化学安定性とは、洗剤、特に液体洗剤において向上した安定性である。向上した洗剤安定性とは、特に、本発明のアルファアミラーゼ変異体を、キレート剤を含む液体洗剤配合物（液体にはゲルまたはペーストも含まれる）に混合した場合における、アルファアミラーゼ活性の向上した安定性である。液体洗剤配合物は、ランドリーもしくは自動皿洗浄プロセス中に添加される濃縮洗剤を指すことも、洗浄溶液、すなわち濃縮洗剤が添加されている水溶液などの希釈洗剤を指すこともある。
本発明において、液体洗剤は液体ランドリー洗剤として特に有用である。
安定性：「安定性」という用語は、保管安定性および使用中の、例えば洗浄プロセス中の安定性を含み、時間に応じたプロテアーゼの安定性、例えば、プロテアーゼを溶液、特に洗剤溶液に保存した場合に活性がどの程度保持されるかを反映する。安定性は、多くの因子、例えばｐＨ、温度、洗剤組成物、例えばビルダー、界面活性剤等の量により影響を受ける。
向上した洗浄性能：「向上した洗浄性能」という用語は、例えば汚れ除去の増大により、親サブチリシン変異体の洗浄性能に対して、または配列番号２のプロテアーゼに対して、あるいは前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の１つまたは複数において改変を有しないプロテアーゼに対して、プロテアーゼ変異体の洗浄性能の改変を示すプロテアーゼ変異体として本明細書において定義される。「洗浄性能」という用語は、ランドリーにおける洗浄性能を含むが、例えば皿洗浄における洗浄性能も含む。洗浄性能は、「材料および方法」のセクションにある自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）の説明で定義されるいわゆる強度値（Ｉｎｔ）を算出することにより定量化することができる。
向上したプロテアーゼ活性：「向上したプロテアーゼ活性」という用語は、タンパク質変換の増加により、親プロテアーゼの活性に対して（または比較して）、または配列番号２のプロテアーゼに対して、あるいは前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の１つまたは複数において改変を有しないプロテアーゼに対して、活性の改変を示すプロテアーゼ変異体の改変されたプロテアーゼ活性（上記に定義される）として本明細書において定義される。
単離された変異体：「単離された変異体」という用語は、人工的に修飾された変異体を意味する。一態様において、この変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度および少なくとも９０％の純度といった、少なくとも１％の純度である。
単離されたポリヌクレオチド：「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、人工的に修飾されたポリヌクレオチドを意味する。一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動による測定で、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度および少なくとも９５％の純度である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来、または、これらのいずれかの組み合わせであり得る。
低度の緊縮条件：「低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに２５％ホルムアミドにおける、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的には、５０℃で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、３回、それぞれ１５分間洗浄される。
成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾に続くその最終形態にあるポリペプチドを意味する。一態様において、成熟型ポリペプチドは配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対応する。
成熟型ポリペプチドコード配列：「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、プロテアーゼ活性を有する成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一態様において、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜９１がシグナルペプチドをコードすると予測するＳｉｇｎａｌＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６）に基づく配列番号１のヌクレオチド３２２〜１１４６である。
一態様において、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号３のヌクレオチド１〜８１がシグナルペプチドをコードすると予測するＳｉｇｎａｌＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６）に基づくと配列番号３のヌクレオチド５７７〜１１４０である。
「中度の緊縮条件」：「中度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに３５％ホルムアミドにおける、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的には、５５℃で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、３回、それぞれ１５分間洗浄される。
中度−高度の緊縮条件：「中度−高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに３５％ホルムアミドにおける、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的には、６０℃で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、３回、それぞれ１５分間洗浄される。
ミュータント：「ミュータント」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するように修飾されるか、あるいは合成される。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に要求される制御配列を含有する場合、用語「発現カセット」と同義である。
作動可能にリンク：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列の発現を導くように、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列が位置する構造を意味する。
親：「親」という用語は、本発明の酵素変異体を生成するために改変が行われたプロテアーゼを意味する。それ故、親は、前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の１つまたは複数例えば２つ以上に改変を有しないプロテアーゼである。本文脈においては、「同等のアミノ酸配列を有する」という表現は、１００％配列同一性に関連することを理解されよう。親は、天然（野生型）ポリペプチドまたはその変異体であり得る。特定の実施形態において、親は、配列番号２または４のポリペプチドに対して、少なくとも６０％の同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するプロテアーゼである。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
アライメントの長さは、好ましくは、少なくとも１５０個のアミノ酸残基、少なくとも１７５個のアミノ酸残基、少なくとも２００個のアミノ酸残基、少なくとも２２０個のアミノ酸残基、少なくとも２４０個のアミノ酸残基または少なくとも２６０個のアミノ酸残基である。
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおりに算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
アライメントの長さは、好ましくは、少なくとも４５０個のヌクレオチド、少なくとも５２５個のヌクレオチド、少なくとも６００個のヌクレオチド、少なくとも６６０個のヌクレオチド、少なくとも７２０個のヌクレオチドまたは少なくとも８４０個のヌクレオチドである。
実質的に純粋な変異体：「実質的に純粋な変異体」という用語は、最大で１０重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で０．５重量％の元々関連しているかまたは組換えにより関連している他のポリペプチド材料を含有する調製物を意味する。好ましくは、この変異体は、調製物中に存在するポリペプチド材料の総重量を基準として、少なくとも９２％の純度、例えば、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の純度および１００％の純度である。本発明の変異体は、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは、例えば、周知の組換え方法によって、または古典的な精製方法によって変異体を調製することにより達成することが可能である。
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、他の外来性または不要なヌクレオチドを含まず、また遺伝的に操作されたポリペプチド産生系内で使用するのに適した形態のポリヌクレオチド調製物を意味する。それ故、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、最大で１０重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で０．５重量％の元々関連しているかまたは組換えにより関連している他のポリヌクレオチド材料を含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモータおよびターミネータなどの天然の５’−および３’−非翻訳領域を含むことができる。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量基準で、少なくとも９０％の純度、例えば、少なくとも９２％の純度、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度および少なくとも９９．５％の純度であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。
変異体：「変異体」という用語は、前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の１つまたは複数において改変を有しないプロテアーゼである親に比較して、１つまたは複数（あるいは１つまたはいくつか）の位置に、改変、すなわち、置換、挿入および／または欠失を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；また挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して、アミノ酸、例えば、９個のアミノ酸、８個のアミノ酸、７個のアミノ酸、６個のアミノ酸、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸などの１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜３個のアミノ酸、より好ましくは１〜２個のアミノ酸、最も好ましくは２個のアミノ酸を付加することを意味する。
極めて高度の緊縮条件：「極めて高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに５０％ホルムアミドにおける、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的には、７０℃で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、３回、それぞれ１５分間洗浄される。
極めて低度の緊縮条件：「極めて低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに２５％ホルムアミドにおける、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的には、４５℃で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、３回、それぞれ１５分間洗浄される。
洗浄性能：「洗浄性能」という用語は、例えば、ランドリーまた硬質面クリーニングなどの洗浄の最中にクリーニングされるべき対象物に存在する汚れを除去する酵素の能力として用いられる。洗浄性能の向上は、本明細書の材料および方法において記載されるＡＭＳＡアッセイで定義されるいわゆる強度値（Ｉｎｔ）を算出することにより定量化することができる。本明細書の実施例２における洗浄性能テストも参照されたい。
野生型プロテアーゼ：「野生型プロテアーゼ」という用語は、天然に見出される細菌、古細菌、酵母、菌類、植物または動物などの天然の生物によって発現されるプロテアーゼを意味する。野生型プロテアーゼの一例は、ＢＰＮ’（配列番号２）またはサビナーゼ（配列番号４）である。
転写プロモータ：「転写プロモータ」という用語は、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡ領域であるプロモータに対して使用される。転写プロモータは、典型的には、それらが調節する遺伝子の近傍にあり、同じ鎖上かつ上流（センス鎖の５’領域方向）に位置する。
転写ターミネータ：「転写ターミネータ」という用語は、転写のために、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子またはオペロンの終端を表す遺伝子配列部分に対して使用される。
変異体名称の規約
本発明の目的のために、配列番号２で開示される成熟型ポリペプチドを、他のサブチリシンの対応するアミノ酸残基を確定するために用いる。他のサブチリシンのアミノ酸配列を配列番号２で開示される成熟型ポリペプチドとアラインメントし、このアラインメントに基づいて、配列番号２で開示される成熟型ポリペプチドの任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）に実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて確定する。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
他のサブチリシンにおける対応するアミノ酸残基の特定は、これらに限定されないが、ＭＵＳＣＬＥ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｙ ｌｏｇ‐ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ；３．５バージョン以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７９２−１７９７），ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：５１１−５１８；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３７：３９−６４；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：１８９９−１９００）、およびＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０）を使用するＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡを含むいくつかのコンピュータプログラムを用い、それらそれぞれのデフォルトパラメータを使用して多重ポリペプチド配列アライメントにより決定することができる。
配列番号２の成熟型ポリペプチドから他の酵素が分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを用いることが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つまたは複数の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９による方法が、未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８−９６）または組み合わせ拡張法（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６−５６７）。
本発明の変異体の記載において、以下の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているＩＵＰＡＣの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
置換 アミノ酸置換に関しては、以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置２２６でのスレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」として示される。複数の突然変異は、加算記号（「＋」）によって分けられ、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」とされ、これは、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による、またセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による、それぞれ位置２０５および４１１での置換を表わす。
欠失 アミノ酸欠失に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、*。従って、位置１９５でのグリシンの欠失は「Ｇｌｙ１９５*」または「Ｇ１９５*」として示される。複数の欠失は加算記号（「＋」）によって分けられ、例えば、「Ｇｌｙ１９５*＋Ｓｅｒ４１１*」または「Ｇ１９５*＋Ｓ４１１*」とされる。
挿入 アミノ酸挿入に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置１９５でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸１番、挿入されたアミノ酸２番；等］と示される。例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」として示される。
このような場合には、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加して、挿入されたアミノ酸残基を番号付ける。それ故、上記の例において配列は以下のとおりとなる。
Figure 2015509364
複数の改変 複数の改変を含む変異体は加算記号（「＋」）によって分けられ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、位置１７０および１９５でのアルギニンおよびグリシンのそれぞれチロシンおよびグルタミン酸による置換を表す。
種々の改変 種々の改変がある位置に導入され得る場合、種々の改変は、コンマにより区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、位置１７０のアルギニンのチロシンまたはグルタミン酸による置換を表す。それ故、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を示す。「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
アミノ酸の位置／残基の番号付け
他に記載がない限り、本明細書で用いられるアミノ酸の番号付けは、サブチラーゼＢＰＮ’（ＢＡＳＢＰＮ）配列の番号付けに対応する。ＢＰＮ’配列のさらなる説明については、配列番号２またはＳｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９−７３７を参照されたい。
以下では、「に対応する」という用語は、配列番号２の位置に対応するものとして理解されたい。すなわち、本文書の全体を通して、番号付けはＢＰＮ’によるものである。
発明の詳細な説明
本発明者ら、配列番号２の位置２１７または２１８に対応する位置の全体電荷を変化させると、特に卵の汚れに関して洗浄性能が増大した変異体が得られることを見出した。配列番号２の位置２１７および２１８に対応する位置の両方において、正または負のいずれかの電荷を増大させると、すなわち、位置２１７を占めるアミノ酸および位置２１８を占めるアミノ酸を、より負に荷電した、またはより正に荷電したアミノ酸によって置換することにより、親に比較して、例えば配列番号２に比較して向上した特性を有するプロテアーゼ変異体が得られる。特に、本発明による変異体は、配列番号２、Ｙ２１７Ｌ突然変異を有する配列番号２に比較して、または位置２１７もしくは２１８のいずれかにおける単一電荷変化に比較して、洗浄性能が増大している。位置２１７または２１８のいずれかにおいて、置換されたアミノ酸よりも電荷が多いアミノ酸で置換すると、洗浄性能に対する有益な効果を得ることができるが、この効果は、位置２１７および２１８の両方を、配列番号２に比較して、より正に荷電するように、またはより負に荷電するようにした場合に、すなわち、親プロテアーゼにおいて、配列番号２の２１７および２１８に対応するアミノ酸を、負に荷電したアミノ酸アミノ酸Ｄ，Ｅ、または正に荷電したアミノ酸Ｒ、ＫおよびＨのいずれかで置換することによって、より顕著となった。性能の増大はまた、配列番号２の位置２１７および２１８に対応する位置において、極性アミノ酸ＳおよびＴで置換する場合に認められる。本発明者らは、配列番号２の位置２１７および２１８に対応する２つの位置で全体的な電荷変化がもたらされる場合に、洗浄性能の増大が得られることを見出した。それ故、位置２１７および２１８に同じ電荷、例えば、Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｄなど、両方の位置に負の電荷を有する変異体は、親に比較して、配列番号２のプロテアーゼに対して、または前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の１つまたは複数において改変を有しないプロテアーゼに対して、性能の増大を示した。配列番号２の位置２１７または２１８に対応する位置において、より正またはより負にプロテアーゼを荷電させると、より親水性のプロテアーゼ変異体が得られる。それ故、一実施形態によると、プロテアーゼ変異体は、配列番号２の位置２１７および２１８に対応する位置で、親に比較して、配列番号２のプロテアーゼに対して、または前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の１つまたは複数において改変を有しないプロテアーゼに対して、より親水性である。
