MX2014006205A

MX2014006205A - Variantes de subtilasa y polinucleotidos que las codifican.

Info

Publication number: MX2014006205A
Application number: MX2014006205A
Authority: MX
Inventors: Allan Svendsen; Marco Malten; Christian Lundager Gylstorff
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2011-11-25
Filing date: 2012-11-23
Publication date: 2014-07-14
Also published as: CN103958657A; JP2015500006A; WO2013076269A1; EP2782988A1; US20140342433A1

Abstract

La presente invención se refiere a variantes de subtilasa y métodos para obtener variantes de subtilasa. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las variantes; a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras que comprenden los polinucleátidos; y a métodos para utilizar las variantes.

Description

VARIANTES DE SUBTILASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE LAS CODIFICAN CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a variantes de subtilasa novedosas que exhiben alteraciones con respecto a la subtilasa original en una o más propiedades que incluyen: estabilidad del quelante, rendimiento de lavado, estabilidad térmica, estabilidad en almacenamiento o actividad catalítica Las variantes de la invención son adecuadas para utilizarse en, por ejemplo, composiciones de limpieza o detergentes, tales como composiciones de detergentes para ropa y composiciones de lavado de vajilla, incluidas las composiciones para lavavaj illas automáticos. La presente invención se refiere también a secuencias aisladas de ADN que codifican las variantes, vectores de expresión, células hospederas y métodos para producir y utilizar las variantes de la invención. Además, la presente invención se refiere a las composiciones de limpieza y detergentes que comprenden las variantes de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En la industria de los detergentes, se han implementado enzimas en las formulaciones de lavado por más de 30 años. Las enzimas de las formulaciones comprenden proteasas, lipasas, amilasas, celulasas y manosidasas, así como otras enzimas y mezclas de las mismas. Las enzimas más importantes Ref . :248505 en el mercado son las proteasas.

Un número cada vez mayor de proteasas utilizadas en el mercado son variantes diseñadas de proteínas de las proteasas de origen natural, tales como Everlase°, Relase°, Novozyme°, Polarzyme°, Liquanase®, Liquanase Ultra° y Kannase* (Novozymes a/s) , Purafast , Purafect OXP , FN3 , FN4 y Excellase (Genencor International, Inc.). Además, se describen en la técnica otras variantes, tal como en WO2004/041979 (NOVOZYMES A/S) , que describe variantes de subtilasa que exhiben alteraciones con respecto a la subtilasa original en, por ejemplo, el rendimiento de lavado, la estabilidad térmica, la estabilidad en almacenamiento o la actividad catalítica. Las variantes se pueden utilizar en, por ejemplo, composiciones de limpieza o detergentes.

Se han descrito distintas variantes de subtilasa, muchas de las cuales han proporcionado una actividad, estabilidad y solubilidad mejoradas en diferentes detergentes El documento WO2004/067737 describe variantes de subtilasa que comprenden una o más deleciones en la región L75 a G80 y la posterior inserción de uno o más aminoácidos en la misma región. Sin embargo, existen varios factores que hacen que una mejora adicional de las proteasas sea ventajosa. Las condiciones de lavado, tales como temperatura y pH, cambian a lo largo del tiempo y distintas manchas resultan aún difíciles de eliminar completamente en condiciones convencionales de lavado. Por consiguiente, a pesar de la profunda investigación en el desarrollo de las proteasas, sigue existiendo una necesidad de proteasas mejoradas.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a variantes de subtilasa que comprenden una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde cada alteración es independientemente una sustitución o inserción y en donde la variante tiene actividad proteasa. La presente invención también se refiere a variantes de subtilasa que comprenden una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde cada alteración es independientemente una sustitución o inserción y en donde la variante tiene actividad proteasa, y en donde las variantes tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 65 % idéntica al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS : 2, 4 o 6.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican las variantes; a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras que comprenden los polinucleótidos; y a métodos para producir las variantes.

La presente invención también se refiere a un método para obtener una variante de proteasa que comprende introducir en una subtilasa progenitora una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde las alteraciones son sustituciones o inserciones, recuperar la variante y evaluar si la variante tiene actividad proteasa. La invención adicionalmente se refiere a composiciones tales como composiciones de limpieza y detergentes y al uso de las composiciones y variantes de la presente invención en procesos de limpieza tales como lavado de ropa y/o lavado de vajilla.

Definiciones Proteasa: El término "proteasa" se define en la presente como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Incluye cualquier enzima que pertenezca al grupo de enzimas EC 3.4 (incluida cada una de las trece subclases del mismo). El número EC refiere a la Nomenclatura de Enzimas de 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, incluidos los anexos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J". Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente.

Actividad proteasa: La expresión "actividad proteasa" significa una actividad proteolítica (EC 3.4). Las proteasas de la invención son endopeptidasas (EC 3.4.21) . Hay varios tipos de actividad proteasa: Los tres tipos de actividad principales son: similar a la tripsina cuando se produce la escisión de sustratos amídicos después de Arg o Lys en Pl, similar a la quimiotripsina cuando la escisión se produce después de uno de los aminoácidos hidrófobos en Pl, y similar a la elastasa con escisión después de una Ala en Pl. A los efectos de la presente invención, la actividad proteasa se determina de conformidad con el procedimiento descrito más adelante en "Materiales y métodos". Las variantes de subtilasa de la presente invención tienen al menos 20%, por ejemplo, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% y al menos 100% de la actividad proteasa del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2 O 6.

Variante alélica: La expresión "variante alélica" se refiere a cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica aparece de manera natural debido a una mutación y puede dar como resultado polimorfismo en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

ADNc: El término "ADNc" hace referencia a una molécula de ADN que se puede preparar mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura, empalmada, obtenida de una célula procariota o eucariota. El ADNc carece de secuencias de intrón que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de varios pasos, incluido el corte y empalme, antes de aparecer como un ARNm maduro que ya ha experimentado corte y empalme .

Los agentes quelantes o quelantes son químicos que forman moléculas con ciertos iones metálicos, que desactivan los iones de forma que no puedan reaccionar con otros elementos, por lo tanto un agente ligante que elimina la actividad química mediante la formación de quelatos . La quelación es la formación o presencia de dos o más ligantes separados entre un ligando y un único átomo central. El ligando puede ser cualquier compuesto orgánico, un silicato o un fosfato. En este contexto, la expresión "agentes quelantes" comprende quelantes, agente quelante, agentes quelantes, agentes de formación de complejos o agentes secuestrantes que forman complejos solubles en agua con iones metálicos, tales como calcio y magnesio. El efecto del quelato describe la afinidad mejorada de los ligandos quelantes por un ión metálico comparada con la afinidad de una colección de ligandos no quelantes similares para el mismo metal. Los agentes quelantes que tienen la capacidad de unirse a metales iónicos, en particular iones de calcio (Ca2+) , se han utilizado ampliamente en detergentes y composiciones para el lavado en general, tales como lavado de ropa o de vajilla. Se ha demostrado, sin embargo, que los agentes quelantes inhiben la actividad enzimática. La expresión "agente quelante" se utiliza en la presente solicitud indistintamente con "agente de formación de complejos" o "agente quelante" o "quelante" .

Debido a que la mayoría de las proteasas son sensibles al calcio, la presencia de agentes quelantes puede inhibir la actividad enzimática. La sensibilidad al calcio de las proteasas se puede determinar mediante la incubación de una proteasa dada en presencia de un agente quelante fuerte y el análisis del impacto de esta incubación en la actividad de la proteasa en cuestión. Una proteasa sensible al calcio perderá una parte significativa de toda su actividad durante la incubación.

Secuencia codificante: La expresión "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto polipeptídico . Los límites de una secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, el cual normalmente comienza con el codón de iniciación ATG o codones de iniciación alternativos, tales como GTG y TTG, y finaliza con un codón de terminación tal como TAA, TAG y TGA.

La secuencia codificante puede ser un ADN, ADNc, un polinucleótido sintético o recombinante .

Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" se refiere a todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o exógena respecto al polinucleótido que codifica la variante o pueden ser nativas o exógenas entre ellas. Las secuencias de control de este tipo incluyen, sin carácter limitante, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de tipo propéptido, un promotor, una secuencia de tipo péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.

Composición detergente: La expresión "composición detergente" incluye, a menos que se indique lo contrario, agentes de lavado de gran potencia o multiusos en forma de polvos o gránulos, especialmente detergentes de limpieza; agentes de lavado multiusos en forma de pasta, gel o líquido, especialmente los denominados de tipo líquido de gran potencia (HDL, por sus siglas en inglés) ; detergentes líquidos para telas delicadas; agentes lavavaj illas para lavado a mano o agentes lavavaj illas poco potentes, especialmente aquellos del tipo que produce gran cantidad de espuma; agentes lavavaj illas para lavado a máquina, incluidos los diferentes tipos de líquidos, granulados, comprimidos y abrillantadores para uso doméstico e institucional; agentes de desinfección y limpieza líquidos, incluidos los tipos de jabones para manos antibacterianos, barras de limpieza, colutorios, productos de limpieza dentales, champús para coches o alfombras, productos de limpieza para el bañe-champús para el pelo y enjuagues para el cabello; geles de ducha, espumas de baño; productos de limpieza de metales; así como auxiliares de limpieza tales como aditivos de blanqueo y tipos de "quitamanchas en barra" o de pretratamientos . Las expresiones "composición detergente" y "formulación detergente" se utilizan haciendo referencia a mezclas que se pretenden utilizar en un medio de lavado para la limpieza de objetos sucios. En algunas modalidades, la expresión se utiliza haciendo referencia al lavado de telas y/o prendas (p. ej . , "detergentes para lavar ropa"). En modalidades alternativas, la expresión se refiere a otros detergentes, tales como los utilizados para limpiar vajilla, cubertería, etc. (p. ej . , "detergentes lavavaj illas " ) . No se pretende que la presente invención se limite a ninguna composición o formulación detergente concreta. Se pretende que, además de las variantes de proteasa de la invención, el término comprenda los detergentes que contengan, por ejemplo, tensioactivos , adyuvantes, quelantes o agentes quelantes, sistema blanqueador o componentes blanqueadores, polímeros, acondicionadores de telas, potenciadores de la espuma, supresores de la espuma de jabones, tintes, perfume, inhibidores de bronceado, abrillantadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensión de suciedad, agentes anticorrosivos, inhibidores o estabilizadores de enzimas, activadores de enzimas, transferasa (s) , enzimas hidrolíticas , óxido reductasas, colorantes azules y tintes fluorescentes, antioxidantes y solubilizantes .

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de la variante, que incluye, sin carácter limitante, la transcripción, modificación posterior a la transcripción, traducción, modificación posterior a la traducción y secreción.

Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN circular o lineal que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está ligada operablemente a nucleótidos adicionales que permiten su expresión.

Condiciones de rigurosidad alta: El término "condiciones de rigurosidad alta" hace referencia a sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado y desnaturalizado y 50% de formamida, seguido de un procesos estándar de Southern Blot durante entre 12 y 24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 65 °C.

Célula hospedera: La expresión "célula hospedera" se refiere a cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transíección, transducción y procesos similares con un constructo de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula original que no sea idéntica a la célula original debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

Propiedad mejorada: El término "propiedad mejorada" hace referencia a una característica asociada con una variante que se ve mejorada en comparación con el progenitor o en comparación con una proteasa de referencia (la proteasa de referencia es, en el contexto de la presente solicitud, el polipéptido maduro de la SEQ ID NO 4 correspondiente a los aminoácidos 1 a 269 de la SEQ ID NO 4) , o en comparación con una proteasa que tiene una secuencia idéntica de la variante pero no tiene las alteraciones de una o más de las posiciones especificadas. Las propiedades mejoradas incluyen, a modo no taxativo, estabilidad del quelante, rendimiento de lavado, actividad proteasa, perfil de actividad térmica, termoestabilidad, perfil de actividad de pH, estabilidad de pH, especificidad del substrato/cofactor, propiedades de superficie mejoradas, especificidad del substrato, especificidad del producto, solubilidad o estabilidad mejorada en presencia de biomasa pretratada, estabilidad mejorada en condiciones de almacenamiento y estabilidad química .

Estabilidad química mejorada: El término "estabilidad química mejorada" se define en la presente como una enzima variante que presenta retención de actividad enzimática luego de un período de incubación en presencia de uno o varios productos químicos, ya sea naturales o sintéticos, que reduce la actividad enzimática de la enzima progenitora. La estabilidad química mejorada puede también resultar en variantes que tienen una mejor capacidad de catalizar una reacción en presencia de los químicos. En un aspecto particular de la invención la estabilidad química mejorada es una estabilidad mejorada en un detergente, en particular en un detergente líquido. La estabilidad de detergente mejorada es en particular una estabilidad mejorada de la variante de proteasa de conformidad con la invención cuando la variante se mezcla en una formulación detergente líquida que comprende un agente quelante. El líquido también incluye geles o una pasta. La formulación de detergente líquido puede hacer referencia a un detergente concentrado que se agrega durante un proceso de lavado de ropa o de lavado automático de vajilla o a un detergente diluido tal como una solución de lavado, es decir, una solución acuosa a la que se agrega el detergente concentrado.

Estabilidad El término "estabilidad" incluye estabilidad en almacenamiento y estabilidad durante el uso, por ejemplo, durante un proceso de lavado, y refleja la estabilidad de la variante de proteasa de la invención en función del tiempo, por ejemplo, cuánta actividad se retiene cuando la proteasa ce mantiene en una solución, en particular una solución detergente. La estabilidad se ve influenciada por muchos factores, por ejemplo, pH, temperatura, composición del detergente, por ejemplo, cantidad de adyuvantes, tensioactivos , etc. La estabilidad de la proteasa se puede medir mediante el uso del ensayo de estabilidad del quelante descrito en el ejemplo 1.

Estabilidad mejorada: El término "estabilidad mejorada", tal como "estabilidad del quelante mejorada", se define en la presente como una enzima variante que exhibe una mayor estabilidad en las soluciones que contienen quelantes, tales como EDTA, con respecto a la estabilidad de la proteasa base, con respecto a una proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de la variante pero que no tiene alteraciones en una o más de las posiciones especificadas o con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4, por ejemplo, al tener actividad residual de más de 16% después de 16 minutos a pH 8 en presencia de EDTA a 50 °C cuando se mide en el ensayo de estabilidad del quelante tal como se describe en Materiales y métodos.

Rendimiento de lavado mejorado: La expresión "rendimiento de lavado mejorado" se define en la presente como una variante de proteasa que exhibe una alteración del rendimiento de lavado de una variante de proteasa con respecto al rendimiento de lavado de la proteasa original, con respecto a una proteasa de referencia o con respecto a una proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de la variante pero que no tiene alteraciones en una o más de las posiciones especificadas, por ejemplo, mediante una mayor remoción de manchas. La expresión "rendimiento de lavado" incluye un rendimiento de lavado en el lavado de ropa pero también, por ejemplo, en el lavado de vajilla. El rendimiento del lavado puede cuantificarse calculando el denominado valor de intensidad (Int) definido en la descripción del Ensayo de Estrés Mecánico Automático (AMSA, por sus siglas en inglés) , por ejemplo, tal como se describe en la sección de Materiales y métodos del documento O11036263.

Actividad proteasa mejorada: La expresión "actividad proteasa mejorada" se define en la presente como una actividad proteasa alterada (tal como se definió anteriormente) de una variante de proteasa que exhibe una alteración de la actividad con respecto a (o en comparación con) la actividad de la proteasa original, o en comparación con una proteasa de referencia, o con respecto a una proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de la variante pero que no tiene las alteraciones en una o más de las posiciones especificadas, mediante una mayor conversión de proteínas.

Variante aislada: La expresión "variante aislada" se refiere a una variante que ha sido modificada mediante la manipulación humana. En un aspecto, la variante presenta una pureza de al menos un 1%, p. ej . , al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 40%, al menos un 60%, al menos un 80% y al menos un 90%, según se determina mediante SDS-PAGE.

Polinucleótido aislado: La expresión "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que ha sido modificado mediante la manipulación humana. En un aspecto, el polinucleótido aislado presenta una pureza de al menos un 1%, p. ej . , de al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 40%, al menos un 60%, al menos un 80%, al menos un 90% y al menos un 95%, según se determina mediante electroforesis en agarosa. Los polinucleótidos pueden tener origen genómico, semisintético, sintético, en el ADNc, ARN o cualesquiera combinaciones de estos.

Condiciones de rigurosidad baja: La expresión "condiciones de rigurosidad baja" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado y desnaturalizado y 25% de formamida, luego de procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 50 °C.

Polipéptido maduro: La expresión "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final luego de la traducción y de cualquier modificación postranslacional , tal como procesamiento de N-terminal, truncación del C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro corresponde a los aminoácidos 1 a 275 de la SEQ ID NO: 2, los aminoácidos 1 a 269 de la SEQ ID NO : 4 y los aminoácidos 1 a 274 de la SEQ ID NO: 6.

Secuencia que codifica el polipéptido maduro: La expresión "secuencia que codifica el polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que posee actividad proteasa. En un aspecto, la secuencia que codifica el polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos comprendidos entre el nucleótido 322 y 1146 de la SEQ ID NO: 1 en base a SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6)] que predice los nucleótidos 1 a 90 de la SEQ ID NO: 1 codifica un péptido señal .

En un aspecto, la secuencia que codifica el polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos comprendidos entre el nucleótido 577 y 1140 de la SEQ ID NO: 3 en base a SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6)] que predice los nucleótidos 1 a 81 de la SEQ ID NO: 3 codifican un péptido señal.

En un aspecto, la secuencia que codifica el polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos comprendidos entre el nucleótido 310 y 1131 de la SEQ ID NO: 5 en base a SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6)] que predice los nucleótidos 1 a 81 de la SEQ ID NO: 5 codifican un péptido señal.

