CN1303437A

CN1303437A - 有氨基酸缺失和替代的丝氨酸蛋白酶变体

Info

Publication number: CN1303437A
Application number: CN99806571A
Authority: CN
Inventors: D·N·鲁冰; E·E·斯科尔斯基; P·E·科雷
Original assignee: Procter and Gamble Ltd
Current assignee: Procter and Gamble Ltd; Procter and Gamble Co
Priority date: 1998-03-26
Filing date: 1999-03-25
Publication date: 2001-07-11
Also published as: BR9909147A; JP2002518993A; KR20010052223A; AR023021A1; WO1999049057A1; AU750336B2; CA2324422A1; AU2742699A; EP1082443A1

Abstract

本发明涉及相对于对应的野生型蛋白酶其免疫原性降低的丝氨酸蛋白酶变体。更具体地,本发明涉及含有经过修饰的野生型氨基酸序列的变体,其中修饰的氨基酸序列包括在对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的一或多个特定位点上的缺失和,视需要而定,替换。本发明还涉及编码此类变体的突变基因和包含此类变体的清洁和个人护理组合物。

Description

有氨基酸缺失和替代的丝氨酸蛋白酶变体

发明领域

本发明涉及丝氨酸蛋白酶变体和包含该变体的组合物，与相应的野生型丝氨酸蛋白酶相比，变体的免疫原性降低。

发明背景

自然存在的蛋白质中，酶蛋白的数量最多。有一类酶，包括了催化其它蛋白质水解的蛋白酶。其水解蛋白质的能力已被开发利用，方法是将自然存在的蛋白酶和通过蛋白质工程制得的蛋白酶掺入到清洁组合物中，尤其是那些用来洗涤衣物的组合物中。

在清洁技术领域，这类蛋白酶中应用最广泛的是丝氨酸蛋白酶。大多数丝氨酸蛋白酶是由细菌产生的，还有一些是由其它生物体产生的，如真菌。见Siezen, Roland J.等,“Homology Modeling andProtein Engineering Strategy of Subtilases,the Family ofSubtilisin-Like Serine Proteases”,Protein Engineering,Vol.4,No.7,pp.719-737(1991)。令人遗憾的是，自然环境中野生型蛋白酶的效能往往不能转化到人工的、具有清洁作用的组合物环境中去。尤其是，蛋白酶的特性，如温度稳定性、pH稳定性、氧化稳定性，以及底物专一性在其非自然环境中不一定是最适的。

已经运用好几种方法改变野生型丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列，以提高非自然洗涤环境中蛋白酶的效能。这些方法包括蛋白酶的遗传重组，以增强不同条件下蛋白酶的温度稳定性和氧化稳定性。

然而，由于由遗传工程制得的蛋白酶对哺乳动物而言是外源的，所以这些蛋白酶是潜在的抗原。作为抗原，这些蛋白酶可以引起哺乳动物的免疫和过敏反应(本文统称为免疫反应)。事实上，在人们经常接触的蛋白酶环境中已经观测到了对丝氨酸蛋白酶的敏感作用。这样的环境包括制造厂，在制造厂里雇员生活于未经处理的粉尘和烟雾之中，这些粉尘和烟雾携带有蛋白酶。而肺是蛋白酶暴露的路径，蛋白酶随粉尘进入肺后，会引起最危险的反应。蛋白酶的敏感作用也可能发生在市场上，消费者反复使用含有蛋白酶的产品也会引起过敏反应。

此外，在不断寻求更有效的用于衣物洗涤的蛋白酶方面，遗传工程一直占重要地位，但是由遗传工程制得的蛋白酶还是最低限度的应用于个人护理组合物和轻垢洗涤剂中。遗传工程制得的蛋白酶不用于肥皂、凝胶、浴液和香波这类产品，其主要原因仍然是前面提到的那个问题，即人们的敏感作用会引发不需要的免疫反应。因此，如果能够生产出一种仅能最低程度地引发免疫反应，但又具有由遗传工程制得的蛋白酶的清洁特性的个人护理组合物，那就再好不过了。

一种降低蛋白酶免疫活性的方法是重新构建蛋白酶的一个或多个表位。表位是抗原的一些氨基酸区域，这些区域与抗体结合会引发免疫反应，或者，通过主要组织相容性复合蛋白质(MHC)将加工过的抗原呈递给T细胞，从而引起免疫反应。表位的改变可能影响蛋白酶作为抗体的效能。见Walsh,B.J.and M.E.H.Howden,“A Method forthe Detection of IgE Binding Sequences of Allergens Based ona Modification of Epitope Mapping”,Journal of ImmunologicalMethods,Vol.121,pp.275-280(1989).

本发明人员发现通常被认为是枯草蛋白酶，包括枯草蛋白酶BPN’的丝氨酸蛋白酶在相应于枯算蛋白酶BPN1的70-84氨基酸位点有一个主要的表位区。在本文中，本发明人员用遗传工程方法重新设计了这些枯草蛋白酶，以降低这一表位区的免疫特性。在这过程中，本发明人员发现了这样的枯草蛋白酶，它们仍然保持了作为有效的、具有清洁功能的蛋白酶的活性，但由它们引发的免疫反应的程度降低。因此，这些蛋白酶适用于多种类型的组合物，包括但并不仅仅限于，清洗衣物、餐具、硬质表面的组合物，以及用来护肤、护发、美容和口腔护理和清洗接触镜片的组合物。

发明概述

本发明涉及丝氨酸蛋白酶变体，与相应的野生型蛋白酶相比，变体的免疫原性下降。更具体而言，本发明涉及的变体有一段氨基酸序列是相应野生型氨基酸序列经修饰而得到的。与枯草蛋白酶BPN’相比，经过修饰的氨基酸序列包含在70-84位点间一个或多个位点的缺失，和视需要而定的一个或多个位点的替换。本发明进一步涉及编码这些变体的突变基因和包含这些变体的清洁和个人护理组合物。

发明详述

本发明的基本组分描述如下，同时还对本发明实施方案中用到的各种视需要而选择的和优选的组分作了非限制性描述。

本发明能包括本文所描述的必须的、或视需要而选择的组分和/或限制因素中的任意组分，或由这些组分和/或限制因素中的任意组分组成，或基本由这些组分和/或限制因素中的任意组分组成。

如果没有其它说明，所有的百分数和比率都是通过重量计算得到的。如果没有其它说明，所有的百分数都是在总组合物的基础上计算得到的。

所有组分或组合物水平是指该组分或组合物的活性水平，不计杂质。例如，残余溶剂或副产物，这些杂质可能存在于通过商业途径获得的原料中。

本文所有的参考文献，包括所有的专利、专利申请和已发表的文章，在此都全文引入以供参考。

本文的氨基酸用缩写形式表示，表1列出了本文所用的缩写形式：

表1

氨基酸	三字母缩写	单字母缩写
氨基酸	三字母缩写	单字母缩写	丙氨酸	Ala	A
精氨酸	Arg	R	丙氨酸	Ala	A
精氨酸	Arg	R	天冬酰胺	Asn	N
天冬氨酸	Asp	D	天冬酰胺	Asn	N
天冬氨酸	Asp	D	半胱氨酸	Cys	C
谷氨酰胺	Gln	Q	半胱氨酸	Cys	C
谷氨酰胺	Gln	Q	谷氨酸	Glu	E
甘氨酸	Gly	G	谷氨酸	Glu	E
甘氨酸	Gly	G	组氨酸	His	H
异亮氨酸	Ile	I	组氨酸	His	H
异亮氨酸	Ile	I	亮氨酸	Leu	L
赖氨酸	Lys	K	亮氨酸	Leu	L
赖氨酸	Lys	K	甲硫氨酸	Met	M
苯丙氨酸	Phe	F	甲硫氨酸	Met	M
苯丙氨酸	Phe	F	脯氨酸	Pro	P
丝氨酸	Ser	S	脯氨酸	Pro	P

氨基酸	三字母缩写	单字母缩写
氨基酸	三字母缩写	单字母缩写	苏氨酸	Thr	T
色氨酸	Trp	W	苏氨酸	Thr	T
色氨酸	Trp	W	酪氨酸	Tyr	Y
缬氨酸	Val	V	酪氨酸	Tyr	Y

定义

本文所用的术语“突变”意指基因序列的改变和由这些基因序列产生的氨基酸序列的改变。“突变”可能是氨基酸缺失、替代或在野生型蛋白质序列中加入氨基酸残基。

本文所用的术语“野生型”意指一种蛋白质，在此尤指一种蛋白酶，该蛋白酶是由未发生突变的生物体产生的。

本文所用的术语“变体”意指一种蛋白质，在此尤指一种蛋白酶，该蛋白酶含有一个氨基酸序列，该序列不同于相应野生型蛋白酶的氨基酸序列。

在此需要指出的是，虽然本发明所指的变体并不仅限于枯草蛋白酶BPN’的变体，但所有氨基酸编号都参照SEQ ID NO:1所描述的枯草蛋白酶BPN’的氨基酸序列。Wells,J.A.,E.Ferrari,D.J.Henner,D.A.Estell,and E.Y.Chen,Nucleic Acids Research,Vol.Ⅱ,7911-7925(1983)，对枯草蛋白酶BPN’的氨基酸序列作了进一步描述在此引入作为参考。

本发明的变体

本发明人员发现在丝氨酸蛋白酶中有一个表位区，其位置相应于枯草蛋白酶BPN’的70-84位点。本发明人员还进一步发现，当野生型丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失和/或替代时，与相应的野生型丝氨酸蛋白酶相比，变体引起的过敏和/或免疫反应会下降。