それ故、本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７Ｄ、Ｙ２１７Ｅ、Ｙ２１７Ｒ、Ｙ２１７Ｋ、Ｙ２１７Ｈ、Ｙ２１７Ｓ、Ｙ２１７Ｔ、Ｙ２１８Ｄ、Ｙ２１８Ｅ、Ｙ２１８Ｒ、Ｙ２１８Ｋ、Ｙ２１８Ｈ、Ｙ２１８ＳまたはＹ２１８Ｔに対応する置換のいずれかを含むサブチリシン変異体に関する。特定の態様において、変異体は、配列番号２のＹ２１７Ｄ、Ｙ２１７Ｅ、Ｙ２１７Ｒ、Ｙ２１７Ｋ、Ｙ２１７Ｈ、Ｙ２１７Ｓ、Ｙ２１７Ｔ、Ｙ２１８Ｄ、Ｙ２１８Ｅ、Ｙ２１８Ｒ、Ｙ２１８Ｋ、Ｙ２１８Ｈ、Ｙ２１８ＳまたはＹ２１８Ｔに対応する置換のいずれかを含み、配列番号２および／または４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも７０％などの少なくとも６５％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
本発明の他の態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択されるサブチリシン変異体に関する。特定の態様においては、ＸおよびＺは同じアミノ酸であり、一態様においては、ＸおよびＺは同じで、かつＤ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択される。さらなる態様においては、ＸおよびＺはＤ、Ｅ、ＳまたはＴであり、さらに一態様においては、ＸおよびＺはＫ、ＨまたはＲである。好ましい態様において、本発明は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択され、かつ配列番号２および／または４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも７０％などの少なくとも６５％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するサブチリシン変異体に関する。一実施形態において、本発明による変異体は、配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列または配列番号２もしくは４の成熟型ポリペプチドをコードする配列に対して、少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。一実施形態において、本発明による変異体は、配列番号１または３の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６５％の同一性、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドである。
他の実施形態は、サブチリシン親プロテアーゼの変異体を得るための方法であって、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を親サブチリシンに導入するステップであって、ＸおよびＺが、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択されるステップと、この変異体を回収するステップと、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するか否かをテストするステップとを含む方法に関する。特定の態様は、サブチリシン親プロテアーゼの変異体を得るための方法であって、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を親サブチリシンに導入するステップであって、ＸおよびＺが、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択されるステップと、この変異体を回収するステップと、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するか否かをテストするステップとを含み、この変異体が、
ａ．配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ．（ｉ）配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）そのｃＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補鎖と、低度緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
ｃ．配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列またはそのｃＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；および
ｄ．プロテアーゼ活性を有する、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドの断片
からなる群から選択されるサブチリシン親プロテアーゼの変異体である方法に関する。
特定の実施形態は、サブチリシン親プロテアーゼの変異体を得るための方法であって、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を親サブチリシンに導入するステップであって、ＸおよびＺが、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択されるステップを含み、この変異体が、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６５％などの少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する親サブチリシンの変異体である方法に関する。一実施形態において、プロテアーゼ変異体は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むＢＰＮ’（配列番号２）変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択されるＢＰＮ’変異体である。他の実施形態において、本発明は、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｄ］ ［Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｋ］からなる群から選択される置換のいずれかを含むＢＰＮ’変異体に関する。さらに他の実施形態において、本発明は、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｄ］ ［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｄ］ ［Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｋ］からなる群から選択される置換のいずれかを含むＢＰＮ’変異体であって、配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも７０％などの少なくとも６５％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するＢＰＮ’変異体に関する。
他の特定の実施形態において、プロテアーゼ変異体は、配列番号２のＬ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサビナーゼ（配列番号４）変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択されるサビナーゼ変異体である。他の実施形態において、本発明は、［Ｌ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｌ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｌ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｌ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｌ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｌ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｌ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｌ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｌ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｌ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｌ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｌ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｌ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｌ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｄ］ ［Ｌ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｌ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｌ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｌ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｌ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｌ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｌ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｌ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｌ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｋ］からなる群から選択される置換のいずれかを含むサビナーゼ変異体に関する。さらに他の実施形態において、本発明は、［Ｌ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｌ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｌ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｌ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｌ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｌ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｌ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｌ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｌ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｌ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｌ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｌ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｌ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｌ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｄ］ ［Ｌ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｌ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｌ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｌ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｌ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｌ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｌ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｌ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｌ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｋ］からなる群から選択される置換のいずれかを含むサビナーゼ変異体であって、配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも７０％などの少なくとも６５％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するサビナーゼ変異体に関する。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＫによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＫによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＫによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＲによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＲによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＫによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＲによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＲによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＨによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＲによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＲによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＨによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＨによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＫによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＫによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＨによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＨによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＨによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＤによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＤによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＥによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＤによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＤによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＥによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＥによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＥによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＥによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＳによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＳによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＥによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＤによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＳによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＳによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＤによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＳによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＳによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＥによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＴによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＴによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＥによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＤによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＴによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＴによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＤによる置換を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号２の位置２１７に対応する位置でＴによる置換を含み、さらに配列番号２の位置２１８に対応する位置でＴによる置換を含む。
一態様において、本発明の変異体における改変の総数は、１〜２０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の改変など、１〜１０個および１〜５個である。
一態様において、変異体は、位置２１７に対応する位置で改変を含むかまたはその改変からなる。他の態様において、位置２１７に対応する位置にあるアミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓで、好ましくはＡｓｐで置換されている。他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟型ポリペプチドの置換Ｙ２１７Ｄを含むかまたはその置換からなる。
一態様において、変異体は、位置２１８に対応する位置で改変を含むかまたはその改変からなる。他の態様において、位置２１８に対応する位置にあるアミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓで、好ましくはＬｙｓで置換されている。他の態様において、変異体は、配列番号２の成熟型ポリペプチドの置換Ｎ２１８Ｋを含むかまたはその置換からなる。
一態様において、変異体は、位置２１７に対応する位置での改変および位置２１８に対応する位置での改変であって、前記位置２１７および２１８がＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓで置換されている改変を含むかまたはその改変からなる。他の態様において、変異体は、位置２１７に対応する位置での改変および位置２１８に対応する位置での改変であって、前記位置２１７および２１８が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓで置換されており、かつ位置２１７および２１８での置換が同じアミノ酸によるものである改変を含むかまたはその改変からなる。それ故、一態様において、変異体は、置換Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｄ、Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｅ、Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ、Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｔ、Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｒ、Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８ＨもしくはＹ２１７Ｋ＋Ｒ２１７Ｋを含むかまたはその置換からなる。他の態様において、変異体は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓによる、配列番号２の位置２１７に対応する位置での改変および位置２１８に対応する位置での改変であって、位置２１７および２１８での置換が同じアミノ酸ではなく、かつ位置２１７および２１８での置換が、これらの２つの位置での全体的な電荷変化をもたらす改変を含むかまたはその改変からなる。それ故、一態様において、変異体は、置換Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｅ、Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｄ、Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｓ、Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｄ、Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｓ、Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｅ、Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｔ、Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｄ、Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｔ、Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｅ、Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｋ、Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｒ、Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｈ、Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｒ、Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８ＫもしくはＹ２１７Ｋ＋Ｒ２１７Ｈを含むかまたはその置換からなる。