Condiciones de rigurosidad media: La expresión "condiciones de rigurosidad media" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado y desnaturalizado y 35% de formamida, luego de procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 55 °C.

Condiciones de rigurosidad media-alta: La expresión "condiciones de rigurosidad media-alta" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado y desnaturalizado y 35% de formamida, luego de procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 60 °C.

Mutante: El término "mutante" se refiere a un polinucleótido que codifica una variante.

Constructo de ácido nucleico: La expresión "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono- o bicatenaria, la cual se aisla a partir de un gen de origen natural o se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de un modo sintético o que no existiría en la naturaleza. La expresión constructo de ácido nucleico es un sinónimo de la expresión "cásete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

Ligado operablemente: La expresión "ligado operablemente" significa una configuración en la que una secuencia testigo se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia de codificación de un polinucleótido de forma tal que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.

Progenitor: La expresión "progenitor11 significa una proteasa a la que se le hace la alteración para producir las variantes de enzimas de la presente invención. Por consiguiente, el progenitor es una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica de la variante pero que no tiene las alteraciones en una o más, por ejemplo, dos o más, de las posiciones especificadas. Se comprenderá que en el presente contexto la expresión "que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica" se refiere a un 100% de identidad secuencial . El progenitor puede ser un polipéptido que se encuentre en la naturaleza (de origen natural) o una variante de este. En una modalidad particular el progenitor es una proteasa con al menos 60% de identidad, tal como al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad con respecto a un polipéptido con el polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6.

Identidad secuencial: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por medio del parámetro "identidad secuencial". A los efectos de la presente invención, el grado de identidad secuencial entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman- unsch (Needlman y Wunsch, 1970, J". Mol. Biol . 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62) . El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación : (Residuos idénticos x 100) / (Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación) A los efectos de la presente invención, el grado de identidad secuencial entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina mediante el uso del algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) tal como se implemento en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100) / (Longitud de la alineación - Número total de huecos en Variante sustancialmente pura: La expresión "variante sustancialmente pura" se refiere a un preparado que contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el cual está asociado de manera natural o recombinante . Preferentemente, la variante presenta una pureza de al menos un 92%, p. ej . , de al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, al menos un 99.5% y un 100% en peso del material polipeptídico total presente en el preparado. Las variantes de la presente invención están preferentemente en una forma sustancialmente pura. Esto puede lograrse, por ejemplo, al preparar la variante por medio de métodos recombinantes conocidos o por medio de métodos de purificación clásicos.

Polinucleótido sustancialmente puro: La expresión "polinucleótido sustancialmente puro" se refiere a un preparado polinucleotídico exento de otros nucleótidos externos o no deseados y que se encuentra en una forma adecuada para su uso en los sistemas de producción de polipéptidos modificados genéticamente. Por lo tanto, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0.5% en peso de otro material polinucleotídico con el cual está asociado de manera natural o recombinante . Sin embargo, un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir regiones no traducidas 5 ' y 31 de origen natural, tales como promotores y terminadores . Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro presente una pureza de al menos un 90%, p. ej . , de al menos un 92%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% y al menos un 99.5% en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferentemente en una forma sustancialmente pura.

Variante: El término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad proteasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción en una o más (o una o varias) posiciones. Una sustitución significa un reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa agregar aminoácidos, por ejemplo, 1 a 10 aminoácidos, tal como 9 aminoácidos, tal como 8 aminoácidos, tal como 7 aminoácidos, tal como 6 aminoácidos, tal como 5 aminoácidos, tal como 4 aminoácidos, preferiblemente 1-3 aminoácidos, más preferiblemente 1-2 aminoácidos y más preferiblemente dos aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición. Deleción es la eliminación de al menos un aminoácido, haciendo la secuencia variante más corta que su progenitor.

Condiciones de rigurosidad muy alta: La expresión "condiciones de rigurosidad muy alta" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado y desnaturalizado y 50% de formamida, luego de procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 70 °C.

Condiciones de rigurosidad muy baja: La expresión "condiciones de rigurosidad muy baja" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado y desnaturalizado y 25% de formamida, luego de procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 45 °C.

Rendimiento de lavado: La expresión "rendimiento de lavado" se utiliza en el sentido de la capacidad de una enzima de quitar las manchas presentes en el ob eto que se va a limpiar durante, por ejemplo, el lavado, tal como lavado de ropa o limpieza de superficies duras. La mejora en el rendimiento del lavado puede cuantificarse calculando el denominado valor de intensidad (Int) definido en el ensayo AMSA, por ejemplo, tal como se describe en la sección de Materiales y métodos del documento WO11036263.

Proteasa de origen natural: La expresión "proteasa de origen natural" significa una proteasa expresada por un organismo natural, tal como una bacteria, arquea, levadura, hongo, planta o animal que se encuentra en la naturaleza. Un ejemplo de una proteasa de origen natural es BPN' es decir, aminoácido 1 a 275 de la SEQ ID NO: 2.

Promotor de transcripción: La expresión "promotor de transcripción" se utiliza para un promotor que se encuentra en una región del ADN que facilita la transcripción de un gen particular. Los promotores de transcripción se ubican normalmente cerca de los genes que regulan, en la misma hebra y corriente arriba (hacia la región 5' de la hebra sentido) .

Terminador de transcripción: La expresión "terminador de transcripción" se utiliza para una sección de la secuencia genética que marca el final del gen u operón en el ADN genómico para transcripción.

Convenciones para designar las variantes A los efectos de la presente invención, el polipéptido maduro que se describe en la SEQ ID NO: 2 se utiliza para determinar el residuo aminoacídico correspondiente en otra subtilisina, que también se denomina "numeración BPN'". A continuación, la expresión "que corresponde a" debe comprenderse como que corresponde a una posición del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, es decir, la numeración a lo largo del documento se realiza de conformidad con BPN' .

La secuencia de aminoácidos de otras subtilisinas se alinea con el péptido maduro de la SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 1 a 275 de la SEQ ID NO 2) , y en base a la alineación, el número de posición del aminoácido que corresponde a cualquier residuo aminoacídico en el polipéptido maduro descrito en la SEQ ID NO: 2 se determina utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62) . La identificación del residuo aminoacídico correspondiente en otra subtilisina puede determinarse mediante una alineación de múltiples secuencias de polipéptidos usando varios programas informáticos incluido, a modo no taxativo, MUSCLE (comparación de múltiples secuencias mediante una expectativa-logarítmica; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versión 6.857 o versiones posteriores; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64 ; Katoh y Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), y EMBOSS EMMA que emplean ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), utilizando sus parámetros respectivos por defecto.

Cuando la otra enzima difiere del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 de forma tal que la comparación en base a las secuencias tradicionales no logra detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol . 295: 613-615), se pueden utilizar otros algoritmos de comparación de secuencias por pares. Se puede obtener una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias utilizando programas de búsqueda que emplean representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para búsquedas en bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda de base de datos iterarivo y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al . , 1997 , Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) . Se puede obtener una sensibilidad incluso mayor si la familia o superfamilia para el polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructuras proteicas. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol . 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de varias fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructurales y potenciales de solvatación) como entrada para una red neural que predice el plegamiento estructural para una secuencia problema. De manera similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919 se puede utilizar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilias presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones se pueden utilizar a su vez para generar modelos de homología para el polipéptido y tales modelos se pueden evaluar para determinar su precisión utilizando varias herramientas desarrolladas con este fin.

Para proteínas de estructura conocida, existen varias herramientas y fuentes disponibles para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias SCOP de proteínas han sido alineadas estructuralmente y estas alineaciones son accesibles y se pueden descargar. Dos o más estructuras de proteínas pueden alinearse utilizando una variedad de algoritmos, tales como la matriz de alineación de distancias (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y se puede utilizar adicionalmente la implementación de estos algoritmos para cuestionar bases de datos de estructuras con una estructura de interés con el fin de descubrir posibles homólogos estructurales (p. ej . , Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567) .

A la hora de describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura que se describe a continuación se adapta para facilitar su referencia. Se emplea la abreviación de los aminoácidos de tres letras o de una única letra aceptada por la IUPAC.

Sustituciones . Para la sustitución de aminoácidos, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 con alanina se denomina "Thr226Ala" o "T226A" . Múltiples mutaciones se separan mediante signos de más ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg + Ser411Phe" o "G205R + S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) con arginina (R) y serina (S) con fenilalanina (F) , respectivamente.

Deleciones . Para la deleción de un aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, *. Por consiguiente, la deleción de glicina en la posición 195 se denomina "Glyl95*" o "G195*" . Múltiples deleciones se separan mediante signos de más ("+"), por ejemplo, , "Glyl95* + Ser411*" o "G195* + S411*" .

Inserciones : La inserción de un residuo aminoacídico adicional tal como por ejemplo, una lisina después de G195 puede indicarse por medio de: Glyl95GlyLys o G195GK. Alternativamente, la inserción de un residuo aminoacídico adicional, tal como una lisina después de G195, puede indicarse por medio de: *195aL. Cuando se inserta más de un residuo aminoacídico, tal como por ejemplo, una Lys y Ala después G195, esto puede indicarse mediante: Glyl95GlyLysAla o G195G A. En los casos, el o los residuos aminoacídicos también pueden numerarse mediante la adición de letras en minúscula al número de posición del residuo aminoacídico anterior al o los residuos aminoacídicos insertados, en este ejemplo: *195aK *195bA. Por consiguiente, en el ejemplo anterior, las secuencias 194 a 196 serían: 194 195 196 Savinasa A - G - L 194 195 195a 195b 196 Variante A - G - K - A - L En los casos en los que una sustitución y una inserción ocurren en la misma posición, esto puede indicarse como S99SD+S99A o abreviado S99AD. La misma modificación puede indicarse también como S99A + *99aD.

En los casos en los que se inserta un residuo aminoacídico idéntico al residuo aminoacídico existente, es claro que surge una degeneración en la nomenclatura. Si por ejemplo se inserta una glicina después de la glicina en el ejemplo anterior, esto se indicaría mediante G195GG o *195aGbG. El mismo cambio real podría indicarse igualmente como A194AG o *194aG para el cambio de 194 195 196 Savinasa A - G - L a 194 195 195a 196 Variante A - G - G - L 194 194a 195 196 Los casos serán evidentes para los expertos en la técnica y la indicación G195GG y las indicaciones correspondientes para este tipo de inserciones comprenden, por lo tanto, las indicaciones degeneradas equivalentes.

Alteraciones múltiples. Las variantes que comprenden múltiples alteraciones se separan mediante signos de más ("+"), por ejemplo, "Argl70Tyr+Glyl95Glu" o MR170Y+G195E" que representan una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 con tirosina y ácido glutámico, respectivamente. Alternativamente, múltiples alteraciones pueden separarse por un espacio o una coma, por ejemplo, A170Y G195E o A170Y, G195E respectivamente.

Alteraciones diferentes. Cuando pueden introducirse alteraciones diferentes en una posición, las diferentes alteraciones se separan por medio de una coma, por ejemplo, "Argl70Tyr , Glu" representa una sustitución de arginina en la posición 170 con tirosina o ácido glutámico. De este modo, "Tyrl67Gly, Ala + Argl70Gly, Ala" designa las siguientes variantes : "Tyrl67Gly+Argl70Gly" , "Tyrl67Gly+Argl70Ala" , "Tyrl67Ala+Argl70Gly" y "Tyrl67Ala+Argl70Ala" .

Alternativamente, diferentes alteraciones o sustituciones opcionales pueden indicarse entre corchetes, por ejemplo, Argl70 [Tyr, Glu] o Argl70{Tyr, Glu} o abreviado R170 [Y, E] o R170 {Y, E} .

Numeración de las posiciones/residuos aminoacídicos Si no se menciona lo contrario, la numeración de los aminoácidos que se utiliza en la presente corresponde a la secuencia BPN' de subtilasa (BASBPN) . Para una descripción más completa de las secuencia BPN1, ver la SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 1 a 275) o Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los inventores han encontrado que las subtilasas con alteraciones en el sitio de unión de iones de calcio fuerte que corresponde a los residuos aminoacídicos 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde las alteraciones son sustituciones o inserciones, resultaron en variantes con mayor estabilidad en composiciones detergentes que comprenden quelantes, tales como EDTA. Sin ánimo de ceñirse a ninguna teoría, se cree actualmente que las alteraciones en el sitio de unión de calcio de las subtilisinas tales como BPN' (aminoácidos 1-275 de la SEQ ID NO 2), subtilisina 309 (aminoácidos 1 a 269 de la SEQ ID NO 4) o Alcalasa (aminoácidos 1 a 274 de la SEQ ID NO 6) en la región que corresponde a los residuos aminoacídicos 75 a 82 del polipéptido maduro con la SEQ ID NO : 2 haciendo la región más similar a la región correspondiente de la proteasa TY145 (una subtilasa de Bacillus sp . TY145, NCIMB 40339 descrita en WO 92/17577) o secuencias homologas a TY145 aumenta la estabilidad de la variante de subtilasa en soluciones que contienen quelantes tales como EDTA cuando se comparan con su proteasa original, por ejemplo, el polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6. En particular, los inventores encontraron que un intercambio del sitio de unión de calcio que corresponde a los residuos 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 de la región 75 a 82 con el tipo de residuos TY145 o residuos de secuencias homologas a TY145 ha demostrado mayores estabilidades en soluciones de detergente que contienen quelantes, tales como EDTA EDTA cuando se comparan con el progenitor, por ejemplo, el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. Asimismo, la combinación de la región independiente de calcio con mutaciones de estabilidad conocida ha resultado en variantes de combinaciones muy estables y funcionales con mayor actividad en detergentes que comprenden quelantes tales como EDTA cuando la actividad residual de las variantes se compara con la actividad residual del progenitor, en comparación con una proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de la variante pero que no tiene una o más alteraciones en una o más de las posiciones específicas o en comparación con una proteasa de referencia. En particular, sustituir al menos un aminoácido en la región que corresponde a los residuos aminoacídicos 75 a 82 del polipéptido maduro con la SEQ ID NO: 2 con aminoácidos similares a la región correspondiente deTY145 o secuencias homologas combinadas con la inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a los residuos aminoacídicos 75 a 82 del polipéptido maduro con la SEQ ID NO: 2 resultó en variantes independientes de calcio que son muy estables en composiciones de detergente que comprenden quelantes tales como EDTA.

De esta forma, la invención se refiere a variantes de subtilasa, que comprenden una alteración en dos o más posiciones que corresponden a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde cada alteración es de forma independiente una sustitución o inserción y en donde la variante tiene actividad proteasa. La expresión "una alteración en" significa en el contexto de la presente solicitud una sustitución en una posición y una inserción en o entre dos posiciones. En una modalidad preferida, la variante de proteasa comprende una sustitución de uno o más aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 y adicionalmente comprende la inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la variante tiene al menos 65% de identidad con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6. Un aspecto de la invención se refiere a una variante de subtilasa que comprende una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde las dos alteraciones son una inserción de al menos dos residuos aminoacídicos adicionales en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto preferido, la variante de subtilasa de conformidad con la invención comprende al menos dos aminoácidos adicionales en comparación con la proteasa progenitora, por ejemplo, el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4, por lo cual los residuos aminoacídicos adicionales corresponden a la inserción de dos residuos aminoacídicos en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto preferido particular, los residuos aminoacídicos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en Gly o Asp, extendiéndose de esta forma la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 dos aminoácidos. Por lo tanto, un aspecto de la invención se relaciona con una variante que comprende dos residuos aminoacídicos adicionales en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, por lo cual los residuos aminoacídicos adicionales corresponden a la inserción de dos residuos aminoacídicos en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde los residuos aminoacídicos se seleccionan del grupo que consiste en Gly o Asp y en donde la región se extiende dos aminoácidos. Por lo tanto, En un aspecto particular, la invención se refiere a una variante de subtilasa que comprende al menos un residuo aminoacídico adicional en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la inserción de al menos un residuo aminoacídico adicional se encuentra entre las posiciones 75 y 76, tales como la o las inserciones *75aG, *75aD o *75a[G,D] *75b[G,D] (esta última indica que dos aminoácidos se insertan entre la posición 75 y 76, que pueden ser cualquiera de las siguientes: *75aG+*75bG; *75aD+*75bD; *75aG+*75bD o *75aD+*75bG) y adicionalmente comprende al menos una modificación adicional (numeración BPN, es decir, la numeración de conformidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID NO 2) . En un aspecto particular, la invención se refiere a una variante de subtilasa que comprende al menos un residuo aminoacídico adicional en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la inserción de al menos un residuo aminoacídico adicional se ubica entre las posiciones 76 y 77, tales como la o las inserciones *76aG, *76aD o *76a[G,D] *76b[G,D] y adicionalmente comprende al menos una modificación adicional (numeración BPN) . En un aspecto particular, la invención se refiere a una variante de subtilasa que comprende al menos un residuo aminoacídico adicional en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la inserción de al menos un residuo aminoacídico adicional se ubica entre las posiciones 77 y 78, tales como la o las inserciones *77aG, *77aD o *77a[G,D] *77b[G,D] y adicionalmente comprende al menos una modificación adicional (numeración BPN) . En un aspecto particular, la invención se refiere a una variante de subtilasa que comprende al menos un residuo aminoacídico adicional en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la inserción de al menos un residuo aminoacídico adicional se ubica entre las posiciones 78 y 79, tales como la o las inserciones *78aG, *78aD o *78a[G,D] *78b[G,D] y adicionalmente comprende al menos una modificación adicional (numeración BPN) . En un aspecto particular, la invención se refiere a una variante de subtilasa que comprende al menos un residuo aminoacídico adicional en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la inserción de al menos un residuo aminoacídico adicional se ubica entre las posiciones 79 y 80, tales como la o las inserciones *79aG, *79aD o *79a[G,D] *79b[G,D] y adicionalmente comprende al menos una modificación adicional (numeración BPN) . En un aspecto particular, la invención se refiere a una variante de subtilasa que comprende al menos un residuo aminoacídico adicional en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la inserción de al menos un residuo aminoacídico adicional se ubica entre las posiciones 80 y 81, tales como la o las inserciones *80aG, *80aD o *80a[G,D] *80b[G,D] y adicionalmente comprende al menos una modificación adicional (numeración BPN) . En un aspecto particular, la invención se refiere a una variante de subtilasa que comprende al menos un residuo aminoacídico adicional en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la inserción de al menos un residuo aminoacídico adicional se ubica entre las posiciones 81 y 82, tales como la o las inserciones *81aG, *81aD o *81a[G,D] *81b[G,D] y adicionalmente comprende al menos una modificación adicional (numeración BPN) . En donde la modificación adicional preferiblemente se selecciona de L75[D,H], N76[S,D,Y], N77 [D] , S78[Q,G], 179 [A, T, Q] y L82 [Y] y en donde la variante tiene al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6.

