CN1426469A - 具有一个或多个d－氨基酸取代的酶变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与它们相应的野生型酶相比具有降低的免疫原性的酶变体。更具体地说，本发明涉及具有野生型氨基酸序列的改性的氨基酸序列的变体，其中改性的氨基酸序列包含用D－氨基酸的一个或多个氨基酸位的取代。本发明进一步涉及编码这种酶变体的突变基因以及含有这种的变体的清洁和个人护理组合物。

Description

具有一个或多个D-氨基酸取代的酶变体
                  有关申请的交叉引用
本申请要求2000年4月24日申请的美国临时申请60/199,415号的利益。
                       发明领域
本发明涉及相对于其相应的野生型酶具有降低的免疫原性的酶变体，以及含有该变体的组合物、编码该变体的DNA序列和使用该变体的方法。
                       发明背景
酶构成最大类的天然存在的蛋白质并负责多种反应的催化。例如，一类酶包含催化其它蛋白质水解的蛋白质酶。通过将天然存在的和蛋白质工程的蛋白酶掺入到清洁组合物、特别是与洗衣应用有关的那些组合物中，人们已经在利用水解蛋白质的这种能力。其它酶例如淀粉酶和脂酶也因多种目的(包括淀粉和脂质的水解)结合入各种清洁组合物中。
在清洁领域，这些蛋白酶中最广泛使用的是丝氨酸蛋白酶。这些丝氨酸蛋白酶中的大多数是由细菌生物体生产的，而另一些是由其它生物体例如真菌生产的。参见，Siezen，Ro1and J.等，“Subti1ases的同源性模拟和蛋白质工程战略，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族”，蛋白质工程，第4卷，No.7,719-737页(1991)。
所有这些酶的相似的性质涉及野生型酶在其相对于人造清洁组合物环境的自然环境中的效力。一般地，在自然环境中的效力不能转变为人造环境中的效力，致使酶的用途受限。例如，蛋白酶特征，例如热稳定性，pH稳定性，氧化稳定性和底物特异性，对于在该酶的天然环境之外的应用未必是最佳的。
为了提高该酶在非天然洗涤环境中的效力，曾应用过几种方法来改变酶的野生型氨基酸序列。这些方法包含酶的基因重设计来增强例如热稳定性和在完全不同的条件下改善氧化稳定性。
但是由于这样的基因工程酶对于哺乳动物是外源的，它们是潜在的抗原。作为抗原，这些酶在哺乳动物中可以引起免疫性反应和/或变应反应(这里简单地统称为变应原性或变应性反应)。实际上，在人经常暴露于酶中的环境中已发现了对酶的敏感。这些环境包括生产设备，在该环境中职员通过如无控灰尘或气溶胶化的媒介暴露于酶中。酶吸入肺中可导致气溶胶化，这是可引起最危险的反应的酶暴露的途径。在消费者重复使用含可引起变应性反应的酶的产品的市场中也会产生酶致敏。
此外，尽管在对在洗衣应用中使用的更高效蛋白酶的不懈探索中基因工程已经是重要的了，但是目前在个人护理组合物和轻垢洗涤剂中最小程度地应用基因工程酶。象例如化妆品，手用/体用水剂和膏霜，肥皂，凝胶，浴液和香波这样的产品中没有基因工程酶的主要原因是由于导致不期望的变应反应的人类致敏的上述问题。因此，提供一种提供具有最小变应反应激发的基因工程酶的清洁性能的个人护理组合物是非常有利的。
减弱酶的变应活性的一个方法是通过该酶的一个或多个抗原决定部位的重设计。抗原决定部位是通过抗体结合或者通过主要的组织相容性复合体蛋白(MHC)将处理过的抗原呈递给T细胞而诱发免疫反应的抗原的那些氨基酸区。抗原决定部位的变化能够影响它们作为抗原的效力。参见Walsh，B.J.和M.E.H.Howden，“以抗原决定部位图谱的修饰为基础测定变应原的IgE结合序列的方法”，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)，121卷，275-280页(1989)。
已发现用一个或多个右旋氨基酸(下文简称为“D-氨基酸”)取代野生型酶中的一个或多个氨基酸残基、特别是在抗原决定部位取代时，可提供具有惊人的降低的变应性和/或免疫反应、同时仍保持酶效力的酶变体。作为参考氨基酸可以左旋(“L-氨基酸”)和右旋(“D-氨基酸”)构象存在。L-氨基酸为天然存在于自然界和大多数生物系统中的。此外，天然存在的多肽由L-氨基酸构成，因而可称为L-多肽。D-氨基酸为其L-氨基酸对应物的“镜像”。尽管D-多肽(完全由D-氨基酸构成的多肽)不是天然存在的，可人工合成这些多肽以形成三维的蛋白质结构。
本发明者已发现优选地在酶的抗原决定部位区引入至少一个D-氨基酸，可使酶相对于野生型酶更少引起变应症。不受理论的限制，通常认为生物系统不会把含有D-氨基酸的抗原决定部位区识别为真抗原决定部位区。因此，不会发生通常会发生的变应性反应。但是，令人兴奋地，可保持生物功能和酶效力。因此，此处可提供降低的引起的变应性反应并保持酶效力的酶。
因而，本发明涉及具有野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列的酶变体，该变体具有在一个或多个氨基酸位由取代D-氨基酸产生的取代。
因此，本发明酶适合在几种类型的组合物中使用，包含但不限于洗衣、洗碟、硬表面、皮肤护理、头发护理、美容护理，口腔和隐形眼镜组合物。
                        发明概述
本发明涉及相对于它们的相应的野生型酶来说具有降低的免疫原性的酶变体。更具体地说，本发明涉及具有野生型氨基酸序列的改性的氨基酸序列的酶变体，其中所述酶变体包含在一个或多个氨基酸位由取代D-氨基酸产生的取代。该酶变体的至少一个氨基酸是L-氨基酸。本发明进一步涉及编码这样的变体的突变基因和含有这样的变体的清洁和个人护理组合物。
                     本发明的详细描述
下面描述本发明的基本成分。也包含本发明实施方案中使用的各种任选的和优选的成分的非限制性描述。
本发明能包含任何必需的或任选的成分和/或这里描述的限定，由任何必需的或任选的成分和/或这里描述的限定构成，或者基本上由任何必需的或任选的成分和/或这里描述的限定构成。
除非另有说明，所有的百分比和比例以重量计算。除非另有说明，所有的百分比以总的组合物为基础计算。
所有的成分或组成含量都与那个成分或组成的活性含量有关，并且不包含在商业可获得的来源中可能存在的杂质，例如残留溶剂或副产物。
这里提到的所有的文献，包括所有的专利，专利申请和出版物，都全文引作参考。
此处提及的为包括、但不限于蛋白质、更特别地酶的原料的商品名。此处发明者不想受限于某种商品名的原料。可将与由商品名注明的原料相当的原料(如来自不同名称或编目(参考)号下的不同来源的原料)代替并将其用在此处的组合物中。
如这里使用的，将用缩写来描述氨基酸，包括L-氨基酸和D-氨基酸。表I提供了这里使用的缩写表：
                                         表I
氨基酸   L-氨基酸的三个字母缩写  L-氨基酸的一个字母缩写 D-氨基酸的三个字母缩写  D-氨基酸的一个字母的缩写
丙氨酸     Ala     A     D-Ala     D-A
精氨酸     Arg     R     D-Arg     D-R
天冬酰胺     Asn     N     D-Asn     D-N
天冬氨酸     Asp     D     D-Asp     D-D
半胱氨酸     Cys     C     D-Cys     D-C
谷氨酰胺     Gln     Q     D-Gln     D-Q
谷氨酸     Glu     E     D-Glu     D-E
甘氨酸     Gly     G     D-Gly     D-G
组氨酸     His     H     D-His     D-H
异亮氨酸     Ile     I     D-Ile     D-I
亮氨酸     Leu     L     D-Leu     D-L
赖氨酸     Lys     K     D-Lys     D-K
蛋氨酸     Met     M     D-Met     D-M
苯丙氨酸     Phe     F     D-Phe     D-F
脯氨酸     Pro     P     D-Pro     D-P
丝氨酸     Ser     S     D-Ser     D-S
苏氨酸     Thr     T     D-Thr     D-T
色氨酸     Trp     W     D-Trp     D-W
酪氨酸     Tyr     Y     D-Tyr     D-Y
缬氨酸     Val     V     D-Val     D-V
如此处所用的，可通过参考表征变体的取代氨基酸位为变体命名。此处通过提供野生型氨基酸残基、随后是位号、随后是待取代的取代氨基酸残基表示取代。在取代氨基酸残基可为在该特定位处的允许的任何D-氨基酸时，提供以符号“D-*”表示。构成变体的多取代以符号“+”分隔。举例说明，甘氨酸在70位处的D-缬氨酸取代可表示为Gly70D-Val或G70D-V。在70位和72位都有D-氨基酸取代的变体的例子可表示为Gly70D-Val+Val72D-Ala或G70D-V+V72D-A。76位处任何D-氨基酸的取代的变体的例子表示为N76D-*。
                          定义
如这里使用的，术语“突变”指在基因序列和这些基因序列产生的氨基酸序列中的改变。突变可以是使野生型蛋白质序列缺失、取代或添加氨基酸残基。
如这里使用的，术语“野生型”指没有突变的生物体生产的酶。
如这里使用的，术语“变体”指具有不同于相应的野生型酶的氨基酸序列的酶。
                     本发明的酶变体
本发明者已鉴别出相对于相应的野生型酶具有降低的变应性反应的某些酶变体。已发现用一个或多个右旋氨基酸(下文简称为“D-氨基酸”)取代野生型酶中的一个或多个氨基酸残基可提供在特别是人造清洁和个人清洁环境中惊人地具有降低的变应性反应同时又保持了酶效力的酶变体。因而，此处提供的为具有至少一个D-氨基酸的酶变体、包含该变体的组合物、该变体的DNA序列编码以及特别是在清洁和个人护理领域使用该变体的方法。
作为参考氨基酸可以左旋(“L-氨基酸”)和右旋(“D-氨基酸”)构象存在。L-氨基酸为天然存在于自然界和大多数生物系统中的。此外，天然存在的多肽由L-氨基酸构成，因而可称为L-多肽。D-氨基酸为其L-氨基酸对应物的“镜像”，尽管D-多肽(完全由D-氨基酸构成的多肽)不是天然存在的，可人工合成这些多肽以形成三维的蛋白质结构。
本发明者已发现优选地在酶的抗原决定部位区引入至少一个D-氨基酸，可使酶相对于相应的野生型酶更少引起变应症。不受理论的限制，通常认为生物系统不会把含有D-氨基酸的抗原决定部位区识别为真抗原决定部位区。因此，不会发生通常会发生的变应性反应。但是，令人兴奋地，可保持生物功能和酶效力。因此，此处可提供降低的引起的变应性反应并保持酶效力的酶。本发明的酶适用于包括、但不限于洗衣、洗碟、硬表面清洁、护肤、护发、美容、口腔和隐形眼镜组合物的几种组合物。
因而，本发明涉及具有野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列的酶变体，该变体具有在一个或多个氨基酸位由取代D-氨基酸产生的取代。因为应避免完全由D-氨基酸组成的酶，变体的至少一个氨基酸为L-氨基酸。优选地，至少有一个取代是发生在野生型氨基酸序列的抗原决定部位区。抗原决定部位区包括B-细胞抗原决定部位区和T-细胞抗原决定部位区，但是，优选地在至少一个T-细胞抗原决定部位区引入D-氨基酸取代。
优选地，此处的酶变体为选自于蛋白酶、纤维素酶、脂酶、淀粉酶、过氧化物酶、微过氧化物酶、半纤维素酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、丹宁酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶(malanases)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、转移酶、异构酶、裂解酶、合成酶和果基酶的改性野生型酶。更优选地，此处的酶变体为选自于蛋白酶、纤维素酶、脂酶、淀粉酶、过氧化物酶、微过氧化物酶、磷脂酶、酯酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、β-葡聚糖酶、转移酶、裂解酶、合成酶和果基酶的改性野生型酶。甚至更优选地，此处的酶变体为选自于蛋白酶、纤维素酶、脂酶、淀粉酶、过氧化物酶、磷脂酶、酯酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、β-葡聚糖酶、转移酶和果基酶的改性野生型酶。最优选地，此处的酶变体为是蛋白酶的改性野生型酶。
作为非限制性例子，含有134个氨基酸的磷脂酶A2含有几个T-细胞抗原决定部位区。这些抗原决定部位区存在于氨基酸位号71-92、101-118、104-121和108-125内。参见如Specht等人的“蜂毒磷脂酶A2的鼠(H-2K)T-细胞抗原决定部位位于酶的活性位以外”，Int.Arch.Allergy Immunol.，第112卷，226-230页(1997年)，以及Blaser的“随变应原剂量而定的细胞因子的生产控制特异性的IgE和IgG抗体的生产”，《变应症免疫疗法新视野》，第295页(1996年)。依照本发明，可在任何这些抗原决定部位区内引入一个或多个D-氨基酸，以减少变应性反应。可使用任何D-氨基酸，优选地使用此处的表1中列出的天然存在的L-氨基酸的“镜像”的D-氨基酸。