本文所述的变体可以用缺失的氨基酸位点来表示，这些位点使变体具有某种特性。例如，一个丝氨酸蛋白酶的变体在70,75,76,77,78,79,80,81,82位点缺失，它就可以表示成Δ70,75-82。类似的，氨基酸替代可这样表示：先写野生型氨基酸残基，接着写位点编号，最后写替代上的残基。其中，替代上的氨基酸残基可能是任意一种天然氨基酸，那就加上符号“*”。一个变体如有多个替代位点，那么位点间用符号“+”分开。例如，在70位点如果缬氨酸替代了甘氨酸，那就可以表示成Gly70Val或G70V。如果一个变体既有缺失又有替代，那就用上述两种方法联合表示。例如，一个变体在70和72位点有替代，同时在75-82位点有缺失，那它就可以表示成Δ75-82，G70V+V72A。

本发明的变体是丝氨酸蛋白酶的变体。本文所用的术语“丝氨酸蛋白酶”是指这样一种蛋白酶，它至少有50％，优选有80％的氨基酸序列与一种或多种枯草蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的序列一致。关于枯草蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其同源性的讨论见Siezen等的文章(Siezen等，“Homology Modeling and Protein Engineering Strategy ofSubtilases,the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases”,Protein Engineering,Vol.4,No.7,pp.719-737(1991))。用来发生突变的优选丝氨酸蛋白酶包括：枯草蛋白酶BPN’、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶DY、枯草蛋白酶309、蛋白激酶K和热蛋白酶(thermitase)。用来发生突变的最优选丝氨酸蛋白酶是枯草蛋白酶BPN’。

本发明的变体是指丝氨酸蛋白酶的变体，这些变体含有一段由野生型氨基酸序列修饰而来的氨基酸序列。在此，相应于枯草蛋白酶BPN’，修饰而来的氨基酸序列包括70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84(70-84)位点上一个或多个氨基酸的缺失。如果不包括个人护理组合物，那这儿所指的变体就不是Δ75-83或Δ71。

本发明中较优选的变体包括73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83(73-83)位点上一个或多个氨基酸的缺失。更优选的变体包括75、76、77、78、79、80、81、82(75-82)位点上一个或多个氨基酸的缺失。

本发明的优选变体包括Δ70,75-82；Δ75-82；Δ70,78,79；Δ70；Δ75；Δ76；Δ78；Δ79；Δ81；Δ82。更优选的变体包括Δ70,75-82；Δ75-82；Δ70,78,79；Δ70；Δ78；Δ79。

本发明的变体是可以任需要而选择的，除了一个或多个位点的缺失以外，相应于枯草蛋白酶BPN’，还包括70-84位点上的一个或多个位点的氨基酸替代。当然，如果在任一给定的位点已经发生了氨基酸的缺失，那在这个位点上就不可能再发生氨基酸的替代。

表位区的氨基酸替代是通过另一种天然氨基酸残基，如表1中所给出的，取代野生型氨基酸残基而发生的。

下面的表2-10举例说明了本发明中的非限制性变体。对于这些表，在描述特定的突变时，野生型氨基酸残基在前，相应的位点编号在后。表2列出了只有一个位点缺失的优选变体，表3-10列出了有一个或多个位点缺失的，和任需要可选择的一个或多个位点替代的优选变体。例如，表3中的第一个例子是“LEU 82 GLY 83”。这个例子可以有如下三种解释：一是在82和83位点有缺失(Δ82,83)，一是在82位点缺失而在83位点上替代(Δ82,G83^*)，另一是在82位点上替代而在83位点缺失(Δ83,L82^*)。

表2单缺失变体

VAL 84

GLY 83

LEU 82

VAL 81

GLY 80

ILE 79

SER 78

ASN 77

ASN 76

LEU 75

ALA 74

ALA 73

VAL 72

GLY 70

表3双突变变体LEU 82GLY 83VAL 81GLY 83VAL 81LEU 82GLY 80GLY 83GLY 80LEU 82GLY 80VAL 81ILE 79GLY 83ILE 79LEU 82ILE 79VAL 81ILE 79GLY 80SER 78GLY 83SER 78LEU 82SER 78VAL 81SER 78GLY 80SER 78ILE 79 ASN 77GLY 83ASN 77LEU 82ASN 77VAL 81ASN 77GLY 80ASN 77ILE 79ASN 77SER 78ASN 76GLY 83ASN 76LEU 82ASN 76VAL 81ASN 76GLY 80ASN 76ILE 79ASN 76SER 78ASN 76ASN 77LEU 75GLY 83LEU 75LEU 82LEU 75VAL 81LEU 75GLY 80LEU 75ILE 79LEU 75SER 78LEU 75ASN 77LEU 75ASN 76ALA 74GLY 83ALA 74LEU 82ALA 74VAL 81ALA 74GLY 80ALA 74ILE 79ALA 74SER 78ALA 74ASN 77ALA 74ASN 76ALA 74LEU 75ALA 73GLY 83ALA 73LEU 82ALA 73VAL 81ALA 73GLY 80ALA 73ILE 79ALA 73SER 78

ALA 73ASN 77

ALA 73ASN 76

ALA 73LEU 75

ALA 73ALA 74

表4

三突变变体VAL 81LEU 82GLY 83GLY 80LEU 82GLY 83GLY 80VAL 81GLY 83GLY 80VAL 81LEU 82ILE 79LEU 82GLY 83ILE 79VAL 81GLY 83ILE 79VAL 81LEU 82ILE 79GLY 80GLY 83ILE 79GLY 80LEU 82ILE 79GLY 80VAL 81SER 78LEU 82GLY 83SER 78VAL 81GLY 83SER 78VAL 81LEU 82SER 78GLY 80GLY 83SER 78GLY 80LEU 82SER 78GLY 80VAL 81SER 78ILE 79GLY 83SER 78ILE 79LEU 82SER 78ILE 79VAL 81SER 78ILE 79GLY 80ASN 77LEU 82GLY 83ASN 77VAL 81GLY 83ASN 77VAL 81LEU 82ASN 77GLY 80GLY 83ASN 77GLY 80LEU 82ASN 77GLY 80VAL 81ASN 77ILE 79GLY 83ASN 77ILE 79LEU 82ASN 77ILE 79VAL 81 ASN 77ILE 79GLY 80ASN 77SER 78GLY 83ASN 77SER 78LEU 82ASN 77SER 78VAL 81ASN 77SER 78GLY 80ASN 77SER 78ILE 79ASN 76LEU 82GLY 83ASN 76VAL 81GLY 83ASN 76VAL 81LEU 82ASN 76GLY 80GLY 83ASN 76GLY 80LEU 82ASN 76GLY 80VAL 81ASN 76ILE 79GLY 83ASN 76ILE 79LEU 82ASN 76ILE 79VAL 81ASN 76ILE 79GLY 80ASN 76SER 78GLY 83ASN 76SER 78LEU 82ASN 76SER 78VAL 81ASN 76SER 78GLY 80ASN 76SER 78ILE 79ASN 76ASN 77GLY 83ASN 76ASN 77LEU 82ASN 76ASN 77VAL 81ASN 76ASN 77GLY 80ASN 76ASN 77ILE 79ASN 76ASN 77SER 78LEU 75LEU 82GLY 83LEU 75VAL 81GLY 83LEU 75VAL 81LEU 82LEU 75GLY 80GLY 83LEU 75GLY 80LEU 82LEU 75GLY 80VAL 81LEU 75ILE 79GLY 83LEU 75ILE 79LEU 82LEU 75ILE 79VAL 81 LEU 75ILE 79GLY 80LEU 75SER 78GLY 83LEU 75SER 78LEU 82LEU 75SER 78VAL 81LEU 75SER 78GLY 80LEU 75SER 78ILE 79LEU 75ASN 77GLY 83LEU 75ASN 77LEU 82LEU 75ASN 77VAL 81LEU 75ASN 77GLY 80LEU 75ASN 77ILE 79LEU 75ASN 77SER 78LEU 75ASN 76GLY 83LEU 75ASN 76LEU 82LEU 75ASN 76VAL 81LEU 75ASN 76GLY 80LEU 75ASN 76ILE 79LEU 75ASN 76SER 78LEU 75ASN 76ASN 77ALA 74LEU 82GLY 83ALA 74VAL 81GLY 83ALA 74VAL 81LEU 82ALA 74GLY 80GLY 83ALA 74GLY 80LEU 82ALA 74GLY 80VAL 81ALA 74ILE 79GLY 83ALA 74ILE 79LEU 82ALA 74ILE 79VAL 81ALA 74ILE 79GLY 80ALA 74SER 78GLY 83ALA 74SER 78LEU 82ALA 74SER 78VAL 81ALA 74SER 78GLY 80ALA 74SER 78ILE 79ALA 74ASN 77GLY 83ALA 74ASN 77LEU 82 ALA 74ASN 77VAL 81ALA 74ASN 77GLY 80ALA 74ASN 77ILE 79ALA 74ASN 77SER 78ALA 74ASN 76GLY 83ALA 74ASN 76LEU 82ALA 74ASN 76VAL 81ALA 74ASN 76GLY 80ALA 74ASN 76ILE 79ALA 74ASN 76SER 78ALA 74ASN 76ASN 77ALA 74LEU 75GLY 83ALA 74LEU 75LEU 82ALA 74LEU 75VAL 81ALA 74LEU 75GLY 80ALA 74LEU 75ILE 79ALA 74LEU 75SER 78ALA 74LEU 75ASN 77ALA 74LEU 75ASN 76ALA 73LEU 82GLY 83ALA 73VAL 81GLY 83ALA 73VAL 81LEU 82ALA 73GLY 80GLY 83ALA 73GLY 80LEU 82ALA 73GLY 80VAL 81ALA 73ILE 79GLY 83ALA 73ILE 79LEU 82ALA 73ILE 79VAL 81ALA 73ILE 79GLY 80ALA 73SER 78GLY 83ALA 73SER 78LEU 82ALA 73SER 78VAL 81ALA 73SER 78GLY 80ALA 73SER 78ILE 79ALA 73ASN 77GLY 83ALA 73 ASN 77LEU 82 ALA 73ASN 77VAL 81ALA 73ASN 77GLY 80ALA 73ASN 77ILE 79ALA 73ASN 77SER 78ALA 73ASN 76GLY 83ALA 73ASN 76LEU 82ALA 73ASN 76VAL 81ALA 73ASN 76GLY 80ALA 73ASN 76ILE 79ALA 73ASN 76SER 78ALA 73ASN 76ASN 77ALA 73LEU 75GLY 83ALA 73LEU 75LEU 82ALA 73LEU 75VAL 81ALA 73LEU 75GLY 80ALA 73LEU 75ILE 79ALA 73LEU 75SER 78ALA 73LEU 75ASN 77ALA 73LEU 75ASN 76ALA 73ALA 74GLY 83ALA 73ALA 74LEU 82ALA 73ALA 74VAL 81ALA 73ALA 74GLY 80ALA 73ALA 74ILE 79ALA 73ALA 74SER 78ALA 73ALA 74ASN 77ALA 73ALA 74ASN 76ALA 73ALA 74LEU 75