それ故、本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、かつＸおよびＺが同じアミノ酸であるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸であり、かつＸおよびＺがＤであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸であり、かつＸおよびＺがＥであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸であり、かつＸおよびＺがＳであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸であり、かつＸおよびＺがＴであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸であり、かつＸおよびＺがＲであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸であり、かつＸおよびＺがＫであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸であり、かつＸおよびＺがＨであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＤであり、ＺがＥであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＤであり、ＺがＳであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＤであり、ＺがＴであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＥであり、ＺがＤであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＥであり、ＺがＳであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＥであり、ＺがＴであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＴであり、ＺがＤであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＴであり、ＺがＥであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＴであり、ＺがＳであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＳであり、ＺがＤであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＳであり、ＺがＥであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＳであり、ＺがＴであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＫであり、ＺがＲであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＫであり、ＺがＨであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＲであり、ＺがＫであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＲであり、ＺがＨであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＨであり、ＺがＫであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸおよびＺが同じアミノ酸ではなく、かつＸがＨであり、ＺがＲであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、かつＸおよびＺがＤ、Ｅ、ＳまたはＴであるサブチリシン変異体に関する。
本発明の一態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、かつＸおよびＺがＲ、ＫまたはＨであるサブチリシン変異体に関する。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＤおよびＮ２１８Ｄを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＥおよびＮ２１８Ｅを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＳおよびＮ２１８Ｓを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＴおよびＮ２１８Ｔを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＤおよびＮ２１８Ｅを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＥおよびＮ２１８Ｄを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＤおよびＮ２１８Ｓを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＳおよびＮ２１８Ｄを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＳおよびＮ２１８Ｅを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＥおよびＮ２１８Ｓを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＤおよびＮ２１８Ｔを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＴおよびＮ２１８Ｄを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＥおよびＮ２１８Ｔを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＴおよびＮ２１８Ｅを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＫおよびＮ２１８Ｋを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＲおよびＮ２１８Ｒを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＨおよびＮ２１８Ｈを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＫおよびＮ２１８Ｒを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＫおよびＮ２１８Ｈを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＲおよびＮ２１８Ｋを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＲおよびＮ２１８Ｈを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＨおよびＮ２１８Ｒを含むかまたはそれらの置換からなる。
他の態様において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの置換Ｌ２１７ＨおよびＮ２１８Ｋを含むかまたはそれらの置換からなる。
変異体は、１つまたは複数（例えば、いくつか）の他の位置で、１つまたは複数の追加の改変をさらに含んでもよい。
アミノ酸の変化は、軽微なものであってもよい。すなわち、タンパク質のフォールディングおよび／または活性に顕著な影響を及ぼさない、保存的なアミノ酸の置換または挿入；典型的には１〜３０個のアミノ酸の小規模な欠失；アミノ末端メチオニン残基などアミノ末端またはカルボキシル末端の小規模な伸長；最大２０〜２５個の残基の小規模なリンカーペプチド；またはポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープまたは結合ドメインなど、正味の電荷または他の機能を変化させることにより精製を容易にする小規模な伸長である。
保存的置換の例としては、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、ならびに小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群内での置換がある。比活性を一般に変化させないアミノ酸置換は当技術分野で公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｇｌｕ／Ｇｌｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
あるいは、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的性質を改変するような性質のものである。例えば、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの熱安定性の向上、基質特異性の変更、至適ｐＨの変化等をもたらすことがある。
例えば、変異体は、位置２１７および２１８に対応する位置で改変を含み、さらに、他の位置での改変が変異体の性能に影響を及ぼさない限り、他の位置での改変を含むことができる。ポリペプチド中の必須なアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）など、当技術分野で公知の手順により同定することができる。後者の手法では、単一アラニン突然変異を分子中のすべての残基に導入し、得られる突然変異分子についてプロテアーゼ活性をテストして、分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照されたい。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせて、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって決定されるような、構造の物理的分析によっても決定することができる。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照されたい。必須アミノ酸の同定は、関連するポリペプチドとのアライメントから推定することができる。ＢＰＮ’（配列番号２）の場合、アミノ酸Ｓ２２１、Ｈ６４およびＤ３２を含む触媒三残基が、酵素のプロテアーゼ活性にとって必須である。
変異体は、２００〜９００個のアミノ酸、例えば、２１０〜８００、２２０〜７００、２３０〜６００、２４０〜５００、２５０〜４００、２５５〜３００、２６０〜２９０、２６５〜２８５、２７０〜２８０、または２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９もしくは２８０個のアミノ酸からなり得る。
一実施形態では、変異体は、親酵素に比較して、向上した触媒活性を有する。
一実施形態において、変異体は、親酵素に比較して、または前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の１つまたは複数で改変を有しないプロテアーゼに比較して、または配列番号２のプロテアーゼに比較して、向上した洗浄性能を有する。洗浄性能は、本明細書中の「材料および方法」の実施例２に記載されるように測定される。
親プロテアーゼ
タンパク質基質中のアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼ、または（互換的に）ペプチダーゼとして分類される（Ｗａｌｓｈ，１９７９，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３を参照のこと）。
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、かつ活性部位に必須のセリン残基がある酵素である（Ｗｈｉｔｅ，Ｈａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９７３“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，ｐｐ．２７１−２７２）。
細菌セリンプロテアーゼの分子量は、２０，０００〜４５，０００ダルトンの範囲にある。それらは、ジイソプロピルフルオロリン酸により阻害される。それらは、単純な末端エステルを加水分解し、同様にセリンプロテアーゼである、真核生物のキモトリプシンに活性が類似している。サブグループを包含する、より狭義の用語であるアルカリ性プロテアーゼは、セリンプロテアーゼの一部にある、ｐＨ９．０〜１１．０の高い至適ｐＨを反映したものである（総説については、Ｐｒｉｅｓｔ（１９７７）Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．４１ ７１１−７５３を参照のこと）。
サブチラーゼ
サブチラーゼと仮に呼ばれるセリンプロテアーゼのサブグループが、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９−７３７およびＳｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６（１９９７）５０１−５２３により提唱されている。それらは、サブチリシン様プロテアーゼと以前呼ばれたセリンプロテアーゼの１７０個を超えるアミノ酸配列の相同性分析により定義される。サブチリシンは、以前は、グラム陽性細菌または真菌類により産生されるセリンプロテアーゼとして定義されることが多かったが、現在は、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．によれば、サブチラーゼのサブグループである。多種多様のサブチラーゼが同定されており、いくつかのサブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。そのようなサブチラーゼおよびそれらのアミノ酸配列のさらに詳細な説明については、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）に言及されている。
サブチラーゼの一サブグループであるＩ−Ｓ１または「真の」サブチリシンは、サブチリシン１６８（ＢＳＳ１６８）、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ Ａ／Ｓ）、およびサブチリシンＤＹ（ＢＳＳＤＹ）などの「古典的な」サブチリシンを含む。
サブチラーゼのさらなる亜群であるＩ−Ｓ２または高アルカリ性サブチリシンは、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．（上記）により認められている。亜群Ｉ−Ｓ２プロテアーゼは、高度アルカリ性サブチリシンとして記載されており、サブチリシンＰＢ９２（ＢＡＡＬＫＰ）（ＭＡＸＡＣＡＬ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、サブチリシン３０９（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ Ａ／Ｓ）、サブチリシン１４７（ＢＬＳ１４７）（ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ Ａ／Ｓ）およびアルカリ性エラスターゼＹａＢ（ＢＳＥＹＡＢ）などの酵素を含む。ＢＰＮ’は、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサブチリシンＢＰＮ’である。ＢＰＮ’は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
サブチリシン
サブチリシンは、ＭＥＲＯＰＳデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｆａｍｓｕｍ？ｆａｍｉｌｙ＝Ｓ８）により定義される、ファミリーＳ８、特にサブファミリーＳ８Ａに由来するセリンプロテアーゼである。ＢＰＮ’およびサビナーゼは、それぞれＭＥＲＯＰＳ番号Ｓ０８．０３４およびＳ０８．００３を有する。
親サブチリシン
「親サブチリシン」という用語は、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１年および１９９７年）により定義されたサブチラーゼを述べている。さらなる詳細については、上記の「サブチラーゼ」の説明を参照されたい。親サブチリシンは、サブチラーゼの特徴を保持しながら、その後に修飾がなされている、天然供給源から単離されたサブチラーゼであってもよい。さらに、親サブチリシンは、Ｊ．Ｅ．Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，８９３−８９６（１９９９）により記載されるものなど、ＤＮＡシャフリング手法により調製されたサブチラーゼであってもよい。
あるいは、「親サブチリシン」という用語は、「野生型サブチラーゼ」と称することもできる。
参考のために、本明細書に記載する種々のサブチラーゼの頭字語の表を提供するが、さらなる頭字語については、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９−７３７およびＳｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６（１９９７）５０１−５２３を参照されたい。
Figure 2015509364
サブチラーゼの修飾
本明細書で使用する「修飾」という用語は、サブチラーゼの化学修飾、ならびにサブチラーゼをコードするＤＮＡの遺伝子操作を含むように定義される。修飾は、アミノ酸側鎖の交換、目的のアミノ酸の中またはそこでの置換、欠失および／または挿入であり得る。
サブチリシン変異体
「変異体」という用語および「サブチリシン変異体」という用語は、上記に定義されるものである。
相同サブチラーゼ配列
２つのアミノ酸配列間の相同性は、本文脈においては、本発明の目的のために「同一性」というパラメータにより記載され、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、上記に記載のようにＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて決定される。ルーチンからの出力は、アミノ酸アライメントに加えて、２つの配列間の「同一性割合」の算出である。
この説明に基づくと、当業者が、本発明に従って修飾され得る好適な相同サブチラーゼを同定することはルーチン作業となる。
実質的に相同な親サブチリシン変異体は、１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を有し得るものであり、本文脈においては、「１つまたは複数の」という用語は、「いくつかの」という用語と互換的に使用される。これらの変化は、軽微なものであることが好ましく、すなわち、タンパク質またはポリペプチドの三次元フォールディングまたは活性に顕著な影響を及ぼさない、上記に記載の保存的なアミノ酸置換および他の置換；典型的には１〜約３０個のアミノ酸の小規模な欠失；アミノ末端メチオニン残基などアミノ末端またはカルボキシル末端の小規模な伸長、最大約２０〜２５個の残基の小規模なリンカーペプチド、あるいはポリヒスチジントラクトまたはプロテインＡなど、精製を容易にする小規模な伸長である（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ．４：１０７５；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３）。また、一般的には、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７を参照されたい。
好ましくは上記に記載する変化は軽微なものであるが、このような変化はまた、アミノ末端またはカルボキシル末端の伸長のような、最大３００個以上のアミノ酸の大規模なポリペプチドの融合など、実質的なものであることもある。
親サブチリシンは、配列番号２もしくはその対立遺伝子変異体のアミノ酸配列；またはプロテアーゼ活性を有するその断片を含むこともまたはそれからなることもある。一態様において、親サブチリシンは、配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
親サブチリシンは、（ａ）配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号２もしくは４の成熟型ポリペプチドをコードする配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補鎖と、中度または高度緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；あるいは（ｃ）配列番号１または３の成熟型ポリペプチドコード配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであってもよい。
一態様において、親は、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも７０％などの少なくとも６５％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸が異なっている。好ましい一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸が異なり、変異体は向上した特性を保持している。
他の態様において、親は、配列番号２または４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。他の態様において、親は、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドを含むかまたはそれからなる。他の態様において、親は、配列番号２のアミノ酸１〜２７５を含むかまたはそれからなる。さらに他の態様において、親は、配列番号４のアミノ酸１〜２６９を含むかまたはそれからなる。