优选地，酶为蛋白酶时，本发明的变体为丝氨酸蛋白酶的变体。此处所用的术语“丝氨酸蛋白酶”是指其中至少50％、优选地80％的氨基酸序列与一种或多种类枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶相同的蛋白酶。可在Siezen等人的“Subtilases-类枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶族的同族模拟和蛋白质工程战略”，《蛋白质工程》第4卷，第7期，719-737页(1991年)中找到有关类枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶及其同族的讨论。用于以一个或多个D-氨基酸取代的优选的丝氨酸蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶309、蛋白酶K和致热酶(thermitase)。用于以一个或多个D-氨基酸取代的更优选的丝氨酸蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶309。用于以一个或多个D-氨基酸取代的最优选的丝氨酸蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶BPN’。
已发现抗原决定部位区存在于丝氨酸蛋白酶中的相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70-84、103-126和217-252位。本发明者已进一步发现在一个或多个这些抗原决定部位区内的以取代D-氨基酸的一个或多个氨基酸取代可提供相对于相应的野生型丝氨酸蛋白酶引起降低的变应性反应的变体。就丝氨酸蛋白酶的位号而言，虽然本发明的变体不限于枯草杆菌蛋白酶BPN’的变体，所有氨基酸的编号是参照以SEQ IDNO：1表示的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的。Well，J.A.、E.Ferrari、D.J.Henner、D.A.Estell和E.Y.Chen在《核酸研究》第2卷，7911-7925页(1983年)中进一步介绍了枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。已在丝氨酸蛋白酶中鉴别出了其它抗原决定部位区，包括在1998年6月16日授权的转让给Novo Nordisk A/S的Loevborg的美国专利5,766,898号中介绍的。
因而，本发明的特别优选的实施方案涉及在三个抗原决定部位区的一个或多个具有由一个或多个取代D-氨基酸的取代的酶变体，其中酶变体为丝氨酸蛋白酶变体。可使用任何D-氨基酸，优选地使用此处的表1中列出的天然存在的L-氨基酸的“镜像”的D-氨基酸。优选的变体具有野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中野生型氨基酸序列含有第一抗原决定部位区、第二抗原决定部位区和第三抗原决定部位区，其中改性氨基酸序列含有在一个或多个抗原决定部位区的一个或多个位处由取代D-氨基酸产生的取代，其中：
(i)当取代发生在第一抗原决定部位区时，取代发生在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70-84位的一个或多个位点；
(ii)当取代发生在第二抗原决定部位区时，取代发生在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的103-126位的一个或多个位点；
(iii)当取代发生在第三抗原决定部位区时，取代发生在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的217-252位的一个或多个位点。
因而，本发明的变体可为具有由取代D-氨基酸取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶的变体，其中取代是在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84(70-84)、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125和126(103-126)和217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251和252(217-252)的一个或多个位点处。更优选地，改性氨基酸序列具有由两个或多个D-氨基酸在两个或多个这些位点处的取代，甚至更优选地具有由三个或多个D-氨基酸在三个或多个这些位点处的取代。在这些位点处的取代是通过以D-氨基酸取代野生型氨基酸残基实现的。优选地，用于取代的氨基酸为天然存在的氨基酸的D-构象，因而是通过以如表1中列出的D-氨基酸残基取代野生型氨基酸残基而实现的。
更明确地说，变体具有包含由取代D-氨基酸在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70-84位的一个或多个位点处的取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中：
(a)取代发生在70位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala、D-Arg、D-Asn、D-Asp、D-Cys、D-Gln、D-Glu、D-His、D-Ile、D-Leu、D-Lys、D-Met、D-Phe、D-Pro、D-Ser、D-Thr、D-Trp、D-Tyr和D-Val；
(b)取代发生在71位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更优选D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Cys，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Pro，D-Gln，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(c)取代发生在72位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；
(d)取代发生在73位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更优选D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(e)取代发生在74位点处时，取代氨基酸选自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更优选D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(f)取代发生在75位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更优选D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(g)取代发生在76位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更优选D-Ala，D-Arg，D-Cys，D-Ile，D-Leu，D-Met，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(h)取代发生在77位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更优选D-Ala，D-Arg，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Pro，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(i)取代发生在78位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更优选D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Pro，D-Gln，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(j)取代发生在79位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更优选D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Cys，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Pro，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(k)取代发生在80位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(l)取代发生在81位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；
(m)取代发生在82位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(n)取代发生在83位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；和
(o)取代发生在84位点处时，取代氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr。
再优选，本发明的变体包括取代，其中取代是在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、和83(73-83)的一个或多个位点处D-氨基酸的取代，更优选地，相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的75、76、77、78、79、80、81、82(75-82)的一个或多个位点处。
变体可以具有包含由取代D-氨基酸在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的103-126位的一个或多个位点处取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中：
(a)取代发生在103位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(b)取代发生在104位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Val；
(c)取代发生在105位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(d)取代发生在106位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Tyr，和D-Val；
(e)取代发生在107位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(f)取代发生在108位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(g)取代发生在109位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(h)取代发生在110位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(i)取代发生在111位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(j)取代发生在112位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(k)取代发生在113位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Tyr，和D-Val；
(l)取代发生在114位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(m)取代发生在115位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(n)取代发生在116位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(o)取代发生在117位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(p)取代发生在118位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(q)取代发生在119位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(r)取代发生在120位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(s)取代发生在121位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；
(t)取代发生在122位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(u)取代发生在123位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(v)取代发生在124位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(w)取代发生在125位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；和
(x)取代发生在126位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val.