表5

四突变变体GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83 ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82SER 78VAL 81LEU 82GLY 83SER 78GLY 80LEU 82GLY 83SER 78GLY 80VAL 81GLY 83SER 78GLY 80VAL 81LEU 82SER 78ILE 79LEU 82GLY 83SER 78ILE 79VAL 81GLY 83SER 78ILE 79VAL 81LEU 82SER 78ILE 79GLY 80GLY 83SER 78ILE 79GLY 80LEU 82SER 78ILE 79GLY 80VAL 81ASN 77VAL 81LEU 82GLY 83ASN 77GLY 80LEU 82GLY 83ASN 77GLY 80VAL 81GLY 83ASN 77GLY 80VAL 81LEU 82ASN 77ILE 79LEU 82GLY 83ASN 77ILE 79VAL 81GLY 83ASN 77ILE 79VAL 81LEU 82ASN 77ILE 79GLY 80GLY 83ASN 77ILE 79GLY 80LEU 82ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81ASN 77SER 78LEU 82GLY 83ASN 77SER 78VAL 81GLY 83ASN 77SER 78VAL 81LEU 82ASN 77SER 78GLY 80GLY 83ASN 77SER 78GLY 80LEU B2ASN 77SER 78GLY 80VAL 81ASN 77SER 78ILE 79GLY 83ASN 77SER 78ILE 79LEU B2ASN 77SER 78ILE 79VAL 81ASN 77SER 78ILE 79GLY 80ASN 76VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76GLY 80LEU 82GLY 83ASN 76GLY 80VAL 81GLY 83ASN 76GLY 80VAL 81LEU 82ASN 76ILE 79LEU 82GLY 83 ASN 76ILE 79VAL 81GLY 83ASN 76ILE 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表7

六突变变体SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ASN 76ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ASN 76ASN 77GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ASN 76ASN 77SER 78VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77SER 78GLY 80LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81GLY 83ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82ASN 76ASN 77SER 78ILE 79LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81GLY 83ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80GLY 83ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82ASN 76ASN 77SER 78ILE 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表8

七突变变体ASN 77 SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83 ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82LEU 75SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82LEU 75ASN 76ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82LEU 75ASN 76ASN 77GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 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表9

八突变变体ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ALA 74ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ALA 74ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ALA 74ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ALA 74LEU 75SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74LEU 75ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74LEU 75ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79VAL 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77SER 78ILE 79LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78VAL 81LEU 82GLY 83 ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78GLY 80LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78GLY 80VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78GLY 80VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77GLY 80LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77GLY 80VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77GLY 80VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78GLY 80GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78GLY 80LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80

表10

九突变变体LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 8lLEU 82GLY 83ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83 ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ALA 73ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73LEU 75ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ALA 73LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ALA 73LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78GLY 80VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76SER 78ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82 ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77GLY 80VAL 8lLEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77ILE 79GLY 80VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78VAL 81LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78GLY 80LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78GLY 80VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79LEU 82GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 8lGLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79VAL 81LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80GLY 83ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80LEU 82ALA 73ALA 74LEU 75ASN 76ASN 77SER 78ILE 79GLY 80VAL 81

表11例举了含有一个或多个缺失及一个或多个替代的优选双突变：

表11

Δ73,Leu75Ile	Δ73,Leu75Met
Δ73,Leu75Ile	Δ73,Leu75Met	Δ73,Asn76His	Δ73,Ser78Asn
Δ73,Ser78Thr	Δ73,Ile79Leu	Δ73,Asn76His	Δ73,Ser78Asn
Δ73,Ser78Thr	Δ73,Ile79Leu	Δ73,Ile79Met	Δ73,Ile79Thr
Δ73,Val81Thr	Δ73,Leu82Phe	Δ73,Ile79Met	Δ73,Ile79Thr
Δ73,Val81Thr	Δ73,Leu82Phe	Δ73,Leu82His	Δ74,Leu82His
Δ74,Leu82Phe	Δ74,Val81Thr	Δ73,Leu82His	Δ74,Leu82His
Δ74,Leu82Phe	Δ74,Val81Thr	Δ74,Val81Thr	Δ74,Ile79Thr
Δ74,Ile79Met	Δ74,Ile79Leu	Δ74,Val81Thr	Δ74,Ile79Thr
Δ74,Ile79Met	Δ74,Ile79Leu	Δ74,Ser78Thr	Δ74,Ser78Asn
Δ74,Asn76His	Δ74,Leu75Met	Δ74,Ser78Thr	Δ74,Ser78Asn
Δ74,Asn76His	Δ74,Leu75Met	Δ74,Leu75Ile	Δ74,Ser78Asp
Δ75,Asn76His	Δ75,Ser78Asr	Δ74,Leu75Ile	Δ74,Ser78Asp

Δ75,Ser78Thr	Δ75,Ile79Leu
Δ75,Ser78Thr	Δ75,Ile79Leu	Δ75,Ile79Met	Δ75,Ile79Thr
Δ75,Val81Thr	Δ75,Leu82Phe	Δ75,Ile79Met	Δ75,Ile79Thr
Δ75,Val81Thr	Δ75,Leu82Phe	Δ75,Leu82His	Δ76,Leu75Ile
Δ76,Leu75Met	Δ76,Ser78Asn	Δ75,Leu82His	Δ76,Leu75Ile
Δ76,Leu75Met	Δ76,Ser78Asn	Δ76,Leu75Thr	Δ76,Ile79Leu
Δ76,Ile79Met	Δ76,Ile79Thr	Δ76,Leu75Thr	Δ76,Ile79Leu
Δ76,Ile79Met	Δ76,Ile79Thr	Δ76,Val81Thr	Δ76,Leu82Phe
Δ76,Leu82His	Δ77,Leu75Ile	Δ76,Val81Thr	Δ76,Leu82Phe
Δ76,Leu82His	Δ77,Leu75Ile	Δ77,Leu75Met	Δ77,Asn76His
Δ77,Ser78Asn	Δ77,Ser78Thr	Δ77,Leu75Met	Δ77,Asn76His
Δ77,Ser78Asn	Δ77,Ser78Thr	Δ77,Ile79Leu	Δ77,Ile79Met
Δ77,IIe79Thr	Δ77,Val81Thr	Δ77,Ile79Leu	Δ77,Ile79Met
Δ77,IIe79Thr	Δ77,Val81Thr	Δ77,Leu82Phe	Δ77,Leu82His
Δ78,Leu82His	Δ78,Leu75Ile	Δ77,Leu82Phe	Δ77,Leu82His
Δ78,Leu82His	Δ78,Leu75Ile	Δ78,Leu75Met	Δ78,Leu75Ile
Δ78,Asn76His	Δ78,Ile79Leu	Δ78,Leu75Met	Δ78,Leu75Ile
Δ78,Asn76His	Δ78,Ile79Leu	Δ78,Ile79Met	Δ78,Ile79Thr
Δ78,Val81Thr	Δ78,Leu82Phe	Δ78,Ile79Met	Δ78,Ile79Thr
Δ78,Val81Thr	Δ78,Leu82Phe	Δ79,Leu82His	Δ79,Leu75Ile
Δ79,Leu75Met	Δ79,Asn76His	Δ79,Leu82His	Δ79,Leu75Ile
Δ79,Leu75Met	Δ79,Asn76His	Δ79,Ser78Asn	Δ79,Ser78Thr
Δ79,Val81Thr	Δ79,Leu82Phe	Δ79,Ser78Asn	Δ79,Ser78Thr
Δ79,Val81Thr	Δ79,Leu82Phe	Δ80,Leu75Ile	Δ80,Leu75Met
Δ80,Asn76His	Δ80,Ser78Asn	Δ80,Leu75Ile	Δ80,Leu75Met
Δ80,Asn76His	Δ80,Ser78Asn	Δ80,Ser78Thr	Δ80,Ile79Leu
Δ80,Ile79Met	Δ80,Ile79Thr	Δ80,Ser78Thr	Δ80,Ile79Leu
Δ80,Ile79Met	Δ80,Ile79Thr	Δ80,Val81Thr	Δ80,Leu82Phe
Δ80,Leu75Ile	Δ81,Leu75Ile	Δ80,Val81Thr	Δ80,Leu82Phe