Un aspecto preferido de la invención se refiere a variantes de subtilasa que comprenden al menos una sustitución y al menos una inserción en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto preferido, la invención se refiere a variantes de subtilasa que comprenden al menos una sustitución, en donde la sustitución se selecciona del grupo que consiste en L75[D,H], N76[S,D,Y], N77[D], S78[Q,G], 179 [A, T, Q] y L82 [Y] y al menos una inserción en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto preferido particular, las variantes de conformidad con la invención comprenden al menos una sustitución, en donde la sustitución se selecciona del grupo que consiste en L75[D,H], N76[S,D,Y], N77[D], S78[Q,G], 179 [A, T, Q] y L82 [Y] y al menos dos inserciones en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto preferido particular, las variantes de conformidad con la invención comprenden al menos una sustitución y al menos dos inserciones en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto aun más preferido, las variantes de conformidad con la invención comprenden al menos dos sustituciones en la región correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 de la SEQ ID NO: 2, en donde las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en L75[D,H], N76[S,D,Y], N77[D], S78[Q,G], 179 [A, T, Q] y L82 [Y] , en donde la variante adicionalmente comprende la inserción de dos residuos aminoacídicos en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde los residuos aminoacídicos insertados se seleccionan del grupo que consiste en Gly o Asp y en donde la región se extiende dos aminoácidos.

Por lo tanto, la invención se refiere a variantes de subtilasa que comprenden una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2, en donde cada alteración es independientemente una sustitución o inserción, y en donde la variante tiene al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. La invención adicionalmente se refiere a variantes de subtilasa que comprenden una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde cada alteración es independientemente una sustitución o inserción, y en donde la variante tiene al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. En otro aspecto, la invención se refiere a variantes de subtilasa que comprenden una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde cada alteración es independientemente una sustitución o inserción, y en donde la variante tiene al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 6. En una modalidad, la variante de conformidad con la invención es un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad con respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5 o una secuencia que codifica el polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6. En una modalidad, la variante de conformidad con la invención es un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 65% de identidad por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5.

Otra modalidad se relaciona con un método para obtener una variante de subtilasa que comprende introducir en una subtilasa progenitora una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde las alteraciones son independientemente sustituciones o inserciones; recuperar la variante y evaluar si la variante tiene actividad proteasa. Un aspecto particular se relaciona con un método para obtener una variante de subtilasa que comprende introducir en una subtilasa progenitora una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde las alteraciones son independientemente sustituciones o inserciones en donde la variante es una variante de una subtilasa progenitora que se selecciona del grupo que consiste en: a. un polipéptido que tiene al menos 60% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6; b. un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad baja con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; c. un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad con respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5, o la secuencia de ADNc del mismo; y d. un fragmento del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6, que tiene actividad proteasa.

Una modalidad particular se relaciona con un método que comprende introducir en una subtilasa progenitora una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la alteración es independientemente sustituciones o inserciones, en donde la variante es una variante de una subtilasa progenitora que tiene al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% o 100% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. Otra modalidad particular se relaciona con un método que comprende introducir en una subtilasa progenitora una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la alteración es independientemente sustituciones o inserciones, en donde la variante es una variante de una subtilasa progenitora que tiene al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% o 100% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. Otra modalidad particular se relaciona con un método que comprende introducir en una subtilasa progenitora una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la alteración es independientemente sustituciones o inserciones, en donde la variante es una variante de una subtilasa progenitora que tiene al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% o 100% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 6. En una modalidad particular, la variante de proteasa es una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO 4 que comprende la sustitución de dos o más aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad la invención, se refiere a una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO 4 que comprende la sustitución de dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en L75[D,H], N76[S,D,Y], N77 [D] , S78[Q,G], 179 [A, T, Q] y L82 [Y] . Una modalidad preferida se relaciona con una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO 4, que comprende la sustitución de dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la variante tiene al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

Una modalidad particularmente preferida se relaciona con una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO 4 que comprende una sustitución de dos, tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la sustitución se selecciona del grupo que consiste en L75[D,H], N76[S,D,Y], N77[D], S78[Q,G], 179 [A,T,Q] y L82 [Y] , en donde la variante adicionalmente comprende la inserción de dos residuos aminoacídicos en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde los residuos aminoacídicos insertados se seleccionan del grupo que consiste en Gly o Asp y en donde la variante tiene al menos 65% de identidad con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otra modalidad, la invención se refiere a una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO 2 que comprende la sustitución de dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2, en donde las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en L75[D,H]; N76[S,D,Y], N77 [D] , S78[Q,G], 179 [A, T, Q] y L82 [Y] , en donde la variante adicionalmente comprende la inserción de dos residuos aminoacídicos en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde los residuos aminoacídicos insertados se seleccionan del grupo que consiste en Gly o Asp y en donde la variante tiene al menos 65% de identidad con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

Una tercera modalidad se refiere a una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO 6, que comprende la sustitución de dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en L75[D,H], N76[S,D,Y], N77 [D] , S78[Q,G], 179 [A, T, Q] y L82 [Y] , en donde la variante adicionalmente comprende la inserción de dos residuos aminoacídicos en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde los residuos aminoacídicos insertados se seleccionan del grupo que consiste en Gly o Asp y en donde la variante tiene al menos 65% de identidad con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6.

La presente invención proporciona variantes de subtilasa que comprenden inserciones y/o sustituciones en una o más (por ejemplo, varias) posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. La invención también se relaciona con variantes de proteasa en donde la región correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 se ha extendido al menos un aminoácido. Además de la inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 también sustituciones en esta región resultaron en estabilidad mejorada del quelante en comparación con una proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de la variante pero que no tiene la o las alteraciones en una o más de las posiciones específicas o en comparación con una proteasa de referencia. Por lo tanto, la presente invención se refiere a variantes de subtilisinas que comprenden alteraciones en dos o más (por ejemplo, varias) posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la variante tiene actividad proteasa. Una modalidad de la invención se relaciona con una variante de subtilasa que comprende la inserción de uno o más aminoácidos combinados con sustituciones de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la variante tiene actividad proteasa. Una modalidad particular de la invención se relaciona con una variante de proteasa aislada que comprende una inserción de uno o más aminoácidos combinados con sustituciones de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la variante tiene una identidad secuencial de al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6.

En una modalidad, la variante comprende una sustitución en la posición correspondiente a la posición 75 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende una sustitución en la posición correspondiente a la posición 76 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende una sustitución en la posición correspondiente a la posición 77 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende una sustitución en la posición correspondiente a la posición 78 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende una sustitución en la posición correspondiente a la posición 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende una sustitución en la posición correspondiente a la posición 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 76 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 77 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 78 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 y 77 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 y 78 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 y 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77 y 78 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77 y 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 78 y 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 78 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende dos sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76 y 77 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76 y 78 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76 y 79 del polipeptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77 y 78 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77 y 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77, 78 y 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77, 78 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende tres sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende cuatro sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77 y 78 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende cuatro sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77 y 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende cuatro sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende cuatro sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77, 78 y 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende cuatro sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77, 78 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende cuatro sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende cinco sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78 y 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En una modalidad, la variante comprende cinco sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende cinco sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la variante comprende seis sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, el número total de alteraciones en las variantes de la presente invención es 1-20, por ejemplo, 1-10 y 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 alteraciones.

En otro aspecto, una variante de conformidad con la invención comprende una alteración en una o más (por ejemplo, varias) posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, una variante de conformidad con la invención comprende una alteración en dos posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, una variante de conformidad con la invención comprende una alteración en tres posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, una variante de conformidad con la invención comprende una alteración en cuatro posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2. En otro aspecto, una variante de conformidad con la invención comprende una alteración en cinco posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, una variante de conformidad con la invención comprende una alteración en cada posición correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, la variante comprende o está constituida por una alteración en una posición correspondiente a la posición 75. En otro aspecto, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 75 se sustituye por Asp o His, preferiblemente por His. En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución L75H del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. En un aspecto particular la variante comprende L75H y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, la variante comprende o está constituida por una alteración en una posición correspondiente a la posición 76. En otro aspecto, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 76 se sustituye por Ser, Asp o Tyr, preferiblemente por Ser. En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución N76S del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. En un aspecto particular la variante comprende N76S y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, la variante comprende o está constituida por una alteración en una posición correspondiente a la posición 77. En otro aspecto, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 77 se sustituye por Asp. En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución N77D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. En un aspecto particular la variante comprende N77D y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, la variante comprende o está constituida por una alteración en una posición correspondiente a la posición 78. En otro aspecto, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 78 se sustituye por Gln o Gly, preferiblemente por Gly. En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. En un aspecto particular la variante comprende S78G y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, la variante comprende o está constituida por una alteración en una posición correspondiente a la posición 79. En otro aspecto, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 79 se sustituye por Ala, Gln o Tyr, preferiblemente por Gln. En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. En un aspecto particular la variante comprende I79Q y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, la variante comprende o está constituida por una alteración en una posición correspondiente a la posición 82. En otro aspecto, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 82 se sustituye por Tyr. En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. En un aspecto particular la variante comprende L82Y y adicionalmente comprende una inserción de al menos un aminoácido en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

Las inserciones pueden ser cualquiera de las siguientes: al menos una inserción entre la posición 75 y 76 (*75) , al menos una inserción entre la posición 76 y 77 (*76) , al menos una inserción entre la posición 77 y 78 (*77), al menos una inserción entre 78 y 79 (*78) , al menos una inserción entre la posición 79 y 80 (*79) , al menos una inserción entre la posición 80 y 81 (*80) , al menos una inserción entre la posición 81 y 82 (*81) cuando se numera de conformidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID NO 2. Aun más preferiblemente las inserciones se seleccionan del grupo que consiste en: *75aG, *75aD, *75aG + *75bD, *75aD + *75bG, *75aD + *75bD, *75aG + *75bG; *76aG, *76aD, *76aG + *76bD, *76aD + *76bG, *76aD + *76bD, *76aG + *76bG; *77aG, *77aD, *77aG + *77bD, *77aD + *77bG, *77aD + *77bD, *77aG + *77bG; *78aG, *78aD, *78aG + *78bD, *78aD + *78bG, *78aD + *78bD, *78aG + *78bG; *79aG, *79aD, *79aG + *79bD, *79aD + *79bG, *79aD + *79bD, *79aG + *79bG; *80aG, *80aD, *80aG + *80bD, *80aD + *80bG, *80aD + *80bD, *80aG + *80bG; *81aG, *81aD, *81aG + *81bD, *81aD + *81bG, *81aD + *81bD, *81aG + *81bG.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por una alteración en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 76, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 77, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 78, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 y 77, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 y 78, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77 y 78, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 78 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 78 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 79 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76 y 77, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76 y 78, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 77 y 78, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 77 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 77 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 78 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 78 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 79 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77 y 78, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 , 77 y 79 , como aquel las descritas anteriormente .

En otro aspecto , la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 , 77 y 82 , como aquellas descritas anteriormente .

En otro aspecto , la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 , 78 y 79 , como aquellas descritas anteriormente .

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 , 78 y 82 , como aquellas descritas anteriormente .

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76 , 79 y 82 , como aquellas descritas anteriormente .

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77 , 78 y 79, como aquellas descritas anteriormente .

En otro aspecto , la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77 , 78 y 82 , como aquellas descritas anteriormente .

En otro aspecto , la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77, 79 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 78, 79 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77 y 78, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77, 78 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77, 78 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 78, 79 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 77, 78, 79 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78 y 79, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 76, 77, 78, 79 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82, como aquellas descritas anteriormente.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por una o más (por ejemplo, varias) sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste en L75[D,H], N76[S,D,Y], N77[D], S78[Q,G], 179 [A, T, Q] y L82 [Y] , preferiblemente las sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste en L75H, N76S, N77D, S78G, I79Q y L82Y y/o una o más {por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución L75H del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución N76S del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución L75H del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución N76S del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + I79Q + PL82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sus ituciones N76S + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más {por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + S78G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N77D + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N77D + S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + S78G + I79Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + S78G + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones N76S + N77D + S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por las sustituciones L75H + N76S + N77D + S78G + I79Q + L82Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 y una o más (por ejemplo, varias) inserciones en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

En donde las inserciones pueden ser cualquiera de las siguientes: al menos una inserción entre la posición 75 y 76 (*75) , al menos una inserción entre la posición 76 y 77 (*76) , al menos una inserción entre la posición 77 y 78 (*77) , al menos una inserción entre 78 y 79 (*78), al menos una inserción entre la posición 79 y 80 (*79) , al menos una inserción entre la posición 80 y 81 (*80) , al menos una inserción entre la posición 81 y 82 (*81) cuando se numera de conformidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID NO 2. Aun más preferiblemente las inserciones se seleccionan del grupo que consiste en: *75aG, *75aD, *75aG + *75bD, *75aD + *75bG, *75aD + *75bD, *75aG + *75bG; *76aG, *76aD, *76aG + *76bD, *76aD + *76bG, *76aD + *76bD, *76aG + *76bG; *77aG, *77aD, *77aG + *77bD, *77aD + *77bG, *77aD + *77bD, *77aG + *77bG; *78aG, *78aD, *78aG + *78bD, *78aD + *78bG, *78aD + *78bD, *78aG + *78bG; *79aG, *79aD, *79aG + *79bD, *79aD + *79bG, *79aD + *79bD, *79aG + *79bG; *80aG, *80aD, *80aG + *80bD, *80aD + *80bG, *80aD + *80bD, *80aG + *80bG; *81aG, *81aD, *81aG + *81bD, *81aD + *81bG, *81aD + *81bD, *81aG + *81bG.

Las variantes adicionalmente pueden comprender una o más alteraciones adicionales en una o más (por ejemplo, varias) posiciones diferentes.

Los cambios en los aminoácidos pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan considerablemente el plegamiento y/o actividad de la proteína; pequeñas deleciones, normalmente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones de extremo terminal amino o carboxilo, tales como un residuo de metionina de extremo terminal amino; un pequeño péptido enlazante de hasta 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación mediante el cambio de la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Algunos ejemplos de sustituciones conservadoras son las sustituciones dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos ( fenilalanina , triptófano y tirosina) y aminoácidos de bajo peso molecular (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . En la técnica existe constancia de sustituciones de aminoácidos que no alteran, generalmente, la actividad específica y han sido descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Asn/Gln, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Glu/Gln, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

De forma alternativa, los cambios en los aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades físico-químicas de los polipéptidos se ven alteradas. Por ejemplo, los cambios de los aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad por el sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.

Por ejemplo, las variantes pueden comprender dos alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 y adicionalmente comprende una alteración en cualquiera de las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en posiciones 167, 170, 191/ 261 y 262 (la numeración de conformidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2) . En una modalidad preferida la alteración en cualquiera de las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste en 167, 170, 191, 261 y 262 es una sustitución. En una modalidad preferida particular la variante de conformidad con la invención comprende dos alteraciones at una posición correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde al menos una de las alteraciones es una inserción y en donde la variante adicionalmente comprende una o más sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste en Y167A, R170S, A191N, N261D y L262Q.

En una modalidad de la invención, las variantes de conformidad con la invención comprenden o consisten en cualquiera de las siguientes variantes: L75D + *75aG + *75bG + N76S + N77D + S78G + I79A + V81I + L82Y L75D + *75aG + *75bG + N76S + N77D + S78Q + I79A + V81I + L82Y L75D + *75aG + *75bG + N76D + N77N + S78G + I79T + V81I + L82Y L75H + *75aG + *75bG + N76Y + N77D + S78G + I79Q + V81I + L82Y L75H + *75aG + *75bG + N76S + S78G + I79Q + L82Y + Y167A L75H + *75aG + *75bG + N76S + S78G + I79Q + L82Y + Q191N L75H + *75aG + *75bG + N76S + S78G + I79Q + L82Y + Y167A + R170S L75H + *75aG + *75bG + N76S + S78G + I79Q + L82Y + Y167A + R170S A194P L75H + *75aG + *75bG + N76S + S78G + I79Q + L82Y + N261D + L262Q L75H + *75aD + *75bG + N76S + S78G + I79Q + L82Y En donde *75aD y *75bG es inserción de Asp y Gly después de la posición 75 o entre la posición 75 y 76 en el bucle correspondiente a la posición 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO 2.

Los aminoácidos esenciales en un polipéptido pueden ser identificados de conformidad con los procedimientos que se conocen en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escaneo de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la técnica más reciente, se introducen mutaciones de una única alanina en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutadas resultantes se ensayan para determinar su actividad proteasa y para identificar los residuos aminoacídicos que son cruciales para la actividad de la molécula. Remítase también a Hilton et al., 1996, J". Biol . Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede determinarse por análisis físico de la estructura, tal como se determina mediante técnicas tales como resonancia nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetado por fotoafinidad, junto con la mutación de los aminoácidos del sitio de contacto putativo. Remítase, por ejemplo, a de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J". Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett . 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también se puede deducir a partir de una alineación con un polipéptido relacionado. Para BPN' (polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2) la tríada catalítica que comprende los aminoácidos S221, H64, y D32 es esencial para la actividad proteasa de la enzima.