变体可以具有包含由取代D-氨基酸在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的217-252位的一个或多个位点处的取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中：
(a)取代发生在217位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Val；
(b)取代发生在218位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(c)取代发生在219位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(d)取代发生在220位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(e)取代发生在221位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(f)取代发生在222位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(g)取代发生在223位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(h)取代发生在224位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(i)取代发生在225位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(j)取代发生在226位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(k)取代发生在227位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；
(l)取代发生在228位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(m)取代发生在229位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(n)取代发生在230位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(o)取代发生在231位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(p)取代发生在232位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(q)取代发生在233位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(r)取代发生在234位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(s)取代发生在235位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(t)取代发生在236位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(u)取代发生在237位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(v)取代发生在238位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(w)取代发生在239位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(x)取代发生在240位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(y)取代发生在241位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Tyr，和D-Val；
(z)取代发生在242位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(aa)取代发生在243位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(bb)取代发生在244位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(cc)取代发生在245位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(dd)取代发生在246位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；
(ee)取代发生在247位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(ff)取代发生在248位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(gg)取代发生在249位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(hh)取代发生在250位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(ii)取代发生在251位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；和
(jj)取代发生在252位点处时，取代D-氨基酸选自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val。
在本发明特别优选的实施方案中，D-氨基酸在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70-84位点、更优选地在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的73-83位点、甚至更优选地在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70和75-82位点、最优选地在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的75-82位点的一个或多个位点处取代野生型氨基酸。在本发明的另外的特别优选的实施方案中，D-氨基酸在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70-84位点(第一抗原决定部位区)的一个或多个位点和相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的103-126位点(第二抗原决定部位区)的一个或多个位点处取代野生型氨基酸。在本发明的另一特别优选的实施方案中，D-氨基酸在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70-84位点(第一抗原决定部位区)的一个或多个位点和相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的217-252位点(第三抗原决定部位区)的一个或多个位点处取代野生型氨基酸。在本发明另一优选的实施方案中，D-氨基酸在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70-84位点(第一抗原决定部位区)的一个或多个位点、相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的103-126位点(第二抗原决定部位区)的一个或多个位点和相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的217-252位点(第三抗原决定部位区)的一个或多个位点处取代野生型氨基酸。
下面的表2-3举例说明了本发明的非限制性优选的变体，其中在此举例说明中使用了丝氨酸蛋白酶。虽然没有明确地说明，可进行三、四、五、六、七、八、九和甚至更高的取代以形成变体。就这些表而言，在介绍特定的取代时，首先给出的是野生型氨基酸残基，其次给出的是位号(相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’)，第三个给出的是取代D-氨基酸。表2-3介绍了具有两个或三个取代的优选的变体。为了说明，表3的第一个例子为“VAL 81 D-THR LEU 82 D-PHE”。这一例子意指说明的是变体Val81D-Thr+Leu82D-Phe。
                         表2
                   单一取代变体
                   GLY 83 D-VAL
                   LEU 82 D-PHE
                   LEU 82 D-HIS
                   LEU 82 D-TYR
                   LEU 82 D-ALA
                   VAL 81 D-THR
                   VAL 81 D-ALA