Δ81,Leu75Met	Δ81,Asn76His
Δ81,Leu75Met	Δ81,Asn76His	Δ81,Ser78Asn	Δ81,Ser78Thr
Δ81,Ile79Leu	Δ81,Ile79Met	Δ81,Ser78Asn	Δ81,Ser78Thr
Δ81,Ile79Leu	Δ81,Ile79Met	Δ81,Ile79Thr	Δ81,Leu82Phe
Δ81,Leu82His	Δ82,Leu75Ile	Δ81,Ile79Thr	Δ81,Leu82Phe
Δ81,Leu82His	Δ82,Leu75Ile	Δ82,Leu75Met	Δ82,Asn76His
Δ82,Ser78Asn	Δ82,Ser78Thr	Δ82,Leu75Met	Δ82,Asn76His
Δ82,Ser78Asn	Δ82,Ser78Thr	Δ82,Ile79Leu	Δ82,Ile79Met
Δ82,Ile79Thr	Δ82,Val81Thr	Δ82,Ile79Leu	Δ82,Ile79Met
Δ82,Ile79Thr	Δ82,Val81Thr	Δ83,Leu75Ile	Δ83,Leu75Met
Δ83,Asn76His	Δ83,Ser78Asn	Δ83,Leu75Ile	Δ83,Leu75Met
Δ83,Asn76His	Δ83,Ser78Asn	Δ83,Ser78Thr	Δ83,Ile79Leu
Δ83,Ile79Met	Δ83,Ile79Thr	Δ83,Ser78Thr	Δ83,Ile79Leu
Δ83,Ile79Met	Δ83,Ile79Thr	Δ83,Val81Thr	Δ83,Leu82Phe

为了某些目的，如使表位区发生突变的蛋白酶重新稳定，或提高变体水解蛋白质的活性，可以在表位区外再发生一个或多个替代突变(“稳定替代”)。在本领域中，许多这样的稳定突变已为人熟知。在下面的文章中可见到稳定突变的实施例，如WO 95/10591,Baeck等，1955年4月20日公开；美国专利号4,914,031,Zukowski等，1990年4月3日授权；美国专利号5,470,733,Brvan等，1995年11月28日授权；美国专利号5,567,601,Bryan等，1996年10月22日授权；WO89/07642，美国专利号5,707,848,Bryan等，1998年1月13日授权；Van Eekelen等，1989年8月24日公开；WO 87/04461,Stabinsky等，1987年7月30日公开；美国专利号4,760,025,Estell等，1988年7月26日授权；WO 92/11348,Branner等,1992年7月9日公开；EP0,405,901,Casteleijn等，1991年1月2日公开；WO 91/00345,Branner等，1991年1月10日公开；and WO 94/10020,Brode等，1995年3月23日公开。

优选的稳定性突变包括一个或多个：I107V；K213R；Y217L；Y217K；N218S；G169A；M50F；Q19E；P5A；S9A；I31L；E156S；G169A；N212G；S188P；T254A；S3C+Q206C和Q271E。更优选的稳定性突变包括一个或多个；P5A；S9A；I31L；E156S；G169A；N212G；S188P；T254A；S3C+Q206C；Q271E；Y217L和Y217K。最优选的稳定性突变包括：Y217L和Y217K。

用于个人护理组合物的优选突变体是：Δ75-83,Y217L。

制备方法

变体制备方法：使编码野生型丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列发生突变，从而得到含有修饰过的氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶变体。这些方法在本领域中都是为人熟知的，下面列举其中一种方法：

将含有野生型枯草蛋白酶BPN’基因(Mitchison,C.and J.A.Wells,“Protein Engineering of Disulfide Bonds in SubtilisinBPN_,Biochemistry,Vol.28,pp.4807-4815(1989))的噬菌粒(pSS-5)转入Escherichia coli dutung株系CJ236，利用VCSM13辅助噬菌体产生一个含尿嘧啶的单链DNA模板(Kunkel等，“Rapid andEfficient Site-Specific Mutagenesis Without PhenotypicSelection”,Methods in Enzymology,Vol.154,pp.367-382(1987),as modified by Yuckenberg等，“Site-Directed in vitroMutagenesis Using Uracil-Containing DNA and Phagemid Vectors”,Directed Mutagenesis-A Practical Approach,McPherson,M.J.ed.,pp.27-48(1991))。所有突变体(Yuckenberg等已列出)都是由引物定点诱变产生的，该方法是在Zoller和Smith方法基础上改进而来的(Zoller,M.J.,and M.Smith,“Oligonucleotide-DirectedMutagenesis Using M13-Derived Vectors:An Efficient and GeneralProcedure for the Production of Point Mutations in any Fragmentof DNA”,Nucleic Acids Research,Vol.10,pp.6487-6500(1982))。

寡核苷酸用380B DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.)制得。将诱变反应产物转入大肠杆菌株系MM294(美国典型培养物保藏中心大肠杆菌33625)。所有突变通过DNA测序来确定，将分离出来的DNA转入枯草芽孢杆菌株系PG632(Saunders等，“Optimization of theSignal-Sequence Cleavage Site for Secretion from BacillusSubtil is of a 34-amino acid Fragment of Human ParathyroidHormone”,Gene,Vol.102,pp.277-282(1991)and Yang等，“cloning of the Neutral Protease Gene of Bacillus Subtilis andthe Use of the Cloned Gene to Create an in vitro DerivedDeletion Mutation”,Journal of Bacteriology,Vol.160,pp.15-21(1984))。变体活性是由转入突变质粒的PG632细胞水解酪蛋白的能力来初步确定的。

发酵方法如下。将含有目标变体的枯草芽孢杆菌细胞(PG632)放在1升含有10g/L葡萄糖LB培养液中培养至对数期中期，然后接种到一个Biostat C发酵罐中(Braun Biotech,Inc.,Allentown,PA)，使总体积达到9升。发酵培养基包括酵母提取物、酪蛋白水解产物、部分水解的可溶性淀粉(Maltrin M-250)、消泡剂、缓冲液和微量矿物质(见“Biology of Bacilli:Applications to Industry”,Doi,R.H.And M.McGloughlin,eds.(1992))。发酵过程中培养液的pH值维持在7.5。加入卡那霉素(50μg/mL)以选择诱变质粒。细胞在37℃条件下培养18小时，当A₆₀₀值在60左右时，即可收获产物。

经过以下步骤从发酵培养液中获得纯的变体。先将培养液切向流过0.16μm的膜，滤出枯草杆菌细胞，然后用仅允许分子量不大于8000的分子通过的膜超滤，以浓缩滤液。用浓缩的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液将滤液的pH值调到5.5。再用含S-琼脂糖凝胶的阳离子交换层析法和NaCl梯度洗脱法进一步纯化变体。(见Scopes,R.K.,“Protein Purification Principles and Practice”,Springer-Verlag,New York(1984))。

用pNA分析法(DelMar等,Analytical Biochemistry,Vol.99,pp.316-320(1979))确定梯度洗脱过程中分步收集的活性变体的浓度。这一方法可以测定变体水解可溶性合成底物时释放对-硝基苯胺(p-nitroaniline)的速率，在此所用底物是琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基苯胺(sAAPF-pNA)。用荧光分光光度计在410nm测量水解反应生成黄色产物的速率，该速率与活性酶的浓度成比例。此外，280nm处的吸收值可以用来确定总的蛋白浓度。活性酶与总蛋白之比即为变体纯度，此比例还可用来鉴别贮存液的各组分。

为了避免贮存过程中变体的自解，在从层析柱得来的各组分的混合液中加入等量的丙二醇。纯化过程一完成，就用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测变体贮存液的纯度。用胰蛋白酶的Ⅱ-T型抑制剂：火鸡卵白(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)进行灵敏点滴定，以确定酶的绝对浓度。

使用前，用葡聚糖凝胶G25(Pharmacia,Piscataway,NewJersey)大小排阻柱洗脱酶贮存液。排阻柱可以除去丙二醇和交换缓冲液。酶贮存液中的MES缓冲液用0.1M Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)置换，该Tris缓冲液含有0.01M CaCl₂，并用HCl调pH值到8.6。所有实验都在pH 8.6的Tris缓冲液、25℃恒温条件下操作。

分析方法

可用下述方法检测本发明变体的酶活性以及免疫和/或过敏反应，本领域的专业人员都熟知这两种方法。可替代地，还可以用本领域其它众所周知的方法。

变体活性

本发明变体的蛋白酶活性可以用本领域众所周知的一些方法来分析，在此列举其中的两种：

皮肤薄片活性分析法

用Scotch^_#3750G胶带，从实验对象的腿上粘下人类皮肤薄片，重复操作，直到粘有皮肤薄片的胶带不再透明为止，然后将胶带剪成1英寸见方的小块，搁在一边。在一个10mm×35mm的培养皿中，将2mL0.75mg/mL的对照酶液(如枯草蛋白酶BPN’)或要检测的变体加入到0.01M KH₂PO₄ pH 5.5的缓冲液中，再加入1mL pH 8.6,2.5％的月桂酸钠溶液，将培养皿放在摇床上轻轻摇晃。将先前准备好的胶带小块放入此溶液中(粘有薄片的一面朝上)，继续摇晃10分钟，然后用自来水轻轻冲洗胶带小块15秒。吸取Stevenel蓝染料(3mL,从SigmaChemical Co.,St.Louis，MO购得)，放到一个干净的培养皿中，将清洗干净的胶带小块放入染料中(粘有薄片的一面朝上)，继续摇晃3分钟，然后将胶带小块从染液中取出，在两个盛有300mL蒸馏水的烧杯中连续清洗2次，每次15秒。胶带小块可依风干。用对照酶液处理过的胶带小块和用变体处理过的胶带小块的颜色深浅，可以直接用肉眼比较，或用比色计比较。相对于用对照酶液处理过的胶带小块，用变体处理过的胶带小块的颜色较浅，这表明变体的活性更高。