他の態様において、親は、（ｉ）配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号２もしくは４の成熟型ポリペプチドをコードする配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補鎖と、極めて低度の緊縮条件、低度の緊縮条件、中度の緊縮条件、または高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
配列番号１もしくは３のポリヌクレオチドまたはそのサブ配列、ならびに配列番号２もしくは４のポリペプチドまたはその断片を用いて、当技術分野で周知の方法により、異なる属または種の系統に由来する親をコードするＤＮＡを同定およびクローニングするための核酸プローブを設計することができる。特に、このようなプローブは、標準的なサザンブロッティング法の後に、目的の細胞の中の対応する遺伝子を同定および単離するために、その細胞のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに使用することができる。このようなプローブは、配列全体よりもかなり短くすることができるが、その長さは少なくとも１５、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５または少なくとも７０ヌクレオチドにするべきである。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチドまたは少なくとも９００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの両方を用いることができる。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチンまたはアビジンにより）。このようなプローブは本発明によって包含される。
このような他の系統から調製したゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリについて、上記に記載するプローブとハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡをスクリーニングすることができる。このような他の系統に由来するゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドのゲル電気泳動、または他の分離技術によって分離することができる。これらのライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡは、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移し固定化することができる。配列番号１もしくは３またはそのサブ配列とハイブリダイズするクローンまたはＤＮＡを同定するために、このキャリア材料をサザンブロットに用いる。
本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションとは、極めて低度から極めて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは３；（ｉｉ）配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列；（ｉｉｉ）配列番号２もしくは４の成熟型ポリペプチドをコードする配列；（ｉｖ）その完全長の相補鎖；または（ｖ）そのサブ配列、に対応する標識化核酸プローブにポリペプチドがハイブリダイズすることを示す。核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムまたは当技術分野で公知の他のいずれかの検出手段を用いて検出することができる。
一態様において、核酸プローブは、配列番号１または３の成熟型ポリペプチドコード配列である。他の態様において、核酸プローブは、配列番号１または３の８０〜１１４０ヌクレオチド長の断片、例えば、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００または１１００ヌクレオチド長である。他の態様において、核酸プローブは、配列番号２もしくは４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；その成熟型ポリペプチド；またはその断片である。他の態様において、核酸プローブは、配列番号１もしくは３、またはそれぞれ配列番号２もしくは４の成熟型ポリペプチドをコードする配列である。
他の実施形態において、親は、配列１または３の成熟型ポリヌクレオチドコード配列に対して、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
ポリペプチドは、一方のポリペプチドの領域が他方のポリペプチドの領域のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであってもよい。
親は、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成するための手法は、当技術分野で公知であり、インフレームにあり、融合ポリペプチドの発現が同じプロモータおよびターミネータの制御下にあるように、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合ポリペプチドはまた、融合ポリペプチドが翻訳後に形成されるインテインテクノロジーを用いて構築することもできる（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）。
融合ポリペプチドは、さらに２つのポリペプチド間に切断部位を含むことができる。融合タンパク質が分泌されると、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離する。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８−５０３；およびＣｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０−２４８；およびＳｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
親は、いずれかの属の生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされた親がソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された株によって生成されることを意味することとする。一態様において、親は、細胞外に分泌される。
親は細菌性プロテアーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロテアーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）またはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）プロテアーゼなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
一態様において、親は、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）α−アミラーゼである。
一態様において、親は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）プロテアーゼ、例えば、配列番号２のプロテアーゼまたはその成熟型ポリペプチドである。
他の態様において、親は、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）プロテアーゼ、例えば、配列番号４のプロテアーゼまたはその成熟型ポリペプチドである。
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
親は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物、または、天然材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接的に得られたＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることによりもたらされ得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化され得る。
変異体の調製
本発明はまた、親プロテアーゼの変異体を得るための方法であって、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を親プロテアーゼに導入するステップであって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択されるステップと、この変異体を回収するステップと、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するか否かをテストするステップとを含む方法に関する。本発明はさらに、親プロテアーゼの変異体を得るための方法であって、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を親プロテアーゼに導入するステップであって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、かつＸがＤ、Ｅ、Ｓ、Ｔから選択される場合、ＺもまたＤ、Ｅ、Ｓ、Ｔから選択され、ＸがＲ、Ｋ、Ｈから選択される場合、ＺもまたＲ、Ｋ、Ｈから選択されるステップと、この変異体を回収するステップと、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するか否かをテストするステップとを含む方法に関する。それ故、好ましい態様において、本発明は、親プロテアーゼの変異体を得るための方法であって、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を親プロテアーゼに導入するステップであって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｓ、ＴまたはＲ、Ｋ、Ｈからなる群から選択されるステップと、この変異体を回収するステップと、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するか否かをテストするステップとを含む方法に関する。本発明はさらに、サブチリシン親プロテアーゼの変異体を得るための方法であって、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を親サブチリシンに導入するステップであって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択されるステップと、この変異体を回収するステップと、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するか否かをテストするステップとを含み、親サブチリシンプロテアーゼが、
ａ．配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ．（ｉ）配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）そのｃＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の完全長相補鎖と、低度緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
ｃ．配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列またはそのｃＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；および
ｄ．プロテアーゼ活性を有する、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドの断片
からなる群から選択される方法に関する。
変異体は、例えば部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、無作為突然変異誘発、シャフリング等の当技術分野で公知のいずれかの突然変異誘発手順を用いて調製することができる。
部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の規定の部位で１つまたは複数（例えば、いくつか）の突然変異を導入する技術である。
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーが使用されるＰＣＲによってインビトロで達成されることが可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドにおける部位が制限酵素により切断され、および、その後、ポリヌクレオチドに突然変異を含有するオリゴヌクレオチドが連結されるカセット式突然変異誘発によってインビトロで行われることが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と挿入断片とを互いに連結させる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９−４９５５；および、Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発はまた、技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；および、Ｃａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。
いずれかの部位特異的突然変異誘発法が本発明において用いられることが可能である。変異体の調製に用いられることが可能である多くの市販のキットが入手可能である。
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０−１０５４）により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されて変異体の発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるプロモータ、ポリヌクレオチドであり得る。プロモータ配列は、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ ａｎｄ Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、ならびにｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、”Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”，ｉｎ Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４−９４；および上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。タンデムプロモータの例は国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに開示されている。
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータ配列であり得る。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
細菌宿主細胞の好ましいターミネータは、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ａｍｙＬ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）に対する遺伝子から得られる。
制御配列はまた、プロモータの下流および遺伝子のコード配列の上流にある、遺伝子の発現を増大させるｍＲＮＡスタビライザー領域であってもよい。
好適なｍＲＮＡスタビライザー領域の例は、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：３４６５−３４７１）から得られる。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列がもちいられてもよい。
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７に記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は変異体のＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド領域のＮ−末端に隣接して位置されている。
宿主細胞の増殖に対した変異体の発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
細菌性選択マーカーの例は、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｄａｌ遺伝子であるか、またはアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシンまたはテトラサイクリンの耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体の生成をもたらす１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明の変異体をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、変異体の組換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）により行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法により（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔法（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入により（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、電気穿孔法（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）により行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、天然コンピテンス（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９−２０７を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）、または、接合（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）により行われ得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知である方法のいずれかを用いることが可能である。
生成方法
本発明はまた：（ａ）本発明の宿主細胞を変異体の発現に好適な条件下で培養するステップ；および、（ｂ）変異体を回収するステップを含む変異体を生成する方法に関する。
宿主細胞は、技術分野において公知である方法を用いて変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびに変異体の発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、または、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
変異体は、プロテアーゼ活性を有する変異体に特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産生物の形成、または、酵素基質の消失を含むが、これらに限定されない。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を判定してもよい。
変異体は技術分野において公知である方法をもちいて回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。
変異体は、実質的に純粋な変異体を得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
代替的な態様においては、変異体は回収されず、変異体を発現する本発明の宿主細胞が変異体のソースとして用いられ得る。
組成物
特定の一態様において、本発明による変異体は、親酵素に比較して、または前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記特定の位置の１つまたは複数で改変を有しないプロテアーゼに比較して、または配列番号２のプロテアーゼに比較して、向上した洗浄性能を有し、ここで、洗浄性能は、本明細書中の「材料および方法」に記載されるＡＭＳＡでの測定である。
それ故、好ましい実施形態において、組成物は洗剤組成物であり、本発明の一態様は、ランドリーまたは硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける、本発明による変異体を含む洗剤組成物の使用に関する。
追加の成分の選択は、当業者の範囲内であり、以下に示す例示的な非限定成分を含む、従来の成分が含まれる。成分の選択には、布地のケアのために、クリーニングされる布地のタイプ、汚染のタイプおよび／または程度、クリーニングが行われる温度、ならびに洗剤製品の配合の検討が含まれ得る。下記の成分は特定の機能に従って一般的な見出しにより分類されるが、当業者により認識されるように、これは、成分が追加の機能を含み得るので、限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明の酵素
本発明の一実施形態において、本発明の変異体は、洗浄液１リットル当たり０．００１〜１００ｍｇのタンパク質、例えば、０．０１〜１００ｍｇのタンパク質、好ましくは０．００５〜５０ｍｇのタンパク質、より好ましくは０．０１〜２５ｍｇのタンパク質、さらにより好ましくは０．０５〜１０ｍｇのタンパク質、最も好ましくは０．０５〜５ｍｇのタンパク質、およびさらに最も好ましくは０．０１〜１ｍｇのタンパク質に相当する量で洗剤組成物に加えることができる。
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロールなどのポリオール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル、または４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体を用いて安定化することができ、また、この組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７０８号パンフレットに記載されるように配合することができ、あるいは、本発明による変異体は、国際公開第２００５／１０５８２６号パンフレットおよび国際公開第２００９／１１８３７５号パンフレットに記載されるものなど、ペプチドアルデヒドまたはケトンを用いて安定化することができる。