GLY 80 D-VAL
ILE 79 D-LEU
ILE 79 D-MET
ILE 79 D-THR
ILE 79 D-VAL
ILE 79 D-ALA
SER 78 D-AsN
SER 78 D-THR
SER 78 D-ARG
SER 78 D-GLN
SER 78 D-HIS
SER 78 D-LYS
SER 78 D-TYR
SER 78 D-ALA
ASN 77 D-ALA
ASN 76 D-ALA
LEU 75 D-ILE
LEU 75 D-MET
LEU 75 D-VAL
LEU 75 D-ALA
ALA 74 D-VAL
ALA 73 D-VAL
VAL 72 D-ALA
THR 71 D-ALA
GLY 70 D-VAL
     表3
双取代变体VAL 81 D-THR LEU 82 D-PHEVAL 81 D-THR LEU 82 D-HISVAL 81 D-THR LEU 82 D-TYRILE 79 D-LEU LEU 82 D-PHEILE 79 D-LEU LEU 82 D-HISILR 79 D-LEU LEU 82 D-TYRILE 79 D-MET LEU 82 D-PHEILE 79 D-MET LEU 82 D-HISILE 79 D-MET LEU 82 D-TYRILE 79 D-THR LEU 82 D-PHEILE 79 D-THR LEU 82 D-HISILE 79 D-THR LEU 82 D-TYRILE 79 D-VAL LEU 82 D-PHEILE 79 D-VAL LEU 82 D-HISILE 79 D-VAL LEU 82 D-TYRILE 79 D-LEU VAL 81 D-THRILE 79 D-MET VAL 81 D-THRILE 79 D-THR VAL 81 D-THRILE 79 D-VAL VAL 81 D-THRSER 78 D-ASN LEU 82 D-PHESER 78 D-ASN LEU 82 D-HISSER 78 D-ASN LEU 82 D-TYRSER 78 D-THR LEU 82 D-PHESER 78 D-THR LEU 82 D-HISSER 78 D-THR LEU 82 D-TYRSER 78 D-ARG LEU 82 D-PHESER 78 D-ARG LEU 82 D-HISSER 78 D-ARG LEU 82 D-TYRSER 78 D-ASP LEU 82 D-PHESER 78 D-ASP LEU 82 D-HISSER 78 D-ASP LEU 82 D-TYRSER 78 D-GLN LEU 82 D-PHRSER 78 D-GLN LEU 82 D-HISSER 78 D-GLN LEU 82 D-TYRSER 78 D-HIS LEU 82 D-PHESER 78 D-HIS LEU 82 D-HISSER 78 D-HIS LEU 82 D-TYRSER 78 D-LYS LEU 82 D-PHESER 78 D-LYS LEU 82 D-HISSER 78 D-LYS LEU 82 D-TYRSER 78 D-TYR LEU 82 D-PHESER 78 D-TYR LEU 82 D-HISSER 78 D-TYR LEU 82 D-TYRSER 78 D-ASN VAL 81 D-THRSER 78 D-THR VAL 81 D-THRSER 78 D-ARG VAL 81 D-THRSER 78 D-ASP VAL 81 D-THRSER 78 D-GLN VAL 81 D-THRSER 78 D-HIS VAL 81 D-THRSER 78 D-LYS VAL 81 D-THRSER 78 D-TYR VAL 81 D-THRSER 78 D-ASN ILE 79 D-LEUSER 78 D-ASN ILE 79 D-METSER 78 D-ASN ILE 79 D-THRSER 78 D-ASN ILE 79 D-VALSER 78 D-THR ILE 79 D-LEUSER 78 D-THR ILE 79 D-METSER 78 D-THR ILE 79 D-THRSER 78 D-THR ILE 79 D-VALSER 78 D-ARG ILE 79 D-LEUSER 78 D-ARG ILE 79 D-METSER 78 D-ARG ILE 79 D-THRSER 78 D-ARG ILE 79 D-VALSER 78 D-ASP ILE 79 D-LEUSER 78 D-ASP ILE 79 D-METSER 78 D-ASP ILE 79 D-THRSER 78 D-ASP ILE 79 D-VALSER 78 D-GLN ILE 79 D-LEUSER 78 D-GLN ILE 79 D-METSER 78 D-GLN ILE 79 D-THRSER 78 D-GLN ILE 79 D-VALSER 78 D-HIS ILE 79 D-LEUSER 78 D-HIS ILE 79 D-METSER 78 D-HIS ILE 79 D-THRSER 78 D-HIS ILE 79 D-VALSER 78 D-LYS ILE 79 D-LEUSER 78 D-LYS ILE 79 D-METSER 78 D-LYS ILE 79 D-THRSER 78 D-LYS ILE 79 D-VALSER 78 D-TYR ILE 79 D-LEUSER 78 D-TYR ILE 79 D-METSER 78 D-TYR ILE 79 D-THRSER 78 D-TYR ILE 79 D-VALASN 76 D-HIS LEU 82 D-PHEASN 76 D-HIS LEU 82 D-HISASN 76 D-HIS LEU 82 D-TYRASN 76 D-HIS VAL 81 D-THRASN 76 D-HIS ILE 79 D-LEUASN 76 D-HIS ILE 79 D-METASN 76 D-HIS ILE 79 D-THRASN 76 D-HIS ILE 79 D-VALASN 76 D-HIS SER 78 D-ASNASN 76 D-HIS SER 78 D-THRASN 76 D-HIS SER 78 D-ARGASN 76 D-HIS SER 78 D-ASPASN 76 D-HIS SER 78 D-GLNASN 76 D-HIS SER 78 D-HISASN 76 D-HIS SER 78 D-LYSASN 76 D-HIS SER 78 D-TYRLEU 75 D-ILE LEU 82 D-PHELEU 75 D-ILE LEU 82 D-HISLEU 75 D-ILE LEU 82 D-TYRLEU 75 D-MET LEU 82 D-PHELEU 75 D-MET LEU 82 D-HISLEU 75 D-MET LEU 82 D-TYRLEU 75 D-VAL LEU 82 D-PHELEU 75 D-VAL LEU 82 D-HISLEU 75 D-VAL LEU 82 D-TYRLEU 75 D-ILE VAL 81 D-THRLEU 75 D-MET VAL 81 D-THRLEU 75 D-VAL VAL 81 D-THRLEU 75 D-ILE ILE 79 D-LEULEU 75 D-ILE ILE 79 D-METLEU 75 D-ILE ILE 79 D-THRLEU 75 D-ILE ILE 79 D-VALLEU 75 D-MET ILE 79 D-LEULEU 75 D-MET ILE 79 D-METLEU 75 D-MET ILE 79 D-THRLEU 75 D-MET ILE 79 D-VALLEU 75 D-VAL ILE 79 D-LEULEU 75 D-VAL ILE 79 D-MET
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此外可以一个或多个L-氨基酸或D-氨基酸、优选地L-氨基酸进行一个或多个另外的取代(“稳定化取代”)，其中在酶的抗原决定部位区的内部或外部进行该取代。该稳定化取代通过以D-氨基酸在抗原决定部位区取代使酶再稳定或提高变体的酶活性。很多这样的稳定化取代是本领域公知的。这样的稳定化突变的非限定性例子(例如丝氨酸蛋白酶)描述于，例如，1995年4月20日公开的WO95/10591，Baeck等；1990年4月3日授权的美国专利No.4,914,031，Zukowski等；1995年11月28日授权的美国专利No.5,470,733，Bryan等；1996年10月22日授权的美国专利No.5,567,601，Bryan等；1998年1月13日授权的WO89/07642，美国专利No.5,707,848，Bryan等；1989年8月24日公开的，Van Eekelen等；1987年7月30日公开的WO92/11348，Branner等；1991年1月2日公开的EP0,405,901，Casteleijn等；1991年1月10日公开的WO91/00345，Branner等；和1995年3月23日公开的WO94/10020，Brode等。