Las variantes pueden consistir en 200 a 900 aminoácidos, por ejemplo, 210 a 800, 220 a 700, 230 a 600, 240 a 500, 250 a 400, 255 a 300, 260 a 290, 265 a 285, 270 a 280 o 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279 o 280 aminoácidos.

En una modalidad, la variante tiene actividad catalítica mejorada en comparación con la enzima original.

En una modalidad, la variante tiene estabilidad de quelante mejorada en comparación con la enzima original o en comparación con una proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de la variante pero que no tiene las alteraciones en una o más de las posiciones especificadas o en comparación con una proteasa de referencia, en donde la estabilidad del quelante se mide tal como se describe en el ejemplo 2 en "Materiales y métodos" en la presente.

Proteasas originales Las enzimas que escinden los enlaces de amida en sustratos proteicos se clasifican como proteasas o (indistintamente) peptidasas (ver Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capítulo 3) .

Proteasas de serina Una proteasa de serina es una enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos y en la que hay un residuo de serina esencial en el sitio activo ( hite, Handler and Smith, 1973 "Principies of Biochemistry" , Quinta Edición, McGraw-Hill Book Company, NY, páginas 271-272) .

Las proteasas de serina bacterianas tienen pesos moleculares en el intervalo de 20,000 a 45,000 Daltones. Son inhibidas por diisopropilfluorofosfato. Hidrolizan los ésteres de extremo terminal simples y son similares en actividad a la quimotripsina eucariota, también una proteasa de serina. Un término más estrecho, proteasa alcalina, que cubre un subgrupo, refleja el pH alto óptimo de las algunas de las proteasas de serina, de pH 9.0 a 11.0 (ver una reseña en Priest (1977) Bacteriological Rev. 41711-753) .

Subtilasas Un subgrupo de las proteasas de serina tentativamente designado subtilasas ha sido propuesto por Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Se definen mediante un análisis por homología de más de 170 secuencias de aminoácidos de proteasas de serina a las que previamente se les denominó proteasas tipo subtilisina. Una subtilisina se definía a menudo anteriormente como una proteasa de serina producida por bacterias u hongos Gram-positivos , y de conformidad con Siezen et al. ahora es un grupo de las subtilasas. Se ha identificado una amplia variedad de subtilasas, y se ha determinado la secuencia de aminoácidos de varias subtilasas. Para una descripción más detallada de las subtilasas y sus secuencias de aminoácidos, se remite al lector a Siezen et al. (1997).

Un subgrupo de subtilasas, I-Sl o subtilisinas "verdaderas", comprende subtilisinas "clásicas", tal como la subtilisina 168 (BSS168) , la subtilisina ???', la subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, NOVOZYMES A/S) y la subtilisina DY (BSSDY) . BPN' es la subtilisina BPN' de B. amiloliquefaciens . BPN' corresponde al polipéptido maduro de la SEQ ID NO 2, es decir, los aminoácidos 1 a 275 de la SEQ ID NO 2.

Otro subgrupo reconocido de las subtilasas, I-S2 o subtilisinas altamente alcalinas, es reconocido por Siezen et al. (supra) . Las proteasas del subgrupo I-S2 se describen como subtilisinas altamente alcalinas y comprenden enzimas tales como la subtilisina PB92 (BAALKP) (MAXACAL® , Genencor International Inc.), la subtilisina 309 (SAVINASE®, NOVOZYMES A/S) , la subtilisina 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVOZYMES A/S) y la elastasa alcalina YaB (BSEYAB) .

Subtilisinas Las subtilisinas son proteasas de serina de la familia S8, en particular de la subfamilia S8A, tal como se define mediante la base de datos MEROPS (http : //merops . sanger . ac . uk/cgi-bin/famsum?family=S8) .

BPN' y Savinasa tienen los números de MEROPS S08.034 y S08.003, respectivamente.

Subtilasa original La expresión "subtilasa original" describe una subtilasa definida de conformidad con Siezen et al. (1991 y 1997) . Por más detalles, ver la descripción de "Subtilasas" anterior. Una subtilasa original puede ser también una subtilasa aislada de una fuente natural, en donde las modificaciones posteriores se realizaron manteniendo la característica de una subtilasa. Asimismo, una subtilasa original puede ser una subtilasa que se ha preparado por medio de la técnica de reordenamiento de ADN, tal como lo describe J.E. Ness et al., Nature Biotechnology, 17, 893-896 (1999) .

Alternativamente, la expresión "subtilasa original" puede denominarse "subtilasa de origen natural" .

Como referencia, se proporciona una tabla de las abreviaturas para varias subtilasas mencionadas en la presente; por más abreviaturas, ver Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523.

Tabla III Organismo enzima abreviatura Bacterias: Gram-positiva Bacillus subtilis 168 subtilisina BSS168 1168, apr Bacillus subtilisina BPN' BASBPN amyloliquefaciens (NOVO) Bacillus subdlis DY subtilisina DY BSSDY Bacillus licheniformis subtilisina BLSCAR Carlsberg Bacillus lentus subtilisina 309 BLSAVI Bacillus lentus subtilisina 147 BLS147 Bacillus alcalophilus subtilisina PB92 BAPB92 PB92 Bacillus YaB elastasa alcalina BYSYAB YaB Bacillus sp. NKS-21 subtilisina ALP I BSAPRQ Bacillus sp. G-825-6 subtilisina Sendai BSAPRS Thermoactinomyces termitasa TVTHER vulgaris Modificación (es) de una subtilasa El término "modificación (es) " que se utiliza en la presente se define para incluir una modificación química de una subtilasa así como una manipulación genética del ADN que codifica una subtilasa. La(s) modificación (es) puede (n) ser (un) reemplazo (s) de la(s) cadena (s) de aminoácidos, sustitución (es) , deleción(es) y/o inserción (es) en el/los aminoácido (s) de interés.

Variante de subtilasa El término "variante" y la expresión "variante de subtilasa" se definen anteriormente.

Secuencias de subtilasa homologas La homología entre dos secuencias de aminoácidos se describe en este contexto por el parámetro "identidad" a los efectos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch tal como se describió anteriormente. El resultado de la rutina es además de la alineación de los aminoácidos el cálculo de la "Identidad porcentual" entre dos secuencias.

En base a esta descripción es de rutina para un experto en la técnica identificar las subtilasas homologas adecuadas, que pueden modificarse de conformidad con la invención.

Variantes de subtilasa básicamente homologas pueden tener una o más (varias) sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos; en el presente contexto, la expresión "una o más" se utiliza indistintamente con el término "varias" . Estos cambios son preferiblemente de naturaleza menor, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras tal como se describió anteriormente y otras sustituciones que no afectan considerablemente el plegamiento tridimensional o la actividad de la proteína o polipeptido; pequeñas deleciones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones de extremo terminal amino o carboxilo, tal como un residuo de metionina de extremo amino-terminal, un pequeño péptido enlazante de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad) , tal como un tracto de polihistidina, o proteína A (Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol . 198: 3. Remítase también, en general, a Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

A pesar de que los cambios descritos anteriormente preferiblemente son de naturaleza menor, los cambios también pueden ser importantes, tal como una fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más como extensiones de extremo terminal amino o carboxilo.

La subtilasa original puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad proteasa. En un aspecto, la subtilasa progenitora comprende o está compuesta por la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

La subtilasa progenitora puede ser (a) un polipéptido que tiene al menos 65% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad media o alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5, (ii) una secuencia que codifica el polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; o (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad secuencial con respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5.

En un aspecto, el progenitor tiene una identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6 de al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% o 100%, que tienen actividad proteasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor difiere en no más de 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9, del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6.

En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por aminoácidos 1 a 275 de la SEQ ID NO : 2. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por aminoácidos 1 a 269 de la SEQ ID NO: 4. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por aminoácidos 1 a 274 de la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto, el progenitor es un fragmento del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6 que contiene al menos 202 residuos aminoacídicos , por ejemplo, desde la posición 28 a 230 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6.

En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6.

En otro aspecto, el progenitor es codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad muy baja, condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, o condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5, (ii) una secuencia que codifica el polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) , (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York) .

El polinucleótido de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5 o una secuencia del mismo, así como el polipéptido de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6 o un fragmento del mismo pueden utilizarse para diseñar sondas de ácido nucleico para identificar y clonar ADN que codifique un progenitor a partir de cepas de diferentes géneros o especies de conformidad con métodos bien conocidos en la técnica. En particular, este tipo de sondas se pueden utilizar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo procedimientos estándar de Southern Blot, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en este. Las sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deberían tener al menos 15, p. ej., al menos 25, al menos 35, o al menos 70 nucleótidos en longitud. Preferentemente, la sonda de ácido nucleótido tiene al menos 100 nucleótidos en longitud, p. ej . , al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, , al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos, o al menos 900 nucleótidos en longitud. Se pueden utilizar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas suelen etiquetarse para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina) . La presente invención abarca este tipo de sondas.

Se puede cribar una colección de ADN genómico o ADNc preparada a partir de otras cepas de este tipo para detectar ADN que se hibride con las sondas descritas anteriormente y que codifique un progenitor. El ADN genómico o de otro tipo procedente de otras cepas de este tipo se puede separar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, o mediante otras técnicas de separación. El ADN de las colecciones o el ADN separado se puede transferir a nitrocelulosa u otro material portador adecuado e inmovilizarlo sobre este. Con el fin de identificar un clon o ADN que se híbrida con las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5 o una subsecuencia de las mismas, el material portador se utiliza en una Southern Blot .

A los efectos de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido se híbrida con una sonda de ácido nucleico etiquetada que corresponde a las (i) SEQ ID NOS: 1, 3 o 5; (ii) la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5; (iii) una secuencia que codifica el polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6; (iv) el complemento de longitud completa del mismo; o (v) una secuencia del mismo; en condiciones de rigurosidad muy baja a muy alta. Las moléculas con las cuales se híbrida la sonda de ácido nucleico en estas condiciones se pueden detectar utilizando, por ejemplo, una película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la técnica.

En un aspecto, la sonda de ácido nucleico es la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleótido es un fragmento de 80 a 1140 nucleótidos de longitud de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5, por ejemplo 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o 1100 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6; el polipéptido maduro del mismo; o un fragmento del mismo. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es SEQ ID NOS: 1, 3 o 5 o una secuencia que codifica el polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6 respectivamente.

En otra modalidad, el progenitor es codificado por un polinucleótido que tiene una identidad secuencial con respecto a la secuencia codificante del polinucleótido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5 de al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% o 100%.

El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el cual una región de un polipéptido se fusiona con el extremo N o el extremo C de una región de otro polipéptido.

El progenitor puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible en el cual se fusiona otro polipéptido con el extremo N o el extremo C del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido con un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son de uso común en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en fase y que la expresión del polipéptido de fusión esté controlada por el mismo promotor o promotores y el mismo terminador. Los polipéptidos de fusión también pueden construirse usando una tecnología de inteínas en la que los polipéptidos de fusión se crean posteriormente a la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

Un polipéptido de fusión también puede comprender un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. Tras la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Ejemplos de los sitios de escisión incluyen, a modo no taxativo, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol . Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl . Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnologry 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotec nology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

El progenitor se puede obtener a partir de microorganismos de cualquier género. A los efectos de la presente invención, la expresión "obtener/obtenido a partir de", tal como se utiliza en la presente en relación con una fuente determinada, significará que el progenitor codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la cual se ha insertado el polinucleótido procedente de la fuente. En un aspecto, el progenitor se secreta extracelularmente .

El progenitor puede ser una proteasa bacteriana. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipéptido bacteriano Gram-positivo tal como una proteasa de Bacillus, Clostridixm, Enterococcus , Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus , Oceanobacillus , Staphylococcus , Streptococcus o Streptomyces, o un polipéptido bacteriano Gram-negat ivo tal como una proteasa de Campylobacter, E. coli, Flavobacteri m, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria , Pseudomonas , Salmonella o Ureaplasma .

En un aspecto, el progenitor es una proteasa de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus wgaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis .

En un aspecto, el progenitor es una proteasa de Bacillus amyloliquefaciens , por ejemplo, la proteasa de la SEQ ID NO : 2 o el polipéptido maduro de esta. En un aspecto, el progenitor es una proteasa de Bacillus lentus , por ejemplo, la proteasa de la SEQ ID NO: 4 o el polipéptido maduro de esta. En un aspecto, el progenitor es una proteasa de Bacillus licheniformis, por ejemplo, la proteasa de la SEQ ID NO: 6 o el polipéptido maduro de esta.

Las cepas de estas especies son de dominio público y se puede acceder a ellas fácilmente en una serie de colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .

El progenitor se puede identificar y obtener a partir de otras fuentes, que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej . , el suelo, compost, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente a partir de materiales naturales (p. ej . , el suelo, compost, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales son de uso común en la técnica. A continuación, se puede obtener un polinucleótido que codifica un progenitor cribando de manera similar una colección de ADN genómico o de ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mixto. Una vez que se ha detectado el polinucleótido que codifica un progenitor con la o las sondas, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que son de uso común para los expertos en la técnica (remítase, por ejemplo, a Sambrook et al., 1989, supra) .

Preparación de las variantes La presente invención también se refiere a métodos para obtener una variante que tiene actividad proteasa que comprenden: (a) introducir en una subtilasa progenitora alteraciones en dos o más (por ejemplo, varias) posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la variante tiene actividad proteasa; y (b) recuperar la variante.

Las variantes se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica tal como la mutagénesis dirigida al sitio, la construcción de genes sintéticos, la construcción de genes semisintéticos , la mutagénesis aleatoria, el reordenamiento, etc.

La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica en la cual se introducen una o más (por ej'empo, varias) mutaciones en uno o más sitios definidos de un polinucleótido que codifica el progenitor.

La mutagénesis dirigida al sitio se puede llevar a cabo in vitro mediante PCR que implica el uso de cebadores oligonucleotídicos que contienen la mutación deseada. La mutagénesis dirigida al sitio también se, puede llevar a cabo in vitro mediante mutagénesis de cásete, que implica la escisión mediante una enzima de restricción en un sitio del plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el progenitor y la ligación posterior de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Normalmente, la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, lo cual permite obtener extremos adhesivos del plásmido y la inserción para ligar el uno con el otro. Ver, por ej . , Scherer and Davis, 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

La mutagénesis dirigida al sitio también se puede llevar a cabo in vivo mediante métodos conocidos en la técnica. Remítase, p. ej . , a la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2004/0171154; Storici et al., 2001, iVature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat . Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet . Newslett . 43: 15-16.

En la presente invención, se puede utilizar cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Existen muchos kits comerciales disponibles que se pueden utilizar para preparar las variantes .

La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitrode una molécula de polinucleótido diseñada para que codifique un polipéptido de interés. La síntesis de genes se puede llevar a cabo utilizando una serie de técnicas tales como la tecnología basada en microchips multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares en las cuales los oligonucleótidos se sintetizan y acoplan en chips microfluídicos fotoprogramables .

Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de un único aminoácido o de múltiples aminoácidos se pueden realizar y evaluar utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o reordenamiento, seguidos de un procedimiento de detección sistemática relevante, tal como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc . Nati. Acad. Sci . Estados Unidos 86: 2152-2156; WO 95/17413 o WO 95/22625. Otros métodos que pueden utilizarse incluyen PCR susceptible a errores, expresión de bacteriófagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente de EE . UU. N.° 5.223.409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127) .

Los métodos de mutagénesis/transposición pueden combinarse con métodos de detección automática de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células hospederas (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican los polipéptidos activos pueden recuperarse de las células hospederas y secuenciarse rápidamente usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoacídicos individuales en un polipéptido.

La construcción de genes semisintéticos se consigue combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos y/o mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria y/o reordenamiento. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos polinucleotídicos que se sintetizan de forma combinada con técnicas de PCR. De este modo, las regiones definidas de los genes se pueden sintetizar de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar utilizando cebadores mutagénicos específicos para un sitio, mientras que otras regiones más se pueden someter a PCR propensa a error o amplificación por PCR no propensa a error. A continuación, las subsecuencias de polinucleótidos se pueden reorganizar.

Polinucleótidos La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican una variante de la presente invención.

Constructos de ácidos nucleicos La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención ligado operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Los polinucleótidos se pueden manipular de diferentes maneras para hacer posible la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante son de uso común en la técnica .

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que sea reconocido por una célula hospedadora para la expresión del polinucléotido . El promotor contiene secuencias de control de la transcripción que regulan la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora, incluidos los promotores híbridos, truncados y mutados, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos intracelulares o extracelulares , tanto homólogos como heterólogos respecto a la célula hospedadora.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera bacteriana son los promotores obtenidos del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (a yL) , gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus {amyM) , gen de la levansacarosa de Bacillus subtilis (sacB) , genes XylA y xylBde <429Bacillus subtilis, gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operón lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gen agarasa de Streptomyces coelicolor {dagA) y gen beta-lactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 80: 21-25). Promotores adicionales se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. En WO 99/43835 se describen ejemplos de promotores tándem.

La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, el cual es reconocido por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está ligada operablemente al extremo 31 del polinucleótido que codifica la variante. Se puede utilizar cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora .

Los terminadores preferidos para las células hospedadoras bacterianas se obtienen a partir de los genes para la proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH) , alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) y ARN ribosómico de Escherichia coli {rrnB) .

La secuencia testigo también puede ser una región estabilizadora de AR m corriente abajo de un promotor y corriente arriba de la secuencia codificadora de un gen que aumenta la expresión del gen.

Ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas se obtienen de un gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis ( O 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

La secuencia testigo también puede ser una región que codifica un péptido señal, la cual codifica un péptido señal ligado al extremo N de una variante y dirige la variante hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia que codifica el polinucleótido puede contener de manera intrínseca una secuencia que codifica un péptido señal ligada de manera natural en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica la variante. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia que codifique un péptido señal que sea exógena con respecto a la secuencia codificante. Una secuencia que codifica el péptido señal exógena puede ser necesaria cuando la secuencia codificante no contenga de manera natural ninguna secuencia que codifique un péptido señal. De manera alternativa, una secuencia que codifica un péptido señal exógena puede simplemente reemplazar la secuencia que codifica el péptido señal natural con el fin de mejorar la secreción de la variante. Sin embargo, se puede utilizar cualquier secuencia que codifique un péptido señal que dirija la variante expresada hacia la vía secretora de una célula hospedadora.

Las secuencias que codifican péptidos señal eficaces para células hospederas bacterianas son las secuencias que codifican péptidos señal obtenidas a partir de los genes de la amilasa maltogénica NCIB 11837 de Bacillus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermqphilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, npiM) y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal se describen en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

La secuencia testigo también puede ser una secuencia que codifique un propéptido, la cual codifica un propéptido situado en el extremo N de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Generalmente, un propolipéptido es inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo mediante la escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La secuencia de codificación de propéptidos puede obtenerse de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE) , proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT) , lacasa de Myceliophthora ther ophila (WO 95/33836) , proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae .

Cuando tanto la secuencia del propéptido como la del péptido señal están presentes, la secuencia del propéptido se coloca a continuación del extremo N de la variante y la secuencia del péptido señal se coloca a continuación del extremo N de la secuencia del propéptido.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión de la variante en función del crecimiento de la célula hospedadora . Algunos ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que provocan la expresión del gen que se ha de activar o desactivar como respuesta a un estímulo físico o químico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procariotas incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp .

Vectores de expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención, un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los diferentes nucleótidos y secuencias de control se pueden unir entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en este tipo de sitios. Como alternativa, el polinucleótido se puede expresar insertando el polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprenda el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se sitúa en el vector de modo que la secuencia codificante esté ligada operablemente a las secuencias de control adecuadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede someterse de forma conveniente a procedimientos de ADN recombinante y puede dar origen a la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual se vaya a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, <<48les decir, un vector que existe como entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación . De forma alternativa, el vector puede ser un vector que, cuando se introduce en la célula hospedera, se integra al genoma y se replica junto con el o los cromosomas a los que se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido, o se pueden utilizar dos o más vectores o plásmidos que contengan de forma conjunta el ADN total que se ha de introducir en el genoma de la célula hospedera, o se puede utilizar un transposón .

El vector contiene preferentemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección sencilla de las células transformadas, transfectadas , transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a virus o biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a los auxótrofos y similares.

Algunos ejemplos de orígenes de marcadores seleccionables son los genes dal de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis o marcadores que confieren resistencia a los antibióticos tal como resistencia a la ampicilina, cloranfenicol , kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina.

El vector contiene preferentemente uno o más elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedera o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa. De manera alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera en una o más ubicaciones concretas en el o los cromosomas . Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación concreta, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como entre 100 y 10 000 pares de bases, entre 400 y 10 000 pares de bases y entre 800 y 10 000 pares de bases, que posean un grado de identidad secuencial elevado respecto a la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de una recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia diana en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector puede estar integrado al genoma de la célula hospedera mediante recombinación no homologa.

Para la replicacion autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicacion que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedera en cuestión. El origen de replicacion puede ser cualquier replicador plasmídico que regule la replicacion autónoma que esté en funcionamiento en una célula. La expresión "origen de replicacion" o "replicador plasmídico" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

Algunos ejemplos de orígenes de replicacion bacterianos son los orígenes de replicacion de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184, que permiten la replicacion en E. coli, y pUBUO, pE194, pTA1060 y pAMSl , que permiten la replicacion en Bacillus .

Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora para incrementar la producción de una variante. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido al integrar al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera o al incluir un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contengan copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, por lo tanto, copias adicionales del polinucleótido, se puedan seleccionar mediante el cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos para un experto en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) .

Células hospederas La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención ligado operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Se introduce un constructo o vector que comprende un polinucleótido en una célula hospedera, de modo que el constructo o vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico capaz de autorreplicarse, tal como se describió anteriormente. La expresión "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula original que no sea idéntica a la célula original debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran medida del gen que codifica la variante y su fuente.

La célula hospedera puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, una célula procariota o eucariota.

La célula hospedadora procariota puede ser cualquier bacteria Gram-positiva o Gram-negativa . Bacterias Gram-positivas incluyen, a modo no taxativo, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Bacterias Gram-negativas incluyen, a modo no taxativo, Carrpylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.

La célula hospedera bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus incluyendo, a modo no taxativo, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearotherwophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis .

La célula hospedera bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus incluyendo, a modo no taxativo, las células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus .

La célula hospedera bacteriana puede ser también cualquier célula de Streptomyces, incluyendo, a modo no taxativo, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans .

La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar mediante la transformación de protoplastos (ver por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Mol. Gen. Genet . 168: 111-115) , transformación de células competentes (ver, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol . 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J". Mol. Biol . 56: 209-221), electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J". Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede efectuarse por transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (ver, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145) . La introducción de ADN en una célula Streptomyces se puede efectuar mediante la transformación de protoplastos, electroporación (ver, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol . (Praha) 49: 399-405), conjugación (ver, por ejemplo,, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) o transducción (ver, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula Pseudomonas se puede efectuar mediante electroporación (ver, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o conjugación (ver, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl . Environ. Microbiol . 71: 51-57) . La introducción de ADN en una célula Streptococcus se puede efectuar mediante competencia natural (ver, por ejemplo, Perry y uramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297) , transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporación (ver, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugación (ver, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedera.

Métodos de producción La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante, que comprenden: (a) cultivar una célula hospedadora de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperar la variante.

Las células hospedadoras se cultivan en un medio de nutrientes adecuado para la producción de la variante utilizando métodos de uso común en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante el cultivo en un matraz agitado o la fermentación a pequeña escala o gran escala (incluidas las fermentaciones continua, discontinua, por lote alimentado o de estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales, llevada a cabo en un medio adecuado y en condiciones que permitan que la variante se exprese y/o se aisle. El cultivo se lleva a cabo en un medio de nutrientes adecuado, que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, mediante la utilización de procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de conformidad con las composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de Colección de Cultivos tipo de Estados Unidos) . Si la variante se secreta al medio de nutrientes, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar a partir de los lisados celulares.

La variante se puede detectar utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para las variantes con actividad proteasa. Estos métodos de detección incluyen, sin carácter limitante, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.

La variante se puede recuperar utilizando métodos de uso común en la técnica. Por ejemplo, la variante se puede recuperar del medio de nutrientes mediante procedimientos convencionales, que incluyen, sin carácter limitante, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación.

La variante se puede purificar mediante varios procedimientos de uso común en la técnica, que incluyen, sin carácter limitante, cromatografía (p. ej . , de intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej . , isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (p. ej . , precipitación con sulfato amónico) , SDS-PAGE o extracción (remítase, p. ej . , a Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.

En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que en su lugar se utiliza una célula hospedadora de la presente invención que expresa la variante como fuente de la variante.

Composiciones En cierto aspecto, las variantes de conformidad con la invención tienen estabilidad de quelante mejorada en comparación con la enzima progenitora, en comparación con una proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de la variante pero que no tiene las alteraciones en una o más de las posiciones específicas o en comparación con una proteasa de referencia, en donde la estabilidad con respecto a los quelantes se mide en el ejemplo 2 tal como se describe en "Materiales y métodos" en la presente.

Por lo tanto, en una modalidad preferida, la composición es una composición detergente, y un aspecto de la invención se refiere al uso de una composición detergente que comprende una variante de conformidad con la invención en un proceso de limpieza, tal como lavado de ropa o limpieza de superficies duras.

La elección de los componentes adicionales se encuentra dentro de las competencias del experto e incluye ingredientes convencionales, incluidos los componentes ilustrativos no limitantes que se exponen a continuación. La elección de los componentes puede incluir, para el cuidado de telas, tener en cuenta el tipo de tela que se ha de limpiar, el tipo y/o grado de suciedad, la temperatura a la cual va a tener lugar la limpieza y la formulación del producto detergente. Aunque los componentes que se mencionan a continuación están clasificados según un título general de conformidad con una funcionalidad particular, esto no debe interpretarse como una limitación, ya que un componente puede comprender funcionalidades adicionales que el experto en la técnica podrá apreciar.

Enzima de la presente invención En una modalidad de la presente invención, las variantes de la presente invención pueden agregarse a una composición detergente en una cantidad correspondiente a 0.001-100 mg de proteína, tal como 0.01-100 mg de proteína, preferiblemente 0.005-50 mg de proteína, más preferiblemente 0.01-25 mg de proteína, aun más preferiblemente 0.05-10 mg de proteína, más preferiblemente 0.05-5 mg de proteína y más preferiblemente 0.01-1 mg de proteína por litro de solución de lavado.

La o las enzimas de la composición detergente pueden estabilizarse mediante el uso de agentes estabilizadores convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático o derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4-formifenil borónico, y la composición puede formularse tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 92/19709 y WO 92/19708 o las variantes de conformidad con la invención pueden estabilizarse utilizando aldehidos peptídicos o cetonas tal como se describe en el documento WO2005/105826 y WO2009/118375.

Una variante de la presente invención también puede incorporarse en las formulaciones de detergente descritas en el documento WO97/07202, que se incorpora a la presente a modo de referencia.

Tensioactivos La composición detergente puede comprender uno o más tensioactivos, los cuales pueden ser aniónicos y/o catiónicos y/o no iónicos y/o semipolares y/o zwiteriónicos o una mezcla de estos. En una modalidad particular, la composición detergente incluye una mezcla de uno o más tensioactivos no iónicos y uno o más tensioactivos aniónicos. El o los tensioactivos están presentes normalmente en un nivel comprendido entre aproximadamente un 0.1% y un 60% en peso, tal como entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40%, o entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 20%, o entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 10%. El o los tensioactivos se seleccionan en función de la aplicación de limpieza deseada e incluyen cualquier o cualesquiera tensioactivos convencionales conocidos en la técnica. Se puede utilizar cualquier tensioactivo conocido en la técnica por su utilización en detergentes.

Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40% en peso, tal como entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 30%, incluido entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 15%, o entre aproximadamente un 20% y aproximadamente un 25% de un tensioactivo aniónico. Los ejemplos no limitantes de tensioactivos aniónicos incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, alquilbencenosulfonatos lineales (LAS) , isómeros de LAS, alquilbencenosulfonatos ramificados (BABS) , fenilalcanosulfonatos , alfa-olefinsulfonatos (AOS) , olefinsulfonatos , alquenosulfonatos , alcano-2 , 3-diilbis (sulfatos) , hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos, alquilsulfatos (AS) tales como dodecilsulfato sódico (SDS) , sulfatos de alcoholes grasos (FAS) , sulfatos de alcoholes primarios (PAS) , étersulfatos de alcoholes (AES o AEOS o FES, también conocidos como etoxisulfatos de alcoholes o étersulfatos de alcoholes grasos) , alcanosulfonatos secundarios (SAS) , sulfonatos de parafina (PS) , sulfonatos de ésteres, ésteres de glicerol y ácidos grasos sulfonados, ésteres metílicos de ácidos grasos alfa-sulfonados (alfa-SFMe o SES) incluido el sulfonato de un éster metílico (MES) , ácido alquil- o alquenilsuccínico, ácido dodecenil/tetradecenilsuccínico (DTSA) , derivados de tipo ácido graso de aminoácidos, diésteres y monoésteres del ácido sulfosuccínico o jabón y combinaciones de estos.

Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40% en peso de un tensioactivo catiónico. Los ejemplos no limitantes de tensioactivos catiónicos incluyen alquildimetiletanolamina cuaternaria (ADMEAQ) , bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) , cloruro de dimetildiestearilamonio (DSDMAC) y alquilbencildimetilamonio y combinaciones de estos, compuestos de alquilamonio cuaternario y amonio cuaternario alcoxilado (AQA) .

Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 0.2% y aproximadamente un 40% en peso de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, entre aproximadamente un 0.5% y aproximadamente un 30%, en particular entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 20%, entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 10%, tal como entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 5% o entre aproximadamente un 8% y aproximadamente un 12%. Los ejemplos no limitantes de tensioactivos no iónicos incluyen los etoxilatos de alcoholes (AE o AEO) , propoxilatos de alcoholes, alcoholes grasos propoxilados (PFA) , esteres alquílicos de ácidos grasos alcoxilados, tales como ésteres alquílicos de ácidos grasos propoxilados y/o etoxilados, etoxilatos de alquilfenol (APE) , etoxilatos de nonilfenol (NPE) , alquilpoliglucósidos (APG) , aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácidos grasos (FAM) , dietanolamidas de ácidos grasos (FADA) , monoetanolamidas de ácidos grasos etoxilados (EFAM) , monoetanolamida de ácidos grasos propoxilados (PFAM) , amidas de ácidos grasos polihidroxialquílieos o derivados de tipo N-acilo o N-alquilo de glucosamina (glucamidas, GA, o glucamida de ácidos grasos, FAGA) , así como productos disponibles con los nombres comerciales SPA y TWEEN, y combinaciones de estos.

Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40% en peso de un tensioactivo semipolar. Ejemplos no taxativos de tensioactivos semipolares incluyen óxidos de amina (OA) tales como alquildimetilaminóxido, N- (coco alquil) -N,N-dimetolaminóxido y N- (sebo-alquil) -N,N-bis (2-hidroxietil) aminóxido, alcanolamidas de ácido graso y alcanolamidas de ácido graso etoxilado y combinaciones de los mismos .

Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40% en peso de un tensioactivo zwiteriónico . Los ejemplos no limitantes de tensioactivos zwiteriónicos incluyen betaína, alquildimetilbetaína y sulfobetaína, y combinaciones de estos Hidrótropos Un hidrótropo es un compuesto que solubiliza compuestos hidrófobos en soluciones acuosas (o, al contrario, sustancias polares en un entorno no polar) . Normalmente, los hidrótropos tienen un carácter tanto hidrófilo como hidrófobo (denominadas propiedades anfifílicas tal como se conocen a partir de los tensioactivos) ; sin embargo, la estructura molecular de los hidrótropos generalmente no favorece la autoglomeración espontánea, remítase, por ejemplo, a una reseña de Hodgdon y Kaler (2007) , Current Opinión en Colloid & Interface Science 12: 121-128. Los hidrótropos no presentan ninguna concentración crítica por encima de la cual tenga lugar la autoagregación, como se observa para los tensioactivos y lípidos que forman fases micelares, lamelares u otras mesofases bien definidas. En su lugar, muchos hidrótropos presentan un proceso de agregación de tipo continuo, en el cual los tamaños de los agregados crecen a medida que se incrementa la concentración. Sin embargo, muchos hidrótropos alteran el comportamiento de fase, estabilidad y propiedades coloidales de sistemas que contienen sustancias de carácter polar y no polar, incluidas las mezclas de agua, aceite, tensioactivos y polímeros. Los hidrótropos se utilizan tradicionalmente en diferentes industrias, desde la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria hasta las aplicaciones técnicas. El uso de hidrótropos en composiciones detergentes permite obtener, por ejemplo, formulaciones más concentradas de tensioactivos (como en el proceso de compactación de detergentes líquidos eliminando el agua) sin introducir fenómenos no deseados tales como la separación de fases o una viscosidad elevada.

El detergente puede contener un 0-5% en peso, tal como entre aproximadamente un 0.5% y aproximadamente un 5%, o entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 5%, de un hidrótropo. Se puede utilizar cualquier hidrótropo conocido en la técnica por su utilización en detergentes. Los ejemplos no limitantes de hidrótropos incluyen el bencenosulfonato sódico, p-toluenosulfonatos sódicos (STS) , xilenosulfonatos sódicos (SXS) , cumenosulfonatos sódicos (SCS) , cimenosulfonato sódico, óxidos de aminas, alcoholes y éteres poliglicólicos, hidroxinaftoato sódico, hidroxinaftalenosulfonato sódico, etilhexilsulfato sódico y combinaciones de estos.

Adyuvantes y coadyuvantes La composición detergente puede contener aproximadamente un 0-65% en peso, tal como entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 50% de un adyuvante o coadyuvante para detergentes, o una mezcla de estos. En un detergente para lavar los platos, el nivel de adyuvante es normalmente de un 40-65%, concretamente de un 50-65%. Concretamente, el adyuvante y/o coadyuvante pueden ser un agente quelante que forme complejos hidrosolubles con Ca y Mg. Se pueden utilizar cualquier adyuvante y/o coadyuvante conocidos en la técnica por su utilización en detergentes para lavar ropa. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes incluyen zeolitas, difosfatos (pirofosfatos) , trifosfatos tales como trifosfato sódico (STP o STPP) , carbonatos tales como carbonato sódico, silicatos solubles tales como metasilicato sódico, silicatos estratificados (p. ej . , SKS-6 de Hoechst) , etanolaminas tales como 2-aminoetan-l-ol (MEA), iminodietanol (DEA) y 2 , 2 ' , 21 1 -nitrilotrietanol (TEA) y carboximetilinulina (CMI) , y combinaciones de estos.