本発明の変異体はまた、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９７／０７２０２号パンフレットに開示される洗剤配合物に組み込むことができる。
界面活性剤
洗剤組成物は、１つまたは複数の界面活性剤を含むことができ、それは、アニオン性および／またはカチオン性および／または非イオン性および／または半極性および／または両性イオン性、あるいはそれらの混合物であってもよい。特定の実施形態において、洗剤組成物は、１つまたは複数の非イオン性界面活性剤および１つまたは複数のアニオン性界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤は、典型的には、約０．１重量％〜６０重量％、例えば、約１重量％〜約４０重量％または約３重量％〜約２０重量％または約３重量％〜約１０重量％のレベルで存在する。界面活性剤は、所望のクリーニング用途に基づいて選択され、当技術分野で公知の従来のいずれの界面活性剤も含む。洗剤で使用される、当技術分野で公知のいずれの界面活性剤も利用することができる。
中に含まれる場合、洗剤は、通常、アニオン性界面活性剤を約１重量％〜約４０重量％、例えば、約５重量％〜約１５重量％または約２０重量％〜約２５重量％を含む約５重量％〜約３０重量％含有することになる。アニオン性界面活性剤の非限定例としては、スルフェートおよびスルホネート、特に、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、ＬＡＳの異性体、分枝アルキルベンゼンスルホネート（ＢＡＢＳ）、フェニルアルカンスルホネート、アルファ−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン−２，３−ジイルビス（スルフェート）、ヒドロキシアルカンスルホネートおよびジスルホネート、アルキルスルフェート（ＡＳ）、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、脂肪アルコールスルフェート（ＦＡＳ）、第一級アルコールスルフェート（ＰＡＳ）、アルコールエーテルスルフェート（ＡＥＳまたはＡＥＯＳまたはＦＥＳ、アルコールエトキシスルフェートまたは脂肪アルコールエーテルスルフェートとしても知られる）、第二級アルカンスルホネート（ＳＡＳ）、パラフィンスルホネート（ＰＳ）、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート（ＭＥＳ）を含むアルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル（アルファ−ＳＦＭｅまたはＳＥＳ）、アルキルまたはアルケニルコハク酸、ドデセニル／テトラデセニルコハク酸（ＤＴＳＡ）、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホ−コハク酸のジエステルおよびモノエステル、または石鹸、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
中に含まれる場合、洗剤は、通常、カチオン性界面活性剤を約１重量％〜約４０重量％含有することになる。カチオン性界面活性剤の非限定例としては、アルキルジメチルエタノールアミンクオート（ａｌｋｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｅｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｑｕａｔ）（ＡＤＭＥＡＱ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド（ＤＳＤＭＡＣ）およびアルキルベンジルジメチルアンモニウム、ならびにそれらの組合せ、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルコキシル化第四級アンモニウム（ＡＱＡ）が挙げられる。
中に含まれる場合、洗剤は、通常、非イオン性界面活性剤を約０．２重量％〜約４０重量％、例えば、約０．５重量％〜約３０重量％、特に約１重量％〜約２０重量％、約３重量％〜約１０重量％、例えば約３重量％〜約５重量％、または約８重量％〜約１２重量％含有することになる。非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルコールエトキシレート（ＡＥまたはＡＥＯ）、アルコールプロポキシレート、プロポキシ化脂肪アルコール（ＰＦＡ）、アルコキシ化脂肪酸アルキルエステル、例えばエトキシ化および／またはプロポキシ化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート（ＡＰＥ）、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰＥ）、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、アルコキシ化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド（ＦＡＭ）、脂肪酸ジエタノールアミド（ＦＡＤＡ）、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ＥＦＡＭ）、プロポキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ＰＦＡＭ）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、またはグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（グルカミド、ＧＡ、または脂肪酸グルカミド、ＦＡＧＡ）、および商標名ＳＰＡＮおよびＴＷＥＥＮで市販される製品、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
中に含まれる場合、洗剤は、通常、半極性界面活性剤を約１重量％〜約４０重量％含有することになる。半極性界面活性剤の非限定的な例としては、アミンオキシド（ＡＯ）、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド、Ｎ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびエトキシ化脂肪酸アルカノールアミド、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
中に含まれる場合、洗剤は、通常、両性イオン性界面活性剤を約１重量％〜約４０重量％含有することになる。両性イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、ベタイン、アルキルジメチルベタイン、およびスルホベタイン、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
ヒドロトロープ
ヒドロトロープは、疎水性化合物を水溶液に（または反対に、極性物質を非極性環境中に）可溶化する化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水性および疎水性の両方の特性を有する（界面活性剤で知られるようないわゆる両親媒性）；しかしながら、ヒドロトロープの分子構造は、一般に、自発的な自己凝集を促進しない（例えば、Ｈｏｄｇｄｏｎ ａｎｄ Ｋａｌｅｒ（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ＆ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２：１２１−１２８による総説を参照のこと）。ヒドロトロープは、ミセル相、ラメラ相または他の十分明確な中間相を形成する界面活性剤および脂質に見られるような、自己凝集を生じる臨界濃度を示さない。その代わり、多くのヒドロトロープは、凝集のサイズが濃度の増加につれて増大する連続型の凝集プロセスを示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水、油、界面活性剤およびポリマーの混合物を含む、極性および非極性の物質を含有する系の相挙動、安定性およびコロイド特性を変化させる。ヒドロトロープは、医薬品、パーソナルケア、食品から技術用途にわたる産業に従来用いられている。洗剤組成物中にヒドロトロープを使用することにより、例えば、（水を除去することにより、液体洗剤をコンパクト化するプロセスにおいてのように）相分離または高粘性などの望ましくない現象を引き起こすことなく、界面活性剤がより濃縮された配合物が可能になる。
洗剤は、ヒドロトロープを０〜５重量％、例えば、約０．５〜約５重量％または約３重量％〜約５重量％含有することができる。洗剤で使用される当技術分野で公知のいずれのヒドロトロープも利用することができる。ヒドロトロープの非限定的な例としては、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（ＳＴＳ）、キシレンスルホン酸ナトリウム（ＳＸＳ）、クメンスルホン酸ナトリウム（ＳＣＳ）、シメンスルホン酸ナトリウム、アミンオキシド、アルコールおよびポリグリコールエーテル、ヒドロキシナフトエ酸ナトリウム、ヒドロキシナフタレンスルホン酸ナトリウム、エチルヘキシル硫酸ナトリウム、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
ビルダーおよび共ビルダー
洗剤組成物は、洗剤ビルダーもしくは共ビルダーまたはそれらの混合物を０〜６５重量％、例えば、約５重量％〜約５０重量％含有することができる。皿洗浄洗剤では、ビルダーのレベルは、典型的には４０〜６５％、特に５０〜６５％である。ビルダーおよび／または共ビルダーは、特に、ＣａおよびＭｇと水溶性錯体を形成するキレート剤であってもよい。ランドリー洗剤で使用される当技術分野で公知のいずれのビルダーおよび／または共ビルダーも利用することができる。ビルダーの非限定例としては、ゼオライト、ジホスフェート（ピロホスフェート）、三リン酸ナトリウム（ＳＴＰまたはＳＴＰＰ）などのトリホスフェート、炭酸ナトリウムなどのカーボネート、メタケイ酸ナトリウムなどの可溶性シリケート、層状シリケート（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫＳ−６）、２−アミノエタン−１−オール（ＭＥＡ）などのエタノールアミン、イミノジエタノール（ＤＥＡ）および２，２’，２”−ニトリロトリエタノール（ＴＥＡ）、およびカルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
洗剤組成物はまた、洗剤共ビルダーまたはそれらの混合物を０〜６５重量％、例えば、約５重量％〜約４０重量％含有することができる。洗剤組成物は、共ビルダーを単独で、またはビルダー、例えばゼオライトビルダーと組み合わせて含むことができる。共ビルダーの非限定例としては、ポリアクリレートのホモポリマーまたはそのコポリマー、例えば、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）またはコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（ＰＡＡ／ＰＭＡ）が挙げられる。さらに非限定例としては、シトレート、キレート剤、例えば、アミノカルボキシレート、アミノポリカルボキシレートおよびホスホネート、ならびにアルキル−またはアルケニルコハク酸が挙げられる。さらなる特定の例としては、２，２’，２”−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノ二コハク酸（ＩＤＳ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジイルビス（ホスホン酸）（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレン）テトラキス（ホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、ジエチレントリアミンペンタキス（メチレン）ペンタキス（ホスホン酸）（ＤＴＰＭＰＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−一プロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノ二コハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）およびスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチリデンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、ジエチレントリアミン五（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、ならびにそれらの組合せおよび塩が挙げられる。さらなる例示的なビルダーおよび／または共ビルダーは、例えば、国際公開第０９／１０２８５４号パンフレット、米国特許第５９７７０５３号明細書に記載されている。
漂白系
洗剤は、漂白系を０〜１０重量％、例えば、約１重量％〜約５重量％含有することができる。ランドリー洗剤で使用される当技術分野で公知のいずれの漂白系も利用することができる。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光退色剤、漂白活性化剤、過酸化水素源、例えば過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウム、予め形成させた過酸、ならびにそれらの混合物が挙げられる。好適な予め形成させた過酸としては、これらに限定されないが、過オキシカルボン酸および過オキシカルボン酸塩、過炭酸および過炭酸塩、過イミド酸および過イミド酸塩、過オキソ硫酸および過オキソ硫酸塩、例えば、Ｏｘｏｎｅ（登録商標）、ならびにそれらの混合物が挙げられる。漂白系の非限定的な例としては、例えば、過酸を形成する漂白活性化剤と組み合わせて、過ホウ酸（通常一水和物または五水和物）、過カルボン酸、過硫酸、過リン酸、過ケイ酸のナトリウム塩などのアルカリ金属塩を含む無機塩を含み得る過酸化物ベースの漂白系が挙げられる。漂白活性化剤とは、本明細書においては、過酸化水素のような過酸化物と反応して、過酸を形成する化合物を意味する。このように形成された過酸は、活性化漂白剤を構成する。本明細書で使用される好適な漂白活性化剤としては、エステル、アミド、イミドまたは無水物のクラスに属するものが挙げられる。好適な例には、テトラアセチルアチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジペルオキシドデカン酸、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＬＯＢＳ）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート、４−（デカノイルオキシ）ベンゾエート（ＤＯＢＳ）、４−（３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ）、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）および４−（ノナノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）、ならびに／または国際公開第９８／１７７６７号パンフレットに開示されたものがある。目的の漂白活性化剤の特定のファミリーが、欧州特許第６２４１５４号明細書に開示され、アセチルトリエチルシトレート（ＡＴＣ）であるという点で特に好ましいものであった。ＡＴＣまたはＴｒｉａｃｉｎのような短鎖トリグリセリドは、最終的にクエン酸およびアルコールに分解するので、環境に優しいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルシトレートおよびトリアセチンは、保管の際に製品中で良好な加水分解安定性を有し、また効率的な漂白活性化剤である。最終的に、ＡＴＣは、ランドリー添加剤に良好なビルディング能力を提供する。あるいは、漂白系は、例えば、アミド、イミドまたはスルホンタイプのペルオキソ酸を含むことができる。漂白系はまた、６−（フタロイルアミノ）ペルカプロン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含むことができる。漂白系はまた、漂白触媒を含むことができる。一部の実施形態において、漂白成分は、以下の式：
Figure 2015509364
［式中、各Ｒ1は独立して９〜２４個の炭素を含有する分岐鎖アルキル基または１１〜２４個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ1は独立して９〜１８個の炭素を含有する分岐鎖アルキル基または１１〜１８個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、より好ましくは、各Ｒ1は独立して２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−〜テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシル、イソノニル、イソデシル、イソトリデシルおよびイソペンタデシルからなる群から選択される］を有する有機触媒、（ｉｉｉ）およびそれらの混合物からなる群から選択される有機触媒であってもよい。他の例示的な漂白系は、例えば、国際公開第２００７／０８７２５８号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４４号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２５９号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４２号パンフレットに記載されている。好適な光退色剤は、例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニンであってもよい。
ポリマー
洗剤は、ポリマーを０〜１０重量％、例えば、０．５〜５重量％、２〜５重量％、０．５〜２重量％または０．２〜１重量％含有することができる。洗剤で使用される当技術分野で公知のいずれのポリマーも利用することができる。ポリマーは、上述のように共ビルダーとして機能しても、または再付着防止、繊維保護、汚染物放出、染料移行阻害、油脂クリーニングおよび／または消泡性を備えていてもよい。一部のポリマーは、上述の特性の２つ以上および／または以下に述べるモチーフの２つ以上を有することがある。例示的なポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシ化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、およびポリカルボキシレート、例えばＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡ、ポリアスパラギン酸、およびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー、疎水性修飾ＣＭＣ（ＨＭ−ＣＭＣ）およびシリコーン、テレフタル酸およびオリゴマー性グリコールのコポリマー、ポリエチレンテレフタレートおよびポリオキシエテンテレフタレートのコポリマー（ＰＥＴ−ＰＯＥＴ）、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキサイド）（ＰＶＰＯまたはＰＶＰＮＯ）、ならびにポリビニルピロリドン−ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）が挙げられる。さらなる例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ）、ならびにジクオタニウムエトキシスルフェートが挙げられる。他の例示的なポリマーは、例えば、国際公開第２００６／１３０５７５号パンフレットに開示されている。上述のポリマーの塩も企図される。
布地色調剤（ｆａｂｒｉｃ ｈｕｅｉｎｇ ａｇｅｎｔ）
本発明の洗剤組成物はまた、洗剤組成物に配合された場合に、前記洗剤組成物を含む洗浄液と布地が接触すると、前記布地上に沈着し、それ故、可視光の吸収／反射により前記布地の色合いを変化させ得る染料または顔料などの布地色調剤を含むことができる。蛍光増白剤は、少なくとも一部の可視光を放射する。これに対して、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部を吸収するので、表面の色合いを変化させる。好適な布地色調剤は、染料および染料−クレーコンジュゲートを含み、また顔料も含むことができる。好適な染料としては、小分子染料およびポリマー染料が挙げられる。好適な小分子染料としては、例えば、国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７５号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７６号パンフレットおよび欧州特許第１８７６２２６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレット、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレットおよびベーシックレッドのカラーインデックス（Ｃ．Ｉ．）分類に該当する染料またはそれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、好ましくは、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％、またはさらには約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色調剤を含む。組成物は、０．０００１重量％〜０．２重量％の布地色調剤を含むことができ、組成剤が単位用量パウチの形態である場合、これは特に好ましくなり得る。好適な色調剤はまた、例えば、国際公開第２００７／０８７２５７号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４３号パンフレットに開示されている。
（追加の）酵素
一実施形態において、本発明による変異体は、１つまたは複数の酵素、例えば、少なくとも２つの酵素、より好ましくは少なくとも３つ、４つまたは５つの酵素と組み合わせる。好ましくは、これらの酵素は、異なる基質特異性、例えば、タンパク質分解活性、アミロース分解活性、脂肪分解活性、ヘミセルロース分解活性またはペクチン分解活性を有する。
洗剤添加物および洗剤組成物は、１つまたは複数の追加の酵素、例えば、カルボヒドラーゼのような炭水化物活性酵素、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、またはプロテアーゼ、リパーゼ、ａ、クチナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、および／またはペルオキシダーゼを含むことができる。