优选的丝氨酸蛋白酶稳定化取代包含下面所列中的一个或多个：I107V；K213R；Y217L；Y217K；N218S；G169A；M50F；Q19E；P5A；S9A；I31L；E156S；G169A；N212G；S188P；T254A；S3C+Q206C；和Q271E，其中整个)该位置编号是相对于枯草杆菌蛋白酶BPN’。其中更优选的稳定化突变包含下面所列中的一个或多个：P5A；S9A；I31L；E156S；G169A；N212G；S188P；T254A；S3C+Q206C；Q271E；Y217L；和Y217K。最优选的丝氨酸蛋白酶的稳定化突变包含Y217L和Y217K。
                         制备方法
可通过含有一个或多个特定位点的D-氨基酸取代的酶的合成制备本发明的变体。这些方法在本领域是众所周知的，下面说明了用枯草杆菌作为非限制性例子的一个方法。制备本发明的变体的其它方法为普通技术人员所熟知，可在此处使用。
用标准固相方法制备长度约为50个氨基酸的枯草杆菌蛋白酶BPN’的片段。该片段应包括前肽前导序列的氨基酸序列以及蛋白酶的最终加工形式的序列。通过用D-氨基酸前体取代相应的L-氨基酸，在适当的肽片段引入氨基酸。这些肽在C-末端(除了蛋白质的C-末端片段)应具有反应性的离去基团，在氨基酸末端(除了蛋白质的N-末端片段)应有可除去的保护基团。合成方法与转让给Genentach公司的Abrahmsen等人的WO94/18329中介绍的方法相似。将改性的枯草杆菌蛋白酶用于按适当的顺序顺序地连接合成肽片段，以生成包括前导肽的完整的蛋白质。将蛋白质折叠并且经自身催化过程以脱除前肽并得到活性蛋白酶(参见如Strausberg等人的蛋白质折叠反应的催化作用：枯草杆菌蛋白酶BPN’与其前肽片段的相互作用的热力学和动力学分析”，《生物化学》，第33卷，8112-8119页(1993年))。
                          分析方法
利用下面的方法可以对本发明变体测定酶活性和变应原性反应，这两种方法都是本领域技术人员公知的。或者，可以使用本领域公知的其它方法。
                         酶变体的活性
可通过本领域众所周知的方法测定本发明变体的酶活性。下文介绍了两种这样的方法，特别地其中的酶为蛋白酶：
皮肤薄片活性方法
该方法尤其适用于测定个人护理组合物中采用的酶变体的效力。使用Scotch#3750G胶带，反复从受试者的腿上剥离人皮肤薄片，直到带有皮肤薄片的胶带薄片基本上不透光。然后将该胶带切为一英寸乘一英寸的方块放置一边。在10毫米×35毫米培养皿中，在0.01M KH2PO4pH5.5缓冲液中加入2毫升的0.75毫克/毫升对照酶(例如枯草杆菌蛋白酶BPN’)或者待测定的变体。向该溶液中加入1毫升2.5％pH8.6的月桂酸钠溶液。该溶液在平台振荡器上温和混合。继续温和混合下将先前制备的胶带块浸泡在该溶液中10分钟(薄片一面向上)。然后将胶带块在自来水中温和漂洗15秒钟。将Stevenel蓝染料(3毫升，从Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO购得)移入干净的培养皿中。温和混合下，将漂洗过的胶带方块置于染料中三分钟(薄片一面向上)。从染料中取出胶带块，并且依次在两个300毫升蒸馏水的烧杯中漂洗，每次漂洗15秒钟。使胶带块风干。目测或者通过色度计(chromameter)比较从对照酶获得的胶布块与从变体获得的胶布块之间的色强度。相对于对照酶胶布块，显示较小色强度的变体胶布块是具有较高活性变体的指示。
染色的胶原活性方法
该方法尤其适用于测定清洁组合物中采用的酶变体的效力。将50毫升含有0.01M CaCl2的0.1M tris缓冲液(三羟甲基-氨基甲烷)(pH8.6)和0.5克azocoll(浸过胶原的偶氮染料，从SigmaChemical Co.，St.Louis，MO购得)混合。该混合物用平台振荡器温和混合下在25℃下温育。通过0.2微米针筒式滤器过滤2毫升该混合物，并且将该混合物在分光光度计520nm处的吸收度读为零。向剩下的48毫升tris/azocoll混合物中加入1ppm对照酶(例如枯草杆菌蛋白酶BPN’)或者待测定的变体。每2分钟通过0.2微米针筒式滤器过滤2毫升含有对照物/变体的溶液，共10分钟。对每个滤过样品，立即读取520nm处的吸收度，用该值对时间作图。对照物和受试缀合物的斜率是样品相对活性的指征。较高斜率的指示较高的活性。受试变体活性(斜率)可以表示为对照活性(斜率)的百分比。
               用于免疫原性的小鼠鼻内试验
利用本领域公知的方法或者通过下面给出的用于免疫原性的小鼠鼻内试验可以测定本发明酶的变应原性的潜力。该实验类似于下面文献中描述的测定：Robinson等，“小鼠中对枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(Alcalase)的特异性抗体反应：鼻内暴露模型的进展”，基础和应用毒理学(Fundamental and Applied Toxicology)，34卷，15-24页(1996)和Robinson等，“小鼠鼻内试验(MINT)测定洗涤剂酶的变应原效力的用途：与豚鼠气管内试验(GPIT)之比较”，毒理科学(ToxicologicalScience)，43卷，39-46页(1998)，这两篇文献中的测定都可以代替下面给出的试验而使用。
在该实验中使用体重大约18至大约20克的雌性BDF1小鼠(Charles River Laboratories，Portage，MI)。在给药之前一周对小鼠检疫。小鼠关养在铺有碎木屑的笼中，控制其中的湿度(30-70％)和温度(67-77华氏度)，并且有12小时光亮和黑暗周期。小鼠喂食Purina小鼠饲料(Purina Mills，Richmond，IN)并自由进水。
对一组五只小鼠施用待测试的酶。在施用之前，通过腹膜内(i.p.)注射盐酸氯胺酮(Ketaset)(88.8毫克/千克)和甲苯噻嗪(6.67毫克/千克)的混合物，将每一只小鼠麻醉。将麻醉的动物放在手掌心中，反转向下，并且用5毫升蛋白酶缓冲液(0.01M KH2PO4，pH5.5)经鼻内给药。各组接受相同剂量的同时，可以测试不同剂量。将药溶液小心放在各鼻孔外面让小鼠吸入。在第3，10，17和24天重复给药。
在第29天采集血清样品。采用ELISA方法如下所述测定总的和特异性抗原抗体。总IgE的测定
用抗小鼠IgE抗体(Pharmingen)涂覆96坑的微滴定盘。用PBS中的BSA保护后，在小坑中培养小鼠血清的稀释物。冲洗后，用带有与辣根过氧化物酶结合的链霉抗生物素的生物素化抗小鼠IgE获得血清IgE。把酶生成物与用硫酸抑制的四甲基联苯胺和过氧化氢一起使用。在450nm处读取盘的数据。将适当的稀释物的OD450值与由小鼠IgE标准值生成的标准曲线比较，以确定IgE的浓度。抗原特异性TgE的测定
用抗小鼠IgE抗体(Pharmingen)涂覆96坑的微滴定盘。用PBS中的BSA保护后，在小室中培养鼠血清的稀释物。冲洗后，用带有与辣根过氧化物酶结合的链菌霉抗生物素的单生物素化抗原获得酶特异性血清IgE。把酶生成物与用硫酸抑制的四甲基联苯胺和过氧化氢一起使用。在450nm处读取盘的数据。将适当的稀释物的OD450值相互比较，以确定抗原特异性IgE的相对量。
                    T-细胞增殖测定
可通过如下文所述的测定法的T-细胞增殖测定法测定本发明的变体的变应性可能。此测定法为在Bungy Poor Fard等人的“用活体外和活体内重叠肽定义的黑麦草Lolium perenne(Lol p I)主要部分的T细胞抗原决定部位”《临床实验免疫学》，第94卷，111-116页(1993年)中介绍的测定法的变更，将枯草杆菌蛋白酶BPN’用作例证的目的。
在此测定法中使用对枯草杆菌蛋白酶BPN’变应的主体(刺破试验阳性)和对照主体(刺破试验阴性)的血液。收集每个主体的血液(约60mL)并用ficoll-hypaque(可从Pharmacia，Piscataway，NewJersey获得)收获单核细胞。将细胞在RPMI 1640(可从Gibco，GrandIsland，New York获得)中洗两次然后再悬浮在添加了10％的人的AB血清、2mM的L-谷氨酰胺和25mg/mL的庆大霉素(可从Gibco获得)的完整介质RPMI中。在盛有0.2mL浓度为2×105细胞/坑的完整介质的U形底的96坑微滴定盘中培养细胞。加入待测潜在抗原(作为阳性对照的失活BPN’或本发明的变体)直到最终浓度最大至约40mg/mL。在37℃、5％的CO2中进行培养。五天后，加入1mCi/坑的甲基-3H-胸腺嘧啶核苷，18小时后收获细胞。通过液体闪烁计数估计作为T-细胞增殖量度的通过细胞引入的3H-胸腺嘧啶核苷。
                   本发明组合物
在适合各自野生型蛋白酶的任何应用中都能够使用本发明变体。一个这样的例子包含清洁组合物。由于本发明变体期望的降低的变应原性和/或免疫原性性质，本发明变体可以进一步应用于从使用酶得到最小利益的那些应用中。这样的应用的例子包括其中变体必须接触人皮肤的那些应用，例如使用个人护理组合物。
                    清洁组合物
本发明变体可以用在清洁组合物中，包括但不限于洗衣组合物，硬表面清洁组合物，轻垢清洁组合物，包括洗碟组合物和自动洗碟机清洁组合物。
这里的清洁组合物含有有效量的一种或多种本发明变体和清洁组合物载体。
如这里所使用的，“有效量的变体”或类似的表达方式是指在具体的清洁组合物中实现需要的蛋白水解活性所必需的变体的量。本领域技术人员容易确定这样的有效量，并且其基于很多因素，例如所使用的特定变体，清洁应用，清洁组合物的具体组成以及期望的是液体组合物还是干燥的组合物(例如颗粒，条块)等等。优选地，清洁组合物含有大约0.0001％至大约10％，更优选大约0.001％至大约1％，最优选大约0.01％至大约0.1％的一种或多种本发明的变体。下面进一步详细讨论其中可以使用本发明变体的各种清洁组合物的几个例子。