La composición detergente también puede contener 0-65% en peso, tal como aproximadamente 5% hasta aproximadamente 40%, de un coadyuvante para detergentes, o una mezcla del mismo. La composición detergente puede incluir un coadyuvante solo o en combinación con un adyuvante, por ejemplo un adyuvante de zeolita. Los ejemplos no limitantes de coadyuvantes incluyen homopolimeros de poliacrilatos o copolímeros de estos, tales como el ácido poliacrílico (PAA) o el copolímero del ácido acrílico y el ácido maleico (PAA/PMA) . Otros ejemplos no limitantes incluyen el citrato, agentes quelantes tales como aminocarboxilatos , aminopolicarboxilatos y fosfonatos, y ácido alquil- o alquenilsuccínico. Otros ejemplos específicos incluyen el ácido 2, 21 , 21 ' -nitrilotriacético (NTA) , ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) , ácido iminodisuccínico (IDS) , ácido etilendiarnino-N,N'-disuccínico (EDDS) , ácido metilglicinodiacético (MGDA.) , ácido glutámico-N,N-ácido diacético (GLDA) , l-hidroxietano-l,l-diilbis (ácido fosfónico) (HEDP) , etilendiaminotetrakis (metilen) tetrakis (ácido fosfónico) (EDTMPA) , dietilentriaminopentakis (metilen)pentakis (ácido fosfónico) (DTPMPA) , ácido N- (2-hidroxietil) iminodiacético (EDG), ácido aspártico-N-ácido monoacético (ASMA) , ácido aspártico-N, N-ácido diacético (ASDA) , ácido aspártico-N-ácido monopropiónico (ASMP) , ácido iminodisuccínico (IDA), ácido N- (2-sulfometil) aspártico (SMAS) , ácido N- (2-sulfoetil) aspártico (SEAS), ácido N- (2-sulfometil) glutámico (SMGL) , ácido N- (2-sulfoetil) glutámico (SEGL) , ácido N-metiliminodiacético (MIDA) , -alanina-ácido N,N-diacético ( -ALDA) , serina-N, N-ácido diacético (SEDA) , isoserina-N, N-ácido diacético (ISDA) , fenilalanina-N, N-ácido diacético (PHDA) , ácido antranílico-N, N-ácido diacético (ANDA) , ácido sulfanílico-N, N-ácido diacético (SLDA) , taurina-N/N-ácido diacético (TUDA) y ácido sulfometil-N/N-diacético (SMDA) , N- (hidroxietil ) etilidendiaminotriacetato (HEDTA) , dietanolglicina (DEG) , dietilentriaminapenta (ácido metilenfosfónico) (DTPMP) , aminotris (ácido metilenefosfónico) (ATMP) y combinaciones y sales de estos. Se describen adyuvantes y/o coadyuvantes ilustrativos adicionales en, p. ej . , los documentos WO 09/102854 y US 5977053.

Sistemas de blanqueo El detergente puede contener 0-10% en peso, tal como aproximadamente 1% a aproximadamente 5% de un sistema blanqueador. Se puede utilizar cualquier sistema de blanqueo conocido en la técnica por su utilización en detergentes para lavar ropa. Los componentes de los sistemas de blanqueo adecuados incluyen catalizadores del blanqueo, fotoblanqueantes , activadores del blanqueo, fuentes de peróxido de hidrógeno tales como percarbonato sódico y perboratos sódicos, perácidos preformados y mezclas de estos. Los perácidos preformados adecuados incluyen, sin carácter limitante, ácidos peroxicarboxílieos y sales, ácidos percarbónicos y sales, ácidos perimídicos y sales, ácidos peroximonosulfúricos y sales, por ejemplo, Oxone (R) y mezclas de estos. Los ejemplos no limitantes de sistemas de blanqueo incluyen sistemas de blanqueo a base de peróxidos, los cuales pueden comprender, por ejemplo, una sal inorgánica, incluidas las sales de metales alcalinos tales como las sales sódicas de un perborato (normalmente un mono- o tetrahidrato) , sales de percarbonatos , persulfatos , perfosfatos , persilicatos , combinadas con un activador del blanqueo que forma perácidos . Activador de blanqueo significa en la presente un compuesto que reacciona con el blanqueador de peroxígeno como peróxido de hidrógeno para formar un perácido. El perácido formado de esta manera constituye el blanqueante activado . Activadores de blanqueo adecuados que se utilizarán en la presente incluyen aquellos que pertenecen a una clase de amidas , imidas o anhídridos de ásteres. Ejemplos adecuados son tetracetil atileno diamina (TAED) , sulfonato sódico de 3, 5, 5 trimetil hexanoiloxibenceno , ácido diperoxi dodecanoico, 4- (dodecanoiloxi)bencenosulfonato (LOBS) , 4- (decanoiloxi)bencenosulfonato, 4- (decanoiloxi) benzoato (DOBS) , 4- (3, 5, 5-trimetilhexanoiloxi) bencenesulfonato (ISONOBS) , tetraacetiletilenodiamina (TAED) y 4- (nonanoiloxi)bencenosulfonato (NOBS) y/o aquellos descritos en el documento W098/17767. En el documento EP624154 se ha descrito una familia particular de activadores del blanqueo de interés y en esa familia se prefiere particularmente el acetilcitrato de trietilo (ACT) . El ACT o un triglicérido de cadena corta como la triacina presenta la ventaj a de que es ecológico, ya que en última instancia se degrada para obtener ácido cítrico y alcohol . Además , el acetilcitrato de trietilo y la triacetina presentan una buena estabilidad hidrolítica en el producto cuando se almacenan y son unos activadores del blanqueo ef icaces . Finalmente , el ATC proporciona una buena capacidad adyuvante al aditivo para lavar la ropa. Como alternativa, el sistema de blanqueo puede comprender peroxiácidos , por ejemplo, de tipo amida, imida o sulfona. El sistema de blanqueo también puede comprender perácidos tales como el ácido 6- (ftaloilamino) percaproico (PAP) . El sistema de blanqueo también puede incluir un catalizador de blanqueo. En algunas modalidades, el componente de blanqueo puede ser un catalizador orgánico seleccionado del grupo constituido por catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas: (iii) y mezclas de los mismos; en donde cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 24 carbonos, preferiblemente cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 18 carbonos o u grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 18 carbonos, más preferiblemente cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2-propilheptilo, 2 -butilooctilo, 2-pentilononilo, 2 -hexilodecilo, n- dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, iso-nonilo, iso-decilo, iso- tridecilo e iso-pentadecilo . Se describen otros sistemas de blanqueo ilustrativos, p. ej . , en WO2007/087258 , WO2007/087244 , WO2007/087259 y O2007/087242. Un fotoblanqueante adecuado puede ser, por ejemplo, la ftalocianina de zinc sulfonada.

Polímeros El detergente puede contener un 0-10% en peso, tal como un 0.5-5%, 2-5%, 0.5-2% o 0.2-1% de un polímero. Se puede utilizar cualquier polímero conocido en la técnica por su utilización en detergentes. El polímero puede actuar como un coadyuvante tal como se menciona anteriormente, o puede proporcionar un efecto anti-redepósito, protección de las fibras, liberación de la suciedad, inhibición de la transferencia del tinte, limpieza de la grasa y/o propiedades antiespumantes . Algunos polímeros pueden poseer más de una de las propiedades mencionadas anteriormente y/o más de uno de los motivos mencionados a continuación. Los polímeros ilustrativos incluyen la (carboximetil ) celulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA) , poli (vinilpirrolidona) (PVP) , poli (ethileneglicol) o poli (óxido de etileno) (PEG) , polietilenimina etoxilada, carboximetilinulina (CMI) , y policarboxilatos tales como PAA, PAA/PMA, ácido poliaspártico y copolímeros de metacritalo laurico/ácido acrílico, CMC modificado hidrofóbicamente (HM-CMC) y siliconas, copolímeros de ácido tereftálico y glicoles oligoméricos , copolímeros de polietilentereftalato y polioxietenteref alato (PET-POET) , PVP, poli (vinilimidazol) (PVI) , poli (N-óxido de vinilpiridina) (PVPO o PVPNO) y polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI) . Algunos polímeros ilustrativos adicionales incluyen los policarboxilatos sulfonado, óxido de polietileno y óxido de polipropileno (PEO-PPO) y etoxisulfato dicuaternario. Se describen otros polímeros ilustrativos, p. ej . , en WO 2006/130575. También se consideran las sales de los polímeros mencionados anteriormente.

Agentes colorantes de la tela Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir agentes colorantes de la tela, tales como tintes o pigmentos, los cuales, cuando se formulan en las composiciones detergentes, se pueden depositar sobre una tela cuando la tela se pone en contacto con una solución de lavado que comprenda las composiciones detergentes, de este modo se altera el color de la tela mediante la absorción/reflexión de la luz visible. Los agentes de blanqueo fluorescentes emiten al menos cierta cantidad de luz visible. En cambio, los agentes colorantes de la tela alteran el color de una superficie, ya que absorben al menos una porción del espectro de la luz visible. Los agentes colorantes de la tela adecuados incluyen tintes y conjugados de tinte-arcilla, y también pueden incluir pigmentos. Los tintes adecuados incluyen tintes que son moléculas de bajo peso molecular y tintes poliméricos. Los tintes que son moléculas de bajo peso molecular adecuados incluyen tintes que son moléculas de bajo peso molecular seleccionados del grupo constituido por los tintes incluidos en las clasificaciones del índice de Color (C.I.) de Azul directo, Rojo directo, Violeta directo, Azul ácido, Rojo ácido, Violeta ácido. Azul básico, Rojo básico y Violeta básico, o mezclas de estos, por ejemplo, según se describe en WO2005/03274, WO2005/03275 , O2005/03276 y EP1876226 (que se incorporan a la presente por referencia) . La composición detergente comprende preferentemente entre aproximadamente un 0.00003% en peso y aproximadamente un 0.2% en peso, entre aproximadamente un 0.00008% en peso y aproximadamente un 0.05% en peso, o incluso entre aproximadamente un 0.0001% en peso y aproximadamente un 0.04% en peso del agente colorante de la tela. La composición puede comprender entre un 0.0001% en peso y un 0.2% en peso de agente colorante de la tela, esto puede preferirse especialmente cuando la composición esté en forma de bolsitas de dosis unitaria. También se describen agentes colorantes adecuados, p. ej . , en WO 2007/087257 y WO2007/087243.

Enzimas (adicionales) En una modalidad, las variantes similares a 10R de conformidad con la invención se combinan con una o más enzimas, tal como al menos dos enzimas, más preferiblemente al menos tres, cuatro o cinco enzimas. Preferiblemente, las enzimas tienen diferente especificidad de sustrato, por ejemplo, actividad proteolítica, actividad amilolítica, actividad lipolítica, actividad hemicelulítica o actividad pectolítica .

El aditivo detergente así como la composición detergente puede comprender una o más enzimas adicionales como proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, manasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa p. ej . , lacasa, y/o peroxidasa .

En general, las propiedades de la o las enzimas seleccionadas debería ser compatible con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y la o las enzimas deberían estar presentes en cantidades eficaces.

Celulasas : Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas alteradas genéticamente. Celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulosas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora ther ophila y Fusarium oxysporum descritas en los documentos US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259.

Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que presentan beneficios en cuanto al cuidado del color. Algunos ejemplos de tales celulasas son las celulasas que se describen en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397 y WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasas tales como las que se describen en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5.457.046, US 5.686.593, US 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.

Las celulasas comercializadas incluyen Celluzyme™ y Carezyme™ (Novozymes A/S) , Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.) y KAC-500(B)™ (Kao Corporation) .

Proteasas : La proteasa puede ser de origen animal, vegetal o microbiano, incluidos mutantes químicamente o genéticamente modificados. Se prefiere el origen microbiano. Puede ser una proteasa alcalina, tal como una proteasa de serina o una metaloproteasa . Una proteasa de serina puede ser, por ejemplo, la familia SI, tal como tripsina o la familia S8 tal como subtilisina. Una proteasa de metaloproteasas puede ser una termolisina o de, por ejemplo, la familia M4 , M5, M7 o M8.

El término "subtilasas" se refiere a un subgrupo de proteasa de serina de conformidad con Siezen et al . , Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Las proteasas de serina son un subgrupo de proteasas caracterizadas por tener una serina en el sitio activo, que forma un aducto covalente con el sustrato. Además, las subtilasas (y las proteasas de serina) se caracterizan por tener dos residuos aminoacídicos de sitio activo aparte de la serina, a saber, una histidina y un residuo de ácido aspártico.

Ejemplos de subtilisinas son aquellas que derivan de Bacillus tales como subtilisina lentus, Bacillus lentus, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisina BPN' , subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 descritas en el documento WO 89/06279 y la proteasa PD138 (WO 93/18140) . Ejemplos de proteasa de serina adicionales se describen en el documento WO 98/020115, WO 01/44452, WO 01/58275, WO 01/58276, WO 03/006602 y WO 04/099401. La secuencia de aminoácidos de BLAP se muestra en la Figura 29 del documento US 5,352,604.

Ejemplos de proteasas similares a tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa Fusariumdescrita en el documento W089/06270 y W094/25583. Algunos ejemplos de proteasas útiles son las variantes que se describen en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.

Algunos ejemplos de metaloproteasas son las metaloproteasas neutras tal como se describe en el documento WO 07/044993.

Enzimas proteasas disponibles en el mercado incluyen Alcalase™, Coronase™, Durazym™, Esperase™, Everlase™, Kannase TM, Li·quanaseTM, Li·quanase UltraTM' OvozymeTM, PolarzymeTM, Primase , Reíase , Savinase y Savmase Ultra , (Novozymes A/S) , Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), BLAP y BLAP X (Henkel AG & Co. KGaA) , Excellase™, FN2™, FN3™, FN4™, axacal™, Maxapem TM, MaxataseTM, ProperaseTM, Puraf<—astTM, PurafectTM, Purafect OxP™, Purafect™ Prime y Puramax™ (Genencor International Inc.) .

Lipasas y Cutinasas: Las lipasas y cutinasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. Ejemplos incluyen lipasa de Thermomyces, por ejemplo, de T. lanuginosus (previamente denominada Humicola lanuginosa) como se describe en los documentos EP 258 068 y EP 305 216, cutinasa de Humicola, por ejemplo H. insolens como se describe en el documento WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272) , P. cepacia (EP 331 376) , P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, cepa SD 705 de Pseudomonas sp . (WO 95/06720 y WO 96/27002) , P. wisconsinensis (WO 96/12012) , una lipasa de Bacillus, por ejemplo, de B. subtilis (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422) .

Otros ejemplos son las variantes de lipasas tal como aquellos descritos en los documentos WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/060063, WO2007/087508 y WO 2009/109500.

Las enzimas lipasas disponibles en el mercado preferidas incluyen Lipolase™, Lipolase Ultra™ y Lipex™; Lecitase™, Lipolex™; Lipoclean™, Lipoprime™ (Novozymes A/S) . Otras lipasas disponibles en el mercado incluyen Lumafast (Genencor Int Inc) ; Lipomax (Gist-Brocades/Genencor Int Inc) y lipasa de Bacillus sp. de Solvay.

Amilasas : Las amilasas (a y/o ß) adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o diseñados de proteínas. Amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita en más detalle en GB 1,296,839.

Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en los documentos WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444.

Las amilasas disponibles en el mercado son Stainzyme™, Stainzyme™ Plus, Natalase™, Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ y BA ™ (Novozymes A/S) , Rapidase y Purastar (de Genencor International Inc.) .

Peroxidasas/Oxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas alteradas genéticamente. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus y variantes de las mismas, tales como aquellas que se describen en los documentos WO 93/24618, O 95/10602 y WO 98/15257.

Las peroxidasas comercializadas incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).

La o las enzimas detergentes se pueden incluir en una composición detergente añadiendo aditivos independientes que contengan una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprenda todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede formularse, por ejemplo, como un granulado, líquido, suspensión, etc. Formulaciones de aditivo de detergente preferidas son granulados, en particular granulados que no sean de polvo, líquidos, en particular líquidos estabilizados o suspensiones.

Pueden producirse granulados que no sean en polvo, por ejemplo, tal como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,106,991 y 4,661,452, y pueden recubrirse opcionalmente mediante los métodos conocidos en la técnica. Algunos ejemplos de materiales de recubrimiento céreos son los productos de tipo poli (óxido de etileno) (polietilenglicol , PEG) con pesos molares medios comprendidos entre 1000 y 20 000; nonilfenoles etoxilados que contienen entre 16 y 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene entre 12 y 20 átomos de carbono y en los cuales hay entre 15 y 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para la aplicación de técnicas de lecho de fluidos se proporcionan en el documento GB 1483591. Los preparados enzimáticos líquidos se pueden estabilizar, por ejemplo, añadiendo un poliol tal como propilenglicol , un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de conformidad con métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden prepararse de conformidad con el método descrito en el documento EP 238,216.

Materiales adjuntos También se pueden utilizar cualesquiera componentes detergentes conocidos en la técnica por su utilización en detergentes para lavar ropa. Otros componentes de detergentes opcionales incluyen agentes anticorrosivos, agentes antiencogimiento, agentes contra la redeposición de la suciedad, agentes antiarrugas, bactericidas, aglutinantes, inhibidores de la corrosión, agentes desintegrantes/de desintegración, tintes, estabilizantes enzimáticos (incluidos el ácido bórico, boratos, CMC y/o polioles tales como propilenglicol ) , suavizantes para la ropa que incluyen arcillas, rellenos/auxiliares de procesamiento, agentes de blanqueo fluorescentes/abrillantadores ópticos, potenciadores de la espuma, reguladores de la espuma (espuma de jabones) , perfumes, agentes de suspensión de la suciedad, suavizantes, supresores de la espuma de jabones, inhibidores de la decoloración y agentes absorbentes, tanto solos como combinados. Se puede utilizar cualquier ingrediente conocido en la técnica por su utilización en detergentes para lavar ropa. La elección de tales ingredientes se encuentra dentro de las competencias del experto.