一般に、選択される酵素の特性は、選択される洗剤と適合するべきであり（すなわち、至適ｐＨ、他の酵素成分および非酵素成分との適合性）、また酵素は有効量で存在するべきである。
セルラーゼ：好適なセルラーゼとしては、細菌または真菌を起源とするものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学による突然変異体が含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に由来するセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトーラサーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびフザリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から産生される真菌セルラーゼが挙げられる。
特に好適なセルラーゼは、カラーケアの利点があるアルカリ性または中性のセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例には、欧州特許第０ ４９５ ２５７号明細書、欧州特許第０ ５３１ ３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載されるセルラーゼがある。他の例には、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０ ５３１ ３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレットおよびＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９に記載されるものなど、セルラーゼ変異体がある。
市販のセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）、およびＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）、およびＰｕｒａｄａｘ ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、およびＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。
プロテアーゼ
追加の酵素は、他のプロテアーゼまたはプロテアーゼ変異体であってもよい。プロテアーゼは、化学的または遺伝的に修飾された変異体を含めて、動物起源であっても、植物起源であっても、または微生物起源であってもよい。微生物起源が好ましい。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼなどのアルカリ性プロテアーゼであってもよい。セリンプロテアーゼは、例えば、トリプシンなどのＳ１ファミリーであっても、サブチリシンなどのＳ８ファミリーであってもよい。メタロプロテアーゼプロテアーゼは、例えば、ファミリーＭ４、Ｍ５、Ｍ７またはＭ８に由来するサーモリシンであってもよい。
「サブチラーゼ」という用語は、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９−７３７およびＳｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６（１９９７）５０１−５２３による、セリンプロテアーゼのサブグループを指す。セリンプロテアーゼは、基質と共有結合付加体を形成する、活性部位のセリンを有することを特徴とする。サブチラーゼは、６つの区分、すなわち、サブチリシンファミリー、テルミターゼファミリー、プロテイナーゼＫファミリー、ランチビオティックペプチダーゼファミリー、ケキシンファミリーおよびピロリシンファミリーに分類することができる。本発明の一態様において、追加のプロテアーゼは、サブチリシンまたはその変異体などのサブチラーゼであってもよい。
サブチリシンの例には、国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載される、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するもの、例えば、サブチリシンレンツス、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８、ならびにプロテアーゼＰＤ１３８（国際公開第９３／１８１４０号パンフレット）がある。追加のセリンプロテアーゼの例は、国際公開第９８／０２０１１５号パンフレット、国際公開第０１／４４４５２号パンフレット、国際公開第０１／５８２７５号パンフレット、国際公開第０１／５８２７６号パンフレット、国際公開第０３／００６６０２号パンフレットおよび国際公開第０４／０９９４０１号パンフレットに記載されている。サブチラーゼ変異体のさらなる例は、ＢＰＮ’の番号付けを用いると、位置：３、４、９、１５、２７、３６、６８、７６、８７、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１１８、１２０、１２３、１２８、１２９、１３０、１６０、１６７、１７０、１９４、１９５、１９９、２０５、２１７、２１８、２２２、２３２、２３５、２３６、２４５、２４８および２７４のいずれかに突然変異を有するものであってもよい。より好ましくは、サブチラーゼ変異体は、突然変異：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｋ２７Ｒ、*３６Ｄ、Ｖ６８Ａ、Ｎ７６Ｄ、Ｎ８７Ｓ、Ｒ、*９７Ｅ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｓ９９ＡＤ、Ｓ１０１Ｇ、Ｍ、Ｒ Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ｙ、Ｎ、Ｓ１０６Ａ、Ｇ１１８Ｖ、Ｒ、Ｈ１２０Ｄ、Ｎ、Ｎ１２３Ｓ、Ｓ１２８Ｌ、Ｐ１２９Ｑ、Ｓ１３０Ａ、Ｇ１６０Ｄ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ａ１９４Ｐ、Ｇ１９５Ｅ、Ｖ１９９Ｍ、Ｖ２０５Ｉ、Ｌ２１７Ｄ、Ｎ２１８Ｄ、Ｋ２３５Ｌ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、Ｎ２５２Ｋ、Ｔ２７４Ａ（ＢＰＮ’の番号付けを用いる）を含み得る。さらなる好ましいプロテアーゼは、例えば国際公開第９５／２３２２１号パンフレットに記載される、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）ＤＳＭ ５４８３由来のアルカリ性プロテアーゼ、および国際公開第９２／２１７６０号パンフレット、国際公開第９５／２３２２１号パンフレット、欧州特許第１９２１１４７号明細書および欧州特許第１９２１１４８号明細書に記載される、その変異体である。
トリプシン様プロテアーゼの例には、トリプシン（例えば、ブタまたはウシに由来する）、および国際公開第８９／０６２７０号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５８３号パンフレットに記載されるフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼがある。有用なプロテアーゼの例には、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレットおよび国際公開第９８／３４９４６号パンフレットに記載される変異体、特に以下の位置：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５および２７４の１つまたは複数に置換を有する変異体がある。
メタロプロテアーゼの例には、国際公開第０７／０４４９９３号パンフレットに記載される中性メタロプロテアーゼがある。
好ましい市販プロテアーゼ酵素としては、Ａｌｃａｌａｓｅ（商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（商標）、Ｒｅｌａｓｅ（商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）およびＳａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（商標）、（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ａｘａｐｅｍ（商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｓｅｓ Ｎ．Ｖ．）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（商標）、ＦＮ２（商標）、ＦＮ３（商標）、ＦＮ４（商標）、Ｍａｘａｃａ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｍａｘａｔａｓｅ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆａｓｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯｘＰ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（商標）およびＰｕｒａｍａｘ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ ｉｎｔ．）が挙げられる。
リパーゼおよびクチナーゼ：好適なリパーゼおよびクチナーゼとしては、細菌または真菌を起源とするものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学による突然変異体が含まれる。例としては、サーモミセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）由来のリパーゼ、例えば、欧州特許第２５８ ０６８号明細書および欧州特許第３０５ ２１６号明細書に記載される、Ｔ．ラヌジノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（以前の名前、フミコララヌジノサス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）由来のリパーゼ、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のクチナーゼ、例えば国際公開第９６／１３５８０号パンフレットに記載されるＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のクチナーゼ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）またはＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（欧州特許第２１８ ２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１ ３７６号明細書）、Ｐ．スタゼリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（ＧＢ１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス種菌株ＳＤ ７０５（国際公開第９５／０６７２０号パンフレットおよび国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）由来のリパーゼ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ、例えば、枯草菌（Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１３１：２５３−３６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＪＰ６４／７４４９９２号明細書）またはＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（国際公開第９１／１６４２２号パンフレット）由来のリパーゼが挙げられる。
他の例には、国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、欧州特許第４０７ ２２５号明細書、欧州特許第２６０ １０５号明細書、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット国際公開第９７／０４０７９号パンフレット国際公開第９７／０７２０２号パンフレット、国際公開第００／０６００６３号パンフレット、国際公開第２００７／０８７５０８号パンフレットおよび国際公開第２００９／１０９５００号パンフレットに記載されるものなどのリパーゼ変異体がある。
好ましい市販リパーゼ酵素としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌａｓｅ Ｕｌｔｒａ（商標）およびＬｉｐｅｘ（商標）；Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（商標）；Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（商標）、Ｌｉｐｏｐｒｉｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。他の市販リパーゼとしては、Ｌｕｍａｆａｓｔ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔ Ｉｎｃ）；Ｌｉｐｏｍａｘ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔ Ｉｎｃ）およびＳｏｌｖａｙからのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種リパーゼが挙げられる。
アミラーゼ：好適なアミラーゼ（αおよび／またはβ）としては、細菌または真菌を起源とするものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学による突然変異体が含まれる。アミラーゼとしては、例えば、ＧＢ１，２９６，８３９号明細書により詳細に記載される、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばバチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特定の菌株から得られるα−アミラーゼが挙げられる。
有用なアミラーゼの例には、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９６／２３８７３号パンフレットおよび国際公開第９７／４３４２４号パンフレットに記載される変異体、特に以下の位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８および４４４の１つまたは複数に置換を有する変異体がある。
市販のアミラーゼには、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｓｔａｒ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）がある。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、植物、細菌または真菌を起源とするものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学による突然変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来、例えばＣ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、ならびに国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレットおよび国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載されるものなどのその変異体が挙げられる。
市販のペルオキシダーゼとしては、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
洗剤酵素は、１つまたは複数の酵素を含有する別々の添加剤を加えることにより、またはこれらの酵素をすべて含む、合わせた添加剤を加えることにより洗剤組成物に含めることができる。本発明の洗剤添加剤、すなわち別々の添加剤または合わせた添加剤は、例えば、顆粒、液体、スラリー等として配合することができる。好ましい洗剤添加剤配合物は、顆粒、特に非ダスティング顆粒、液体、特に安定化された液体、またはスラリーである。
非ダスティング顆粒は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および同第４，６６１，４５２号明細書に開示されるように製造することができ、場合によっては、当技術分野で公知の方法によりコーティングすることができる。ワックスコーティング材料の例には、平均モル重量が１０００〜２００００のポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコール部分が１２〜２０個の炭素原子を含有し、１５〜８０個のエチレンオキシド単位があるエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；ならびに脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドがある。流動層手法による適用に適したフィルム形成コーティング材料の例は、ＧＢ１４８３５９１号明細書に示されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従い、プロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸などのポリオールを加えることにより安定化することができる。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示されている方法により調製することができる。
補助材料
ランドリー洗剤で使用される当技術分野で公知のいずれの洗剤成分も利用することができる。他の任意選択の洗剤成分としては、単独でまたは組み合わせて、耐食剤、防縮剤、汚染物再付着防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、結合剤、腐食防止剤、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）／崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、染料、酵素安定剤（ホウ酸、ボレート、ＣＭＣおよび／またはプロピレングリコールなどのポリオールを含む）、クレーを含む柔軟剤、充填剤／加工助剤、蛍光増白剤／光学的光沢剤、起泡力増進剤、発泡（石鹸の泡）調節剤、香料、汚染物懸濁剤、軟化剤、石鹸の泡抑制剤、汚れ防止剤およびウィッキング剤が挙げられる。ランドリー洗剤で使用される当技術分野で公知のいずれの成分も利用することができる。そのような成分の選択は、当業者の範囲内である。
分散剤−本発明の洗剤組成物はまた、分散剤を含有することができる。特に、粉末洗剤は分散剤を含むことができる。好適な水溶性有機材料は、ホモポリマーまたはコポリマーの酸またはそれらの塩を含み、ここでポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子により互いから分離している少なくとも２つのカルボキシルラジカルを含む。好適な分散剤は、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ ｖｏｌｕｍｅ ７１，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃに記載されている。
染料移行阻害剤−本発明の洗剤組成物はまた、１つまたは複数の染料移行阻害剤を含むことができる。好適なポリマー性染料移行阻害剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、およびポリビニルイミダゾール、ならびにそれらの混合物を挙げることができる。対象組成物に存在する場合、染料移行阻害剤は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％またはさらには約０．１重量％〜約３重量％のレベルで存在することができる。
蛍光増白剤−本発明の洗剤組成物はまた、好ましくは、蛍光増白剤または光学的光沢剤など、クリーニングされる商品に色をつけることができる追加の成分を含有する。存在する場合、光沢剤は、好ましくは、約０．０１％〜約０．５％のレベルである。ランドリー洗剤組成物で使用するのに適したいずれの蛍光増白剤も、本発明の組成物中に用いることができる。最も一般に使用される蛍光増白剤は、ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体およびビスフェニル−ジスチリル誘導体のクラスに属するものである。蛍光増白剤のジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体タイプの例としては、以下のナトリウム塩が挙げられる：４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２−アニリノ−４（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２−アミノ−４（１−メチル−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、および２−（スチルビル−４”−ナフト−１，２’：４，５）−１，２，３−トリゾール−２”−スルホネート。好ましい蛍光増白剤は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能なＴｉｎｏｐａｌ ＤＭＳおよびＴｉｎｏｐａｌ ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ ＤＭＳは、４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートのジナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ ＣＢＳは、２，２’−ビス−（フェニル−スチリル）ジスルホネートのジナトリウム塩である。また好ましい蛍光増白剤は、Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｍｉｎｅｒａｌｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａにより供給される市販のＰａｒａｗｈｉｔｅ ＫＸである。本発明で使用するのに適した他の蛍光剤としては、１−３−ジアリールピラゾリンおよび７−アルキルアミノクマリンを挙げることができる。
好適な蛍光増白剤レベルは、約０．０１、０．０５、約０．１またはさらには約０．２重量％の下位レベルから０．５またはさらには０．７５重量％の上位レベルまで含む。