除了本发明变体之外，本发明清洁组合物进一步含有包含与所述变体相容的一或多种清洁组合物材料的清洁组合物载体。如这里使用的术语“清洁组合物材料”指为了需要的特殊类型的清洁组合物和产物形式(例如液体，颗粒，条块，喷雾剂，棒剂，糊剂，凝胶)而选择的任何材料，该材料也与组合物中使用的变体相容。通过考虑要清洁的材料、使用中的清洁条件需要的组合物形式，可以容易地进行清洁组合物材料的具体选择。这里使用的术语“相容”指清洁组合物材料不使所述变体的蛋白水解活性在正常使用情况下降低到不象该变体期望的那样有效的程度。下文举例详细描述具体的清洁组合物材料。
本发明的变体可以用于各种需要高起泡和好的清洁活性的清洁组合物中。因此，所述变体可以和各种常规成分一起使用以提供完全配制的硬表面清洁品、洗碟组合物、织物清洁组合物等等。这样的组合物可以是液体、颗粒、条块等等形式。这样的组合物可以配制成含有大约30％至大约60％(按重量计)表面活性剂的“浓缩”洗涤剂。
这里的清洁组合物可以任选地、并且优选地含有各种表面活性剂(例如阴离子，非离子或两性离子表面活性剂)。这种表面活性剂典型地以大约5％至大约35％的水平存在于组合物中。
这里使用的表面活性剂的非限制性例子包括常规的C11-C18烷基苯磺酸盐和伯烷基硫酸盐和任意烷基硫酸盐，式CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3 -M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸盐，其中x和(y+1)是至少大约7优选大约9的整数，M是水溶性阳离子，特别是钠，C10-C18烷基烷氧基硫酸盐(特别是EO 1-5乙氧基硫酸盐)，C10-C18烷基烷氧基羧酸盐类(特别是EO 1-5乙氧基羧酸盐)，C10-C18烷基多聚葡糖苷类和它们相应的硫酸化多聚葡糖苷类，C12-C18a-磺酸化脂肪酸酯类，C12-C18烷基和烷基苯酚烷氧基化物类(特别是乙氧基化物和混合乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜碱类和磺基三甲铵乙内酯类(“磺基甜菜碱类”)，C10-C18氧化胺类等等。烷基烷氧基硫酸盐(AES)和烷基烷氧基羧酸盐(AEC)是优选的。根据配方者的需要，这样的表面活性剂与氧化胺和/或甜菜碱或磺基甜菜碱表面活性剂结合使用也是优选的。在标准教科书中列出了其它常规的有用表面活性剂。特别有用的表面活性剂包括在1993年3月16日授权的Connor等人的美国专利No.5,194,639中公开的C10-C18N-甲基葡糖酰胺。
组合物中可以含有用于去污清洁组合物的各种其它成分，其包括，例如，其它活性成分、载体、水溶助长剂、操作助剂、染料或颜料以及用于液体配方的溶剂。如果需要额外的增加起泡，则典型地以大约1％至大约10％的水平向组合物中掺入增泡剂，例如C10-C16烷醇酰胺。C10-C14一乙醇酰胺和二乙醇酰胺能举例说明这样的一类增泡剂。这类增泡剂与高起泡辅助表面活性剂如上述氧化胺、甜菜碱和磺基甜菜碱一起使用也是有利的。如果需要，典型地可以以大约0.1％至大约2％的水平加入可溶性镁盐，例如MgCl2、MgSO4等等，以提供额外的起泡。
这里的液体清洁组合物可以含有水和其它溶剂作为载体。例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇这类低分子量的伯醇或仲醇是合适的。一元醇对于溶解表面活性剂是优选的，但是也可以使用例如含有大约2至大约6个碳原子和大约2至大约6个羟基的那些多元醇(例如1，3-丙二醇，乙二醇，甘油和1，2-丙二醇)。组合物可以含有大约5％至大约90％、典型地大约10％至大约50％这样的载体。
优选配制这里所述的清洁组合物使得在含水清洁操作中，洗用水具有的pH在大约6.8和大约11之间。典型地在该范围内配制最终产品。将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用例如缓冲剂、碱和酸。这样的技术是本领域技术人员公知的。
当配制本发明硬表面清洁组合物和织物清洁组合物时，配方者可以期望以大约5％至大约50％(按重量计)的水平应用各种助洗剂。典型的助洗剂包括1-10微米沸石、聚羧酸盐类，例如柠檬酸盐和氧代二琥珀酸盐，层状硅酸盐，磷酸盐等等。在标准配方手册中列出了其它常规助洗剂。
同样，配方者可以期望在这样的组合物中使用各种各样其它的酶，例如纤维素酶、脂酶、淀粉酶和蛋白酶，典型地大约为0.001％至大约1％(按重量计)的水平。各种清洁酶和织物护理酶是洗衣清洁剂领域公知的。
这样的组合物中可以使用各种各样的漂白化合物，例如过碳酸盐，过硼酸盐等等，典型地为大约1％至大约15％(按重量计)的水平。如果需要，这样的组合物还可以含有漂白活性剂，例如四乙酰基乙二胺、壬酰氧基苯磺酸盐等等，这也是本领域公知的。使用水平典型的是大约1％至大约10％(按重量计)。
污垢释放剂、特别是阴离子低聚酯型，螯合剂、特别是氨基膦酸盐(酯)和乙二胺二琥珀酸盐(酯)，粘土污垢去除剂、特别是乙氧基化的四亚乙基五胺，分散剂、特别是聚丙烯酸盐类和聚天冬氨酸盐类，增白剂、特别是阴离子增白剂，抑泡剂、特别是硅氧烷类和仲醇类，织物柔软剂、特别是绿土粘土等等都可以以大约1％至大约35％(按重量计)的水平用于这样的组合物中。标准配方手册和公开的专利对这样的常规材料有很多详细描述。
在清洁组合物中也可以使用酶稳定剂。这样的酶稳定剂包括丙二醇(优选大约1％至大约10％)，甲酸钠(优选大约0.1％至大约1％)和甲酸钙(优选大约0.1％至大约1％)。
本发明变体在硬表面清洁组合物中是有用的。这里使用的“硬表面清洁组合物”指用于清洁硬表面例如底板、墙面、浴室瓷砖等等的液体和颗粒清洁组合物。本发明硬表面清洁组合物含有有效量的一或多种本发明的变体，优选占组合物的大约0.001％至大约10％，更优选大约0.01％至大约5％，更优选大约0.05％至大约1％(按重量计)。除了含有一种或多种所述变体之外，这样的硬表面清洁组合物典型地含有表面活性剂和水溶性螯合助洗剂。但是在一些特殊化产品例如喷雾式窗户清洁剂中有时不使用表面活性剂，因为它们可能在玻璃表面上产生薄膜和/或条痕残余物。
当存在时，组合物中可以含有仅仅0.1％的表面活性剂成分，但是典型地组合物含有大约0.25％至大约10％、更优选大约1％至大约5％的表面活性剂。
典型地组合物含有大约0.5％至大约50％的清洁助洗剂，优选大约1％至大约10％。
优选地，pH应该在大约7至大约12的范围内。如果需要调节，可以使用常规的pH调节剂，例如氢氧化钠、碳酸钠或盐酸。
组合物中可以含有溶剂。有用的溶剂包括但不限于二醇醚，例如二乙二醇一己醚，二乙二醇一丁醚，  乙二醇一丁醚，乙二醇一己醚，丙二醇一丁醚，二丙二醇一丁醚和二元醇，例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。当使用时，这样的溶剂典型地以大约0.5％至大约15％、更优选大约3％至大约11％的水平存在。
另外，本发明组合物中可以使用高挥发性溶剂，例如异丙醇或乙醇以有利于当对表面“全强度”施用组合物之后不淋洗表面时组合物从表面的快速蒸发。当使用时，挥发性溶剂典型地以占组合物大约2％至大约12％的水平存在。
通过下面的实施例详细说明本发明的硬表面清洁组合物。
                                      实施例1-6
                                 液体硬表面清洁组合物
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6
G70D-*+S78D-*+I79D* 0.05％ 0.50％ 0.02％ 0.03％ 0.30％ 0.05％
EDTA - - 2.90％ 2.90％ - -
柠檬酸钠 - - - - 2.90％ 2.90％
C12烷基苯磺酸钠 1.95％ - 1.95％ - 1.95％ -
C12烷基硫酸钠 - 2.20％ - 2.20％ - 2.20％
C12(乙氧基)硫酸钠 - 2.20％ - 2.20％ - 2.20％
C12二甲胺氧化物 - 0.50％ - 0.50％ - 0.50％
异丙基苯磺酸钠 1.30％ - 1.30％ - 1.30％ -
己基卡必醇 6.30％ 6.30％ 6.30％ 6.30％ 6.30％ 6.30％
水 90.4％ 88.3％ 87.53％ 85.87％ 87.25％ 85.85％
所有的配方都调节到pH7。
在实施例1-6中，表2-3中所列举的变体和此处所列举的在其它变体中优选的变体取代G70D-*+S78D-*+I79D-*，结果大体上相似。
在本发明的另一个实施方案中，洗碟组合物包含一种或多种本发明变体。这里使用的“洗碟组合物”指用于清洁碟子的组合物的所有形式，包括但不限于颗粒和液体形式。通过下面的实施例详细说明本发明的洗碟组合物。
                                   实施例7-10
                                 液体碟子洗涤剂
  实施例7   实施例8   实施例9   实施例10