Dispersantes - Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden contener dispersantes. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Los materiales orgánicos hidrosolubles adecuados incluyen los ácidos homo- o copoliméricos o sus sales, en los cuales el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Dispersantes adecuados se describen, por ejemplo, en Powdered Detergents, Surfactant science series volumen 71, Marcel Dekker, Inc.

Agentes inhibidores de la transferencia de tintes - Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes inhibidores de la transferencia de tintes. Agentes inhibidores de la transferencia de tintes poliméricos adecuados incluyen, a modo no taxativo, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de poliamina N-óxido, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de estos. Cuando están presentes en una composición en cuestión, los agentes inhibidores de la transferencia de tintes pueden estar presentes en niveles de aproximadamente un 0.0001 % a aproximadamente un 10%, de aproximadamente un 0.01% a aproximadamente un 5% o incluso de aproximadamente un 0.1% a aproximadamente un 3% en peso de la composición.

Agente blanqueador fluorescente - Las composiciones de detergente de la presente invención también contendrán preferiblemente componentes adicionales que pueden teñir los artículos que se limpian, tal como un agente blanqueador fluorescente o abrillantadores ópticos. Cuando el abrillantador está presente, está preferentemente en un nivel de entre aproximadamente un 0.01% y aproximadamente un 0.5%. En la composición de la presente invención se puede utilizar cualquier agente de blanqueo fluorescente adecuado para su uso en una composición detergente para lavar la ro a. Los agentes de blanqueo fluorescentes utilizados más frecuentemente son los que pertenecen a las clases de derivados del ácido diaminoestilbenosulfónico, derivados de diarilpirazolina y derivados de bisfenildiestirilo . Los ejemplos de agentes de blanqueo fluorescentes de tipo derivados del ácido diaminoestilbenosulfónico incluyen las sales sódicas de: 4 , 4 ' -bis (2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 21 -disulfonato; 4,4' -bis (2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 21 -disulfonato; 4 , 41 -bis (2-anilino-4- (iV-meti1-N- 2 -hidroxietilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 21 -disulfonato, 4,4'-bis(4-fenil-2 , 1, 3 -triazol -2 - il ) estilbeno-2 , 2 ' -disulfonato; 4,4'-bis (2-anilino-4- (l-metil-2-hidroxietilamino) -s-triazin-6 -ilamino) estilbeno-2 , 2 ' -disulfonato y 2 - (estilbil -4 " -nafto-1. , 21 : 4 , 5 ) -1 , 2 , 3 -triazol-2 " -sulfonato . Los agentes de blanqueo fluorescentes preferidos son Tinopal DMS y Tinopal CBS, que se pueden adquirir de Ciba-Geigy AG, Basilea, Suiza. Tinopal DMS es la sal disódica del 4 , 41 -bis (2 -morfolino-4 -anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbenodisulfonate . Tinopal CBS es la sal disódica del 2 , 2 ' -bis ( fenilestiril ) disulfonato . También es un agente de blanqueo fluorescente preferido el producto comercializado Parawhite KX, suministrado por Paramount Minerals and Chemicals, Bombai, India. Otros fluorescentes adecuados para utilizar en la invención incluyen las 1-3-diaril pirazolinas y las 7-alquilaminocoumarinas .

Los niveles de abrillantadores fluorescentes adecuados incluyen niveles inferiores de aproximadamente un 0.01, de un 0.05, de aproximadamente un 0.1 o incluso de aproximadamente un 0.2% en peso y niveles superiores de un 0.5 o incluso un 0.75% en peso.

Polímeros que liberan la suciedad - Las composiciones de detergente de la presente invención también pueden incluir uno o más polímeros que liberan la suciedad que ayudan a eliminar la suciedad de telas, tales como telas de algodón y poliéster, en particular a eliminar suciedades hidrófobas de telas de poliéster. Los polímeros que liberan la suciedad pueden ser, por ejemplo, polímeros basados en tereftalato aniónicos o no iónicos, polivinilcaprolactama y copolímeros relacionados, copolímeros vinílicos de injerto, poliéster, poliamidas, remítase, por ejemplo, al Capítulo 7 en Powdered Detergents, Surfactant science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros que liberan la suciedad son los polímeros alcoxilados anfifílicos que limpian la grasa, los cuales comprenden una estructura central y una pluralidad de grupos alcoxilato unidos a esa estructura central . La estructura central puede comprender una estructura de tipo polialquilenimina o una estructura de tipo polialcanolamina, según se describe detalladamente en O 2009/087523 (que se incorpora a la presente por referencia) . Además, los copolímeros de injerto aleatorio son polímeros que liberan la suciedad adecuados. En los documentos WO 2007/138054, WO 2006/108856 y WO 2006/113314 (que se incorporan a la presente por referencia) se describen detalladamente copolímeros de injerto adecuados. Otros polímeros que liberan la suciedad son estructuras de polisacáridos sustituidos, especialmente estructuras celulósicas sustituidas tales como derivados de celulosa modificados tales como los que se describen en EP 1867808 o WO 2003/040279 (ambos se incorporan a la presente por referencia) . Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa y mezclas de estos. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa modificada aniónicamente, celulosa modificada no iónicamente, celulosa modificada catiónicamente, celulosa modificada zwiteriónicamente y mezclas de estas. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxiletilcelulosa, hidroxilpropilmetilcelulosa, éster de la carboximetilcelulosa y mezclas de estas.

Agentes contra la redeposición - Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes contra la redeposición, tales como carboximetilcelulosa (CMC) , alcohol polivinílico (PVA) , polivinilpirrolidona (PVP) , polioxietileno y/o polietilenglicol (PEG) , homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico y polietileniminas etoxiladas. Los polímeros de base celulósica descritos en los polímeros que liberan la suciedad anteriores también pueden actuar como agentes contra la redeposición.

Otros materiales accesorios adecuados incluyen, a modo no taxativo, agentes antiencogimiento, agentes antiarrugas, bactericidas, aglutinantes, portadores, tintes, estabilizadores enzimáticos, suavizantes de telas, cargas, reguladores de espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supresores de césped, disolventes, estructurantes para detergentes líquidos y/o agentes elastizantes.

Formulación de productos detergentes La composición detergente de la invención puede adoptar cualquier forma conveniente, p. ej . , una pastilla, un comprimido homogéneo, un comprimido con una o más capas, un polvo compacto o regular, un gránulo, una pasta, un gel o un líquido concentrado, compacto o regular.

Formas de formulaciones detergentes: en capas (fases iguales o diferentes), bolsitas, frente a formas para una unidad de dosificación para máquinas.

Las bolsitas se pueden configurar con un único compartimento o con múltiples compartimentos. Puede tener cualquier forma, figura y material que sea adecuado para guardar la composición, p. ej . , sin permitir que se libere la composición de la bolsita antes de que entre en contacto con el agua. La bolsita está hecha de una película hidrosoluble que encierra un volumen interno. El volumen interno se puede dividir en compartimentos de la bolsita. Las películas preferidas son materiales poliméricos, preferentemente polímeros a los cuales se les da forma de película o lámina. Los polímeros, copolímeros o derivados de estos preferidos son poliacrilatos seleccionados y copolímeros de acrilato hidrosolubles, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrina sódica, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, maltodextrina, polimetacrilatos , más preferentemente copolímeros del alcohol polivinílico e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) . Preferiblemente, el nivel de polímero en la película, por ejemplo PVA, es la menos aproximadamente 60%. El peso molecular promedio preferido generalmente será de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 150,000. Las películas también pueden estar constituidas por composiciones mezcladas que comprenden mezclas de polímeros hidrosolubles y degradables hidrolíticamente tales como ácido poliláctico y alcohol polivinílico (conocidos con la referencia comercial M8630 y comercializados por Chris Craft en Prod. Of Gary, Ind., EE . UU. ) , además de plastificantes tales como glicerol, etilenglicerol , propilenglicol , sorbitol y mezclas de estos. Las bolsas pueden comprender una composición de limpieza de lavandería sólida o componentes en parte y/o una composición de limpieza líquida o componentes de parte separados por la película soluble en agua. El compartimento para los componentes líquidos puede tener una composición diferente que los compartimentos que contienen los sólidos. Ref: (US2009/0011970 Al).

Los ingredientes del detergente se pueden separar físicamente unos de otros mediante compartimentos en bolsitas que se disuelven en agua o en diferentes capas de comprimidos De este modo, pueden evitarse interacciones negativas entre los componentes durante el almacenamiento. Los diferentes perfiles de disolución de cada uno de los compartimentos también pueden dar lugar a una disolución más tardía de los componentes seleccionados en la solución de lavado.

Definición/características de las formas: Un detergente líquido o en gel, el cual no se dosifica de manera unitaria, puede ser acuoso, y contendrá normalmente al menos un 20% en peso y hasta un 95% de agua, tal como hasta aproximadamente un 70% de agua, hasta aproximadamente un 65% de agua, hasta aproximadamente un 55% de agua, hasta aproximadamente un 45% de agua, hasta aproximadamente un 35% de agua. Se pueden incluir otros tipos de líquidos, incluidos sin carácter limitante, alcanoles, aminas, dioles, éteres y polioles en un líquido o gel acuosos. Un detergente líquido o en gel acuosos puede contener entre un 0-30% de un disolvente orgánico .

Un detergente líquido o en gel puede ser no acuoso.

Formulaciones de detergentes granulados Un detergente granulado se puede formular según se describe en WO09/092699, EP1705241, EP1382668, WO07/001262, US6472364, WO04/074419 o WO09/102854. Se describen otras formulaciones detergentes útiles ! en O09/124162, WO09/124163, WO09/117340, O09/117341, WO09/117342, WO09/072069, WO09/063355, O09/132870, O09/121757, WO09/112296, WO09/112298, O09/103822, WO09/087033 , O09/050026, WO09/047125, O09/047126, WO09/047127, WO09/047128, WO09/021784, WO09/010375, WO09/000605, WO09/122125, O09/095645, WO09/040544, WO09/040545, O09/024780, O09/004295, WO09/004294, WO09/121725, WO09/115391, WO09/115392, WO09/074398, WO09/074403, WO09/068501, WO09/065770, WO09/021813, WO09/030632 y O09/015951, WO2011025615, WO2011016958 , O2011005803 , WO2011005623, WO2011005730, WO2011005844, WO2011005904, WO2011005630, WO2011005830, WO2011005912 , WO2011005905, WO2011005910, WO2011005813, WO2010135238, WO2010120863, WO2010108002, WO2010111365, WO2010108000, WO2010107635, WO2010090915, WO2010033976, WO2010033746, WO2010033747, WO2010033897, WO2010033979, WO2010030540, O2010030541, WO2010030539, WO2010024467, WO2010024469, O2010024470, WO2010025161, O2010014395, O2010044905, WO2010145887, O2010142503 , WO2010122051, O2010102861, WO2010099997, WO2010084039, WO2010076292, WO2010069742 , WO2010069718, O2010069957, WO2010057784, WO2010054986 , WO2010018043 , WO2010003783 , WO2010003792, WO2011023716 , WO2010142539 , WO2010118959 , WO2010115813, O2010105942 , WO2010105961 , WO2010105962 , WO2010094356, WO2010084203 , WO2010078979 , WO2010072456 , WO2010069905, WO2010076165 , WO2010072603 , WO2010066486 , O2010066631, WO2010066632 , WO2010063689 , WO2010060821 , WO2010049187, WO2010031607 y WO2010000636.

Usos La presente invención también está dirigida a métodos para utilizar las variantes de conformidad con la invención o composiciones de las mismas en lavado de ropa de tejidos y telas, tal como lavado de ropa doméstico y lavado de ropa industrial.

La invención también está dirigida a métodos para utilizar las variantes de conformidad con la invención o composiciones de las mismas en limpieza de superficies duras tales como lavado de vajilla automático (AD , por sus siglas en inglés) , lavado de autos y limpieza de superficies industriales.

Las variantes de subtilasa de la presente invención pueden agregarse a y de este modo convertirse en un componente de una composición detergente. Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere al uso de una composición detergente que comprende una variante de proteasa que comprende alteración de dos o más aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la alteración es una sustitución o inserción y en donde la variante tiene al menos 60% de identidad con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6 en un proceso de limpieza tal como lavado de ropa y/o limpieza de superficies duras. Otro aspecto se refiere al uso de una composición detergente que comprende una variante que comprende inserción de uno o más aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 y adicionalmente comprende una o más sus ituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2, en donde la variante tiene una identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6 de al menos 60% tal como al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6.

Una modalidad de la invencións se refiere al uso de una variante de proteasa que comprende la inserción de uno o más aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente comprende una o más sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82, en donde la variante tiene al menos 60% de identidad, tal como al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo, al menos 75%, al menos 76% al menos 77% al menos 78% al menos 79% al menos 80%, al menos 81% al menos 82% al menos 83% al menos 84% al menos 85%, al menos 86% al menos 87% al menos 88% al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6 en un proceso de limpieza tal como lavado de ropa y/o limpieza de superficies duras, en donde la variante tiene mayor estabilidad de quelante con respecto al progenitor, con respecto a un progenitor de proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de la variante pero que no tiene las alteraciones en una o más de las posiciones o con respecto a una proteasa de referencia, cuando se evalúa en el ejemplo 2, tal como se describe en "Materiales y métodos" .

La composición detergente puede formularse, por ejemplo, como una composición detergente de lavado de ropa a mano o a máquina, incluida una composición de aditivo de lavandería adecuada para el pretratamiento de telas teñidas y una composición suavizante de tela agregada al enjuague o puede formularse como una comosición detergente para utilizar en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar, o puede formularse para operaciones de lavado de vajilla a mano o a máquina.

En un aspecto específico, la presente invención proporciona un aditivo del detergente que comprende un polipéptido de la presente invención según se ha descrito en la presente.

El proceso de limpieza o el proceso de cuidado de tejidos puede ser, por ejemplo, un proceso de lavado de ropa, un proceso de lavado de vajilla o limpieza de superficies duras tales como azulejos, pisos, mesas, desagües, piletas de lavado e instrumentos quirúrgicos. Los procesos de lavado de ropa pueden ser, por ejemplo, lavados domésticos pero también pueden ser lavados industriales. Asimismo, la invención se refiere a un proceso para el lavado de telas y/o prendas donde el proceso comprende tratar las telas con una solución de lavado que contiene una composición detergente y al menos una variante de proteasa de la invención. El proceso de limpieza o un proceso de cuidado de textiles puede, por ejemplo, llevarse a cabo en un proceso de lavado a máquina o en un proceso de lavado manual. La solución de lavado puede, por ejemplo, ser una solución de lavado acuosa que contiene una composición detergente.

Las telas y/o prendas sujetas a un proceso de lavado, limpieza o de cuidado de textiles de la presente invención pueden ser ropas sucias lavables de manera convencional, por ejemplo ropas sucias domésticas. Preferentemente, la mayor parte de la ropa sucia está constituida por prendas y telas, incluidas prendas de punto, tejidos, tejidos vaqueros, telas no tejidas, fieltros, hilos y telas de toalla. Las telas pueden tener una base celulósica, tales como materiales celulósicos naturales, incluidos el algodón, fibra de lino, tejido de lino yute, ramio, sisal o fibra de coco o materiales celulósicos hechos a mano (p. ej . , que se han originado a partir de pulpa de madera) , incluidos el rayón/viscosa, ramio, fibras de acetato de celulosa (Tricell) , Lyocell o mezclas de estos. Las telas también pueden tener una base no celulósica, tales como poliamidas naturales, incluidas lana, camelo, cachemira, lana de cabra, conejo y seda o polímero sintético tal como nylon, aramida, poliéster, acrílico, polipropileno y telas elastizadas/elastano, o mezclas de estos, así como una mezcla de fibras de base no celulósica y no celulósica. Los ejemplos de mezclas son mezclas de algodón y/o rayón/viscosa con uno o más materiales que los acompañan tal como lana, fibras sintéticas (p. ej . , fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol polivinílico, fibras de cloruro polivinílico, fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida) y fibras que contienen celulosa (p. ej . , rayón/viscosa, ramio, firbra de lino, tejido de lino, yute, fibras de acetato de celulosa, Lyocell) .

En los últimos años se ha observado un interés creciente en reemplazar componentes en detergentes, el cual se deriva de los productos petroquímicos con componentes biológicos renovables tales como enzimas y polipéptidos , sin comprometer el rendimiento del lavado.

La invención se refiere además al uso de variantes de subtilasa de la invención en un proceso de remoción de manchas proteináceas . Las manchas proteináceas pueden ser manchas tales como manchas de alimentos, p. ej . , alimento para bebés, sebo, cacao, huevo, sangre, leche, tinta, césped o una combinación estos.

Composiciones detergentes típicas incluyen varios componentes, además de las enzimas; estos componentes tienen diferentes efectos: algunos componentes, como los tensioactivos , reducen la tensión superficial en el detergente, lo que permite que la mancha limpiada se levante y disperse, desapareciendo con el lavado; otros componentes, como los sistemas blanqueadores, descoloran a menudo por oxidación y muchos blanqueadores también tienen fuertes propiedades bactericidas y se utilizan para desinfectar y esterilizar. Otros componentes adicionales como adyuvantes y quelantes suavizan el agua de lavado al eliminar los iones metálicos del líquido.

En una modalidad particular, la invención se refiere al uso de una composición que comprende una variante de proteasa de la invención, en donde la composición enzimática comprende además al menos uno o más de los siguientes: un tensioactivo, un adyuvante, un quelante o agente quelante, sistema blanqueador o componente blanqueador en lavado de ropa o lavado de vajilla.