染色胶原蛋白活性分析法

将50mL含有0.01M CaCl₂,pH8.6的0.1M Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)和0.5g偶氮胶原(azocoll)(偶淡染料染色后的胶原，从Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO购得)混合，将混合物在25℃条件下温育，并用摇床轻轻摇晃。取出2mL混合液用0.2微米的针筒式过滤器过滤，在520nm处读取混合液的吸收值，并调零荧光分光光度计。在剩余的48mL Tris/azocoll混合液中加入1ppm对照酶液或要检测的变体。用0.2微米的针筒式过滤器过滤2mL含有对照/变体的溶液，每隔2分钟过滤一次，共计10分钟。每次过滤的滤液都立刻在520nm处读取吸收值，所得结果对时间作点图。对照和相应被测变体的斜率表征了样品的相对活性，斜率大表明活性高。被测变体的活性(斜率)可以被表示为对照酶液活性(斜率)的百分数。

T-细胞增殖分析

本发明变体引起免疫和/或过敏反应的潜能可以用T-细胞增殖分析来确定，如下述的分析方法。此分析方法由Bungy Poor Fard等的方法修改而来。(Bungy Poor Fard等，“T Cell Epitopes of theMajor Fraction of Rye Grass Lolium perenne (Lol p I)DefinedUsing Overlapping Peptides in vitro and in vivo”,ClinicalExperimental Immunology,Vol.94,pp.111-116(1993))。

在这种分析方法中要用对枯草蛋白酶BPN’敏感的实验对象(针刺检验阳性)和对照(针刺检验阴性)的血液。从每一对象身上采集血液(约60mL)，用Ficoll-hypaque(可从Pharmacia,Piscataway,New Jersy获得)收集单核细胞。这些细胞在RPMI 1640(可从Gibco,Grand Island.New York获得)中清洗两次，然后在加入了10％的人AB-血清，2mM L-谷氨酰胺和25μg/mL庆大霉素(可从Gibco获得)的RPMI完全培养基中重新悬浮。在U-底面、96孔的微量滴定板的每一孔中加入0.2mL完全培养基，以每孔2×10⁵的浓度培养细胞。然后加入要检测的潜在抗原(既可以是作为阳性对照的不活跃的枯草蛋白酶BPN’，也可以是本发明的一个变体)，直到抗原的最终浓度约为40ug/mL培养物在37℃，5％CO₂条件下温育，5天后，在每孔中加入1μCi的甲基-³H-胸苷，18小时后，收集细胞。被细胞掺入的³H-胸苷可用液闪计数法来估测，这就是一种T-细胞增殖分析方法。

本发明的组合物

这些变体可用于清洗组合物中。这类清洗组合物包括但并不仅限于，衣物清洗组合物、硬质表面清洁组合物、包括餐具清洁组合物以及专用于自动洗碗机的洗涤剂组合物在内的轻垢清洗组合物。

这里所说的清洗组合物含有有效剂量的一种或一种以上的本发明变体以及一种清洗组合物载体。

此处的“有效剂量的变体”或类似用语是指使某一特定清洗组合物具备必须的蛋白水解活力所需要的变体的量。该行业的一般技术人员就可以很容易地确定这一有效剂量。有效剂量建立在许多因素的基础之上。例如所使用的变体、应用的对象、清洗组合物的特殊成分、以及所要求的是液体的还是是干的(颗粒状，条棒状)清洗组合物等等。清洗组合物至少含有一种本发明的变体。该变体的优选含量约为0.0001％～10％，更优选含量约为0.001％～1％，最优选含量约为0.01％～0.1％。其中有关可能用到这些变体的不同类型的清洗组合物的几个实施例在下文有深入的论述。

除了这些变体外，清洗组合物中还含有一种清洗组合物载体。该载体含有至少一种与变体相容的清洗组合物原料。这里的“清洗组合物原料”一词指那些为了特定类型的清洗组合物及其产品形式(例如，液态、颗粒状、条棒状、喷雾状、圆棍状、面糊状、胶状)而挑选出来的任何原材料。而且这些原材料与组合物中所使用的变体是相容的。挑选清洗组合物原料并不难，需考虑的是待清洗的材料以及使用时的洗涤条件所要求的组合物的形式。这里的“相容”指的是清洗组合物原料不会降低变体水解蛋白质的活力，而导致低于变体在正常使用条件下的洗涤效果。具体的清洗组合物在下文会举例详述。

本发明的变体可用于各种要求多泡沫、强去污力的清洗组合物。所以可将这些变体与各种普通原料配合使用，制成全配方的硬质表面去污剂、餐具清洗组合物、织物清洗组合物等。这些组合物可以是液体颗粒、条棒等形式。这些组合物也可制成含有约30％～60％的表面活性剂的“浓缩型”去污剂。

可以任需要优选含各种表面活性剂(例如，阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂)的清洗组合物。这些表面活性剂在那些组合物中的含量一般为5％～35％。

这里所说的不计其数的各类表面活性剂具体包括：C₁₁～C₁₈的烷基苯磺酸盐和伯烷基硫酸盐以及无规烷基硫酸盐，分子式为CH₃(CH₂)X(CHOSO₃)^-M⁺CH₃和CH₃(CH₂)_y(CHOSO₃)^-M⁺CH₂CH₃的C₁₀～C₁₈的仲(2,3)烷基硫酸盐，其中的x及(y+1)是大于或等于7的整数，最好是至少在9左右，而M是水溶性阳离子，尤其是Na⁺,C₁₀～C₁₈的烷基烷氧基硫酸盐(尤其是环氧乙烷1-5乙氧基硫酸盐)，C₁₀～C₁₈的烷基烷氧基羧酸盐(尤其是环氧乙烷1-5乙氧基羧酸盐)，C₁₀～C₁₈烷基多聚葡糖苷及其相应的硫酸化的多聚葡糖苷，C₁₂～C₁₈α-磺化脂肪酸酯，C₁₂～C₁₈的烷基和烷基酚烷氧化物(尤其是乙氧化物和混合乙氧基/丙氧基)，C₁₂～C₁₈甜菜碱或磺化甜菜碱(“磺基甜菜碱”)，C₁₀～C₁₈氧化胺等。其中优选烷基烷氧基硫酸盐(AES)和烷基烷氧基羧酸盐(AEC)。将这些表面活性剂与氧化胺和/或甜菜碱或磺基甜菜碱配合使用，效果更佳。当然这取决于配制者的喜好。其他有用的普通表面活性剂列于标准书本中。特别有效的包括C₁₀～C₁₈N-甲基葡聚糖胺。该物质已公布于美国专利号5,194,639,Connor等人，3/16/1993。

还可在清洗组合物中添加其他多种有效成分。例如，其他活性成分、载体、促水溶物、处理佐剂、染料或颜料，液体配方的溶剂。如果要使泡沫更多一些，可在组合物中添加一些发泡剂，例如含量约1％～10％的C₁₀～C₁₆的烷基酰胺。这类发泡剂中典型的一类是C₁₀～C₁₄的单乙醇胺和双乙醇胺。将这些发泡剂与诸如氧化胺、甜菜碱及磺基甜菜碱等的高泡沫添加型表面活性剂配合使用，效果更佳。如果需要再增加些泡沫，还可加入一些可溶性镁盐，如MgCl₂、MgSO₄等。这些镁盐的普通加入量约为0.1％～2％。

水及其他溶剂可以作为这些液态清洗组合物的载体。甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇等低分子量的伯醇或仲醇也可作载体。一水合醇更适于作表面活性剂的溶剂，但是也可以使用诸如含有2～6个碳原子以及约2～6个羟基基团的多羟化合物(例如，1,3-丙二醇、乙二醇、甘油和1,2-丙二醇)。这些载体在组合物中的合量可以是5％～90％，通常约为10％～50％。

需优化这些清洗组合物的配置方法，使水洗时的清洗用水的酸碱度为pH6.8～pH11。成品的pH值通常在这个范围内。将pH值控制在推荐使用水平的方法包括使用缓冲物、碱和酸。这些方法已为本领域的技术人员所熟知。

在配制本发明的硬质表面去污组合物和织物清洗组合物时，配制者可能要用到含量约为5％～50％的各种助洗剂。典型的助洗剂包括1～10微米沸石、柠檬酸盐和琥珀酸盐等多聚羧酸盐、分层硅酸盐、磷酸盐等。其他普通助洗剂列于标准配方之中。

同样的，配制者可能会在这些组合物中添加各种酶，如纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，一般含量约为0.001％～1％。各种去圬及织物保护酶已为洗涤剂制造业所熟悉。在这些组合物中也可添加各种漂白化合物，诸如过碳酸盐、过硼酸盐等。添加量一般为1％～5％。如果需要，这些组合物中也可含有漂白活化物，诸如已为该行业所熟知的四乙酰基乙二胺、壬酰基羟苯磺酸盐等。其一般含量约为1％～10％。