汚染物放出ポリマー−本発明の洗剤組成物はまた、綿およびポリエステルベースの布地などの布地から汚染物を除去する、特にポリエステルベースの布地から疎水性の汚染物を除去する助けとなる１つまたは複数の汚染物放出ポリマーを含むことができる。汚染物放出ポリマーは、例えば、非イオン性またはアニオン性のテレフタレートベースのポリマー、ポリビニルカプロラクタムおよび関連コポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドであってもよく、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ ７ ｉｎ Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ ｖｏｌｕｍｅ ７１，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照されたい。他のタイプの汚染物放出ポリマーは、コア構造およびそのコア構造に結合した複数のアルコキシレート基を含む、両親媒性アルコキシル化油脂クリーニングポリマーである。このコア構造は、国際公開第２００９／０８７５２３号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されているポリアルキルエンイミン構造またはポリアルカノールアミン構造を含むことができる。さらにランダムグラフトコポリマーは、好適な汚染物放出ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４号パンフレット、国際公開第２００６／１０８８５６号パンフレットおよび国際公開第２００６／１１３３１４号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に、より詳細に記載されている。他の汚染物放出ポリマーは、置換された多糖構造、特に、欧州特許第１８６７８０８号明細書または国際公開第２００３／０４０２７９号パンフレット（両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものなど、変性セルロース誘導体などの置換されたセルロース構造である。好適なセルロースポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミドおよびそれらの混合物が挙げられる。好適なセルロースポリマーとしては、アニオン変性セルロース、非イオン変性セルロース、カチオン変性セルロース、両性イオン変性セルロースおよびそれらの混合物が挙げられる。好適なセルロースポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロースおよびそれらの混合物が挙げられる。
再付着防止剤−本発明の洗剤組成物はまた、１つまたは複数の再付着防止剤、例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレンおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸およびマレイン酸のコポリマー、ならびにエトキシル化ポリエチレンイミンを含むことができる。上記の汚染物放出ポリマーの下で記載されたセルロースベースのポリマーはまた、再付着防止剤として機能することができる。
他の好適な補助材料としては、これらに限定されないが、防縮剤、しわ防止剤、殺菌剤、結合剤、担体、染料、酵素安定剤、柔軟剤、充填剤、発泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、泡立ち（ｓｏｄ）抑制剤、溶媒、液体洗剤のための構造体（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｎｔ）および／または構造弾性化剤が挙げられる。
洗剤製品の配合
本発明の洗剤組成物は、任意の好都合な形態、例えば、バー、均質錠剤、２つ以上の層のある錠剤、レギュラーまたはコンパクトな粉末、顆粒、ペースト、ゲル、またはレギュラー、コンパクト、もしくは濃縮された液体であってもよい。
洗剤配合物形態：層（同じまたは異なる相）、パウチ、対（ｖｅｒｓｕｓ）マシン投与単位のための形態。
パウチは、単一または多重コンパートメントとして構成することができる。パウチは、水と接触する前にパウチから組成物を放出するために組成物を放出することなく、組成物を保持するのに適したいずれの形態、形状および材料であってもよい。パウチは、内部体積を包む水溶性フィルムから作製される。前記内部体積は、パウチの複数のコンパートメントに分割することができる。好ましいフィルムは、ポリマー材料、好ましくはフィルムまたはシートに形成されるポリマーである。好ましいポリマー、コポリマーまたはそれらの誘導体は、選択されたポリアクリレート、および水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、最も好ましくはポリビニルアルコールコポリマーおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。好ましくは、フィルム中のポリマー、例えばＰＶＡのレベルは、少なくとも約６０％である。好ましい平均分子量は、典型的には、約２０，０００〜約１５０，０００である。フィルムはまた、ポリ乳酸およびポリビニルアルコール（Ｃｈｒｉｓ Ｃｒａｆｔ Ｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｏｆ Ｇａｒｙ，Ｉｎｄ．，ＵＳにより販売される商標名Ｍ８６３０の下で知られている）にグリセロール、エチレングリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールおよびそれらの混合物のような可塑剤を加えたものなど、加水分解可能で水溶性のポリマーブレンドを含むブレンド組成物であってもよい。パウチは、水溶性フィルムにより分離された固体ランドリークリーニング組成物または部分成分および／または液体ランドリークリーニング組成物または部分成分を含むことができる。液体成分のためのコンパートメントは、固体を含有するコンパートメントとは組成物が異なり得る。参考文献：（米国特許出願公開第２００９／００１１９７０ Ａ１号明細書）
洗剤成分は、水溶解可能なパウチのコンパートメントにより、または錠剤の異なる層において、互いから物理的に分離することができる。それによって、成分間のネガティブな保管相互作用を回避することができる。コンパートメントのそれぞれの溶出プロファイルが異なることによっても、洗浄溶液中の選択された成分の溶出を遅延させることができる。
形態の定義／特性：
単位用量ではない液体洗剤またはゲル洗剤は水性であってもよく、典型的には、少なくとも２０重量％および最大９５％の水、例えば、最大約７０％の水、最大約６５％の水、最大約５５％の水、最大約４５％の水、最大約３５％の水を含有する。限定はされないが、アルカノール、アミン、ジオール、エーテルおよびポリオールを含む他のタイプの液体は、水性の液体またはゲルの中に含まれ得る。水性の液体洗剤またはゲル洗剤は、０〜３０％の有機溶媒を含むことができる。
液体洗剤またはゲル洗剤は非水性であってもよい。
顆粒洗剤配合物
顆粒洗剤は、国際公開第０９／０９２６９９号パンフレット、欧州特許第１７０５２４１号明細書、欧州特許第１３８２６６８号明細書、国際公開第０７／００１２６２号パンフレット、ＵＳ６４７２３６４、国際公開第０４／０７４４１９号パンフレットまたは国際公開第０９／１０２８５４号パンフレットに記載されるように配合することができる。他の有用な洗剤配合物は、国際公開第０９／１２４１６２号パンフレット、国際公開第０９／１２４１６３号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４０号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４１号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４２号パンフレット、国際公開第０９／０７２０６９号パンフレット、国際公開第０９／０６３３５５号パンフレット、国際公開第０９／１３２８７０号パンフレット、国際公開第０９／１２１７５７号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９６号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９８号パンフレット、国際公開第０９／１０３８２２号パンフレット、国際公開第０９／０８７０３３号パンフレット、国際公開第０９／０５００２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２５号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２７号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２８号パンフレット、国際公開第０９／０２１７８４号パンフレット、国際公開第０９／０１０３７５号パンフレット、国際公開第０９／０００６０５号パンフレット、国際公開第０９／１２２１２５号パンフレット、国際公開第０９／０９５６４５号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４４号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４５号パンフレット、国際公開第０９／０２４７８０号パンフレット、国際公開第０９／００４２９５号パンフレット、国際公開第０９／００４２９４号パンフレット、国際公開第０９／１２１７２５号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９１号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９２号パンフレット、国際公開第０９／０７４３９８号パンフレット、国際公開第０９／０７４４０３号パンフレット、国際公開第０９／０６８５０１号パンフレット、国際公開第０９／０６５７７０号パンフレット、国際公開第０９／０２１８１３号パンフレット、国際公開第０９／０３０６３２号パンフレットおよび国際公開第０９／０１５９５１号パンフレットに記載されている。
国際公開第２０１１０２５６１５号パンフレット、国際公開第２０１１０１６９５８号パンフレット、国際公開第２０１１００５８０３号パンフレット、国際公開第２０１１００５６２３号パンフレット、国際公開第２０１１００５７３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８４４号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０４号パンフレット、国際公開第２０１１００５６３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１２号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０５号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１３５２３８号パンフレット、国際公開第２０１０１２０８６３号パンフレット、国際公開第２０１０１０８００２号パンフレット、国際公開第２０１０１１１３６５号パンフレット、国際公開第２０１０１０８０００号パンフレット、国際公開第２０１０１０７６３５号パンフレット、国際公開第２０１００９０９１５号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４７号パンフレット、国際公開第２０１００３３８９７号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７９号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４０号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４１号パンフレット、国際公開第２０１００３０５３９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６７号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４７０号パンフレット、国際公開第２０１００２５１６１号パンフレット、国際公開第２０１００１４３９５号パンフレット、国際公開第２０１００４４９０５号パンフレット
国際公開第２０１０１４５８８７号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５０３号パンフレット、国際公開第２０１０１２２０５１号パンフレット、国際公開第２０１０１０２８６１号パンフレット、国際公開第２０１００９９９９７号パンフレット、国際公開第２０１００８４０３９号パンフレット、国際公開第２０１００７６２９２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７４２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７１８号パンフレット、国際公開第２０１００６９９５７号パンフレット、国際公開第２０１００５７７８４号パンフレット、国際公開第２０１００５４９８６号パンフレット、国際公開第２０１００１８０４３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７８３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７９２号パンフレット
国際公開第２０１１０２３７１６号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５３９号パンフレット、国際公開第２０１０１１８９５９号パンフレット、国際公開第２０１０１１５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９４２号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６１号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６２号パンフレット、国際公開第２０１００９４３５６号パンフレット、国際公開第２０１００８４２０３号パンフレット、国際公開第２０１００７８９７９号パンフレット、国際公開第２０１００７２４５６号パンフレット、国際公開第２０１００６９９０５号パンフレット、国際公開第２０１００７６１６５号パンフレット、国際公開第２０１００７２６０３号パンフレット、国際公開第２０１００６６４８６号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３１号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３２号パンフレット、国際公開第２０１００６３６８９号パンフレット、国際公開第２０１００６０８２１号パンフレット、国際公開第２０１００４９１８７号パンフレット、国際公開第２０１００３１６０７号パンフレット、国際公開第２０１００００６３６号パンフレット
方法および使用
本発明はまた、家庭用ランドリー洗浄ならびに産業用ランドリー洗浄などの生地および布地のランドリーにおいて、本発明による変異体またはその組成物を使用するための方法に関する。
本発明はまた、自動食器洗浄（ＡＤＷ）、自動車洗浄および工業的表面のクリーニングなどの硬質面クリーニングにおいて、本発明による変異体またはその組成物を使用するための方法に関する。
本発明のサブチリシン変異体は、洗剤組成物に加えることができ、それ故、その成分になり得る。それ故、本発明の一態様は、ランドリーおよび／または硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚ（ＸおよびＺは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、またはＤ、Ｅ、Ｓ、Ｔからなる群から選択される）に対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、配列番号２または４に対して少なくとも６０％の同一性を有するサブチリシン変異体の使用に関する。他の態様は、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚ（ＸおよびＺは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、またはＤ、Ｅ、Ｓ、Ｔからなる群から選択される）に対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、配列番号２または４に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％などの少なくとも６０％の配列同一性、例えば、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するサブチリシン変異体を含む洗剤組成物の使用に関する。
本発明の一実施形態は、ランドリーおよび／または硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚ（ＸおよびＺは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、またはＤ、Ｅ、Ｓ、Ｔからなる群から選択される）に対応する置換を含むサブチリシン変異体であって、配列番号２または４に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％などの少なくとも６０％の配列同一性、例えば、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有し、実施例２において、「材料および方法」の下で記載されるようにテストされた場合に、親に対して、または前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが、前記位置の１つまたは複数で置換を有しない親プロテアーゼに対して、向上した洗浄性能を有するサブチリシン変異体の使用に関する。
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布地の前処理に適したランドリー添加組成物およびリンス添加柔軟剤組成物を含む、ハンド用またはマシン用のランドリー洗剤組成物として配合することができ、または一般家庭での硬質面クリーニング作業で使用される洗剤組成物として配合することができ、またはハンドまたはマシンによる皿洗浄作業のために配合することができる。
特定の態様において、本発明は、本明細書に記載する本発明のポリペプチドを含む洗剤添加物を提供する。
クリーニングプロセスまたは生地ケアプロセスは、例えば、ランドリープロセス、皿洗浄プロセスまたは浴室のタイル、床、排水溝、シンクおよび洗面台などの硬質面のクリーニングであってもよい。ランドリープロセスは、例えば、家庭の洗濯であり得るが、産業上の洗濯であってもよい。さらに、本発明は、洗剤組成物および本発明の少なくとも１つのプロテアーゼ変異体を含有する洗浄溶液で布地を処理することを含む、布地および／または衣服を洗濯するためのプロセスに関する。クリーニングプロセスまたは生地ケアプロセスは、例えば、マシン洗浄プロセスまたはマニュアル洗浄プロセスで実施することができる。洗浄溶液は、例えば、洗剤組成物を含有する水性洗浄溶液であってもよい。
本発明の洗浄、クリーニングまたは生地ケアプロセスに供せられる布地および／または衣服は、従来の洗浄可能な洗濯物、例えば家庭内洗濯物であってもよい。好ましくは、洗濯物の大部分は、ニット、織布、デニム、不織布、フェルト、糸およびタオル地を含む、衣服および布地である。布地は、綿、亜麻、リネン、ジュート、ラミー、サイザルもしくはココナツ繊維を含む天然セルロース、またはビスコース／レーヨン、ラミー、酢酸セルロース繊維（ｔｒｉｃｅｌｌ）、リヨセルもしくはそれらのブレンドを含む合成セルロース（例えば、木材パルプ由来）など、セルロースベースのものであってもよい。布地はまた、ウール、キャメル、カシミア、モヘア、ウサギの毛および絹を含む天然ポリアミド、またはナイロン、アラミド、ポリエステル、アクリル、ポリプロピレンおよびスパンデックス／エラスタン、またはそれらのブレンドなどの合成ポリマーなど、非セルロースベースのものであっても、セルロースベースの繊維および非セルロースベースの繊維のブレンドであってもよい。ブレンドの例には、綿および／またはレーヨン／ビスコースと、１つまたは複数の相手材料、例えばウール、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）およびセルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻、リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リヨセル）とのブレンドがある。
ここ数年において、石油化学製品に由来する洗剤中の成分を、洗浄性能を損なうことなく、酵素およびポリペプチドなどの再生可能な生物学的成分に置き換えることに関心が高まっている。洗剤組成物の成分を変更する場合は、プロテアーゼ、リパーゼおよびアミラーゼなどの一般に使用される洗剤酵素に比較して、代替的かつ／または向上した特性を有する新規酵素活性または新規酵素が、従来の洗剤組成物と比較したときに、同等または向上した洗浄性能を達成するために必要とされる。
本発明はさらに、タンパク質性の汚れを除去するプロセスおける、本発明のプロテアーゼ変異体の使用に関する。タンパク質性の汚れは、食物の汚れ、例えば、ベビーフード、皮脂、ココア、卵、血液、ミルク、インク、草、またはそれらの組合せなどの汚れであり得る。
典型的な洗剤組成物は、酵素に加えて種々の成分を含み、これらの成分は異なる効果を有し、界面活性剤のような一部の成分は、洗剤中の表面張力を低下させ、それによって、クリーニングされる汚れを浮上および分散させて、洗い流すことを可能にし、漂白剤系のような他の成分は、多くの場合、酸化によって変色を除去し、また多くの漂白剤は、強力な殺菌性も有しており、消毒および滅菌のために用いられる。さらに、ビルダーおよびキレーターのような他の成分は、例えば、液体から金属イオンを除去することによって洗浄水を軟化する。
特定の実施形態において、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を含む組成物であって、以下のもの：ランドリーまたは皿洗浄における界面活性剤、ビルダー、キレーターまたはキレート剤、漂白剤系または漂白剤成分の少なくとも１つまたは複数をさらに含む組成物の使用に関する。
本発明の好ましい実施形態において、界面活性剤、ビルダー、キレーターまたはキレート剤、漂白剤系および／または漂白剤成分の量は、本発明のプロテアーゼ変異体を添加することなく用いられる界面活性剤、ビルダー、キレーターまたはキレート剤、漂白剤系および／または漂白剤成分の量に比較して低減される。好ましくは、界面活性剤、ビルダー、キレーターまたはキレート剤、漂白剤系および／または漂白剤成分である少なくとも１つの成分は、本発明のプロテアーゼ変異体を添加していない系における成分の量、例えばそのような成分の従来の量よりも、１％少ない、例えば２％少ない、例えば３％少ない、例えば４％少ない、例えば５％少ない、例えば６％少ない、例えば７％少ない、例えば８％少ない、例えば９％少ない、例えば１０％少ない、例えば１５％少ない、例えば２０％少ない、例えば２５％少ない、例えば３０％少ない、例えば３５％少ない、例えば４０％少ない、例えば４５％少ない、例えば５０％少ない量で存在する。一態様において、本発明のプロテアーゼ変異体は、界面活性剤、ビルダー、キレーターまたはキレート剤、漂白剤系および／または漂白剤成分、ならびに／あるいはポリマーである少なくとも１つの成分を含まない洗剤組成物中で使用される。