En una modalidad preferida de la invención, la cantidad de un tensioactivo, un adyuvante, un quelante o agente quelante, sistema blanqueador y/o componente blanqueador se reduce en comparación con la cantidad de tensioactivo, adyuvante, quelante o agente quelante, sistema blanqueador y/o componente blanqueador utilizado sin la variante de proteasa agregada de la invención. Preferiblemente, al menos un componente que es un tensioactivo, un adyuvante, un quelante o agente quelante, sistema blanqueador y/o componente blanqueador está presente en una cantidad que es 1% menos, tal como 2% menos, tal como 3% menos, tal como 4% menos, tal como 5% menos, tal como 6% menos, tal como 7% menos, tal como 8% menos, tal como 9% menos, tal como 10% menos, tal como 15% menos, tal como 20% menos, tal como 25% menos, tal como 30% menos, tal como 35% menos, tal como 40% menos, tal como 45% menos, tal como 50% menos que la cantidad del componente en el sistema sin la adición de variante de proteasa de la invención, tal como una cantidad convencional del componente. En un aspecto, una variante de proteasa de la invención utilizada en las composiciones de detergente en donde la composición está libre de al menos un componente que es un tensioactivo, un potenciador, un quelante, sistema de blanqueado o componente de blanqueado y/o polímeroEn un aspecto, una variante de proteasa de la invención es utilizada en las composiciones de detergente, en donde la composición está libre de al menos un componente que es un tensioactivo, un adyuvante, un quelante, sistema blanqueador o componente blanqueador y/o polímero.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.

Ej emplos Materiales y métodos Métodos de biología molecular general : A menos que se mencione lo contrario, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron utilizando métodos estándar de biología molecular (Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (1995); Harwood and Cutting (1990).

Ensayos de proteasas : 1) Ensayo de Suc-AAPF-pNA: Sustrato pNA : Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400) .

Temperatura : Temperatura ambiente (25 °C) Tampones de ensayo : Ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl2lmM, KC1 150mM, Tritón X-100 al 0.01% ajustados a los valores de pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 y 11.0 con HCl o NaOH.

Se mezclaron 20 µ?? de proteasa (diluida en Tritón X-100 al 0.01%) con 100 \iL de amortiguador de ensayo. Se inició el ensayo añadiendo 100 µ?? de sustrato pNA (50 mg disueltos en 1.0 mL de DMSO y diluidos adicionalmente 45x con Tritón X-100 al 0.01%). El aumento de OD405 se monitoreó como una medida de la actividad proteasa. 2) Ensayo de Protazyme AK Substrato : Comprimido de Protazyme AK (caseína teñida y reticulada; de Megazyme) Temperatura : 37°C (o se fijó a otra temperatura de ensayo) .

Amortiguador de ensayo : Ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl2 1 mM, KC1 150 mM, Tritón X-100 al 0.01%, pH 6.5 o H 7.0.

Un comprimido de Protazyme AK se suspendió en 2.0 mi de Tritón X100 al 0.01% mediante agitación suave. 500µ1 de esta suspensión y 500µ1 de amortiguador de ensayo se dispensaron en un tubo de microcentrífuga y se colocaron sobre hielo. Se agregaron 20µ1 de solución de proteasa (diluida en Tritón X-100 al 0.01%) a la mezcla enfriada con hielo. El ensayo se inició transfiriendo el tubo a una termomezcladora a 37°C y agitando a su tasa más alta (1400 rpm) . Después de 15 minutos, el tubo se volvió a colocar en el baño de hielo. Para retirar el sustrato sin reaccionar, la mezcla se centrifugó en una centrifugadora de agua helada durante unos minutos y se transfirieron 200µ1 de sobrenadante a una placa de microtitulación. Se midió la absorbancia del sobrenadanente a 650 nm. Una muestra con 20µ1 de Tritón X100 al 0.01% en vez de solución de proteasa se ensayó en paralelo y su valor se restó de la medición de la muestra de proteasa.

Titulación de sitio activo (TSA) Configuración experimental : Amortiguador de actividad: 100 mM de Tris-HCl, Brij 35 al 0.0225%, pH 8.6 Solución concentrada inhibidora: 2.0*10"4 M de Inhibidor de Quimotripsina-2 (CI-2) (también podrían utilizarse otros inhibidores de subtilisina para la titulación del sitio activo) Solución concentrada de sustrato: lOOmg/mL de Suc-AAPF-pNA disuelto en solución de Sustrato de DMSO : Solución concentrada diluida hasta 1.0 mg/mL en amortiguador de Tris Se preparó una dilución de cada variante y se agregó a dos filas adyacentes (1+2, 3+4, etc.) de una placa de microtitulación de 96 pocilios mientras que se varió la concentración de la solución inhibidora entre las dos filas. Normalmente el inhibidor se diluye 1.5 veces más en la segunda de las dos filas para cubrir un intervalo de concentración más amplio. El inhibidor utilizado con las variantes de Savinasa es el inhibidor de quimotripsina 2, conocido por presentar una fuerte unión a la Savinasa con una constante de inhibición de Ki < 10"10 M. Después de la agitación inicial, las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente para asegurar el equilibrio total de la unión del inhibidor. Luego de la incubación, se agregaron 30pL de soluciones de sustrato a cada pocilio y después de la agitación inmediata se midió la absorbancia cada 10 segundos durante 3 minutos en un espectrofotómetro (Molecular Devices Spectra Max Plus 384) . Para poder calcular la concentración, la enzima debe estar totalmente inactivada en la fila A o B. A medida que se conoce la concentración del inhibidor en cada pocilio, la inhibición gradual de la enzima posibilita la estimación de la concentración de la variante asumiendo que el inhibidor CI-2 se une en una relación 1:1 con la proteasa.

El principio general de titulación del sitio activo se describe en ézdy y Kaiser - Methods in Enzymology Volumen 19, 1970, págs. 3-20.

Ensayo de estabilidad de quelante Se utilizaron las siguientes soluciones para la preparación de las muestras: Amortiguador de Tris: Tris-HCl lOOmM, Brij-35 al 0.045%, pH 8 Solución concentrada de EDTA: EDTA lOOmM en agua milli-Q Para las mediciones de la actividad proteasa: Amortiguador de actividad: Tris-HCl lOOmM, Brij 35 al 0.0225%, H 8.6 Solución concentrada de sustrato: lOOmg/mL de Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA disuelto en DMSO Solución de sustrato: Solución concentrada hasta 0.5 mg/mL en amortiguador de actividad pH 8.6 Las concentraciones de las variantes micropurificadas se determinaron usando titulación del sitio activo con el inhibidor de quimotripsina 2a como el inhibidor, tal como se describió anteriormente.

Para asegurar que las placas con tiempos de incubación diferentes fueran idénticas, se prepararon placas madre en placas de microtitulación de 96 pocilios que contenían cada una de las variantes micropurificadas junto con Savinasa (el polipéptido maduro de la SEQ ID NO 4) como una referencia. Las variantes se diluyeron utilizando el amortiguador Tris, pH 8, hasta una concentración total de 2.5 ppm en cada pocilio. Se prepararon cuatro concentraciones de EDTA, 0, 25, 35 y 50 mM, para cada variante, con un volumen total de 100 µL en cada pocilio. Todos los experimentos se prepararon por triplicado, las muestras se mantuvieron sobre hielo en todo momento. Para cada placa madre se transfirieron 30 uL a dos placas de 96 pocilios diferentes, una para las mediciones de actividad de las muestras sin estrés y una para incubación a 50 °C durante el tiempo indicado. Para mediciones de actividad se transfirieron muestras de 2.5 L a una placa de 384 pocilios y se mezclaron con 7.5 ]ih de amortiguador. Se agregaron 40 µ?? de la solución de sustrato a través de una unidad de dispensación rápida (Thermo MULTIDROP 384) y la placa se mezcló inmediatamente antes de medir la absorbancia a 405 nm 60 segundos durante 20 minutos mediante un espectrofotómetro (PerkinElmer En Vision Reader) para 384 placas. La velocidad máxima y, por consiguiente, la actividad de las enzimas se estima por regresión lineal en la parte lineal de las curvas de absorbancia. Se utilizó un bloque de calentamiento (un bloque de PCR de ciclador de Reacción en Cadena de Polimerasa, termo muestreador BIORAD C 1000) para la incubación de temperatura. Se seleccionó el bloque de PCR para reducir los posibles efectos de borde. El bloque se precalentó hasta 50°C antes de insertar las muestras. Después de 10 minutos, se retiró la incubación de las muestras del bloque de PCR y se midió la actividad residual, tal como se describió anteriormente.

Ejemplo 1: Preparación y purificación de variantes de subtilasa Preparación y expresión de variantes Un derivado de Bacillus subtilis 168 (F. Kunst, et al.

The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390 (6657) : 249-256 (1997)) se utilizó en este estudio. Se realizaron transformaciones de <775B. subtilis tal como se describió anteriormente (Anagnostopolous , C. y J. Spizizen. 1961. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol . 81:741-746) . Todos los procedimientos biológicos moleculares de rutina se realizaron de conformidad con los protocolos descritos por Sambrook et al. (1989) .

Fermentación de las variantes La fermentación puede realizarse mediante métodos bien conocidos en la técnica o de la siguiente forma. Una cepa de B. subtilis que albergaba el plásmido de expresión correspondiente se sembró en placas de agar de LB (Luria Bertani) con 2% de leche descremada y 9 ug / mi de cloranfenicol (Sambrook et al. (1989)) y se cultivó durante la noche a 33 °C. Se inocularon 3mL de un medio de crecimiento de Bacillus (medio de crecimiento TB-Gly) que contenía 6 ug / mi de cloranfenicol en microplacas de 24 pocilios de 10 mL (Whatman Ltd.) con una sola colonia de cada placa y se incubaron durante 4 días a 30°C y 220rpm. El medio de crecimiento TB-Gly consiste en 13.3 g/L de Triptona, 26.6 g/L de extracto de levadura, 0.44% v/v de glicerol ajustado a pH 7. Las células y otro material sin disolver se quitaron del caldo de fermentación mediante centrifugación a 2500rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cosechó para micropurificación.

Purificación Se utilizaron las siguientes soluciones para la micropurificación : Amortiguador de unión: CHES 0.5 M, borato de sodio 25 mM, CaC12 10 mM, pH 10.0 Amortiguador de lavado A: CHES 0.1 M, borato de sodio 25 mM, CaCl2 2 mM, pH 9.5 Amortiguador de lavado B: Tris 25 mM, borato de sodio 25 mM, CaCl2 2 mM, pH 9.5 Amortiguador de lavado C: Tris 10 mM, borato de sodio 25 mM, CaC12 2 mM, pH 9.5 Amortiguador de elución: Acetato de sodio 50 mM, CaC12 2 mM, pH 4.8 Amortiguador de almacenamiento: Mes 0.5 M, pH 7.0 Amortiguador de regeneración: Ácido cítrico 0.1 M, pH 3.5 La micropurif icación se basó en interacciones hidrófobas usando un material de separación croma tográf ico (mercapto-etil-piridina (MEP) -HyperCel de Pall Corporation) . A cada pocilio de una placa de filtro Whatman Uhif ilter de 800 µ? de 96 pocilios (Whatman Ltd. ) se agregaron 100 µ? de suspensión de medio cromatográf ico MEP HyperCel (BioSepra, suspensión en NaCl 1 M, 20% de EtOH, aproximadamente 70-75% v/v) . El líquido se retiró al vacío (Whatman, UniVac 3) y el MEP HyperCel se lavó dos veces con 200 µ? de amortiguador de lavado A durante 10 minutos a temperatura ambiente. El amortiguador de lavado utilizado se retiró al vacío después de cada etapa. Después de las etapas de lavado iniciales, se agregaron a cada pocilio 100 µ? de amortiguador de unión. Asimismo, se agregaron a cada pocilio 400 µ? de sobrenadante del caldo de fermentación de la variante. El sobrenadante se cosechó tal como se describió anteriormente. Para permitir la unión de las variantes de proteasa al MEP HyperCell, la placa de filtro se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación vigorosa (Heidolph, Titramax 101, 1200 rpm) para agitar las moléculas de MEP HyperCell para accesibilidad óptima para la unión. Las células y el material no unido se quitaron al vacío y se recolectaron para medir la actividad no unida en comparación con la actividad en el sobrenadante junto con la proteína micropurificada . Después de la etapa de unión, se realizaron las siguientes etapas. El medio cromatográfico se lavó una vez con amortiguador de lavado A, dos veces con el amortiguador de lavado B y dos veces con el amortiguador de lavado C. En cada etapa de lavado se agregaron 200 µ? de amortiguador de lavado y la placa se incubó bajo agitación durante 10 minutos a temperatura ambiente. El amortiguador de lavado se retiró al vacío después de la incubación en cada etapa. Para liberar las variantes de proteasa de la columna, se agregaron a cada pocilio 200 µ? del amortiguador de elución. La placa de filtro (Uhifilter) se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos bajo agitación, liberando las variantes unidas del MEP-HyperCel y a la solución. El amortiguador de elución que contenía las variantes de proteasa se transfirió al vacío a una placa de 96 pocilios que contenía 100 µ? de amortiguador de almacenamiento. La etapa de elución se repitió agregando unos 200 µ? adicionales de amortiguador de elución a la placa.

Después de 10 minutos de incubación, las proteínas eluidas se agruparon con la primera ronda de elución. Las variantes micropurificadas se almacenaron a -18°C.

Ejemplo 2: Pruebas de las variantes de subtilasa Tabla 1 Las actividades residuales en el sustrato de Suc-AAPF-pNA después de 10 min a pH 8 , incubación a 50 °C en ausencia y presencia de EDTA se midieron para cada variante, tal como se describe en Materiales y métodos en el ensayo de estabilidad de quelante. Las actividades residuales se computaron para cada variante como actividad a una concentración de EDTA elevada dividida entre la actividad sin adición de EDTA. El porcentaje de actividad residual después de 10 minutos sin EDTA se fijó en 100% para la enzima de referencia (el polipéptido maduro de la SEQ ID NO 4) y variantes .

Tal como se observa en la Tabla 1, la enzima de referencia es inestable en las tres concentraciones de EDTA: 25, 35 y 50. Las variantes solo se ven levemente afectadas por EDTA hasta 25mM, y todas las variantes tienen actividad considerablemente más alta hasta EDTA 35 mM. Por consiguiente, todas las variantes tienen estabilidad mejorada en soluciones que contienen EDTA cuando se comparan con una proteasa de referencia (el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 que corresponde a los aminoácidos 1 a 269 de la SEQ ID NO: 4) .

La invención descrita y reivindicada en la presente no debe estar limitada en cuanto a su alcance por los aspectos específicos que se describen en la presente, ya que se pretende que estos aspectos sean ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se pretende que cualesquiera aspectos equivalentes queden incluidos en el alcance de esta invención. En efecto, varias modificaciones de la invención, además de aquellas que se muestran y describen en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. También se pretende que tales modificaciones queden incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. En caso de conflicto, regirá la presente descripción, incluidas las definiciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una variante de subtilasa caracterizada porque comprende una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde cada alteración es independientemente una sustitución o inserción, y en donde la variante tiene actividad proteasa.

2. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos una alteración es una inserción

3. La variante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque al menos una alteración es una sustitución.

4. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la variante comprende dos aminoácidos adicionales entre las posiciones 75 y 82.

5. La variante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la variante comprende dos residuos aminoacídicos adicionales en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, por lo cual los residuos aminoacídicos adicionales corresponden a la inserción de dos residuos aminoacídicos en la región correspondiente a las posiciones 75 a 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde los residuos aminoacídicos insertados se seleccionan del grupo que consiste en Gly o Asp, y en donde la región se extiende por dos aminoácidos.

6. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de identidad, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100%, de identidad secuencial con respecto a la secuencia de aminoácidos de la proteasa progenitora, en donde el progenitor se selecciona del grupo de proteasas que consiste en el polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6.

7. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque consiste en 150 a 350, por ejemplo, 175 a 330, 200 a 310, 220 a 300, 240 a 290, 260 a 280, 270 a 275 aminoácidos.

8. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque el número de alteraciones es 1-20, por ejemplo, 1-10 y 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 alteraciones.

9. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 75 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

10. La variante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la alteración es una sustitución por Asp o His.

11. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 76 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

12. La variante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la alteración es una sustitución por Ser, Asp o Tyr.

13. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 77 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

14. La variante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la alteración es una sustitución por Asp.

15. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada porque comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 78 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

16. La variante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la alteración es una sustitución por Gly o Gln.

17. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 79 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.

18. La variante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la alteración es una sustitución por Ala, Thr o Gln.

19. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada porque comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

20. La variante de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la alteración es una sustitución por Tyr.

21. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque comprende una alteración en tres posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

22. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque comprende una alteración en cuatro posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

23. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque comprende una alteración en cinco posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

24. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque comprende una alteración en cada una de las posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

25. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizada porque comprende una o más sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste en L75H, N76S, N77D, S78G, I79Q y L82Y.

26. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizada porque comprende cualquiera de las siguientes sustituciones adicionales Y167A, R170S, A191N, N261D, L262Q.

27. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizada porque tiene una estabilidad mejorada del quelante en comparación con el progenitor o en comparación con una proteasa de referencia.

28. Una composición caracterizada porque comprende la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27.

29. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la composición es una composición de limpieza y/o detergente.

30. El uso de la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29 en un proceso de limpieza.

31. El uso de conformidad con la reivindicación 30, en donde el proceso de limpieza es lavado de ropa.

32. El uso de conformidad con la reivindicación 31, en donde el proceso de limpieza es limpieza de superficies duras tal como lavado de vajilla.

33. Un método para obtener una variante de subtilasa caracterizado porque comprende introducir en una subtilasa progenitora una alteración en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 75, 76, 77, 78, 79 y 82 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en donde la alteración es independientemente una sustitución o una inserción; recuperar la variante y evaluar si la variante tiene actividad proteasa.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la variante es una variante de una subtilasa progenitora que se selecciona del grupo que consiste en: a. un polipéptido que tiene al menos 60% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6; b. un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad baja con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; c. un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad con respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5, o la secuencia de ADNc del mismo; y d. un fragmento del polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6, que tiene actividad proteasa.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la subtilasa progenitora tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6.