 G70D-*+L75D-*+N76D-*+N77D-*+S78D-*+179D-*+G80D-*+V81D-*L82D-*   0.05％   0.50％   0.02％     0.40％
 C12-C14N-甲基葡糖酰胺   0.90％   0.90％   0.90％     0.90％
 C12乙氧基(1)硫酸盐   12.0％   12.0％   12.0％     12.0％
 2-甲基十一烷酸   4.50％   4.50％   4.50％     4.50％
 C12乙氧基(2)羧酸盐   4.50％   4.50％   4.50％     4.50％
 C12醇乙氧基化物(4)   3.00％   3.00％   3.00％     3.00％
 C12氧化铵   3.00％   3.00％   3.00％     3.00％
 异丙基苯磺酸钠   2.00％   2.00％   2.00％     2.00％
 乙醇   4.00％   4.00％   4.00％     4.00％
 Mg2+(以MgCl2的形式)   0.20％   0.20％   0.20％     0.20％
 Ca2+(以CaCl2的形式)   0.40％   0.40％   0.40％     0.40％
 水   65.45％   65％   65.48％     65.1％
所有的配方都调节到pH7。
在实施例7-10中，表2-3中所列举的变体和此处所列举的在其它变体中优选的变体取代G70D-*+L75D-*+N76D-*+N77D-*+S78D-*+I79D-*+G80D-*+V81D-*+L82D-*，结果大体上相似。
通过下面的实施例详细说明本发明的液体织物清洁组合物。
                       实施例11-13
                    液体织物清洁组合物
实施例11 实施例12 实施例13
G70D-* 0.05％ 0.03％ 0.30％
C12-C14烷基硫酸钠 20.0％ 20.0％ 20.0％
2-丁基辛酸 5.0％ 5.0％ 5.0％
柠檬酸钠 1.0％ 1.0％ 1.0％
C10醇乙氧基化物(3) 13.0％ 13.0％ 13.0％
一乙醇胺 2.50％ 2.50％ 2.50％
水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1) 58.45％ 58.47％ 58.20％
在实施例11-13中，表2-3中所列举的变体和此处所列举的在其它变体中优选的变体取代G70D-*，结果大体上相似。
                    个人护理组合物
本发明变体特别适合用于个人护理组合物，例如存留型和漂洗型头发调理剂、香波、存留型和漂洗型粉刺组合物、洗面奶和调理剂、沐浴凝胶、肥皂、起泡和非起泡洁面剂、化妆品、手和面部以及身体露剂以及增湿剂、存留型面部增湿剂、化妆用和清洁用擦巾、口腔护理组合物以及隐形眼镜护理组合物。本发明个人护理组合物包含一或多种本发明变体和个人护理载体。
为了详细说明，下面参考文献中描述的组合物适合含有本发明变体：1997年6月24日授权的Linares等人的美国专利No.5,641,479(洁肤剂)；1997年2月4日授权的Wivell等人的美国专利No.5,599,549(洁肤剂)；1996年12月17日授权的Ha等人的美国专利No.5,585,104(洁肤剂)；1996年7月30日授权的Kefauver等人的美国专利No.5,540,852(洁肤剂)；1996年4月23日授权的Dunbar等人的美国专利No.5,510,050(洁肤剂)；1997年3月18日授权的Guang Lin等人的美国专利No.5,612,324(抗粉刺制剂)；1996年12月24日授权的Warren等人的美国专利No.5,587,176(抗粉刺制剂)；1996年8月27日授权的Venkateswaran等人的美国专利No.5,549,888(抗粉刺制剂)；1995年11月28日授权的Corless等人的美国专利No.5,470,884(抗粉刺制剂)；1997年7月22日授权的Gordon等人的美国专利No.5,650,384(沐浴凝胶)；1997年3月4日授权的Moore等人的美国专利No.5,607,678(沐浴凝胶)；1997年4月29日授权的Coffindaffer等人的美国专利No.5,624,666(头发调理剂和/或香波)；1997年4月8日授权的Bolich等人的美国专利No.5,618,524(头发调理剂和/或香波)；1997年3月18日授权的Inman等人的美国专利No.5,612,301(头发调理剂和/或香波)；1996年11月12日授权的Wells等人的美国专利No.5,573,709(头发调理剂和/或香波)；1996年1月9日授权的Pings等人的美国专利No.5,482,703(头发调理剂和/或香波)；1994年4月12日再次授权的Grote等人的美国专利No.Re.34,584(头发调理剂和/或香波)；1997年6月24日授权的Date等人的美国专利No.5,641,493(化妆品)；1997年2月25日授权的Blank等人的美国专利No.5,605,894(化妆品)；1996年12月17日授权的Yoshioka等人的美国专利No.5,585,090(化妆品)；1990年7月3日授权的Cheney等人的美国专利No.4,939,179(洗手液，洗面液和/或沐浴露)；1997年3月4日授权的McAtee等人的美国专利No.5,607,980(洗手液，洗面液和/或沐浴露)；1977年8月30授权的Richter等人的美国专利No.4,045,364(化妆擦巾和清洁擦巾)；1994年10月12日公开的Touchet等人的欧洲专利申请EP 0 619 074(化妆擦巾和清洁擦巾)；1990年12月4日授权的Brown-Skrobot等人的美国专利No.4,975,217(化妆擦巾和清洁擦巾)；1992年3月17日授权的Seibel的美国专利No.5,096,700(口腔清洁组合物)；1991年7月2日授权的Sampathkumar等人的美国专利No.5,028,414(口腔清洁组合物)；1991年7月2授权的Benedict等人的美国专利No.5,028,415(口腔清洁组合物)；1989年9月5日授权的Davies等人的美国专利No.4,863,627(隐形眼镜清洁液)；1988年5月24日再次授权的Huth等人的美国专利No.Re.32,672(隐形眼镜清洁液)；以及1986年9月2日授权的Schafer的美国专利No.4,609,493(隐形眼镜清洁液)。
为了进一步说明本发明的口腔清洁组合物，组合物中可以含有药学可接受量的一或多种本发明变体用于从牙齿或假牙上去除蛋白质污垢。这里使用的“口腔清洁组合物”指洁齿剂，牙膏，牙用凝胶，牙粉，漱口液，口腔喷雾剂，口腔用凝胶，口香糖，糖锭，香囊，片剂，生物凝胶，预防膏剂，牙科治疗液等等。优选地，所述口腔清洁组合物含有占组合物重量大约0.0001％至大约20％、更优选大约0.001％至大约10％、更优选大约0.01％至大约5％的一或多种本发明变体以及药物学可接受的载体。这里使用的“药物学可接受”指术语描述的药剂、药物或惰性成分适合用于与人和低级动物组织接触而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、变应反应等等，并具有合理的利益/风险比。
典型地，所述口腔清洁组合物的口腔清洁成分的药物学可接受口腔清洁载体占所述组合物重量的大约50％至大约99.99％，优选大约65％至大约99.99％，更优选大约65％至大约99％。
包含在本发明口腔清洁组合物中的药物学可接受载体成分和任选成分是本领域技术人员公知的。上文引述的参考文献中公开了用于口腔清洁组合物的各种组合物类型、载体成分和任选成分。
在本发明的另一个实施方案中，用于口腔外清洁假牙的假牙清洁组合物包含一或多种本发明变体。这样的假牙清洁组合物包含有效量的一或多种所述变体，优选占所述组合物重量大约0.0001％至大约50％、更优选大约0.001％至大约35％、更优选大约0.01％至大约20％的一或多种所述变体以及假牙清洁载体。各种假牙清洁组合物形式例如泡腾片等是本领域公知的(参见，例如Young的美国专利No.5,055,305)，并且通常适合掺入一或多种所述变体以去除假牙上的蛋白质污垢。
在本发明的另一个实施方案中，隐形眼镜清洁组合物包含一或多种本发明变体。这样的隐形眼镜清洁组合物包含有效量的一或多种所述变体，优选占所述组合物重量大约0.01％至大约50％、更优选大约0.01％至大约20％、更优选大约1％至大约5％的一或多种所述变体以及隐形眼镜清洁载体。各种隐形眼镜清洁组合物形式例如片剂、液体等是本领域公知的，并且通常适合掺入一或多种本发明变体以从隐形眼镜上去除蛋白质污物。
通过实施例14-17详细说明本发明的隐形眼镜清洁组合物实施方案。
                                         实施例14-17
                                       隐形眼镜清洁溶液
  实施例14   实施例15   实施例16   实施例17
N76D-*   0.01％   0.5％   0.1％   2.0％
葡萄糖   50.0％   50.0％   50.0％   50.0％
非离子表面活性剂(聚氧乙烯-聚)   2.0％   2.0％   2.0％   2.0％