还可向清洗组合物中加入约1％～35％的下列物质：去污剂，尤其是阴离子酯类低聚物类型；螯合剂，尤其是氨基磷酸盐和乙二胺琥珀酸盐；粘土清除剂，尤其是乙氧基化四亚乙基五胺；扩散剂，尤其是多聚丙烯酸盐和多聚天冬氨酸盐；增白剂，尤其是阴离子增白剂；泡沫抑制剂，尤其是硅树脂和仲醇；织物柔软剂，尤其是蒙脱石粘土等。有关这些普通原料的大量详尽的描述参见标准配方和已发布的专利。

酶稳定剂也可用于这些组合物中。这些酶稳定剂包括：丙二醇(优选含量约为1％～10％)，甲酸钠(优选含量约为0.1％～1％)和甲酸钙(优选含量约为0.1％～1％)。

本发明的变体可用于硬质表面清洗组合物中。此处的“硬质表面清洗组合物”指的是液态剂颗粒状的清洗组合物，这些组合物可用于清洗诸如地板、墙壁、浴室瓷砖等的硬质表面。本发明的硬质表面清洗组合物包含一定有效剂量的一种以上本发明的变体，其优选含量为0.001％～10％，更优选含量为0.01％～5％，进一步优选含量为0.05％～1％。除含有至少一种变体外，这种清洗组合物通常还含有一种表面活性剂和一种水溶性螯合助洗剂。然而，在诸如喷雾式窗玻璃清洁剂等的某些特殊产品中有时候并没有使用表面活性剂。因为他们可能会在玻璃表面产生膜状或条斑状的残留物。

如果需添加表面活性剂，其含量可以仅为组合物的0.1％，但是组合物中一般含有约0.25％～10％的表面活性剂，更优选的含量为1％～10％。

典型的清洗组合物中含有约0.5％～50％的助洗剂，其优选含量为1％～10％。

清洗组合物的酸碱度最好为pH7～pH12。如果需要调节pH值，可以用普通的pH调节剂，如氢氧化钠、碳酸钠或盐酸等。

溶剂也可包含于这些组合物中。有效的溶剂包括乙二醇醚和二醇。前者诸如二甘醇单己醚、二甘醇单丁醚、乙二醇单丁醚、乙二醇单己醚、丙二醇单丁醚、二丙醇单丁醚和二醇类诸如2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇和2-乙基～1,3-己二醇。但并不仅限于这两类溶剂。这些溶剂的含量一般为0.5％～15％，更优选的含量为3％～11％。

另外，也可在这些组合物中添加异丙醇或乙醇等强挥发性溶剂，促使组合物更快地从那些用了大量的清洗组合物而未漂净的表面挥发掉。挥发性溶剂在组合物中的含量一般为2％～12％。

本发明的硬质表面清洗组合物可由下面的实施例说明。

实施例1-6硬质表面清洗液

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	Δ75-82	0.05％	0.50％	0.02％	0.03％	0.30％	0.05％
EDTA	-	-	2.90％	2.90％	-	-	Δ75-82	0.05％	0.50％	0.02％	0.03％	0.30％	0.05％
EDTA	-	-	2.90％	2.90％	-	-	柠檬酸钠	-	-	-	-	2.90％	2.90％
十二烷基苯磺酸钠	1.95％	-	1.95％	-	1.95％	-	柠檬酸钠	-	-	-	-	2.90％	2.90％
十二烷基苯磺酸钠	1.95％	-	1.95％	-	1.95％	-	十二烷基硫酸钠	-	2.20％	-	2.20％	-	2.20％
十二碳(乙氧基)硫酸钠	-	2.20％	-	2.20％	-	2.20％	十二烷基硫酸钠	-	2.20％	-	2.20％	-	2.20％
十二碳(乙氧基)硫酸钠	-	2.20％	-	2.20％	-	2.20％	C₁₂氧化二甲胺	-	0.50％	-	0.50％	-	0.50％
异丙基苯磺酸钠	1.30％	-	1.30％	-	1.30％	-	C₁₂氧化二甲胺	-	0.50％	-	0.50％	-	0.50％
异丙基苯磺酸钠	1.30％	-	1.30％	-	1.30％	-	己基卡必醇	6.30％	6.30％	6.30％	6.30％	6.30％	6.30％
水	90.4％	88.3％	87.53％	85.87％	87.25％	85.85％	己基卡必醇	6.30％	6.30％	6.30％	6.30％	6.30％	6.30％

所有配方的pH=7。

表2-10所列出的变体以及本文中所提及的优选变体等其他变体都可替代实施例1-6中的Δ75-82，而清洗效果基本相似。

本发明的另一种实施方案是餐具清洗组合物。它含有至少一种本发明的变体。此处的“餐具清洗组合物”指各种形式的用于清洗餐具的组合物，包括颗粒状以及液体的，但不局限于这两种形式。本发明的餐具清洗组合物可由下面的实施例说明。

实施例7-10

液体餐具洗涤剂

	实施例7	实施例8	实施例9	实施例10
	实施例7	实施例8	实施例9	实施例10	Δ79	0.05％	0.50％	0.02％	0.40％
12-14碳N-甲基葡糖胺	0.90％	0.90％	0.90％	0.90％	Δ79	0.05％	0.50％	0.02％	0.40％
12-14碳N-甲基葡糖胺	0.90％	0.90％	0.90％	0.90％	12碳乙氧基(1)硫酸盐	12.0％	12.0％	12.0％	12.0％
2-甲基十一烷酸	4.50％	4.50％	4.50％	4.50％	12碳乙氧基(1)硫酸盐	12.0％	12.0％	12.0％	12.0％
2-甲基十一烷酸	4.50％	4.50％	4.50％	4.50％	十二碳乙氧基(2)羧酸盐	4.50％	4.50％	4.50％	4.50％
十二碳醇乙氧基化物(4)	3.00％	3.00％	3.00％	3.00％	十二碳乙氧基(2)羧酸盐	4.50％	4.50％	4.50％	4.50％
十二碳醇乙氧基化物(4)	3.00％	3.00％	3.00％	3.00％	十二碳氧化胺	3.00％	3.00％	3.00％	3.00％
枯烯磺酸钠	2.00％	2.00％	2.00％	2.00％	十二碳氧化胺	3.00％	3.00％	3.00％	3.00％
枯烯磺酸钠	2.00％	2.00％	2.00％	2.00％	乙醇	4.00％	4.00％	4.00％	4.00％
Mg⁺(如MgCl₂)	0.20％	0.20％	0.20％	0.20％	乙醇	4.00％	4.00％	4.00％	4.00％
Mg⁺(如MgCl₂)	0.20％	0.20％	0.20％	0.20％	Ca²⁺(如CaCl₂)	0.40％	0.40％	0.40％	0.40％
水	65.45％	65％	65.48％	65.1％	Ca²⁺(如CaCl₂)	0.40％	0.40％	0.40％	0.40％

所有配方的pH=7。

表2-10所列出的变体以及本文中所提及的优选变体等其他变体都可替代实施例7-10中的Δ79，而清洗效果基本相似。

本发明的液态织物清洗组合物由下面的实施例说明。

实施例11-13

织物清洗液

	实施例11	实施例12	实施例13
	实施例11	实施例12	实施例13	Δ70,75-82	0.05％	0.03％	0.30％
12-14碳烷基硫酸钠	20.0％	20.0％	20.0％	Δ70,75-82	0.05％	0.03％	0.30％
12-14碳烷基硫酸钠	20.0％	20.0％	20.0％	2-丁基辛酸	5.0％	5.0％	5.0％
柠檬酸钠	1.0％	1.0％	1.0％	2-丁基辛酸	5.0％	5.0％	5.0％
柠檬酸钠	1.0％	1.0％	1.0％	十碳醇乙氧基(3)化物	13.0％	13.0％	13.0％
单乙醇胺	2.50％	2.50％	2.50％	十碳醇乙氧基(3)化物	13.0％	13.0％	13.0％
单乙醇胺	2.50％	2.50％	2.50％	水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1)	58.45％	58.47％	58.20％

表2-10所列出的变体以及本文中所提及的优选变体等其他变体都可替代实施例11-13中的Δ70,75-82，而清洗效果基本相似。

个人护理组合物

本发明的变体尤其适用于作个人护理组合物，诸如保留及漂洗净的护发素、香波、保留及漂洗净的粉刺清洗组合物，洁面奶和润肤露，浴胶、肥皂、泡沫及无泡沫型洗面液，化妆品，手、面部和身体的洗液及保温剂，保留型面部保湿剂，化妆擦洗物，口腔护理组合物以及隐形眼镜片护理液。这些个人护理组合物含有一种以上的本发明变体以及一种个人护理载体。