洗浄方法
本発明の洗剤組成物は、理想的にはランドリー用途での使用に適している。したがって、本発明は、布地を洗濯するための方法を含む。この方法は、洗濯される布地と、本発明による洗剤組成物を含むクリーニングランドリー溶液とを接触させるステップを含む。布地は、通常の消費者使用条件で洗濯することができるいずれの布地も含み得る。この溶液のｐＨは、好ましくは約５．５〜約１１．５である。組成物は、約１００ｐｐｍから、好ましくは５００ｐｐｍから約１５，０００ｐｐｍの溶液濃度で使用することができる。水温は、典型的には、約５℃〜約９５℃の範囲、例えば、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃および約９０℃である。水対布地の比は、典型的には、約１：１〜約３０：１である。
特定の実施形態において、洗浄方法は、約５．０〜約１１．５、または約６〜約１０．５、約５〜約１１、約５〜約１０、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約５．５〜約１１、約５．５〜約１０、約５．５〜約９、約５．５〜約８、約５．５〜約７、約６〜約１１、約６〜約１０、約６〜約９、約６〜約８、約６〜約７、約６．５〜約１１、約６．５〜約１０、約６．５〜約９、約６．５〜約８、約６．５〜約７、約７〜約１１、約７〜約１０、約７〜約９、または約７〜約８、約８〜約１１、約８〜約１０、約８〜約９、約９〜約１１、約９〜約１０、約１０〜約１１、好ましくは約５．５〜約１１，５のｐＨで行われる。
特定の実施形態において、洗浄方法は、約０°ｄＨ〜約３０°ｄＨ、例えば約１°ｄＨ、約２°ｄＨ、約３°ｄＨ、約４°ｄＨ、約５°ｄＨ、約６°ｄＨ、約７°ｄＨ、約８°ｄＨ、約９°ｄＨ、約１０°ｄＨ、約１１°ｄＨ、約１２°ｄＨ、約１３°ｄＨ、約１４°ｄＨ、約１５°ｄＨ、約１６°ｄＨ、約１７°ｄＨ、約１８°ｄＨ、約１９°ｄＨ、約２０°ｄＨ、約２１°ｄＨ、約２２°ｄＨ、約２３°ｄＨ、約２４°ｄＨ、約２５°ｄＨ、約２６°ｄＨ、約２７°ｄＨ、約２８°ｄＨ、約２９°ｄＨ、約３０°ｄＨの硬度で行われる。典型的な欧州洗浄条件下では、硬度は約１６°ｄＨであり、典型的な米国洗浄条件下では、約６°ｄＨであり、また典型的なアジア洗浄条件下では、約３°ｄＨである。
本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を含む洗剤組成物を用いて、布地、皿類または硬質表面をクリーニングする方法に関する。
好ましい実施形態は、対象と、本発明のプロテアーゼ変異体を含むクリーニング組成物とを、前記対象をクリーニングするのに適した条件下で接触させるステップを含む、クリーニングする方法に関する。好ましい実施形態において、クリーニング組成物は洗剤組成物であり、プロセスはランドリーまたは皿洗浄プロセスである。
さらに他の実施形態は、布地から汚れを除去するための方法であって、前記布地と、本発明のプロテアーゼを含む組成物とを、前記対象をクリーニングするのに適した条件下で接触させるステップを含む方法に関する。
好ましい実施形態において、上記方法で使用される組成物は、上記「他の酵素」セクションで示された少なくとも１つの追加の酵素、例えば、プロテアーゼ、リパーゼおよびクチナーゼなどのヒドロラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼおよびペクチナーゼなどのカルボヒドラーゼ、またはそれらの組合せの群から選択される酵素をさらに含む。さらに他の好ましい実施形態において、上記方法で使用される組成物は、以下の成分、界面活性剤、ビルダー、キレーターまたはキレート剤、漂白剤系および／または漂白剤成分、あるいはポリマーの少なくとも１つまたは複数を低減された量で含む。
また、本発明のプロテアーゼの１つまたは複数を用いて、（例えば、生地を糊抜きするために）布地を処理する組成物および方法も企図される。プロテアーゼは、当技術分野で周知のいずれの布地処理方法でも用いることができる（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号明細書を参照のこと）。例えば、一態様において、布地の感触および外観は、溶液中で布地とプロテアーゼとを接触させるステップを含む方法により向上する。一態様において、布地は圧力下で溶液により処理される。
一実施形態において、プロテアーゼ変異体は、生地の製織の間もしくはその後、または糊抜き段階の間、または１つまたは複数の追加の布地処理ステップで適用される。生地の製織の間、糸は相当な機械的歪に曝される。機械織機で製織する前に、縦糸は、その引張強度を高め、切断を防止するために、糊付けデンプンまたはデンプン誘導体でコーティングされることが多い。プロテアーゼ変異体は、これらの糊付けタンパク質またはタンパク質誘導体を除去するために適用することができる。生地が織られた後、布地は糊抜き段階に進むことができる。これに続いて、１つまたは複数の追加の布地処理ステップを行うことができる。糊抜きは、生地から糊を除去する行為である。製織の後、糊コーティングは、均質で洗浄に耐えられる結果を保証するために、布地をさらに処理する前に除去されるべきである。また、酵素の作用による糊の酵素的加水分解を含む糊抜きの方法も提供される。
本出願においてプロテアーゼ変異体について開示される、すべての問題、対象および実施形態は、本明細書に記載される方法および使用に対しても適用可能である。したがって、それはまた、本明細書に記載される方法および使用に関する前記開示に明示的に参照される。
本発明は、以下の実施例により、さらに詳細に説明されるが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
材料および方法
一般的な分子生物学的方法：
他に記載がない限り、ＤＮＡの操作および形質転換は、分子生物学の標準的方法を用いて実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）；Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ（１９９０）。
プロテアーゼアッセイ：
１）Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイ：
ｐＮＡ基質：Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ Ｌ−１４００）
温度：室温（２５℃）
アッセイ緩衝液：ｐＨ値をＨＣｌまたはＮａＯＨを用いて、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、および１１．０に調整した、１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００。
２０μｌのプロテアーゼ（０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈した）を１００μｌのアッセイ緩衝液と混合した。アッセイは、１００μｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００によりさらに４５倍希釈した）を加えることにより開始した。プロテアーゼ活性の尺度としてＯＤ405の増加をモニターした。
２）Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫアッセイ：
基質：Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫ錠（架橋および染色カゼイン；Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）
温度：３７℃（または他のアッセイ温度にセットする）
アッセイ緩衝液：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ６．５またはｐＨ７．０。
Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫ錠を緩やかに撹拌することにより、２．０ｍｌの０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に懸濁した。この懸濁液５００μｌおよびアッセイ緩衝液５００μｌを微量遠心チューブに分注し、氷上に置いた。２０μｌのプロテアーゼ溶液（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に希釈）を氷冷混合物に加えた。このチューブを３７℃のサーモミキサーに移し、最高速度（１４００ｒｐｍ）で振盪させることにより、アッセイを開始した。１５分後、チューブを氷浴に戻した。未反応基質を除去するために、この混合物を氷冷遠心分離機中で数分間遠心分離し、２００μｌの上清をマイクロタイタープレートに移した。６５０ｎｍでの上清の吸光度を測定した。プロテアーゼ溶液の代わりに２０μｌの０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むサンプルを、並行してアッセイし、その値をプロテアーゼ試料の測定値から差し引いた。
ランドリー用自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）
ランドリーにおける洗浄性能を評価するために、自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を用いて洗濯実験を実施する。ＡＭＳＡでは、大量の小容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験可能である。ＡＭＳＡプレートは、テスト溶液用の多数のスロットと、洗浄されるランドリーサンプルである生地をすべてのスロット開口部に対してしっかりと押し込む蓋とを有する。洗浄時間の間、プレート、テスト溶液、生地および蓋を激しく振盪してテスト溶液と生地とを接触させ、規則正しい周期的な振動で機械的応力を加える。さらなる説明については、国際公開第０２／４２７４０号パンフレット、特に第２３〜２４頁の段落「Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照のこと。
ランドリー実験を以下に指定する実験条件下で実施する。
Figure 2015509364
モデル洗剤およびテスト材料は以下のとおりであった。
Figure 2015509364
ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2およびＮａＨＣＯ3（Ｃａ2+：Ｍｇ2+＝４：１：７．５）をテスト系に添加することにより水硬度を１５°ｄＨに調整した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
洗浄性能は、洗浄した生地の色の輝度として計測される。輝度はまた、白色の光を照射した際のサンプルからの反射光の強度として表されることが可能である。サンプルが汚れている場合、きれいなサンプルのものよりも反射光の強度は低い。従って、反射光の強度を用いて洗浄性能を計測することが可能である。
色の計測は、洗浄した生地のイメージを撮像するために用いられるプロ用の平面スキャナ（Ｋｏｄａｋ ｉＱｓｍａｒｔ，Ｋｏｄａｋ，Ｍｉｄｔａｇｅｒ ２９，ＤＫ−２６０５ Ｂｒｏｎｄｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で行わる。
スキャンしたイメージからの光強度の値を抽出するために、イメージからの２４ビットピクセル値をレッド、グリーンおよびブルー（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）は、ＲＧＢ値をベクターとして一緒に加算し、次いで、得られるベクターの長さから算出される。
Figure 2015509364
実施例１：プロテアーゼ変異体の調製およびテスト
変異体の調製および発現
突然変異および発現カセットの枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）への導入。
ＤＮＡ操作はすべて、ＰＣＲ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により行われ、当業者は誰でも再現することができる。
プロテアーゼ変異体をコードする組換え枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）構築物を用いて、富栄養培地（例えば、ＰＳ−１：１００ｇ／Ｌスクロース（Ｄａｎｉｓｃｏカタログ番号１０９−０４２９）、４０ｇ／Ｌ大豆外皮（大豆粉末）、１０ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4．１２Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋカタログ番号６５７９）、０．１ｍｌ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ＰＥ ６１００（ＢＡＳＦ １０２−３０９８））を含有する振盪フラスコに播種した。典型的には、２２０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で４日間培養した。
変異体の発酵
発酵は当技術分野で周知の方法によるかまたは以下のように実施することができる。関連発現プラスミドを包含する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を、関連抗生物質（６μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を含有するＬＢ寒天プレート上に画線し、３７℃で一晩増殖させた。
コロニーを、５００ｍｌの振盪フラスコ中の関連抗生物質を添加した１００ｍｌのＰＳ−１培地に移した。
細胞および他の溶解していない材料を、４５００ｒｐｍで２０〜２５分間の遠心分離により、発酵ブロスから除去した。その後、上清を濾過して透明な溶液を得た。
実施例２：サブチリシン変異体のテスト
Ｙ２１７Ｌ突然変異を有するＢＰＮ’（配列番号２）に対するプロテアーゼ変異体の洗浄性能を、「材料および方法」の下で記載されるＡＭＳＡ法を用いて、温度３０℃で粉末および液体モデル洗剤にてテストした。
結果：
プロテアーゼ変異体およびそれに対応するＹ２１７Ｌ突然変異を有する親プロテアーゼ（配列番号２）の相対的な洗浄性能を、２つの汚れ、ＰＣ−Ｓ−３７（綿／ポリエステル上の全卵）およびＰＣ−Ｓ−３９（綿／ポリエステル上の熟成完全卵）について、以下の表２．１に示す。
Figure 2015509364
この結果から、位置２１７または２１８に負または正の電荷があると（残基Ｄ、Ｅ、ＲまたはＫにより示され得る）、これらの位置の１つに電荷がない変異体、すなわちＹ２１７Ｌに比較して、性能が増大することがわかる。さらに、極性アミノ酸であるＳまたはＴの１つを挿入しても、洗浄性能が増大した。
同じ洗剤において、例えばＹ２１７Ｅ＋Ｎ２１８ＤおよびＹ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｅのように、同じアミノ酸でも他の荷電アミノ酸でも、すなわちＤでもＥでもよい第２の負電荷の提供により、対応する単一突然変異の変異体Ｙ２１７Ｅ、Ｎ２１８ＤおよびＮ２１８Ｅに比較して、位置２１７または２１８での負電荷の効果を、さらに増大させることができる。
さらに、残基Ｋ、ＨまたはＲにより、位置２１７または２１８に正電荷が提供されると、性能が増大する。この効果は、位置２１７および２１８にそれぞれある２つの正電荷により増強させることができる、すなわち、Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｒ、Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８ＲおよびＹ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｋは、１つの電荷を有する変異体、例えばＹ２１７Ｒに比較して、性能が増大している。
位置２１７および２１８に２つの正電荷または２つの負電荷を有する変異体は、正電荷と負電荷を組み合わせた変異体（Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｒ、Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｋ）よりも優れていた。
本明細書に記載され、特許請求されている本発明は、本明細書に開示されている特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、これは、これらの態様は本発明の数々の態様の例示であることが意図されているためである。いずれかの同等の態様は本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本明細書に示され、記載されているものに追加した本発明の種々の改変形態が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような改変形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に属することが意図されている。競合する場合には、定義を含む本開示が優先されることとなる。
配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (16)

  1. 配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を含む、プロテアーゼ活性を有するサブチリシン変異体であって、ＸおよびＺが、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択されるサブチリシン変異体。
  2. ＸおよびＺが同じアミノ酸である、請求項１に記載の変異体。
  3. ＸおよびＺがＤまたはＥである、請求項２に記載の変異体。
  4. ＸおよびＺがＫまたはＲである、請求項２に記載の変異体。
  5. 配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
  6. アライメントの長さが、少なくとも１５０個のアミノ酸残基、少なくとも１７５個のアミノ酸残基、少なくとも２００個のアミノ酸残基、少なくとも２２０個のアミノ酸残基、少なくとも２４０個のアミノ酸残基または少なくとも２６０個のアミノ酸残基である、請求項５に記載の変異体。
  7. 前記変異体が、１５０〜３５０個のアミノ酸、例えば、１７５〜３３０、２００〜３１０、２２０〜３００、２４０〜２９０、２６０〜２８０、２７０〜２７５個のアミノ酸からなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体。
  8. 改変の数が、１〜２０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の改変など、１〜１０個および１〜５個である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体。
  9. ［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｓ］、［Ｙ２１７Ｓ＋Ｎ２１８Ｄ］、［Ｙ２１７Ｅ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｅ］、［Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｙ２１７Ｄ＋Ｎ２１８Ｔ］、［Ｙ２１７Ｔ＋Ｎ２１８Ｄ］ ［Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｋ］、［Ｙ２１７Ｒ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｒ］、［Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｙ２１７Ｋ＋Ｎ２１８Ｈ］、［Ｙ２１７Ｈ＋Ｎ２１８Ｋ］からなる群から選択される置換のいずれかを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異体。
  10. 親に比較して、または配列番号２のプロテアーゼに比較して、卵の汚れに関して向上した洗浄性能を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異体。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体を含む組成物。
  12. サブチリシン親プロテアーゼの変異体を得るための方法であって、配列番号２のＹ２１７ＸおよびＮ２１８Ｚに対応する置換を親サブチリシンに導入するステップであって、ＸおよびＺが、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＳおよびＴからなる群から選択され、ＸがＤ、Ｅ、ＳまたはＴのいずれかである場合、ＺもまたＤ、Ｅ、ＳまたはＴから選択され、ＸがＫ、ＨまたはＲのいずれかである場合、ＺもまたＫ、ＨまたはＲから選択されるステップと、前記変異体を回収するステップと、前記変異体がプロテアーゼ活性を有するか否かをテストするステップとを含む方法。
  13. 前記親サブチリシンプロテアーゼが、
    ａ．配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
    ｂ．（ｉ）配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）そのｃＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長相補鎖と、低度緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
    ｃ．配列番号１もしくは３の成熟型ポリペプチドコード配列またはそのｃＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；および
    ｄ．プロテアーゼ活性を有する、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドの断片
    からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記親サブチリシンが、配列番号２または４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項１３に記載の方法。
  15. アライメントの長さが、少なくとも１５０個のアミノ酸残基、少なくとも１７５個のアミノ酸残基、少なくとも２００個のアミノ酸残基、少なくとも２２０個のアミノ酸残基、少なくとも２４０個のアミノ酸残基または少なくとも２６０個のアミノ酸残基である、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１４または１５の方法により得られる、サブチリシン親プロテアーゼの変異体。
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