阴离子表面活性剂(聚氧乙烯-烷基苯基醚 硫酸酯钠(sodium sulfricester))   1.0％   1.0％   1.0％   1.0％
氯化钠   1.0％   1.0％   1.0％   1.0％
硼砂   0.30％   0.30％   0.30％   0.30％
水   45.69％   45.20％   45.60％   43.70％
在实施例14-17中，表2-3中所列举的变体和此处所列举的在其它变体中优选的变体取代N76D-*，结果大体上相似。
实施例18-21详细说明本发明变体在洁身产品中的应用。
                               实施例18-21
                                 洁身产品
实施例18 实施例19 实施例20 实施例21
水 62.62％ 65.72％ 57.72％ 60.72％
EDTA二钠 0.2％ 0.2％ 0.2％ 0.2％
甘油 3.0％ 3.0％ 3.0％ 3.0％
聚季铵盐-10 0.4％ 0.4％ 0.4％ 0.4％
月桂基醚硫酸钠 12.0％ 12.0％ 12.0％ 12.0％
椰油酰胺MEA 2.8％ 2.8％ 2.8％ 2.8％
月桂两性乙酸钠 6.0％ 6.0％ 6.0％ 6.0％
十四烷酸 1.6％ 1.6％ 1.6％ 1.6％
硫酸镁七水合物 0.3％ 0.3％ 0.3％ 0.3％
三羟基硬脂精 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％
PEG-6辛/癸酸甘油三酯 3.0％ - - -
棉籽酸脂肪酸(cottonatefatty acid)蔗糖多酯 3.0％ - - -
山萮酸脂肪酸蔗糖多酯 3.0％ - 4.0％ -
凡士林 - 4.0％ 8.0％ -
矿物油 - - - 6.0％
DMDM乙内酰脲 0.08％ 0.08％ 0.08％ 0.08％
L75D-*+N76D-*+N77D-*+S78D-*+I79D-*+G80D-*+V81D-*+L82D-* 0.1％ 2.0％ 2.0％ 5.0％
柠檬酸 1.40％ 1.40％ 1.40％ 1.40％
在实施例18-21中，表2-3中所列举的变体和此处所列举的在其它变体中优选的变体取代L75D-*+N76D-*+N77D-*+S78D-*+I79D-*+G80D-*+V81D-*+L82D-*，结果大体上相似。
实例22-25详细说明本发明变体在洗面产品中的应用：
                          实施例22-25
                            洗面产品
实施例22 实施例23 实施例24 实施例25
水 66.52％ 65.17％ 68.47％ 68.72％
EDTA二钠 0.1％ 0.1％ 0.2％ 0.2％
柠檬酸 - - 1.4％ 1.4％
月桂基醚-3硫酸钠 3.0％ 3.5％ - -
月桂基醚-4羧酸钠 3.0％ 3.5％ - -
月桂基醚-12 1.0％ 1.2％ - -
聚季铵盐-10 - - 0.4％ 0.4％
聚季铵盐-25 0.3％ 0.3％ - -
甘油 3.0％ 3.0％ 3.0％ 3.0％
月桂两性乙酸钠 - - 6.0％ 6.0％
月桂酸 6.0％ 6.0％ 3.0％ 3.0％
十四烷酸 - - 3.0％ 3.0％
硫酸镁七水合物 2.3％ 2.0％ 2.0％ 2.0％
三乙醇胺 4.0％ 4.0％ 4.0％ 4.0％
三羟基硬脂精 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％
山萮酸脂肪酸蔗糖多酯 2.0％ 2.0％ - -
棉籽脂肪酸蔗糖多酯 3.0％ 2.0％ - -
PEG-6辛/癸酸甘油三酯 - - - 2.0％
凡士林 - - 4.0％ -
矿物油 - - - 2.0％
椰油酰胺丙基甜菜碱 2.0％ 3.0％ 1.8％ 1.8％
月桂基二甲基胺氧化物 1.0％ 1.2％ 1.2％ 1.2％
D-泛醇 1.0％ 0.25％ 0.25％ -
DMDM乙内酰脲 0.08％ 0.08％ 0.08％ 0.08％
L75D-* 1.0％ 2.0％ 0.5％ 0.5％
香料 0.2％ 0.2％ 0.2％ 0.2％
在实施例22-25中，表2-3中所列举的变体和此处所列举的在其它变体中优选的变体取代L75D-*，结果大体上相似。
实施例26-27详细说明本发明变体在存留型皮肤增湿剂组合物中的应用。
                       实施例26-27
                 存留型皮肤增湿剂组合物
    实施例26     实施例27
    甘油     5.0％     -
    硬脂酸     3.0％     -
    C11-13异链烷烃     2.0％     -
    乙二醇硬脂酸酯     1.5％     -
    丙二醇     -     3.0％
    矿物油     1.0％     10.0％
    芝麻油     -     7.0％
    凡士林     -     1.8％
    三乙醇胺     0.7％     -
    乙酸十六烷酯     0.65％     -
    硬脂酸甘油酯     0.48％     2.0％
    TEA硬脂酸酯     -     2.5％
    十六烷醇     0.47％     -
    羊毛脂醇     -     1.8％
    DEA-十六烷基磷酸酯     0.25％     -
    对羟苯甲酸甲酯     0.2％     0.2％
    对羟苯甲酸丙酯     0.12％     0.1％
    Carbomer 934     0.11％     -
    EDTA二钠     0.1％     -
    L82D-*     0.1％     0.5％
    水     84.32％     7.1％
在实施例26-27中，表2-3中所列举的变体和此处所列举的在其它变体中优选的变体取代L82D-*，结果大体上相似。
实施例28详细说明本发明变体在清洁擦巾组合物中的应用。
           实施例28
       清洁擦巾组合物
    丙二醇     1.0％
    月桂基硫酸铵     0.6％
    琥珀酸     4.0％
    琥珀酸钠     3.2％
    三氯生     0.15％
    S78D-*     0.05％
    水     91.0％
将上述组合物以吸收层重量大约250％的量浸润到由纤维素和/或聚酯组成的纺织吸收层中。
在实施例28中，表2-3中所列举的变体和此处所列举的在其它变体中优选的变体取代S78D-*，结果大体上相似。

Claims (12)

1.酶变体，特征为该变体具有包含由取代D-氨基酸在一个或多个氨基酸位产生的取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中酶变体的至少一个氨基酸为L-氨基酸。
2.权利要求1的酶变体，其中至少一个取代发生在野生型氨基酸序列的抗原决定部位区。
3.权利要求1的酶变体，其为选自于蛋白酶、纤维素酶、脂酶、淀粉酶、过氧化物酶、微过氧化物酶、半纤维素酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、丹宁酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、转移酶、异构酶、裂解酶、连接酶、合成酶和果基酶的酶的变体。
4.权利要求3的酶变体，其中酶为蛋白酶。
5.权利要求4的酶变体，其中野生型氨基酸序列含有第一抗原决定部位区、第二抗原决定部位区和第三抗原决定部位区，其中改性氨基酸序列含有在一个或多个抗原决定部位区的一个或多个位处由取代D-氨基酸产生的取代，其中：
(i)当取代发生在第一抗原决定部位区时，取代发生在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70-84位的一个或多个位点；
(ii)当取代发生在第二抗原决定部位区时，取代发生在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的103-126位的一个或多个位点；
(iii)当取代发生在第三抗原决定部位区时，取代发生在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的217-252位的一个或多个位点。
6.权利要求5的酶变体，为选自于枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶309、蛋白酶K和致热酶的丝氨酸蛋白酶。
7.权利要求6的酶变体，其中至少一个取代发生在第一抗原决定部位区。
8.权利要求7的酶变体，其中至少一个取代是在相应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的70和75-82位的一个或多个位处。
9.权利要求7的酶变体，其中至少一个取代发生在第二抗原决定部位区。
10.权利要求7的蛋白质变体，其中至少一个取代发生在第三抗原决定部位区。
11.组合物，特征为该组合物选自于清洁组合物和个人护理组合物，其中该组合物含有权利要求1的酶变体和载体。
12.突变基因，特征为该基因编码权利要求1的酶变体。
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