具体而言，有关适用于这些组合物的变体的详细情况见以下参考文献：美国专利号5,641,479,Linares等人，6/24/1997授权(皮肤清洁物)；美国专利号5,599,549,Wivell等人，2/4/1997授权(皮肤清洁物)；美国专利号5,585,104,Ha等人，12/17/1996授权(皮肤清洁物)；美国专利号5,540,852,Kefauver等人，7/30/1996授权(皮肤清洁物)；美国专利号5,510,050,Dunbar等人，4/23/1996授权(皮肤清洁物)；美国专利号5,612,324,Guang Lin等人，3/18/1997授权(抗粉刺药剂)；美国专利号5,587,176,Warren等人，12/24/1996授权(抗粉刺药剂)；美国专利号5,549,888,Venkateswaran,8/27/1996授权(抗粉刺药剂)；美国专利号5,470,884,Corless等人，11/28/1995授权(抗粉刺药剂)；美国专利号5,650,384,Gordon等人，7/22/1997授权(浴胶)；美国专利号5,607,678,Moore等人，3/4/1997授权(浴胶)；美国专利号5,624,666,Coffindaffer等人，4/29/1997授权(护发素和/或香波)；美国专利号5,618,524,Bolich等人，4/8/1997授权(护发素和/或香波)；美国专利号5,612,301,Inman,3/18/1997授权(护发素和/或香波)；美国专利号5,573,709,Wells,11/12/1996授权(护发素和/或香波)；美国专利号5,482,703,Pings,1/9/1996授权(护发素和/或香波)；美国专利号Re.34,584,Grote等人，4/12/1994 授权(护发素和/或香波)；美国专利号5,641,493,Date等人，6/24/1997授权(化妆品)；美国专利号5,605,894,Blank等人，2/25/1997授权(化妆品)；美国专利号5,585,090,Yoshioka等人，12/17/1996授权(化妆品)；美国专利号5,607,980,McAtee等人，3/4/1990授权(手、脸和/或身体洗液)；美国专利号4,045,364,Richter等人，8/30/1977授权(化妆擦洗物)；欧洲专利申请，EP 0 619 074,Touchet等人，10/12/1994公开(化妆擦洗物)；美国专利号4,975,217,BrownSkrobot等人，12/4/1990授权(化妆擦洗物)；美国专利号5,096,700,Seibel等人，3/17/1992授权(口腔清洗组合物)；美国专利号5,028,414,Sampathkumar,7/2/1991授权(口腔清洗组合物)；美国专利号5,028,415,Benedict等人，7/2/1991授权(口腔清洗组合物)；美国专利号4,863,627,Davies等人，9/5/1989授权(隐形眼镜清洗液)；美国专利号Re.32,672,Huth等人，5/24/1988授权(隐形眼镜清洗液)；美国专利号4,609,493,Schafer等人，9/2/1986授权(隐形眼镜清洗液)。

要进一步说明的是本发明的口腔清洗组合物。将医药可接受量的本发明的一种或多种变体加入组合物中，可有效地清除牙齿或假牙上的蛋白斑垢。此处的“口腔清洗组合物”指的是牙粉、牙膏、牙胶、漱口液、口腔喷剂、洁口胶、咀嚼式口香糖、止咳糖、香粉、片剂、生物胶、预防膏、洗牙水等。口腔清洁组合物含有至少一种本发明的变体及一种医药可接受的载体。其中变体的优选含量为0.0001％～20％，更优选含量约为0.001％～10％，进一步优选含量大约为0.01％～5％。这里所说的“医药可接受的”意味着这些药物、药剂或惰性成分可以与人类以及低等动物的组织接触，而不会产生太大的毒性、不亲和性、不稳定性、刺激性及过敏反应等。这与理想的效果/副作用的比率是相当的。

口腔清洗组合物中的去污成分的医药可接受的载体成分在组合物中的含量一般约为50％～99.99％，优化含量约为65％～99.99％，更优化含量约为65％～99％。

医药可接受的载体成分和任需要可选择加入本发明的口腔清洗组合物中的成分都已经为精于此道的人所熟知。在前面已用的参考文献中就有各种各样的组合物类型、可用作口腔清洁组合物的载体成分和任需要可选择的成分。

本发明的另一种实施方案，即用于清洗口腔外的假牙的假牙清洗组合物也包含有至少一种本发明的变体。这种假牙清洗组合物含有有效剂量的一种以上的本发明的变体和一种假牙清洗载体。其中变体的优选含量为0.0001％～50％，更优选含量为0.001％～35％，进一步优选含量为0.01％～20％。诸如可以释放气泡的片剂等各种形式的假牙清洗组合物已为人们所熟知(见实施例，美国专利号5,055,305,Young)，而这些形式一般也适于和一种或更多种变体配合使用以去除假牙上的蛋白斑。

本发明的另一种实施方案，即隐形眼镜清洗组合物也包含有至少一种本发明的变体。这种隐形眼镜清洗组合物含有有效剂量的一种以上的变体以及一种隐形眼镜清洗载体。其中变体的优选含量为0.01％～50％，更优选含量约为0.01％～20％，进一步优选含量为1％～5％。诸如片剂、液体等各种形式的隐形眼镜清洗组合物已为人们所熟识，而且这些形式一般也适于和一种或更多种变体配合使用以去除隐形眼镜片上的蛋白斑。

本发明的隐形眼镜清洗组合物的实施方案可由实施例14-17说明。

实施例14-17

隐形眼镜洗液

	实施例14	实施例15	实施例16	实施例17
	实施例14	实施例15	实施例16	实施例17	Δ75-82	0.01％	0.5％	0.1％	2.0％
葡萄糖	50.0％	50.0％	50.0％	50.0％	Δ75-82	0.01％	0.5％	0.1％	2.0％
葡萄糖	50.0％	50.0％	50.0％	50.0％	非离子表面活性剂(聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)	2.0％	2.0％	2.0％	2.0％
阴离子表面活性剂(聚氧乙烯-烷基苯醚钠硫酸酯)	1.0％	1.0％	1.0％	1.0％	非离子表面活性剂(聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)	2.0％	2.0％	2.0％	2.0％
阴离子表面活性剂(聚氧乙烯-烷基苯醚钠硫酸酯)	1.0％	1.0％	1.0％	1.0％	NaCl	1.0％	1.0％	1.0％	1.0％
硼砂	0.30％	0.30％	0.30％	0.30％	NaCl	1.0％	1.0％	1.0％	1.0％
硼砂	0.30％	0.30％	0.30％	0.30％	水	45.69％	45.20％	45.60％	43.70％

表2-10所列出的变体以及本文中所提及的优选变体等其他变体都可替代实施例14-17中的Δ75-82，而清洗效果基本相似。

实施例18-21说明这些变体在沐浴产品中的应用：

实施例18-21

沐浴产品

	实施例18	实施例19	实施例20	实施例21
	实施例18	实施例19	实施例20	实施例21	水	62.62％	65.72％	57.72％	60.72％
EDTA二钠盐	0.2％	0.2％	0.2％	0.2％	水	62.62％	65.72％	57.72％	60.72％
EDTA二钠盐	0.2％	0.2％	0.2％	0.2％	甘油	3.0％	3.0％	3.0％	3.0％
多聚季铵10(Pol yquaternium10)	0.4％	0.4％	0.4％	0.4％	甘油	3.0％	3.0％	3.0％	3.0％
多聚季铵10(Pol yquaternium10)	0.4％	0.4％	0.4％	0.4％	十二烷基硫酸钠	12.0％	12.0％	12.0％	12.0％
椰子酰胺MEA	2.8％	2.8％	2.8％	2.8％	十二烷基硫酸钠	12.0％	12.0％	12.0％	12.0％
椰子酰胺MEA	2.8％	2.8％	2.8％	2.8％	月桂醋酸钠(Sodiumlauraphoace-tate)	6.0％	6.0％	6.0％	6.0％
肉豆蔻酸	1.6％	1.6％	1.6％	1.6％	月桂醋酸钠(Sodiumlauraphoace-tate)	6.0％	6.0％	6.0％	6.0％
肉豆蔻酸	1.6％	1.6％	1.6％	1.6％	MgSO₄·7H₂O	0.3％	0.3％	0.3％	0.3％
三羟基硬酯精	0.5％	0.5％	0.5％	0.5％	MgSO₄·7H₂O	0.3％	0.3％	0.3％	0.3％
三羟基硬酯精	0.5％	0.5％	0.5％	0.5％	聚乙二醇-6辛酸/奎酸甘油三酯	3.0％	-	-	-
棉脂肪酸蔗糖聚酯	3.0％	-	-	-	聚乙二醇-6辛酸/奎酸甘油三酯	3.0％	-	-	-
棉脂肪酸蔗糖聚酯	3.0％	-	-	-	山嵛脂肪酸蔗糖聚酯	3.0％	-	4.0％	-
石油冻	-	4.0％	8.0％	-	山嵛脂肪酸蔗糖聚酯	3.0％	-	4.0％	-
石油冻	-	4.0％	8.0％	-	矿物油	-	-	-	6.0％
DMDM乙内酰脲	0.08％	0.08％	0.08％	0.08％	矿物油	-	-	-	6.0％
DMDM乙内酰脲	0.08％	0.08％	0.08％	0.08％	Δ75-83,Y217L	0.1％	2.0％	2.0％	5.0％
柠檬酸	1.40％	1.40％	1.40％	1.40％	Δ75-83,Y217L	0.1％	2.0％	2.0％	5.0％

表2-10所列出的变体以及本文中所提及的优选变体等其他变体都可替代实施例18-21中的Δ75-83、Y217L，而清洗效果基本相似。

实施例22-25说明这些变体在洁面产品中的应用：

实施例22-25

洗面产品

	实施例22	实施例23	实施例24	实施例25
	实施例22	实施例23	实施例24	实施例25	水	66.52％	65.17％	68.47％	68.72％
EDTA二钠	0.1％	0.1％	0.2％	0.2％	水	66.52％	65.17％	68.47％	68.72％
EDTA二钠	0.1％	0.1％	0.2％	0.2％	柠檬酸	-	-	1.4％	1.4％
十二烷基-3硫酸钠(Sodium Laureth-3Sul fate)	3.0％	3.5％	-	-	柠檬酸	-	-	1.4％	1.4％
十二烷基-3硫酸钠(Sodium Laureth-3Sul fate)	3.0％	3.5％	-	-	十二烷基-4羧酸钠(Sodium Laureth-4Carboxyl ate)	3.0％	3.5％	-	-
月桂酯-12(Laureth-12)	1.0％	1.2％	-	-	十二烷基-4羧酸钠(Sodium Laureth-4Carboxyl ate)	3.0％	3.5％	-	-
月桂酯-12(Laureth-12)	1.0％	1.2％	-	-	多聚季铵10	-	-	0.4％	0.4％
多聚季铵25	0.3％	0.3％	-	-	多聚季铵10	-	-	0.4％	0.4％
多聚季铵25	0.3％	0.3％	-	-	甘油	3.0％	3.0％	3.0％	3.0％
十二烷基醋酸钠(SodiumLauroamphoacetate)	-	-	6.0％	6.0％	甘油	3.0％	3.0％	3.0％	3.0％
十二烷基醋酸钠(SodiumLauroamphoacetate)	-	-	6.0％	6.0％	月桂酸	6.0％	6.0％	3.0％	3.0％
肉豆蔻酸	-	-	3.0％	3.0％	月桂酸	6.0％	6.0％	3.0％	3.0％
肉豆蔻酸	-	-	3.0％	3.0％	MgSO₄·7H₂O	2.3％	2.0％	2.0％	2.0％
三乙醇胺	4.0％	4.0％	4.0％	4.0％	MgSO₄·7H₂O	2.3％	2.0％	2.0％	2.0％
三乙醇胺	4.0％	4.0％	4.0％	4.0％	三羟基硬酯	0.5％	0.5％	0.5％	0.5％
三萮脂肪酸蔗糖聚酯	2.0％	2.0％	-	-	三羟基硬酯	0.5％	0.5％	0.5％	0.5％
三萮脂肪酸蔗糖聚酯	2.0％	2.0％	-	-	棉脂肪酸蔗糖聚酯	3.0％	2.0％	-	-

	实施例22	实施例23	实施例24	实施例25
	实施例22	实施例23	实施例24	实施例25	聚乙二醇-6辛酸/癸酸甘油三酯	-	-	-	2.0％
石油冻	-	-	4.0％	-	聚乙二醇-6辛酸/癸酸甘油三酯	-	-	-	2.0％
石油冻	-	-	4.0％	-	矿物油	-	-	-	2.0％
椰子酰胺丙基甜菜碱	2.0％	3.0％	1.8％	1.8％	矿物油	-	-	-	2.0％
椰子酰胺丙基甜菜碱	2.0％	3.0％	1.8％	1.8％	氧化十二烷基二甲基胺	1.0％	1.2％	1.2％	1.2％
泛烯醇(DexPanthenol)	1.0％	0.25％	0.25％	-	氧化十二烷基二甲基胺	1.0％	1.2％	1.2％	1.2％
泛烯醇(DexPanthenol)	1.0％	0.25％	0.25％	-	DMDM乙内酰脲	0.08％	0.08％	0.08％	0.08％
Δ73,I79M	1.0％	2.0％	0.5％	0.5％	DMDM乙内酰脲	0.08％	0.08％	0.08％	0.08％
Δ73,I79M	1.0％	2.0％	0.5％	0.5％	芳香剂	0.2％	0.2％	0.2％	0.2％

表2-10所列出的变体以及本文中所提及的优选变体等其他变体都可替代实施例22-25中的Δ73、I79M，而清洗效果基本相似。

实施例26-27说明了这些变体在保留型润肤组合物中的应用：

实施例26-27

保留型润肤组合物

	实施例26	实施例27
	实施例26	实施例27	甘油	5.0％	-
硬酯酸	3.0％	-	甘油	5.0％	-
硬酯酸	3.0％	-	11-13碳异构石蜡	2.0％	-
乙二醇硬酯	1.5％	-	11-13碳异构石蜡	2.0％	-
乙二醇硬酯	1.5％	-	丙二醇	-	3.0％
矿物油	1.0％	10.0％	丙二醇	-	3.0％
矿物油	1.0％	10.0％	芝麻油	-	7.0％
石油冻	-	1.8％	芝麻油	-	7.0％
石油冻	-	1.8％	三乙醇胺	0.7％	-
十六烷基醋酸酯	0.65％	-	三乙醇胺	0.7％	-
十六烷基醋酸酯	0.65％	-	甘油硬脂酸酯	0.48％	2.0％
三乙醇胺硬酯	-	2.5％	甘油硬脂酸酯	0.48％	2.0％
三乙醇胺硬酯	-	2.5％	十六醇	0.47％	-
羊毛酯	-	1.8％	十六醇	0.47％	-
羊毛酯	-	1.8％	PEA-十六烷基磷酸盐	0.25％	-
甲基对羟苯甲酸酯	0.2％	0.2％	PEA-十六烷基磷酸盐	0.25％	-
甲基对羟苯甲酸酯	0.2％	0.2％	丙基对羟苯甲酸酯	0.12％	0.1％
Carbomer934	0.11％	-	丙基对羟苯甲酸酯	0.12％	0.1％
Carbomer934	0.11％	-	EDTA二钠盐	0.1％	-
Δ75-83	0.1％	0.5％	EDTA二钠盐	0.1％	-
Δ75-83	0.1％	0.5％	水	84.32％	71.1％

表2-10所列出的变体以及本文中所提及的优选变体等其他变体都可替代实施例26-27中的Δ75-83，而清洗效果基本相似。

实施例28说明了这些变体在擦洗组合物中的应用：

实施例28

擦洗组合物

丙二醇	1.0％
丙二醇	1.0％	十二烷基硫酸铵	0.6％
琥珀酸	4.0％	十二烷基硫酸铵	0.6％
琥珀酸	4.0％	琥珀酸钠	3.2％
三氯苯氧氯酚(Triclosan^_)	0.15％	琥珀酸钠	3.2％
三氯苯氧氯酚(Triclosan^_)	0.15％	Δ75-82,G70V	0.05％
水	91.0％	Δ75-82,G70V	0.05％

可将该组合物加在一张含有纤维素酶和/或多聚酯的编织的吸水性薄片上，所加量大约为吸水性薄片重量的250％。

表2-10所列出的变体以及本文中所提及的优选变体等其他变体都可替代实施例28中的Δ75-82、G70V，而清洗效果基本相似。

序列表(1)一般信息

(ⅰ)申请人：RUBINGH,D.N.et al.

(ⅱ)发明题目：免疫原性降低的丝氨酸蛋白酶

(ⅲ)序列数：1

(ⅳ)通信地址：

(A)收信人：保洁公司

(B)街道： 11810 EAST MIAMI RIVER ROAD

(C)城市 ROSS

(D)州 OH

(E)国家：美国

(F)邮区： 45061

(ⅴ)机读形式：

(A)介质类型：软盘Floppy disk

(B)计算机： IBMPC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件： PatentIn Release #1.0,Version #1.30

(ⅵ)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日期：

(C)分类：

(ⅷ)代理机构/代理人信息：

(A)姓名： HERSKO,BART S.

(B)登记号：32,572

(C)代理机构卷号：

(ⅸ)电信信息：

(A)电话：513-627-0633

(B)电传：513-627-0260(2)SEQ ID NO:1的信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：275氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr ser Met Ala Ser

210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270Ala Ala Gln

275

Claims

1．一种丝氨酸蛋白酶变体，其特征在于由野生型氨基酸序列的修饰后的氨基酸序列，其中修饰的氨基酸序列在对应于枯草蛋白酶BPN’位点70-84有一或多个缺失，其中所述变体不是Δ75-83或Δ71。

2．权利要求1的变体，其中的丝氨酸蛋白酶选自枯草蛋白酶BPN’，枯草蛋白酶Carlsberg，枯草蛋白酶DY，枯草蛋白酶309，蛋白酶K和热蛋白酶。

3．权利要求1或2的变体，其中的缺失是在对应于枯草蛋白酶BPN’的73-83位点上一或多个氨基酸的缺失。

4．上述任一项权利要求的变体，其中的缺失是对应于枯草蛋白酶BPN’位点70和位点75-82上的一或多个氨基酸的缺失。

5．上述任一项权利要求的变体，所述变体选自：

(a)Δ71,75-82；

(b)Δ75-82；

(c)Δ70,78,79；

(d)Δ70；

(e)Δ75；

(f)Δ76；

(g)Δ78；

(h)Δ79；

(i)Δ81；和

(j)Δ82。

6．上述任一项权利要求的变体，还包括在对应于枯草蛋白酶BPN’的位点70-84上的一或多个氨基酸的替换。

7．上述任一项权利要求的变体，还包括一或多个稳定突变。

8．编码上述任一项权利要求的变体的突变丝氨酸蛋白酶基因。

9．一种个人护理组合物，其特征在于：

(a)丝氨酸蛋白酶变体，其具有由野生型氨基酸序列经突变而得到的修饰的氨基酸序列，其中修饰的氨基酸序列在对应于枯草蛋白酶BPN’位点70-84有一或多个缺失；和

(b)个人护理组合物载体。

10．权利要求9的组合物，其中变体进一步的特征在于在相应于枯草蛋白酶BPN’70-84位点上的一或多个氨基酸的替换。